ES2548452T3 - Epítopos de IL-17A e IL-17F y sus anticuerpos específicos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humana y a IL-17F humana que se une a un epítopo de la IL-17A humana que comprende SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73, ASP84, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131 de la SEQ ID NO: 21, donde el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3, donde las SEQ ID NOs se muestran en la Figura 1.

Description

Epítopos de IL-17A e IL-17F y sus anticuerpos específicos

La presente invención se refiere a epítopos neutralizantes de IL-17A e IL-17F y a anticuerpos que se unen a dichos epítopos. La presente invención también se refiere a los usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpo y a los métodos para producirlas.

La interleucina 17 (IL-17), también conocida como CTLA-8 ó IL-17A, es una citocina pro-inflamatoria que estimula la secreción de un amplio rango de otras citocinas procedentes de diversas células no inmunes. La IL-17A es capaz de inducir la secreción de IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 y G-CSF por células adherentes como los fibroblastos, la queratinocitos, células epiteliales y endoteliales y también es capaz de inducir la expresión superficial de ICAM-1, la proliferación de células T y el crecimiento y la diferenciación de progenitores humanos de CD34+ en neutrófilos cuando se co-cultivan en presencia de fibroblastos irradiados (Fossiez et al., 1998, Int. Rev. Immunol. 16, 541-551). La IL-17A se produce predominantemente en células T activadas por memoria a través de la unión a un receptor superficial distribuido uniformemente (IL-17R) (Yao et al., 1997, Cytokine, 9, 794-800). También puede actuar a través de la unión a un complejo de IL-17RA y IL-17RC (Toy et al., 2006, J. Immunol. 177(11): 36-39). Las células productoras de IL-17 denominadas 'células TH17' han sido implicadas en la patogénesis de determinados cánceres (Weaver et al., 2006, Immunity, 24, 677-688; Langowski et al., 2006, 442, 461-465; Iwakura e Ishigame, 2006, J. Clin. Invest. 116, 5, 1218-1222).

Se han identificado una serie de homólogos de IL-17 que presentan papeles tanto similares como distintos en la regulación de respuestas inflamatorias. Para una revisión de las familias de citocina IL-17/receptor véase Dumont, 2003, Expert Opin. Ther. Patents, 13, 287-303. Uno de dichos homólogos es el IL-17F, también denominado IL-24 y ML-1, que es idéntico en aproximadamente un 55% a la IL-17A y se cree que comparten los mismos receptores que la IL-17A (Kolls y Linden 2004, Immunity, 21, 467-476; Hymowitz, et al., 2001, EMBO J. 20(19), 5332-5341; Kuestner et al., 2007, Journal of Immunology, 179, 5462-5473).

Tanto la IL-17A como la IL-17F pueden formar proteínas homodiméricas y heterodiméricas, todas las cuales pueden ser activadas por células T CD4+ humanas (Wright et al., 2007, J Biol Chem. 282 (18), 13447-13455).

La IL-17 puede contribuir a una serie de enfermedades mediadas por respuestas inmunes anormales, tal como la artritis reumatoide y la inflamación de las vías aéreas, así como el rechazo a trasplante de órganos y la inmunidad antitumoral. Los inhibidores de actividad de IL-17 son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una proteína de fusión de ratón de IL-17R:Fc humana, una IL-17R soluble de ratón y un anticuerpo monoclonal anti-IL-17, han sido usados para demostrar la función de la IL-17 en varios modelos de artritis reumatoide (Lubberts et al., J. Immunol. 2001,167, 1004-1013; Chabaud et al., Arthritis Res. 2001, 3, 168-177). Adicionalmente, se han usado anticuerpos policlonales neutralizantes para reducir la formación de adhesión peritoneal (Chung et al., 2002, J. Exp. Med., 195, 1471-1478). Anticuerpos de IL-17A anti-humanos derivados de rata se describieron en el documento WO04/106377. Un anticuerpo anti-IL-17A humanizado con una afinidad de aproximadamente 220 pM se describió en el documento WO2006/054059. Un anticuerpo monoclonal anti-IL-17A completamente humano con una afinidad de aproximadamente 188 pM se describió en el documento WO2006/013107.

La solicitud internacional de patente WO2008/001063 describe un anticuerpo anti-IL-17A neutralizante de alta afinidad, el CA048_497. Otros anticuerpos neutralizantes que se unen a IL-17A han sido descritos en WO2007/070750 y WO2007/149032.

Los anticuerpos que se unen a IL-17F y a heterodímeros IL-17A/IL-17F se describieron en el documento WO2006/088833. Los anticuerpos que se unen específicamente al heterodímero IL-17A/IL-17F se describieron en el documento WO2005/010044.

El antagonismo de IL-17F ha sido asociado a la protección frente al asma (Kawaguchi et al., 2006, J.Allergy Clin. Immunol. 117(4): 795-801) y también se cree que la IL-17F desempeña un papel en la patología de la artritis (Lubberts 2003, Current Opinion in Investigational Drugs, 4 (5), 572-577).

Por consiguiente, los antagonistas duales de IL-17A e IL-17F pueden ser más efectivos que un único antagonista para tratar enfermedades mediadas por IL-17. Los anticuerpos que se unen a IL-17A e IL-17F se describieron en el documento WO2007/106769. La solicitud internacional de patente WO2008047134 (fecha de presentación internacional, 18 de octubre de 2007) describe un anticuerpo de alta afinidad, el CA048_496 que se une a IL-17A, IL17F y al heterodímero IL-17A/F humanos, cuya secuencia se proporciona en la presente memoria más adelante.

La presente invención proporciona nuevos epítopos neutralizantes en la IL-17A y la IL-17F, y anticuerpos que se unen a dichos epítopos, y/o interaccionan con ellos.

En una realización, la presente invención proporciona un epítopo neutralizante de la IL-17A que comprende o que consiste en uno o más de los residuos seleccionados del grupo que consiste en SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73, ASP84, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131 de la IL-17A humana (SEQ ID NO: 21).

En una realización, el epítopo neutralizante proporcionado por la presente invención no comprende uno o más de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en ASP80, GLY81 y ASN82 de la IL-17A humana (SEQ ID NO: 21).

La presente invención también proporciona un nuevo epítopo neutralizante de la IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) que comprende o que consiste en los residuos: SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, VAL91, PRO92, GLN94, THR126, PRO127, VAL128.

La presente invención también proporciona un nuevo epítopo neutralizante de la IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) que comprende o consiste en los siguientes residuos: SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, CYS72, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, SER90, VAL91, PRO92, GLN94, THR119, CYS122, VAL125, THR126, PRO127, VAL128.

En una realización, el epítopo neutralizante de la IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) comprende además o consiste además en uno o más, por ejemplo, tres o cuatro, de los siguientes residuos: GLN71, CYS72, ILE86, ASN89, SER90 y VAL128, por ejemplo, de una primera cadena en un dímero de IL17f.

En una realización, el epítopo neutralizante de la IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) comprende además o consiste además en un único resido: ARG47 por ejemplo de una segunda cadena en un dímero de IL17f.

En una realización, el epítopo neutralizante de la IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) comprende además o consiste además en uno o más, por ejemplo, tres o cuatro, de los siguientes residuos: ARG37, SER39, SER41 y ARG47 por ejemplo a partir de una segunda cadena en un dímero de IL17f.

En una realización, el epítopo neutralizante de la IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) comprende además o consiste además en uno o más, por ejemplo, tres o cuatro de los siguientes residuos: ASN33, GLN36, ARG37, SER39, SER41, ARG42, ILE44 y ARG47 por ejemplo a partir de una segunda cadena en un dímero de IL17f.

En una realización, el epítopo neutralizante de la IL-17F comprende además uno o más de los siguientes residuos: ILE129, HIS130, H131, V132, Q133.

En una realización se proporciona uno o más epítopos neutralizantes de IL-17F humana (SEQ ID NO: 22) que comprenden o constan cada uno de forma independiente de los aminoácidos V33 a V38, ambos inclusive, y/o del V87 al Q94, ambos inclusive.

En una realización el epítopo se define como los residuos de aminoácido localizados a 4 Ǻ, 3,5 Ǻ ó 3,0 Ǻ de una entidad de unión, tal como un anticuerpo o fragmento.

También se proporcionan fragmentos de epítopo de IL-17A que pueden usarse, si se requiere, como inmunógenos para obtener anticuerpos neutralizantes que se unen al epítopo neutralizante de la IL-17A. Por ejemplo, los fragmentos de epítopo que comprenden uno o más de los residuos de aminoácido de IL-17A proporcionados antes en la presente memoria, pueden usarse como inmunógeno.

También se proporcionan fragmentos de epítopo de IL-17F que pueden usarse, si se requiere, como inmunógenos para obtener anticuerpos neutralizantes que se unen al epítopo neutralizante de la IL-17F. Por ejemplo, los fragmentos de epítopo que comprenden uno o más de los residuos de aminoácido de IL-17F proporcionados antes en la presente memoria, pueden usarse como inmunógeno.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen a un epítopo neutralizante proporcionado por la presente invención. Cabe destacar que un anticuerpo puede interaccionar directamente, p.ej., mediante unión directa.

Los residuos de los dominios variables de un anticuerpo son numerados convenientemente según un sistema diseñado por Kabal et al. Este sistema se establece en Kabat et al., 1987, en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., NIH, EE.UU. (a partir de ahora, "Kabat et al. (ver anterior)"). En la presente especificación se usa dicho sistema de numeración, a menos que se indique lo contrario.

Las designaciones de residuos de Kabat siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácido. La secuencia de aminoácidos lineal en cuestión puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales respecto a la numeración Kabat estricta, que corresponden a un acortamiento, inserción en un componente estructural, tanto estructura básica como región determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura de dominio variable básica. Para un anticuerpo dado se puede determinar la numeración Kabat de residuos correcta a través del alineamiento de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar".

Las CDRs del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), los residuos 50-65 (CDR-H2) y los residuos 95-102 (CDR-H3) según el sistema de numeración Kabat. Sin embargo, según

Chothia (Chothia, C. y Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el lazo equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Por tanto, 'CDR-H1', tal como se usa en la presente memoria, comprende los residuos 26 a 35, descritos mediante una combinación del sistema de numeración Kabat y la definición de lazo topológica de Chothia.

Las CDRs del dominio de cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), los residuos 50-56 (CDR-L2) y los residuos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración Kabat.

En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a IL-17A e IL-17F. Unión específica significa que los anticuerpos tienen una mayor afinidad por los polipéptidos de IL-17A e IL-17F (incluyendo el heterodímero IL-17A e IL-17F) que por otros polipéptidos. Preferiblemente, los polipéptidos de IL-17A e IL-17F son humanos. En una realización, el anticuerpo también se une a IL-17A y/o IL-17F de mono cynomolgus.

Cuando un anticuerpo de la presente invención se une a IL-17A humana y a IL-17F humana, el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para la CDR-H1, la secuencia dad en la SEQ ID NO: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo neutralizante" describe un anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad de señalización biológica de IL-17A y/o IL-17F y/o el heterodímero IL-17A/F, por ejemplo a través del bloqueo de la unión de IL-17A y/o IL-17F a uno o más de sus receptores, y a través del bloqueo de la unión del heterodímero IL-17A/IL-17F a uno o más de sus receptores. Cabe destacar que el término "neutralizante" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una reducción de la actividad de señalización biológica que puede ser parcial o completa. Adicionalmente, cabe destacar que el grado de neutralización de la actividad de IL17A e IL-17F por un anticuerpo que se une tanto a IL-17A como a IL-17F puede ser el mismo o diferente. En una realización, el grado de neutralización de la actividad del heterodímero IL-17A/IL-17F puede igual o diferente del grado de neutralización de la actividad de IL-17A o IL-17F.

En una realización, la invención proporciona anticuerpos que se unen y/o interaccionan con un epítopo neutralizante de IL-17A proporcionado por la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humana que se une a un epítopo de IL-17A humana que comprende o consiste en uno o más de los residuos seleccionados del grupo que consiste en SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73, ASP84, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131 de la IL-17A humana (SEQ ID NO: 21).

En una realización, un anticuerpo de la presente invención no se une a uno o más, p.ej., dos o más, de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en ASP80, GLY81 y ASN82 de la IL-17A humana (SEQ ID NO: 21).

En una realización, un anticuerpo de la presente invención no se une a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en ASP80, GLY81, ASN82 y VAL83 de IL-17A humana (SEQ ID NO: 21).

En una realización, un anticuerpo de la presente invención no se une a ninguno de los siguientes residuos de aminoácido, ASP80, GLY81 y ASN82 de la IL-17A humana (SEQ ID NO: 21).

En una realización, la invención proporciona anticuerpos que se unen y/o interaccionan con un epítopo neutralizante de IL-17F proporcionado por la presente invención.

Por consiguiente, en una realización la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL17F humana que se une a un epítopo de IL-17F humana que comprende uno o más, p.ej., tres o más, p.ej., cinco o más, p.ej., diez o más, de los siguientes residuos: SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, VAL91, PRO92, GLN94, THR126, PRO127, VAL128 de la SEQ ID NO: 22 (IL-17F).

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17F humana que se une a un epítopo de IL-17F humana dentro de una o más de las siguientes regiones:

(i)

39-42 (SER39, MET40, SER41, ARG42)

(ii)

47 (ARG47)

(iii) 53 (ASN53)

(iv)

72-75 (CYS72, ARG73, ASN74, LEU75)

(v)

83-92 (LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, SER90, VAL91, PRO92)(vi) 94 (GLN94)

(vii) 119 (THR119)

(viii) 122 (CYS122)

(ix) 125-128 (VAL125, THR126, PRO127, VAL128).

En una realización, un anticuerpo de la presente invención se une a IL-17A humana y a IL-17F humana.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención se une al heterodímero IL-17A/F humano.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención se une a IL-17A humana y al heterodímero IL-17A/F humano. En una realización, un anticuerpo de la presente invención se une a IL-17F humana y al heterodímero IL-17A/F humano. En una realización preferida, un anticuerpo de la presente invención se une a IL17A humana, a IL17F humana y al heterodímero IL-17A/F humano.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humana y a IL-17F humana que se une a un epítopo de IL-17A humana que comprende ASN52 y ASP84 de la SEQ ID NO: 21 (IL-17A) y opcionalmente uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, HIS54, ARG72, HIS73, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131, donde el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A y a IL-17F humanas que se une a un epítopo de IL-17F humano que comprende uno o más de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, VAL91, PRO92, GLN94, THR126, PRO127 y VAL128 de IL-17F humana (SEQ ID NO: 22), donde el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humana y a IL-17F humana que se une a un epítopo de IL-17F humana dentro de una o más de las siguientes regiones:

(i)

39-42 (SER39, MET40, SER41, ARG42)

(ii)

47 (ARG47)

(iii) 53 (ASN53)

(iv)

72-75 (CYS72, ARG73, ASN74, LEU75)

(v)

83-92 (LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, SER90, VAL91, PRO92)

(vi)

94 (GLN94)

(vii) 119 (THR119)

(viii) 122 (CYS122)

(ix) 125-128 (VAL125, THR126, PRO127, VAL128).

donde el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A e IL-17F humanas que se une a un epítopo de IL-17A humana que comprende uno o más de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73, ASP84, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131 de IL-17A humana (SEQ ID NO: 21) y que se une a un epítopo de IL-17F humana que comprende uno o más de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, VAL91, PRO92, GLN94, THR126, PRO127 y VAL128 de IL-17F humana (SEQ ID NO: 22), donde el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la

SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención que es capaz de unirse tanto a IL-17A como a IL-17F es capaz de neutralizar la actividad de ambas isoformas de IL-17. En particular, en una realización un anticuerpo de la presente invención es capaz de unirse específicamente tanto a IL-17A como a IL-17F, es decir, el anticuerpo no se une a otras isoformas de IL-17. Preferiblemente, un anticuerpo de la presente invención también se une al heterodímero IL-17A/IL-17F. Preferiblemente, un anticuerpo de la presente invención neutraliza la actividad tanto de IL-17A como de IL-17F. En una realización, un anticuerpo de la presente invención también neutraliza la actividad del heterodímero IL-17A/IL-17F. Los anticuerpos proporcionados por este aspecto de la presente invención tienen, por tanto, la propiedad favorable de que pueden inhibir la actividad biológica tanto de IL-17A como de IL-17F. Por consiguiente, la presente invención también proporciona el uso de dichos anticuerpos en el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad mediada por IL-17A ó IL-17F, o por ambas, tal como una enfermedad autoinmune o inflamatoria o cáncer.

Los polipéptidos de IL-17A ó IL-17F, o una mezcla de los dos, o células que expresen uno o ambos polipéptidos, pueden usarse para producir anticuerpos que reconozcan específicamente uno o ambos polipéptidos. Los polipéptidos de IL-17 (IL-17A e IL-17F) pueden ser polipéptidos "maduros" o fragmentos o derivados biológicamente activos de los mismos, que preferiblemente incluyen el sitio de unión a receptor. Preferiblemente, los polipéptidos de IL-17 son los polipéptidos maduros proporcionados en las SEQ ID NO: 21 y 22 para IL-17A e IL-17F, respectivamente. Los polipéptidos de IL-17 pueden prepararse mediante procesos bien conocidos en la técnica a partir de células hospedantes modificadas genéticamente que comprenden sistemas de expresión, o pueden recuperarse de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Éstos se usan de manera indistinta a menos que se especifique lo contrario. El polipéptido de IL-17 en algunos casos puede formar parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión, por ejemplo fusionado a una etiqueta de afinidad. Se pueden obtener anticuerpos generados contra estos polipéptidos, cuando sea necesaria la inmunización de un animal, mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos rutinarios bien conocidos, véase por ejemplo "Handbook of Experimental Immunology", D. M. Weir (ed.), Vol. 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, tal como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas o cerdos. Sin embargo, generalmente se prefieren los ratones, los conejos, los cerdos y las ratas.

Los anticuerpos para uso en la presente invención incluyen anticuerpos completos y fragmentos o derivados de los mismos funcionalmente activos, y pueden ser, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, multivalentes, multiespecíficos, completamente humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de dominio, p.ej., VH, VL, VHH, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y F(ab')2 y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores. Otros fragmentos de anticuerpo incluyen los descritos en las Solicitudes Internacionales de Patente WO2005003169, WO2005003170 y WO2005003171. Los fragmentos de anticuerpo y los métodos para producirlos son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181; Adair y Lawson, 2005. Therapeutic antibodies. Drug Design Reviews -Online 2(3): 209-217.

Los anticuerpos para uso en la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier clase (p.ej., IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si los hay, pueden seleccionarse en relación a la función propuesta para la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanas. En particular, se pueden usar los dominios de región constante de IgG humana, especialmente los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo se destina a usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras. Alternativamente, se pueden usar los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo se destine a propósitos terapéuticos y no se requieran funciones efectoras de anticuerpo, p.ej., simplemente para bloquear la actividad de IL-17. Cabe destacar que también se pueden usar variantes de secuencia de dichos dominios de región constante. Por ejemplo, se pueden usar moléculas de IgG4 en las que la serina de la posición 241 ha sido cambiada por prolina, tal como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. El dominio constante de IgG4 que comprende dicho cambio es particularmente preferido. Los especialistas en la técnica también comprenden que los anticuerpos pueden verse sometidos a una serie de modificaciones post-traduccionales. El tipo y el grado de dichas modificaciones a menudo dependen de la línea celular hospedante utilizada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, la oxidación de metionina, la formación de dicetopiperacina, la isomerización de aspartato y la desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (tal como se describe en Harris, R.J. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse empleando cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de hidridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de

célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) y la técnica de hibridoma-EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos para uso en la invención también pueden ser generados usando métodos de anticuerpo de linfocito sencillo mediante clonación y expresión de ADNcs de región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos sencillos seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 y la Solicitud de Patente Internacional número WO2004/106377.

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo procedentes de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de especies no humanas y una región estructural de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, p.ej. la Patente de EE.UU. nº 5.585.089; y la Solicitud de Patente Internacional WO91/09967).

Los anticuerpos quiméricos son aquellos anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina que han sido modificados genéticamente de tal modo que los genes de cadena ligera y pesada están compuestos por segmentos de genes de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies. Estos anticuerpos quiméricos probablemente son menos antigénicos. Se pueden preparar anticuerpos bivalentes empleando métodos conocidos en la técnica (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659). Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos (véase por ejemplo los documentos WO 92/22853 y WO05/113605).

Los anticuerpos para uso en la presente invención también pueden generarse mediante diversos métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica y que incluyen los descritos por Brinkman et al. (en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187: 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) y las solicitudes internacionales de patente WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de EE.UU. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108. También se pueden adaptar técnicas de producción de anticuerpos de cadena sencilla, como las descritas en la patente de EE.UU. nº 4.946.778 para producir anticuerpos de cadena sencilla que se unan a IL-17A e IL-17F. Asimismo, se pueden usar ratones transgénicos, u otros organismos transgénicos, que incluyen a otros mamíferos transgénicos, para expresar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (si las hay) tanto de las cadenas pesadas como de las ligeras son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos por ejemplo a través de los métodos de presentación de fagos descritos antes, y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de región variable y constante de inmunoglobulina de ratón han sido reemplazados por sus contrapartidas humanas, p.ej., tal como se describe en términos generales en el documento EP0546073 B1, en las patentes de EE.UU. 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 y 5.770.429, y en los documentos EP 0438474 B1 y EP0463151 B1.

Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para determinar los residuos ligados por un anticuerpo proporcionado por la presente invención, p.ej., intercambio hidrógeno-deuterio, mutagénesis sito-dirigida, espectrometría de masas, RMN y cristalografía de rayos X. Véanse, por ejemplo, los métodos descritos en la solicitud de patente internacional WO2007/149032.

La región específica o epítopo del polipéptido de IL-17A humana y/o la región específica o epítopo del polipéptido de IL-17F humana y/o la región específica o epítopo del heterodímero IL-17A/F humano puede identificarse mediante cualquier método de mapeo de epítopos conocido en la técnica en combinación con uno cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de dichos métodos incluyen péptidos de escrutinio de longitudes variables derivados de IL-17A e IL-17F para unirse al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que pueda unirse específicamente al anticuerpo que contiene la secuencia del epítopo reconocido por el anticuerpo. Los péptidos de IL-17 pueden producirse sintéticamente o mediante digestión proteolítica del polipéptido de IL-17 apropiado. Los péptidos que se unen al anticuerpo pueden identificarse, por ejemplo, mediante análisis de espectrometría de masas. En otro ejemplo, se puede usar espectroscopía de RMN, tal como se describe en los Ejemplos de la presente memoria, para identificar residuos que interaccionen con un anticuerpo de la presente invención.

Las moléculas de anticuerpo neutralizante proporcionadas por la presente invención preferiblemente presentan una elevada afinidad de unión, preferiblemente nanomolar, incluso más preferiblemente picomolar. Cabe destacar que la afinidad de unión de un anticuerpo de acuerdo a la presente invención por IL-17A humana puede ser diferente de la afinidad de unión del mismo anticuerpo por IL-17F y/o el heterodímero IL-17A/F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17A que es superior a su afinidad por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17A que es al menos 10 veces más grande que su afinidad de unión por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención

tiene una afinidad por IL-17A que es al menos 50 veces más grande que su afinidad de unión por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17A que es al menos 100 veces más grande que su afinidad de unión por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17F que es superior a su afinidad por IL-17A. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17A que es igual a su afinidad por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad picomolar por IL-17A y una afinidad nanomolar por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad nanomolar por IL-17F y una afinidad picomolar por IL-17A. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad nanomolar tanto por IL-17A como por IL-17F. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad picomolar tanto por IL-17A como por IL-17F.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17A mejor que 10 nM. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17A mejor que 500 pM. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17A mejor que 100 pM. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17A mejor que 20 pM.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17F mejor que 10 nM. En una realización, el anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17F mejor que 2 nM. En una realización, el anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad por IL-17F mejor que 500 pM. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17F mejor que 100 pM.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por el heterodímero IL-17A/F mejor que 10 nM. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por el heterodímero IL-17A/F mejor que 500 pM. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por el heterodímero IL-17A/F mejor que 100 pM.

En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión por IL-17F de cynomolgus mejor que 2 nM.

Cabe destacar que la afinidad de anticuerpos proporcionados por la presente invención puede alterarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, que presentan una afinidad mejorada por IL-17A y/o IL17F. Dichas variantes se pueden obtener a través de una serie de protocolos de maduración de afinidad que incluyen la mutación de las CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), el barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), el barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), la presentación de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y la PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (ver anterior) discuten estos métodos de maduración de afinidad.

En una realización, las moléculas de anticuerpo de la presente invención neutralizan la actividad de IL-17A e IL-17F, por ejemplo, en los ensayos in vitro descritos en los Ejemplos. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad por IL-17A e IL-17F humanas, que es capaz de inhibir la actividad de 0,8 nM de IL-17A humana en un 50% a una concentración inferior a 5 nM, y la actividad de 4,2 nM de IL-17% en un 50% a una concentración inferior a 12 nM, siendo medida dicha actividad inhibidora a través de la liberación de IL-6 inducida por IL-17A ó IL-17F en células Hela. En una realización, la concentración de anticuerpo que inhibe IL-17A en un 50% es inferior a 3 nM. En una realización, la concentración de anticuerpo que inhibe IL-17F en un 50% es inferior a 11 nM. En una realización, la IL-17A humana y la IL-17F humanas utilizadas en el ensayo son IL-17A e IL-17F humanas recombinantes. En una realización, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo humanizado o completamente humano.

Si se desea, un anticuerpo para uso en la presente invención puede conjugarse con una o más moléculas efectoras. Cabe destacar que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más de dichas moléculas ligadas de tal modo que forman un único grupo funcional que puede unirse a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desea obtener un fragmento de anticuerpo ligado a una molécula efectora, éste se puede preparar mediante procedimientos químicos o de recombinación de ADN estándares de ADN en los que el fragmento de anticuerpo se liga directamente o a través de un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar dichas moléculas efectoras a anticuerpo son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2ª Ed., Robinson et al., eds., 1987, pág. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev.,

62: 119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos concretos incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO03031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlace puede obtenerse usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo tal como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745.

El término molécula efectora tal como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p.ej., ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden ser detectados mediante espectroscopía de RMN o ESR.

Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células (p.ej., que las mate). Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos.

Las moléculas efectoras también incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (p.ej., metotrexato, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbacina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) u lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p.ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p.ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas), y agentes anti-mitóticos (p.ej., vincristina y vinblastina).

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Wolframio188/Renio188; o fármacos tales como, aunque sin limitación, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, aunque sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, aunque sin limitación, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria, una proteína tal como la insulina, factor de necrosis tumoral, interferón α, interferón β, factor de crecimiento de nervio, factor de crecimiento derivado de plaqueta o activador de plasminógeno de tejido, un agente trombótico o un agente anti-trombótico, p.ej., angioestatina o endoestatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfoquina, interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), factor estimulante de colonia de macrófago granulocito (GM-CSF), factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF), factor de crecimiento de nervio (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles por ejemplo en diagnosis. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radioactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía de emisión de positrones), e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase de forma general la Patente de EE.UU. nº 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como elementos diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o acetilcolinaesterasa; los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficocoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y acuorina; y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.

En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar la administración de un anticuerpo a través de la barrera epitelial al sistema inmune. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, en general, puede ser un polímero sintético o un polímero natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada sustituido opcionalmente, o un polisacárido ramificado o sin ramificar, p.ej., un homo-o hetero-polisacárido.

Los sustituyentes particulares que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados antes incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(vinilalcohol) sustituidos opcionalmente, de cadena lineal o ramificada, o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) sustituido opcionalmente, tal como metoxipoli (etilenglicol) o sus derivados.

Los polímeros naturales incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno, o derivados de los mismos.

"Derivados" tal como se usa en la presente memoria pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido directamente o a través un segmento ligando al polímero. Cabe destacar que el residuo de dicho grupo en algunos casos formará parte del producto, como grupo de unión entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero se puede variar según se desee, pero generalmente se encontrará en un rango de peso molecular medio de 500 Da a 50000 Da, preferiblemente entre 5000 y 40000 Da y más preferiblemente entre 20000 y 40000 Da. En particular, el tamaño del polímero se puede seleccionar en base al uso pretendido para el producto, por ejemplo, la capacidad para localizarse en determinados tejidos tales como tumores o extender la vida media en circulación (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por tanto, por ejemplo, cuando el producto se destine a abandonar la circulación y penetrar en un tejido, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de bajo peso molecular, por ejemplo con un peso molecular en torno a 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en circulación, puede ser ventajoso usar un peso molecular de polímero mayor, por ejemplo que tenga un peso molecular en el rango de 20000 Da a 40000 Da.

Los polímeros particularmente preferidos incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el rango entre aproximadamente 15000 Da y aproximadamente 40000 Da.

En un ejemplo, los anticuerpos para uso en la presente invención están unidos a grupos funcionales de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden estar unidas a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal disponible localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo libre de tipo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo. Dichos aminoácidos puede existir de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden diseñarse en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véase por ejemplo la patente de EE.UU. nº 5.219.996; la patente de EE.UU. nº 5.667.425; la solicitud internacional de patente WO98/25971). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en el que la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Preferiblemente, los aminoácidos adicionales forman una región de bisagra modificada que contiene uno o más residuos de cisteína a los que se puede unir la molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.

Preferiblemente, las moléculas de PEG se unen covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar ligada covalentemente al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. El enlace covalente generalmente será un enlace de disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de unión se pueden usar moléculas efectoras activadas apropiadamente, por ejemplo derivados selectivos para tiol tales como maleimidas y los derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como los descritos anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo tiol tal como un éster o ácido α-halocarboxílico, p.ej. yodoacetamida, una imida, p.ej., maleimida, una vinil sulfona o un disulfuro. Dichos materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo en Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando procedimientos químicos convencionales. Moléculas de PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible en Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible en Nektar, anteriormente Shearwater).

En una realización, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado que está PEGilado, es decir, que tiene un PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente, p.ej., según el método descrito en el documento EP 0948544 [véase también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds.), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. En un ejemplo, el PEG se une a una cisteína en la región de bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un único grupo tiol en una región de bisagra modificada. Se puede unir covalentemente un residuo de lisina a un grupo maleimida, y cada uno de los grupos amina del residuo de lisina se puede unir a un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tenga un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. Por lo tanto, el peso molecular total del PEG unido al fragmento de Fab puede ser aproximadamente de 40.000 Da.

En una realización, una molécula de anticuerpo neutralizante de la presente invención es un fragmento Fab modificado que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de bisagra modificada que contiene al menos un residuo de cisteína al cual se une la molécula efectora. Preferiblemente, la molécula efectora es PEG y se ha unido mediante métodos descritos en los documentos WO98/25971 y WO2004072116, en los que un grupo lisil-maleimida se une a un residuo de cisteína del extremo C-terminal de la cadena pesada, y cada grupo amino del

residuo de lisilo tiene unido un residuo de metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al anticuerpo, por tanto, es de aproximadamente 40.000 Da.

En otro ejemplo, las moléculas efectoras pueden unirse a fragmentos de anticuerpo usando los métodos descritos en las solicitudes internacionales de patente WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171.

La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la(s) cadena(s) pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o la cadena ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido mediante procesado químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.

Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse mediante métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican para una parte o para la totalidad de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo pueden sintetizarse según se desee a partir de determinadas secuencias de ADN, o en base a las correspondientes secuencias de aminoácidos.

El ADN que codifica para secuencias estructurales aceptoras está ampliamente disponible para los especialistas en la técnica, y se puede sintetizar fácilmente en base a sus secuencias de aminoácidos conocidas.

Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o parcialmente usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden usar técnicas de mutagénesis sito-dirigida y de reacción en cadena de polimerasa (PCR), según sea apropiado.

La presente invención también se refiere a un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el vector de clonación o de expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente.

Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los especialistas en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y al "Maniatis Manual" producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula hospedante que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Se puede usar cualquier célula hospedante/sistema de vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, o también se pueden usar sistemas de expresión de células hospedantes eucarióticas, por ejemplo de mamífero. Las células hospedantes de mamífero adecuadas incluyen las células CHO, de mieloma o de hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo según la presente invención que comprende cultivar una célula hospedante que contenga un vector de la presente invención en las condiciones adecuadas que conduzcan a la expresión de proteína a partir de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso solo es necesario usar una secuencia codificadora de polipéptido de cadena pesada o ligera para transfectar las células hospedantes. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede ser transfectada con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un único vector, vector que incluye secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Puesto que los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo según la presente invención para la fabricación de un medicamento. Habitualmente, la composición se suministrará como parte de una composición farmacéutica esterilizada que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención adicionalmente puede comprender un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo de la composición farmacéutica o diagnóstica o puede estar acompañada de otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo anticuerpos anti-TNF, anti-IL-1β, anti-células T, anti-IFNy o anti-LPS, o ingredientes que no sean anticuerpos tales como xantinas.

Las composiciones farmacéuticas preferiblemente comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, aliviar o prevenir una enfermedad

o afección diana, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a través de ensayos de cultivo o en modelos de animales, habitualmente de roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo de animal también se puede usar para determinar el rango de concentraciones apropiado y la ruta de administración apropiada. A continuación dicha información puede usarse para determinar dosis y rutas que tengan éxito para administración en humanos.

La cantidad terapéuticamente precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, de la salud general del sujeto, de la edad, el peso y el género del sujeto, de la dieta, del tiempo y frecuencia de administración, de combinación(es) de fármacos, de sensibilidades a reacción y de la tolerancia/respuesta a la terapia. Dicha cantidad puede determinarse mediante experimentación rutinaria y se encuentra dentro del criterio del médico. De forma general, una cantidad terapéuticamente efectiva estará entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, preferiblemente entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse de forma conveniente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (p.ej., simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección a tratar, del grado de inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo está siendo usada profilácticamente o para tratar una afección existente.

La frecuencia de dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (p.ej., de 2 a 10 horas) puede ser necesario suministrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media larga (p.ej., de 2 a 15 días) puede que solo sea necesario administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 ó 2 meses.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debería inducir por sí mismo la producción de anticuerpo dañinos para el individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables de composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, salino, glicerol y etanol. Adicionalmente, en dichas composiciones puede haber presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes de pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes y suspensiones, para ingestión por parte del paciente.

Las formas preferidas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, p.ej., mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección de bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, una disolución o una emulsión en un vehículo oleaginoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede encontrarse en forma seca, para su reconstitución antes de ser usada con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, es preferible que las composiciones se adapten para la administración a sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a través de una serie de rutas que incluyen, aunque sin limitación, las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal,

intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipoesprays para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, como disoluciones líquidas o como suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.

La administración directa de las composiciones generalmente se realizará mediante inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o se administrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosis puede ser un calendario de dosis única o un calendario de dosis múltiples.

Cabe destacar que el ingrediente activo de la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición va a ser administrada a través de una ruta que use el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo frente a la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez absorbido del tracto gastrointestinal.

Se puede encontrar una discusión exhaustiva de vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

También se contempla que el anticuerpo de la presente invención se administre mediante uso de terapia génica. A fin de llevar esto a cabo, se introducen secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados en un paciente de tal modo que las cadenas del anticuerpo se expresen a partir de las secuencias de ADN y se ensamblen in situ.

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo para uso en el control de enfermedades inflamatorias. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo puede usarse para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio.

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL-17A y/o IL-17F, o que está asociado a un aumento del nivel de IL-17A y/o IL-17F. Preferiblemente, la afección patológica se selecciona del grupo que consiste en infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choques endotóxicos asociados a una infección, artritis, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celiaca, enfermedad de la vesícula viliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, soriasis, vasculitis, adhesiones quirúrgicas, apoplejía, diabetes de tipo I, artritis de Lyme, meningoencefalitis, trastornos inflamatorios mediados inmunitariamente del sistema nervioso central y periférico, tal como la esclerosis múltiple y el síndrome de Guillain-Barr, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugía), enfermedad injerto-versus-hospedante, rechazo de trasplante, cáncer (tanto tumores sólidos como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, cánceres de células transicionales, cánceres de ovario y malignidades hematológicas, y en particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielogena crónica, cáncer gástrico y cáncer de colon), enfermedad del corazón que incluye enfermedades isquémicas tales como el infarto de miocardio, así como la aterosclerosis, la coagulación intravascular, la resorción ósea, la osteoporosis, la periodontitis y la hipocloridia.

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo según la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis del dolor.

La presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo según la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL17A y/o IL-17F o que está asociado a un aumento del nivel de IL-17A y/o IL-17F. Preferiblemente, el trastorno patológico es artritis reumatoide o esclerosis múltiple.

La presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo según la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis del dolor.

Una molécula de anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en cualquier terapia en la que se desee para reducir los efectos de la IL-17A y/o de la IL-17F en el cuerpo del humano o animal. La IL-17 A y/o la IL-17F pueden estar en circulación por el organismo o pueden estar presentes en un nivel indeseadamente elevado localizadas en un sitio particular del organismo, por ejemplo en una zona de inflamación.

Una molécula de anticuerpo según la presente invención se usa preferiblemente para el control de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune o cáncer.

La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen, o que están en riesgo de padecer, un trastorno mediado por IL-17A y/o IL-17F, método que comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo de la presente invención.

También se puede usar una molécula de anticuerpo según la presente invención en diagnosis, por ejemplo en la

diagnosis in vivo, y en la obtención de imágenes de estados de enfermedad que impliquen IL-17A y/o IL-17F. La presente invención se describe adicionalmente simplemente a modo de ilustración a través de los siguientes ejemplos, que se refieren a las Figuras acompañantes, en las que:

Figura: 1 a) Región V de cadena ligera del anticuerpo CA028_0496 (SEQ ID NO: 7) b) Región V de cadena pesada del anticuerpo CA028_0496 (SEQ ID NO: 9) c) CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ

ID NO: 5), CDRL3 (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo CA028_496. d) Cadena ligera del anticuerpo CA028_496 (SEQ ID NO: 11). e) Cadena pesada del anticuerpo CA028_496 (SEQ ID NO: 15). f) ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo CA028_496 que incluye la secuencia señal (SEQ ID NO: 14). g) ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo CA028_496 que incluye la secuencia señal (SEQ ID NO: 18) h) IL-17A madura humana. i) IL-17F madura humana. Figura 2 a) Efecto del anticuerpo CA028_0496 (designado como Ab#496 en la leyenda) sobre la producción de IL-6 inducida

por IL-17 humana a partir de células Hela. b) Efecto del anticuerpo CA028_0496 (designado como Ab#496 en la leyenda) sobre la producción de IL-6 inducida por IL-17F humana a partir de células Hela.

Manipulaciones de ADN y métodos generales

Se usó la cepa de E. coli INVαF' (Invitrogen) para la transformación y el crecimiento de cultivo rutinario. Las enzimas de restricción y modificación de ADN fueron obtenidas en Roche Diagnostics Ltd. y en New England Biolabs. Las preparaciones de plásmidos se realizaron usando kits de purificación Maxi Plasmid (QIAGEN, nº de catálogo 12165). Las reacciones de secuenciamiento de ADN se llevaron a cabo usando el kit de secuenciamiento ABI Prism Big Dye terminator (nº de catálogo 4304149) y se pasaron por un secuenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems). Los datos fueron analizados usando el programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Los oligonucleótidos fueron obtenidos de Invitrogen. La concentración de IgG se determinó usando ELISA de ensamblaje de IgG.

Isoformas de IL-17

La IL-17A y la IL-17F recombinantes fueron adquiridas en R&D Systems.

El heterodímero IL-17A/F recombinante fue producido uniendo IL-17A e IL-17F usando un ligando GS. El heterodímero presentó la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 19)

IL-17F recombinante de cynomolgus (SEQ ID NO: 20)

La secuencia de ADN que codifica el heterodímero IL-17A/F se sintetizó químicamente mediante Entelechon GmbH y se subclonó en pET43.1a en los sitios Ndel/XhoI.

La secuencia de ADN que codifica L-17F de cynomolgus se amplificó mediante PCR usando cebadores que introdujeron sitios de restricción NdeI y XhoI. Los productos PCR fueron ligados en pCR4Blunt-TOPO y la secuencia se verificó antes de la digestión y la ligación en los sitios NdeI/XhoI.

Se usó ADN de pET43.1a que codifica isoformas de IL-17 para transfectar células BL21(DE3) y se cultivó clones seleccionados resistentes a carbenicilina a 37°C durante una noche en medio de cultivo 2TY que contenía un 2% de glucosa y 50 µg/mL de carbenicilina. A continuación los cultivos fueron diluidos y cultivados en el mismo medido hasta DO600 de 0,5-0,7, inducidos con IPTG 1 mM y cultivados a 37ºC durante otras 4-5 horas.

Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y a partir de las células se prepararon cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en Tris-HCl 50 mM, hidrocloruro de guanidinio 5 M, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, glutationa reducida 2 mM, glutationa oxidada 0,2 mM, pH 8.5. La proteína de IL-17 se replegó mediante adición gota a gota de la proteína solubilizada al tampón anterior sin hidrocloruro de guanidinio, con agitación vigorosa. Se eligió el volumen final de tal modo que la concentración final de proteína no fuera superior a 0,1 mg/mL.

La disolución de proteína replegada se concentró si era necesario, antes del cambio de disolución tampón por MES 10 mM, pH 6. A continuación se aplicó la proteína a una columna de Sepharose SP HP equilibrada con MES 20 mM, pH 6. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM en MES pH 6 a lo largo de 10 volúmenes de columna. Para la IL-17F, el gradiente se extendió a NaCl 600 mM. A fin de purificar adicionalmente la IL-17, se reunió la fracción relevante procedente de la columna de Sepharose SP HP, se concentró y se diluyó con CAPSO 20 mM (pH 10) y se aplicó a una columna Mono Q equilibrada con CAPSO 20 mM. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-250 mM en CAPSO 20 mM a lo largo de 20 volúmenes de columna. Se agruparon las fracciones que contenían IL-17 y se neutralizaron usando MES 1 M pH 6.

Ejemplo 1: Producción de un anticuerpo neutralizante anti-IL-17

Se inmunizaron ratas Sprague Dawly hembras con IL-17 recombinante humana (adquirida en R & D systems). Las ratas recibieron cuatro inmunizaciones de 20 µg de IL-17 en 100 µL de adyuvante de Freund. El anticuerpo 225, que se une a IL-17 humana, fue aislado usando los métodos descritos en el documento WO04/051268. Los genes correspondientes al dominio variable de cadena pesada (VH) y al dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo 225 fueron aislados y secuenciados tras clonación vía PCR de transcripción inversa.

Se diseñó una serie de regiones VL y VH humanizadas usando estructuras aceptoras de región V y variando el número de residuos donantes de las regiones estructurales. Se diseñaron ocho regiones VL ancladas (gL 1-8) y 9 regiones VH ancladas (gH 1-9) y se construyeron los genes mediante ensamblaje de oligonucleótidos y mutagénesis de PCR.

Las secuencias ancladas a la cadena ligera fueron subclonadas en el vector de expresión de cadena ligera humano pKH10.1, que contiene el ADN que codifica la región constante C-Kappa humana (alotipo Km3). Las secuencias ancladas a cadena pesada fueron subclonadas en el vector de expresión gamma-4 humano pVhg4P FL, que contiene el ADN que codifica la región constante gamma-4 humana que contiene la mutación estabilizadora de bisagra S241P (Angal et al., ver antes). Los plásmidos fueron co-transfectados en células CHO y los anticuerpos producidos fueron sometidos a escrutinio en relación a su actividad en la unión a IL-17 y en ensayos de neutralización. Las transfecciones de células CHO se llevaron a cabo usando el procedimiento de Lipofectamine™ 2000 siguiendo las instrucciones del fabricante (InVitrogen, nº de catálogo 11668).

El injerto óptimo en base a la expresión, la afinidad y la potencia de neutralización (gL7gH9) fue seleccionado y designado como CA028_0496 (también denominado en la presente memoria 496). Las secuencias de la región V de dicho anticuerpo se muestran en la Figura 1 (a) y (b) y en las SEQ ID NO: 7 y 9 para la cadena ligera (gL7) y la cadena pesada (gH9) respectivamente.

La estructura aceptora de cadena pesada es la secuencia de línea germinal humana VH3 1-3 3-07 procediendo la estructura 4 de esta porción de la línea germinal JH4 de región JH humana. La estructura aceptora de cadena ligera es la secuencia de línea germinal humana VK1 2-1-(1) L4, procediendo la estructura 4 de esta porción de la línea germinal JK1 de región JK humana.

Ejemplo 2: El anticuerpo CA028 0496 neutraliza la IL-17 y la IL-17F y el heterodímero IL-17A/F

Células Hela

Se evaluó la potencia del anticuerpo CA028_0496 frente a IL-17 recombinante humana y frente a IL-17F recombinante humana en células Hela y se comparó con el anticuerpo CDP435 (WO06/054059). Las células Hela fueron obtenidas en el banco de células de ATCC (ATCC CCL-2). Las células fueron cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de ternero fetal, penicilina, gentamicina y glutamina. Se llevaron a placa 1x104 células en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Las células fueron incubadas durante una noche y se lavaron una vez con tampón de ensayo. Tanto la IL-17A humana (25 ng mL-1) como la IL-17F humana (125 ng mL-1) fueron incubadas en presencia de una concentración fija de TNF-α humano, dicha mezcla fue preincubada con anticuerpo CA028_0496 o con anticuerpo CDP435. A continuación se

añadió la citoquina más el anticuerpo a las células Hela, que se incubaron durante una noche. La producción de IL-6 en el sobrenadante del cultivo celular fue proporcional a la cantidad de IL-17A/IL-17F añadida a las células. Los niveles de IL-6 humana se midieron mediante ELISA y se cuantificaron por comparación con concentraciones patrón conocidas de IL-6 humana.

Los datos (Figuras 2a y 2b) indican que CA028_0496 neutralizó de manera potente la IL-17A recombinante humana y también presentó algo de actividad frente a IL-17F humana. Los datos de estos experimentos indicaron que el anticuerpo CA028_0496 dio lugar a una IC50 de 43 ng/mL frente a IL-17 recombinante humana (25 ng·mL-1) y de 1477 ng/mL frente a IL-17 F recombinante (125 ng·mL-1). Por consiguiente, el anticuerpo CA028_0496 dio lugar a una IC50 de 0,29 M frente a IL-17 recombinante humana (0,78 nM) y de 10,18 nM frente a IL-17F recombinante humana (4,16 nM) en este ensayo (cálculo basado en IgG suponiendo un peso molecular de 145.000 como IgG4 promedio y suponiendo que la IL-17A y la IL-17F son dímeros).

Células de microglía humanas

Se llevaron a placa células de microglía humanas (TCS Cellworks) en una placa de 96 pocillos de fondo plano en una concentración de 5.000 células por pocillo en un volumen total de 100 µL y se dejaron durante 24 horas para que se unieran al plástico. En ese momento, se añadieron a los pocillos por triplicado valoraciones (5, 1, 0,2 y 0,04 µg/mL) de IL-17A recombinante humana, de IL-17F recombinante humana, de IL-17F recombinante de cynomolgus y de heterodímero IL-17A/F recombinante humano, en presencia y en ausencia de 10 ng/mL de TNFα recombinante humano. Los pocillos de control no contenían estimulación, contenían solo IL-17A (q00 ng/mL), contenían solo TNFα, y contenían IL-17A y TNFα juntos. Todas las citocinas se añadieron en un volumen total de 110 µL/pocillo, dando lugar a un volumen total de 210 µL. En los experimentos que implicaban anticuerpos, las células se llevaron a placa de forma similar. Transcurridas 24 horas, se añadieron los anticuerpos y las citocinas al mismo tiempo para generar las concentraciones finales fijadas en un volumen final de 200 µL.

Tras otras 24 horas adicionales de incubación a 37ºC, los sobrenadantes fueron recolectados y congelados a -20ºC hasta ser analizados. Para el análisis, los sobrenadantes fueron diluidos 1/10 y se midieron para determinar la IL-6 usando un kit MSD de IL-6 humana, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se observó que todas las isoformas de IL-17 evaluadas eran activas en el ensayo, particularmente en presencia de TNFα.

La potencia del anticuerpo CA028_0496 frente a IL-17A recombinante humana e IL-17F recombinante humana, IL17F recombinante de cynomolgus y heterodímero de IL-17A/F recombinante humano, en células de microglía humanas, fue evaluada en presencia de TNFα y se comparó con un anticuerpo de control y un anticuerpo específico de IL-17A usando el método descrito anteriormente.

El anticuerpo de control no tuvo efecto sobre la actividad de ninguna de las citocinas evaluadas. El anticuerpo CA028_0496 presentó actividad de inhibición frente a las tres citocinas IL-17, IL-17F e IL-17A/F, incluyendo la IL-17F de cynomolgus, mientras que el anticuerpo específico de IL-17A solo presentó actividad de inhibición frente a IL-17A y el heterodímero IL-17A/F.

Ejemplo 3: Afinidad del anticuerpo CA028 0496 (regiones constantes de IgG4 humana) por IL-17A e IL-17F

Se llevaron a cabo análisis BIA (Análisis de Interacción Biomolecular) usando un Biacore 3000 (BiacoreAB).

Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25ºC. Se inmovilizó IgG anti-humana de cabra de fragmento Fc Affinipure, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en un chip sensor CM5 empleando química de acoplamiento vía grupo amino hasta un nivel de captura de ≈6000 unidades de respuesta (RUs). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% de Surfactante P20, Biacore AB) como tampón de elución con un caudal de 10 µL/min. Se usó una inyección de 10 µL de anticuerpo CA028_0496 (1,81 mg/mL) para la captura por la IgG-Fc anti-humana inmovilizada. Las isoformas de IL-17A e IL-17 humanas fueron valoradas sobre el CA028_0496 capturado a diluciones dobles desde 50 nM hasta sub nM con un caudal de 30 µL/min. La superficie se regeneró mediante inyecciones de 30 µL de HCl 40 mM, seguidas de una inyección de 5 µL de NaOH 5 mM.

Las curvas de unión con sustracción del ruido de fondo fueron referenciadas doblemente y analizadas usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo procedimientos estándar. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.

El valor de afinidad determinado para el anticuerpo CA028_0496 en la unión a IL-17A fue de 16 pM, y de 1750 pM para la IL-17F. El anticuerpo CA028_0496 no se unió a las otras isoformas de la IL-17 (IL-17 B, C, D y E). El anticuerpo CA028_0496, por lo tanto, se une específicamente a IL-17A e IL-17F.

Ejemplo 4: Afinidad del anticuerpo CA028 0496 (regiones constantes de IgG1 de ratón) por IL-17A, IL-17F de cynomolgus y heterodímero IL-17A/F

Se llevaron a cabo análisis BIA (Análisis de Interacción Biomolecular) usando un Biacore 3000 (Biacore AB).

Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25ºC. Se inmovilizó IgG anti-ratón de cabra de fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en un chip sensor CM5 (Biacore AB) empleando química de acoplamiento vía grupo amino hasta un nivel de captura de ≈6000 unidades de respuesta (RUs). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% de Surfactante P20, Biacore AB) como tampón de elución con un caudal de 10 µL/min. Se usó una inyección de 10 µL de anticuerpo CA028_0496 a 4 ug/mL para la captura por la IgG-Fc anti-ratón inmovilizada. La IL-17A humana, la IL-17F de cynomolgus y el heterodímero A/F fueron valorados sobre el CA028_0496 capturado a diluciones dobles desde 25 nM hasta sub nM con un caudal de 30 µL/min. Se regeneró la superficie con un caudal de 10µL/min mediante una inyección de 10 µL de HCl 40 mM, seguida de una inyección de 5 µL de NaOH 5 mM.

Las curvas de unión con sustracción del ruido de fondo doblemente referenciadas fueron analizadas usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo procedimientos estándar. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.

El anticuerpo CA028_0496 presentó una afinidad de 21 pM por IL-17A, de 116 pM por el heterodímero IL-17A/F y de 1030 pM por IL-17F de cynomolgus.

Ejemplo 5: Mapeado de epítopos mediante RMN de un fragmento Fab' que comprende las regiones variablesdel anticuerpo CA028 0496

El anticuerpo CA028_0496 fue producido como un fragmento Fab' que comprende 496 regiones variables y regiones constantes de IgG1 de ratón (SEQ ID NO: 23 y 24).

Secuencia de cadena pesada (SEQ ID NO: 23)

Secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 24)

Expresión transitoria de CA028_00496.gl mFab' en un biorreactor de ondas de 10 L

Para la transfección de las células HEK 293 F en una bolsa de ondas de 10 L, se prepararon 10 L de medio NM6 doméstico y se suplementaron con Glutamax 2 mM (Invitrogen). Las células fueron contabilizadas y sembradas en la bolsa a una densidad celular final de 1x106 células/mL. La mezcla de transfección se preparó en 700 mL de medio NM6. Para la preparación de la mezcla de transfección, se dividió el medio NM6 en dos mitades. A una mitad se le añadió 5 mg de ADN de plásmido de cadena pesada y 5 mg de ADN de plásmido de cadena ligera y se agitó suavemente. A la otra mitad se añadió 37 mL de una disolución de reserva de polietilenimina (PEI) lineal de 35 kD y se agitó suavemente. Después de eso, el medio NM6 que contenía el ADN fue transferido lentamente al medio NM6 que contenía el PEI. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de añadirse a la suspensión celular en la bolsa de ondas. Las células transfectadas fueron cultivadas durante 14 días a 25 rpm, un ángulo de 7º, 37ºC y 5% de CO2. Se tomaron muestras de forma regular para determinar la densidad y la viabilidad celular. En el día 14 tras la transfección las células fueron recolectadas. La suspensión celular de 10 L fue transferida a botellas de centrifugación y se hicieron girar a 4.000 rpm durante 45 minutos. A continuación el sobrenadante se hizo pasar a través de un filtro Sartobran (0,45 µm a 0,2 µm) y finalmente a través de un filtro estéril Millipack Gold60 (0,22 µm). Entonces se purificó Fab' a partir del sobrenadante filtrado en condiciones estériles.

Purificación de mFab' de CA028_00496.gl

El mFab' de CA028_00496.gl expresado transitoriamente fue purificado a partir de células hospedantes de mamífero (HEK293F) como se indica a continuación. El medio acondicionado de célula hospedante de mamífero que contenía mFab' de CA028_00496.gl secretado se concentró en una relación 10:1 mediante ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de 10.000 MWCO. El sobrenadante concentrado se hizo pasar a través de una columna de Sepharose GammaBind Plus (medio suministrado por GE Healthcare) que había sido equilibrada con tampón de citrato/fosfato 75 mM, pH 6,0. Tras realizar la carga, la columna de Sepharose GammaBind Plus se lavó con tampón de citrato/fosfato 75 mM, pH 6,0, hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo a su través retornó a línea base. A continuación el mFab' de CA028_00496.gl se eluyó de la columna mediante la adición a tampón de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7. Se monitorizó la absorbancia a 280 nm del eluato y se recogieron las fracciones que contenían proteína. Se llevó a cabo la carga del sobrenadante y la elución en columna en dos lotes, de tal modo que no se excediera la capacidad de la columna.

Se combinaron las fracciones que contenían la proteína y se cambiaron de tampón (por diafiltración) a tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 6,0, + EDTA 2 mM usando una celda agitada Amicon y membrana de 10.000 MWO. El mFab' de CA028_00496.gl purificado por afinidad se concentró hasta 20 mg/mL antes de la reducción. Las cisteínas enlazadas por disulfuro de la región de bisagra fueron reducidas mediante incubación del Fab' con β-Mercaptoetilamina 5 mM a 37ºC durante 30 minutos. La reducción se paró añadiendo N-etilinaleimida (NEM) 50 mM para tapar los grupos tiol reducidos. La reacción de tapado se incubó a +4°C durante una noche. El agente de tapado de exceso y las impurezas de alto peso molecular se retiraron mediante Filtración en Gel preparativa. El Fab' reducido y capado fue cargado en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) y eluido en PBS, pH 7,4. Se monitorizó la absorbancia a 280 nm del eluato y se recogieron las fracciones que contenían proteína. Se analizaron las fracciones para determinar la pureza mediante SE-HPLC analítica usando una columna Zorbax GF250 (Agilent) con tampón de fosfato sódico 0,2 M, pH 7,0. Se combinaron las fracciones que contenían Fab' puro, se filtraron a través de filtros estériles de 0,22 µm y se almacenaron a +4°C. La pureza final se analizó mediante SE-HPLC (como se ha indicado antes) y SDS-PAGE reductora y no reductora.

Preparación de hIL17A marcada con dN y dCN

La secuencia de ADN que codifica IL-17A se amplificó mediante PCR usando cebadores que introdujeron sitios de restricción NdeI y XhoI. Los productos PCR fueron ligados en pCR4Blunt-TOPO y la secuencia se verificó antes de la digestión y la ligación en los sitios NdeI/XhoI.

Se usó hIL17A-pET43.1a para transformar la cepa de E. coli BL21(DE3). Se inoculó 1 mL de LB con células transformadas. Las células se incubaron durante una noche a 37°C. Se usó un cultivo denso de una noche para inocular un 30% de medio Celltone marcado con dN a una dilución 1:40. Las células se incubaron durante una noche a 37°C. A continuación el cultivo denso de una noche se usó para inocular medio Celltone marcado al 30% con dN o dCN. El cultivo se incubó durante una noche a 37°C. Esta etapa se repitió a continuación con un 70% de medio y después finalmente con un 100% de medio. Se inoculó medio marcado al 100% con dN o dCN con cultivo denso de una noche y se cultivó hasta una DO de 0,8 a 595 nm. Se indujo el cultivo con una concentración final de IPTG 1 mM y se incubó durante 6 horas a 37°C. Las células se recogieron por centrifugación.

Los cuerpos de inclusión se extrajeron (para 2 L de cultivo).

1) Resuspender partícula de células en 40 mL de Tampón A (KCl 100 mM, DTT 2 mM, PMSF 2 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, 25% (p/v) de sacarosa)

2) Añadir 10 mL de Tampón B (Tris-HCl 300 mM, pH 8,5, EDTA 100 mM, 4 mg/mL de lisozima). Incubar en hielo durante 10-30 minutos con movimiento ocasional.

3) Añadir 50 mL de Tampón C (LiCl 1 M, EDTA 20 mM, 0,5% (v/v) de NP-40). Someter la muestra a ultasonidos para homogeneizar. Pasar la muestra a través de una Prensa Francesa a 20.000 psi (1360 bar). Volver a pasar la muestra a través de la Prensa Francesa. Girar la muestra a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C.

4) Resuspender la partícula en 40 mL de Tampón D (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, EDTA 0,1 mM, LiCl 0,5 mM, 0,5% (v/v) de NP-40, DTT 1 mM, PMSF 1 mM). Someter a ultrasonidos y girar a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Repetir la etapa.

5) Resuspender la partícula en 40 mL de Tampón E (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, EDTA 0,1 mM, 0,5% (v/v) de NP-40, DTT 1 mM, PMSF 1 mM). Someter a ultrasonidos y girar a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Repetir la etapa.

Resolubilización de partícula

6) Preparar Guanidina HCl 6 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, NaCl 50 mM. Añadir a la partícula. Agitar la partícula hasta disolver completamente.

7) Filtrar la muestra a través de un filtro de jeringa de 0,2 uM.

Replegamiento y diálisis

1) 2,5 mL de cuerpos de inclusión resolubilizados se diluyen en 50 mL de Guanidina-HCl 5 M, Tris 50 mM, pH 8,5, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, Glutationa reducida 2 mM, Glutationa oxidada 0,2 mM.

2) Añadir los cuerpos de inclusión diluidos gota a gota a 500 mL de Tris 50 mM, pH 8,5, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, Glutationa reducida 2 mM, Glutationa oxidada 0,2 mM.

3) Diálisis de proteína replegada frente a MES 20 mM, pH 6, durante una noche a 4°C.

Purificación de proteína marcada

1) Se carga el lisato dializado en una columna Mono SP HP (catión) equilibrada con MES 20 mM, pH 6.

2) Se eluye la proteína con un gradiente de NaCl al 50% a lo largo de 10 volúmenes de columna.

3) Se cambia el tampón de la proteína eluída a NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, 0,02% de azida, pH 6, y se concentra y se ensaya para determinar la concentración.

Purificación de proteína no marcada

1) Se carga el lisato dializado en una columna Mono SP HP (catión) equilibrada con MES 20 mM, pH 6.

2) Se eluye la proteína con un gradiente de 50% de NaCl 1 M a lo largo de 10 volúmenes de columna.

3) Se concentra la proteína eluída y se cambia el tampón a CAPSO 20 mM, pH 10 y se carga en una columna MonoQ equilibrada con CAPSO 20 mM, pH 10.

4) Se eluye la proteína con un gradiente de 50% de NaCl 1 M a lo largo de 20 volúmenes de columna.

5) Se concentra la proteína eluída.

6) Se inyecta la proteína concentrada en una columna Superdex 75 16?60 para una etapa final de acabado. Se equilibra la columna con HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4. Se recoge la proteína eluída y se concentra y evalúa para determinar la concentración.

Principio del ensayo de mapeado de epítopo por RMN

La tecnología de RMN permite la detección sensible de cambios en el entorno de especies paramagnéticas. En la práctica, esto significa que una proteína que ha sido marcada de forma uniforme con 15N y 2H puede mezclarse con una pareja de unión no marcada, y los aminoácidos de la proteína marcada que interaccionan con la pareja de unión no marcada pueden detectarse según varía su posición en un espectro de RMN. En este caso, la IL-17A humana fue marcada uniformemente y su espectro de RMN se registró en presencia y en ausencia del fragmento Fab' de un anticuerpo anti-IL-17A. La diferencia entre los dos espectros permite identificar los aminoácidos de la IL-17A que están implicados en la interacción con el anticuerpo.

Espectroscopía de RMN

Los experimentos de RMN se llevaron a cabo con muestras de 0,35 mL de las proteínas y complejos en un tampón de fosfato sódico 25 mM, cloruro sódico 100 mM y azida sódica al 0,01% (p/v) a pH 6 (95% de H2O y 5% de D2O). El complejo 1:2 (dímero:Fab) entre IL-17A marcada con 15N/2H y el fragmento Fab' no marcado del anticuerpo '496 se preparó para análisis de RMN mezclando cantidades equimolares (monómero:Fab) de las proteínas para alcanzar una concentración final de 0,25 mM. Los datos de RMN fueron adquiridos a 35°C para la IL-17A libre y para el complejo IL-17A:fragmento Fab' de '496 en un espectrómetro Bruker Avance de 800 MHz equipado con una criosonda de triple resonancia (15N/13C/1H). Se usaron espectros HNCACB, HN(CO)CACB y HNCO basados en TROSY (1-4) para realizar la asignación completa de resonancias de cadena principal específicas de secuencia (15N,13C y 1H) para IL-17A libre usando una muestra 0,8 mM marcada con 15N/13C de forma uniforme.

Los cambios de posición de las señales de cadena principal de IL-17A inducidos por la unión del fragmento Fab' de '496 fueron detectados usando un espectro TROSY 2D 15N/1H (5). Los parámetros de adquisición típicos de todos los experimentos de RMN se incluyen a continuación.

Parámetros básicos de los experimentos de RMN.

Experimento

Dimensión indirecta Ancho de barrido [ppm] Desfase de disolvente [ppm] Tiempo deadquisición [ms]

TROSY-HNCACB &

15N (F2) 32 118,0 19,3

TROSY-HN(CO)CACB

13C (F1) 56 44,0 8,0

TROSY-HNCO

15N (F2) 32 118,5 20,6

13C (F1)

11,5 175,5 24,8

2D 15N/1H HSQC

15N (F1) 34 118,0 80

2D 15N/1H TROSY

15N (F1) 34 117,5 50

La dimensión directa de 1H (F3 ó F2) fue adquirida con ancho de barrido de 14 ppm y un tiempo de adquisición de 90 ó 60 ms.

Todos los espectros fueron procesados usando Topspin 2.1, usando predicción lineal para extender el tiempo de adquisición efectivo en la dimensión de 15N de los datos 3D hasta aproximadamente 30 ms. Se aplicó un aumento de resolución suave en todas las dimensiones usando una función de seno-cuadrado desplazado. El análisis de los espectros se llevó a cabo usando Sparky (7).

Análisis de datos de unión a Fab'

La aproximación de mínimo desplazamiento (Farmer, B. T. et al., (1996) Nat Struct Mol Biol 3(12), 995; Muskett, F.

W. et al., (1998) J Biol Chem 273(34), 21736-21743) fue usada para determinar los cambios en las posiciones de las señales de RMN de la IL-17A resultantes de la unión de fragmento Fab' de '496 con la IL-17A humana. Inicialmente, se tomaron todos los picos del espectro HSQC 2D de 15N/1H de IL-17A libre y TROSY 2D de 15N/1H de IL-17A unida al fragmento Fab' de '496 en sus centros. Se corrigieron los valores de desplazamiento químico de 15N y 1H de las resonancias de la cadena principal para tener en cuenta la diferencia en los espectros de TROSY 2D de 15N/1H y de HSQC 2D de 15N/1H del complejo y de la proteína libre (0,58 ppm para 15N y -0,06 ppm para 1H). El cambio mínimo en la posición para los picos entre la IL-17A libre y la IL-17A ligada a Fab' se obtuvo usando Microsoft Excel para calcular la diferencia de desplazamiento químico combinado en 15N y 1H para cada pico asignado del espectro HSQC de 15N/1H de la proteína libre comparada con el espectro TROSY de 15N/1H del complejo con Fab'. Las diferencias combinadas de desplazamiento química en el protón y el nitrógeno del grupo amida (Δδ) se definieron según la siguiente ecuación (Ecuación 1), donde ΔδHN y ΔδN corresponden a las diferencias en los desplazamientos de 1H y 15N entre pares de picos comparados y αN es un factor de escalado de 0,2 requerido para contabilizar las diferencias en el rango de desplazamientos químicos de protón de amida, nitrógeno de amia y carbono. Para cada pico individual, el desplazamiento mínimo inducido por la unión de Fab' se consideró el valor de desplazamiento combinado (Δδ) más bajo posible.

Para identificar los sitios de unión a Fab' (epítopos) sobre la IL-17A, se usó un histograma de desplazamiento mínimo combinado frente a secuencia de proteína para revelar las regiones de la IL-17A que contiene señales significativamente perturbadas. Si la dimensión del cambio de desplazamiento químico combinado para aminoácidos individuales excedía un valor umbral, dichos residuos eran seleccionados para una evaluación posterior como posibles residuos de contacto en el sitio de unión a Fab'. Cabe destacar que estos posibles residuos de "contacto" pueden estar implicados en la unión mediante interacciones directas o indirectas (p.ej., alostéricas) con el Fab'. Los valores umbral se fijaron como + 1,5 x SD de todos los datos de desplazamiento mínimo, la media de desplazamiento mínimo +1 SD y la media de desplazamiento químico +2 SD. Las localizaciones de residuos de sitio de unión candidatos fueron examinadas finalmente en la estructura de alta resolución de la IL-17A y solo los residuos posicionados en la superficie de la proteína fueron considerados como disponibles para la unión a Fab'.

Residuos seleccionados como posibles residuos de "contacto" en base a desplazamientos > +1,5 x SD de todos los datos de desplazamientos mínimos, accesibilidad de disolvente >25%:

SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73, ASP84, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131.

Residuos seleccionados como posibles residuos de "contacto" en base a desplazamientos > la media + 1 SD de todos los datos de desplazamientos mínimos, accesibilidad de disolvente >25%:

SER41, TYR44, ASN45, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73 y ASP84.

Residuos seleccionados como posibles residuos de "contacto" en base a desplazamientos > la media + +2 SD de todos los datos de desplazamientos mínimos, accesibilidad de disolvente >25%:

TYR44, ASN45, TRP51, ASN52 y ASP84.

La técnica de RMN descrita antes también fue usada para identificar los sitios de unión de Fab' (epítopos) sobre la IL-17F.

Los valores umbral se fijaron como el desplazamiento mínimo medio, el desplazamiento mínimo medio + 0,5 SD y el desplazamiento mínimo medio +1 SD. Las localizaciones de residuos de sitio de unión candidatos fueron examinadas finalmente en la estructura de alta resolución de la IL-17F y solo los residuos posicionados en la superficie de la proteína fueron considerados como disponibles para la unión a Fab'.

Residuos seleccionados como posibles residuos de "contacto" en base a desplazamientos > la media de todos los datos de desplazamientos mínimos, accesibilidad de disolvente >20%:

GLN12, LYS13, SER24, ISO32, ASN33 GLU34, ASN35, GLN36, VAL38, SER46, ASN53, TYR54, GLN69, ISO78, ASP85, SER87, MET88, ASM89, GLN94, LYS103 y THR126.

Residuos seleccionados como posibles residuos de "contacto" en base a desplazamientos > la media + +0,5 SD de todos los datos de desplazamientos mínimos, accesibilidad de disolvente >20%:

GLN12, SER24, ASN33, GLU34, GLN36, VAL38, ASN53, TYR54, ASP85, MET88, ASM89 y THR126.

Residuos seleccionados como posibles residuos de "contacto" en base a desplazamientos > la media + +1 SD de todos los datos de desplazamientos mínimos, accesibilidad de disolvente >20%:

GLN12, SER24, ASN33, GLU34, ASP85 y MET88.

Ejemplo 6: Modelización de la unión de anticuerpo 496 sobre la IL-17F

El sitio de unión probable para el anticuerpo 496 sobre la IL-17F se determinó mediante modelización de homología y alojamiento.

Se usó MODELLER (Sali, A. & Blundell, T. L., (1993) J. Mol. Biol. 234(3), 779-815) para construir un modelo de homología del anticuerpo 496, usando la estructura de rayos X del anticuerpo CA048_497 (anticuerpo descrito en el documento WO2008/001063). La identidad de secuencia global entre los dos anticuerpos es del 82%. Con dicho nivel de similitud tan elevado, el proceso de modelización de la homología es bien entendido por cualquier especialista en la técnica.

El modelo de homología del anticuerpo 496 se acopló entonces a la estructura de rayos X del heterodímero IL-17A/F usando RosettaDock (Gray, J. J., et. al., (2003) J. Mol. Biol., 331(1), 281-299) con el objetivo de construir un modelo 3D del complejo. Se llevó a cabo un proceso de acoplamiento sin restricción global para generar 10.000 señuelos (es decir, potenciales soluciones de acoplamiento). Los 10 mejores señuelos, con las menores puntuaciones de energía, según el RosettaDock, fueron seleccionados para el estudio de perturbación para probar el entorno energético alrededor de cada solución de acoplamiento. Los estudios de perturbación fueron llevados a cabo de nuevo usando RosettaDock. Los señuelos que presentaron un entorno energético de tipo embudo fueron promocionados como candidatos potenciales.

Los candidatos potenciales fueron sometidos entonces a escrutinio frente a la proximidad a los residuos ASP80, GLY81 y ASN82 de la subunidad de IL17A y a los residuos GLN81, GLY82 y LYS83 de la subunidad de IL17F. Se descartaron los candidatos que tenían el anticuerpo 496 localizado a menos de 4 angstroms de cualquiera de dichos residuos. Nótese que los residuos ASP80, GLY81 y ASN82 de la IL17A, que son estructuralmente equivalentes a los residuos GLN81, GLY82 y LYS83 de la IL17F, no fueron identificados como posibles residuos de contacto a través de los datos de desplazamiento mínimo mostrados en el Ejemplo 5, pero fueron identificados como posibles residuos de contacto cuando se estudió la unión del anticuerpo CA048_497 y la IL-17A usando la misma técnica (datos no mostrados).

Los candidatos restantes fueron sometidos a continuación a escrutinio para determinar la proximidad a los residuos de IL17F ARG42, GLU45, SER46, ARG47, TRP52, ASN53, THR55, ARG73, ASN74, LEU75, ASP85 y SER87 ("Residuos Clave de IL17F-496"), que son estructuralmente equivalentes a los posibles residuos de contacto de IL17A especificados en el Ejemplo 5. Nótese que los residuos que son estructuralmente equivalentes a VAL128, HIS129 y VAL131 de la IL17A no están presentes en la estructura de rayos X de la IL-17F y por tanto son ignorados. El candidato con la menor suma de distancias entre "Residuos Clave de IL17F-496" y el anticuerpo 496 fue seleccionado como solución final de acoplamiento.

Se llevaron a cabo protocolos de escrutinio de proximidad usando PyMol (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System (2002) en Internet, http://www.pymol.org). Según la solución final de acoplamiento, es de esperar que el anticuerpo 496 se una a IL-17F en uno o más de los siguientes residuos:

SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, CYS72, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, SER90, VAL91, PRO92, GLN94, THR119, CYS122, VAL125, THR126, PRO127, VAL128.

Es de esperar que el anticuerpo 496 se una en una o más de las siguientes regiones, que comprenden los residuos de aminoácido:

39-42 (SER39, MET40, SER41, ARG42)

47 (ARG47) 53 (ASN53)

72-75 (CYS72, ARG73, ASN74, LEU75)

83-92 (LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, SER90, VAL91, PRO92)

94 (GLN94)

119 (THR119)

122 (CYS122)

125-128 (VAL125, THR126, PRO127, VAL128).

Nótese que CYS72, SER90, THR119, CYS122 y VAL125 son menos de un 25% accesibles a disolvente, según la estructura de rayos X de la IL17F, y por tanto no pueden interaccionar directamente con el anticuerpo 496. Sin embargo, es probable que dichos residuos apoyen a los residuos de su entorno que están realizando contactos directos con el anticuerpo 496.

Por lo tanto, es de esperar que el anticuerpo 496 se una a IL-17F en uno o más de los siguientes residuos:

SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, VAL91, PRO92, GLN94, THR126, PRO127, VAL128.

Ejemplo 7:

La interacción entre 496 e IL-17F fue estudiada mediante cristalografía de rayos X.

Cristalización, Determinación de Estructura y Afino de la estructura cristalina de la IL17F humana acomplejada con Fab 496.

Cristalización

El complejo IL17F humana/Fab 496 cristalizó en forma de pirámides a partir de gotas colgantes a través de la fase vapor a 18,5ºC frente a un reservorio de 500 µL de disolución que contenía sulfato amónico 0,85 M, tartrato potásico sódico 0,2 M y tampón Tris 0,05 M, pH 6,9, durante 1-2 semanas en placas Hampton Research VDXm. Las gotas contenían 1 µL de proteína a 10 mg/mL en Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM, 0,02% de azida, y 1 µL de disolución de reservorio. Los cristales pertenecen al grupo especial H32 con dimensiones de celda a=b=189,4; c=490,9, y tres moléculas del complejo IL17F/Fab 496 en la unidad asimétrica.

Toma de datos de difracción de rayos X

Realizamos la toma de datos de difracción de rayos X a través de un único cristal de IL17F/Fab 496 suspendido en un lazo lito y congelado instantáneamente en nitrógeno líquido, tras pasar brevemente el cristal a través de una disolución crioprotectora que contenía sulfato amónico 1,3 M, tartrato potásico sódico 0,2 M y tampón Tris pH 6,9, y un 30% de glicerol. Los datos de difracción fueron adquiridos en un dispositivo de carga acoplada ADSC Quantum 4 en la estación I03 beamline en el sincrotrón Diamond, Didcot, Oxfordshire, R.U. La longitud de onda del haz monocromático de rayos X fue de 0,9796 Ǻ. El espacio recíproco fue muestreado con un paso de oscilación de 1,0º alrededor del eje goniostático ϕ. Los datos fueron procesados con Mosflm (Leslie, AGW, Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, Nº 26; CCP4, Collaborative Computational Project, Number 4. Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)).

Determinación de Estructura

La estructura cristalina del complejo IL17F humana/Fab 496 se determinó en dos etapas. En primer lugar se localizó la posición Fab con el programa de sustitución molecular Phaser (Read, RJ, Acta Cryst. D57, 1373-1382 (2001)), usando el Fab con el código PDB limpio de moléculas de agua. Las funciones de rotación transversal y traslación se llevaron a cabo con una resolución de 4,0 Ǻ y con los parámetros por defecto. Se localizaron tres moléculas de Fab. Las búsquedas tras la traducción dieron lugar a una solución con un factor R elevado tras refino de cuerpo rígido en CNX (Brunger, A. et al, Science, 235, 458-460 (1997)). Aunque la densidad electrónica para la IL17F fue visible en

mapas de densidad electrónica 2Fo-Fc, no se obtuvo una solución de sustitución molecular para la IL17F usando IL17f(PDB código 1JPY). En su lugar se usó la estructura de un dímero de IL17A para localizar dicha molécula. Se encontró una solución que correspondía con su localización a lo largo de un eje doble. Tras seleccionar una mitad del IL-17A, y sobreponer con la IL-17F, se creó un nuevo modelo de búsqueda que contenía un Fab y una mitad de un dímero de IL17F, con los residuos del extremo N eliminados que produjeron colisiones de simetría. Este modelo de búsqueda fue usado para definir la solución de sustitución molecular final para este medio-complejo.

Construcción y refinamiento de modelo

La estructura Fab 496/IL17F se construyó a partir de las operaciones de rotación y traslación observadas mediante sustitución molecular. Usando mapas de densidad electrónica 2Fo-Fc y Fo-Fc, se cambiaron los residuos del modelo Fab para reflejar la secuencia del Fab 496. Según estos mapas, uno puede establecer el modelo aproximado de Fab 496 alterando las conformaciones de cadena lateral, reemplazando los aminoácidos presentes en la estructura de modelo por las del Fab 496, así como añadiendo o eliminando residuos. Se realizaron ajustes en las orientaciones conformes de residuos para la IL17F. Usamos el programa de ordenador interactivo O (Jones, TA et al., Acta Cryst. A47, 110-119 (1991)) para llevar a cabo estas manipulaciones.

Este modelo aproximado fue sometido a rondas de maduración simulada, refinamiento posicional y de factor B usando CNX, seguido de una intervención manual. El refinamiento y la reconstrucción manual se monitorizó a través de la calidad de los mapas de densidad electrónica 2Fo-Fc y Fo-Fc, así como a través del valor de R y R-libre cristalográficos. La resolución usada a través del refinamiento aumentó gradualmente desde 4,0 Å a 3,2 Å según avanzaba el refinamiento, usando en todo el proceso una corrección en bruto de disolvente. El modelo del complejo IL17F/Fab 496 abarca los residuos 15 a 133 de la IL17F (véase la SEQ ID NO: 22), los residuos 1 a 214 de la cadena ligera de Fab 496 (SEQ ID NO: 11) y los residuos 1 a 227 de la cadena pesada de Fab 496 (SEQ ID NO: 15). El factor-R del modelo es 0,243, y la R-libre es 0,288 para 56128 reflexiones. La desviación rms de geometría estándar (Engh, R. et al., Acta Cryst., A47, 392-400 (1991)) es de 0,009 Å para longitudes de enlace y de 1,48° para ángulos de enlace.

El epítopo

La interacción entre 496 e IL-17F (que es un homodímero covalente) estudiada mediante cristalografía de rayos X fue de un complejo de fragmentos Fab de 496 incubados con IL-17F humana. La estructura revela los sitios de contacto principales entre Fab 496 e IL-17F, y se identificaron como agrupados principalmente en los lazos CDR del anticuerpo y a lo largo de parte de la longitud de la IL-17F, interaccionando con ambas cadenas de la IL-17F. Según la numeración de secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 22 para la proteína IL-17F madura, es decir, la proteína IL17F a partir de la cual se ha escindido el péptido señal, los residuos que interaccionan con la mayor proximidad conla región CDR del Fab 496, en una proximidad 3,0 Å, son Gln71, Cys72, Ile86, Asn89, Ser90 y Via1128 en la primera cadena, y Arg47 en la segunda cadena. Los residuos principales de la IL-17F que están en contacto con el Fab 496 en una proximidad de 3,5 Å son Gln71, Cys72, Asn74, Leu75, Ile86, Asn89, Ser90, Pro92, Va1128, His131 y Gln133, en la primera cadena, y Arg37, Ser39, Ser41 y Arg47 en la segunda cadena. Los residuos que están en contacto con Fab 496 en una proximidad de 4,0 Å son Gln71, Cys72, Arg73, Asn74, Leu75, Ile86, Ser87, Asn89, Ser90, Va191, Pro92, Va1128, His131 y Gln133 en la primera cadena, y Asn33, Gln36, Arg37, Ser39, Ser41, Arg42, Ile44 y Arg47 en la segunda cadena. Estos residuos definen el epítopo del anticuerpo 496.

Tabla 1. Coordenadas atómicas de la IL-17F en el complejo con Fab de 496 (H32; a=189,4; b=189,4; c=490,9; α,β=90º; γ=120º)

En un aspecto adicional, se proporciona una estructura cristalina que comprende un epítopo como el definido en la presente memoria.

También se proporciona un método para generar una representación tridimensional por ordenador que emplea el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100% de las coordenadas de la Tabla 1.

También se proporciona un medio legible mecánicamente que tiene almacenado en su interior datos que comprenden el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100% de las coordenadas enumeradas en la Tabla 1.

Por supuesto, debe destacarse que la presente invención ha sido descrita meramente a modo de ejemplo, en modo alguno pretende ser limitante, y que se pueden realizar modificaciones de detalles dentro del alcance de las reivindicaciones incluidas a continuación en la presente memoria. Las características preferidas de cada realización de la invención son para cada una de las otras realizaciones mutatis mutandis.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humana y a IL-17F humana que se une a un epítopo de la IL-17A humana que comprende SER41, TYR44, ASN45, ARG46, TRP51, ASN52, HIS54, ARG72, HIS73, ASP84, HIS86, VAL128, HIS129 y VAL131 de la SEQ ID NO: 21, donde el anticuerpo no es un anticuerpo que comprende la

   5 secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para la CDR-L3, donde las SEQ ID NOs se muestran en la Figura 1.

   2, Un anticuerpo neutralizante según la reivindicación 1, que se une a un epítopo de IL-17F humana que comprende

   10 uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en SER39, MET40, SER41, ARG42, ARG47, ASN53, ARG73, ASN74, LEU75, LYS83, GLU84, ASP85, ILE86, SER87, MET88, ASN89, VAL91, PRO92, GLN94, THR126, PRO127 y VAL128 de la SEQ ID NO: 22.
2. 3. Un anticuerpo neutralizante según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, que se une a IL-17A humana, a IL-17F humana y al heterodímero IL-17A/F humano.

   15 4. Un anticuerpo neutralizante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una afinidad de unión por IL-17A mejor que 500 pM.
3. 5. Un anticuerpo neutralizante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune o cáncer.
4. 6. Un anticuerpo neutralizante para uso según la reivindicación 5, donde la enfermedad inflamatoria es artritis 20 reumatoide.