ES2543455T3

ES2543455T3 - Métodos para identificar los hábitats de insectos

Info

Publication number: ES2543455T3
Application number: ES09816101.1T
Authority: ES
Inventors: Hiromasa Yamauchi
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2029-09-17
Also published as: JP5973133B2; CN101712991A; EP2388319A1; JP2015154772A; EP2388319B1; WO2010035686A1; US9624550B2; US20110229901A1; CA2737903C; DK2388319T3; CN101712991B; CA2737903A1; AU2009297666A1; EP2388319A4; JPWO2010035686A1; AU2009297666B2

Abstract

Un método para preparar un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos para identificar el hábitat de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende las etapas de: (a) determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats; (b) alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a); (c) eliminar sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas en dicha etapa (b) a partir de las secuencias de nucleótidos; (d) definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios discriminadores de tipos; (e) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipos obtenidos en dicha etapa (d) para clasificar sitios que discriminan tipos completamente idénticos como el mismo tipo y sitios que discriminan tipos incompletamente idénticos como uno o más tipos diferentes; y (f) determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio, donde el ADN es el gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) y/o el gen de la subunidad de la NADH deshidrogenasa (NDS), y donde dicho sitio discriminador de tipo es al menos uno del siguiente grupo para el hábitat de Tribolium castaneum: (1) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A; (2) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2 es G, y el nucleótido 331º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A; (3) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 3 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 359º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 10 es A, y el nucleótido 419º es A; (4) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4 es A, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A; (5) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 5 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A; (6) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 22º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 6 es T, el nucleótido 142º es G, y el nucleótido 317º es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 11 es T, el nucleótido 248º es G, el nucleótido 308º es C, el nucleótido 359º es G y el nucleótido 419º es G; (7) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 317º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 7 es T, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 12 es C; y donde dicho sitio discriminador de tipo es el siguiente para el hábitat de Rhyzopertha dominica: (8) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 34 es T.

Description

Métodos para identificar los hábitats de insectos

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para preparar un criterio para identificar el hábitat de insectos del mismo tipo mediante el análisis del ADN.

Antecedente de la técnica

Japón es el mayor importador mundial de alimentos. Estos alimentos incluyen no solo productos alimenticios sino también materiales de productos alimenticios tales como tales como soja y granos comestibles tales como maíz. Estos se transportan por el aire o el mar desde países exportadores a Japón y por tierra en países exportadores.

15 Los alimentos importados se pueden infestar con gusanos durante su almacenamiento en un almacén. Puede estar originado por contaminación con insectos que habitan en el almacén o el país exportador o la ruta de transporte, y es muy importante seguir la ruta de contaminación de los insectos para adoptar medidas de seguridad. Sin embargo, algunos insectos se distribuyen en varias zonas del mundo, y en aquellos casos donde los insectos de la misma morfología habitan diversas zonas, ha sido difícil determinar a partir de sus características morfológicas el lugar donde los insectos han contaminado el alimento, es decir, el hábitat de los insectos, y ha sido también difícil localizar la causa de la contaminación con los insectos.

Descripción de la invención Problemas que va a resolver la invención

La presente invención proporciona métodos para preparar un criterio para identificar el hábitat de los insectos del mismo tipo mediante el análisis del ADN.

Cuando el alimento has sido contaminado por Tribolium castaneum durante su almacenamiento en un almacén portuario, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, aún no existen medios para identificar si se ha contaminado con el insecto en el almacén portuario, estando ya en Japón o si se ha contaminado en el país exportador o en la ruta de transporte, donde habita el insecto, y sería muy deseable desarrollar una técnica para

35 identificar el lugar donde el alimento se ha contaminado con plagas de insectos.

Medios para resolver los problemas

Los inventores han consagrado sus estudios a resolver los anteriores problemas. Los inventores han analizado las secuencias de nucleótidos del gen COI mitocondrial y del gen NDS de Tribolium castaneum de diversas zonas de Japón y en el extranjero para encontrar que existe un polimorfismo específico de hábitat en cada secuencia de nucleótidos y conseguir la presente invención.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona las siguientes realizaciones que se caracterizan en los 45 elementos (1) a (10):

1. Un método para preparar un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos para identificar el hábitat de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende las etapas de:

(a): determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats;

(b): alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a);

(c): eliminar sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas en dicha etapa (b) a partir de las secuencias de nucleótidos;

(d) definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios 55 discriminadores de tipos;

(e): comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipos obtenidos en dicha etapa (d) para clasificar sitios que discriminan tipos completamente idénticos como el mismo tipo y sitios que discriminan tipos incompletamente idénticos como uno o más tipos diferentes; y

(f): determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio, donde el ADN es el gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) y/o el gen de la subunidad S de la NADH deshidrogenasa (NDS), y donde dicho sitio discriminador de tipo es al menos uno del siguiente grupo para el hábitat de Tribolium castaneum:

65 (1) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 229º contado desde el extremo S' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido

253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A;

(2): un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2 es G, y el nucleótido 331º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(3): un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 3 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 359º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 10 es A, y el nucleótido 419º es A;

(4): un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4 es A, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(5): un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 5 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(6): un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 22º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 6 es T, el nucleótido 142º es G, y el nucleótido 317º es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 11 es T, el nucleótido 248º es G, el nucleótido 308º es C, el nucleótido 359º es G y el nucleótido 419º es G;

(7): un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 317º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 7 es T, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 12 es C; y donde el sitio discriminador de tipo es el siguiente para el hábitat de Rhyzopertha dominica:

(8): un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 34 es T.

2. El método de acuerdo con el punto 1, que comprende además las siguientes etapas además de las etapas que se han definido en el punto 1:

(g): comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los criterios obtenidos en la etapa (f) que se define en el punto 1 para extraer uno o más nucleótidos existentes en un solo tipo pero no en otros tipos; y

(h): definir el uno o más nucleótidos extraídos en dicha etapa (g) solos o en combinación, como un criterio discriminador de zona.

3.: Un método para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende determinar el polimorfismo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el método del punto 1, comparar la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos obtenido mediante el método del punto 1 o 2 y una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra, y analizar si un nucleótido del sitio correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la muestra es idéntico o no al nucleótido del criterio, identificando por tanto el hábitat de la muestra, donde dicho insecto muestra es Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica.

4.: El método de acuerdo con el punto 3, donde el método comprende las etapas de: almacenar una tabla de criterios que contiene datos que representan la secuencia de nucleótidos de un criterio obtenido mediante el método del punto 1 o 2 y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos en un ordenador en el cual se ejecuta un programa informático de análisis, almacenar una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra, y permitir al ordenador comparar los datos que representan nucleótidos de las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos entre la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios con referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos de la tabla de criterios

5.: El método de acuerdo con el punto 1 para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no, donde se satisfacen uno o más de los siguientes criterios: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen COI de Tribolium castaneum que se muestra en la

SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen NDS de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A.

: 5 6. Un cebador o sonda que comprende al menos uno de los nucleótidos que constituyen un criterio preparado mediante el método de uno cualquiera de los puntos 1-4, donde dicho cebador o sonda comprende un ácido nucleico que se muestra en las SEC ID Nos: 17-29.

7. El método de acuerdo con el punto 3, donde se usan el cebador y/o la sonda del punto 6, el método que comprende las etapas de:

(a): extraer el ADN de un insecto muestra;

(b): poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador y/o la sonda del punto 6;

(c): amplificar un fragmento de ADN; y 15 (d) identificar el hábitat del insecto muestra.

8. El método de acuerdo con el punto 3, donde se usan el cebador y la sonda del punto 6, el método que comprende las etapas de:

(a): extraer el ADN de un insecto muestra;

(b): poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador y la sonda del punto 6;

(c): amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(d): detectar una sustancia fluorescente con la cual se ha marcado la sonda por adelantado; y

(e): identificar el hábitat del insecto muestra. 25

9. El método de acuerdo con el punto 3, donde el cebador del punto 6 se usa para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no, el método que comprende las etapas de:

(a): extraer el ADN de una muestra de Tribolium castaneum;

(b): poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador del punto 6;

(c): amplificar un fragmento de ADN; y

(d): identificar si la muestra de Tribolium castaneum es el Tribolium castaneum que habita la principal isla de Japón o el Tribolium castaneum que habita otras zonas.

35 10. El método de acuerdo con el punto 3, donde se usan la sonda del punto 6 y una pareja de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores, el método que comprende las etapas de:

(a): extraer el ADN de un insecto muestra;

(b): poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con la sonda del punto 6 y una pareja de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores;

(c): amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(e): identificar el hábitat del insecto muestra.

45 Además, se describen los puntos (1) a (26) siguientes:

(1) Un método para preparar un criterio para identificar el hábitat de insectos mismo tipo, que comprende las etapas de:

(f): determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio.

(2) Un método para preparar un criterio discriminador de zona para identificar si el hábitat de insectos del mismo tipo es o no una zona, que comprende además las siguientes etapas además de las etapas que se han definido en el punto (1):

(g) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los criterios obtenidos en la etapa (f) que se define

en el punto (1) para extraer uno o más nucleótidos existentes en un solo tipo pero no en otros tipos; y

(h) definir el uno o más nucleótidos extraídos en dicha etapa (g) solos o en combinación como un criterio discriminador de zona.

(3): El método como se define en (1) o (2) donde el insecto es un insecto que pertenece al orden Coleoptera.

(4): El método como se define en una cualquiera de (1)-(3) donde el insecto es un insecto que pertenece a la familia Tenebrionidae.

(5): El método como se define en uno cualquiera de (1)-(4) donde el insecto es Tribolium castaneum.

(6): El método como se define en uno cualquiera de (1)-(5) donde el ADN es ADN mitocondrial.

(7): El método como se define en (6) donde el ADN mitocondrial es el gen COI y/o el gen ND5.

(8): Un método para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende comparar la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio obtenido por el método que se define en una cualquiera de (1)-(7) y una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra, y analizar si un nucleótido del sitio correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la muestra es idéntico o no al nucleótido del criterio, identificando por tanto el hábitat de la muestra.

(9): Un método para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende las etapas de: almacenar una tabla de criterios que contiene datos que representan el nucleótido de un criterio obtenido mediante el método que se define en uno cualquiera de (1)-(7) y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos en un ordenador en el cual se ejecuta un programa informático de análisis, almacenar una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra, y permitir al ordenador comparar los datos que representan nucleótidos de las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos entre la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios con referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos de la tabla de criterios.

(10): El método como se define en (8) o (9) donde el insecto es un insecto que pertenece al orden Coleoptera.

(11): El método como se define en una cualquiera de (8)-(10) donde el insecto es un insecto que pertenece a la familia Tenebrionidae.

(12): El método como se define en uno cualquiera de (8)-(11) donde el insecto es Tribolium castaneum.

(13): El método como se define en uno cualquiera de (8)-(12) donde el ADN es ADN mitocondrial.

(14): El método como se define en (13) donde el ADN mitocondrial es el gen COI y/o el gen ND5.

(15): Un programa informático de análisis para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende una tabla de criterios que contienen datos que representan el nucleótido de un criterio obtenido mediante el método que se define en uno cualquiera de (1)-(7) y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos.

(16): El programa informático de análisis para identificar el hábitat de un insecto muestra como se define en (15), que permite a un ordenador funcionar como un medio que comprende medios para almacenar una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra y medios para comparar los datos que representan nucleótidos en las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos en la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios que hacen referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos en la tabla de criterios.

(17): Un medio legible por un ordenador en el cual se ha registrado el programa informático de análisis que se ha definido en (15) o (16).

(18): Un criterio obtenido por el método que se ha definido en uno cualquiera de (1)-(7).

(19): Un criterio discriminador de zona obtenido mediante el método (2) para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no, donde se satisfacen uno o más de los siguientes criterios: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen COI de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen ND5 de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A.

(20): Un cebador o sonda que comprende al menos uno de los nucleótidos que constituyen un criterio preparado mediante el método de uno cualquiera de los puntos (1)-(7).

(21): Una sonda que comprende al menos uno de los nucleótidos que constituyen un criterio preparado mediante el método de uno cualquiera de los puntos (1)-(7).

(22): El cebador que se ha definido en (20) que comprende un ácido nucleico que se muestra en las SEC ID Nos: 17-29 para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no.

(23): Un método para identificar el hábitat de un insecto utilizando el cebador que se ha definido en (20) y/o la sonda que se ha definido en (21), que comprende las etapas de:

(a): extraer el ADN de un insecto muestra;

(b): poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador que se ha definido en (20) y/o la sonda que se ha definido en (21);

(c): amplificar un fragmento de ADN; y

(d): identificar el hábitat del insecto muestra.

(24) Un método para identificar el hábitat de un insecto utilizando el cebador que se ha definido en (20) y la sonda que se ha definido en (21), que comprende las etapas de:

(a) extraer el ADN de un insecto muestra;

5 (b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador que se ha definido en (20) y la sonda que se ha definido en (21);

(c): amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(e): identificar el hábitat del insecto muestra. 10

(25) Un método para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no usando el cebador que se ha definido en (22), que comprende las etapas de:

(a): extraer el ADN de una muestra de Tribolium castaneum; 15 (b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador que se ha definido en (22);

(c): amplificar un fragmento de ADN; y

20 (26) Un método para identificar el hábitat de un insecto utilizando la sonda que se ha definido en (21) y una pareja de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores, que comprende las etapas de:

(a) extraer el ADN de un insecto muestra;

25 (b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con la sonda que se ha definido en (21) y una pareja de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores;

(c): amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(e) identificar el hábitat del insecto muestra. 30

Ventajas de la invención

La capacidad de identificar el hábitat de Tribolium castaneum posibilita aclarar la causa de la contaminación de alimento con Tribolium castaneum suponiendo la zona donde se ha contaminado, y por tanto, se puede esperar que

35 puedan tomarse rápidamente medidas de seguridad más eficaces.

Además, se pueden preparar cebadores de sondas para identificar el hábitat utilizando información de los criterios para constituir nucleótidos preparados mediante los métodos de la presente invención. Cuando ADN de Tribolium castaneum extraído de un hábitat desconocido se usa como molde y se amplifica mediante PCR con cebadores para

40 la principal isla de Japón y cebadores para zonas extranjeras de la presente invención para identificar si Tribolium castaneum habita o no la principal isla de Japón, por ejemplo, y si el cebador para la principal isla de Japón es positivo y el cebador para zonas extranjeras es negativo, por ejemplo, se puede determinar que el Tribolium castaneum se deriva de la principal isla de Japón. De esta manera, los cebadores y las sondas son útiles para simplificar la identificación de los hábitats de insectos.

45 En el alimento procesado o similar, el ADN de los insectos contaminantes está a menudo fragmentado. Si se fragmenta el ADN, la región que se va a amplificar mediante la PCR se puede segmentar, lo que impide la amplificación mediante la PCR y el análisis del ADN de tal manera que no se puede determinar el hábitat de los insectos contaminantes. De esta manera, es deseable que el fragmento que se va a amplificar mediante la PCR que

50 corresponde a la región del ADN que se va a analizar se acorte por adelantado. De manera ventajosa, se pueden diseñar cebadores o similares como se describe en el presente documento para cubrir los productos amplificados mediante la PCR tan cortos como 1-200 pares de bases (pb), preferentemente 1-100 pares de bases (pb), más preferentemente 10-50 pares de bases (pb) excluyendo las regiones de los cebadores. De esta manera, dichos cebadores o similares como se describe en el presente documento tienen la ventaja de que la influencia de la

55 fragmentación del ADN pueda ser tan pequeña como sea posible.

En la presente invención, se ha observado amplificación mediante la PCR incluso si el ADN de Tribolium castaneum se ha degradado artificialmente por un tratamiento térmico o de presión o el ADN de Tribolium castaneum se ha degradado artificialmente por irradiación gamma, y su hábitat podría identificarse mediante la PCR en tiempo real.

60 Además, se ha observado amplificación mediante la PCR incluso en el caso de Tribolium castaneum almacenado a temperatura ambiente durante 5 meses que había muerto por causas naturales durante el cultivo. Estos resultados demuestran una gama muy amplia de aplicaciones de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía que muestra las bandas de la electroforesis del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Tailandia 1 y Okinawa 1.

5 La Figura 2 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Canadá 1. La Figura 3 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Chiba 1, Urawa 1 y Okayama 1. La Figura 4 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI

10 mitocondrial de Tribolium castaneum de Tailandia 2 y Tailandia 3. La Figura 5 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Canadá 2, Canadá 3, Okinawa 2, Okinawa 3, Chiba 2, Chiba 3, Okayama 2, Okayama 3, Urawa 2, y Urawa 3. La Figura 6 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI

15 mitocondrial de Tribolium castaneum de Tailandia 4, Tailandia 5, Okinawa 4, Okinawa 5, Canadá 4 y Canadá 5. La Figura 7 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Takarazuka 1, Takarazuka 2 y Takarazuka 3. La Figura 8 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen ND5 mitocondrial de Tribolium castaneum de Tailandia 1.

20 La Figura 9 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen ND5 mitocondrial de Tribolium castaneum de Okinawa 1. La Figura 10 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen ND5 mitocondrial de Tribolium castaneum de Tailandia 2, Tailandia 3, Okayama 1, Urawa 1, Chiba 1 y Canadá 1. La Figura 11 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen ND5

25 mitocondrial de Tribolium castaneum de Urawa 2, Urawa 3, Okayama 2, Okayama 3, Chiba 2, Chiba 3, Okinawa 2, Okinawa 3, Canadá 2 y Canadá 3. La Figura 12 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen ND5 mitocondrial de Tribolium castaneum de Takarazuka 1, Takarazuka 2 y Takarazuka 3. La Figura 13 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen ND5

30 mitocondrial de Tribolium castaneum de Tailandia 4, Tailandia 5, Okinawa 4, Okinawa 5, Canadá 4 y Canadá 5. La Figura 14 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Takarazuka 1 y Canadá 1 usando diferentes combinaciones de cebadores. La Figura 15 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI

35 mitocondrial de Tribolium castaneum de Takarazuka 1 y Canadá 1 usando diferentes combinaciones de cebadores. La Figura 16 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de la región del gen COI mitocondrial de Tribolium castaneum de Takarazuka 1 y Canadá 1 usando diferentes combinaciones de cebadores.

40 La Figura 17 es un diagrama que muestra los resultados de detección de un colorante fluorescente (VIC) usado para marcar la sonda para la principal isla de Japón en el análisis de datos de la PCR en tiempo real. La Figura 18 es un diagrama que muestra los resultados de detección de un colorante fluorescente (VIC) usado para marcar la sonda para la principal isla de Japón en el análisis de datos de la PCR en tiempo real. La Figura 19 es un diagrama que muestra los resultados de detección de un colorante fluorescente (FAM) usado

45 para marcar la sonda para zonas extranjeras en el análisis de datos de PCR en tiempo real. La Figura 20 es un diagrama que muestra los resultados de detección de un colorante fluorescente (FAM) usado para marcar la sonda para zonas extranjeras en el análisis de datos de PCR en tiempo real. La Figura 21 es un diagrama esquemático de un programa informático de análisis para identificar el hábitat de un insecto de la presente invención.

50 La Figura 22 es un diagrama esquemático de un ordenador usado con un programa informático de análisis para identificar el hábitat de un insecto. La Figura 23 es un diagrama que muestra que un ordenador funciona con un programa informático de análisis para identificar el hábitat de un insecto. La Figura 24 es un diagrama que muestra una tabla de criterios usada con un programa informático de análisis

55 para identificar el hábitat de un insecto. La Figura 25 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de Tribolium castaneum degradado artificialmente mediante un tratamiento térmico o de presión. El panel izquierdo muestra los resultados de la PCR del método A (fragmento amplificado de un tamaño de 435 pb), y un panel derecho que muestra el resultado de la PCR del método B (fragmento amplificado de un tamaño de 179 pb).

60 La Figura 26 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de Tribolium castaneum que ha muerto por causas naturales. La Figura 27 es una fotografía que muestra las bandas electroforéticas del ADN de Tribolium castaneum degradado artificialmente por irradiación gamma.

Realizaciones preferidas de la invención

La presente invención se explicará específicamente a continuación, pero no debe tomarse como una limitación de la siguiente descripción. Se describe un método para preparar un criterio para identificar el hábitat de insectos del

5 mismo tipo, el criterio resultante, un método para identificar el hábitat de un insecto usando el criterio, un cebador y una sonda para identificar el hábitat del insecto, y un programa informático de análisis para identificar el hábitat del insecto.

10 La presente invención se caracteriza por identificar el hábitat de insectos del mismo tipo de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica usando un criterio. Específicamente, se extrae el ADN de un insecto muestra y se analiza la secuencia de nucleótidos de una región correspondiente a la secuencia de nucleótidos de un criterio de la presente invención para evaluar si la secuencia de nucleótidos es idéntica o no a una secuencia de nucleótidos que

15 corresponde con el criterio, y si es idéntica, el hábitat del insecto muestra se identifica como un hábitat del criterio.

Como se usa en el presente documento, "insectos del mismo tipo" se refiere a insectos que no muestran diferencias

20 morfológicas típicas del hábitat, y no solamente se pueden usar insectos de la misma especie, sino cualquier insecto que no muestre diferencias morfológicas típicas del hábitat para preparar un criterio. En la taxonomía actual, las especies se clasifican principalmente por las diferencias morfológicas, por lo cual los insectos que pertenecen a las mismas especies tienen la misma morfología. En los casos donde insectos que tienen la misma morfología se distribuyen en diversas zonas del mundo, ha sido difícil identificar el hábitat de estos insectos a partir de sus

25 características morfológicas. La presente invención se caracteriza porque los hábitats de insectos que no se pueden identificar fácilmente a partir de sus características morfológicas se identifican de forma rápida y sencilla sobre la base de la biología molecular. Como se usa en el presente documento, los insectos son aquellos que pertenecen a la subclase Pterygota que constituyen una parte principal de la clase Insecta del phylum Arthropoda, preferentemente aquellos que pertenecen a los órdenes, pero sin limitación, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera,

30 Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera y Odonata. Más específicamente, incluyen, pero sin limitación, Orden Coleoptera tales como escarabajos; Orden Diptera tales como moscas, mosquitos y tábanos; Orden Hymenoptera tales como abejas y hormigas; Orden Lepidoptera tales como mariposas y polillas; Orden Hemiptera tales como cigarras e insectos del repollo; Orden Orthoptera tales como saltamontes y grillos; Orden Odonata tales como libélulas, etc., tal como se ha descrito anteriormente.

35 Tribolium castaneum, que pertenece a la familia Tenebrionidae del orden Coleoptera es más ampliamente conocido como un insecto perjudicial para los cereales en polvo tales como las harinas y sus productos procesados secundarios tales como tortas y pan y a menudo se encuentra en hogares, comercios de alimentos, molinos de harinas y molinos de alimentos, y se distribuye por casi todo el mundo excepto en regiones frías que tienen una

40 temperatura promedio anual de 15 ºC o menos tales como las zonas septentrionales del continente norteamericano, Siberia e Inglaterra. Es un insecto preferente de la presente invención debido a que no muestra diferencias morfológicas típicas del hábitat tanto en Japón como en el extranjero.

Los insectos usados para la preparación de un criterio de la presente invención se pueden suministrar o adquirir de

45 distribuidores de insectos o proveedores de insectos, o se pueden recoger en almacenes o factorías, casas o en el campo tal como en matorrales o en matas de hierba, o encontrarse en alimentos que se pueden usar también. Los insectos suministrados o adquiridos o recogidos u obtenidos de otra manera deben criarse en aislamiento de cada fuente para evitar que insectos de diferentes fuentes se mezclen.

50 <Hábitat de un insecto de la presente invención>

Como se usa en el presente documento, el término "hábitat de un insecto" se refiere a la zona donde vive el insecto de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica. La zona donde un insecto vive y el país no son siempre idénticos, y puede producirse una diversidad de insectos en una zona aislada por el mar incluso en el mismo país o en una

55 zona aislada por ríos o montañas incluso en zonas vecinas. Por otra parte, el mismo insecto en términos de biología molecular puede crecer a través de una pluralidad de países diferentes que pertenecen al mismo continente. Además, un insecto procedente de la zona de envío puede habitar en un aeropuerto o puerto de la ruta de transporte como resultado del transporte a lo largo del mundo. Después, el cargamento que transporta el insecto procedente de la zona de envío se transporta a una factoría y se desempaqueta, el insecto puede habitar adicionalmente la zona

60 que rodea la factoría. Por tanto, el término "zona" que se usa en el presente documento incluye no solo las zonas basadas en el país sino también continentes, zonas o regiones en el mismo país, lugares a través de los que se trasporta el cargamento tales como aeropuertos y puertos, y almacenes y factorías tal como se ha descrito anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término "criterio" se refiere a un indicador para identificar el hábitat de un insecto de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, y define un hábitat que corresponde a cada tipo clasificado

5 sobre la base de un polimorfismo de nucleótido único, como se analiza en detalle más adelante. Uno o más hábitats pueden corresponder a un tipo. Cuando un insecto procedente de la zona de envío habita un lugar en la ruta de transporte, por ejemplo, se supone que los sitios discriminadores del tipo de insectos que habitan la zona de envío y el insecto que habita un lugar en la ruta de transporte pertenecen al mismo tipo, por lo cual un tipo cubre ambos hábitats, es decir, la zona de envío y el lugar en la ruta de transporte. Como se muestra en los Ejemplos siguientes y en la Tabla 1, puede existir una pluralidad de tipos en una zona. Específicamente, La Tabla 1 que se muestra a continuación demuestra que existen dos haplotipos en cada zona excepto para los nucleótidos procedentes de la isla principal de Japón. Como se usa en el presente documento, haplotipo significa una secuencia de nucleótidos que contiene diferentes polimorfismos, es decir, polimorfismos de múltiples nucleótidos únicos (SNP) en moléculas de ADN homólogo de organismos del mismo tipo que muestran un modelo de un conjunto completo de cambios.

15 Por ejemplo, existe una relación haplotípica entre Okinawa 2-5 del tipo 2 de Japón y Okinawa 1 del tipo 3 de Japón; Tailandia 1, 3-5 del tipo 1 extranjero y Tailandia 2 del tipo 2 extranjero; Canadá 1, 4, 5 del tipo 3 extranjero y Canadá 2, 3 del tipo 4 extranjero, en la Tabla 1 que se muestra a continuación. En esos casos, existen múltiples tipos en una zona.

La secuencia de nucleótidos del ADN (denominada a partir de ahora algunas veces "datos de la secuencia") de un insecto de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica usada para preparar un criterio de la presente invención puede derivarse del ADN mitocondrial o del ADN nuclear. Especialmente, es preferible el ADN mitocondrial debido a que experimenta sustituciones de nucleótidos más rápidamente que el ADN nuclear de tal manera que se cree que

25 es más variable entre hábitats, y el mayor número de copias por células permite la preparación en grandes cantidades y facilita por tanto el análisis.

Los ejemplos de criterios de la presente invención incluyen los que se muestran en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra los resultados del análisis de nucleótidos de polimorfismos de nucleótidos únicos en las dos regiones del gen COI y la región del gen ND5 mitocondriales de Tribolium castaneum, desvelando 15 y 5 polimorfismos típicos de su propio hábitat en la región COI y en la región ND5, respectivamente, por lo cual las secuencias se han clasificado actualmente en siete tipos. Se puede usar la tabla de criterios para analizar, por ejemplo, la región COI (379pb de longitud) y la región ND5 (473 pb de longitud) del ADN mitocondrial de una muestra de Tribolium castaneum y determinar el tipo al cual pertenece, identificando por tanto el hábitat de la muestra de Tribolium castaneum. Las

35 zonas que se pueden determinar actualmente incluyen la isla principal de Japón, Okinawa, Tailandia y Canadá, pero pueden aumentar los criterios y se pueden determinar más zonas analizando el ADN mitocondrial de Tribolium castaneum derivado de otros hábitats para evaluar polimorfismos.

<Método para preparar un criterio de la presente invención>

La presente invención se refiere a un método para preparar un criterio para identificar el hábitat de insectos de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende específicamente las etapas de:

(a) determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más zonas; 45 (b) alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a);

(d): definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios discriminadores de tipos;

55 Sin embargo, la presente divulgación no se limita a estos métodos, y se pueden usar también las modificaciones adecuadas de otros métodos comúnmente conocidos.

(a) Etapa de determinación de las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats

Se ha usado el ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats para preparar un criterio en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término "ADN de dos o más hábitats" significa que se han usado 2 o más, preferentemente 5 o más, más preferentemente 7 o más secuencias de datos de insectos que tienen la misma 65 morfología pero diferentes hábitats. Los hábitats de los insectos usados pueden seleccionarse adecuadamente para el fin de la aplicación del criterio, pero preferentemente deben seleccionarse de zonas aisladas geográficamente de

tal manera que se puedan encontrar diferencias entre los hábitats. El término "ADN de uno o más insectos" significa que se han usado una o más, preferentemente 3 o más, más preferentemente 5 o más secuencias de datos de insectos de cada hábitat como se ha descrito anteriormente. Esto permite la preparación de un criterio específico y preciso del hábitat.

5 Los datos de la secuencia de un insecto usados para preparar un criterio de la presente invención se pueden determinar de forma rutinaria utilizando la secuencia de nucleótidos del ADN extraído del insecto de forma única. Se ilustra a continuación un método para extraer ADN de un insecto de forma única para determinar la secuencia de nucleótidos.

(1) Recogida de insectos

El "ADN" utilizado en la presente invención puede extraerse del cuerpo completo o de una parte (antena, tórax, alas, pata, etc.) de un insecto. Es preferible usar el cuerpo completo de uno o unos pocos individuos en el caso de

15 insectos pequeños tales como Phoridae o una parte del cuerpo (una cualquiera de antena, tórax (o el músculo del mismo), ala anterior, ala posterior, pata, etc.) en el caso de insectos grandes tales como Musca domestica o insectos más anchos.

(2) Extracción del ADN

20 Se puede extraer el ADN utilizando un método conocido en la técnica incluyendo el método CTAB (Bromuro de cetiltrimetil amonio) o utilizando un kit comercialmente disponible tal como el Qiagen DNeasy Tissue Kit (Qiagen) o ISOPLANTII (NIPPON GENE CO., LTD.). En términos de procesabilidad y economía, es preferible el método CTAB.

25 (3) Amplificación de un fragmento de ADN

El ADN extraído según lo anterior se amplifica mediante un método de la PCR. El método de la PCR utilizado en la presente invención no está específicamente limitado, e incluye métodos de la PCR conocidos y diversos métodos mejorados. Se muestra un ejemplo más adelante. Es decir, se mezclan un conjunto de cebadores y el molde de ADN

30 con reactivos tales como Tris-HCl, KCl, MgCl2, cada dNTP, TaqADN polimerasa para preparar una solución de la PCR. Un ciclo de la PCR consiste en tres etapas: desnaturalización térmica, hibridación, y reacción de alargamiento (síntesis) de una cadena de ADN con una ADN polimerasa. Cada etapa requiere una temperatura de reacción y un periodo de reacción diferente o igual, que se determinan adecuadamente dependiendo de la secuencia de nucleótidos, la longitud y otros de una región de ADN que se va a amplificar. Estos procedimientos se pueden

35 conseguir usando un ciclador térmico comercial.

Los ejemplos de cebadores usados en la presente divulgación incluyen cebadores existentes usados para el análisis filogenético de los insectos que se describen en los siguientes Ejemplos, incluyendo un conjunto de cebadores derivados del gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) (L6625/H7005 (SEC ID Nos: 13 y 14))

40 y/o un conjunto de cebadores derivados del gen de la subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa (ND5) (F6999/R7495 (SEC ID Nos: 15 y 16)).

En los casos donde no se puede amplificar una banda deseada con cebadores existentes en algunas especies de insectos, se diseñan y se usan cebadores adecuados que flanquean el nucleótido del criterio, es decir, una región

45 que contiene el nucleótido del criterio. Los cebadores se seleccionan preferentemente para permitir la amplificación de una banda deseada en más especies de insectos.

(4) Verificación de la amplificación mediante la PCR

50 Como método para evaluar los resultados de la PCR (productos de la PCR), se usa cualquier método que permita la identificación de un fragmento específico del ADN tal como por ejemplo, electroforesis, filtración en gel o hibridación para verificar que se ha amplificado un fragmento de ADN de un tamaño deseado. Por ejemplo, la verificación se hace de tal manera que se amplifique un fragmento de 435 pb de longitud cuando se usa un conjunto de cebadores derivado del gen COI mitocondrial, o de tal manera que se amplifique un fragmento de 513 pb de longitud cuando se

55 usa un conjunto de cebadores derivado del gen ND5.

(5) Purificación de los productos de la PCR

Los productos amplificados mediante la PCR se separan de los componentes utilizados para la reacción tales como

60 los cebadores en exceso de tal manera que se puedan usar como moldes para la reacción de secuenciación en ciclos. Esta purificación se puede llevar a cabo utilizando, por ejemplo, un kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) comercialmente disponible siguiendo el protocolo adjunto.

(6) Reacción de secuenciación en ciclos y purificación de los productos secuenciados

Para secuenciar los productos de la PCR purificados como se ha descrito anteriormente, se usan como moldes para llevar a cabo una reacción de secuenciación en ciclos. Este método es similar a la PCR, y comprende repetir tres 5 etapas de desnaturalización térmica, hibridación, y una reacción de alargamiento de una cadena de ADN con una ADN polimerasa utilizando un ciclador térmico para sintetizar varios fragmentos de ADN monocatenarios de diferentes longitudes usando tanto un cebador en presencia de un terminador marcado con cuatro colorantes fluorescentes diferentes cada uno para un nucleótido. Se puede llevar a cabo la secuenciación en ciclos utilizando un kit de secuenciación en ciclos BigDye Terminator v1.1 comercialmente disponible (ABI), por ejemplo. Específicamente, se puede llevar a cabo el procedimiento siguiendo el protocolo japonés del kit ("Cycle sequencing of single-stranded DNA and double-stranded DNA" en la p. 22, "Cycle sequencing in GeneAmpPCR System 9700, 9600, 2700, 2400" en la p. 25, y "Purification method on spin columns (or spin plates)" en las pp. 38-40). Las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados pueden ser las mismas que las usadas para la amplificación de un fragmento de ADN deseado mediante la PCR. Es decir, se han añadido materiales predeterminados a una

15 solución purificada del producto de la PCR opcionalmente diluido con agua destilada estéril para preparar una solución de reacción de secuenciación en ciclos. Un microtubo de PCR que contenía esta solución se introdujo en un reactor de la PCR para llevar a cabo la desnaturalización (por ejemplo, 96°C, 1 minuto) seguido por ejemplo de, 25 ciclos de desnaturalización (por ejemplo, 96°C, 10 segundos), hibridación (por ejemplo, 50°C, 5 segundos) y alargamiento (por ejemplo, 60°C, 4 minutos). Si la muestra no se puede recoger inmediatamente tras la finalización de la reacción, la temperatura del bloque de muestra puede disminuirse y mantenerse a este nivel.

Después, una solución mixta de los productos secuenciados, es decir, ADN monocatenario, se purifica a partir de la solución de reacción obtenida anteriormente para preparar una muestra para uso en el secuenciador posterior. Un ejemplo de este método es un método que utiliza la Columna de Giro CENTRISEP (ABI) siguiendo el protocolo

25 adjunto para preparar una muestra deseada.

(7) Secuenciación de fragmentos de ADN

Se secuenciaron los productos secuenciados obtenidos mediante el método del colorante terminador descrito anteriormente. Un método típico utiliza la electroforesis, y como ejemplo, comprende llevar a cabo la electroforesis utilizando el analizador genético ABI PRISM 310, y determinar secuencialmente las secuencias de nucleótidos mediante un detector de fluorescencia láser sobre la base de la diferencia de las sustancias fluorescentes utilizadas como marcas entre los nucleótidos.

35 (8) Análisis de las secuencias de nucleótidos

Se analizaron las secuencias de nucleótidos determinadas para proporcionar los datos de la secuencia. Cuando se usa por ejemplo un conjunto de cebadores derivado del gen COI mitocondrial y del gen ND5, se obtiene una secuencia de datos de 300-600 pb de longitud desde cada uno de los extremos 5' (en el lado del cebador L6625 o F6999) y 3' (en el lado del cebador H7005 o R7495). Se verificaron las secuencias de datos obtenidas para determinar las secuencias de nucleótidos exactas.

Los datos de la secuencia de un insecto usados como criterio de la presente invención se pueden determinar de forma rutinaria utilizando la secuencia de nucleótidos del ADN extraído del insecto de forma única, o puede ser una

45 secuencia de datos conocida disponible de bases de datos públicas. Los datos de la secuencia conocidos que se pueden usar incluyen, por ejemplo, datos de la secuencia de insectos en bases de datos tales como bases de datos del GeneBank (base de datos NIH de secuencias genéticas) y DDBJ (Banco de datos de ADN de Japón). Los datos de las secuencias investigados y descargados de estas bases de datos se pueden usar en la alineación (análisis de alineación múltiple) directamente o después de haber extraído una región continua. En este caso, es preferible que se haya identificado el hábitat tal como el lugar de recogida del insecto a partir del que se derivan los datos de la secuencia de la base de datos.

(b) Etapa de alineación de las secuencias de nucleótidos

55 Los datos de la secuencia de al menos un insecto individual por hábitat se seleccionan para dos o más hábitats a partir de los resultados de los análisis reales obtenidos como anteriormente o a partir de datos conocidos, y se alinearon como se ha descrito anteriormente.

Como se usa en el presente documento, la alineación se refiere a un procedimiento donde una pluralidad de secuencias de nucleótidos obtenidas de individuos se disponen en hileras de tal manera que aparezcan restos homólogos en columnas sucesivas, determinando de esta forma la homología entre las secuencias de nucleótidos. Dicho procedimiento se denomina también alineación múltiple y se usa convencionalmente en el campo de la biología molecular para extraer un motivo de una determinada secuencia de nucleótidos, la suposición de la estructura o función de una secuencia de nucleótidos concreta, y la preparación de una genealogía evolutiva. De 65 esta manera, la alineación de la presente invención incluye cualquier procedimiento usado normalmente para estos análisis tal como el uso de un programa informático de análisis tal como DNAspace (de Hitachi Software Engineering

Co., Ltd.). Los datos de la secuencia utilizados para la alineación en la presente invención incluyen secuencias de nucleótidos de 20 pb o más, preferentemente 50 pb o más, más preferentemente 20 – 10000 pb, más preferentemente 50 – 5000 pb de longitud.

5 Los datos de la secuencias de una pluralidad de insectos usados en la presente invención deben contener una región compartida (denominada también a partir de ahora en el presente documento "región consenso") de tal manera que se pueda alinear. De esta manera, por ejemplo, un conjunto de datos de la secuencia obtenidos el análisis real, es decir, una región amplificada con los cebadores deseados y secuenciada se define como una región consenso, y se seleccionan datos de la secuencia que contienen la región consenso de una base de datos pública y se usan directamente o se ha extraído una región continua. Más específicamente, se usan los nombres de las especies y subespecies y el nombre de una proteína (enzima, etc.) codificada por el gen como palabras clave para investigar en una base de datos, o se lleva a cabo la investigación de la homología (investigación mediante BLAST) sobre la base de datos de la secuencia obtenidos mediante análisis real, y se seleccionan y descargan datos de la secuencias que tienen la región de los datos de la secuencia obtenida mediante análisis real. Los datos de las

15 secuencias descargados de estas bases de datos se pueden usar en la alineación (análisis de alineación múltiple) directamente o después de haber extraído una región continua. La región consenso seleccionada no está específicamente limitada, y puede ser una región que expresa una función o estructura específica tal como el gen ND5 mitocondrial o una región genéticamente no funcional. Cuando se conoce por adelantado una región variable entre hábitats, dicha región se selecciona preferentemente. Por ejemplo, son preferibles los genomas mitocondriales debido a que tienen un número mayor de copias sin función de reparación y evolucionan rápidamente de tal manera que se cree que son más variables entre hábitats y se sabe que reflejan más exactamente las relaciones genealógicas debido a que se heredan por vía materna. Específicamente, el gen COI mitocondrial y el gen ND5 son especialmente preferibles como regiones consenso de criterios debido a que evolucionan rápidamente y se cree que son más variables entre hábitats. La región consenso es preferiblemente amplificable mediante la PCR. Por ejemplo,

25 dichas regiones incluyen regiones amplificables utilizando los cebadores descritos en los Ejemplos siguientes. El tamaño de la región consenso se selecciona para proporcionar una secuenciación fiable en el intervalo de aproximadamente 20 – 2000 pb, aproximadamente 50-1000 pb, preferentemente, 100-700 pb, más preferentemente 100-500 pb.

La región consenso para preparar un criterio puede no ser una región, pero se pueden seleccionar múltiples regiones. Puede prepararse un criterio específico de más hábitats utilizando múltiples regiones. Específicamente, se puede preparar un criterio específico del hábitat de Tribolium castaneum analizando las secuencias en la región del gen COI y la región del gen ND5 de Tribolium castaneum mediante alineación múltiple usando un programa informático de análisis tal como ClustalW2 de EMBL-EBI en Internet y el hallazgo de polimorfismos de nucleótidos

35 únicos (SNP) en cada región, y a continuación combinándolos, como se describe en los siguientes Ejemplos.

(c) Etapa de eliminación de los nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos anteriores

Después, se eliminan los sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas de esta manera a partir de las secuencias de nucleótidos anteriores. Dicha eliminación de regiones de nucleótidos conservadas en todas las secuencias de nucleótidos desvela claramente la presencia de polimorfismos de nucleótidos únicos y facilita posteriormente la tipación basada en SNP.

Específicamente, los sitios de nucleótidos conservados en las secuencias de nucleótidos de todos los individuos se

45 extraen de los datos obtenidos por alineación. El término "nucleótido conservado" significa que todos los nucleótidos son iguales en una columna de los datos de alineación resultantes en las secuencias de nucleótidos de todos los individuos. Se eliminan todos los sitios extraídos. Se explica a continuación el motivo por el cual todos los sitios conservados se eliminan.

Cuando se comparan secuencias de nucleótidos de insectos de igual morfología, casi todos los nucleótidos están compartidos por todos los individuos. Sin embargo, la presente invención se caracteriza por centrarse en polimorfismos de nucleótidos únicos más bien que en restos compartidos por todos los individuos y se pretende preparar un criterio basado en el hallazgo de una correlación entre polimorfismos de nucleótidos únicos y hábitats. Se puede usar cualquier método que pueda nucleótidos conservados en las secuencias de nucleótidos de todos los

55 individuos, tales como por manipulación visual o mecánica.

(d) Etapa de preparación de sitios discriminadores de tipo

Todos o parte de los sitios que quedan tras la eliminación como se han definido anteriormente se definen como sitios discriminadores de tipo. El sitio discriminador de tipo de la presente invención consiste en todo o parte de los sitios de nucleótidos no conservados en todas las secuencias de nucleótidos de insectos de la misma morfología procedentes de diferentes hábitats. El término "nucleótido no conservado" significa que no todos los nucleótidos son iguales en una columna de los datos de alineación resultantes en las secuencias de nucleótidos de todos los individuos, e incluso un resto que contiene un cambio de nucleótido de un solo individuo no se considera 65 conservado. El sitio discriminador de tipo en un criterio de la presente invención consiste en el nucleótido no conservado, pero se puede eliminar dicho nucleótido del sitio discriminador de tipo si se localiza en un sitio no muy

fiable o en un sitio que soporta preferentemente poca relación con las propiedades del hábitat. El número de nucleótidos contenido en un sitio discriminador de tipo es de uno o más, preferentemente 3-50, más preferentemente 5-30, más preferentemente 15-30.

5 (e) Etapa de tipación

Después, se comparan los nucleótidos que corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipo de todos los individuos y se clasifican. Es decir, los sitios discriminadores de tipo completamente idénticos se clasifican como el mismo tipo, y los sitios discriminadores de tipo incompletamente idénticos se clasifican como uno o más tipos diferentes. Aquí, el término "sitios discriminadores de tipo completamente idénticos" significa que todos los nucleótidos que constituyen el sitio discriminador de tipo son idénticos, y el término "sitios discriminadores de tipo incompletamente idénticos" significa que uno o más nucleótidos pueden ser diferentes en todos los nucleótidos que constituyen el sitio discriminador de tipo. Por tanto, pueden existir uno o más tipos diferentes.

15 (f) Etapa de preparación de un criterio

Finalmente, se puede definir el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio por determinación del hábitat de cada tipo clasificado sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo. Específicamente, el hábitat que corresponde presumiblemente a un tipo se determina mediante evaluación comprehensiva de las relaciones geográficas entre el hábitat a partir del cual un insecto pertenece a un tipo y el hábitat a partir del cual un insecto pertenece a otro tipo, la fuente de un insecto que pertenece a un tipo tal como la ruta de recogida, y similares.

En el caso de los criterios de Tribolium castaneum que se muestran en la siguiente Tabla 1, por ejemplo, los hábitats

25 a partir de los cuales se derivan los insectos que pertenecen al tipo 1 de Japón son Urawa, Okayama, Chiba y Takarazuka, el hábitat a partir de los cuales se derivan los insectos que pertenecen al tipo 2 de Japón es Okinawa, el hábitat a partir de los cuales se derivan los insectos que pertenecen al tipo 3 de Japón es también Okinawa, el hábitat a partir de los cuales se derivan los insectos que pertenecen al tipo 1 del extranjero es Tailandia. De esta manera, el hábitat que corresponde presumiblemente a tipo 1 de Japón se determina para que sea la principal isla de Japón aislada por el mar, por lo cual, el sitio discriminador de tipo del tipo 1 de Japón se puede definir como un criterio de la principal isla de Japón. De manera similar, los sitios discriminadores de tipo del tipo 2 de Japón y del tipo 3 de Japón pueden definirse como criterio de Okinawa.

Debe señalarse que los criterios que se describen en el presente documento pueden mejorarse para que sean

35 criterios más precisos añadiendo datos de secuencias recientes a los datos de secuencias previamente acumulados para llevar a cabo la anterior etapa (b) y las posteriores etapas para preparar un criterio descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede añadir un criterio de la principal isla de Japón diferente al tipo 1 de Japón a los datos de secuencias de insectos que habitan una zona de la principal isla de Japón diferente de Urawa, Okayama, Chiba y Takarazuka descritos anteriormente para preparar el criterio. Alternativamente, una zona que corresponde al tipo 1 extranjero puede cambiarse de Tailandia a Tailandia y zona circundante añadiendo los datos de secuencias de insectos que habitan zonas geográficamente no aisladas que rodean Tailandia para preparar el criterio.

45 De acuerdo con la presente invención, se puede preparar también un criterio discriminador de zona para identificar si el hábitat de un insecto es una zona o no.

Como se usa en el presente documento, el término "criterio discriminador de zona" se refiere a un criterio para identificar si el hábitat de un insecto es una zona o no, tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, un criterio que permite la identificación de un insecto muestra es Tribolium castaneum que habita la principal isla de Japón u otras zonas, como ejemplo.

El "criterio discriminador de zona" de la presente invención se puede preparar como sigue. Se trata de un método que comprende las etapas de comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los criterios obtenidos

55 mediante el método descrito en <Método para preparar un criterio de la presente invención> antes de extraer un nucleótido existente en un solo tipo pero no en otros tipos, y preparar un criterio discriminador de zona a partir de uno o más nucleótidos extraídos en la etapa precedente solo o en combinación. Cualquier nucleótido existente en un solo tipo pero no en los otros tipos puede ser un criterio discriminador de zona de la presente invención, pero se puede proporcionar una identificación más precisa si los nucleótidos en los otros tipos son idénticos.

Como ejemplo de un criterio discriminador de zona de la presente invención, el nucleótido 229º de la región COI es G en el tipo 1 de Japón en contraste a A en los otros tipos entre los criterios que se muestran en la Tabla 1 siguiente de tal manera que "el nucleótido 229º G" puede ser un indicador para discriminar el tipo 1 de Japón de los otros tipos, es decir, un criterio discriminador de zona. De manera similar, el nucleótido 253º T y el nucleótido 298º G de la 65 misma región y el nucleótido 248º A de la región NDS son nucleótidos específicos del tipo 1 de Japón de tal manera que pueden ser indicadores para discriminar el tipo 1 de Japón de otros tipos. En otro caso, el nucleótido 22º de la

región COI es t en los tipos Canadá (tipo 3 extranjero y tipo 4 extranjero) mientras que es A en los otros tipos de tal manera que "el nucleótido 22º T" puede ser un indicador para discriminar los tipos Canadá de los otros tipos, es decir, un criterio discriminador de zona. De manera similar, el nucleótido 142º G es también un nucleótido específico de los tipos Canadá de tal manera que puede ser un indicador para discriminar los tipos Canadá de los otros tipos.

5 La Tabla 1 muestra los resultados del análisis de nucleótidos de polimorfismos de nucleótidos únicos en las dos regiones del gen COI mitocondrial y la región del gen ND5 de Tribolium castaneum. Cuando se usan estos criterios, el hábitat de una muestra de Tribolium castaneum se encuentra que es la principal isla de Japón si (1) se satisfacen uno o más de los siguientes criterios: el nucleótido 229º de la región COI de la muestra de Tribolium castaneum es G, el nucleótido 253º es T y el nucleótido 298º es G, y/o (2) el nucleótido 248º de la región NDS es A. Se ha descubierto que el hábitat de una muestra de Tribolium castaneum es Canadá, si el nucleótido 22º de la región COI de la muestra de Tribolium castaneum es T y/o el nucleótido 142º es G.

De acuerdo con la presente invención, un criterio discriminador de zona puede no identificar una zona, pero múltiples criterios discriminadores de zonas pueden identificar una zona.

15 <Método para identificar el hábitat de un insecto usando un criterio de la presente invención>

La presente invención proporciona también un método para identificar el hábitat de un insecto. Específicamente, se proporciona un método para identificar el hábitat de un insecto muestra de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende comparar la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio de la presente invención que se ha definido anteriormente y una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra, y analizar si un nucleótido del sitio correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la muestra es idéntico o no al nucleótido del criterio, identificando por tanto el hábitat de la muestra.

(a) Comparación de secuencias de nucleótidos

En el método para identificar el hábitat de un insecto usando un criterio de la presente invención, la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de la presente invención se compara en primer lugar con una secuencia de nucleótidos que corresponde con la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica.

Se puede llevar a cabo la comparación mediante evaluación visual o cálculo matemático. Alternativamente, se puede usar un programa informático.

35 Se ilustra a continuación un método de comparación usando un programa informático de análisis. Es decir, se almacena por adelantado una tabla de criterios que contiene datos que representan el nucleótido de un criterio obtenido mediante el método descrito anteriormente y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos en un ordenador en el cual se ejecuta un programa informático de análisis tal como SeqScape (ABI). Se pueden almacenar una o más tablas de criterios. Después, se almacena en el ordenador una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra. Se puede obtener la secuencia de nucleótidos de la muestra extrayendo el ADN y analizando la secuencia de nucleótidos de la muestra de la misma manera que se ha descrito en <Método para preparar un criterio de la presente invención>,

45 "(a) Etapa de determinación de las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats" anterior. En este caso, la secuencia de nucleótidos de la muestra se prepara para incluir la misma región que el criterio de referencia. Después, el ordenador compara los datos que representan nucleótidos de las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos entre la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios con referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos de la tabla de criterios. Se puede llevar a cabo la comparación alineando ambas secuencias de nucleótidos utilizando el programa informático para análisis.

(b) Análisis de los nucleótidos de un criterio y una muestra

55 En el método para identificar el hábitat de un insecto usando un criterio de la presente invención, se identifica el hábitat de la muestra analizando si un nucleótido del sitio que corresponde al criterio en las secuencias de nucleótidos de la muestra es idéntico al nucleótido del criterio tras la comparación en (a) descrita anteriormente.

Específicamente, se hace un análisis de si un nucleótido en el sitio correspondiente al criterio en la secuencia de nucleótidos de la muestra es completamente idéntico o no al nucleótido del criterio, y si es completamente idéntico, indica que la muestra es un insecto que procede de un hábitat al cual pertenece el criterio. Incluso si esta no es completamente idéntica, puede esperarse el hábitat de la muestra. Por ejemplo, puede esperarse la zona en alguna extensión a partir del hábitat del criterio incluso si uno o unos pocos de los nucleótidos del criterio no son idénticos,

65 pero otros nucleótidos son idénticos.

De esta manera, el hábitat del insecto muestra puede identificarse usando un criterio de la presente invención. En el caso de un análisis informático, el hábitat del insecto muestra puede identificarse de manera sencilla y rápida comparando y analizando la secuencia de nucleótidos de la muestra y la secuencia de nucleótidos de cada hábitat a su vez cuando se ha registrado por adelantado la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio acerca

5 de múltiples hábitats.

La comparación puede hacerse fácilmente marcando o etiquetando de otra manera un nucleótido concreto definido como criterio. Es decir, se alinean una secuencia de nucleótidos que tiene un nucleótido del control coloreado (criterio) y una secuencia de nucleótidos de una muestra, y a continuación se extrae solamente el nucleótido coloreado para preparar una tabla comparando ambos. Esto facilita la identificación de si todos los tipos de nucleótidos y sus localizaciones son idénticos o no, facilitando por tanto la identificación de si el insecto muestra pertenece o no al hábitat del criterio. Este método es preferible debido a que se incluso pueden analizar simultáneamente múltiples muestras.

15 <Programa informático de análisis para identificar el hábitat de un insecto>

Se describe también un programa informático de análisis para que un ordenador ejecute un procedimiento para identificar el hábitat de un insecto de la presente invención.

Un programa informático de análisis para identificar el hábitat de un insecto usando un criterio de la presente invención comprende una tabla de criterios que contiene datos que representan el nucleótido de un criterio, y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos. Específicamente, es un programa informático, que permite a un ordenador hospedador utilizado para el análisis funcionar como un medio que comprende (1) medios para almacenar una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que

25 representan un nucleótido obtenido del insecto muestra, y (2) medios para comparar los datos que representan nucleótidos de las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos entre la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios con referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos de la tabla de criterios, dirigiendo por tanto sus recursos de hardware a cooperar entre sí para identificar el hábitat del insecto (Figura 21). El ordenador, en el contexto de la presente invención, comprende recursos de hardware típicos tales como un dispositivo de entrada (3), un dispositivo de salida (4), una memoria (5), y una CPU (6), etc. (Figura 22). Será evidente para los expertos en la materia que los medios de la presente invención pueden organizarse combinando los recursos de hardware.

Para identificar el hábitat de un insecto utilizando el programa informático de análisis de la presente invención, es

35 deseable proporcionar tablas de criterios múltiples relacionadas con diversos hábitats del insecto. Aquí, una tabla de criterios puede estar relacionada solamente con un hábitat o más de un hábitat. Además, el programa informático de análisis de la presente invención puede almacenarse en medios de almacenamiento de datos (ROM, RAM, etc.) a los cuales puede acceder un ordenador conectado a una red que permita al ordenador funcionar como un medio necesario para identificar el hábitat y ejecutar los procedimientos necesarios. De esta manera, el programa informático de análisis de la presente invención puede escribirse en cualquier lenguaje de programación funcional en un ordenador utilizado en la presente invención o mediante una red. Específicamente, se puede usar un ordenador que ejecuta un programa informático de análisis tal como SeqScape (ABI) y donde se ha almacenado un criterio para cada hábitat de un insecto. Alternativamente, el programa informático de análisis de la presente invención puede ser un programa que permita a un ordenador funcionar como sigue (Figura 23). De esta manera, existen al

45 menos una o más tablas de criterios, que se han almacenado en una memoria del ordenador por adelantado o se pueden almacenar en este (SO), y se pueden distinguir entre sí por números. Una tabla de criterios contiene datos que representan el nucleótido de un criterio en una secuencia de nucleótidos en la primera columna, y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos en la segunda columna (Figura 24). Por ejemplo, los nucleótidos A, T, G y C pueden estar codificados por sus códigos ASCII "A", "T", "G" y "C" y se describen como datos. En la memoria descriptiva y en los dibujos adjuntos, los datos en la iésima hilera, la iésima columna en la tabla de criterios mésima se describe como "criterio m[c][r]".

(i) Una lista de secuencias de nucleótidos de muestra se almacena en una memoria (S1). La lista de secuencias de nucleótidos de muestra contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra (Figura

55 24). El nésimo dato corresponde a un nucleótido en la posición n de la secuencia de nucleótidos. El nésimo dato de la lista de secuencias de nucleótidos de muestra se describe como "secuencia de nucleótidos de muestra [n]".

(ii) Se seleccionan una o más tablas de criterios de muestra. Este procedimiento puede ejecutarse asignando un valor adecuado (aquí, valor 1) a la variante m que representa el número de la tabla de criterios (S2).

(iii) Los datos de la primera columna de todas las hileras de la tabla de criterios mésima se comparan con los datos de una lista de secuencias de nucleótidos de muestra correspondiente. Puede decidirse esta relación de correspondencia haciendo referencia a la segunda columna de la tabla de criterios (Figura 24). Este procedimiento puede ejecutarse en un programa, por ejemplo, mediante un proceso en bucle utilizando la variante r que representa la hilera de una tabla de criterios que va a denominarse (S3-S8).

(iv) Si la comparación de todas las hileras de la tabla de criterios mésima en (iii) desvela que los datos comparados

65 son completamente idénticos, la zona relacionada con esta tabla de criterios puede identificarse como el hábitat del insecto muestra. En este caso, se ejecuta un procedimiento en el caso de identificación satisfactoria de un

hábitat (S10). Este procedimiento implica notificar la zona relacionada con esta tabla de criterios mediante un dispositivo de salida o similar.

(v) Si aparecen datos emparejados de manera incorrecta durante la comparación con la tabla de criterios mésima en (iii), el procedimiento (iii) se repite en otra tabla de criterios (S12). Si el procedimiento se ha repetido ya en

5 todas las tablas de criterios (S11), se ejecuta un procedimiento en el caso de ausencia de cualquier tabla de criterios completamente idéntica o similar (S13). Este procedimiento implica suministrar un mensaje relevante mediante un dispositivo de salida o similar.

Como se explica en Método para identificar el hábitat de un insecto usando un criterio de la presente invención (b), se puede esperar el hábitat de una muestra incluso si la secuencia de nucleótidos del criterio y la secuencia de nucleótidos de una zona que corresponde al criterio del insecto muestra no son completamente idénticas. Por ejemplo, puede esperarse la zona en alguna extensión a partir del hábitat del criterio incluso si uno o unos pocos de los nucleótidos del criterio no son idénticos, pero otros nucleótidos son idénticos. En el programa informático de análisis de la presente invención, por tanto, puede identificarse también el hábitat de un insecto muestra ejecutando

15 los procedimientos anteriores en una tabla de la región conservada que contiene datos que representan un nucleótido conservado solamente en insectos de un hábitat en un criterio y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos más bien que en una tabla de criterios. La estructura de datos de esta tabla de la región conservada es la misma que la de la tabla de criterios.

Para que el programa informático de análisis de la presente invención se ejecute en un ordenador, se usan los programas necesarios para acceder a los mismos mediante redes informáticas tales como, por ejemplo, sistemas operativos (OS) bien conocidos o programas informáticos de navegación por Internet además de los programas informáticos de análisis de la presente invención. Los sistemas operativos bien conocidos incluyen, pero sin limitación, Windows(R), Mac OS, Linux, FreeBSD, Solaris, etc.

25 El programa informático de análisis de la presente invención permite que datos normalizados de los criterios para cada insecto o cada hábitat o similares y el programa de identificación que los utiliza se almacenen por categorías. Esto es preferible para que el hábitat de una muestra pueda identificarse rápidamente.

El programa informático de análisis de la presente invención puede registrarse en un medio legible por ordenador o en medios de almacenamiento conectables a un ordenador, y se puede leer según sea adecuado de manera que puede ejecutarse y servir en un ordenador. De esta manera, se describen también en el presente documento medios

35 de registro y medios de almacenamiento para ordenadores que contienen el programa informático de análisis de la presente invención. Dichos medios de registro o medios de almacenamiento incluyen, pero sin limitación, medios magnéticos tales como discos flexibles, discos duros, almacenamientos de memoria; medios ópticos tales como CD, DVD; medios magneto-ópticos tales como MO, MD.

El programa informático de análisis de la presente invención puede ejecutarse y usarse en un ordenador mediante descarga de otro ordenador trabajando en red mediante un medio de transferencia de datos o una conexión inalámbrica. El medio de transferencia de datos se refiere a un medio de comunicación en un sistema de red informática para transmitir información al programa como una onda portadora para alimentar el programa informático de análisis de la presente invención, y dichos medios de transferencia de datos incluyen, pero sin limitación, cable

45 10BASE-T, cable 100BASE-TX, cable 1000BASE-TX, etc.

El programa informático de análisis de la presente invención puede implementarse en otro ordenador trabajando en red mediante un medio de transferencia de datos o una conexión inalámbrica y usarse mediante acceso a un ordenador cliente que ejecuta el programa. Los sistemas de redes de ordenadores incluyen, pero sin limitación, LAN (Red de Área Local), WAN (Red de Amplio Alcance) tal como Internet, MAN (Red de Área Metropolitana), intranet, SAN (Red de Área de Almacenamiento), red de comunicación inalámbrica, etc. Los medios de comunicación incluyen, pero sin limitación, fibra óptica y red sin cables, etc. Los programas de clientes incluyen, pero sin limitación, navegadores web, software del terminal, software específico del cliente para los programas informáticos de análisis del presente documento, etc.

55 <Cebadores y sondas para su uso en los métodos para identificar el hábitat de un insecto>

La presente invención proporciona también cebadores y sondas en el método para identificar el hábitat de un insecto.

Se puede seleccionar un nucleótido específico de un hábitat a partir de los que contienen un polimorfismo de nucleótidos únicos de un criterio de la presente invención para diseñar un cebador y una sonda que flanquean este nucleótido. Cuando se usan el cebador y la sonda para amplificar el ADN de un insecto muestra como un molde mediante la PCR, se puede identificar el éxito de la amplificación (positivo) como un insecto de este hábitat mientras 65 que se puede determinar el fracaso de la amplificación (negativo) como un insecto de otro hábitat. Específicamente, se puede seleccionar el nucleótido específico de un hábitat mediante el método descrito en <Criterio discriminador

de zona de la presente invención> anterior.

Por ejemplo, se encuentran polimorfismos de nucleótidos únicos en los nucleótidos 229º y 298º desde el extremo 5' en la región analizada del gen COI de Triboliun castaneum de la Tabla 1. Es decir, estos nucleótidos son G en el tipo 5 1 de Japón mientras que estos nucleótidos son A en insectos que habitan otras zonas diferentes de la principal isla de Japón (denominadas algunas veces a partir de ahora en el presente documento como "extranjero"). Basándose en esta diferencia, se pueden diseñar un cebador de tipo 1 específico de Japón (denominado algunas veces a partir de ahora en el presente documento como "cebador para la principal isla de Japón") y un cebador específico del extranjero (denominado algunas veces a partir de ahora en el presente documento como "cebador para el extranjero"), como se describe en los siguientes Ejemplos. Específicamente, se pueden diseñar cebadores que contienen los ácidos nucleicos que se muestran en las SEC ID Nos: 17-24 que se muestran en los siguientes Ejemplos. Estos cebadores son preferibles ya que puede identificarse de forma más precisa que los insectos que muestran resultados positivos para el cebador para la principal isla de Japón y resultados negativos pare el cebador para el extranjero habitan en la principal isla de Japón basándose en la variación A o G de nucleótidos en el

15 polimorfismo de nucleótidos únicos de la presente invención. En otras palabras, un nucleótido existente en un solo tipo y no en los otros tipos puede ser un cebador de la presente invención, pero se puede proporcionar una identificación más precisa si los nucleótidos en los otros tipos son idénticos.

Los cebadores de la presente invención permiten también específicamente la identificación de si Tribolium castaneum habita la principal isla de Japón o no. Específicamente, los cebadores que identifican si Tribolium castaneum habita o no la principal isla de Japón pueden prepararse mediante una combinación adecuada de parejas de cebadores descritas anteriormente o la modificación de un nucleótido contenido en cada cebador. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores que contienen los ácidos nucleicos que se muestran en las SEC ID Nos: 25-29 descritos en los siguientes Ejemplos y un cebador común (extremo 3') sobre la base del hallazgo de que el

25 nucleótido 248º desde el extremo 5' en la región analizada del gen ND5 de Tribolium castaneum es A en el tipo 1 de Japón mientras que es G en el extranjero tal como se muestra en la Tabla 1. Se pueden usar dichos cebadores y sondas para preparar cebadores y sondas que den resultados positivos solo para el tipo 1 de Japón, es decir, el ADN de insectos que habitan la principal isla de Japón y resultados negativos para el ADN de insectos de otras zonas. Por ejemplo, se pueden usar dichos cebadores que dan resultados positivos solo para el tipo 1 de Japón para identificar si el insecto muestra habita o no la principal isla de Japón.

<Método para identificar el hábitat de un insecto usando un criterio o sonda de la presente invención>

La presente invención proporciona un método para identificar el hábitat de un insecto usando los cebadores o

35 sondas descritos anteriormente. Específicamente, el método comprende las etapas de: (a) extraer el ADN del insecto muestra; (b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con un cebador y/o una sonda de la presente invención; (c) amplificar un fragmento de ADN; y (d) identificar el hábitat del insecto muestra. Cada etapa se explica específicamente a continuación.

(a): Se puede llevar a cabo la etapa de extraer ADN del insecto muestra mediante un método que se describe en "(2) Extracción del ADN" en Método para preparar un criterio de la presente invención "(a) Etapa de determinación de la secuencia del nucleótidos del ADN de uno o más insectos procedentes de dos o más hábitats" anterior.

(b): Etapa de poner en contacto el ADN extraído con un cebador y/o una sonda de la presente invención

45 Se puede usar cualquier método para poner en contacto en las condiciones adecuadas la reacción de amplificación de la PCR, incluyendo el uso de kits comercialmente disponibles o similares. -Por ejemplo, se preparó una solución de reacción de la PCR (50 µl; microtubo de 0,2 ml) usando PerfectShot Ex Taq (mezcla de colorante de carga) (Takara Bio Inc.) seguido por el manual unido, y se añadieron un cebador y/o un molde (ADN molde) a concentraciones finales adecuadas para preparar una solución de reacción de la PCR.

(c) Etapa de amplificación de un fragmento de ADN

Se pueden usar métodos conocidos para amplificar un fragmento de ADN. Por ejemplo, se puede usar la PCR en

55 tiempo real. Se pueden usar cualesquiera condiciones de amplificación de la PCR donde se amplifican un cebador del control positivo y/o una sonda y un molde. Por ejemplo, se puede usar la solución de reacción de la PCR descrita anteriormente en condiciones de desnaturalización de la PCR a 94 ºC durante 3 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (94 ºC, 30 segundos), hibridación (55 ºC, 45 segundos) y alargamiento (72 ºC, 60 segundos).

(d) Etapa de identificación del hábitat del insecto muestra

Para identificar el hábitat del insecto muestra, se ha evaluado el éxito o el fracaso de la amplificación llevada a cabo mediante la PCR en (c) anterior, y se han analizado los resultados.

65 Específicamente, una cantidad adecuada de la solución de reacción de la PCR obtenida anteriormente se ha sometido a electroforesis en gel de agarosa en condiciones adecuadas y a continuación se ha teñido en una

solución de bromuro de etidio, y el producto amplificado se ha fotografiado bajo irradiación UV para evaluar si se ha amplificado o no un fragmento de ADN deseado. Por ejemplo, el tamaño esperado del gen COI de Tribolium castaneum es de 110 pb de longitud, y el tamaño esperado del gen ND5 es de 139 pb de longitud. Si la amplificación es satisfactoria, se puede observar visualmente una banda del fragmento de ADN deseado, y por tanto, si se

5 observa visualmente una banda, se determina que el ADN derivado de la muestra es positivo para el cebador de tal manera que el insecto muestra se puede identificar como un insecto procedente del hábitat del cebador.

En la presente invención, se puede usar también la PCR en tiempo real como la etapa (c) de amplificar un fragmento de ADN. En este caso, se pueden usar una sonda y un cebador diseñados y sintetizados para flanquear un nucleótido específico de un hábitat seleccionado entre nucleótidos que contienen un polimorfismo de nucleótidos únicos de la presente invención. Por ejemplo, Se puede usar el servicio de ensayos de Genotipación de la Expresión Génica/SNP TaqMan(R) personalizados de ABI para diseñar y sintetizar cebadores y sondas. El principio de utilización de esta sonda TaqMan(R) MGB de ABI se explica a continuación.

15 En primer lugar, se proporciona un conjunto de cebadores de la PCR que puede amplificar una región que contiene un SNP del genoma y dos sondas TaqMan(R) MGB correspondientes a la variación de nucleótidos únicos en el ADN genómico. Fundamentalmente, se mezclan los cebadores, dos sondas TaqMan(R) MGB que tienen secuencias complementarias al alelo 1 y al alelo 2, y el ADN del molde, y se amplifican mediante la PCR para detectar los SNP de los dos alelos. Específicamente, las sondas usadas en la presente invención se marcan en el extremo 5' con un colorante indicador fluorescente FAM o VIC, y se conjugan adicionalmente en el extremo 3' de un inactivador no fluorescente (NFQ) y el aglutinante de la ranura menor (MGB, por sus siglas en inglés). Tras la irradiación con la luz que excita el indicador (488 nm) en presencia de las sondas solas, el colorante indicador fluorescente se excita para emitir luz fluorescente (alrededor de 530-560 nm), pero la longitud de onda fluorescente de este indicador se absorbe por el inactivador y el inactivador no emite luz fluorescente, de tal manera que se inhibe la fluorescencia del

25 indicador. Cuando la sonda TaqMan(R) MGB se usa en la reacción de la PCR, la sonda hibridada con el ADN del molde junto con los cebadores de la PCR durante la etapa de alargamiento se hidroliza por la actividad de la 5'-3' exonucleasa de la AmpliTaq ADN polimerasa. Como resultado, el colorante indicador fluorescente se libera para aumentar la fuerza fluorescente del indicador, y el MGB unido al NFQ penetra y se une a la ranura pequeña (hueco) donde se han hibridado la sonda y el ADN del molde. Esto potencia la unión entre la sonda y el ADN del molde para aumentar el valor de Tm. El valor de Tm aumentado permite una identificación más definitiva de un nucleótido único incluso en una secuencia corta. Se pueden obtener resultados de la PCR evaluando los éxitos o fracasos de la amplificación usando un detector para detectar la sustancia fluorescente previamente conjugada con la sonda.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Sin embargo, la presente invención no está 35 limitada a los Ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

1. Secuencias de datos de insectos

(A) Insectos

Los insectos utilizados para la extracción del ADN son las especies de Tribolium castaneum que pertenecen a la familia Tenebrionidae del orden Coleoptera, que es conocido más ampliamente como un insecto de la misma

45 morfología que habita diversas zonas del mundo incluyendo Japón y es muy perjudicial para los cereales en polvo tales como la harina. Los insectos de Tribolium castaneum usados en este ejemplo se recogieron en siete zonas donde vivían, y se criaron individualmente. Se incluyen insectos de Chiba recogidos en hogares de reciente construcción en la Prefectura de Chiba, insectos de Urawa recogidos en el campo de Urawa, insectos de Okayama recogidos en hogares de reciente construcción en la Prefectura de Okayama, insectos de Takarazuka adquiridos de la Sumika Technoservice Corporation que se recogieron y criaron en Takarazuka, insectos de Okinawa recogidos en la Prefectura de Okinawa, insectos de Tailandia encontrados en anacardos adquiridos en Tailandia en mayo, 2006, e insectos de Canadá encontrados en la harina exportada desde Canadá a Hong Kong. Para la extracción del ADN, se usó normalmente el cuerpo completo de estos insectos.

55 (B) extracción del ADN

En la etapa de extracción del ADN, el ADN extraído mediante el método CTAB se amplificó mediante la PCR y se secuenció para proporcionar los datos de la secuencia, como se explica a continuación.

El protocolo de extracción del ADN de CTAB fue el siguiente.

Se preparó una solución de CTAB que contenía CTAB al 2 % (p/v) (de Calbiochem), Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), NaCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 1,4 M, se preparó PVP (polivinilpirrolidona) al 1 % (p/v). Se introdujeron en un microhomogeneizador 650 µl de esta solución CTAB con muestras de insectos. Después, este 65 microhomogeneizador que contiene las muestras y la solución CTAB se incubaron en un baño de agua controlado a 65 ºC durante 10 minutos de tal manera que las muestras quedaron sumergidas. Las muestras se molieron a

continuación en el tubo de vidrio (que tiene una parte inferior de vidrio esmerilado) del microhomogeneizador usando una varilla de vidrio que tiene una punta redonda de vidrio esmerilado (procesada para cooperar con la parte inferior del tubo de vidrio), y a continuación se incubaron con 2 µl de una solución de 1 mg/ ml de ARNasa A a 65°C durante 1 hora para romper las células de los insectos. Esto se transfirió a un microtubo de 1,5 ml, y se añadió un volumen

5 igual (650 µl) de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y los materiales se mezclaron mediante volteado manual durante 3 minutos. La mezcla se repartió entre una capa de disolvente orgánico (capa inferior) y una capa acuosa (capa superior) mediante una breve centrifugación (Beckman Allegra 21R Centrifuge F2402H; 15.000 rpm (aproximadamente 15.000 x g) durante 1-5 minutos)), y la capa acuosa (aproximadamente 400 µl) se transfirió a un tubo nuevo. Se añadió un volumen igual de alcohol isopropílico y se mezclaron los materiales mediante volteo, y a continuación se centrifugaron de la misma menara que se ha descrito anteriormente. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se enjuagó con etanol al 70 %, se secó y se disolvió en 20-50 µl de tampón TE para preparar una muestra de ADN.

(C) PCR

15 Para amplificar los fragmentos de ADN, se preparó una solución de reacción de la PCR (50 µl; microtubo de 0,2 ml) usando PerfectShot Ex Taq (mezcla de colorante de carga) (Takara Bio Inc.) seguido por el manual adjunto. Las cantidades (concentraciones finales) de los cebadores y moldes (ADN del molde) añadidos y las condiciones de la PCR fueron las siguientes.

1) Análisis del gen COI mitocondrial

Conjunto de cebadores:

25 L6625 5'-CCGGATCCTTYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3' (SEC ID Nº: 13) 1 µM H7005 5'-CCGGATCCACANCRTARTANGTRTCRTG-3' (SEC ID Nº: 14) 1 µM

Molde: Solución de reacción 1 µl/50 µl

Este microtubo se colocó en un reactor de PCR (Ciclador Térmico del ADN GeneAmp PCR System 9600 antiguamente Perkin Elmer o Ciclador Térmico TaKaRa PCR PERSONAL) para llevar a cabo la amplificación de la PCR en las siguientes condiciones:

desnaturalización: 94°C, 1 minuto

35 de hibridación: 60°C, 1 minuto de alargamiento: 70°C, 2 minutos.

Se emplearon cincuenta ciclos de la reacción. Si la muestra no se puede recoger inmediatamente tras la finalización de la reacción, la temperatura del bloque de muestra se hace disminuir a 4 ºC y se mantiene a este nivel.

2) Análisis del gen ND5 mitocondrial

Conjunto de cebadores:

45 F6999 5'-AAACAGTTAAAMCARTWGAA-3' (SEC ID Nº: 15) 1 µM R7495 5'-CCTGTWTCWDCTTTAGTWCA-3' (SEC ID Nº: 16) 1 µM

Molde: Solución de reacción 1 µl/50 µl

Este microtubo se colocó en un reactor de PCR (Ciclador Térmico del ADN GeneAmp PCR System 9600 antiguamente Perkin Elmer o el Ciclador Térmico TaKaRa PCR PERSONAL) para llevar a cabo la amplificación de la PCR en las siguientes condiciones:

predesnaturalización: 94 ºC, 3 minutos

55 de desnaturalización: 94 ºC, 30 segundos de hibridación: 45 ºC, 45 segundos de alargamiento: 72 ºC, 60 segundos.

Se emplearon cuarenta ciclos de la reacción excepto para la predesnaturalización. Si la muestra no se puede recoger inmediatamente tras la finalización de la reacción, la temperatura del bloque de muestra se hace disminuir a 4 ºC y se mantiene a este nivel.

(D) Verificación de la amplificación mediante la PCR

65 Una alícuota de 5 µl de la solución de reacción de la PCR obtenida anteriormente se sometió a electroforesis en gel de agarosa. En este caso, la electroforesis se llevó a cabo utilizando el Mupid Mini Gel Electrophoresis System (gel:

3 % de NuSieve 3:1 Agarosa de FMC BioProducts o Cambrex Bio Science Rockland, condiciones electroforéticas: 100 V, 30 minutos), y el gel se tiñó en una solución de 2 µg/ml de bromuro de etidio durante aproximadamente 40 minutos, y después, el producto amplificado se fotografió bajo irradiación UV para verificar que se había amplificado un fragmento de ADN deseado (tamaño COI: de 435 pb de longitud, ND5: 513 pb de longitud) (bandas rodeadas en

5 las Figuras 1-7 (COI), Figuras 8-13 (ND5)).

En la Figura 1, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Tailandia-1, la hilera 2 muestra Tribolium castaneum de Okinawa-1, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador en escalera de 100 pb de longitud (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 2, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Canadá1, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 3, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Chiba-1, la hilera 2 muestra Tribolium castaneum de Urawa-1, la hilera 3 muestra Tribolium castaneum de Okayama-1, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 4, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Tailandia-2, la hilera 2 muestra Tribolium castaneum de Tailandia-3, la banda B 15 muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 5, las bandas 1 -10 muestran Tribolium castaneum de Canadá-2, -3, Okinawa-2, -3, Chiba-2, -3, Okayama-2, -3, y Urawa-2, -3, respectivamente, y la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 6, las bandas 1 -6 muestran Tribolium castaneum de Tailandia-4, -5, Tribolium castaneum de Okinawa-4, -5, y Tribolium castaneum de Canadá-4, -5, respectivamente, y la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 7, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Takarazuka-1, la hilera 2 muestra Tribolium castaneum de Takarazuka-2, la hilera 3 muestra Tribolium castaneum de Takarazuka-3, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 8, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Tailandia-1, la banda B muestra un 25 blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 9, la hilera 1 muestra Tribolium castaneum de Okinawa-1, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 10, las bandas 1 -6 muestran Tribolium castaneum de Tailandia-2, -3, Tribolium castaneum de Okinawa-1, Tribolium castaneum de Urawa-1, Tribolium castaneum de Chiba-1, y Tribolium castaneum de Canadá-1, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 11, las bandas 1 -10 muestran Tribolium castaneum de Urawa-2, -3, Okayama-2, -3, Chiba-2, -3, Okinawa2, -3, y Canadá-2, -3, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 12, las bandas 1 -3 muestran Tribolium castaneum de Takarazuka-1, -2, -3, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente. En la Figura 13, las bandas 1 -6 muestran Tribolium castaneum de

35 Tailandia-4, -5, Okinawa-4, -5, y Canadá-4, -5, la banda B muestra un blanco sin molde, y la banda M muestra un marcador de tamaño (escalera de 100 pb), respectivamente.

(E) Purificación de los productos de la PCR

Los anteriores productos de la PCR se purificaron utilizando el Kit de Purificación QIAquick PCR (50) (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante como sigue. Es decir, la solución de reacción de la PCR (equilibrio de aproximadamente 45 µl) se mezcló con 5 volúmenes de tampón pb I (225 µl). Después, esta solución se colocó en QIA quickspin y se centrifugó a 13.000 rpm (aproximadamente 11.000 x g) durante 1 minuto. Se descartó el filtrado y se añadieron 750 µl de tampón PE, y a continuación se centrifugó la solución a 13.000 rpm durante 1 minuto. Se

45 descartó el filtrado y se centrifugó la solución de nuevo a 14.000 rpm (aproximadamente 13.000 x g) durante 1 minuto. Se descartó el filtrado y se transfirió la columna a un microtubo de 1,5 ml, se añadieron 30 µl de tampón EB y se dejó reposar la columna durante 1 minuto y a continuación se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 minutos, y el filtrado se recogió como muestra.

(F) Reacción de secuenciación en ciclos y purificación de los productos secuenciados

La reacción se llevó a cabo usando el Kit de Secuenciación en Ciclos BigDye Terminator v1.1 (ABI) siguiendo el protocolo japonés ("Cycle sequencing of single-stranded DNA and doublestranded DNA" en la p. 22, "Cycle sequencing in Gene-AmpPCR System 9700, 9600, 2700, 2400" en la p. 25, y "Purification method on spin columns 55 (or spin plates)" en la p.38-40), como se establece a continuación. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados fueron las mismas que las usadas para la amplificación de los fragmentos de ADN deseados mediante la PCR. Es decir, 8 µl de Sequence premix (colorante Big) y 3,2 µl de cada uno de los cebadores L6625 y H7005 (para el análisis de la región COI) o F6999 y R7495 (para el análisis de la región ND5) diluidos hasta 1 µM se añadieron a una alícuota de 2 µl de una solución purificada del producto de la PCR diluido hasta 5-20 ng/µl con agua destilada estéril, y la solución se llevó hasta un volumen final de 20 µl con agua destilada estéril para preparar una solución de reacción de secuenciación en ciclos. Un microtubo de 0,2-ml (para la PCR) que contenía esta solución se colocó en un reactor de PCR (ciclador Térmico del ADN GeneAmp PCR System 9600 antiguamente Perkin Elmer) para llevar a cabo la desnaturalización (96°C, 1 minuto), seguido por 25 ciclos de desnaturalización (96 ºC, 10 segundos), hibridación (50 ºC, 5 segundos) y alargamiento (60 ºC, 4 min). Si la muestra no se puede recoger inmediatamente

65 tras la finalización de la reacción, la temperatura del bloque de muestra se hace disminuir a 4 ºC y se mantuvo a este nivel.

Los productos secuenciados se purificaron mediante CENTRI-SEP SpinColumn (ABI). Es decir, los productos secuenciados (aproximadamente 20 µl) se añadieron en el centro de la CENTRI-SEP SpinColumn que se había pretratado mediante hinchamiento del material de envase durante 2 horas o más a temperatura ambiente, y se centrifugó a 2.700 rpm (aproximadamente 500 x g) durante 2 minutos por encima de un microtubo de 1,5-ml, y la

5 solución recogida en el microtubo se recuperó como ADN purificado. Esta solución se secó a vacío, y a continuación se añadieron 20 µl de TSR o Hi-Di formamida, y la solución se dejó reposar durante aproximadamente 10 minutos y a continuación se mezcló vigorosamente. Esta solución se transfirió a un microtubo de 0,2 ml (para la PCR), se desnaturalizó (95 ºC, 2 min) en un Ciclador Térmico de ADN GeneAmp PCR System 9600, se inactivó inmediatamente en hielo, y se dejó reposar durante 10 minutos o más.

(G) Secuenciación del ADN

Se usó el analizador genético ABI PRISM 310 siguiendo el "Manual de Funcionamiento del Analizador Genético ABI PRISM 310". Es decir, la muestra inactivada se transfirió a un tubo de muestras, que se cerró a continuación con un

15 septo y se colocó en una bandeja de muestras de 48 pocillos. Después, se llevó a cabo la secuenciación mediante el método del colorante terminador siguiendo el manual de funcionamiento.

(H) Análisis de las secuencias de nucleótidos

20 Los datos de la secuencia obtenidos del extremo 5' (en el lado del cebador L6625 o F6999) y el extremo 3' (en el lado del cebador H7005 o R7495) se verificaron para determinar las secuencias de nucleótidos exactas. Se muestran a continuación los datos de las secuencias resultantes.

1) Región COI (379 pb de longitud completa)

25 Tipo 1 de Japón (SEC ID Nº: 1) de Urawa (1-3), Okayama (1-3), Chiba (1-3), y Takarazuka (1-3)

[Fórmula 1]

Tipo 2 de Japón (SEC ID Nº: 2) de Okinawa (2-5)

[Fórmula 2]

Tipo 3 de Japón (SEC ID Nº: 3) de Okinawa (1)

[Fórmula 3]

Tipo 1 extranjero (SEC ID Nº: 4) de Tailandia (1, 3-5)

[Fórmula 4]

Tipo 2 extranjero (SEC ID Nº: 5) de Tailandia (2)

[Fórmula 5]

Tipo 3 extranjero (SEC ID Nº: 6) de Canadá (1, 4, 5)

[Fórmula 6]

Tipo 4 extranjero (SEC ID Nº: 7) de Canadá (2, 3)

[Fórmula 7]

Tipo 1 de Japón (SEC ID Nº: 8) de Urawa (1-3), Okayama (1-3), Chiba (1-3), y Takarazuka (1-3)

[Fórmula 8]

Tipo 2 de Japón y tipos 1, 2 extranjeros (SEC ID Nº: 9) de Okinawa (2-5) y Tailandia (1-5)

[Fórmula 9]

Tipo 3 de Japón (SEC ID Nº: 10) de Okinawa (1)

[Fórmula 10]

Tipo 3 extranjero (SEC ID Nº: 11) de Canadá (1, 4, 5)

[Fórmula 11]

Tipo 4 extranjero (SEC ID Nº: 12) de Canadá (2, 3)

[Fórmula 12]

15 Se compararon las anteriores secuencias de nucleótidos de cada región (CO1 o ND5) usando un programa informático de análisis tal como ClustalW2 de EMBL-EB1 en Internet (análisis de alineación múltiple). Como resultado, se incubaron 15 y 5 polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en las secuencias que se muestran anteriormente en la región COI y en la región ND5, respectivamente. Las secuencias se pueden clasificar en siete

20 tipos combinando estos polimorfismos, y los hábitats que corresponden a estos tipos se identificaron como la principal isla de Japón, Okinawa, Tailandia, y Canadá mediante evaluación comprehensiva a partir de zonas origen de insectos que pertenecen a cada tipo y similares. Es decir, se ha determinado que el tipo 1 de Japón (un total de 12 individuos formados por 3 individuos de cada zona de Urawa, Okayama, Chiba y Takarazuka; haplotipo 1-1 (indicado a partir de ahora en el presente documento en el orden de COI-ND5)) cubre principalmente la principal isla

25 de Japón; Tipo 2 de Japón (4 individuos de la zona de Okinawa; 11-2) y tipo 3 de Japón (1 individuo de la zona de

Okinawa; 111-3 (tipo L)) cubre principalmente Okinawa; tipo 1 extranjero (4 individuos procedentes de la zona de Tailandia; 1V-2) y tipo 2 extranjero (1 individuo de la zona de Tailandia; 111-2) cubre principalmente Tailandia; y tipo 3 extranjero (3 individuos de la zona de Canadá; V-4) y tipo 4 extranjero (2 individuos de la zona de Canadá; V1-5) cubre principalmente Canadá (Tabla 1). Se muestra también que existen dos haplotipos en cada zona excepto para los nucleótidos procedentes de la isla principal de Japón. Por ejemplo, dicha relación existe entre Okinawa 2-5 del tipo 2 de Japón y Okinawa 1 del tipo 3 de Japón; Tailandia 1, 3-5 del tipo 1 extranjero y Tailandia 2 del tipo 2 extranjero; Canadá 1, 4, 5 del tipo 3 extranjero y Canadá 2, 3 de tipo 4 extranjero en la Tabla 1 que se muestra a continuación.

Un análisis detallado adicional desveló características específicas de zona de la siguiente forma. El tipo 1 de Japón se refiere a un tipo que habita principalmente la principal isla de Japón y se caracteriza por G en las posiciones 229 y 298 y T en la posición 253 contado a partir del extremo 5' del gen COI, y A en la posición 248 de la región ND5. El tipo 2 de Japón y el tipo 3 de Japón se refieren a tipos que habitan principalmente la zona de Okinawa, pero se

5 muestran estrechamente similares al ADN de tipo 1 extranjero que habita la zona de Tailandia, sugiriendo una estrecha relación entre los mismos también desde un punto de vista geográfico. El tipo 1 extranjero y el tipo 2 extranjero concuerdan con el tipo 1 de Japón excepto para G en la posición 248 de la región del gen ND5. El tipo 3 extranjero y el tipo 4 extranjero se refieren a tipos que habitan principalmente la zona de Canadá y se caracterizan por T en la posición 22 y G en la posición 142 de la región del gen COI.

2. Desarrollo de cebadores usados en el método para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no

Se han descubierto cambios de nucleótidos en las posiciones 229 y 298 contadas desde el extremo 5' en la región

15 COI analizada. Es decir, estos nucleótidos son G en el tipo 1 de Japón, mientras que estos nucleótido son A en los tipos que habitan zonas extranjeras incluyendo Okinawa. Sobre la base de esta diferencia, se diseñaron cebadores específicos de tramos secuenciados en la siguiente secuencia de nucleótidos.

[Fórmula 13]

20 La región COI (379 pb de longitud completa que se muestran en la dirección 5' →3' Tipo 1 de Japón: (de Urawa (1-3), Okayama (1-3), Chiba (1-3), Takarazuka (1-3))

25 Se muestran a continuación los cebadores diseñados.

Cebadores para la discriminación de KN y cebadores mejorados

Honndo-F AATTATTGCTGTCCCAACCGGG (SEC ID Nº: 17)

30 Honndo-F2 AATTATTGCTGTCCCAACCGAG (SEC ID Nº: 18) Honndo-R GGAATACAAATCCTAGTGCC (SEC ID Nº: 19) Honndo-R2 GGAATACAAATCCTAGTGAC (SEC ID Nº: 20) Kaigai-F AATTATTGCTGTYCCAACCGGA (SEC ID Nº: 21) Kaigai-F2 AATTATTGCTGTYCCAACCGAA (SEC ID Nº: 22)

35 Kaigai-R RGAATACAAATCCTAGTGCT (SEC ID Nº: 23) Kaigai-R2 RGAATACAAATCCTAGTGAT (SEC ID Nº: 24).

De manera similar, se diseñaron cebadores específicos de tramos secuenciados y un cebador común (extremo 3') sobre la base de A en la posición 248 en la región ND5 analizada en el tipo 1 de Japón en contraste con G de zonas

40 extranjeras (véase la secuencia de nucleótidos de la región ND5 siguiente). [Fórmula 14] Región ND5 (473 pb de longitud completa que se muestran en la dirección 5' →3'. Tipo 1 de Japón: (de Urawa (1-3), Okayama (1-3), Chiba (1-3), Takarazuka (1-3))

ND-Honndo-F GAGTCAATAAATGGAAGAAA (SEC ID Nº: 25)

ND-Honndo-F2 GAGTCAATAAATGGAAGATA (SEC ID Nº: 26)

5 ND-Kaigai-F GAGTCAATAAATGGAAGAAG (SEC ID Nº: 27) ND-Kaigai-F2 GAGTCAATAAATGGAAGATG (SEC ID Nº: 28) ND-Kyoutsuu-R TTTATGTCCGGGTTAGGGGCGAG (SEC ID Nº: 29).

PCR

10 Para amplificar los fragmentos de ADN, se preparó una solución de reacción de la PCR (50 µl; microtubo de 0,2 ml) usando PerfectShot Ex Taq (mezcla de colorante de carga) (Takara Bio Inc.) seguido por el manual adjunto. Las cantidades (concentraciones finales) de los cebadores y moldes (ADN del molde) añadidos y las condiciones de la PCR fueron las siguientes.

15 Cebadores:

Combinaciones del cebador directo (1 µM) /Cebador inverso (1 µM)

20 1. Honndo-F/Honndo-R

2.: Kaigai-F/Kaigai-R

3.: ND-Honndo-F/ND-Kyoutsuu-R

4.: ND-Kaigai-F/ND-Kyoutsuu-R

25 Molde: Solución de reacción 1 µl/50 µl

1.: ADN extraído de Urawa (1) como representativo de la principal isla de Japón.

2.: ADN extraído de Canadá (1) como representativo de zonas extranjeras.

30 Este microtubo se colocó en un reactor de PCR (Ciclador Térmico del ADN GeneAmp PCR System 9600 antiguamente Perkin Elmer o el Ciclador Térmico TaKaRa PCR PERSONAL) para llevar a cabo la amplificación de la PCR en las siguientes condiciones:

predesnaturalización: 94 ºC, 3 minutos

35 desnaturalización: 94 ºC, 30 segundos hibridación: 45 ºC, 45 segundos alargamiento: 72 ºC, 60 segundos.

Se emplearon cuarenta ciclos de la reacción excepto para la predesnaturalización. Si la muestra no se puede

40 recoger inmediatamente tras la finalización de la reacción, la temperatura del bloque de muestra se hace disminuir a 4 ºC y se mantiene a este nivel.

3. Evaluación del éxito o el fracaso de la amplificación mediante la PCR y análisis de los resultados

45 Cinco µl de la solución de reacción de la PCR obtenida anteriormente se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. En este caso, la electroforesis se llevó a cabo utilizando el Mupid Mini Gel Electrophoresis System (gel: 3 % de NuSieve 3:1 Agarosa de FMC BioProducts o Cambrex Bio Science Rockland, condiciones electroforéticas: 100 V, 30 minutos), y el gel se tiñó en una solución de 2 µg/ml de bromuro de etidio durante aproximadamente 40 minutos, y después, el producto amplificado se fotografió bajo irradiación UV para evaluar si se ha amplificado o no un

50 fragmento de ADN deseado (COI de tamaño esperado: de 110 pb de longitud, ND5: 139 pb de longitud) (Figura 14). En la Figura 14, se muestra la leyenda de cada banda a continuación.

Los resultados mostraron que se observaron productos amplificados en las hileras 1, 5, 7, 11, pero se observaron bandas similares en las hileras 2, 4, 8, 10 que se había esperado que fueran negativas.

5 Cuando se llevó a cabo la PCR cambiando la temperatura de hibridación en las condiciones de PCR anteriores desde 45 ºC a 55 ºC, las bandas de las hileras 4 y 8 se debilitaron, pero las bandas de las hileras 2 y 10 fueron tan fuertes como las bandas positivas (bandas 1 y 11) (Figura 15). En la Figura 15, la leyenda de cada hilera es como se muestra en la Tabla 2.

10 Después, se sintetizaron los cebadores con especificidad ligeramente disminuida sustituyendo el nucleótido próximo al extremo 3' por A o T como se ha descrito anteriormente. Estos se combinaron también como se describe a continuación para llevar a cabo la PCR.

15 Combinaciones del cebador directo (1 µM) /Cebador inverso (1 µM)

1.: Honndo-F2/Honndo-R2

2.: Kaigai-F2/Kaigai-R2

3.: ND-Honndo-F2/ND-Kyoutsuu-R

20 4. ND-Kaigai-F2/ND-Kyoutsuu-R

Como resultado, desapareció la banda de la hilera 2, mostrando un gran contraste con la hilera 1 (Figura 16). Es decir, podría encontrarse una condición bajo la cual el tipo 1 de Japón sea positivo mientras que los tipos extranjeros sean negativos. En la Figura 16, se muestra la leyenda de cada banda en la tabla siguiente.

Ejemplo 2 5 Ensayo de identificación del hábitat de Tribolium castaneum usando la PCR en tiempo real

(A) Insectos

Los insectos de Tribolium castaneum usados en este ejemplo fueron los recogidos en el campo de la Prefectura de 10 Saitama (Urawa) (Urawa 2) y los que se encuentran en la harina exportada desde Canadá a Hong Kong (Canadá 4).

(B) extracción del ADN

Se extrajo el ADN de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1. 15

(C) Síntesis de las sondas TaqMan(R) MGB

Basándose en el hecho de que el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' del gen COI es G en los insectos procedentes de la isla principal de Japón en contraste con A en los procedentes de zonas extranjeras, se 20 sintetizaron las siguientes sondas MGB. Para insectos procedentes de la principal isla de Japón (KN_CO1-C229V1; colorante indicador VIC)

CAACCGGGATTAAAA (SEC ID Nº: 30)

25 Para insectos de zonas extranjeras (KN_CO1-C229M1; colorante indicador FAM)

CAACCGGAATTAAAA (SEC ID Nº: 31).

Se sintetizaron también los siguientes cebadores de la PCR. KN-CO1-C229F: 30 AGCCTATTTCACTTCAGCCACAAT (SEC ID Nº: 32)

KN_CO1-C229R:

35 ATGAATTTGCTAAGATTACTCCTGTTAGTCC (SEC ID Nº: 33)

Estos se localizan como sigue. Es decir, los cebadores están subrayados y las sondas MGB están doblemente subrayadas en la secuencia siguiente. La secuencia siguiente corresponde a un fragmento amplificado de 179 pb de longitud que incluye el conjunto del cebador.

[Tabla 4]

El diseño y la síntesis de las sondas y cebadores se basan en el servicio de Ensayos Personalizados de 5 Genotipación/SNP de la Expresión Génica TaqMan(R) de ABI.

(D) PCR

Se llevó a cabo la PCR siguiendo el manual adjunto a los cebadores y a la sonda preparados por el servicio de

10 Ensayos Personalizados de Genotipación de la Expresión Génica/SNP TaqMan(R) (sondas TaqMan MGB, marcadas con colorantes FAM y VIC). Es decir, se añadieron 12,5 µl de TaqMan Universal PCR Master Mix, 0,625 µl de 40 x AssayMix, y 0,5 o 1 µl de las muestras de ADN disueltas en 20 µl solos o como una mezcla, y las soluciones se llevaron hasta un volumen final de 25 µl con agua pura. Estas soluciones de preparación se colocaron en MicroAmp Optical 8-Tube Strip (0,2 ml) para llevar a cabo la PCR en tiempo real PCR usando el Sistema 7500 de

15 PCR en Tiempo Real en condiciones predeterminadas (95°C durante 10 minutos, (92°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto) x 40 ciclos).

(E) Resultados

20 Las Figuras 17 y 18 muestran los resultados detectados con la sonda para la principal isla de Japón (VIC), desvelando un aumento indicativo de la amplificación en el ADN procedente de Urawa 2 (A, B). Sin embargo, no se encontró amplificación en el ADN de Canadá 4 (C, D). Aquí, la Figura 17 muestra los datos para 1 µl, donde A es Urawa 2, C es Canadá 4, y E es un blanco. La Figura 18 muestra los datos para 0,5 µl, donde B es Urawa 2, D es Canadá 4, y E es un blanco. Por otra parte, las Figuras 19 y 20 muestran los resultados detectados con la sonda

25 para zonas extranjeras (FAM), desvelando un fuerte aumento en Canadá 4 (C, D). Sin embargo, no se encontró amplificación de la PCR en Urawa 2 (A, B). Aquí, La Figura 19 muestra los datos para 1 µl, donde A es Urawa 2, C es Canadá 4, y E es un blanco. La Figura 20 muestra los datos para 0,5 µl, donde B es Urawa 2, D es Canadá 4, y E es un blanco. De esta manera, los insectos procedentes de la principal isla de Japón y otros (procedentes de zonas extranjeras) podrían discriminarse claramente.

30 Ejemplo 3

1. Secuencias de datos de insectos

35 (A) Insectos

Los insectos utilizados para la extracción del ADN son las especies de Rhyzopertha dominica que pertenecen a la familia Bostrychidae del orden Coleoptera, que se conoce como un insecto de la misma morfología que habita diversas zonas del mundo incluyendo Japón y se clasifica con Sitophilus zeamais como un insecto muy perjudicial

40 que daña los cereales de la familia Graminae tales como arroz y trigo. Los insectos de Rhyzopertha dominica usados en este ejemplo se recogieron en Japón y China donde vivían, y se criaron individualmente.

(B) extracción de ADN para (H) Análisis de las secuencias de nucleótidos

45 Se extrajo el ADN de la región COI, se amplificó mediante la PCR, y se secuenció para proporcionar secuencias de datos mediante el mismo procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 1. Se muestran a continuación los datos de las secuencias resultantes.

1) Región COI (379 pb de longitud completa)

El tipo 1 de Japón y el tipo 1 de China se muestran a continuación como la SEC ID Nº: 34 y la SEC ID Nº: 35, respectivamente.

En las secuencias anteriores, la secuencia designada como "Japón" representa el tipo 1 de Japón de la SEC ID Nº: 34 mientras que la secuencia designada como "China" representa el tipo 1 de China de la SEC ID Nº: 35.

10 Las secuencias de nucleótidos anteriores se analizaron mediante el mismo procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 1. Como resultado, se encontró un SNP (polimorfismo de nucleótido único), es decir, el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de los nucleótidos 379 resultantes es "T" en el tipo 1 de Japón en contraste con "C" en el tipo 1 de China.

15 Ejemplo 4

Evaluación de la amplificación mediante la PCR del ADN procedente de muestras tratadas térmicamente o con presión

20 Se evaluó si se podía amplificar, o no, mediante la PCR, el ADN de Tribolium castaneum degradado artificialmente mediante tratamiento térmico o de presión, y si su hábitat se podía identificar, o no, mediante la PCR en tiempo real.

(A) Insectos

25 En este ejemplo, se usó el Tribolium castaneum adquirido de Sumika Technoservice Corporation descrito en el Ejemplo 1 (Takarazuka, Tipo 1 de Japón).

(B) Tratamientos de las muestras

30 A. Dos individuos del insecto se introdujeron en 1 ml de agua Milli-Q (en un microtubo), que se sometió a ebullición durante 30 minutos o 60 minutos (usando un calentador de microondas) y después se enfrió rápidamente sobre hielo.

B. Un matraz de 100 ml alto que contenía aproximadamente 30 ml de agua Milli-Q y dos individuos del insecto

se sometió a autoclavado a 121°C durante 15 min, después se eliminaron aproximadamente a 50°C y se dejaron 35 enfriar naturalmente.

(C) Extracción del ADN

El ADN se extrajo de forma similar a la descrita en el Ejemplo 1 (B). 40

(D) Sibdas TaqMan(R) MG8

Se usaron las descritas en el Ejemplo 2 (C). (E) PCR 45 Se utilizaron los siguientes tres métodos.

A. La PCR se llevó a cabo de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 1 (C) con el conjunto de cebadores usados en el análisis del gen COI mitocondrial descrito en el Ejemplo 1 (C) (L6625/H7005, tamaño del

fragmento amplificado 435 pb ).

B. Se llevó a cabo la PCR usando el conjunto de cebadores descrito en el Ejemplo 2 (C) (KN_COI-C229F/KN_COI-C229R, tamaño del fragmento amplificado 179 pb) en el ciclador térmico Veriti 96 Well de ABI en condiciones predeterminadas (95°C durante 1 min, (92°C durante 15 s + 60°C durante 1 min) x 40 ciclos).

5 C. Se llevó a cabo la PCR en tiempo real usando las sondas MGB de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 2.

(F) Resultados

10 En las muestras sometidas a ebullición durante 30 minutos según el método A anterior se descubrió una banda amplificada de 435 pb que permitía una comparación del conjunto completo de criterios (Figura 25, panel izquierdo, banda 2 indicada por una flecha, Tabla 5). Sin embargo, esta banda no se apareció en las muestras sometidas a ebullición durante 60 min o a autoclavado (121°C, 15 min) (Figura 25, panel izquierdo, hileras 3, 4, Tabla 5). Por otra parte, se descubrió en todos los casos, según el método B anterior, una banda a 179 pb que permitía la

15 identificación del tipo 1 de Japón (indicada por una flecha en la Figura 25, panel derecho, Tabla 5). Además, todas las muestras se pudieron identificar definitivamente como Tribolium castaneum del tipo 1 de Japón (la isla principal de Japón) mediante las características de estas muestras mediante la PCR en tiempo real usando las muestras MGB (método C anterior) (Tabla 6). De esta manera, cuando el ADN del insecto está fragmentado, es difícil identificar el hábitat de una muestra de insecto por comparación del conjunto completo de criterios, pero incluso el

20 ADN fragmentado se puede someter a análisis para identificación de hábitat seleccionando un nucleótido específico de un hábitat y usando cebadores y sondas diseñados sobre la base de este nucleótido.

[Tabla 5]

Muestra: Baño Temperatura Periodo Amplificación mediante la PCR

435 pb: 179 pb

No tratada: Agua pura 100°C 0 minutos Sí Sí

Ebullición durante 30 minutos: Agua pura 100°C 30 minutos Sí Sí

Ebullición durante 60 minutos: Agua pura 100°C 60 minutos No Sí

Autoclavado: Agua pura 121°C 15 minutos No Sí

25 [Tabla 6]

Muestra: Detector Amplificación mediante la PCR en tiempo real Criterio

Colorante fluorescente: Tipo discriminable

No tratada: VIC Isla principal Sí (29,3)** Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

Ebullición durante 30 minutos: VIC Isla principal Sí (31,1) Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

Ebullición durante 60 minutos: VIC Isla principal Sí (35,2) Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

A/C*: VIC Isla principal Sí (37,2) Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

Blanco (sin ADN): VIC Isla principal No

FAM: No de la isla principal No

*A/C: Autoclavado (121 °C, 15 min) **( ): Número de ciclos para la primera detección con el colorante fluorescente

Ejemplo 5 Evaluación de la amplificación mediante la PCR del ADN de individuos que han muerto por causas naturales Se evaluó si se podía amplificar, o no, mediante la PCR, el ADN de Tribolium castaneum que había muerto por

causas naturales.

(A) Insectos

En este ejemplo, Tribolium castaneum (hábitat desconocido) almacenado a temperatura ambiente durante 5 meses que había muerto por causas naturales durante el cultivo. 5

(B) Extracción del ADN y PCR

El ADN se extrajo de dos individuos del insecto de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 1 y se sometió a la PCR de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 4 (E) A.

(C) Resultados

En ambos individuos se descubrió una banda amplificada de 435 pb que permitía una comparación del conjunto completo de criterios (indicada por una flecha en la Figura 26).

15 EJEMPLO 6

Evaluación de la amplificación mediante la PCR del ADN procedente de muestras irradiadas con rayos gamma

20 Se evaluó si se podía amplificar, o no, mediante la PCR, el ADN de Tribolium castaneum degradado artificialmente mediante irradiación gamma, y si su hábitat se podía identificar, o no, mediante la PCR en tiempo real.

(A) Insectos

25 En este ejemplo, se utilizó Tribolium castaneum recogido en un molino de arroz de la ciudad de Tsukuba (que incluye el tipo 1 de Japón y un tipo que no es el tipo 1 de Japón).

(B) Tratamientos de las muestras

30 Los individuos del insecto (que incluye el tipo 1 de Japón y un tipo que no es el tipo 1 de Japón) se irradiaron con rayos gamma 60Co usando un irradiador gamma (Gamma Cell 220 de Nordion) para preparar las muestras. Las dosis (Gy) se establecieron a dos niveles de 1,5 K y 2 K para periodos de irradiación de 810 segundos y 18 minutos, respectivamente. Las dosis precias en esta condición de irradiación se determinaron mediante una curva de calibración preparada usando un dosímetro de alanina (Alanine Pellet Dosimeter ES200-2106, Bruker Biospin) y

35 fueron 1623 y 2142 Gy, respectivamente.

(C) Extracción del ADN y PCR

Se extrajo ADN de la misma forma que en el Ejemplo 1 de las muestras dañadas en las condiciones de los niveles

40 preconfigurados de 1,5 KGy y 2 KGy tal como se ha descrito anteriormente. (dos muestras se ensayaron para cada condición; designadas como 1,5K-1, 1,5K-2, 2K-1 y 2K-2 en la Figura 27 y en la Tabla 7, respectivamente) y se amplificaron mediante la PCR de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 4 (E) A y C.

(D) Resultados

45 Cuando se extrajo el ADN de las cuatro muestras (1,5K-1, 1,5K-2, 2K-1 y 2K-2, respectivamente) y se usaron como molde para la PCR normal (método descrito en el Ejemplo 4 (E) A), la banda amplificada deseada de 435 pb de tamaño no se encontró en tres de las cuatro muestras, excluyendo la irradiada a 2 KGy, lo que sugiere que se ha producido la fragmentación del ADN (indicado por una flecha en la Figura 27). Cuando el mismo molde de ADN se

50 sometió a la PCR en tiempo real (método descrito en el Ejemplo 4 (E) C) usando las sondas MGB, se observó una reacción de la PCR en las cuatro muestras, y se pudo conseguir una identificación del hábitat prácticamente definitiva, es decir, 2K-1, 2K-2 y 1,5K-2 se identificaron como del tipo de la isla principal y solamente 1,5K-1 se identificó como n o del tipo de la isla principal (Tabla 7).

55 [Tabla 7]

Muestra: Detector Amplificación mediante la PCR en tiempo real Criterio

Colorante fluorescente: Tipo discriminable

2K-1: VIC Isla principal Sí (32,6)* Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

Muestra: Detector Amplificación mediante la PCR en tiempo real Criterio

Colorante fluorescente: Tipo discriminable

2K-2: VIC Isla principal Sí (32,7) Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

1,5K-1: VIC Isla principal No No del tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal Sí (32,4)

1,5K-2: VIC Isla principal Sí (33,0) Tipo de la isla principal

FAM: No de la isla principal No

Blanco (sin ADN): VIC Isla principal No

FAM: No de la isla principal No

* ( ): Número de ciclos para la primera detección con el colorante fluorescente

TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

5 SEC ID Nº: 13: cebador SEC ID Nº: 14: cebador SEC ID Nº: 15: cebador SEC ID Nº: 16: cebador SEC ID Nº: 17: cebador

10 SEC ID Nº: 18: cebador SEC ID Nº: 19: cebador SEC ID Nº: 20: cebador SEC ID Nº: 21: cebador SEC ID Nº: 22: cebador

15 SEC ID Nº: 23: cebador SEC ID Nº: 24: cebador SEC ID Nº: 25: cebador SEC ID Nº: 26: cebador SEC ID Nº: 27: cebador

20 SEC ID Nº: 28: cebador SEC ID Nº: 29: cebador SEC ID Nº: 30: sonda SEC ID Nº: 31: sonda SEC ID Nº: 32: cebador

25 SEC ID Nº: 33: cebador

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Suntory Holdings Limited 30

<120> Métodos para identificar los hábitats de insectos

<130> FA0008-09100

35 <150> JP2008-249148

<151>

<160> 35

40 <170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 1

<210> 2

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 2

<210> 3

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 3

<210> 4

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 4

<210> 5

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 5

15

<210> 6

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

20

<400> 6

25 <210> 7

<211> 379

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 7

<210> 8

<211> 473

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 8

15

<210> 9

<211> 473

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

20

<400> 9

<210> 10

<211> 473

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 10

<210> 11

<211> 473

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 11

<210> 12

<211> 473

<212> ADN

<213> Tribolium castaneum

<400> 12

10: <210> 13 <211> 28 <212> ADN <213> cebador

15: <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> N significa cualquier base

20: <400> 13 ccggatcctt ytgrttytty ggncaycc 28

25: <210> 14 <211> 28 <212> ADN <213> cebador

30: <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n significa cualquier base

35: <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n significa cualquier base

40 45: <400> 14 ccggatccac ancrtartan gtrtcrtg <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> cebador <400> 15 aaacagttaa amcartwgaa 28 20

50: <210> 16 <211> 20

<212> ADN <213> cebador

5: <400> 16 cctgtwtcwd ctttagtwca 20

<210> 17 <211> 22 <212> ADN <213> cebador

<400> 17 aattattgct gtcccaaccg gg: 22

15: <210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> cebador

<400> 18 aattattgct gtcccaaccg ag: 22

25: <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 19 ggaatacaaa tcctagtgcc: 20

35: <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> cebador <400> 20 ggaatacaaa tcctagtgac 20

<210> 21 <211> 22 <212> ADN <213> cebador

45: <400> 21 aattattgct gtyccaaccg ga 22

<210> 22 <211> 22 <212> ADN <213> cebador

<400> 22 aattattgct gtyccaaccg aa: 22

55: <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 23 rgaatacaaa tcctagtgct: 20

65: <210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 24 rgaatacaaa tcctagtgat: 20

5: <210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 25 gagtcaataa atggaagaaa: 20

15: <210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 26 gagtcaataa atggaagata: 20

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

25: <400> 27 gagtcaataa atggaagaag 20

<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

35: <400> 28 gagtcaataa atggaagatg <210> 29 <211> 23 <212> ADN <213> cebador 20

<400> 29 tttatgtccg ggttaggggc gag: 23

45: <210> 30 <211> 15 <212> ADN <213> sonda

<400> 30 caaccgggat taaaa: 15

55: <210> 31 <211> 15 <212> ADN <213> sonda

<400> 31 caaccggaat taaaa: 15

<210> 32 <211> 24 <212> ADN <213> cebador

65: <400> 32 agcctatttc acttdagcca caat 24

5: <210> 33 <211> 31 <212> ADN <213> cebador <400> 33 atgaatttgc taagattact cctgttagtc c 31

10: <210> 34 <211> 379 <212> ADN <213> Rhyzopertha dominica

15: <400> 34

<210> 35

<211> 379

<212> ADN

<213> Rhyzopertha dominica

<400> 35

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos para identificar el hábitat de

Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende las etapas de: 5

(a)

determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats;

(b)

alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a);

(c)

eliminar sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas en dicha etapa (b) a partir de las secuencias de nucleótidos;

10 (d) definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios discriminadores de tipos;

(e) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipos obtenidos en dicha etapa (d) para clasificar sitios que discriminan tipos completamente idénticos como el mismo tipo y sitios que discriminan tipos incompletamente idénticos como uno o más tipos diferentes; y

15 (f) determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio, donde el ADN es el gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) y/o el gen de la subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa (NDS), y donde dicho sitio discriminador de tipo es al menos uno del siguiente grupo para el hábitat de Tribolium

20 castaneum:

(1) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o

25 un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A;

(2) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2 es G, y el nucleótido 331º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido

30 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(3) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 3 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 359º contado

35 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 10 es A, y el nucleótido 419º es A;

(4) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4 es A, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado

40 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(5) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 5 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado

45 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(6) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 22º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 6 es T, el nucleótido 142º es G, y el nucleótido 317º es C, y/o

50 un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 11 es T, el nucleótido 248º es G, el nucleótido 308º es C, el nucleótido 359º es G y el nucleótido 419º es G;

(7) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 317º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 7 es T, y/o

55 un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 12 es C;

y donde dicho sitio discriminador de tipo es el siguiente para el hábitat de Rhyzopertha dominica:

60 (8) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 34 es T.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además las siguientes etapas además de las

etapas que se han definido en la reivindicación 1: 65

(g)

comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los criterios obtenidos en la etapa (f) que se define en la reivindicación 1 para extraer uno o más nucleótidos existentes en un solo tipo pero no en otros tipos; y

(h)

definir el uno o más nucleótidos extraídos en dicha etapa (g) solos o en combinación, como un criterio

discriminador de zona. 5
3. Un método para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende determinar el polimorfismo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el método de la reivindicación 1, comparando la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos obtenidos mediante el método de la reivindicación 1 o 2 y una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra, y analizar si un nucleótido del sitio correspondiente al criterio de la secuencia de nucleótidos de la muestra es idéntico o no al nucleótido del criterio, identificando por tanto el hábitat de la muestra, donde dicho insecto muestra es Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica.

15 4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el método comprende las etapas de: almacenar una tabla de criterios que contiene datos que representan la secuencia de nucleótidos de un criterio obtenido mediante el método de la reivindicación 1 o 2 y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos en un ordenador en el cual se ejecuta un programa informático de análisis, almacenar una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra, y permitir al ordenador comparar los datos que representan nucleótidos de las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos entre la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios con referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos de la tabla de criterios.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal

25 isla de Japón o no, donde se satisfacen uno o más de los siguientes criterios: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen COI de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen ND5 de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es

A.
6. Un cebador o sonda que comprende al menos uno de los nucleótidos que constituyen un criterio preparado mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho cebador o sonda comprende un ácido nucleico que se muestra en las SEC ID Nos: 17-29.

35 7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde se usan el cebador y/o la sonda de la reivindicación 6, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

extraer el ADN de un insecto muestra;

(b)

poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador y/o la sonda de la reivindicación 6;

(c)

amplificar un fragmento de ADN; y

(d)

identificar el hábitat del insecto muestra.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde se usan el cebador y la sonda de la reivindicación 6,

comprendiendo el método las etapas de: 45

(a)

extraer el ADN de un insecto muestra;

(b)

poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador y la sonda de la reivindicación 6;

(c)

amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(d)

detectar una sustancia fluorescente con la cual se ha marcado la sonda por adelantado; y

(e)

identificar el hábitat del insecto muestra.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el cebador de la reivindicación 6 se usa para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no, comprendiendo el método las etapas de:

55 (a) extraer el ADN de una muestra de Tribolium castaneum;

(b)

poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador de la reivindicación 6;

(c)

amplificar un fragmento de ADN; y

(d)

identificar si la muestra de Tribolium castaneum es el Tribolium castaneum que habita la principal isla de Japón o el Tribolium castaneum que habita otras zonas.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde se usan la sonda de la reivindicación 6 y una pareja de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores, comprendiendo el método las etapas de:

(a) extraer el ADN de un insecto muestra;

65 (b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador de la reivindicación 6 y un par de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores;

(c)

amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(d)

detectar una sustancia fluorescente con la cual se ha marcado la sonda por adelantado; y

(e)

identificar el hábitat del insecto muestra.