CN104894117A - 用于鉴定六种拟谷盗类储粮害虫的实时荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定六种拟谷盗类储粮害虫的实时荧光PCR检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括Tca引物探针组合物、Tco引物探针组合物、Tde引物探针组合物、Tma引物探针组合物、Tfr引物探针组合物和Tbr引物探针组合物。本发明还保护所述试剂盒在鉴定待测拟谷盗是否为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗中的应用。本发明能够满足储粮保护和口岸检疫部门对拟谷盗类储粮害虫快速、准确鉴定方法和技术的迫切需求，为储粮害虫的防治和检验检疫提供技术支持和决策参考，从而有效降低因拟谷盗类储粮害虫滋生、为害和扩散造成的农业经济损失，具有重要的推广应用价值。

Description

用于鉴定六种拟谷盗类储粮害虫的实时荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定六种拟谷盗类储粮害虫的实时荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

拟谷盗(Flour beetle)隶属于鞘翅目(Coleoptera)、拟步甲科(Tenebrionidae)、拟谷盗属(Tribolium Macleay)。该类害虫的成虫和幼虫均可为害面粉、谷物、玉米、豆类、油料作物等，除直接取食为害外，成虫体表的臭腺会分泌出含苯醌等致癌物质的臭液，导致被害储粮结块、霉变、发臭而无法食用，从而降低粮食产量和食用价值，造成严重的农业经济损失。

拟谷盗类储粮害虫是我国口岸检疫工作中经常被截获的一类有害生物。加入WTO后，我国的进出口贸易日益频繁，粮食、饲料以及其它农副产品的进出口数量与日俱增，伴随而来的是各类危险性病害和虫害进出国门机会的大幅增加。

目前检疫截获昆虫的鉴定大都采用形态学的方法，但该方法存在一定局限性，如对拟谷盗的形态鉴定往往以保留完整种的形态特征的成虫为鉴定对象，对卵、幼虫、蛹和昆虫残体的鉴定十分困难且耗时较长。在检疫工作中，昆虫生活史的各类虫态及其残体都是经常被截获的对象，如何快速准确地鉴定虫态特征相似、非成虫期形态和昆虫残体成为检疫工作中的难点所在。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定六种拟谷盗类储粮害虫的实时荧光PCR检测试剂盒。

本发明提供了一种用于鉴定拟谷盗的试剂盒，包括Tca引物探针组合物、Tco引物探针组合物、Tde引物探针组合物、Tma引物探针组合物、Tfr引物探针组合物和Tbr引物探针组合物；

所述Tca引物探针组合物由Tca引物对和Tca探针组成；Tca引物对由引物TcaF和引物TcaR组成；引物TcaF如序列表的序列1所示；引物TcaR如序列表的序列2所示；Tca探针的核苷酸序列为序列表的序列3；所述Tco引物探针组合物由Tco引物对和Tco探针组成；Tco引物对由引物TcoF和引物TcoR组成；引物TcoF如序列表的序列4所示；引物TcoR如序列表的序列5所示；Tco探针的核苷酸序列为序列表的序列6；所述Tde引物探针组合物由Tde引物对和Tde探针组成；Tde引物对由引物TdeF和引物TdeR组成；引物TdeF如序列表的序列7所示；引物TdeR如序列表的序列8所示；Tde探针的核苷酸序列为序列表的序列9；所述Tma引物探针组合物由Tma引物对和Tma探针组成；Tma引物对由引物TmaF和引物TmaR组成；引物TmaF如序列表的序列10所示；引物TmaR如序列表的序列11所示；Tma探针的核苷酸序列为序列表的序列12；所述Tfr引物探针组合物由Tfr引物对和Tfr探针组成；Tfr引物对由引物TfrF和引物TfrR组成；引物TfrF如序列表的序列13所示；引物TfrR如序列表的序列14所示；Tfr探针的核苷酸序列为序列表的序列15；所述Tbr引物探针组合物由Tbr引物对和Tbr探针组成；Tbr引物对由引物TbrF和引物TbrR组成；引物TbrF如序列表的序列16所示；引物TbrR如序列表的序列17所示；Tbr探针的核苷酸序列为序列表的序列18。

以上任一所述探针均可为TaqMan探针。以上任一所述TaqMan探针中，在DNA分子的5’末端修饰荧光基团FAM，在DNA分子的3’末端修饰淬灭集团BHQ-1。

所述试剂盒中，每种引物探针组合物均单独包装。所述试剂盒中，每种引物探针组合物中的引物和探针均单独包装。

所述试剂盒还可包括实时荧光PCR反应缓冲液、Hot Start PCR酶、4种dNTP和参比荧光ROX。

所述试剂盒中，探针和参比荧光需避光保存。

本发明还保护所述试剂盒在鉴定待测拟谷盗是否为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗中的应用。所述待测拟谷盗为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗。

本发明还保护一种鉴定待测拟谷盗是否为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗的方法，包括如下步骤：

以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，分别采用所述Tca引物探针组合物、所述Tco引物探针组合物、所述Tde引物探针组合物、所述Tma引物探针组合物、所述Tfr引物探针组合物或所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR；

如果采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的赤拟谷盗，如果采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的杂拟谷盗，如果采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的褐拟谷盗，如果采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的黑拟谷盗，如果采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的弗氏拟谷盗，如果采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的短角拟谷盗。

所述待测拟谷盗为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗。

所述方法中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔比均为1：1。所述方法中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度均为0.2μM，探针在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度为0.4μM。

所述方法中，实时荧光PCR的反应数据由与ABI 7500PCR仪配套的7500 Softwarev2.0.6软件自动收集和分析，生成扩增曲线图。扩增曲线图中：当反应样品的荧光值(Rn)与参比染料ROX之差(ΔRn)超过系统默认的阈值，且Ct值小于30，则被认为是阳性反应；否则，被认为是阴性反应。

本发明还保护一种鉴定待测拟谷盗为哪种拟谷盗的方法，包括如下步骤：

以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，分别采用所述Tca引物探针组合物、所述Tco引物探针组合物、所述Tde引物探针组合物、所述Tma引物探针组合物、所述Tfr引物探针组合物或所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR；

如果采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的赤拟谷盗，如果采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的杂拟谷盗，如果采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的褐拟谷盗，如果采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的黑拟谷盗，如果采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的弗氏拟谷盗，如果采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的短角拟谷盗；

如果采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR或采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR均显示阴性反应，待测拟谷盗为候选的非赤拟谷盗、非杂拟谷盗、非褐拟谷盗、非黑拟谷盗、非弗氏拟谷盗且非短角拟谷盗。

所述方法中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔比均为1：1。所述方法中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度均为0.2μM，探针在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度为0.4μM。

所述方法中，实时荧光PCR的反应数据由与ABI 7500PCR仪配套的7500 Softwarev2.0.6软件自动收集和分析，生成扩增曲线图。扩增曲线图中：当反应样品的荧光值(Rn)与参比染料ROX之差(ΔRn)超过系统默认的阈值，且Ct值小于30，则被认为是阳性反应；否则，被认为是阴性反应。

本发明还保护一种用于鉴定拟谷盗的试剂盒，包括如下六种引物组合物中的至少一种：所述Tca引物探针组合物、所述Tco引物探针组合物、所述Tde引物探针组合物、所述Tma引物探针组合物、所述Tfr引物探针组合物和所述Tbr引物探针组合物。

以上任一所述探针均可为TaqMan探针。以上任一所述TaqMan探针中，在DNA分子的5’末端修饰荧光基团FAM，在DNA分子的3’末端修饰淬灭集团BHQ-1。

所述试剂盒中，每种引物探针组合物均单独包装。所述试剂盒中，每种引物探针组合物中的引物和探针均单独包装。

所述试剂盒还可包括实时荧光PCR反应缓冲液、Hot Start PCR酶、4种dNTP和参比荧光ROX。

所述试剂盒中，探针和参比荧光需避光保存。

本发明还保护所述试剂盒在鉴定拟谷盗中的应用。所述拟谷盗为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗。

本发明还保护一种鉴定待测拟谷盗为哪种拟谷盗的方法，为如下(a)-(e)中的任意一种：

(a)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的赤拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非赤拟谷盗；

(b)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的杂拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非杂拟谷盗；

(c)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的褐拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非褐拟谷盗；

(d)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的黑拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非黑拟谷盗；

(e)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的弗氏拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非弗氏拟谷盗；

(f)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的短角拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非短角拟谷盗。

所述方法中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔比均为1：1。所述方法中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度均为0.2μM，探针在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度为0.4μM。

所述方法中，实时荧光PCR的反应数据由与ABI 7500 PCR仪配套的7500 Softwarev2.0.6软件自动收集和分析，生成扩增曲线图。扩增曲线图中：当反应样品的荧光值(Rn)与参比染料ROX之差(ΔRn)超过系统默认的阈值，且Ct值小于30，则被认为是阳性反应；否则，被认为是阴性反应。

本发明提供的6种引物探针组合物对于六种拟谷盗类储粮害虫均具有较高的特异性。本发明提供的6种引物探针组合物均具有较高的灵敏度。

本发明采用分子生物方法鉴定拟谷盗类储粮害虫，不需要形态分类学基础，不受标本个体发育状态和环境条件的影响，并且大大缩短了鉴定周期，提高了鉴定结果的准确性。本发明能够满足储粮保护和口岸检疫部门对拟谷盗类储粮害虫快速、准确鉴定方法和技术的迫切需求，为储粮害虫的防治和检验检疫提供技术支持和决策参考，从而有效降低因拟谷盗类储粮害虫滋生、为害和扩散造成的农业经济损失，具有重要的推广应用价值。

附图说明

图1为实施例2中的特异性结果。

图2为实施例2中的灵敏度结果。

图3为实施例3中的特异性结果。

图4为实施例3中的灵敏度结果。

图5为实施例4中的特异性结果。

图6为实施例4中的灵敏度结果。

图7为实施例5中的特异性结果。

图8为实施例5中的灵敏度结果。

图9为实施例6中的特异性结果。

图10为实施例6中的灵敏度结果。

图11为实施例7中的特异性结果。

图12为实施例7中的灵敏度结果。

灵敏度结果中，各扩增曲线对应的DNA模板浓度分别为：标记为1的三条扩增曲线：100ng；标记为2的三条扩增曲线：10ng；标记为3的三条扩增曲线：1ng；标记为4的三条扩增曲线：0.1ng；标记为5的三条扩增曲线：0.01ng；标记为6的三条扩增曲线：0.001ng。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实验材料涉及6种拟谷盗类储粮害虫，具体为：赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、杂拟谷盗(T.confusum)、褐拟谷盗(T.destructor)、黑拟谷盗(T.madens)、弗氏拟谷盗(T.freemani)和短角拟谷盗(T.brevicornis)。

赤拟谷盗涉及如下地理种群：捷克布拉格(Prague,Czech Republic)种群、捷克拉科夫尼克(Rakovník,Czech Republic)种群、克罗地亚奥西耶克(Osijek，Croatia)种群、法国波尔多(Bordeaux，France)种群、美国堪萨斯州(Kansas，USA)种群、广西北海(Guangxi，P.R.China)种群、新疆阿克苏(Xinj iang，P.R.China)种群、广东广州(Guangdong，P.R.China)种群、河南许昌(Henan,P.R.China)种群。

杂拟谷盗涉及如下地理种群：捷克布拉格(Prague，Czech Republic)种群、捷克赫瑞克(Herink，Czech Republic)种群、捷克基约夫(Kyjov，Czech Republic)种群、法国波尔多(Bordeaux,France)种群、美国堪萨斯州(Kansas，USA)种群。

褐拟谷盗涉及如下地理种群：捷克布拉格(Prague,Czech Republic)种群。

黑拟谷盗涉及如下地理种群：美国堪萨斯州(Kansas,USA)种群。

弗氏拟谷盗涉及如下地理种群：美国堪萨斯州(Kansas,USA)种群。

短角拟谷盗涉及如下地理种群：英国约克郡(York,UK)种群。

赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗记载在如下文献中：张生芳，周玉香.拟谷盗属重要种的分布、寄主及鉴别.植物检疫，2006:6(16).；张生芳，刘永平.拟谷盗属赤拟谷盗组重要种的鉴定.植物检疫，1992:6(4).；Angelini,D.R.,Jockusch,E.L.,2008.Relationships among pest flourbeetles of the genus Tribolium(Tenebrionidae)inferred from multiplemolecular markers.Molecular Phylogenetics and Evolution 46,127-141.；N.,Mravinac,B.,Plohl,M.,B.,2006.Preliminary phylogeny of Tribolium beetles(Coleoptera:Tenebrionidae)resolved by combined analysis of mitochondrial genes.European Journal ofEntomology 103,709-715。

实时荧光PCR的反应数据由与ABI 7500 PCR仪配套的7500 Software v2.0.6软件自动收集和分析，生成扩增曲线图。扩增曲线图中：当反应样品的荧光值(Rn)与参比染料ROX之差(ΔRn)超过系统默认的阈值，且Ct值小于某一选定值(Ct值指的是荧光值开始达到指数增长时的循环数；本发明中设置的选定值为30)，则被认为是阳性反应；否则，被认为是阴性反应。

实施例1、针对6种拟谷盗类储粮害虫的特异性TaqMan探针和引物的设计

1、采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取单头拟谷盗成虫胸部(包括腿节)或单头非成虫态整个虫体的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，利用LCO1490和HCO2198组成的引物对进行PCR扩增。

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

3、将步骤2的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收并测序。

4、将获得的6种拟谷盗(每种包含1至多个地理种群)的测序结果进行DNAMAN比对分析，分别设计针对6种拟谷盗的特异性TaqMan探针和引物，见表1。

表1针对六种拟谷盗类储粮害虫的特异引物和探针

实施例2、应用Tca引物探针组合物鉴定赤拟谷盗的特异性和灵敏度

用于鉴定赤拟谷盗的引物探针组合物为Tca引物探针组合物，由Tca引物对和Tca探针组成。Tca引物对由表1中的TcaF和TcaR组成。Tca探针为表1中的TcaP。

特异性试验中的待测拟谷盗分别如下：捷克布拉格种群赤拟谷盗、捷克拉科夫尼克种群赤拟谷盗、克罗地亚奥西耶克种群赤拟谷盗、法国波尔多种群赤拟谷盗、美国堪萨斯州种群赤拟谷盗、广西北海种群赤拟谷盗、新疆阿克苏种群赤拟谷盗、广东广州种群赤拟谷盗、河南许昌种群赤拟谷盗、法国波尔多种群杂拟谷盗、捷克布拉格种群褐拟谷盗、美国堪萨斯州种群黑拟谷盗、美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗、英国约克郡种群短角拟谷盗。

灵敏度试验中的待测拟谷盗为广东广州种群赤拟谷盗。

一、特异性

1、采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，提取单头待测拟谷盗成虫胸部或单头待测非成虫态整个虫体的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用Tca引物探针组合物进行单重实时荧光PCR。设置用ddH₂O代替基因组DNA的空白对照。

实时荧光PCR的仪器为ABI 7500PCR仪。

实时荧光PCR的反应体系(20μL)：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司)10μL，ddH₂O 7.2μL，模板溶液1μL(模板溶液中DNA浓度为10ng/μL)，上游引物溶液0.4μL(上游引物溶液中，上游引物浓度为10μM)，下游引物溶液0.4μL(下游引物溶液中，下游引物浓度为10μM)，TaqMan探针溶液0.8μL(TaqMan探针溶液中，探针浓度为10μM)，参比荧光ROX II(大连宝生物工程有限公司)0.2μL。实时荧光PCR的反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM。

实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火和延伸34s，35个循环。

结果见图1。9个地理种群的赤拟谷盗均显示阳性反应(荧光信号出现指数增长，Ct值为20-26)，杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Tca引物探针组合物鉴定赤拟谷盗具有良好的特异性。

二、灵敏度

1、采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，提取单头待测拟谷盗成虫胸部或单头待测非成虫态整个虫体的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA的梯度稀释液为模板，采用Tca引物探针组合物进行单重实时荧光PCR。

实时荧光PCR的仪器为ABI 7500PCR仪。

实时荧光PCR的反应体系(20μL)：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司)10μL，ddH₂O 7.2μL，模板溶液1μL(DNA含量为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng)，上游引物溶液0.4μL(上游引物溶液中，上游引物浓度为10μM)，下游引物溶液0.4μL(下游引物溶液中，下游引物浓度为10μM)，TaqMan探针溶液0.8μL(TaqMan探针溶液中，探针浓度为10μM)，参比荧光ROX II(大连宝生物工程有限公司)0.2μL。实时荧光PCR的反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM。

实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火和延伸34s，35个循环。

结果见图2。采用各个浓度的赤拟谷盗基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低而明显增大，当模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng时，Ct值分别依次为18、21、24、27、31或33。结果表明：应用Tca引物探针组合物鉴定赤拟谷盗，检测限度可达0.001ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光信号在反应到达第33个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当DNA模板浓度大于0.01ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测赤拟谷盗的适宜模板浓度应高于0.01ng。

实施例3、应用Tco引物探针组合物鉴定杂拟谷盗的特异性和灵敏度

用于鉴定杂拟谷盗的引物探针组合物为Tco引物探针组合物，由Tco引物对和Tco探针组成。Tco引物对由表1中的TcoF和TcoR组成。Tco探针为表1中的TcoP。

特异性试验中的待测拟谷盗分别如下：捷克布拉格种群杂拟谷盗、捷克赫瑞克种群杂拟谷盗、捷克基约夫种群杂拟谷盗、法国波尔多种群杂拟谷盗、美国堪萨斯州种群杂拟谷盗、广东广州种群赤拟谷盗、捷克布拉格种群褐拟谷盗、美国堪萨斯州种群黑拟谷盗、美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗、英国约克郡种群短角拟谷盗。

灵敏度试验中的待测拟谷盗为法国波尔多种群杂拟谷盗。

一、特异性

方法同实施例2的步骤一。

结果见图3。5个地理种群的杂拟谷盗均显示阳性反应(荧光信号出现指数增长，Ct值为20-24)，赤拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Tco引物探针组合物鉴定杂拟谷盗具有良好的特异性。

二、灵敏度

方法同实施例2的步骤二。

结果见图4。采用各个浓度的杂拟谷盗基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低而明显增大，当模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng时，Ct值分别依次为19、23、26、29、31或33。结果表明：应用Tco引物探针组合物鉴定杂拟谷盗，检测限度可达0.001ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光信号在反应到达第33个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当DNA模板浓度大于0.01ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测杂拟谷盗的适宜模板浓度应高于0.01ng。

实施例4、应用Tde引物探针组合物鉴定褐拟谷盗的特异性和灵敏度

用于鉴定褐拟谷盗的引物探针组合物为Tde引物探针组合物，由Tde引物对和Tde探针组成。Tde引物对由表1中的TdeF和TdeR组成。Tde探针为表1中的TdeP。

特异性试验中的待测拟谷盗分别如下：捷克布拉格种群褐拟谷盗、广东广州种群赤拟谷盗、法国波尔多种群杂拟谷盗、美国堪萨斯州种群黑拟谷盗、美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗、英国约克郡种群短角拟谷盗。

灵敏度试验中的待测拟谷盗为捷克布拉格种群褐拟谷盗。

一、特异性

方法同实施例2的步骤一。

结果见图5。褐拟谷盗显示阳性反应(荧光信号出现指数增长，Ct值为24)，赤拟谷盗、杂拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Tde引物探针组合物鉴定褐拟谷盗具有良好的特异性。

二、灵敏度

方法同实施例2的步骤二。

结果见图6。采用各个浓度的褐拟谷盗基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低而明显增大，当模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng时，Ct值分别依次为17、22、25、29、32或35。结果表明：应用Tde引物探针组合物鉴定褐拟谷盗，检测限度可达0.01ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光信号在反应到达第32个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当DNA模板浓度大于0.1ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测褐拟谷盗的适宜模板浓度应高于0.1ng。

实施例5、应用Tma引物探针组合物鉴定黑拟谷盗的特异性和灵敏度

用于鉴定黑拟谷盗的引物探针组合物为Tma引物探针组合物，由Tma引物对和Tma探针组成。Tma引物对由表1中的TmaF和TmaR组成。Tma探针为表1中的TmaP。

特异性试验中的待测拟谷盗分别如下：美国堪萨斯州种群黑拟谷盗、广东广州种群赤拟谷盗、法国波尔多种群杂拟谷盗、捷克布拉格种群褐拟谷盗、美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗、英国约克郡种群短角拟谷盗。

灵敏度试验中的待测拟谷盗为美国堪萨斯州种群黑拟谷盗。

一、特异性

方法同实施例2的步骤一。

结果见图7。黑拟谷盗显示阳性反应(荧光信号出现指数增长，Ct值为17)，赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗均在Ct值为32-35时荧光信号才有所增长，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Tma引物探针组合物鉴定黑拟谷盗具有良好的特异性。

二、灵敏度

方法同实施例2的步骤二。

结果见图8。采用各个浓度的黑拟谷盗基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低而明显增大，当模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng时，Ct值分别依次为16、19、23、26、29或32。结果表明：应用Tma引物探针组合物鉴定黑拟谷盗，检测限度可达0.001ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光信号在反应到达第32个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当DNA模板浓度大于0.01ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测黑拟谷盗的适宜模板浓度应高于0.01ng。

实施例6、应用Tfr引物探针组合物鉴定弗氏拟谷盗的特异性和灵敏度

用于鉴定弗氏拟谷盗的引物探针组合物为Tfr引物探针组合物，由Tfr引物对和Tfr探针组成。Tfr引物对由表1中的TfrF和TfrR组成。Tfr探针为表1中的TfrP。

特异性试验中的待测拟谷盗分别如下：美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗、广东广州种群赤拟谷盗、法国波尔多种群杂拟谷盗、捷克布拉格种群褐拟谷盗、美国堪萨斯州种群黑拟谷盗、英国约克郡种群短角拟谷盗。

灵敏度试验中的待测拟谷盗为美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗。

一、特异性

方法同实施例2的步骤一。

结果见图9。弗氏拟谷盗显示阳性反应(荧光信号出现指数增长，Ct值为17)，赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗和短角拟谷盗均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Tfr引物探针组合物鉴定弗氏拟谷盗具有良好的特异性。

二、灵敏度

方法同实施例2的步骤二。

结果见图10。采用各个浓度的弗氏拟谷盗基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低而明显增大，当模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng时，Ct值分别依次为19、24、28、31、33或35。结果表明：应用Tfr引物探针组合物鉴定弗氏拟谷盗，检测限度可达0.01ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光信号在反应到达第33个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当DNA模板浓度大于0.1ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测弗氏拟谷盗的适宜模板浓度应高于0.1ng。

实施例7、应用Tbr引物探针组合物鉴定短角拟谷盗的特异性和灵敏度

用于鉴定短角拟谷盗的引物探针组合物为Tbr引物探针组合物，由Tbr引物对和Tbr探针组成。Tbr引物对由表1中的TbrF和TbrR组成。Tbr探针为表1中的TbrP。

特异性试验中的待测拟谷盗分别如下：英国约克郡种群短角拟谷盗、广东广州种群赤拟谷盗、法国波尔多种群杂拟谷盗、捷克布拉格种群褐拟谷盗、美国堪萨斯州种群黑拟谷盗、美国堪萨斯州种群弗氏拟谷盗。

灵敏度试验中的待测拟谷盗为英国约克郡种群短角拟谷盗。

一、特异性

方法同实施例2的步骤一。

结果见图11。短角拟谷盗显示阳性反应(荧光信号出现指数增长，Ct值为19)，赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗和弗氏拟谷盗均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Tbr引物探针组合物鉴定短角拟谷盗具有良好的特异性。

二、灵敏度

方法同实施例2的步骤二。

结果见图12。采用各个浓度的短角拟谷盗基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低而明显增大，当模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng或0.001ng时，Ct值分别依次为20、23、26、29、32和34。结果表明：应用Tbr引物探针组合物鉴定短角拟谷盗，检测限度可达0.001ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光信号在反应到达第34个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当DNA模板浓度大于0.01ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测短角拟谷盗的适宜模板浓度应高于0.01ng。

实施例8、试剂盒的应用

试剂盒由如下组分组成：Tca引物探针组合物、Tco引物探针组合物、Tde引物探针组合物、Tma引物探针组合物、Tfr引物探针组合物和Tbr引物探针组合物。试剂盒中，各个引物探针组合物独立包装。各个引物探针组合物中，引物和探针独立包装。

待测样本如下：2011年采集自山东济宁粮库的未知种拟谷盗幼虫、蛹和成虫样品，2012年采集自云南昆明面粉厂的未知种拟谷盗幼虫、蛹和成虫样品，北京出入境检验检疫局提供进境阿联酋货物中截获的未知种拟谷盗成虫样品。

1、采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，提取单头待测拟谷盗成虫胸部或单头待测非成虫态整个虫体的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，分别采用试剂盒中的六种引物探针组合物进行单重实时荧光PCR。设置用ddH₂O代替基因组DNA的空白对照。

实时荧光PCR的仪器为ABI 7500 PCR仪。实时荧光PCR的反应体系(20μL)：PremixEx Taq(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司)10μL，ddH₂O 7.2μL，模板溶液1μL(模板溶液中DNA浓度为10ng/μL)，上游引物溶液0.4μL(上游引物溶液中，上游引物浓度为10μM)，下游引物溶液0.4μL(下游引物溶液中，下游引物浓度为10μM)，TaqMan探针溶液0.8μL(TaqMan探针溶液中，探针浓度为10μM)，参比荧光ROX II(大连宝生物工程有限公司)0.2μL。实时荧光PCR的反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM。实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火和延伸34s，35个循环。

来自山东济宁汶上粮库的未知种拟谷盗幼虫、蛹和成虫三种虫态的DNA模板，均只有在使用Tca引物探针组合物时才有较强荧光信号能被检测，Ct值在18左右，使用其他引物探针组合物均无特异性扩增。来自云南昆明的未知种拟谷盗幼虫、蛹和成虫三种虫态的DNA模板，均只有在使用Tco引物探针组合物时才出现特异性扩增曲线，Ct值在18左右，而使用其他引物探针组合物均无特异性扩增反应。来自进境阿联酉货物中截获的未知种拟谷盗成虫DNA模板，均只在使用Tca引物探针组合物时才产生特异性扩增曲线，Ct值在20左右，使用其他引物探针组合物均无特异性扩增反应。由此可知，山东济宁汶上粮库采集到的未知种拟谷盗和北京出入境检验检疫局进境阿联酉货物中截获的未知种拟谷盗均为赤拟谷盗，云南昆明面粉厂采集到的未知种拟谷盗为杂拟谷盗。

同时，本发明的发明人采用了现有的形态学鉴定方法。中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所张生芳研究员从事鞘翅目储藏物害虫(如：拟谷盗，扁谷盗，皮蠹等)的形态研究30余年，具备丰富的形态学鉴定经验，经过张生芳研究员对采于山东济宁粮库和采自云南昆明面粉厂的各5头未知种拟谷盗样品进行形态学鉴定(鉴定方法参见“拟谷盗属重要种的分布、寄主及鉴别”一文)，结果证实，来自山东济宁粮库和北京出入境检验检疫局截获的进境阿联酉货物的未知种拟谷盗确实为赤拟谷盗，来自云南昆明面粉的未知种拟谷盗确实为杂拟谷盗。

结果表明，利用本发明提供的试剂盒对待测拟谷盗样品进行种的鉴定，结果可靠，并且在以拟谷盗成虫DNA为模板基础上建立的实时荧光PCR方法同样能用于拟谷盗幼虫、蛹等未成熟虫态的种类鉴定。

Claims (9)

1.一种用于鉴定拟谷盗的试剂盒，包括Tca引物探针组合物、Tco引物探针组合物、Tde引物探针组合物、Tma引物探针组合物、Tfr引物探针组合物和Tbr引物探针组合物；

所述Tca引物探针组合物由Tca引物对和Tca探针组成；Tca引物对由引物TcaF和引物TcaR组成；引物TcaF如序列表的序列1所示；引物TcaR如序列表的序列2所示；Tca探针的核苷酸序列为序列表的序列3；所述Tco引物探针组合物由Tco引物对和Tco探针组成；Tco引物对由引物TcoF和引物TcoR组成；引物TcoF如序列表的序列4所示；引物TcoR如序列表的序列5所示；Tco探针的核苷酸序列为序列表的序列6；所述Tde引物探针组合物由Tde引物对和Tde探针组成；Tde引物对由引物TdeF和引物TdeR组成；引物TdeF如序列表的序列7所示；引物TdeR如序列表的序列8所示；Tde探针的核苷酸序列为序列表的序列9；所述Tma引物探针组合物由Tma引物对和Tma探针组成；Tma引物对由引物TmaF和引物TmaR组成；引物TmaF如序列表的序列10所示；引物TmaR如序列表的序列11所示；Tma探针的核苷酸序列为序列表的序列12；所述Tfr引物探针组合物由Tfr引物对和Tfr探针组成；Tfr引物对由引物TfrF和引物TfrR组成；引物TfrF如序列表的序列13所示；引物TfrR如序列表的序列14所示；Tfr探针的核苷酸序列为序列表的序列15；所述Tbr引物探针组合物由Tbr引物对和Tbr探针组成；Tbr引物对由引物TbrF和引物TbrR组成；引物TbrF如序列表的序列16所示；引物TbrR如序列表的序列17所示；Tbr探针的核苷酸序列为序列表的序列18。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：任一所述探针均为TaqMan探针。

3.权利要求1或2所述试剂盒在鉴定待测拟谷盗是否为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗中的应用。

4.一种利用权利要求1所述的试剂盒鉴定待测拟谷盗是否为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗或短角拟谷盗的方法，包括如下步骤：

以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，分别采用所述Tca引物探针组合物、所述Tco引物探针组合物、所述Tde引物探针组合物、所述Tma引物探针组合物、所述Tfr引物探针组合物或所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR；

如果采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的赤拟谷盗，如果采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的杂拟谷盗，如果采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的褐拟谷盗，如果采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的黑拟谷盗，如果采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的弗氏拟谷盗，如果采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的短角拟谷盗。

5.一种采用权利要求1所述的试剂盒鉴定待测拟谷盗为哪种拟谷盗的方法，包括如下步骤：

以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，分别采用所述Tca引物探针组合物、所述Tco引物探针组合物、所述Tde引物探针组合物、所述Tma引物探针组合物、所述Tfr引物探针组合物或所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR；

如果采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的赤拟谷盗，如果采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的杂拟谷盗，如果采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的褐拟谷盗，如果采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的黑拟谷盗，如果采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的弗氏拟谷盗，如果采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的短角拟谷盗；

如果采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR、采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR或采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR均显示阴性反应，待测拟谷盗为候选的非赤拟谷盗、非杂拟谷盗、非褐拟谷盗、非黑拟谷盗、非弗氏拟谷盗且非短角拟谷盗。

6.一种用于鉴定拟谷盗的试剂盒，包括如下六种引物组合物中的至少一种：Tca引物探针组合物、Tco引物探针组合物、Tde引物探针组合物、Tma引物探针组合物、Tfr引物探针组合物和Tbr引物探针组合物；

所述Tca引物探针组合物由Tca引物对和Tca探针组成；Tca引物对由引物TcaF和引物TcaR组成；引物TcaF如序列表的序列1所示；引物TcaR如序列表的序列2所示；Tca探针的核苷酸序列为序列表的序列3；所述Tco引物探针组合物由Tco引物对和Tco探针组成；Tco引物对由引物TcoF和引物TcoR组成；引物TcoF如序列表的序列4所示；引物TcoR如序列表的序列5所示；Tco探针的核苷酸序列为序列表的序列6；所述Tde引物探针组合物由Tde引物对和Tde探针组成；Tde引物对由引物TdeF和引物TdeR组成；引物TdeF如序列表的序列7所示；引物TdeR如序列表的序列8所示；Tde探针的核苷酸序列为序列表的序列9；所述Tma引物探针组合物由Tma引物对和Tma探针组成；Tma引物对由引物TmaF和引物TmaR组成；引物TmaF如序列表的序列10所示；引物TmaR如序列表的序列11所示；Tma探针的核苷酸序列为序列表的序列12；所述Tfr引物探针组合物由Tfr引物对和Tfr探针组成；Tfr引物对由引物TfrF和引物TfrR组成；引物TfrF如序列表的序列13所示；引物TfrR如序列表的序列14所示；Tfr探针的核苷酸序列为序列表的序列15；所述Tbr引物探针组合物由Tbr引物对和Tbr探针组成；Tbr引物对由引物TbrF和引物TbrR组成；引物TbrF如序列表的序列16所示；引物TbrR如序列表的序列17所示；Tbr探针的核苷酸序列为序列表的序列18。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：任一所述探针均为TaqMan探针。

8.权利要求6或7所述试剂盒在鉴定拟谷盗中的应用。

9.一种采用权利要求6所述的试剂盒鉴定待测拟谷盗为哪种拟谷盗的方法，为如下(a)-(e)中的任意一种：

(a)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tca引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的赤拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非赤拟谷盗；

(b)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tco引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的杂拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非杂拟谷盗；

(c)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tde引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的褐拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非褐拟谷盗；

(d)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tma引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的黑拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非黑拟谷盗；

(e)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tfr引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的弗氏拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非弗氏拟谷盗；

(f)以待测拟谷盗的基因组DNA为模板，采用所述Tbr引物探针组合物进行实时荧光PCR，如果显示阳性反应、待测拟谷盗为候选的短角拟谷盗，如果显示阴性反应、待测拟谷盗为候选的非短角拟谷盗。