ES2541684T3 - Crioconservación de material biocompatible - Google Patents

Abstract

Un material implantable crioconservado que comprende: (a) una matriz biocompatible injertada con células que tienen un fenotipo inhibidor de tal manera que son capaces de inhibir o interferir con la proliferación de células de la musculatura lisa vascular y en el que dichas células son casi confluentes, confluentes o postconfluentes y (b) un volumen de una composición de medio de crioconservación suficiente para mantener la viabilidad de las células, la integridad de dicho fenotipo inhibidor y de dicha matriz mientras que están crioconservadas, en el que dicha composición de medio de crioconservación comprende un crioconservante, un polisacárido y suero.

Description

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Los recuentos celulares se realizan mediante digestión completa de la alícuota del material implantable con una solución de colagenasa 0,8 mg/ml en una solución de tripsina-EDTA. Después de medir el volumen del material implantable digerido, se diluye un volumen conocido de la suspensión celular con azul de tripano al 0,4 % (células

4:1 con respecto a azul de tripano) y se evalúa la viabilidad por exclusión con azul de tripano. Las células viables, no viables y totales se enumeran usando un hemocitómetro. Las curvas de crecimiento se construyen representando un número de células viables frente al número de días de cultivo. Las células se envían y se implantan después de alcanzar la confluencia.

Para los fines de la presente invención, la confluencia se define como la presencia de al menos 4 x 105 células/cm3 cuando en una forma plana flexible del material implantable (1,0 x 4,0 x 0,3 cm), y preferentemente 7 x 105 a 1 x 106 células totales por alícuota (50-70 mg) cuando está en la composición flexible. Para ambas, la viabilidad celular es al menos 90 % preferentemente pero no menor que el 80 %. Si las células no están en confluencia los días 12 o 13, los medios se cambian y la incubación continúa durante un día más. Este proceso continua hasta conseguir la confluencia o hasta 14 días después de la siembra. El día 14, si las células no han alcanzado la confluencia, el lote se desecha. Si se determina que las células están en confluencia después de realizar comprobaciones en proceso, se realiza un cambio de medio final. El cambio de medio final realizado usando rojo fenol sin EGM-2 y sin antibióticos. Inmediatamente después el medio se cambia, los tubos se ajustan con tapas herméticas de tapón estéril para su envío.

Evaluación de Funcionalidad. Para los fines de la invención descritos en el presente documento, el material implantable se ensaya adicionalmente para con respecto a los indicios de funcionalidad antes del implante. Por ejemplo, se recoge medio condicionado durante el período de cultivo para determinar niveles heparán sulfato, factorβ1 de crecimiento transformante (TGF-β1), factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF), y óxido nítrico que producen las células endoteliales cultivadas. En determinadas realizaciones preferidas, el material implantable puede usarse para los fines descritos en el presente documento cuando el número de células totales es de al menos aproximadamente 2, preferentemente al menos 4 x 105 células/cm3 de la forma plana flexible; el porcentaje de células viables es al menos el 80-90 %, preferentemente ≥ 90 %, más preferentemente al menos 90 %; el heparán sulfato en medio condicionado es al menos 0,5-1,0, preferentemente al menos 1,0 microg/106 células/día. El TGF-β1 en medio condicionado es al menos 200-300, preferentemente al menos 300 picog/ml/día; el b-FGF en medio condicionado está por debajo de 200 picog/ml, preferentemente no más de 400 picog/ml.

Los niveles de heparán sulfato pueden cuantificarse usando un ensayo espectrofotométrico de digestión con ABC de crondroitinasa de azul de dimetilmetileno rutinario. Los niveles de glucosaminoglucano (GAG) sulfatado se determinan usando un ensayo de unión al colorante de azul de dimetilmetileno (DMB) en el cual muestras desconocidas se comparan con una curva patrón generada usando cantidades conocidas de condroitín sulfato purificado diluido en medios de recogida. Muestras adicionales de medio condicionado se mezclan con ABC crondroitinasa para digerir la condroitina y los dermatán sulfatos antes de la adición del reactivo de color DMB. Todas las absorbancias se determinan a la absorbancia de longitud de onda máxima del colorante DMB mezclado con el parón de GAG, generalmente de aproximadamente 515-525 nm. La concentración del heparán sulfato por 106 células por día se calcula restando la concentración de condroitín y dermatán sulfato a la concentración de glucosaminoglucano sulfatado total en las muestras de medio condicionado. La actividad de ABC crondroitinasa se confirma digiriendo una muestra de condroitín sulfato purificado. Las muestras de medio condicionado se corrigen apropiadamente si se digiere menos del 100 % del condroitín sulfato purificado. Los niveles de heparán sulfato también pueden cuantificarse usando un ensayo ELISA que emplea anticuerpos monoclonales.

Los niveles de TGF-β1 y b-FGF pueden cuantificarse usando un ensayo de ELISA que emplea anticuerpos monoclonales o policlonales, preferentemente policlonales. Los medios de recogida de control también pueden cuantificarse usando un ensayo ELISA y las muestras corregirse apropiadamente para los niveles de TGF-β1y b-FGF presentes en los medios de control.

Los niveles de óxido nítrico (NO) se pueden cuantificarse usando un ensayo de Reacción de Griess convencional. La naturaleza transitoria y volátil del óxido nítrico lo hace inadecuado para la mayoría de los métodos de detección. Sin embargo, pueden detectarse dos productos de degradación estable de óxido nítrico, nitrato (NO3) y nitrito (NO2), usando métodos fotométricos rutinarios. El ensayo de Reacción de Griess convierte enzimáticamente el nitrato en nitrito en presencia de nitrato reductasa. El nitrito se detecta colorimétricamente como un producto colorante azo de color, que absorbe luz visible en el intervalo de aproximadamente 540 nm. El nivel de óxido nítrico presente en el sistema se determina convirtiendo todo el nitrato en nitrito, determinando la concentración total de nitrito en las muestras desconocidas, y después comparando la concentración resultante de nitrito con una curva patrón generada usando cantidades conocidas de nitrato convertido a nitrito.

El fenotipo inhibidor preferido descrito anteriormente se evalúa usando ensayos cuantitativos de heparán sulfato, TGF-β1, NO y/o b-FGF descritos anteriormente, así como ensayos cuantitativos in vitro de células de la musculatura lisa que crecen y la inhibición de trombosis de la siguiente manera. Para los fines de la presente invención, el material implantable estará listo para su implante cuando uno o más de estos ensayos in vitro alternativos confirmen que el material implantable presenta el fenotipo inhibidor preferido.

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En otra realización, la composición fluida se aplica localmente a un sitio extraluminal expuesto quirúrgicamente adyacente a o en la proximidad de un sitio que necesita el tratamiento. En este caso la aplicación está guiada y dirigida por observación directa del sitio que necesite el tratamiento; también en este caso, la aplicación puede estar ayudada por el uso coincidente de otros métodos de guía como se ha descrito anteriormente.

Sellador anastomótico. En determinadas otras realizaciones, la composición fluida de la presente invención puede servir adicionalmente como un sellador anastomótico específicamente o generalmente un sellador quirúrgico. En dicha realización de doble propósito, la composición es también eficaz para sellar la unión de dos o más estructuras tubulares o sellar un espacio en una estructura tubular cuando se pone en contacto con una superficie exterior de la(s) estructura(s), o aplicarse en un arco sobre una superficie exterior o aplicarse en una circunferencia. Dicho sellador puede eliminar una necesidad de suturas que pueden dañar adicionalmente el tejido vascular, por ejemplo, y contribuir a un traumatismo endotelial luminal. Dicho sellador también puede proporcionar estabilidad adicional en la proximidad de una anastomosis reforzando de este modo cualquier reparación de la sutura. Todo lo que se requiere es que las propiedades de tipo sellador de esta composición de doble finalidad no interfieran con u otorguen una expresión coincidente del fenotipo deseado de las células y la funcionalidad basada en células de la composición.

Para los fines de determinadas realizaciones selladoras, la composición fluida comprende una matriz biocompatible en sí misma, comprende un componente que tiene propiedades selladoras, tales como, pero sin limitación, una red de fibrina, aunque también tiene las propiedades necesarias para soportar poblaciones de células endotelial o de tipo endotelial. Además, por sí misma la matriz biocompatible puede tener propiedades selladoras así como las necesarias para soportar una población de células. En el caso de otras realizaciones, las células pueden contribuir al menos en parte a las propiedades selladoras. Por ejemplo, se contempla que las células asociadas con la composición produzcan una sustancia que pueda modificar un sustrato, de tal manera que el sustrato adquiere propiedades selladoras, al mismo tiempo que presenta/mantiene su requisito de funcionalidad celular. Determinadas células pueden producir esta sustancia naturalmente mientras que otras células pueden modificarse por ingeniería genética para que lo hagan.

Método de Preparación, Conservación y Transporte de Material Implantable

Métodos para Obtener y Preparar Células. El material implantable comprende células endoteliales o de tipo endotelial alogénicas, xenogénicas o autólogas. Las células endoteliales se obtienen de un paciente, un cadáver o un banco de células. Las células endoteliales proceden de tejido vascular, más preferentemente de tejido aórtico, más preferentemente de tejido de arteria coronaria, tejido de arteria pulmonar o tejido de arteria iliaca. Como alternativa, las células endoteliales o de tipo endotelial proceden de un tejido u órgano no vascular, células progenitoras endoteliales u otras células progenitoras o de células madre. De acuerdo con realizaciones adicionales, las células se alteran, modifican o diseñan por ingeniería genética.

Cada lote de células procedente de un donante se ensaya exhaustivamente con respecto a la pureza de las células endoteliales, función biológica, la presencia de micoplasma, bacterias, hongos, levaduras, agentes patógenos humanos conocidos u otros agentes accidentales. De acuerdo con una realización preferida, las células se obtienen de un donante con sangre de tipo O. Adicionalmente las células se expanden al pase 2 o 4, se caracterizan y se crioconservan a -140 ºC para formar un banco de células maestro usando técnicas bien conocidas para preparación posterior de un banco celular de trabajo, expansión en cultivos y posterior formulación en el material implantable.

Después, un banco de células maestro seleccionado se expande para formar un banco de células de trabajo en un matraz T-75 que contiene 15 ml de medio de crecimiento de células endoteliales. Los matraces se colocan en una incubadora mantenida a una temperatura de aproximadamente 37 ºC y 5 % deCO2 / 95 % de aire, 90 % de humedad durante un mínimo de 30 minutos. Uno o dos viales de células se sacan del congelador a -160 ºC-140 ºC y se descongelan a aproximadamente 37 ºC. Cada vial de células descongeladas se siembra en dos matraces T-75 a una densidad de 3,0x103 células por cm3, preferentemente, pero no menos de 1,0x103 y no más de 7,0x103. Los matraces que contienen las células vuelven a llevarse a la incubadora. Después de 8-24 horas, el medio consumido se retira y se reemplaza por medio reciente. Los medios se cambian cada dos o tres días, posteriormente, hasta que las células alcanzan una confluencia del 85-100 % preferentemente, pero no menor del 60 % y no mayor del 100 %. Cuando el material implantable está destinado a aplicación clínica, solamente se usa medio sin antibióticos en el cultivo postdescongelado de células y la fabricación de material implantable de la invención.

El medio de crecimiento endotelial se retira después y la monocapa de células se aclara con 10 ml de solución salina tamponada con HEPES (HEPES). El HEPES se retira, y se añaden 2 ml de tripsina (aproximadamente 0,25 mg/ml) para separar las células de la superficie de los matraces T-75. Una vez producida la separación, se añaden 3 ml de solución neutralizante de tripsina (TNS) para detener la reacción enzimática. Se añaden 5 ml más de HEPES y las células se enumeran usando un hemocitómetro. La suspensión celular se centrifuga y se ajusta a una densidad de 1,75 x 106 células/ml usando EGM-2 sin antibióticos.

Si las células van a congelarse para formar un banco de células de trabajo, el medio se complementa con un FBS al 10 % adicional (FBS al 12 % final) y dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 %. Volúmenes de un mililitro de la suspensión

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