ES2539840T3 - Procedimiento para prevenir el desarrollo de artritis reumatoide en sujetos con artritis indiferenciada - Google Patents

Abstract

Una molécula de CTLA4, en donde la molécula de CTLA4 se une a CD80 y/o CD86 y comprende un dominio extracelular de CTLA4 tal como se muestra en la SEC ID N.º: 2 que empieza por alanina en la posición 26 o metionina en la posición 27 y que termina por ácido aspártico en la posición 150, para su uso en el tratamiento de la artritis indiferenciada (AI).

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

sustancialmente libre de moléculas monoméricas de CTLA4-Ig. Sustancialmente libre de moléculas monoméricas de CTLA4-Ig puede referirse a una población de moléculas de CTLA4-Ig que tiene menos de 1 %, 0,5 %, o 0,1 % de monómeros.

En una modalidad, la invención proporciona una población de moléculas de CTLA4-Ig en la que la población está sustancialmente libre de multímeros de CTLA4-Ig que sean mayores que dímeros, tales como tetrámeros, hexámeros, etc. Sustancialmente libre de moléculas de multímero de CTLA4-Ig mayores que dímeros puede referirse a una población de moléculas de CTLA4-Ig que tengan menos de 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, o 0,1 % de multímeros de CTLA4-Ig mayores que la forma dimérica.

En una modalidad, una molécula de monómero de CTLA4-Ig puede tener, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de: (i) 26-383 de la SEC ID N.º: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID N.º: 2 (iii) 27-383 de la SEC ID N.º: 2, o (iv) 27-382 de la SEC ID N.º: 2, u opcionalmente (v) 25-382 de la SEC ID N.º: 2, o (vi) 25-383 de la SEC ID N.º: 2. Cuando un casete de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID N.º: 1 se expresa en células CHO, la forma monomérica predominante que se expresa tiene el grupo aminoacídico del extremo N de metionina (grupo 27 de la SEC ID N.º: 2), que corresponde al grupo aminoacídico del extremo N de CTLA4 humana de tipo natural. Sin embargo, dado que la SEC ID N.º: 1 también incluye la secuencia codificante de una secuencia de señal M de oncostatina (nucleótidos 11-88 de la SEC ID N.º: 1), la proteína expresada de la SEC ID N.º: 1 contiene una secuencia de señal M de oncostatina. La secuencia de señal se escinde de la proteína expresada durante el procesamiento de exportar la proteína del citoplasma, o secreción al exterior de la célula. Pero la escisión puede producir variantes del extremo N, tales como escisión entre los grupos aminoacídicos 25 y 26 (que produce una variante del grupo 26 del extremo N, es decir, la “variante Ala”), o entre los grupos aminoacídicos 24 y 25 (que produce una variante del grupo 2 del extremo N, es decir, la “variante Met-Ala”), en vez de la escisión entre los grupos aminoacídicos 26 y 27 (que produce un extremo N del grupo 27). Por ejemplo, la variante Met-Ala can puede estar presente en una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a aproximadamente 1 %, y la variante Ala puede estar presente en una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a aproximadamente 8-10 %. Además, la proteína expresada de la SEC ID N.º: 1 puede tener variantes del extremo C debido a un procesamiento incompleto. El extremo C predominante es la glicina en el grupo 382 de la SEC ID N.º: 2. En una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig, los monómeros que tienen lisina en el extremo C (grupo 383 de la SEC ID N.º: 2) pueden estar presentes, por ejemplo, a aproximadamente 4-5 %.

Una molécula de monómero de CTLA4-Ig puede comprender un dominio extracelular de CTLA4 humana. En una modalidad, el dominio extracelular puede comprender la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 89-463 de la SEC ID N.º: 1 que codifican los aminoácidos 27-151 de la SEC ID N.º: 2. En otra modalidad, el dominio extracelular puede comprender secuencias mutantes de CTLA4 humana. En otra modalidad, el dominio extracelular puede comprender cambios de nucleótidos en los nucleótidos 89-463 de la SEC ID N.º: 1 de tal forma que se produzcan cambios conservadores en los aminoácidos. En otra modalidad, el dominio extracelular puede comprender una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a los nucleótidos 89-463 de la SEC ID N.º: 1.

Una molécula de monómero de CTLA4-Ig puede comprender una región constante de una inmunoglobulina humana. Esta región constante puede ser una porción de una región constante; esta región constante puede tener una secuencia de tipo natural o mutante. La región constante puede ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD

o IgE humanas. La región constante puede ser de una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina. Cuando la región constante es de una molécula de IgG, IgD, o IgA, la región constante puede comprender uno o más de los siguientes dominios de región constante: CL, CH1, bisagra, CH2, o CH3. Cuando la región constante es de IgM o IgE, la región constante puede comprender uno o más de los siguientes dominios de región constante: CL, CH1, CH2, CH3, o Ca4. En una modalidad, la región constante puede comprender una o más dominios de región constante de IgG, IgD, IgA, IgM o IgE.

En una modalidad, una molécula de monómero de CTLA4-Ig comprende una región bisagra de IgG1 humana modificada (nucleótidos 464-508 de la SEC ID N.º: 1; aminoácidos 152-166 de la SEC ID N.º: 2) en la que las serinas de los grupos aminoacídicos 156, 162, y 165 de la SEC ID N.º: 2 se han diseñado a partir de cisteínas presentes en la secuencia de tipo natural.

En una modalidad, una molécula de monómero de CTLA4-Ig comprende una región CH2 de IgG1 humana modificada y una región CH3 de tipo natural (el dominio CH2 de IgG1 humana modificada que tiene los nucleótidos 509-838 de la SEC ID N.º: 1 y los aminoácidos 167-276 de la SEC ID N.º: 2; el dominio CH3 de IgG1 humana que tiene los nucleótidos 839-1159 de la SEC ID N.º: 1 y los aminoácidos 277-383 de la SEC ID N.º: 2).

En una modalidad, una población de moléculas de CTLA4-Ig comprende monómeros que tienen una secuencia que se muestra en una o más de las Figuras 7, 8 o 9 de la patente de Estados Unidos n.º 7.094.874, expedida el 22 de agosto de 2006 y en las solicitudes de patentes de Estados Unidos publicadas n.º 2003/0083246 y 2004/0022787.

En una modalidad, una molécula de tetrámero de CTLA4-Ig comprende dos pares o dos dímeros de polipéptidos de CTLA4-Ig, en la que cada polipéptido tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) 26-383 de la SEC

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

ID N.º: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID N.º: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID N.º: 2, o (iv) 27-382 de la SEC ID N.º: 2, u opcionalmente (v) 25-382 de la SEC ID N.º: 2, o (vi) 25-383 de la SEC ID N.º: 2. Cada eslabón del par de polipéptidos o dímero está ligado covalentemente al otro eslabón, y los dos pares de polipéptidos están asociados de forma no covalente entre sí formando un tetrámero. Las moléculas tetraméricas tienen capacidad de unirse a CD80 o CD86.

En otra modalidad, las moléculas tetraméricas pueden unirse a CD80 o CD86 con una avidez que es al menos 2 veces mayor que la avidez de unión de un dímero de CTLA4-Ig (cuyos monómeros tienen una de las secuencias de aminoácidos anteriores) a CD80 o CD86. En otra modalidad, las moléculas tetraméricas pueden unirse a CD80 o CD86 con una avidez que es al menos 2 veces superior a la afinidad o avidez de unión de CTLA4 de tipo natural a CD80 o CD86. La avidez superior puede contribuir a una mayor eficacia en el tratamiento de trastornos inmunitarios y otras enfermedades como se describe más adelante. Además, la avidez superior o mejorada puede producir el resultado de mayor potencia del fármaco. Por ejemplo, una composición terapéutica que comprende tetrámero de CTLA4-Ig tendría una mayor avidez y por lo tanto una mayor potencia que la misma cantidad de una composición terapéutica que tiene monómero de CTLA4-Ig. En otra modalidad, las moléculas tetraméricas pueden tener una inhibición sobre la proliferación de los linfocitos T al menos a 2 veces superior a un dímero de CTLA4-Ig (cuyos monómeros tienen una de las secuencias de aminoácidos anteriores). En otra modalidad, las moléculas tetraméricas pueden tener una inhibición sobre la proliferación de los linfocitos T al menos a 2 veces superior a una molécula de CTLA4 de tipo natural.

La proliferación de los linfocitos T puede medirse usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, una de las formas más habituales de evaluar la proliferación de los linfocitos T es estimular los linfocitos T mediante antígenos o anticuerpos agonistas a TCR y medir, por ejemplo, la incorporación de timidina titulada (3H-TdR) a los linfocitos T en proliferación o la cantidad de citocinas liberadas por los linfocitos T proliferantes en cultivo. De ese modo puede medirse el efecto inhibidor de las moléculas de CTLA4-Ig sobre la activación o proliferación de los linfocitos T.

La afinidad de una molécula de CTLA4-Ig es la fuerza de la unión de la molécula a un único ligando, que incluye CD80, CD86, o proteínas de fusión CD8OIg o CD86Ig. La afinidad de CTLA4-Ig a los ligandos puede medirse usando, por ejemplo, análisis de la interacción de unión (BIA) basado en una técnica de plasmón superficial. A parte de medir la fuerza de la unión, permite la determinación en tiempo real de la cinética de unión, tal como las constantes de velocidad de asociación y disociación. Un chip sensor, constituido por un porta de vidrio recubierto con una película de metal fina, a la que está unida covalentemente una matriz superficial, está recubierta con uno de los elementos que interactúan, es decir, CTLA4-Ig o uno de los ligandos. Una solución que contiene el otro elemento que interactúa se deja fluir sobre su superficie. Un haz de luz continuo se dirige contra el otro lado de la superficie y se mide su ángulo de reflexión. Al unirse CTLA4-Ig al ligando, el ángulo de resonancia del haz de luz cambia (ya que depende del índice de refracción del medio cercano al lado reactivo del sensor, que a su vez se correlaciona directamente con la concentración de material disuelto en el medio). Posteriormente se analiza con ayuda de un ordenador.

En una modalidad, los experimentos de unión de CTLA4-Ig pueden realizarse mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIAcore (BIAcore AG, Uppsala, Suecia). CTLA4-Ig puede acoplarse covalentemente mediante grupos de amina primaria a una matriz de dextrano carboximetilado sobre un chip sensor BIAcore, inmovilizando así CTLA4-Ig sobre el chip sensor. De forma alternativa, puede usarse un anticuerpo contra la región constante para inmovilizar CTLA4-Ig indirectamente sobre la superficie del sensor mediante el fragmento de Ig. A partir de ahí, se añaden los ligandos al chip para medir la unión de CTLA4-Ig a los ligandos. Las mediciones de afinidad pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en van der Merwe, P. y cols., J. Exp. Med.,185(3):393404 (1997).

También puede medirse la avidez de las moléculas de CTLA4-Ig. La avidez puede definirse como la suma total de la fuerza de la unión de dos moléculas o células entre sí en múltiples sitios. La avidez se diferencia de la afinidad que es la fuerza de unión de un sitio de una molécula a su ligando. Sin comprometerse con la teoría, la mayor avidez de las moléculas de CTLA4-Ig puede provocar una mayor potencia de inhibición por las moléculas de CTLA4-Ig sobre la proliferación y activación de los linfocitos T. La avidez puede medirse, por ejemplo, mediante dos categorías de ensayos en fase sólida: a) ensayos de inhibición competitiva, y b) ensayos de elución. En ambos, el ligando está unidos sobre un soporte sólido. En el ensayo de inhibición competitiva, las moléculas de CTLA4-Ig se añaden después en solución a una concentración fija, junto con el ligando libre en diferentes concentraciones, y se determina la cantidad de ligando que inhibe la unión en fase sólida en un 50 %. Cuando menos ligando se necesite, más fuerte es la avidez. En los ensayos de elución, el ligando se añade en solución. Después de obtener un estado de equilibrio, se añade un caótropo o agente desnaturalizante (por ejemplo, isotiocianato, urea, o dietilamina) en diferentes concentraciones para alterar las interacciones entre CTLA4-Ig y ligando. La cantidad de CTLA4-Ig que resiste la elución se determina después con un ELISA. Cuanto mayor la avidez, más agente caotrópico se necesita para eluir una cierta cantidad de CTLA4-Ig. La avidez relativa de una mezcla heterogénea de moléculas de CTLA4-Ig puede expresarse en términos del índice de avidez (AI), igual a la concentración de agente eluyente necesario para eluir el 50 % de las moléculas de CTLA4-Ig unidas. El análisis refinado de los datos puede realizarse determinando los porcentajes de CTLA4-Ig eluido a diferentes concentraciones de agente de elución.

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

Procedimientos para producir las moléculas de CTLA4Ig de la invención

La expresión de las moléculas de CTLA4Ig puede ser en células procariotas. Los procariotas muy frecuentemente son representados por diversas cepas de bacterias. Las bacterias pueden ser gram positivas o a gram negativas. Habitualmente se prefieren bacterias gram negativas tales como E. coli. También pueden usarse otras cepas microbianas.

Las secuencias, que se describen anteriormente, que codifican moléculas de CTLA4Ig pueden insertarse en un vector diseñado para expresar secuencias exógenas en células procariotas tales como E. coli. Estos vectores pueden incluir secuencias de control procariotas de uso habitual que se definen en el presente documento como que incluyen promotores para iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de unión de ribosomas, que incluyen promotores de uso habitual tales como los sistemas promotores de betalactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang y cols., Nature, 198:1056 (1977)), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y cols., Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980)) y el promotor PL derivado de lambda y el sitio de unión ribosómico del gen N (Shimatake y cols., Nature, 292:128 (1981)).

Los vectores de expresión también incluyen orígenes de replicación y marcadores seleccionables, tales como un gen de beta-lactamasa o neomicin fosfotransferasa que confiere resistencia a antibióticos, de forma que los vectores puedan replicarse en las bacterias y las células que portan los plásmidos pueden seleccionarse cuando se cultivan en presencia de antibióticos, tales como ampicilina o kanamicina.

El plásmido de expresión puede introducirse en las células procariotas mediante varios procedimientos estándar, que incluyen pero sin limitación choque con CaCl2 (Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972), y Sambrook y cols., editores., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press (1989)) y electroporación.

De acuerdo con la práctica de la invención, las células eucariotas también son células hospederas adecuadas. Los ejemplos de células eucariotas incluyen cualquier célula animal, ya sea primaria o inmortalizada, levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,y Pichia pastoris), y células vegetales. Las células de mieloma, COS y CHO son ejemplos de células animales que pueden usarse como huéspedes. Las células CHO particulares incluyen, pero sin limitación, DG44 (Chasin y cols., Som. Cell. Molec. Genet., 12:555-556 (1986); Kolkekar, Biochemistry, 36:10901-10909 (1997)), CHO-K1 (ATCC® n.º CCL-61), CHO-K1 Tet-On cell line (Clontech), CHO denominada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), CHO clon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clon B (GEIMG, Génova, Italia), CHO-K1/SF denominada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), y RR-CHOK1 denominada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Las células vegetales ilustrativas incluyen células de tabaco (plantas enteras, cultivo celular o esquejes), maíz, soja y arroz. También son aceptables las semillas de maíz, soja y arroz.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las moléculas de CTLA4Ig que se describen anteriormente también pueden insertarse en un vector diseñado para expresar secuencias exógenas en un huésped eucariota. Los elementos reguladores del vector pueden variar de acuerdo con el huésped eucariota particular.

Las secuencias de control eucariotas que se usan habitualmente en los vectores de expresión incluyen promotores y secuencias de control compatibles con las células de mamífero tales como, por ejemplo, promotor de CMV (vector CDM8) y virus del sarcoma aviario (ASV) (vector πLN). Otros promotores que se usan habitualmente incluyen los promotores temprano y tardío del virus simio 40 (SV40) (Fiers y cols., Nature, 273:113 (1973)), u otros promotores víricos tales como los que se derivan de polioma, Adenovirus 2, y virus del papiloma bovino. También puede usarse un promotor inducible, tal como hMTII (Karin y cols., Nature, 299:797-802 (1982)).

Los vectores para expresar moléculas de CTLA4Ig en eucariotas también pueden portar secuencias denominadas regiones potenciadoras. Estas son importantes para optimizar la expresión génica y se encuentran o aguas arriba o aguas abajo de la región promotora.

Los ejemplos de vectores de expresión para las células hospederas eucariotas incluyen, pero sin limitación, vectores para células hospederas de mamífero (por ejemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSG5 (Stratagene)), vectores de retrovirus (por ejemplo, vectores pFB (Stratagene)), pCADN-3 (Invitrogen) o formas modificadas del mismo, vectores de adenovirus; vectores de virus adenoasociados, vectores de baculovirus, vectores de levaduras (por ejemplo, vectores pESC (Stratagene)).

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican moléculas de CTLA4Ig pueden integrarse en el genoma de las células hospederas eucariotas y replicarse al replicarse el genoma huésped. De forma alternativa, el vector que porta las moléculas de CTLA4Ig puede contener orígenes de replicación que permitan la replicación extracromosómica.

Para expresar las secuencias de ácidos nucleicos en Saccharomyces cerevisiae, puede usarse el origen de

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

replicación del plásmido de levadura endógeno, el círculo de 2µ. (Broach, Meth. Enzymol., 101:307 (1983)). De forma alternativa, pueden usarse secuencias del genoma de levadura que tienen capacidad de promover la replicación (véase, por ejemplo, Stinchcomb y cols., Nature, 282:39 (1979)); Tschemper y cols., Gene, 10:157 (1980); y Clarke y cols., Meth. Enzymol., 101:300 (1983)).

Las secuencias de control de la transcripción para los vectores de levaduras incluyen promotores para la síntesis de enzimas glucolíticas (Hess y cols., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968) y Holland y cols., Biochemistry, 17:4900 (1978)). Los promotores adicionales conocidos en la técnica incluyen el promotor de CMV que se proporciona en el vector CDM8 (Toyama y cols., FEBS, 268:217-221 (1990)); el promotor de 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman y cols.,

J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)), y los de otras enzimas glucolíticas.

Otros promotores son inducibles porque pueden regularse mediante estímulos ambientales o por el medio de cultivo de las células. Estos promotores inducibles incluyen los de los genes de las proteínas del choque térmico, alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas asociados al catabolismo del nitrógeno, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

También pueden introducirse secuencias reguladoras en el extremo 3΄ de las secuencias codificantes. Estas secuencias pueden actuar estabilizando el ARN mensajero. Los terminadores se encuentran en la región 3΄ sin traducir después de las secuencias codificantes en diversos genes derivados de levaduras y de mamíferos.

Los vectores ilustrativos de plantas y células vegetales incluyen, pero sin limitación, plásmidos de Agrobacterium Ti, virus del mosaico de la coliflor (CaMV), y virus del mosaico dorado del tomate (TGMV).

Las células de mamífero pueden transformarse mediante procedimientos que incluyen pero sin limitación, transfección en presencia de fosfato cálcico, microinyección, electroporación, o mediante transducción con vectores víricos.

Los procedimientos para introducir secuencias de ADN exógeno en genomas vegetales y de levaduras incluyen (1) procedimientos mecánicos, tales como microinyección de ADN en células o protoplastos aislados, agitación en vórtice de células con perlas de vidrio en presencia de ADN, o disparo de esferas de tungsteno u oro recubiertas de ADN a las células o protoplastos; (2) introducción del ADN haciendo las membranas celulares permeables a las macromoléculas mediante tratamiento con polietilenglicol o sometimiento a pulsos eléctricos a voltaje elevado (electroporación); o (3) uso de liposomas (que contienen ADNc) que se fusionan con las membranas celulares.

La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.º 2005/0019859 y la patente de Estados Unidos n.º

7.332.303 enseñan procedimientos para la producción de proteínas de la invención, específicamente de productos glucoproteínicos recombinantes, mediante cultivos de células animales o de mamífero.

Tras la fase de producción de proteínas del procedimiento de cultivo celular, las moléculas de CTLA4Ig se recuperan del medio de cultivo celular usando técnicas que entiende una persona experta en la técnica. En particular, la molécula de CTLA4Ig se recupera del medio de cultivo en forma de un polipéptido segregado.

El medio de cultivo se centrifuga inicialmente para eliminar los desechos celulares y las partículas. La proteína deseada posteriormente se purifica del ADN contaminante, las proteínas, y polipéptidos solubles, con los siguientes procedimientos de purificación no limitantes bien establecidos en la técnica: SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; precipitación con etanol; fraccionamiento por inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio aniónico tal como QAE o DEAE; cromatoenfoque; filtración en gel usando, por ejemplo, una columna SEPHADEX® G-75; y columnas de proteína A SEPHAROSE® para eliminar los contaminantes tales como IgG. La adición de un inhibidor de proteasas, tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), o una mezcla de cóctel de inhibidores de proteasas también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. Una persona experta en la técnica reconocerá que los procedimientos de purificación adecuados para una proteína de interés, por ejemplo una glucoproteína, pueden requerir alteraciones para adaptarse a los cambios del carácter de la proteína tras la expresión en un cultivo de células recombinantes.

Las técnicas y procedimientos de purificación que seleccionan los grupos carbohidrato de la glucoproteína también son de utilidad en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, las técnicas incluyen, cromatografía por HPLC o de intercambio iónico usando resinas de intercambio catiónico o aniónico, en las que se recoge la fracción más básica o más ácida, dependiendo de qué carbohidrato se esté seleccionando. El uso de las técnicas también puede provocar la eliminación concomitante de contaminantes.

El procedimiento de purificación puede comprender además etapas adicionales que inactivan y/o eliminan virus y/o retrovirus que podrían estar presentes potencialmente en el medio de cultivo celular de las líneas celulares de mamíferos. Hay disponible un número significativo de etapas de aclaramiento vírico, que incluyen pero sin limitación, tratamiento con caótropos tales como urea o guanidina, detergentes, etapas adicionales de ultrafiltración/diafiltración, separación convencional, tal como cromatografía de intercambio iónico o de exclusión por

imagen6

E09743410

18-06-2015

Composición de producto farmacéutico SC de CTLA4Ig, 125 mg/ml (125 mg/jeringuilla)

Componente

Cantidad (mg/jeringuilla)

Sacarosa

170

Poloxamer 188

8,0

Fosfato sódico monobásico, monohidratado

0,143

Fosfato sódico dibásico, anhidro

0,971

Agua inyectable

c.s. hasta 1 ml

Los ejemplos I y II de la presente descripción describen la fabricación de una formulación intravenosa (IV) y subcutánea de CTLA4Ig de utilidad en los procedimientos de la invención. Más adelante se ofrece un ejemplo de la formulación de CTLA4Ig liofilizada que se utiliza en el procedimiento de la invención que se describe en el Ejemplo

5 III.

TABLA 4

Composición de producto farmacéutico de CTLA4Ig liofilizada (250mg/vial)

Componente

Cantidad (mg/vial)a

CTLA4Ig

262,5

Maltosa monohidratada

525

Fosfato sódico monobásico, monohidratadob

18,1

Cloruro sódicob

15,3

Ácido clorhídrico

Ajustar a 7,5

Hidróxido sódico

Ajustar a 7,5

a Incluye un 5 % extra para las pérdidas en el vial, aguja y jeringuilla. b Estos componentes están presentes en la solución de la sustancia farmacéutica con CTLA4Ig.

El producto farmacéutico liofilizado puede reconstituirse con un vehículo acuoso. El vehículo acuoso de interés en el

10 presente documento es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para la administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida, tras la liofilización. Habitualmente, el producto farmacéutico liofilizado se reconstituye a aproximadamente 25 mg/ml con 10 ml de agua inyectable estéril, USP (SWFI) o cloruro sódico al 0,9 % inyectable, USP. La solución reconstituida se diluye además a concentraciones de producto farmacéutico de entre 1 y 10 mg/ml con cloruro sódico al 0,9 % inyectable, USP. El producto farmacéutico

15 diluido inyectable es isotónico y adecuado para la administración mediante infusión intravenosa.

Artículo manufacturado

Además, se describe un artículo manufacturado que contiene el producto farmacéutico y preferiblemente

20 proporciona instrucciones para su uso. El artículo manufacturado comprende un envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por varios materiales tales como vidrio, plástico o metales.

El envase mantiene las formulaciones liofilizadas o líquidas. La etiqueta del envase, o asociada a él, puede indicar

25 instrucciones para la reconstitución y/o el uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que el producto farmacéutico a 250 mg/vial debe reconstituirse a concentraciones de proteína como las que se describen anteriormente. La etiqueta puede indicar también que la formulación SC es útil o que debe usarse para la administración subcutánea. El envase con la formulación puede ser un vial de usos múltiples, que permita administraciones repetidas (por ejemplo, de 2-6 administraciones), por ejemplo, de la formulación subcutánea. De forma alternativa, el envase puede ser una

30 jeringuilla previamente cargada que contiene, por ejemplo, la formulación subcutánea.

El artículo manufacturado puede comprender además un segundo envase que comprende, por ejemplo, un vehículo adecuado para la formulación liofilizada.

35 El artículo manufacturado puede incluir, además, otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, y prospectos con instrucciones de uso.

Para un producto farmacéutico sin tensioactivos preferiblemente se utilizan las jeringuillas sin silicona, tal como tras la reconstitución de un producto farmacéutico liofilizado y/o la transferencia de las soluciones del vial a la bolsa

40 intravenosa y puede envasarse conjuntamente con el vial del producto farmacéutico.

Procedimientos de uso

La presente invención proporciona una molécula de CTLA4Ig o composición farmacéutica de la misma para su uso

45 en un método de tratamiento de sujetos con AI que comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la molécula de CTLA4Ig o composición farmacéutica de la misma.

La administración de una cantidad eficaz de la molécula de CTLA4Ig o composición farmacéutica es, en particular,

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

para aliviar al sujeto de al menos uno de los síntomas asociados a la enfermedad, que incluyen la reducción de: inflamación de las articulaciones, dolor con la exploración de las articulaciones, inflamación, rigidez matinal y dolor, y daños estructurales que posteriormente disminuyen la capacidad física.

Los procedimientos de la invención también pueden usarse para mejorar la función física de los sujetos con AI tal como se evalúa en el Cuestionario de valoración de la salud (HAQ) y/o el instrumento de calidad de vida relacionada con la salud (SF-36).

Los procedimientos de la invención pueden usarse también para inhibir los daños estructurales de las articulaciones en sujetos con AI evaluados por la puntuación de la erosión y el edema de la médula ósea y/o puntuación de sinovitis de la muñeca y la mano.

La cantidad de alivio de los síntomas que proporciona la presente invención puede medirse usando cualquiera de los criterios aceptados establecidos para medir y documentar el alivio de los síntomas en un entorno clínico. Los criterios aceptables para medir el alivio de los síntomas puede incluir puntuaciones que se basan en los criterios establecidos por el American College de Rheumatology (por ejemplo, ACR 20), las cuatro mediciones de alivio de los síntomas (en: “CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-inflammatory and Antirheumatic Drugs—FDA 1988”), y el Cuestionario de evaluación de la salud (HAQ) (Fries, J.F. y cols., J. Rheumatology, 9:789-793 (1982)). Para una descripción general de estos criterios, véase Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (AR) (Feb. 1999).

La presente invención proporciona diversos procedimientos, locales o sistémicos, para administrar la molécula de CTLA4Ig sola o junto con otros fármacos terapéuticos. Los procedimientos incluyen procedimientos intravenosos, intramusculares, intraperitoneales, orales, de inhalación y subcutáneos, así como procedimientos de bomba implantable, infusión continua, genoterapia, liposomas, supositorios, contacto tópico, vesículas, cápsulas e inyección. La CTLA4Ig, complejada con un vehículo, se liofiliza habitualmente para su almacenamiento y se reconstituye con agua o una solución tamponada antes de su administración. Tal y como es la práctica estándar en la técnica, las composiciones de la invención pueden administrarse al sujeto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable.

El modo de administración y pauta posológica más eficaz para las formulaciones de esta invención depende de la salud del paciente y de la respuesta al tratamiento y del juicio del doctor que lo trate. De acuerdo con la práctica de la invención, una cantidad eficaz para tratar a un sujeto es una cantidad de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg de peso de un sujeto. En otra modalidad, la cantidad eficaz es una cantidad de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso de un sujeto, preferiblemente de 1 a 10 mg/kg de peso de un sujeto. En una modalidad específica, la cantidad eficaz de CTLA4Ig es de aproximadamente 2 mg/kg de peso de un sujeto. En otra modalidad específica, la cantidad eficaz de CTLA4Ig es de aproximadamente 10 mg/kg de peso de un sujeto. En otra modalidad específica, una cantidad eficaz de CTLA4Ig es 500 mg para un sujeto que pese menos de 60 kg, 750 mg para un sujeto que pese entre 60-100 kg y 1000 mg para un sujeto que pese más de 100 kg.

Las formulaciones de moléculas de CTLA4Ig de la invención pueden administrarse a un sujeto en una cantidad y durante un tiempo (por ejemplo, cantidad de tiempo y/o veces múltiples) suficiente para bloquear la unión de las moléculas de B7 endógenas (por ejemplo, CD80 y/o CD86) a sus ligandos respectivos, en el sujeto. El bloqueo de la unión de B7 endógena y el ligando por lo tanto inhibe las interacciones entre las células positivas para B7 (por ejemplo, células positivas para CD80 y/o CD86) con células positivas para CD28 y/o CTLA4. Por consiguiente, las dosis de los agentes pueden variar dependiendo del sujeto y el modo de administración, las solicitudes de patentes de Estados Unidos publicadas n.º 2003/0083246 y 2004/0022787 enseñan dosis y pautas de administración para CTLA4Ig que tienen la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º: 2 para tratar enfermedades reumáticas, tales como artritis reumatoide. Una cantidad eficaz de molécula de CTLA4Ig puede administrarse a un sujeto una vez al día, a la semana, al mes y/o al año, en una sola vez o en veces múltiples por hora/día/semana/mes/año, dependiendo de la necesidad. Por ejemplo, en una modalidad, puede administrarse inicialmente una cantidad eficaz de la molécula de CTLA4Ig una vez cada dos semanas durante un mes, y después de eso una vez al mes o los Días 1, 15, 29 y después una vez al mes. Se permite un intervalo de +/-3 días para las primeras dosis (es decir, los Días 15 y 29). Se permite un intervalo de +/-7 día para las dosis mensuales posteriores.

De forma alternativa, una persona con conocimiento en la técnica sería capaz de modificar la pauta de administración como respuesta al estado de riesgo del paciente y/o su respuesta al tratamiento. Por ejemplo, la pauta que se describe anteriormente podría modificarse añadiendo el día de administración 5 a la pauta.

Tal como se usa en el presente documento, “cuatro semanas,” “mes”, “meses” o “mensual” se refiere a un periodo de 28 ± 7 días

Habitualmente, las dosis de la formulación de la molécula de CTLA4Ig de la invención están basadas en el peso corporal, y las pautas de administración pueden venir dictadas por los perfiles mínimos diana en suero. Habitualmente, la concentración mínima diana de las moléculas de CTLA4Ig de la invención de entre aproximadamente 3 µg/ml y aproximadamente 35 µg/ml serán suficiente para tratar AI o para prevenir el desarrollo

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

de AR en sujetos con AI, preferiblemente de entre aproximadamente 5 µg/ml y aproximadamente 30 µg/ml, más preferiblemente de entre aproximadamente 10 µg/ml y aproximadamente 30 µg/ml. Una persona experta en la técnica sería capaz de ajustar la dosis y/o la pauta de administración de CTLA4Ig para lograr las concentraciones mínimas en suero deseadas.

La administración de las moléculas o composiciones farmacéuticas de la invención puede ser mediante una infusión intravenosa de 30 minutos a una hora o más. De forma alternativa, las inyecciones subcutáneas múltiples pueden administrar la dosis necesaria.

Las moléculas de CTLA4Ig de la invención pueden administrarse de forma concomitante o secuencial junto con otro tratamiento inmunosupresor / inmunomodulador, por ejemplo, como se especifica en el presente documento, las dosis del compuesto inmunosupresor, o inmunomodulador variarán por supuesto dependiendo del tipo de cofármaco empleado.

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) pueden administrarse de forma concomitante o secuencial junto con la molécula de CTLA4Ig de la invención. Los AINE reducen las reacciones inflamatorias en un sujeto. Los AINE incluyen, pero sin limitación ácido acetilsalicílico, salicilato de colina magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato sódico, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2, meloxicam y tramadol.

Los corticosteroides pueden administrarse de forma concomitante o secuencial junto con la molécula de CTLA4Ig de la invención. Por ejemplo, dosis bajas estables de corticosteroide oral (equivalente a ≤10 mg de prednisona al día), o dosis altas de corticosteroides administradas cada seis meses como ciclo oral (equivalente a 20 mg/día de prednisona al día durante un máximo de dos semanas), o una única dosis IM (intramuscular) o una única dosis IA (intra-articular).

Los ejemplos de corticosteroides incluyen pero sin limitación, betametasona, budesonida, cortisol, cortisona, dexametasona, hidrocritisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona.

Habitualmente, la dosis y pauta de administración estándar de los fármacos coadministrados que se describen anteriormente no se ven influenciados por la adición de las moléculas de CTLA4Ig de la invención a la pauta de tratamiento. Sin embargo, una persona con conocimientos en la técnica puede prescribir dosis menores de los fármacos coadministrados debido a la incorporación de las moléculas de CTLA4Ig de la invención menos tóxicas en la pauta de tratamiento. La información de prescripción puede basarse en el prospecto para cada fármaco coadministrado.

Tal como se describe anteriormente, la destrucción de las articulaciones se produce al inicio de la AR. Este entendimiento ha subrayado la necesidad de tratamientos que puedan alterar de forma fundamental y no meramente suprimir los procesos inflamatorios que provocan los síntomas debilitantes y las lesiones estructurales al inicio del curso de la AR. En consecuencia, esto ha supuesto un creciente énfasis en el diagnóstico y tratamiento tempranos de la AR. Sin embargo, los criterios de 1987 de la ARA para la AR son menos sensibles y específicos cuando se aplican a sujetos con artritis inflamatoria y estos sujetos reciben entonces el diagnóstico de artritis indiferenciada, un problema clínico habitual.

Recientemente se ha demostrado que los sujetos con AI que también dan positivo para anticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos (positivos en anticuerpos contra CCP2) presentan un riesgo elevado de desarrollar AR desde tan solo un año después de la observación (Van Gaalen, F.A. y cols., “Autoantibodies to Cyclic Citrullinated Peptides Predict Progression to Rheumatoid Arthritis in Patients with Undifferentiated Arthritis”, Arthritis Rheum., 50(3):709715 (2004)). Una prueba positiva para determinar la presencia de anticuerpos en suero contra los péptidos citrulinados cíclicos tiene un mayor valor predictivo del desarrollo de AR que los criterios más tradicionales, tales como la presencia o ausencia de factor reumatoide. El 83 % de los sujetos con AI que dieron positivo para anticuerpos contra CCP desarrollaron AR en un año, comparado con 18 % de los controles negativos para anticuerpos contra CCP. Este hallazgo sugiere que puede identificarse fácilmente una subpoblación de sujetos con AI que tendrán riesgo de desarrollar AR y que por lo tanto serían candidatos ideales para el tratamiento dirigido contra los mecanismos subyacentes que desencadenan la inflamación y la destrucción de las articulaciones en AR. La estrategia podría prevenir el desarrollo de lesiones articulares, discapacidad funcional y posterior menor calidad de vida que desafortunadamente caracteriza la historia natural de la AR.

Los ejemplos III y IV describen un estudio clínico diseñado para comparar la eficacia de CTLA4Ig con placebo para prevenir el desarrollo de AR en sujetos con artritis indiferenciada de inicio reciente que presentan un riesgo elevado de desarrollar AR.

El estudio clínico es un estudio de diseño en paralelo, aleatorizado, de doble ciego, controlado con placebo, de dos grupos de 12 meses de duración para el criterio de valoración primario y de 24 meses para el criterio de valoración secundario. Los sujetos se asignan de forma aleatoria 1:1 para recibir o CTLA4Ig o placebo durante los seis

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

E09743410

18-06-2015

primeros meses del estudio. La aleatorización se estratifica en dos grupos basándose en la presencia o ausencia de erosiones.

Los sujetos de este estudio se seleccionaron cuidadosamente para asegurarse de que tenían AI de inicio reciente (es decir, presencia de síntomas de artritis durante < 18 meses), de que eran positivos para anticuerpos contra CCP2, de que no cumplían los criterios de diagnóstico de ninguna otra enfermedad reumática, y de que no habían recibido más tratamiento con DMARD durante más de 2 semanas o de ningún fármaco biológico indicado para la AR. El estudio se diseñó para investigar si un periodo de tratamiento relativamente corto, 6 meses, con monoterapia con CTLA4Ig prevenía la progresión a AR en 1 año o 2 años después del inicio del tratamiento. Además, se exploraron los efectos de CTLA4Ig sobre la actividad de la enfermedad, función física, calidad de vida relacionada con la salud, y actividad del biomarcador PD en sujetos con AI y se compararon con placebo tanto durante el periodo de tratamiento de 6 meses y durante hasta 18 meses después de la última dosis de la medicación del estudio. La inclusión de un periodo de observación sin tratamiento durante 18 meses después de la última dosis de la medicación del estudio permitió evaluar la persistencia de cualesquiera efectos observados de tratamiento con CTLA4Ig. Se permitió el uso de AINE y de dosis bajas estables de corticosteroides orales (-<10 mg/día de prednisona o equivalente), así como el uso limitado de dosis elevadas de tratamiento con corticosteroides, tanto durante los periodos de tratamiento como de observación. Los sujetos que desarrollaron AR en cualquier momento se excluyeron del estudio y podían recibir el tratamiento estándar.

Debido a los estrictos criterios de admisión, que limitaron la aleatorización a 57 sujetos (a 56 de los cuales se trató), no se realizó un análisis estadístico formal de las hipótesis. Los resultados de este estudio, sin embargo, eran generalmente coherentes en múltiples mediciones de la eficacia de los resultados (clínica, radiológica, RM, y actividad de los biomarcadores) a favor de CTLA4Ig comparado con el placebo, y proporcionan indicios de que CTLA4Ig, administrado por vía IV una vez al mes a una dosis de 10 mg/kg basado en el peso corporal durante 6 meses, ralentiza la progresión de AI a AR. El beneficio terapéutico de CTLA4Ig pareció persistir durante hasta 18 meses después de interrupción del fármaco.

La proporción de sujetos que desarrollaron AR para el mes 12 era menor para el grupo que recibió CTLA4Ig (12/27, 46,2 %) que para el grupo con placebo (t6/24, 66,7 %) (20,5 % de diferencia entre tratamientos; IC a 95 %: ~47,4 %, +7,8 %). Para el mes 24, 87,5 % (12/24) de los sujetos con AI habían desarrollado AR en el grupo con placebo comparado con 73,9 % (17/23) de sujetos que habían recibido un ciclo de 6 meses de tratamiento con CTLA4Ig (13,6 % de diferencia entre tratamientos; IC a 95 %: -37,6 %, +10,8 %). La dosis escalonada según el peso de 10 mg/kg dosis de CTLA4Ig que se usó en este estudio de sujetos con AI es análoga a la dosis de 10 mg/kg autorizada para el tratamiento de AR en adultos.

En esta población de sujetos con AI, el tratamiento con CTLA4Ig mejoró la función física y la actividad de la enfermedad referida por el médico. En el mes 6, más de dos veces el número de sujetos tratados con CTLA4Ig comparado con placebo habían logrado una mejora en función física clínicamente significativa (HAQ-DI) (62 % frente a 24 %) o presentaban remisión de la enfermedad indicada por una puntuación en el DAS-28 (CRP) de < 2,6 (71 % contra 35 %). Las mejoras numéricamente mayores en ILAQ-DI y DAS 28 (CRP) observadas al final del periodo de tratamiento del estudio con CTLA4Ig eran aún evidentes después de 6 y 18 meses de seguimiento sin tratamiento, aunque las diferencias entre el grupo de tratamiento y de placebo eran menores los meses 12 y 24. Las evaluaciones radiográficas usando imágenes de RM con contraste de gandolinio de la mano y muñeca y las radiografías convencionales de manos y pies, indicaron una progresión mínima de la enfermedad durante el periodo de tratamiento con el fármaco del estudio entre los sujetos que recibieron CTLA4Ig.

De forma notable, después de 6 meses de tratamiento con CTLA4Ig, se redujeron los niveles en suero de los anticuerpos contra CCP2, y esta reducción era evidente todavía después de 6 meses sin tratamiento con el fármaco del estudio. Por comparación, los niveles de los anticuerpos contra CCP2 aumentaron en el grupo con placebo. Los anticuerpos contra CCP2 predicen con mucha fiabilidad el futuro desarrollo de AR tanto en sujetos sanos como en pacientes con artritis indiferenciada.

Se ha defendido una estrategia conservadora para el tratamiento de AI temprana, limitando el uso de los DMARD y posteriormente de los tratamientos biológicos sólo a aquellos pacientes cuyos síntomas y signos de artritis no responden a los AINE y a dosis bajas de corticosteroides. En este estudio de 56 sujetos con AI, CTLA4Ig fue bien tolerado por los individuos con enfermedad en una etapa muy temprana. Durante los 6 meses del periodo de tratamiento del estudio, los EA se refirieron a tasas similares en los grupos con CTLA4Ig y con placebo, ningún EA provocó la muerte, e igualmente, pocos sujetos en ambos grupos de tratamiento presentaron un EAG (1 en cada grupo de tratamiento) o fueron excluidos debido a un EA (1 en cada grupo de tratamiento). Además, no se observaron indicios de un mayor riesgo de infecciones con CTLA4Ig, y sólo 1 sujeto refirió EA por la infusión en el intervalo de 1 hora desde el inicio de la infusión con CTLA4Ig. Los datos del laboratorio clínico de hematología y análisis bioquímico de la sangre generalmente no presentaban nada que reseñar y no se identificaron problemas de seguridad. Cuatro (4) sujetos se convirtieron en seropositivos para anticuerpos contra CTLA4-T el mes 12, 2 de los cuales dieron positivo para anticuerpos neutralizadores. El desarrollo de anticuerpos no pareció mostrar relación directa con los hallazgos sobre seguridad clínica.

imagen7

E09743410

18-06-2015

Ciclo de liofilización para el producto farmacéutico con CTLA4Ig liofilizado

Parámetro de procesamiento

Control durante el proceso

Secado intermedio

Mantener a 0 + 3 ºC durante 8 horas.

Secado secundario (curva descendente)

De 0 ºC a 30 ºC en 2,5 horas.

Secado secundario (vacío)

100 + 20 micrómetros

Secado secundario

Mantener a 30 ºC durante 12 horas.

Taponado

30 + 3 ºC

Taponado (Vacío)

500 + 100 micrómetros

Almacenamiento antes de descargar

Mantener a 20 + 3 ºC durante al menos 4 horas.

Al final del ciclo de liofilización, la presión de la cámara se eleva a 500 micrómetros usando nitrógeno esterilizado por filtración y se lleva a cabo el taponado de los viales a vacío. Los viales taponados permanecen en el liofilizador durante al menos 4 horas. Los viales liofilizados y taponados se sellan con un precinto de aluminio de 20 mm, blanco

5 flip-off con aire filtrado con HEPA mediante la máquina taponadora. Los viales sellados se enjuagan con agua mediante un lavaviales exterior. Los viales con el producto farmacéutico lavados se almacenan de 2 a 8 ºC.

La composición de producto farmacéutico de CTLA4Ig liofilizado (250 mg/vial) se recoge en la Tabla 7 siguiente.

10 TABLA 7

Composición de producto farmacéutico de CTLA4Ig liofilizado (250 mg/vial)

Componente

Cantidad (mg/vial)b

CTLA4Ig

262,5

Maltosa monohidratada

525

Fosfato sódico monobásico, monohidratadob

18,1

Cloruro sódicob

15,3

Ácido clorhídrico

Ajustar a 7,5

Hidróxido sódico

Ajustar a 7,5

a Incluye un 5 % extra para las pérdidas en el vial, aguja y jeringuilla. b Estos componentes están presentes en la solución de la sustancia farmacéutica con CTLA4Ig.

EJEMPLOII

El producto farmacéutico de CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/vial) se formula en forma de una solución estéril,

15 apirógena, lista para usar adecuada para la administración subcutánea. Se fabrica un lote de producto farmacéutico de CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/vial) a una escala de 5 l (3.500 viales). La fórmula del lote se describe en la Tabla 8 siguiente.

TABLA 8

Fórmula del lote

Componente

Cantidad (g)

Sustancia farmacéutica con CTLA4Iga

625

Sacarosa

850

Poloxamer 188

40

Fosfato sódico monobásico, monohidratado

0,715

Fosfato sódico dibásico, anhidro

4,86

Agua inyectable

c.s. hasta 5,0 l

Tamaño total del lote (l)

5,0

a Sustancia farmacéutica con CTLA4Ig: concentración proteínica 50 mg/ml, fosfato sódico 25 mM, cloruro sódico 50 mM, pH de 7,5, <5 % de especies de APM.

20 Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo I, el procedimiento de fabricación para el producto farmacéutico de CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/vial) supone el intercambio de tampones de la sustancia farmacéutica a granel de fosfato sódico 15 mM, cloruro sódico mM a un pH de 7,5 a tampón de fosfato sódico 10 mM a pH 7,8, seguido de concentración de la proteína de ~50 mg/ml a ~150 mg/ml por eliminación del tampón. Después se disuelven la

25 sacarosa y el Poloxamer 188 en la solución de proteína concentrada y se ajusta el peso del lote final con tampón de fosfato sódico 10 mM, a pH 7,8. La solución a granel se filtra a través de un filtro esterilizador de 0,22 micrómetros y se carga en viales de vidrio de plomo de tipo I de 5 cc esterilizados y despirogenados, tapados con tapones de caucho de 20 mm y sellados con precintos flip-off de aluminio de 20 mm.

30 La composición del producto farmacéutico de CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/vial) se proporciona en la Tabla 9 siguiente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E09743410

18-06-2015

TABLA 9

Composición del producto farmacéutico de CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/vial)

Componente

Cantidad (mg/vial)c

CTLA4Ig

175

Sacarosa

238

Poloxamer 188

11,2

Fosfato sódico monobásico, monohidratado

0,20

Fosfato sódico dibásico, anhidro

1,36

Agua inyectable

c.s. hasta 1,4 ml

a Incluye un 40 % extra para las pérdidas en el vial, aguja y jeringuilla.

EJEMPLO III

La artritis reumatoide (AR) es un trastorno autoinmunitario que puede provocar la destrucción progresiva de las articulaciones, deformidad, discapacidad física significativa y mala calidad de vida. No se ha demostrado que ningún tratamiento prevenga el desarrollo de la AR. Este estudio comparará la eficacia de CTLA4Ig con placebo en la prevención del desarrollo de AR en sujetos con artritis indiferenciada (AI) de inicio reciente que presentan un riesgo elevado de desarrollar AR durante el periodo del estudio.

Objetivo primario

Evaluar la proporción de sujetos con AI que desarrollan AR según se define en los criterios de la ARA de 1987 un año después del inicio de la medicación ciega del estudio.

Objetivos secundarios

1) Evaluar la proporción de sujetos con AI que desarrollan AR según se define en los criterios de la ARA de 1987 dos años después del inicio de la medicación ciega del estudio. 2) Evaluar el grado de sinovitis y lesiones articulares estructurales de las manos (articulaciones carpianas, MCP y PIP) a los 6, 12, y 24 meses después del inicio del tratamiento en estudio entre los dos grupos de tratamiento usando RM. 3) Evaluar la proporción de sujetos con sinovitis clínica sintomática persistente a los 6, 12, y 24 meses después del inicio de la medicación entre los dos grupos de tratamiento. 4) Evaluar el efecto farmacodinámico de CTLA4Ig sobre los niveles en suero de autoanticuerpos [factor reumatoide IgM y contra péptido citrulinado cíclico (anticuerpos contra CCP2)]. 5) Evaluar la actividad de la enfermedad en función del tiempo entre los grupos de tratamiento usando los valores medios de la puntuación en el DAS completo (CRP). 6) Evaluar la proporción de sujetos con puntuación en el DAS completo de <1,6 a los 6, 12, y 24 meses. 7) Evaluar la función física y calidad de vida relacionada con la salud usando los instrumentos de Índice de discapacidad de HAQ (HAQ) y SF-36, respectivamente. 8) Evaluar la seguridad de CTLA4Ig en esta población del estudio, que incluye evaluación de la capacidad inmunógena de CTLA4Ig tras completar un ciclo de tratamiento de seis meses.

Objetivo terciario

1) Evaluar los cambios en componentes fundamentales de la variable compuesta de AR según el ACR (artritis reumatoide según el American College of Rheumatology) en función del tiempo entre los dos grupos de tratamiento.

Diseño del estudio

Este estudio es un estudio de diseño en paralelo, aleatorizado, de doble ciego, controlado con placebo, de dos grupos de 12 meses de duración para el criterio de valoración primario y de 24 meses para el criterio de valoración secundario. Los sujetos se asignarán de forma aleatoria 1:1 para recibir o CTLA4Ig o placebo durante los seis primeros meses del estudio. La aleatorización se estratificará en dos grupos basándose en la presencia o ausencia de erosiones (leídas centralmente). Se permitirá a los sujetos tomar fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) durante todo el estudio. Se permitirá a los sujetos tomar una dosis oral baja estable de corticosteroides (equivalente a ≤10 mg de prednisona al día) durante todo el estudio. Pueden utilizarse hasta dos de las siguientes medicaciones de corticosteroides concomitantes a dosis elevadas cada seis meses del ensayo según el criterio del investigador: ciclo oral (equivalente a 20 mg/día de prednisona al día durante un máximo de dos semanas), o una única dosis IM o una única dosis IA. Los sujetos con artritis persistente después de seis meses de la medicación del estudio pero que no cumplen los criterios de AR se observarán sin la medicación del estudio y se les permitirá tomar las medicaciones concomitantes que se describen anteriormente según el criterio del investigador. No se permitirán administraciones posteriores de medicación del estudio.

Los sujetos que desarrollen el criterio de valoración primario (AR según criterios de la ARA) en cualquier momento

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

durante el ensayo se excluirán del estudio y se les permitirá recibir tratamiento antirreumático según el criterio del investigador, que incluye DMARD y/o tratamiento biológico.

A los sujetos inicialmente se les administrarán dosis basándose en su peso en la visita de selección. Los sujetos que pesen < 60 kg recibirán 500 mg; los sujetos que pesen entre 60 y 100 kg recibirán 750 mg, y los sujetos que pesen > 100 kg recibirán 1 gramo. Se administrará CTLA4Ig los Días 1, 15, 29 y cada 28 días después de eso durante un total de 8 dosis. Se permitirá a los sujetos tomar una dosis oral baja estable de corticosteroides (equivalente a ≤10 mg de prednisona al día) durante todo el estudio.

Los sujetos a los que se les ha diagnosticado artritis inflamatoria indiferenciada se evaluarán en el Periodo de selección para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos (anticuerpos contra CCP2). Los sujetos que presenten una prueba positiva de anticuerpos contra CCP2 se estratificarán basándose en la presencia o ausencia de erosiones y se asignarán aleatoriamente al Periodo de tratamiento con el fármaco del estudio. El Periodo de tratamiento con el fármaco del estudio será de seis meses de tratamiento o con CTLA4Ig o con placebo. Los sujetos que completen el periodo de tratamiento que no cumplan los criterios de AR se observarán sin de la medicación del estudio en el Periodo de observación manteniendo el ciego. El Periodo de observación consistirá en visitas trimestrales durante 18 meses para determinar la seguridad y eficacia.

Población del Estudio

Hombres o mujeres (que no estén lactando ni embarazadas) de al menos 18 años de edad, pero no superior a los 75 años con diagnóstico de artritis inflamatoria indiferenciada (AI) que presenten sinovitis clínica sintomática de dos

o más articulaciones y que 1) posean al menos uno y no más de tres de los criterios de la ARA de 1987 para el diagnóstico de AR, 2) no cumplan los criterios de diagnóstico para ninguna otra enfermedad reumática (por ejemplo, lupus eritematoso), y 3) que también sean positivos para autoanticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos mediante ELISA (Immunoscan AR Mark 2, Euro-Diagnostica, Arnhem, Holanda). La duración de la enfermedad [definida como el tiempo desde el inicio de los síntomas (dolor de la articulación, hinchazón, o rigidez significativa) de artritis inflamatoria indiferenciada hasta la admisión] debe ser de menos de 18 meses. No se permite ningún tratamiento anterior con DMARD ni tratamiento biológico antes de la selección.

Criterios de evaluación

El criterio de valoración primario del estudio será la proporción de sujetos con un diagnóstico de AR según los criterios de la ARA de 1987 a 12 meses.

La medición de los criterios de valoración secundarios incluyen la proporción de sujetos con diagnóstico de AR según los criterios de la ARA de 1987 a los 24 meses, la proporción de sujetos con sinovitis clínica sintomática persistente a los 6, 12, y 24 meses, la puntuación media del DAS completo (CRP) a los 6, 12, y 24 meses, la proporción de sujetos con una puntuación en el DAS de <1,6 a los 6, 12, y 24 meses, valoraciones de factor reumatoide y de anticuerpos contra CCP e inflamación y lesiones estructurales (grado de sinovitis, erosiones, y osteítis) de las manos según RM con contraste de gadolinio usando un lector centralizado ciego a la secuencia y el tratamiento. Los criterios de valoración referidos por los sujetos incluirán el HAQ y SF-36.

Los cambios en los componentes fundamentales de la variable compuesta de AR según el ACR se evaluarán en función del tiempo entre los dos grupos de tratamiento como criterio de valoración terciario.

Análisis de la eficacia

El análisis de la eficacia primario será evaluar las tasas de desarrollo de AR a los 12 meses en CTLA4Ig y placebo. Se proporcionarán estimaciones puntuales y de intervalos para la proporción de sujetos con diagnóstico de AR a los 12 meses para los dos grupos de tratamiento. Los sujetos que interrumpan el estudio con una razón expresada de “falta de eficacia” en el CRF se considerará que no responden para el criterio de valoración primario (es decir, se contarán en el numerador y denominador al evaluar la proporción de sujetos que desarrollan AR según los criterios de la ARA). Si a un sujeto le faltan datos en la visita del mes 12 sin que se deba a la interrupción y tiene una evaluación de la visita posterior, se usará esta evaluación en el análisis de los 12 meses. Si no, los sujetos no se incluirán en el análisis. Se realizarán análisis similares para evaluar las tasas de desarrollo de AR a los 24 meses.

El grado de sinovitis y de lesiones articulares estructurales se evaluará usando RM. Se usará el sistema de puntuación OMERACT 6 AR RM (Ostergaard, M. y cols., “OMERACT Rheumatoid Arthritis Magnetic Resonance Imaging Studies. Core Set of MRI Acquisitions, Joint Pathology Definitions, and the OMERACT AR-MRI Scoring System”, J. Rheumatology, 30(6):1385-1386 (2003)). Se resumirán los cambios desde el inicio en erosión, edema, y sinovitis a los 6, 12, y 24 meses usando herramientas estadísticas descriptivas.

La persistencia de sinovitis clínica sintomática se evaluará a los 6, 12 y 24 meses. Las tasas de sinovitis persistente se resumirán con estimaciones puntuales e intervalos de confianza al 95 % para los grupos con CTLA4Ig y con placebo.

5

15

25

35

45

55

65

E09743410

18-06-2015

Se evaluará el efecto farmacodinámico de CTLA4Ig sobre los niveles en suero de autoanticuerpos [factor reumatoide IgM y contra péptido citrulinado cíclico (anticuerpos contra CCP2)]. Se resumirá la distribución de las variables farmacodinámicas en las visitas al inicio, del mes 12 y del mes 24, junto con sus cambios desde el nivel inicial, por grupo de tratamiento. La proporción de sujetos que alcancen resultados positivos/negativos se resumirá por grupo de tratamiento y el estado inicial (positivo/negativo).

Los cambios medios desde el nivel inicial en DAS completo (CRP), HAQ y todos los componentes de SF-36 a los 6, 12 y 24 meses se resumirá con estimaciones puntuales e intervalos de confianza al 95 % para los grupos con CTLA4Ig y con placebo en cada visita. Además, los porcentajes de sujetos con remisión (puntuación en el DAS completo <1,6) se resumirá por grupo de tratamiento.

Los cambios en los componentes fundamentales de la variable compuesta de AR según el ACR se evaluarán en función del tiempo entre los dos grupos de tratamiento.

Análisis de la seguridad

Se enumerarán los hallazgos significativos de la exploración física y de los resultados de las pruebas clínicas y de laboratorio. Se tabularán las estadísticas de resumen. Se generarán distribuciones de frecuencia y listados individuales de todos los eventos adversos. Se enumerarán los cambios en los resultados de las pruebas clínicas de laboratorio desde el nivel inicial. Las interrupciones se resumirán por causa y por grupo de grupo de tratamiento.

Análisis de la capacidad inmunógena

La distribución de las variables de la capacidad inmunógena y sus cambios desde el nivel inicial se resumirá usando herramientas estadísticas descriptivas (medias geométricas, desviaciones típicas, etc.) y también se calcularán los intervalos de confianza al 95 % de los cambios desde el nivel inicial. La falta de capacidad inmunógena se define como la ausencia de una respuesta positiva. La existencia de una respuesta positiva se define basándose en un valor de corte de ensayo para la positividad para cada ensayo y la confirmación de esa respuesta se hace por inmunodepleción. Para el ensayo contra CTLA4Ig, el valor se calcula dividiendo la DO media de la muestra de suero del sujeto tras la administración entre la media de la DO de la muestra de suero del sujeto antes de la administración (Día 1). Para el ensayo contra CTLA4-T, el valor de corte se calcula dividiendo la DO media de la muestra de suero del sujeto tras la administración entre la DO media del control negativo de la placa de muestras. El valor de corte se establece durante la validación del ensayo y puede reestablecerse cuando se hagan cambios en las poblaciones de sujetos o en los reactivos del ensayo. Si una muestra es negativa, se le asigna un valor < la dilución que se evalúa. Si el valor es positivo, se evalúa una dilución seriada y se le asigna un valor de valoración correspondiente al recíproco de la dilución del suero interpolada que es igual al valor de corte para positividad establecido. También se calculará la tasa de respuesta positiva (si la hubiera) y su intervalo de confianza al 95 %.

Criterios para la selección de sujetos

Para ser admitido en el estudio, DEBEN cumplirse los siguientes criterios.

Criterios de inclusión

A. Consentimiento informado por escrito firmado

El sujeto está dispuesto a participar en el estudio y firma el consentimiento informado.

B. Población diana

Los sujetos deben haber sido diagnosticados de AI. Un sujeto con AI debería tener sinovitis clínica sintomática de dos o más articulaciones y debería presentar al menos uno y no más de tres de los criterios de clasificación de AR de la American Rheumatism Association (1987).

Los sujetos no deben cumplir los criterios para el diagnóstico de ninguna otra enfermedad reumática (por ejemplo, lupus eritematoso).

La duración de la enfermedad del sujeto [definida como el tiempo desde el inicio de los síntomas (dolor de la articulación, hinchazón o rigidez) de artritis inflamatoria indiferenciada hasta la admisión] debe ser de menos de 18 meses.

Los sujetos deben ser positivos para autoanticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos por ELISA (Immunoscan AR Mark 2, Euro-Diagnostica, Arnhem, Holanda).

C. Edad y sexo

imagen8

imagen9

imagen10

E09743410

18-06-2015

Procedimientos y observaciones del estudio A. Fase de tratamiento con el fármaco del estudio en doble ciego

Día de visita

Día 1a Día 15 (+/3 días) Día 29 (+/3 días) Día 57 (+/7 días) Día 85 (+/7 días) Día 113 (+/7 días) Día 141 (+/7 días) Día 169 (+/7 días)

RM de mano-muñeca con gadolinio (únicamente en emplazamientos europeos)

X

Recuento de articulaciones con dolor por palpaciónb

X X X X X X X X

Recuento de articulaciones hinchadas

X X X X X X X X

Evaluación del dolor por el sujeto

X X X X X X X X

Evaluación de la actividad de la enfermedad por el sujeto

X X X X X X X X

Evaluación global por el doctor de la actividad de la enfermedad

X X X X X X X X

Evaluación global por el sujeto de la función física (HAQ)

X X X X X X X X

SF-36

X X X X

Respuesta de los sujetos al tratamiento

X X

Evaluaciones de la seguridad

Control de los eventos adversos

X X X X X X X X

Examen físico parcial

X X X X X X X X

ECG

X

Signos vitales

X X X X X X X X

Analítica

Hemograma

X X X X X X X X

Bioquímica

X X X X X X X X

Análisis de orina

X

Prueba de embarazo en orina/suero (solo mujeres en edad fértil)c

X X X X X X X X

CRP

X X X X X X X X

RF de IgM

X X

Biomarcadores (IL-6, TNFα, IL-1 beta, MMP-3)

X X

Tipado de HLA

X

Capacidad inmunógena

X X

Anticuerpos contra CCP2

X

Administración

X X X X X X X X

a Todas las evaluaciones y resultados deben ser revisadas antes de contactar con el Centro de aleatorización central. Todas las evaluaciones deben realizarse antes de la administración. b Se realizará una evaluación de recuento 68/66. c Debería realizarse una prueba de embarazo negativa en las 48 horas anteriores a la visita.

B. Observación de doble ciego posterior al tratamiento

Día de visita (se permiten +/-7 días para los meses 9, 15, 18, y 21; se permiten +/-30 días para los meses 12 y 24)

Mes 9 (Día 253) Mes 12 (Día 365)a Mes 15 (Día 449) Mes 18 (Día 533) Mes 21 (Día 617) Mes 24 (Día 729) Term temprana

Evaluaciones de la eficacia

Radiografías de manos y piesb

X X

RM de mano-muñeca con gadolinio (únicamente en emplazamientos europeos)

X X

Recuento de articulaciones con dolor por palpaciónc

X X X X X X X

Recuento de articulaciones hinchadas

X X X X X X X

Evaluación del dolor por el sujeto

X X X X X X X

Evaluación de la actividad de la enfermedad por el sujeto

X X X X X X X

Evaluación global por el doctor de la actividad de la enfermedad

X X X X X X X

E09743410

18-06-2015

Día de visita (se permiten +/-7 días para los meses 9, 15, 18, y 21; se permiten +/-30 días para los meses 12 y 24)

Mes 9 (Día 253) Mes 12 (Día 365)a Mes 15 (Día 449) Mes 18 (Día 533) Mes 21 (Día 617) Mes 24 (Día 729) Term temprana

Evaluación global por el sujeto de la función física (HAQ)

X X X X X X X

SF-36

X X X X X X X

Respuesta de los sujetos al tratamiento

X X X X X X X

Evaluaciones de la seguridad

Control de los eventos adversos

X X X X X X X

Examen físico parcial

X X X X X X X

Examen físico completo

Peso

X X

Signos vitales

X X X X X X X

Analítica

Hemograma

X X X X X X X

Bioquímica

X X X X X X X

Análisis de orina

X X

Prueba de embarazo en orina/suero (solo mujeres en edad fértil)

Xd X X X X X X

Detección de cáncer de mama

Anual/periódica (sólo mujeres)

X X X

CRP

X X X X X X X

RF de IgM

X X

Biomarcadores (IL-6, TNFα, IL-1 beta, MMP-3)

X X

Capacidad inmunógena

X X

Anticuerpos contra CCP2

X X

a Si el sujeto no se presenta en la clínica para la visita de los 12 meses, todas las evaluaciones necesarias para el mes 12 se realizarán en la siguiente visita clínica.b Si las radiografías se toman entre los meses 6 y 12 y el sujeto interrumpe el tratamiento, las radiografías deberían enviarse al lector central para evaluar la puntuación en el Sharp modificado por Genant. c Se realizará una evaluación de las articulaciones de recuento 68/66. d Debería realizarse una prueba de embarazo negativa en las 48 horas anteriores a la visita.

Evaluaciones de la seguridad

Todos los sujetos que reciban una dosis de fármaco del estudio serán evaluados en pruebas de seguridad y

5 capacidad inmunógena. Los criterios de valoración de la seguridad incluyen eventos adversos, cambios clínicamente significativos de los signos vitales, y anormalidades en las pruebas de laboratorio. El investigador determinará la gravedad de cada evento adverso como leve, moderada, grave, o muy grave. Los hallazgos del laboratorios que el investigador sienta que son clínicamente relevantes basándose en las Directrices del laboratorio deberían registrarse como eventos adversos. Además, el investigador determinará la relación entre el evento adverso y la administración

10 del fármaco del estudio.

Los exámenes físicos completo y/o parcial pueden ser realizados por un médico (MD), osteópata (DO), auxiliar (PA),

o enfermero (NP). Aunque el examen físico puede no ser tan exhaustivo como el examen completo inicial, los aspectos clave del examen parcial deberían evaluar sistemas corporales importantes según venga indicado

15 clínicamente. Estos sistemas corporales pueden incluir nódulos linfáticos, hígado, bazo y mama, según el criterio del examinador. Un examen físico parcial puede registrar cualesquiera cambios en el estado del sujeto (sistemas corporales) desde el último examen y no excluye el examen de ninguno de los sistemas corporales según esté clínicamente indicado.

20 Es necesaria una radiografía de tórax en la visita de selección si no se ha realizado ya en los seis meses anteriores a la obtención del Consentimiento informado escrito o si la documentación no está en el expediente.

Es necesario un electrocardiograma (ECG) de 12 derivaciones en la visita de selección si no se ha realizado ya en los seis meses anteriores a la obtención del Consentimiento informado escrito o si la documentación no está en el

25 expediente. El ECG se repetirá al final del periodo de tratamiento (Día 169) o 28 días después de la interrupción si el sujeto interrumpe el periodo de tratamiento pronto.

Para identificar a los sujetos con tuberculosis (TB) latente, es necesario realizar una prueba de PPD (prueba cutánea de derivado de proteína tuberculina purificada) si no se ha realizado ya en los seis meses anteriores a la obtención

30 del Consentimiento informado escrito o si la documentación no está en el expediente. Todos los sujetos que incluyen los que han sido vacunados anteriormente contra BCG deberían ser evaluados para determinar la TB latente.

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

Claims (1)

1. imagen1