ES2535981T3

ES2535981T3 - Producción de hidrógeno mediante la expresión heteróloga de una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II en Chlamydomonas

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Publication number: ES2535981T3
Application number: ES05809308.9T
Authority: ES
Inventors: Laetitia Bernard; Florence Mus; Carine Simon-Desplats; Stéphan CUINE; Laurent Cournac; Gilles Peltier
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2004-10-11
Filing date: 2005-10-11
Publication date: 2015-05-19
Anticipated expiration: 2025-10-11
Also published as: JP4885862B2; IL182386A0; AU2005293460A1; FR2876388B1; JP2008515418A; AU2005293460B2; WO2006040471A2; US7919292B2; EP1809754A2; CN101103117A; WO2006040471A3; PT1809754E; IL182386A; EP1809754B1; US20080199928A1; FR2876388A1; CN101103117B

Abstract

Procedimiento para incrementar la capacidad de un alga verde de producir hidrógeno, caracterizado porque comprende la transformación de dicha alga por un polinucleótido que codifica una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II (NDH-II), y la expresión de dicha NDH-II en dicha alga, en el que dicha NDH-II: - presenta al menos un ejemplar del motivo de consenso GxGxxG en que "G" representa una glicina y "x" representa un aminoácido cualquiera, - tiene la capacidad de catalizar la reducción de quinonas de las cadenas de transferencia de electrones mediante la oxidación de NADH o NDPH usando un cofactor flavínico, y - es, en su forma activa, un monómero de 30 a 60 kDa o un homodímero.

Description

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Se digirió el producto de amplificación con mfeI y PstI (New England Biolab, protocolo recomendado por el fabricante) y se introdujo por ligamiento (ligasa de New England Biolab, protocolo recomendado por el fabricante) en un vector de expresión digerido con EcoRI y PstI.

Este vector, pSD80, porta un módulo de resistencia a ampicilina, un promotor Taq fuerte y un gen represor Laq iQ (PATEL y DUNN, J. Bacteriol. 177: 3917-3922,1995; SMITH et al., Biochem. 35: 8805-8814, 1996).

Se introdujo a continuación el producto de ligamiento por electroporación en dH10ß de E. coli.

Se cribaron a continuación los transformantes resistentes a ampicilina por PCR usando los mismos cebadores y las mismas condiciones que se indican anteriormente, con el fin de verificar la presencia del gen Agtundh2.

Se verificó a continuación la construcción mediante secuenciación usando cebadores específicos del vector pSD80, así como cebadores internos del gen Agtundh2.

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Después de verificar que la secuencia y la inserción eran correctas, se nombró este plásmido pSDN2Ag6H y sirvió para contransformar por electroporación la cepa dH10ß de E. coli con un vector (pRare, Novagen) portador de los 6 ARNt más raros de E. coli.

Se eligió un de los cotransformantes resistentes a ampicilina y cloranfenicol para la expresión y purificación de la proteína NDH-II 6His.

2-Expresión

Se inoculó un cultivo de medio LB (Luria Berthani), en presencia de ampicilina y cloranfenicol, de un volumen de 1 l en un matraz Erlenmeyer de 2,5 l a 1/50 a partir de un precultivo de 15 h, y se incubó a 37 ºC con agitación hasta una densidad óptica de 0,5.

Se indujo la expresión de NDH-II 6His durante 2 h con isopropiltio-ß-D-galactósido 0,5 mM (IPTG).

Se recogieron a continuación las células por centrifugación, se aclararon con medio de cultivo nuevo y se conservaron a -80 ºC.

3-Purificación

Se publicó el protocolo de purificación por BJÖRKLÖF et al. (FEBS Letts., 467: 105-110, 2000).

Se descongelaron las células y se resuspendieron en EDTA 2,5 mM, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 0,2 mM, Tris-Cl 200 mM, pH 8 a una concentración de aproximadamente 1 g por 10 ml. Se añadieron 300 µg/ml de lisozima y se incubó la mezcla durante 1 h en hielo.

Se centrifugó a continuación la suspensión durante 60 min a 120.000 x g. Se sometió el sedimento a un choque osmótico por resuspensión en un tampón de fosfato de potasio 10 mM, pH 8, que contenía EDTA 2 mM, PMSF 0,2 mM, se homogeneizó con la ayuda de un Potter y después se volvió a centrifugar (60 min, 120.000 x g).

Se retomó la fracción de membrana en el tampón precedente y se homogeneizó con un Potter. Se solubilizaron a continuación las membranas mediante la adición de dodecilmaltósido (DM) a una concentración final del 0,2 % (peso/vol) y una relación de detergente/proteína de 0,1 y de NaCl 500 mM de concentración final. Se agita la suspensión, se incuba en hielo durante 30 min y después se centrifuga (60 min, 120.000 x g).

Se realizó la purificación de la enzima por cromatografía de afinidad de presión media en columna de níquel (columna quelante HiTrap de 5 ml, Amersham Biosciences, Uppsala) a 4 ºC mediante un sistema de cromatografía (Åktå FPLC, Amersham Biosciences, Uppsala). Se preequilibró en primer lugar la columna con tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 500 mM, 0,2 % de DM e imidazol 20 mM. Después de depositar la muestra, se aclaró la columna con la solución precedente sin imidazol (solución A) para eliminar todas las proteínas no fijadas. Se eluyó por último la columna con una concentración creciente de una solución que contenía imidazol 250 mM (solución B). Se recogieron fracciones de 5 ml a diferentes proporciones de solución concentrada de imidazol (10 %, 15 %, 50 %, 100 %).

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inhibición del difenilenyodonio (DPI) después de 10 min de incubación en hielo en presencia de la mezcla de enzima-membranas. Se realizaron las cinéticas de inhibición en presencia de NADH 200 µM o NADPH 2 mM.

La actividad máxima de la NDH-II de Agrobacterium (Vmáx = 5 µmol de O2·min-1·mg de proteína-1) está comprendida en el orden de magnitud de otras NDH-II descritas en la bibliografía. Al pH fisiológico, esta enzima tiene una fuerte afinidad por NADH (Km =10 µM) (Figura 6A), pero igualmente una afinidad no despreciable por NADPH (Km = 50 µM) (Figura 6B), lo que es raro para una enzima bacteriana. Esta característica es interesante para hacer funcionar esta enzima en el cloroplasto, pues este compartimento celular contiene NADPH en abundancia. La enzima se ve muy afectada por los inhibidores clásicos de NDH-II, y especialmente por DPI con una I50 de 10 µM (Figura 6C).

EJEMPLO 2: PUESTA DE MANIFIESTO DE LA REDUCCIÓN DE PLASTOQUINONAS DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII POR LA NDH-II DE AGROBACTERIUM

Se analizó la actividad de reducción de plastoquinonas por la NDH-II de Agrobacterium midiendo la fluorescencia de la clorofila. En presencia de un destello débil no actínico, la medida de la fluorescencia de la clorofila proporciona una indicación del estado rédox de las plastoquinonas.

I-Preparación de membranas de tilacoides

Se extrajo un cultivo de 200 ml de Chlamydomonas reinhardtii (de tipo silvestre 137c) en fase exponencial de crecimiento (aproximadamente 5x106 células·ml-1) y después se centrifugó (5 min, 1000 x g). Se lavaron las células con tampón HEPES-NaOH 35 mM (pH 7,2), se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis (tricina-NaOH 50 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl2 5 mM, 1 % de BSA, benzamidina 1 mM y PMSF 1 mM) y se conservaron en frío y en la oscuridad para las etapas siguientes.

Se pasó la suspensión dos veces a través de una prensa de French a 13,8 MPa. Se centrifugó en primer lugar el lisado (5 min, 4 ºC, 500 x g) para eliminar las células no lisadas, se sedimentaron a continuación las membranas de tilacoides a 10.000 x g durante 10 min y se resuspendieron en 250 a 500 µl de tampón de análisis (tricina-NaOH 50 mM, pH 7,2, NaCl 10 mM y MgCl2 5 mM).

II-Reducción de plastoquinonas

Se midió la fluorescencia del fotosistema II gracias a un fluorímetro de luz modulada (PAM 101-103, Walz, Effeltrich, Alemania).

Se usó una luz modulada no actínica (650 nm, 1,6 kHz) para determinar el nivel de fluorescencia clorofílica F0. Se midió el nivel máximo de fluorescencia clorofílica Fm bajo un destello saturante de 1 segundo (aproximadamente 1000 µmol de fotones·m-2·s-1). Con el fin de evitar la reoxidación de las plastoquinonas, se realizaron los experimentos en condiciones anaeróbicas mediante la adición a la mezcla de reacción de glucosa (20 mM), glucosa oxidasa (2 mg·ml-1) y catalasa (1000 unidades·ml-1). Se incubaron las membranas de tilacoides con o sin NDH-II (1,5 µg·ml-1 de concentración final) durante 10 min en hielo y se comparó la tasa de reducción de plastoquinonas antes y después de la adición de NADH 200 µM. Se presentan los resultados en la Figura 7 (NDH2Ag = presencia de la NDH-II de Agrobacterium; control = presencia de la enzima nativa sola; DPI = efecto de inhibición del DPI).

La Figura 7 muestra que la fluorescencia de la clorofila medida en membranas de tilacoides de Chlamydomonas aumenta después de la adición de NADH. Este aumento corresponde a la reducción no fotoquímica de las PQ por la enzima nativa del alga. Sin embargo, en presencia de la NDH-II de Agrobacterium purificada (NHD2Ag), el aumento de la fluorescencia es más rápido y más intenso. La reducción de plastoquinonas es por tanto superior a la efectuada por la enzima nativa sola (control). Esta es la demostración de la capacidad de la NDH-II de Agrobacterium de interaccionar con la cadena fotosintética de transporte de electrones.

Con el fin de cuantificar este efecto de la NDH-II de Agrobacterium sobre el flujo de electrones desde NAD(P)H hasta los aceptores del PSI, se realizaron medidas de consumo de oxígeno en presencia de metilviológeno (un aceptor del PSI) de DCMU (un inhibidor del PSII) o de un donante de electrones NADH (200 µM) o NADPH (2 mM).

Los tilacoides de Chlamydomonas (50 µl, correspondientes a 85 µg·ml-1 de clorofila) se disponen en un electrodo de Clark que contiene 900 µl de tampón de análisis (tricina-NaOH 50 mM, pH 7,2, NaCl 10 mM y MgCl2 5 mM, DCMU 25 µM, metilviológeno 50 µM, SOD (500 U·ml-1), catalasa (1000 U·ml-1), mixotiazol 4 µM, SHAM (ácido salicilhidroxámico) 800 µM. Estos dos últimos compuestos se añaden con el fin de inhibir la captación de O2 respiratorio.

En estas condiciones, la fracción de captación de oxígeno fotoinducida sensible a DNP-INT (2-yodo-6-isopropil-3metil-2’,4,4’-trinitrodifeniléter; 10 µM), inhibidor del citocromo b6f, es proporcional a la transferencia de electrones entre NAD(P)H y la cadena fotosintética.

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La adición de 1,5 µg de NDH-II de Agrobacterium tumefaciens purificada estimula esta transferencia de electrones de 20 a 45 nmol·min-1·mg-1 de clorofila cuando se usa NADPH como donante, y de 21 a 67 nmol·min1·mg-1 de clorofila cuando se usa NADH como donante.

Este experimento permite por tanto cuantificar la estimulación de la transferencia de electrones entre NADPH (o NADH) y las plastoquinonas de tilacoides mediante la adición de la NDH-II de Agrobacterium tumefaciens. La estimulación es de un factor de aproximadamente 2 en el caso de NADPH y de un factor de aproximadamente 3 en el caso de NADH.

Estos resultados in vitro permiten suponer que una expresión heteróloga de una NDH-II en Chlamydomonas reinhardtii (y más genéricamente en cualquier alga susceptible de producir hidrógeno), sea cloroplástica o nuclear con orientación hacia el cloroplasto, puede aumentar la actividad plastoquinona reductasa intracloroplástica y la producción de H2 asociada.

EJEMPLO 3: TRANSFORMACIÓN DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII POR LA SECUENCIA QUE CODIFICA LA NDH-II DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

I-Construcción del plásmido pSADN2Ag

Se amplificó el gen Agtundh2 por PCR a partir del genoma de A. tumefaciens (cepa C58) usando los cebadores siguientes:

ndhAgTu.F

(Tm 66,5 ºC) y ndhAgTu.R

(Tm 69,5 ºC) y en las condiciones siguientes:

-Mezcla de reacción:

Tampón de reacción específico que contiene MgCl2 1,5 mM Cebadores 0,5 µM final Mezclas de dNTP 200 µM final 300 ng de ADN 1,5 unidades de polimerasa Taq Expand High Fidelity (Roche)

-Condiciones de amplificación:

3 mina95 ºC + 1 min a80ºC: 1 ciclo

1 min a95ºC + 1 min a60ºC + 2 min a72ºC: 30 ciclos

6 minutos a 72 ºC: 1 ciclo.

El producto de amplificación se digirió con SmaI/mfeI.

Se digirió el plásmido pGEND2 (FISHER y ROCHAIX, Mol. Genet. Genomics 265: 888-894, 2001) con NaeI/EcoRI, para escindir la secuencia que codifica la proteína PsaD, con excepción del péptido de orientación cloroplástica. Se reemplazó el fragmento escindido por el fragmento SmaI/mfeI obtenido a partir del producto de amplificación del gen N2Ag.

El plásmido resultante, denominado pSADN2Ag, contiene por tanto la secuencia que codifica la NDH-II de Agrobacterium tumefaciens bajo el control del promotor del gen psaD, y en fusión traduccional con el péptido de orientación cloroplástica de la proteína PsaD.

II-Transformación de Chlamydomonas reinhardtii

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Los transformantes que han integrado el gen de la NDH-II presentan una banda de aproximadamente 1,2 kb observada igualmente en el control positivo. La proporción de cotransformantes (= que hayan integrado los dos plásmidos) es de aproximadamente un 50 %.

III-Expresión de la NDH-II:

Se verificó la expresión del gen de la NDH-II de Agrobacterium por PCR-TI en 6 cotransformantes. Se extraen los ARN totales a partir de 25 ml de cultivo en fase exponencial con el kit RNeasy®, según las indicaciones del fabricante (Qiagen). Se preparan los ADNc con la ayuda del kit Omniscript®, según el protocolo recomendado por el fabricante (Qiagen) ajustando el volumen de los diferentes ARN para obtener 2 µg en cada reacción.

Se efectúa la PCR usando los cebadores ndhAgTu.F y ndhAgTu.R, y en las condiciones siguientes:

-Mezcla de reacción:

Tampón de reacción específico que contiene MgCl2 1,5 mM

Cebadores 0,5 µM final

Mezclas de dNTP 200 µM final

300 ng de ADNc

1,5 unidades de polimerasa Taq Expand High Fidelity (Roche)

-Condiciones de amplificación:

3 min a 95ºC + 1 min a80ºC: 1 ciclo

1 min a95ºC + 1 min a60ºC + 2 min a72ºC: 30 ciclos

6 minutos a 72 ºC: 1 ciclo.

Se realizó un control negativo para verificar que los amplicones observados no provienen de una amplificación del ADN nuclear persistente después de la etapa de digestión incluida en el protocolo de extracción de ARN. Para este control, se reemplazan los 300 ng de ADN obtenidos después de la etapa de transcriptasa inversa por 5 µl de solución del ARN precedente a esta etapa.

Para controlar la eficacia del protocolo de extracción, así como el nivel de expresión de la NDH-II, se amplificó en paralelo el ADNc de actina 1, que es una proteína expresada constitutivamente y en alta cantidad.

Se analizaron los productos de amplificación por migración en un gel de agarosa al 1 % y se visualizaron después de marcar el gel con bromuro de etidio (Figura 9). Se depositó en paralelo sobre el gel un marcador de peso molecular con el fin de estimar el tamaño de los productos de amplificación obtenidos.

Los cotransformantes que expresan el gen de la NDH-II presentan una banda de aproximadamente 1,2 kb correspondiente al tamaño del inserto. El control negativo no presenta ninguna banda, lo que significa que las preparaciones de ARN no estaban contaminadas con ADN genómico, mientras que sí presenta un producto de amplificación por actina. Todos los cotransformantes ensayados expresan el gen de la NDH-II a niveles diferentes, pero del mismo orden de magnitud que el de la actina.

EJEMPLO 4: COMPLEMENTACIÓN FUNCIONAL DE UNA CEPA DE E. COLI DEFICIENTE EN NDH

I – Ensayo de complementación del crecimiento

Se ensayó la funcionalidad de la proteína Agtundh2 in vivo en un hospedador heterólogo determinando su capacidad de restaurar el crecimiento de una cepa mutante de E. coli, ANN.0222, deficente en NDH-1 y NDH-2. Esta cepa crece normalmente en medio LB, pero es incapaz de crecer en medio M9 mínimo suplementado con manitol como única fuente de carbono.

Se transformó químicamente la cepa ANN.0222 de E. coli (CaCl2) con el plásmido pSDN2Ag6H. Se seleccionaron los transformantes en medio LB de agar (suplementado con 1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura y 0,5 % de NaCl, pH 7) que contenía ampicilina (100 µg/ml). Se cultivaron los transformantes y la cepa de origen hasta el medio de fase exponencial a 37 ºC en medio LB líquido que contenía ampicilina (100 µg/l). Se aclararon las células con medio M9 estéril suplementado con manitol como única fuente de carbono (1X sales M9, MgSO4 2x10-3 M, CaCl2 10-4 M, 0,4 % de manitol). Se diluyeron a continuación las células en medio M9/manitol y se inocularon sobre un medio sólido M9/manitol/agar que contenía ampicilina y diferentes concentraciones de IPTG. Se incubaron las placas Petri a 37 ºC durante 2 días. Como control, se inocularon las mismas células en paralelo en placas que contenían medio LB de agar que contenía ampicilina y diversas concentraciones de IPTG, y se incubaron después a 37 ºC durante una noche.

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Se ilustran los resultados por la Figura 10A, que representa la formación de colonias sobre medio rico (LB) y sobre medio mínimo suplementado con manitol (M9+manitol) para la cepa ANN0222 y el transformante que expresa Agtundh2 (señalado como AtuNdh2 en la Figura). Se indican las concentraciones de IPTG por encima de cada carril correspondiente.

El crecimiento de las cepas mutantes no transformadas está considerablemente limitado sobre medio mínimo, en ausencia o en presencia de IPTG (0,1 mM). En contraposición, se restauró el crecimiento sobre medio mínimo de la cepa que expresa Agtundh2 después de inducción por IPTG 0,1 mM. Se observó una complementación parcial del mutante incluso en ausencia de IPTG, lo que sugiere un cierto nivel de expresión de la proteína independiente de IPTG.

II – Actividad de NADH deshidrogenasa de membrana

Se prepararon dos lotes de fracciones de membrana de ANN.0222 de E. coli a partir de un cultivo de la cepa de muestra sobre medio LB y de un cultivo de la cepa que ha incorporado el plásmido pSDN2Ag6H cultivada sobre medio LB en presencia de IPTG 0,1 mM. Se llevaron los cultivos hasta una densidad óptica de 1 a 600 nm. Se recogieron las células por centrifugación (15 min, 3200 x g), se aclararon dos veces y se resuspendieron en 10 ml de tampón A (Tris-Cl 200 mM, pH 8, EDTA 2,5 mM y PMSF 0,2 mM; (30)). Se disgregaron a continuación las células mediante dos pasadas a través de una prensa de French a 110 MPa. Se retomó la fracción de membrana, recogida por centrifugación (30 min, 4 ºC, 48500 x g), en 200 µl de tampón B (tampón fosfato 50 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM). Se midió la captación de O2 con la ayuda de un electrodo de Clark (DW2/2, Hansatech, King’s Lynn, Inglaterra) en dos alícuotas de 2 µl de estas fracciones de membrana, diluidas en 1 ml de tampón A a 25 ºC y en presencia de NADH.

Se ilustran los resultados por la Figura 10B, que representa la captación de O2 en presencia de NADH de membranas de ANN0222 de E. coli preparadas a partir de la cepa de referencia (control) y de la cepa que expresa Agtundh2.

Mientras que no se ha detectado ninguna actividad de captación de O2 en las membranas de la cepa de control en respuesta a la adición de NADH, se ha detectado en cambio una captación de O2 elevada en las mismas condiciones en membranas de la cepa transformada con pSDN2Ag6H. (Fig. 10B). Expresada en las membranas de E. coli, Agtundh2 es capaz de oxidar NADH y NADPH con velocidades máximas del mismo orden, pero con una afinidad mucho más fuerte por NADH.

III – Expresión de proteína

Se confirmó por inmunodetección la expresión de proteína Agtundh2 en la cepa ANN.0222 transformada.

Se produjo un suero de conejo contra proteína Agtundh2 purificada (Agro-Bio, Villeny, Francia). Se extrajeron las fracciones proteicas soluble y de membrana como se indica anteriormente. Se cargaron estas fracciones proteicas, así como las alícuotas de la proteína Agtundh2 purificada, sobre gel PAGE-SDS al 10 %, se sometieron a una electroforesis y se transfirieron después a membranas de nitrocelulosa. Se incubaron a continuación las membranas de nitrocelulosa durante 30 minutos en leche (3 % de leche descremada en polvo en agua con adición de 0,1 % de TBST) y se aclararon después con TBST al 0,1 % de nuevo durante 1h y 30 min con el anticuerpo anti-Agtundh2 diluido 1/10000. Se aclararon a continuación las membranas tres veces durante 10 minutos con TBST al 0,1% y se incubaron después durante 1 h con un anticuerpo secundario anticonejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/10000. Se realizó la reacción de detección siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante (Sigma).

Se ilustran los resultados por la Figura 11: Panel de la izquierda: inmunodetección en las fracciones proteicas soluble (S) y de membrana (Mb) de la cepa ANN0222 de E. coli, transformada con el vector pSD80 "vacío” o con la construcción portadora de Agtundh2, y expuesta a IPTG 0, 0,1 o 0,5 mM. La carga del gel correspondía al final a una dilución de 1/400 de las fracciones soluble y de membrana de 50 ml de cultivo recogidos a DO600= 1 (o sea 2,5 µg de proteínas sobre los carriles correspondientes a las fracciones de membrana y 30 µg de proteínas sobre los correspondientes a las fracciones solubles). Panel de la derecha: inmunodetección de Agtundh2 purificada a 0,1, 0,2 y 0,3 µg/carril de izquierda a derecha.

Se encontró la mayor parte de la proteína en las fracciones de membrana, detectándose una proporción menor en las proteínas solubles. Se detectó una expresión significativa de Agtundh2 incluso en ausencia de IPTG, lo que está de acuerdo con la complementación parcial observada en estas condiciones (véase la Fig. 10A).

Para determinar la eficacia catalítica de Agtundh2 expresada en E. coli, se estimó la actividad específica a partir de las cantidades determinadas por transferencia Western.

Basándose en las intensidades relativas de las señales obtenidas para la proteína Agtundh2 purificada y para las fracciones de membrana, se estimó la cantidad de proteína Agtundh2 en los experimentos ilustrados por la Fig. 10B en 0,6 µg de proteína. Las captaciones de O2 máximas en estas condiciones se estiman así en 13,2/0,6= 22 nmol de O2·min-1. µg de proteína-1, o sea 44 nmol de NADH min-1·µg de proteína-1 .

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-Mezcla de reacción:

Tampón de reacción específico 1X MgSO4 1,5 µM final Cebadores 0,5 µM final Mezcla de dNTP 200 µM final 200 ng de ADN 1 unidad de Pfx platinum (Invitrogen)

-Condiciones de amplificación:

2 min a 94 ºC: 1 ciclo

30 sa94ºC +1 min a55ºC + 3 min a68ºC: 25 ciclos

10 min a 68 ºC: 1 ciclo.

Los dos fragmentos de amplificación encierran la mutación de interés introducida gracias a los cebadores N2Ag.E201 Q.F y N2Ag.E201 Q.R.

Se realiza la segunda etapa de amplificación mezclando los dos fragmentos de amplificación obtenidos en la etapa precedente. Estos dos fragmentos van a hibridar gracias a su secuencia común (TTGCTTGTGCAGGCCGGCCCT) (SEQ ID NO: 17) y van a constituir así la matriz. Se realiza la amplificación usando los dos cebadores N2Ag.NcoI y N2Ag.XbaI, en las condiciones siguientes:

-Mezcla de reacción:

Tampón de reacción específico 1X MgSO4 1,5 µM final Cebadores 0,5 µM final Mezcla de dNTP 200 µM final 200 ng de fragmento N2Ag.NcoI/N2Ag.E201Q.R 200 ng de fragmento N2Ag.XbaI/N2Ag.E201Q.F 1 unidad de Pfx platinum (Invitrogen)

-Condiciones de amplificación:

2 min a 94 ºC: 1 ciclo 30 sa 94ºC +1 min a55ºC + 6 min a68ºC: 30 ciclos 10 min a 68 ºC: 1 ciclo.

III – Clonación de las construcciones

Se digirió el producto de amplificación con Ncol y XbaI (New England Biolabs, protocolo recomendado por el suministrador) y se introdujo por ligamiento (ADN ligasa T4 de New England Biolabs, protocolo recomendado por el suministrador) en el vector pBAD24 digerido con NcoI y XbaI. Este vector porta un módulo de resistencia a ampicilina, un promotor de tipo pBAD inducible por arabinosa. Se introdujeron a continuación los productos de amplificación por electroporación en dh10 de E. coli. Se seleccionaron los transformantes resistentes a ampicilina y se verificó la presencia del inserto mediante extracción del ADN plasmídico y digestión con NcoI e HindIII.

Se verificaron a continuación las dos construcciones por secuenciación usando cebadores internos del gen Agtundh2 (N2Ag.E201Q.F; N2Ag.NcoI; N2Ag.E201 Q.R; N2Ag.XbaI).

La secuenciación mostró que se había introducido la mutación deseada (E201 Q). El plásmido se nombró E201Qc1.

IV – Actividad de la proteína modificada

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Se determinó la afinidad de la proteína purificada por NADH y NADPH.

Se ilustran los resultados por la Figura 12. Mientras que la proteína de tipo silvestre (A) presenta una actividad netamente superior a NADH 2001 µM con relación a la registrada de NADPH 200 µM, la proteína modificada (B) presenta una afinidad comparable por los dos sustratos.

EJEMPLO 6: IDENTIFICACIÓN DE UNA NDH2 DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII DE LOCALIZACIÓN CLOROPLÁSTICA

I – Amplificación del gen

Se aisló el ARN total de cultivos de C. reinhardtii sobre medio TAP (extraídas entre 1x106 y 1x107 células/ml), usando el kit QIAGEN RNeasy® Plant Mini, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó la síntesis de ADNc usando el sistema de transcriptasa inversa Omniscript™ (QIAGEN) con un cebador oligo-dT. Se amplificaron los productos de reacción por PCR con la polimerasa turbo pfu (Stratagene) en un termociclador OmniGene Hybrid.

-Condiciones de amplificación del ADNc:

Desnaturalización a 94 ºC: 5 min 30 s a94ºC, 40 s a 72ºC y2 min a 72 ºC: 5 ciclos 30 s a94ºC, 40 s a 68ºC y2 min a 72 ºC: 5 ciclos 30 s a94ºC, 40 s a 65ºC y2 min a 72 ºC: 5 ciclos 30 s a94ºC, 40 s a 62ºC y2 min a 72 ºC: 15 ciclos Extensión a 72 ºC: 5 min. Los cebadores utilizables para la amplificación de N2Cr2 son:

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Estos dos cebadores han permitido amplificar un ADNc (1662 pb) por PCR-TI. La nueva secuencia así identificada se bautizó como N2Cr2. El ADNc correspondiente a N2Cr2 codifica un polipéptido de 533 aminoácidos con una masa predicha de 60,5 kDa.

Comparando la secuencia de este ADNc con las secuencias genómicas disponibles de C. reinhardtii, se advirtió que corresponde de hecho a una proteína truncada de 65 aminoácidos en su extremo N-terminal.

Se representa la secuencia completa de ADNc de N2Cr2 en la lista de secuencias del anexo con el número SEQ ID NO: 3, y la secuencia polipeptídica deducida con el número SEQ ID NO: 4. El ADNc clonado corresponde a los nucleótidos 196-1857 de la secuencia SEQ ID NO: 3, y codifica un polipéptido correspondiente a los aminoácidos 67-619 de la secuencia SEQ ID NO: 4.

La proteína codificada por la secuencia de ADNc de 1662 pb clonada, aunque truncada en su extremo Nterminal, codifica una proteína que presenta eficazmente una actividad de NADH deshidrogenasa y que ha permitido generar un anticuerpo que reconoce la proteína N2Cr2 en Chlamydomonas, como se ilustra a continuación.

II – Clonación del gen en pSD80

Se amplificó la región codificante de N2Cr2 de la secuencia de ADNc de 1662 pb por PCR usando los cebadores correspondientes a las partes N-y C-terminales de la secuencia extendidas por bases adicionales que confieren los sitios de restricción EcoRI, SmaI y una secuencia codificante de 6-histidina. Se insertaron los sitios EcoRI y SmaI (subrayados) en los cebadores de codificación (F) e inverso (R), respectivamente en 5’ y 3’ de los codones de inicio y terminación. Se insertó la secuencia codificante de 6-histidina (en cursiva) en el cebador F en 3’ del codón de inicio de la región codificante de N2Cr2. Las secuencias de los oligonucleótidos son por tanto:

*F-EcoRI:

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y *R-SmaI:

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Para ello, se centrifugan 600 ml de un cultivo de Cw15 en medio de fase exponencial de crecimiento a 500 g durante 5 min a 4 ºC. Se lava el sedimento una vez con 50 ml de HEPES 35 mM a pH= 7,2 y se vuelve a centrifugar durante 5 min a 500 g a 4 ºC. Se retoma el sedimento en 12,5 ml de tampón A (sorbitol 0,3 M, HEPES 50 mM, pH 8,2, EDTA 2 mM, MgCl2 5 mM) y se introduce en la prensa de Yeda durante 3 min a 450 kPa. Se deposita el material por encima de un gradiente de Percoll (40-60 %) y se centrifuga durante 20 min a 4000 g. Se recoge el anillo correspondiente a los cloroplastos intactos y se diluye a 10 veces su volumen con tampón A. Se centrifuga la muestra durante 15 min a 3220 g, se retoma el sedimento con 3,5 ml de SDS al 0,2 % y después se precipita con acetona al 80 %.

Se dosifica la muestra según el procedimiento de ácido bicinconínico.

VI – Transferencia Western:

Se preparan 100 µg de cada fracción centrifugando el volumen adecuado durante 10 min a 10.000 rpm y resuspendiendo el sedimento en tampón de carga 1X. Se cargan 5 µl (o sea 5 µg) de cada fracción sobre un gel de PAGE-SDS al 10 %. Como control, se cargan igualmente aproximadamente 0,1 µg de proteína purificada sobre el gel. Después de la migración, se transfieren las proteínas (transferencia semiseca) sobre una membrana de nitrocelulosa (Life sciences, BioTrace NT).

Se marcan a continuación las proteínas por inmunotransferencia usando como anticuerpo primario el anticuerpo obtenido contra la proteína recombinante (AGRO-BIO). La incubación dura 1 hora a temperatura ambiente. Se añade después el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo) acoplado con un fluorocromo durante 1 hora. Se realiza la detección usando el escáner infrarrojo Odyssey de la compañía LICOR.

Se ilustran los resultados por la Figura 13.

Se localiza en la fracción tilacoide la banda que reacciona de manera más intensa. Es de tamaño ligeramente mayor que la N2Cr2 recombinante producida. Esta diferencia de tamaño es probablemente debida al hecho de que la proteína recombinante esta truncada en el extremo N con relación a la secuencia predicha de proteína madura en Chlamydomonas.

EJEMPLO 7: CLONACIÓN DE AGTUNDH2 EN EL PLÁSMIDO PXX6 PARA TRANSFORMACIÓN EN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

I – Construcción del fragmento para clonar:

Con el fin de poder expresar la proteína Agtundh2 en Chlamydomonas reinhardtii, se creó un producto de fusión entre el gen rbcS2 de Chlamydomonas reinhardtii y el gen Agtundh2 de Agrobacterium tumefasciens. Para ello, se dispuso la secuencia del péptido de tránsito de rbcS2 en 5’ del codón de inicio de Agtundh2 y se dispuso la secuencia de la región 3’ UTR de rbcS2 en 3’ del codón de terminación de Agtundh2, usando la técnica de PCR de fusión.

Amplificación del péptido de tránsito de rbcS2

En un primer momento, se amplificó el péptido de tránsito de rbcS2 a partir de ADN genómico de Chlamydomonas reinhardtii usando el par de cebadores siguientes:

*N2Ag.XhoI :

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Se introdujo el sitio de restricción de la enzima XhoI (en cursiva) en 5’ del codón de inicio (en negrita) del gen

rbcS2.

*TP.ndh.R :

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Se indica la región correspondiente a la secuencia del péptido de tránsito de rbcS2 en cursiva, y aquella correspondiente a la extensión de Agtundh2 en caracteres normales. -MEZCLA DE REACCIÓN: Tampón de reacción específico 1X MgSO4 1,5 µM final

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MgSO4 1,5 µM final Cebadores 0,5 µM final Mezcla de dNTP 200 µM final 200 ng de fragmento de péptido de tránsito + gen Agtundh2

5 200 ng de fragmento 3’ UTR de rbcS2 1 unidad de Pfx platinum (Invitrogen)

-Condiciones de amplificación:

2 min a 94 ºC: 1 ciclo 30 sa94ºC +1 min a55ºC + 6 min a68ºC: 30 ciclos 10 10 min a 68 ºC: 1 ciclo.

II – Clonación del fragmento de fusión en el plásmido pXX6:

Se digirió el producto de fusión con XhoI y KpnI (New England Biolabs, protocolo recomendado por el suministrador) y se introdujo por ligamiento (ADN ligasa T4 de New England Biolabs, protocolo recomendado por el suministrador) en el plásmido pXX6 previamente digerido con XhoI y KpnI.

15 El plásmido pXX6 se describe por (FUHRMANN M et al., Plant Mol. Biol., 55, 6, 869-881, 2004). Porta un módulo de resistencia a ampicilina, una región del promotor fuerte Hsp de Chlamydomonas reinhardtii que optimiza la transcripción, el gen dispuesto en 3’, el promotor constitutivo del gen rbcS2 de Chlamydomonas reinhardtii y el primer intrón del gen rbcS2 de Chlamydomonas reinhardtii.

Se introdujo a continuación el producto de ligamiento por electroporación en dh10 de E. coli.

20 Se seleccionaron los transformantes resistentes a ampicilina y se verificó la presencia del inserto por extracción del ADN plasmídico y digestión con las enzimas XhoI y KpnI.

Se verificó a continuación la construcción por secuenciación usando los cebadores siguientes: N2Ag.XhoI; N2Ag.KpnI; TP.ndh.R; TP.ndh.F; rbcS2.3’.F.

Después de verificar que la secuencia y la inserción eran correctas, se usa este plásmido, denominado

25 pXX6N2Ag, para cotransformar mediante la técnica de perlas de vidrio la cepa CW15 de Chlamydomonas con el plásmido aphVIII portador de resistencia a paromomicina y la cepa 388 (auxótrofa de arginina) de Chlamydomonas con el plásmido pArg portador del gen Arg7 codificante de arginosuccinato liasa.

Claims

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