ES2477499T3 - Métodos para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o subespecie - Google Patents

Métodos para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o subespecie Download PDF

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Abstract

Un método para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica, a nivel de especie y/o de subespecie, usando el análisis de MALDI-TOF-MS que comprende una etapa de clasificación del germen en un grupo antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, en el que dicho análisis de MALDI-TOF-MS comprende la etapa de comparar el perfil de espectros de la cepa que se va a identificar con una base de datos de referencia que contiene los espectros de MALDI-TOF-MS característicos de las cepas representativas de la genoespecie del grupo de gérmenes al que pertenece dicha cepa que se va a identificar, conteniendo dicha base de datos, para cada cepa representativa, los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0,05, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos

Description

Métodos para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o subespecie
Descripción
La invención se refiere a un método para la identificación precisa y rápida a nivel de especie y/o a nivel de subespecie de un aislado clínico usando espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz con un analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS).
MALDI-TOF-MS es una técnica usada para examinar el perfil de proteínas detectado directamente de la superficie celular bacteriana intacta.
Se trata de un método de ionización suave basado en masas moleculares relativas que permiten la desorción de péptidos y proteínas de diferentes microorganismos enteros cultivados. Los iones se separan y se detectan de acuerdo con su masa molecular y su carga. Las especies se identifican por su masa: relación de carga (m/z). Este enfoque produce un espectro reproducible en minutos que consiste en una serie de picos de 500 a 20.000 m/z. Cada pico corresponde a un fragmento molecular liberado de la superficie celular durante la desorción por láser.
MALDI-TOF-MS ya se ha usado para la caracterización de las bacterias. Sin embargo, entre los diversos componentes identificados en un espectro, solo unos cuantos están presentes en una gran población de gérmenes de una genoespecie dada, bien siendo el resto aislados de manera específica o variables en base a las condiciones de crecimiento (medios, temperatura de incubación, etc.), y no se pueden usar para identificar la especie o subespecie de una bacteria y, más en general, de un germen.
La falta de una estrategia global para identificar esos picos de los espectros que pueden servir para distinguir diversas genoespecies ha dificultado el uso de MALDI-TOF-MS en los laboratorios de microbiología clínica habituales para el diagnóstico de genoespecies. De hecho, estos picos tienen que corresponder a componentes que estén presentes en la mayoría de los aislados de una genoespecie dada y que estén presentes en gran cantidad en la pared celular. Teniendo en cuenta la posible variabilidad en una genoespecie, es probable que la característica de una genoespecie no se base en la presencia de un solo pico, sino más bien en la presencia de un conjunto de picos que estén más o menos conservados entre la genoespecie.
Los antecedentes relevantes de la técnica están representados por los documentos DE 10 2005 002672 A1; US 2002/192676 A1; Dare D., en: ADV TECHNIQUES IN DIAGNOSTIC MICROBIOL, 2006, 117-133; Du Z et al., ANAL CHEM, 74(21), 2002, 5487-5491; Walker J et al., J MICROBIOL METHODS, 48(2-3), 2002, 117-126; Smole S. C. et al., J MICROBIOL METHODS, 48(2-3), 2002, 107-115; Keys C. J. et al., INFECTION GENETICS & EVOL, 4(3), 2004, 221-242; WO 98/09314 A; US-B1-7 020 559; US-B1-6 177 266; WO 01/92872 A; Coales M. C. et al., ABSTR GENERAL MEETING AM SOC MICROBIOL, vol. 102, 2002, página 103, C -25; Nagai R. et al., J BONE JOINT SURG BR PROCEEDINGS, vol. 88 - B, 2006, página 238; y Nielsen P. B. et al., CLIN MICROBIOL INFECT, 11 (supl. 2), 2005, página 210, P723.
Los inventores han encontrado que dichos problemas se podrían resolver (i) mediante la realización de un análisis fenotípico del germen que se vaya a identificar antes del análisis de MALDI-TOF-MS, y (ii) mediante la realización del análisis de MALDI-TOF-MS en condiciones específicas relativas particularmente a la selección de la solución de la matriz y las bases de datos de referencia.
Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar un nuevo método basado en el análisis de MALDI-TOF-MS para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica a nivel de especie y/o de subespecie.
Es un objeto de la invención proporcionar bases de datos establecidas a partir de un conjunto de cepas con respecto a un germen dado.
Así pues, la invención se refiere a un método para la identificación, a nivel de especie y/o de subespecie, de una cepa aislada de una muestra clínica usando el análisis de MALDI-TOF-MS que comprende una etapa de clasificación de la cepa en un grupo antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, en el que dicho análisis de MALDI-TOF-MS comprende la etapa de comparar el perfil de espectros de la cepa que se va a identificar con una base de datos de referencia que contiene los espectros de MALDI-TOF-MS característicos de las cepas representativas de la genoespecie del grupo de gérmenes al que pertenece dicha cepa que se va a identificar, conteniendo dicha base de datos para cada cepa representativa los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0,05, más particularmente superior a 0,1, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos, preferentemente 5 o incluso 10
o más.
Dicho método puede comprender la etapa de mantener en el espectro de la cepa analizada los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a
0,05, más particularmente superior a 0,1.
La selección de picos llevada a cabo de acuerdo con la invención permite identificar con exactitud el germen presente en una muestra clínica.
La etapa de clasificación se basa en las condiciones de crecimiento y/o la característica de las colonias y/o la morfología de las bacterias ante el examen microscópico y/o la tinción de Gram y/o pruebas fenotípicas sencillas.
La técnica de MALDI-TOF-MS se lleva a cabo en células enteras intactas o en extractos de proteínas obtenidos tras la lisis o correspondientes a una fracción de los componentes celulares (pared celular, citoplasma, etc.). Lo ideal es realizar esta técnica en una colonia aislada de la cepa que se vaya a identificar, obtenida a partir de una muestra clínica cultivada en un medio de crecimiento apropiado e incubada a una temperatura apropiada.
Antes de realizar la técnica de MALDI-TOF-MS, se añade un medio de matriz a las colonias aisladas.
Los medios de matriz adecuados comprenden, por ejemplo, derivados de ácido benzoico tales como ácido hidroxibenzoico, particularmente ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB).
Cada espectro es la suma de al menos 400 disparos de láser, preferentemente más de 1.000, e incluso más de 2.000, desde diferentes regiones del pocillo que contiene la cepa que se va a analizar, siendo dicho espectro analizado en un intervalo de m/z de 500 a 50.000, y más preferentemente de entre 500 y 20.000, y más preferentemente de entre 2.000 y 20.000.
A continuación, se comparan los perfiles usando un programa informático que selecciona la mejor coincidencia entre la cepa analizada y los picos seleccionados de dicha base de datos de referencia obtenida mediante el análisis de una o varias cepas de referencia específicas de una genoespecie o genosubespecie dada. Cada cepa representa una genoespecie o genosubespecie del grupo en estudio, de manera que el conjunto de cepas corresponde a la genoespecie o genosubespecie pertinente de un grupo de gérmenes. El espectro de cada cepa de referencia se registra usando la técnica de MALDI-TOF-MS. Como se ha mencionado anteriormente, el pico con la intensidad más elevada se fija arbitrariamente en 1, y el resto de picos tiene un valor correspondiente a la intensidad relativa de este pico más elevado. Los picos presentes con una intensidad relativa superior a 0,05 o más particularmente superior a 0,1 se retienen, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos, preferentemente 5 o incluso 10 o más. Estos picos son los picos seleccionados.
Teniendo en cuenta una posible variación, el programa informático selecciona la mejor coincidencia entre la cepa analizada y la base de datos, teniendo en cuenta un posible error del valor m/z. El intervalo del error se fija arbitrariamente en 20, o más preferentemente en 10.
La presencia y ausencia de picos se consideran los identificadores genéticos de un determinado aislado.
Dicho método es una potente herramienta para la identificación rápida de un germen, lo que permite su uso en el diagnóstico habitual de laboratorio. La necesidad de un equipo costoso se compensa con la simplicidad del protocolo, que requiere un tiempo de práctica mínimo. Es especialmente apropiado para los laboratorios de referencia o los hospitales que reciben un alto volumen de muestras.
La alta resolución del método MALDI-TOF-MS realizado de acuerdo con la invención hace que sea posible, por ejemplo, obtener huellas espectrales características para cada especie e incluso subespecie de un germen dado.
Resulta ventajoso usar dicho método para la identificación de gérmenes seleccionados del grupo que comprende bacterias, levaduras, mohos a nivel de especie y/o subespecie.
De acuerdo con una realización específica, la invención se refiere a la identificación de especies y/o subespecies de estafilococos coagulasa positiva (abreviado como CNS).
La identificación de CNS a nivel de especie no se realiza de forma habitual, ya que con frecuencia se consideran contaminantes de la muestra. Además, los resultados de los métodos fenotípicos realizados en cepas clínicamente significativas son decepcionantes. Los kits comerciales de identificación tienen un valor limitado en la identificación de los aislados de CNS. La determinación de la secuencia SodA, a pesar de ser el método más preciso para la identificación correcta de especies de CNS, es largo, costoso y técnicamente exigente. Además, aunque los métodos genotípicos son claramente superiores a las identificaciones fenotípicas, un inconveniente de los métodos genotípicos basados en secuencias puede ser la falta de calidad de las secuencias depositadas en los bancos de datos.
Gracias a la invención, la diferenciación a nivel de subespecie es más precisa, por ejemplo, para la subespecie de los estafilococos, con MALDI-TOF-MS que con el método de SodA, pues se demostró que el gen SodA no diferencia bien entre las subespecies S. capitis, S. hominis, S. saprophyticus y S. schleiferi.
De acuerdo con otra realización, la invención se refiere a la identificación de especies o subespecies de bacilos Gram negativos no fermentadores.
Las bases de datos usadas en dicho método también forman parte de la memoria descriptiva.
5 Consisten en un conjunto de picos seleccionados obtenidos mediante análisis de MALDI-TOF-MS de cepas al menos parcialmente conservadas entre cepas pertenecientes a las mismas genoespecie.
Dichos picos de referencia corresponden a los principales picos conservados con una intensidad relativa superior a 10 0,05, más particularmente superior a 0,1.
Dichas bases de datos se obtienen ventajosamente para cada grupo de gérmenes mediante el uso de un conjunto de cepas, representando cada cepa una genoespecie del grupo de estudio, de modo que el conjunto de cepas corresponde a la genoespecie pertinente de un grupo de gérmenes. El espectro de cada cepa de dicho grupo se 15 registra usando la técnica de MALDI-TOF-MS. Cada cepa representa una genoespecie de este grupo de gérmenes, y se designa además como cepa de referencia. Como se ha mencionado anteriormente, el pico con la intensidad más elevada se fija arbitrariamente en 1, teniendo el resto de picos un valor correspondiente a la intensidad relativa de este pico más elevado. Los picos principales son mantenidos, teniendo dichos picos una intensidad relativa al menos superior a 0,05, más particularmente superior a 0,1. Entonces, se retienen los picos presentes que tienen una
20 intensidad relativa superior a 0,05, o más particularmente superior a 0,1 en todos los conjuntos de datos obtenidos para una cepa de referencia dada, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos, preferentemente 5 o incluso 10 o más.
El conjunto de picos obtenido de este modo es específico de una genoespecie para una condición de crecimiento 25 dada (medio y la duración), y con respecto a las características de un espectrómetro dado.
De aquí en adelante, se dan otras características y ventajas de la invención con respecto a la identificación de 1) CNS a nivel de especie; y 2) bacilos Gram negativos no fermentadores aislados en la fibrosis quística. Se dan para ilustrar la invención sin limitar su alcance. En el presente documento, se hará referencia a las figuras 1 a 7, que
30 representan, respectivamente:
-
Figura 1: Perfiles de MALDI-TOF-MS de 10 aislados de la misma cepa de S. aureus CIP 7625;
-
Figura 2: Dendrogramas de MALDI-TOF-MS de la especie Micrococcacae, de acuerdo con las bases de datos 1
(Muëller Hinton 24H) y 2 (Muëller Hinton 48H), designando así la genoespecie por identificar en este grupo de 35 gérmenes;
-
Figura 3: Valor de m/z de los picos con una intensidad relativa superior a 0,1 en relación con las cepas de estafilococos;
-
Figuras 4 y 5: Conservación del conjunto de picos de cepas seleccionadas entre las cepas pertenecientes a la
misma genoespecie; 40 - Figura 6: Clasificación de bacterias aeróbicas y anaeróbicas facultativas;
-
Figura 7: Perfiles de MALDI-TOF-MS de 6 bacilos Gram negativos.
1. Identificación de CNS a nivel de especie
45 Material y métodos
Cepas bacterianas
Los resultados dados a continuación se obtuvieron mediante el análisis de cincuenta y una cepas de bacterias 50 pertenecientes a Micrococcacae obtenidas de la colección del Instituto Pasteur (París, Francia).
En la Tabla 1, se dan las cepas seleccionadas usadas para establecer las bases de datos de MALDI-TOF-MS.
Tabla 1
Especie
Cepa
Staphylococcus aureus
CIP 7625
Micrococcus luteus
CIP 103664
M. lentus
CIP 103430
S. epidermidis
CIP 103563
S. warneri
CIP 103960
Especie
Cepa
S. xylosus
CIP 8166
S. intermedius
CIP 8177
S. haemolyticus
CIP 81.56
S. saprophyticus subesp. saprophyticus
CIP 104064
S. saprophyticus subesp. bovis
CIP 105260T
S. lugdunensis
CIP 103642
S. hominis subesp. hominis
CIP 102642
S. hominis subesp. novobiosepticus
CIP 105721
S. capitis subesp. capitis
CIP 8153T
S. capitis subesp. ureolyticus
CIP 104191
S. caprae
CIP 104519
S. pasteuri
CIP 103831
S. cohni subesp. cohni
CIP 8154T
S. cohni subesp. urealyticum
CIP 104023
S. scheiferi subesp. scheiferi
CIP 103643T
S. scheiferi subesp. coagulans
CIP 104370
S. sciuri subesp. sciuri
CIP 103824
S. simulans
CIP 8164 T
En la Tabla 2, se dan las cepas pertenecientes a la familia Micrococcacae. Tabla 2
Especie
Cepa
S. aureus
68 aislados clínicos
M. luteus
CIP A270
S. epidermidis
81 aislados clínicos
S. warneri
CIP 106511
CIP 8165
6 aislados clínicos
S. xylosus
CIP 103720
CIP 104065
S. intermedius
CIP 81.60
S. haemolyticus
CIP 104114
13 aislados clínicos
S. satprophyticus subesp. saprophyticus
CIP 76.125T
CIP 103545
S. saprophyticus subesp. bovis
CIP 105262
CIP 105261
(continuación)
Especie
Cepa
S. saprophyticus sp *
6 aislados clínicos
S. lugdunensis
CIP 103584
S. hominis subesp. hominis
CIP 81.57
CIP 104689
S. hominis subesp. novobiosepticus
CIP 105719T
S. hominis sp *
10 aislados clínicos
S. capitis subesp. capitis
CIP 103688
S. capitis subesp. ureolyticus
CIP 104192T
S. caprae
CIP 104000T
CIP 104520
S. pasteuri
CIP 105540T
CIP 103830
CIP 103832
S. cohni subesp. urealyticum
CIP 104024T
CIP 104025
S. scheiferi subesp. coagulans
CIP 104366
S. sciuri subesp. sciuri
CIP 8162T
CIP 103583
CIP 103825
*: La genoespecie de estas cepas clínicas se identificó usando la secuencia del gen sodA, que no distingue las 2 subespecies.
También se estudiaron ciento dieciséis aislados clínicos de estafilococos coagulasa negativa (CNS): 74 cepas aisladas de hemocultivos, 25 cepas aisladas de mediastinitis infantil (piel, líquido mediastínico, electrodos), 12 cepas
5 aisladas de infecciones óseas (Hôpital Necker-Enfants malades, París, Hôpital Raymond Poincaré, Garches, Francia) y 5 cepas aisladas de infecciones del tracto urinario. Además, se analizaron 68 cepas clínicas de Staphylococcus aureus aisladas de diversas infecciones.
Identificación fenotípica y genotípica
10 Se diferenciaron las cepas clínicas de CNS de las cepas de S. aureus mediante pruebas fenotípicas convencionales incluyendo la prueba de aglutinación de látex de Slidex (bioMérieux, Marcy I'Etoile, Francia) y la prueba de ADNasa. En caso de discordancia entre las dos últimas técnicas, se realizaron pruebas de coagulasa en tubo. La identificación precisa del CNS se obtuvo mediante la secuenciación de un fragmento interno del gen SodA como se
15 ha descrito previamente. En síntesis, se realizó la extracción de ADN genómico de cultivos puros de CNS con el kit de Quiagene (Courtaboeuf, Francia). Se amplificó el gen SodA parcial y se secuenciaron los amplicones obtenidos usando el kit de reacción listo para la secuenciación por ciclos ABI Big Dye Terminator v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) según lo descrito anteriormente por Poyart et al. 2001, J. Clin. Microbiol. 39:4296-4301. Las secuencias nucleotídicas se enviaron a la base de datos GenBank para la asignación de las especies.
20 Con esta estrategia, se identificaron los 116 aislados clínicos de CNS dados en la Tabla 2.
Técnica de MALDI-TOF-MS
25 Se cultivaron las cepas en agar Muëller Hinton o agar Columbia + sangre de caballo al 5 % (bioMérieux), se incubaron 24 o 48 horas a 37 ºC. Para cada identificación, se cosechó una colonia aislada en 100 l de agua estéril; se depositó 1 l de esta mezcla sobre una placa diana (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) por triplicado y se dejó secar a temperatura ambiente. A continuación, se añadió 1 l de etanol absoluto a cada pocillo y 1 l de la solución
de matriz DHB (50 mg/ml de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, acetonitrilo al 30 %, ácido trifluoroacético al 0,1 %). Tras el secado, se añadió 1 l de la solución de matriz DHB. Luego, se procesaron las muestras en el espectrómetro MALDI-TOF-MS modelo autoflex (Bruker Daltonics) con el programa informático de control de la flexión (Bruker Daltonics). Los iones positivos se extrajeron con un voltaje de aceleración de 20 Hz en modo lineal. Cada espectro era la suma de los iones de 5 x 200 disparos de láser procedentes de diferentes regiones del mismo pocillo, y se analizó en un intervalo de m/z de 1.000 a 23.000. El análisis se realizó con el programa informático de análisis de la flexión y se calibró con el patrón T de calibración de proteínas (Proteína I, Bruker Daltonics). Se añadieron los datos obtenidos con las 3 repeticiones para reducir al mínimo el efecto aleatorio. La presencia y la ausencia de picos se consideraron como los identificadores genéticos de un determinado aislado. Los perfiles se analizaron y se compararon usando el programa informático de la base de datos BGP disponible en la página web http://sourceforge.net/projects/bgp.
Resultados
Las cepas que figuran en la Tabla 1 son aquellas seleccionadas arbitrariamente como representativas de la genoespecie.
Se analizaron diez aislados de cada una de estas cepas seleccionadas mediante MALDI-TOF-MS como se ha descrito en el apartado de Materiales y métodos.
Para cada espectro, se dio a cada pico un valor correspondiente a la intensidad.
El pico con la intensidad más elevada se fijó arbitrariamente en 1, teniendo el resto de los picos un valor correspondiente a la intensidad relativa de este pico más elevado (Figura 1).
Los picos menores (intensidad relativa inferior a 0,1) estuvieron presentes de manera inconstante. Por lo tanto, el análisis se concentró posteriormente en los picos con una intensidad relativa superior al 0,1 que estaban presentes en la totalidad de los 10 conjuntos de datos obtenidos para una cepa dada.
Para determinar el impacto de las condiciones de crecimiento en la identificación bacteriana, se realizó el procedimiento anteriormente descrito con todas las cepas enumeradas en la Tabla 1 y se cultivaron en agar Muëller Hinton o agar Columbia complementado con sangre de caballo al 5 % durante 24 o 48 horas.
Los resultados se dan en la Tabla 3.
Las bases de datos se denominaron 1 a 4, respectivamente: se obtuvieron usando cultivos bacterianos en Muëller Hinton 24H (base de datos 1), Muëller Hinton 48H (base de datos 2), medio de sangre de caballo Columbia 24H (base de datos 3), medio de sangre de caballo Columbia 24H (base de datos 4). Para una cepa dada, la desviación típica del valor de m/z para cada uno de los picos conservados nunca fue superior a 7. En la Figura 3, se registra el valor de m/z de los picos con una intensidad relativa superior a 0,1 y presentes en los 10 conjuntos de datos para cada condición de crecimiento.
La Tabla 3 muestra para cada cepa seleccionada y cada base de datos el número de picos que se ha mantenido. Mientras que para una cepa, algunos picos se conservaron independientemente del medio o del tiempo de cultivo, otros picos bien desaparecieron o aparecieron al cambiar las condiciones de cultivo. Sin embargo, para un determinado medio y tiempo de cultivo, el conjunto de los picos fue específico de cada cepa como se muestra en los dendrogramas (Figura 2).
Conservación del conjunto de picos de cada una de las cepas seleccionadas entre las cepas pertenecientes a la misma genoespecie
Para abordar este punto, se realizó una MALDI-TOF-MS usando bacterias cultivadas en Muëller Hinton durante 24 horas a 37 ºC. Las cepas usadas son los aislados enumerados en la Tabla 2.
Para cada cepa, se mantuvieron solo los picos con un valor superior a 0,1. Luego se comparó el perfil obtenido para cado uno de estos aislados con el de los de la base de datos 1.
Para realizar esta tarea, se desarrolló un programa informático (base de datos BGP disponible en http://sourceforge.net/projects/bgp) que permitió la rápida identificación del conjunto más cercano de valores de la base de datos con el de la cepa analizada. Este programa informático selecciona la mejor coincidencia entre la cepa analizada y las cepas de referencia de la base de datos, teniendo en cuenta un posible error del valor de m/z que se ha medido. Este valor se fijó arbitrariamente en 7.
La cepa analizada siempre tuvo la mejor coincidencia con la cepa perteneciente a la misma genoespecie de la base de datos. Todos los datos se presentan en la Figura 4 y la Figura 5.
Número medio de picos conservados de las cepas analizadas cultivadas de acuerdo con Muëller Hinton durante 24 h en comparación con el número de picos de cada base de datos
Se analizó el mismo conjunto de datos obtenido mediante el cultivo de las bacterias analizadas en Muëller Hinton durante 24 horas frente a las bases de datos 2, 3 y 4.
Los resultados se dan en la Tabla 4.
Tabla 4 5
Especie
Número de cepas Base de datos 1 Base de datos 2 Base de datos 3 Base de datos 4
S. aureus
68 9,6/11 8,7/11 4,5/7 4,7/8
S. capitis capitis
1 8/8 14/14 4/4 6/6
S. capitis urealyticus
1 7/7 7/9 6/6 4/4
S. caprae
2 5/5 8/12 6/6 5/6
S. cohni urealyticus
2 6/6 9/12 7/7 6,5/8
S. epidermidis
81 3,2/4 5,1/11 2,2/4 3,4/6
S. haemolyticus
14 3,4/5 5,4/10 3,3/4 4,8/8
S. hominis hominis
6 5,6/8 * 5,7/9 3,5/4 3,6/5
S. hominis novobio
7 4/6 * 7,7/12 *** 2,7/7 ***** 3,1/8
S. intermedius
1 10/10 11/12 7/7 6/6
S. lugdunensis
1 8/8 11/12 5/5 9/9
S. saprophyticus bovis
3 7,6/9 9,6/12 **** 4/7 4/5
S. saprophyticus saprophyticus
7 6/8 ** 5,8/10 5,1/7 8/11
S. schleiferi coagulans
1 7/7 6/8 4/4 10/10
S. pasteuri
3 11/11 11/12 9,5/10 11,6/12
S. sciuri sciuri
3 7/7 8,3/11 2,3/3 3,6/4
S. xylosus
2 5/5 9/9 7/8 6/9
S. warneri
8 6,7/9 8,8/10 8/10 6,8/14
M. luteus
1 7/7 11/12 8/10 11/11
* Una cepa por identificar a nivel de subespecie no se pudo diferenciar.
**3 identificaciones de S. saprophyticus bovis.
*** 6 identificaciones de S. hominis hominis.
**** 1 identificación de S. saprophyticus saprophyticus.
***** 3 cepas sin diferenciar entre S. hominis hominis y S. hominis novobiosepticus.
9
La Tabla 4 muestra, para cada genoespecie, el número medio de picos que se conservaron entre las cepas analizadas y cada una de las cuatro bases de datos.
A pesar del número de picos conservado al establecer las bases de datos usadas para la identificación de genoespecies usando diferentes condiciones de crecimiento de las usadas para las cepas analizadas, la identificación a nivel de especie fue posible en todos los casos.
La única diferencia observada mediante el uso de las bases de datos 2, 3 y 4 con los resultados obtenidos con la base de datos 1, es que la identificación a nivel de subespecie no fue posible para S. hominis y S. saprophytics a diferencia de los resultados obtenidos con la base de datos 1.
En conjunto, dichos datos demuestran que mediante la selección de un conjunto apropiado de cepas y el mantenimiento de solo los picos conservados con un valor de m/z superior a 0,1, se puede diseñar mediante ingeniería genética una base de datos que se pueda usar para la identificación de genoespecies. Además, la especificidad de estos picos es tal que la identificación de genoespecies fue posible, incluso habiéndose cultivado las cepas por identificar con diferentes condiciones de cultivo de las usadas para diseñar la base de datos.
2. Identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores
La primera etapa consistió en crear una base de datos completa para todas las especies pertenecientes al grupo de los bacilos Gram negativos no fermentadores recuperados en seres humanos. A continuación, se validó esta base de datos para identificar, usando MALDI-TOF-MS, todos los bacilos Gram negativos no fermentadores clínicos que se habían recuperado de pacientes con fibrosis quística (FQ) en el período de un año.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Las cepas de referencia usadas para diseñar mediante ingeniería genética la base de datos de MALDI-TOF-MS pertenecían a 52 especies de bacilos Gram negativos no fermentadores que se pueden recuperar de pacientes. Estas cepas se enumeran en la Tabla 4.
Tabla 4 5
Especie
Cepa de referencia Especie Cepa de referencia
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas mosselii
CIP 76.110 CIP 69.13 T CIP 104061 Inquilinus limosus Pandoraea apista Bordetella avium CIP 108342 T CIP 106627 T CIP 103348 T
Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas mendocina
CIP 52.191 T CIP 103022 T CIP 75.21 T Bordetella bronchiseptica Bordetella hinzii Alcaligenes faecalis subesp. faecalis CIP 55.110 T CIP 104527 T CIP 60.80 T
Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas luteola
CIP 101034T CIP 66.14 T CIP 102996T CIP 102995T Aeromonas sobria Aeromonas hydrophila subesp. hydrophila Aeromonas veronii Aeromonas caviae CIP 74.33 T CIP 76.14 T CIP 103438 T CIP 76.16 T
Stenotrophomonas maltophilia Achromobacter xylosoxydans xylosoxydans Achromobacter xylosoxydans denitrificans
CIP 60.77 T subesp. CIP 71.32 T subesp. CIP 77.15 T Delftia acidovorans Shewanella putrefaciens Plesiomonas shigelloides CIP 103021 T CIP 80.40 T CIP 63.5 T
Achromobacter piechaudii
CIP 60.75 T Chryseobacterium indologenes CIP 101026 T
Burkholderia cepacia
CIP 80.24 T Elizaberhkingia meningoseptica CIP 60.57 T
Burkholderia multivorans
CIP 105495T Sphingobacterium multivorum CIP 100541 T
Burkholderia cenocepacia
CIP 108255T Sphingobacterium spiritivorum CIP 100542 T
Burkholderia stabilis
CIP 106845T Brevundimonas diminuta CIP 63.27 T
Burkholderia vietnamlensis
CIP 105875T Brevundimonas vesicularis CIP 101035 T
Burkholderia dolosa
CIP 108406 Sphingomonas paucimobilis CIP 100752 T
Especie
(continuación Cepa de referencia Especie Cepa de referencia
Burkholderia ambifaria
CIP 107266T Cupriavidus pauculus CIP 105943 T
Burkholderia anthina
CIP 108228T Inquilinus limosus CIP 108342 T
Burkholdería pyrrocinia
CIP 105874 T Pandoraea apista CIP 106627 T
Burkholdería gladioli Burkholderia gladiolicocovenenans
pathovar CIP 105410 T ATCC 33664 Bordetella avium Bordetella bronchiseptica CIP 103348 T CIP 55.110 T
Burkholderia glumae Burkholderia plantarii
NCPPB 2391 ATCC 43733 Bordetella hinzii Alcaligenes faecalis subesp. faecalis CIP 104527 T CIP 60.80 T
Burkholderia glathei Burkholderia andropogonis Ralstonia mannitolilytica
CIP 105421 T CIP 105771 T CIP 107281 T Aeromonas sobria Aeromonas hydrophila subesp. hydrophila Aeromonas veronii CIP 74.33 T CIP 76.14 T CIP 103438 T
Ralstonia pickettii
CIP 73.23 T Aeromonas caviae CIP 76.16 T
Cupriavidus gilardii
CIP 105966 T Delftia acidovorans CIP 103021 T
Cupriavidus pauculus
CIP 105943 T
Los aislados clínicos de bacilos Gram negativos no fermentadores se recuperaron del esputo de niños con FQ que acudieron al departamento de pediatría del hospital Necker-Enfants Malades (París, Francia) entre el 01/01/06 y el 31/12/06. En síntesis, se identificaron como Pseudomonas aeruginosa los aislados que mostraban una pigmentación verde o amarilla verdosa, prueba de oxidasa positiva, crecimiento a 42 ºC, crecimiento en agar cetrimida y susceptibilidad a la colimicina. Los aislados que no expresaban esos criterios se identificaron mediante el sistema API 20NE. Los resultados de las pruebas API 20NE se interpretaron usando el paquete informático APILAB PLUS. Cuando se consideró que los resultados obtenidos usando este programa informático no correspondían a una buena identificación de P. aeruginosa, A. xylosoxydans subesp. xylosoxydans y S. maltophilia, las bacterias se identificaron mediante la secuenciación de un fragmento interno del gen ADNr 16S.
Todas las cepas bacterianas usadas en el estudio se almacenaron a -80 ºC en caldo de tripticasa de soja complementado con glicerol al 15 %.
MALDI-TOF-MS. Las cepas se cultivaron en agar de Muëller-Hinton y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC. La mayoría de los aislados crecieron después de 24 horas, pero algunas cepas que no crecieron tras 24 horas se incubaron adicionalmente durante 48 h o 72 h. Se cosechó una colonia aislada en 100 l de agua estéril; se depositó 1 l de esta mezcla sobre una placa diana (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) por triplicado y se dejó secar a temperatura ambiente. A continuación, se añadió un microlitro de etanol absoluto a cada pocillo, y se dejó secar la mezcla. Luego, se añadió un l de solución de matriz DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico, 50 mg/ml, acetonitrilo al 30 %, ácido trifluoroacético al 0,1%). Se procesaron las muestras en el espectrómetro de MALDI-TOF-MS (Autoflex; Bruker Daltonics) con el programa informático de control de la flexión (Bruker Daltonics). Los iones positivos se extrajeron con un voltaje de aceleración de 20 kV en modo lineal. Cada espectro era la suma de los iones obtenidos a partir de 200 disparos de láser llevados a cabo en cinco regiones diferentes del mismo pocillo. Los espectros se analizaron en un intervalo de m/z de 2.000 a 20.000. El análisis se realizó con el programa informático de análisis de la flexión y se calibró con el patrón T de calibración de proteínas (Proteína I; Bruker Daltonics). Se añadieron los datos obtenidos por triplicado para reducir al mínimo el efecto aleatorio. La presencia y la ausencia de picos se consideraron como los identificadores genéticos de un determinado aislado. Los perfiles se analizaron y se compararon usando el programa informático de la base de datos BGP disponible en la página web http://sourceforge.net/projects/bgp.
Resultados
Diseño por ingeniería genética de la base de datos de los bacilos Gram negativos no fermentadores
Se usaron las cepas de referencia enumeradas en la Tabla 4 para determinar los valores de m/z obtenidos por MALDI-TOF-MS que constituían un espectro característico de cada especie bacteriana y que luego se podrían usar para la identificación bacteriana. La Figura 7 muestra el espectro obtenido con 6 especies de bacilos Gram negativos no fermentadores. Se analizaron diez aislados de cada una de estas cepas seleccionadas cultivadas en Muëller Hinton 24H mediante MALDI-TOF-MS como se describe en el apartado de Métodos y materiales. Para cada espectro, se adoptó la misma estrategia usada para Micrococcacae. De acuerdo con esta estrategia, solo se mantuvieron los picos con una intensidad superior a 0,1 que estaban presentes de manera constante en el total de los 10 conjuntos de datos obtenidos para una cepa dada. Para cada cepa, la desviación típica del valor de m/z
(datos normalizados) para cada pico conservado no fue nunca superior a 8. La Tabla 5 muestra, para 8 especies, los valores de los picos que se han mantenido para la base de datos.
El conjunto de picos mantenidos para cada cepa de referencia da un espectro característico.
Identificación de las cepas clínicas
5 Se llevaron a cabo experimentos para determinar si las bases de datos anteriores se podían usar para la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores clínicos, demostrando así que el conjunto de picos de cada cepa seleccionada se conservaba, al menos parcialmente, entre los aislados de la misma especie. De enero a diciembre de 2006, se recuperaron e identificaron mediante pruebas fenotípicas o método molecular 811 cepas de bacilos Gram negativos no fermentadores: 699 cepas de P. aeruginosa (120 pacientes), 54 cepas de A.
10 xylosoxydans (12 pacientes), 32 cepas de S. maltophilia (12 pacientes), 9 cepas de R. mannitolilytica (1 paciente), 14 Bcc (2 pacientes), 1 cepa de B. gladioli, 1 cepa de B. hinzii y 1 cepa de I. limosus. Entre estas, se realizó un análisis de MALDI-TOF-MS en un grupo de 400 cepas de P. aeruginosa y en el resto de las cepas distintas de P. aeruginosa. Para cada aislado, se consideraron todos los valores de m/z del espectro. Para cada cepa, se mantuvieron todos los picos independientemente de su intensidad y luego se compararon con el de la base de datos
15 usando el programa informático de la base de datos BGP. Este programa informático selecciona la mejor coincidencia entre la cepa analizada y la base de datos, teniendo en cuenta un posible error del valor de m/z. Este valor se fijó en. La cepa se identificó como perteneciente a la genoespecie de la cepa de la base de datos que daba la mejor coincidencia. Los resultados se dan en la siguiente Tabla 6, que muestra las coincidencias obtenidas para una cepa de P. aeruginosa proporcionada por el programa informático BGP.
20 Tabla 6
Nombre del perfil: P. aeruginosa Coincidencia: 13/13
06178603,0, valores txt
Valores de P. aeruginosa
4.441
4.436
4.548
4.544
5.216
5.213
5.743
5.742
6.053
6.051
6.354
6.353
6.682
6.682
6.917
6.918
7.209
7.211
7.584
7.586
7.620
7.621
8.571
8.575
9.096
9.100
Nombre del perfil: F. orzyhabitans Coincidencia: 7/12
06178603,0, valores txt
Valores de F. orzyhabitans
4.441
4.435
6.053
6.053
6.505
6.503
6.682
6.680
7.497
7.498
7.584
7.581
9.123
9.126
La Tabla 7 muestra la identificación obtenida para todas las cepas clínicas en comparación con la segunda elección de identificación de especies.
Tabla 7
Cepas (número)
Pacientes (número) Especies identificadas por técnicas convencionales Comparación con la cepa de referencia Diferencia del % de picos comunes con las respectivas cepas de referencia entre la primera y segunda selección de especies
Cepa de referencia
% medio de picos comunes
400
100 P. aeruginosa P. aeruginosa 86 (ext : 23100) 35 (ext : 2-67)
54
11 A. xylosoxydans subesp. xylosoxydans A. xylosoxydans subesp. xylosoxydans 91 (ext : 73100) 75 (ext: 1-5) (II elección: principalmente A. piechaudii o A. xylosoxydans subesp. denitrificans)
32
12 S. maltophilia S. maltophilia 82 (ext: 63100) 36 (ext : 4-59)
14
2 Complejo de B. cepacia* B. cenocepacia 89 (ext: 71 100) 23 (ext: 2-31)
9
1 Ralstonia sp ** R. mannitolilytica 76 (ext : 6080) 8 (ext: 2-18)
1
1
B. gladioli B. gladioli 78*** 14***
1
1
B. hinzii B. hinzii 90 34
1
1
I. limosus I. limosus 60 35
*Todas las cepas excepto 3 (identificadas como B. cepacia en sentido estricto) se identificaron correctamente como B. cenocepacia. ** Todas las cepas excepto una (identificada como R. picketti) se identificaron correctamente como R. mannitolilytica. ***: este porcentaje es el mismo que se obtuvo con B. gladioli pathovar. cocovenenans.
5 MALDI-TOF-MS identificó correctamente el 100% de las cepas de P. aeruginosa, 100% de las cepas de A. xylosoxydans y 100% de las cepas de S. maltophilia. La espectrometría de masas identificó cepas clínicas de A. xylosoxydans a nivel de subespecie. El análisis de espectrometría de masas identificó correctamente 11 cepas BCC como B. cenospacia. Para las 3 cepas BCC restantes, no hubo diferenciación entre B. cenocepacia y B. cepacia en
10 sentido estricto. Cabe señalar que las 9 cepas de R. mannitolilytica, excepto una (identificada por espectrometría de masas como R. picketti), se identificaron correctamente mediante espectrometría de masas.
Conclusiones
15 Estos resultados demuestran que la base de datos diseñada por ingeniería genética de acuerdo con la invención también es adecuada para la identificación precisa de especies de bacilos Gram negativos no fermentadores. Por lo tanto, mediante MALDI-TOF-MS, es posible, a partir de una colonia de bacilos Gram negativos no fermentadores (condiciones de cultivo, características de la colonia), obtener en pocos minutos una identificación precisa y sin necesidad de realizar ensayos adicionales. Las cepas clínicas de FQ analizadas se identificaron con precisión a
20 nivel de especie, a excepción de tres cepas de B. cenocepacia y una de R. mannitolylitica. Es interesante señalar que la cepa identificada como B. gladioli también coincidió con la cepa de referencia de B. cocovenenans, una especie de bacteria que ha demostrado ser un sinónimo menor de B. gladioli. MALDI-TOF-MS permite la identificación de bacterias de manera rápida mientras que la identificación bioquímica convencional por API 20NE a menudo requiere más de 24 h-48 h con frecuentes identificaciones erróneas. Por lo tanto, la identificación de cepas
25 por MALDI-TOF-MS es un método muy interesante para la caracterización de especies de bacilos Gram negativos y ayudará a la comprensión de su relevancia clínica y distribución.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para la identificación de una cepa aislada de una muestra clínica, a nivel de especie y/o de subespecie, usando el análisis de MALDI-TOF-MS que comprende una etapa de clasificación del germen en un 5 grupo antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, en el que dicho análisis de MALDI-TOF-MS comprende la etapa de comparar el perfil de espectros de la cepa que se va a identificar con una base de datos de referencia que contiene los espectros de MALDI-TOF-MS característicos de las cepas representativas de la genoespecie del grupo de gérmenes al que pertenece dicha cepa que se va a identificar, conteniendo dicha base de datos, para cada cepa representativa, los picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente
    10 en 1, una intensidad relativa superior a 0,05, por lo que están presentes en al menos 2 subcultivos.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, donde dicha base de datos contiene, para cada cepa representativa, picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0,1.
  3. 3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la etapa de clasificación se basa en las condiciones de crecimiento y/o la característica de las colonias y/o la morfología de las bacterias ante el examen microscópico y/o la tinción de Gram y/o pruebas fenotípicas sencillas.
    20 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la realización de la técnica de MALDITOF-MS en células enteras intactas o en extractos de proteínas obtenidos tras la lisis o correspondientes a una fracción de los componentes celulares.
  4. 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la adición de un derivado de ácido
    25 benzoico como medio de matriz a las colonias aisladas antes de realizar el análisis de MALDI-TOF-MS, siendo dicho derivado seleccionado del grupo que comprende DHB.
  5. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada espectro es la suma de al menos 400 disparos de láser, preferentemente más de 1.000, incluso más preferentemente más de 2.000, procedentes de
    30 diferentes regiones del pocillo que contiene la cepa que se va a analizar, siendo dicho espectro analizado en un intervalo de m/z de 500 a 50.000.
  6. 7. El método de la reivindicación 6, que comprende el uso de al menos 1.000 disparos de láser.
    35 8. El método de la reivindicación 7, que comprende el uso de al menos 2.000 disparos de láser.
  7. 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho espectro se analiza en un intervalo de m/z de entre 500 y 20.000.
    40 10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho espectro se analiza en un intervalo de m/z de entre 2.000 y
  8. 20.000.
  9. 11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cepa por identificar se selecciona del
    grupo que comprende bacterias. 45
  10. 12.
    El método de la reivindicación 11, en el que la bacteria es un estafilococo coagulasa negativa.
  11. 13.
    El método de la reivindicación 11, en el que la bacteria es un bacilo Gram negativo no fermentador.
    50 14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cepa por identificar se selecciona del grupo que comprende levaduras.
  12. 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cepa por identificar se selecciona del
    grupo que comprende mohos. 55
  13. 16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende la conservación, en el espectro de la cepa analizada, de picos que tienen, en comparación con el pico con la intensidad más elevada fijada arbitrariamente en 1, una intensidad relativa superior a 0,05.
    60 17. El método de la reivindicación 16, que comprende la conservación de los picos que tienen una intensidad relativa superior a 0,1.
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