ES2442973A1

ES2442973A1 - Composición para su uso como agente antifúngico

Info

Publication number: ES2442973A1
Application number: ES201201255A
Authority: ES
Inventors: Luis Vicente López Llorca; Corey Nislow; Mª De Los Angeles JAIME
Original assignee: Universidad de Alicante
Current assignee: Universidad de Alicante
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2014-02-14
Anticipated expiration: 2032-05-30
Also published as: ES2442973B1

Abstract

Composición para su uso como agente antifúngico. La presente invención proporciona una composición que comprende quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y fluconazol, la cual es de utilidad para inhibir el crecimiento en células eucariotas. Por tanto, se propone su uso como agente antifúngico y para la prevención y/o tratamiento de infecciones fúngicas.

Description

La presente invención se encuadra en I~I campo de las composiciones antifúngicas, específicamente dentro de las composici-ones que conducen a una mayor sensibilidad de las células eucariotas a los efectos del quitosano o de sus oligosacáridos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La quitina es un polímero natural abllndante que forma el exoesqueleto de los crustáceos, la cutícula de los artrópodos y las paredes celulares de la mayoría de los hongos. El quitosano es un polímero de N-glucosamina obtenido por N-deacetilación parcial de la quitina. La hidrólisis ácida o la rotura enzimálica de los enlaces glicosídicos de las cadenas de quilosanc), genera cadenas más cortas de un tamaño <1-10 KDa de oHgosacáridos de quitosano (CaS). cas tienen mayores propiedades antimicrobianas que el quitc)sano y actúan como aquél desestabilizando/permeabilizando las metmbranas celulares de bacterias, levaduras y de otros hongos.

El quitosano ejerce una acción antifúngic:a en diversos hongos (Palma~Guerrero J., et al., 2010, Appl Microbiol Biol. , 87:222'7-2245). Dicho compuesto inhibe tanto el crecimiento de las hifas como la germinación de esporas y reduce la producción de toxinas. Recientemente, se ha demostrado que el quitosano incrementa la producción de conidios en hongos filamentosos, incluso a concentraciones a las que el crecimiento de las hifas esta bloqueado. En conjunto dichas observaciones sugieren que el quitosano ejerce su actividad antiflingica por múltiples mecanismos.

Por airo lado, cas es más soluble yactivo biológicamente que el quitosano (Kim SK., Rajapakse N. , 2005, Carbohyd Polym., 62:357-368). La actividad biOlógica del quitosano y del COS depende de su peso molecular, grado de deacetilación y pH del medio. La actividad antibiótica del quitosano y del COS se debe a la permeabilizaci6n de las membranas plasmáticas bacterianas (Liu H., Du Y., Wang X., Sun L., 2004, International joumal of food microbio/o9'Y, 95:147-155). De igual forma los efectos antifúngicos del quitosano en levaduras y hongos filamentosos son debidos al daño que este compuesto causa a sus memtlranas plasmáticas. La sensibilidad fúngica al

quitosano depende de la fluidez de la membrana. La permeabilización de la membrana plasmática por quitosano también se ha detectado (indirectamente) en Saccharomyces cerevisiae, ya que la deleción de genes codificantes para proteínas implicadas en el mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática incrementó la sensibilidad al quitosano en dicho microorganismo (Zakrzewska A. , et al., 2007, Eukaryotic ce", 6:600-608).

Los COS son no-tóxicos para mamíferos, por lo que son de particular interés para su uso como antifúngicos en diversas aplicaciones. No obstante, debido a que muchos de los hongos patógenos pueden desarrollé:u resistencias al tratamiento prolongado con quitosano o con COS, es deseable mejorar la acción antifúngica del mismo mediante la identificaci6n de dianas moleculares cuya inhibición/activación contribuya a mejorar el efecto de dicho compuesto en la muerte o inhibición del crecimiento de células eucariotas, preferiblemente de hongos. ¡6,demás, mediante la identificación de dichas dianas moleculares de quitosano o de COS, se consigue incrementar el conocimiento del modo de acción antifúngico de este c1Jmpuesto.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

En los ejemplos de la presente invención se muestra que el uso combinado de quitosano, o de oligosacáridos del quitosano, con el antifúngico f1uconazol presenta un efecto sinérgico en la inhibición del crecirniento de células eucariotas.

Tras el uso combinado de quitosano, o ~¡us oligosacáridos, con fluconazol se observa una dramática disminución del crE!cimiento celular de células eucariotas, preferiblemente de hongos. La combinalción de quitosano, o de sus oligosacáridos, preferiblemente de COS, más preferiblE!menle de COS-5.44, y fluconazol actúa de modo sinérgico, ya que la combinación de ambos compuestos inhibe el crecimiento celular en mayor medida que la suma de! la inhibición del crecimiento celular causada por cada uno de estos dos compuestos individualmente.

Por ello, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante "composición de la invenciónH que comprende quitosano, o un oligosacárido

,

de quitosano, y f1uconazol. Preferiblemente, esta composición de la invención comprende COS, más preferiblemenle COS-5.44, y Huconazol.

La "célula eucariotan a la que se refiere la presente invención puede proceder de cualquier organismo eucariota, aunque preferiblemente procede de un hongo o de un mamifero. El término "hongo~, tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere tanto a hongos filamentosos como a lev'aduras. Preferiblemente, el hongo al que se refiere la presente invención se selecciona de la lista que comprende: S. cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii, Gandida a/bicans, Gandida glabrata, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Aspergillus fumiga tus, Gryptococcus neoformans, Trichosporon spp., Malassezia spp., Scedosporium spp. o cualquiera de los hongos descritos como sensibles a quitosano en Palma Guerrem et al., 2008, Joumal of Applied Microbiology, 104(2): 541-553.

En la presente invención se entiende por "quitosano" el polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de p.-(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas) y de N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) obtenido por Ndeacetilación parcial de la quitina, y que posee efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias.

Un "oligosacárido de quitosanon o "cos" es aquel oligosacárido del quitosano que presenta cadenas cortas, preferiblemente de un tamaño <1-10 KDa, obtenido por la hidrólisis ácida o la rotura enzimática dE! los enlaces glicosídicos de las cadenas de quitosano, y que presenta efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias. Preferiblemente, el cas al que se refiere la presente invención es CaS-5.44.

El "f1uconazor es un medicamento trialzol antimicótico usado en el tratamiento y prevención de infecciones fúngicas superficiales y sistémicas, y disponible comercialmente.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención como antifúngico.

El término "antifúngicon se refiere a un cC1mpuesto que inhibe el crecimiento del hongo sin llegar a provocar su muerte (fungistático), o que destruye, es decir, provoca la muerte, del hongo (fungicida). Este uso como agente antifúngico de la composición de la invención se refiere a un uso ex vivo. Así, la composición de la invención puede ser utilizada como antifúngico en diversé:IS aplicaciones, por ejemplo, aunque sin limitamos, en la industria textil; en la industria alimentaria, como por ejemplo, para el recubrimiento de alimentos con el fin de evitar su contaminación microbiana y, por tanto, de evitar una potencial intoxicación en el cuerpo humano o animal una vez que el alimento es ingerido; en agricultura, como por ejemplo, en tratamientos fitosanitarios, preferiblemente en infecciones causadas por Botrytis cinerea o Fusarium oxysporum; o como detergente, por ejemplo, para la limpieza de diversas superficies.

La expresión "ex vivoM se refiere a que 113 célula eucariota tratada con la composición de la invención se encuentra fuera del cuerpo humano o animal.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a la composición de la invención para su uso como medicamento. En una realización preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de infeicciones fúngicas. Más preferiblemente, la infección fúngica es producida por hongos tales como por ejemplo, aunque sin limitamos, S. cerevisiae, Zygosaccharomyces bail;;, Gandida albicans, Gandida glabrata, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans, Trichosporon spp., Malassezia spp. o Scedosporium spp .. Aun más preferiblemente, la infección fúngica se produce en humanos.

El término "medicamentoM en la presentl:! invención se refiere a un medicamento de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano~ es toda sustancia o combinación de sustancias que se preSEtnte como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedadl=s en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejercil~ndo una acción farmacológica, inmunológica

: o metabólica, o de establecer un dial:;1nóstico médico. El "medicamento de uso veterinarioM es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejercioendo una acción farmacológica, inmunológica

: o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario.

5: Se entiende por ~infección fúngican le:! colonización de un organismo huésped, preferiblemente de un mamífero no humano o de un humano, más preferiblemente de un humano, por parte de un hongo patógeno. Aun más preferiblemente, la infección fúngica es producida por hongos tales como por ejemplo, aunque sin limitamos, S. cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii, Gandida albicans, Gandida glabrata, Aspergillus fumigatus, Gryptococcus neoformans, Trichosporon spp., Malassezia spp. o Scedosporium spp ..

1O 15: El término ~tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye: (i) ínhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; (ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica el su sintomatologia; (Hi) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

20: El término KprevenciónH, tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dichcl sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.

25: Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, "composición farmacéutica de la invención", que comprende la composición de la invención.

30: En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehiculo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo. En una realización más preferida, el otro principio activo es un compuesto antifúngico. Esta composición farmacéutica de la invención puede comprender además uno o más excipientes.

35: El término "excipiente" hace referencia al una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición farmacéutica de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle

consistencia o aportar sabores que la ha!~an más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la I::omposición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra fonna de presentación, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El uvehículo farmacéuticamente aceptablet, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición farmacéutica de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición.

Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención comprende la composición de la invención, es decir, quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y fluconazol, en una cantidad terapéulicamente efectiva, entendiéndose por "cantidad terapéuticamente efectiva" el nivel, cantidad o concentración de quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y fluconazol, que produzca el efecto deseado tratando y/o previniendo infecciones fúngicas, sin caus:ar efectos adversos.

La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye (;ualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición farmacéutica de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida de drogas o de cualquier otro sistema convencional de liberación, así puede estar contenida, aunque sin limitarnos, en nanoparticulas, liposomas o nanosferas, en un material polimérico, en un implantE! biodegradable o no biodegradable o en microparticulas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables.

Tal composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, inlraestromal, intraarticular, intrasinovial, intralecal, inlralesional, intraarterial, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía vaginal o vía rectal, mediante la administración de un supositorio, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caralcterísticas técnicas, aditivos o componentes. Para los expertos en la materia, otro::; objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra el efecto sinérgico inhibitorio de COS-5.44 sobre el crecimiento celular cuando se utiliza en combinacilón con fluconazol. A) Curvas de crecimiento de la cepa de tipo salvaje (BY4743) cre~ciendo en el medio sin quitosano (vehículo, DMSO), COS-5,44 (77 ~g/ml), Fluconazol (16 ~g/ml) y COS-5,44 + Huconazol (77 + 16 Jlg/ml, respectivamente). B) Curvas dE~ crecimiento de la cepa de tipo salvaje (BY4743): crecimiento en presencia del vehículo, COS-5,44 (84 ~g/ml), tluconazol (20 J.lg/ml) y COS-5,44 + fluconazol (84 + :W J.lg/ml, respectivamente). Las lecturas de densidad óptica (DO) se tomaron cada 15 minutos durante 20 horas utilizando un lector Tecan Genios. Las medidas DO Tecan se convirtieron a DO de cubetas convencionales de 1 mm de longitud de paso de luz.

EJEMPLOS DE REALIZACiÓN

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la composición de la invención, la cual comprende quitosano o sus oligosacáridos y fluconazol, en la inhibición del crecimiento de células eucariotas. Estos; ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la preisente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han die ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo die aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. SINERGIA DE COS CON ANTIFÚNGICOS.

1.1. INTERACCiÓN ENTRE COS y FLUC:ONAZOL

Para COS-5.44, se preparó un intervalo de concentración de 35-105 ~g/ml y para fluconazol, un intervalo de concentración 4-24 IJg/ml. Se prepararon soluciones stock para cada fármaco en 12,5% de DMSO p¡:.ra obtener una concentración final de 1% en OMSO. Se crecieron levaduras de tipo salvaje (BY4743) por la noche y se diluyó a una 00'00 de 0,0625 en YPO 0.54X pH 5. Se, tomaron alícuotas de 92 1'1 de la mezcla de células y se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc), y se añadieron 4 ~I stock de COS-5.44 y/o fluconazol en una matriz de 7 x 12 dosisrespuesta. Se realizaron dos matrices de dosis-respuesta: la auto-auto (COS-5,44 5,44 Y COS·Flueonazol -Flueonazol) y dos repeticiones de la COS-5.44 y la matriz de fluconazoL Las células se cultivaron a 30°C en un espectrofotómetro con agitación (Tecan), tomándose lecturas cada 15 minutos durante 24 horas. Se utilizó el área bajo la curva de crecimiento como un indicador para medir el defecto en el crecimiento y la interacción de fármacos.

1.2. INTERACCiÓN SINÉRGICA DE C08-5.44 CON FLUCONAZOL

Debido a que COS-5.44 y el fluconazol tienen diferentes modos de acción, se analizó el efecto del tratamiento de células con ambos compuestos simultáneamente, para comprobar si estos dos compuestos podrían interactuar de manera sinérgica. A concentraciones en las que ninguno de los fármacos inhibe o inhibe débilmente el crecimiento de las células (CeS inhibe el crecimiento de <15%, mientras que el fluconazol inhibe <9%), cuando se utilizan en combinación se observa una dramática disminución en el crecimiento celular (Finura 1A-B). Usando el área bajo la curva de crecimiento como una medida, se vio que la combinación de COS-S.44 y Fluconazol actúa de modo sinérgico ya que la c;ombinación de ambos fármacos inhibe el crecimiento mucho más (45 a 86%) que la suma de inhibición del crecimiento causado por cada compuesto individualmente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y

f1uconazol. 5
2.

Uso ex vivo de la composición senún la reivindicación 1, como antifúngico.
3.

Uso de la composición según la reivindicación 1, para la elaboración de un medicamento.
4. Uso de la composición según la reivindicación 1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones fúngicas.