ES2431569T3 - Biochip y procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis y para la averiguación desi se trata de una infección aguda por Chlamydia pneumoniae o de una infección crónica por Chlamydia trachomatiso de una infección aguda por Chlamydia trachomatis, caracterizado por que se usan al menos tres antígenos parala comprobación de anticuerpos en muestras, estando seleccionados los antígenos del grupo compuesto por:CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 así como de fragmentos y subsecuenciasde los anteriores antígenos, presentando los fragmentos al menos aminoácidos consecutivos de los antígenos yal menos un epítopo específico de especie diagnósticamente relevante.
Description
Biochip y procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis
5 La presente invención se refiere a un procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis, en el que se usan los antígenos CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 para la comprobación de anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis en muestras de mamíferos. Además, la invención se refiere a un biochip que presenta los antígenos que se han mencionado anteriormente para la comprobación de los anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis. Además, la presente invención se refiere a un kit de ensayo que es adecuado para la comprobación de infecciones por Chlamydia trachomatis.
Las clamidias son agentes infecciosos extendidos a nivel mundial de considerable relevancia clínica y epidemiológica. Se trata de bacterias de replicación intracelular obligada que existen, morfológica y funcionalmente, en dos formas celulares diferentes (cuerpos elementales altamente infecciosos metabólicamente inactivos y cuerpos
15 reticulares intracelulares con capacidad de replicación) y que recorren un ciclo de vida típico. Las células diana de los patógenos, por norma general, son las células epiteliales de la conjuntiva así como las mucosas del aparato respiratorio y del aparato genital.
El reservorio de patógenos para Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae (nueva nomenclatura también: Chlamydophila pneumoniae) es el ser humano, mientras que para Chlamydia psittaci (nueva nomenclatura también: Chlamydophila psittaci) pueden ser fuentes importantes de infección, sobre todo, las aves, sin embargo, también animales de producción. Debido a su ubicación intracelular, las clamidias han desarrollado estrategias para evitar la defensa inmunitaria del hospedador, de tal manera que no es infrecuente una cronificación de la infección con el riesgo de afecciones secundarias. En tales casos, el diagnóstico mediante la comprobación del patógeno la mayoría
25 de las veces ya no es posible, mientras que la comprobación de anticuerpos específicos de especie adquiere una considerable importancia para el diagnóstico.
Las clamidias se pueden multiplicar también en células de defensa inmunitaria del hospedador, tales como monocitos y linfocitos. Posiblemente, por ello, los patógenos consiguen diseminarse desde el lugar de la primoinfección y llegar, de este modo, a otros compartimentos (articulaciones, vasos). La primoinfección con frecuencia evoluciona clínicamente de forma no característica y de manera oligosintomática, por lo que se favorece la propagación y la diseminación de la infección. Ya que, al parecer, una primoinfección no induce ninguna inmunidad completa, precisamente en Chlamydia pneumoniae y Chlamydia trachomatis no son infrecuentes las reinfecciones. De forma correspondiente, la terapia con frecuencia es de larga duración y se consigue solamente
35 con antibióticos que alcanzan, dentro de la célula, elevados niveles de principio activo. Precisamente debido a su sintomatología clínica no característica, para la comprobación de infecciones por clamidias el diagnóstico de laboratorio desempeña un papel decisivo.
Chlamydia trachomatis pertenece, en los países industrializados, a las causas más frecuentes de enfermedades de transmisión sexual (ETS). Según estimaciones del "Center of Disease Control and Prevention" de Estados Unidos, más de 700 millones de seres humanos están infectados por Chlamydia trachomatis. La incidencia anual se sitúa en 50 millones. A nivel de Alemania se cuenta con una incidencia anual de 300.000 (en total aproximadamente 1,15 millones). En los países en vías de desarrollo, el patógeno causa, con el tracoma, una queratoconjuntivitis crónica que, al igual que antes, en estos países es la causa más frecuente de la ceguera evitable.
45 El espectro de enfermedades de Chlamydia trachomatis depende del serotipo del patógeno. Los serotipos A-C causan el tracoma, los serotipos L1-L3 causan el linfogranuloma venéreo, una enfermedad de transmisión sexual que cursa de forma invasiva en estadios con aparición, sobre todo, en zonas tropicales. Por el contrario, los serotipos D-K desempeñan en los países industrializados el papel decisivo como causa de infecciones urogenitales que pueden conducir a esterilidad debida a infección y artritis postinfecciosa. La transmisión perinatal del patógeno de la madre infectada al recién nacido conduce a la denominada conjuntivitis del recién nacido o también a la neumonía del recién nacido. Debido a las graves afecciones secundarias que pueden causar las infecciones por Chlamydia trachomatis no reconocidas y, por tanto, no tratadas, en los países escandinavos y angloamericanos se ofrecen pruebas de despistaje para grupos de riesgo. Actualmente todavía no está claro si se introducirán en
55 Alemania también pruebas de despistaje.
Chlamydia pneumoniae es un patógeno conocido desde hace tan solo aproximadamente 15 años que puede causar, normalmente, infecciones del aparato respiratorio, tales como sinusitis, faringitis, bronquitis y neumonía. Los estudios seroepidemiológicos indican que Chlamydia pneumoniae está muy extendida con prevalencias de anticuerpos de más del 50 %.
Sin embargo, finalmente la relevancia clínica de Chlamydia pneumoniae no se ha aclarado de forma definitiva. En el marco de la red de competencia del BMBF (Ministerio de Educación e Investigación) "neumonía extrahospitalaria" (CAPNETZ), actualmente se intenta aclarar la importancia del patógeno en la neumonía extrahospitalaria, lo que 65 resulta, sin embargo, extremadamente difícil debido a dificultades metodológicas en el diagnóstico de laboratorio, particularmente en la serología. Sin embargo, es aún más difícil estimar la relevancia del patógeno en enfermedades
extrapulmonares. Es de importancia clave y también en cuanto a la política sanitaria y la economía nacional la cuestión de si Chlamydia pneumoniae interviene en la aterogénesis y, por tanto, también es corresponsable de las enfermedades sociales infarto cardiaco e ictus.
5 Chlamydia psittaci es el patógeno de la ornitosis o también de la psitacosis. A este respecto se trata de una zooantroponosis que se transmite al ser humano, por norma general, por aves decorativas o de producción infectadas mediante secreción y excreción de secreciones y excrementos que contienen patógeno, por vía aérea o, más infrecuentemente, a través del contacto directo. Por tanto, están en riesgo de infección, además de los dueños de aves decorativas y de producción, sobre todo los pajareros y los empleados en la industria procesadora de aves. Globalmente, la enfermedad en Alemania se ha hecho poco frecuente, no obstante, debido al difícil diagnóstico se ha de partir de una cifra desconocida relativamente alta.
La principal forma de manifestación de la infección es una neumonía atípica que puede ir acompañada de una sintomatología sistémica grave. No tratada, la infección puede tener un curso letal. Hasta ahora no se ha observado
15 una transmisión de persona a persona, sin embargo, el patógeno se considera altamente contagioso y se clasifica, según el reglamento de sustancias biológicas, en el nivel 3 de seguridad de laboratorio.
Además de esto, Chlamydia psittaci tiene una gran importancia económica en el ámbito de la tenencia de animales de producción, donde pueden aparecer infecciones graves de evolución sistémica y que tienen en cabañas infectadas, particularmente en ovejas, sin embargo, también otros animales de producción, elevados índices de abortos.
El diagnóstico de infecciones por clamidias generalmente es difícil, complejo y caro. Para la comprobación de infecciones crónicas por Chlamydia trachomatis hasta ahora no están disponibles procedimientos de comprobación
25 suficientemente sensibles, normalizados y fáciles de evaluar que, además, no generen resultados de falsos positivos.
La comprobación de una infección por Chlamydia trachomatis hasta ahora se ha llevado a cabo, por ejemplo, con ensayos de amplificación de ácido nucleico (NAAT, nucleic acid amplification test). Estos procedimientos se llevaron a cabo para la comprobación de infecciones genitales de forma rutinaria en laboratorios clínicos. Sin embargo, tales ensayos disponibles en el mercado son bastante caros y demasiado complejos para utilizarlos a gran escala. Precisamente debido a la elevada selectividad de este procedimiento de ensayo existe el riesgo de contaminaciones cruzadas o de resultados de ensayo erróneos debido a una incorrecta manipulación de las muestras. Por tanto, este procedimiento de ensayo requiere una gran atención con respecto al control de calidad y la formación del personal
35 de laboratorio.
Además, existe el riesgo de que se modifique el patógeno o su secuencia de ácido nucleico y ya no sea posible una comprobación con las sondas anteriores. Además, existe el riesgo de que se generen resultados de falsos positivos cuando más de una especie de clamidia presenta la secuencia de ácido nucleico de la sonda.
Otro procedimiento conocido se basa en la comprobación de anticuerpos séricos contra Chlamydia trachomatis. Las comprobaciones de anticuerpos específicos de género disponibles hasta ahora en el mercado registran anticuerpos contra todas las especies de clamidias y, con frecuencia, son muy difíciles de interpretar en vista de la elevada prevalencia de pacientes positivos para anticuerpos contra Chlamydia pneumoniae. Los ensayos específicos de
45 especie técnicamente son muy complejos y son difíciles de valorar (ensayo de microinmunofluorescencia).
En el pasado ya ha habido muchos intentos infructuosos de identificar antígenos de clamidias inmunodominantes y específicos. En particular, ha resultado difícil el diagnóstico específico de especie mediante antígenos de Chlamydia pneumoniae. En este caso se dieron discrepancias en la reactividad entre el método de referencia válido hasta ahora MIF (ensayo de microinmunofluorescencia) y los antígenos recombinantes (Maile et al., 2005, "recomLine Chlamydia: a new serological test system for the detection of antibodies against Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci", 3. Deutscher Chlamydienworkshop, 09.03.-11.03.2005, Jena).
El documento WO 2004/074318 describe polipéptidos de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y Chlamydia
55 pneumoniae y su uso en el diagnóstico. Entre más de 10 polipéptidos distintos que se han de utilizar para el diagnóstico de Chlamydia trachomatis se mencionan, entre otros, también la proteína CT664.
Sharma et al., Infection and Immunity (marzo 2006), pág. 1490-1499 describen la expresión de 156 proteínas de fusión de Chlamydia trachomatis que se utilizaron en placas de microtitulación para el diagnóstico de infecciones urogenitales por C. trachomatis. En esta publicación, ciertamente se menciona la proteína CT431 en una lista de 156 proteínas, sin embargo, este antígeno no presentaba ninguna reactividad significativa con los sueros ensayados. Este pasaje de la bibliografía prefiere el uso de otros antígenos para el diagnóstico.
Sánchez-Campillo, Electrophoresis (1999), pág. 2269- 2279 describe la identificación de proteínas inmunorreactivas
65 de Chlamydia trachomatis mediante Análisis de Transferencia de Western y electroforesis en gel bidimensional con sueros de pacientes. Para el diagnóstico de rutina, el método descrito allí no es adecuado, debido a que es
demasiado complejo y demasiado caro.
Biendo et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (noviembre 1996), pág. 706-709 describen los límites del ensayo de microinmunofluorescencia y las ventajas de la inmunotransferencia en el diagnóstico de infecciones 5 por clamidias.
El documento WO 2007/110700 no publicado previamente desvela composiciones inmunógenas que se han de usar, sobre todo, como vacunas. En esta publicación se mencionan antígenos con los números 456 y 017.
10 Los ensayos iniciales en el ámbito de la presente invención para la clonación y la producción recombinante de proteínas de clamidias conocidas, tales como, por ejemplo, las proteínas PGP3 (Maile et al., 2004, "Evaluation of selected recombinant chlamydial antigens for serological diagnosis of Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae infection", 5th Meeting of the European Society for Chlamydia Research, 01-04.09.2004, Budapest), MOMP, OMP2, hsp60, MIP y MOMPIV de Chlamydia trachomatis no eran adecuados para el desarrollo de un
15 procedimiento específico de comprobación para infecciones por Chlamydia trachomatis.
Esto muestra que con antígenos de lisado de células completas basados en cuerpos elementales de clamidias purificados no se pueden conseguir avances sustanciales en el diagnóstico serológico de clamidias. De este modo, hasta ahora tampoco se conocen antígenos específicos de Chlamydia pneumoniae que permitan una diferenciación
20 serológica segura de Chlamydia pneumoniae y de infecciones por Chlamydia trachomatis.
Además se desarrolló una gran cantidad de procedimientos basados en PCR, desarrollándose, por ejemplo, diferentes genes diana de Chlamydia pneumoniae a partir de muestras respiratorias y no respiratorias. Sin embargo, muchos de estos procedimientos de PCR no eran lo suficientemente fiables o estables para posibilitar resultados
25 reproducibles en exámenes clínicos rutinarios. Por ello, estos ensayos se usaron más bien como herramientas de investigación.
Además se usaron procedimientos basados en ensayos inmunoenzimáticos para la detección de infecciones por Chlamydia trachomatis mediante anticuerpos monoclonales o policlonales. Sin embargo, estos ensayos hasta ahora
30 no han resultado exitosos, particularmente a causa de su reducida sensibilidad y de los resultados de ensayo de falsos positivos generados por los mismos.
Por tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento de comprobación selectivo para infecciones por Chlamydia trachomatis. Este procedimiento no debe presentar reactividad cruzada con respecto
35 a otros patógenos y posibilitar, por ello, en particular una delimitación con respecto a infecciones por Chlamydia pneumoniae.
Otro objetivo de la presente invención consiste en averiguar, en el diagnóstico, de qué tipo de infección por clamidias se trata. A este respecto se considera una infección aguda por Chlamydia pneumoniae o una infección crónica por
40 Chlamydia trachomatis así como una infección aguda por C. trachomatis. Otro objetivo de la presente invención consiste en facilitar antígenos altamente específicos y/o altamente sensibles para el diagnóstico diferencial de infecciones por clamidias.
En particular, el procedimiento de ensayo debe presentar una alta sensibilidad para posibilitar la comprobación de
45 infecciones crónicas por Chlamydia trachomatis. Además, el procedimiento de ensayo debe ser adecuado para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis para exámenes rutinarios de laboratorio debido a un manejo más económico, sencillo y seguro y, adicionalmente, ser adecuado no solamente para la comprobación del patógeno de la enfermedad, sino también para la valoración de la progresión de la enfermedad o del estadio de la enfermedad.
50 El procedimiento de ensayo selectivo debe ser adecuado, en particular, para la aplicación en ensayos multiparamétricos basados en la tecnología de biochip o Luminex, en particular debido a que las infecciones por clamidias también pueden ser el desencadenante de cuadros clínicos con complicaciones secundarias típicas, tales como la artritis reactiva. Precisamente el diagnóstico de la artritis está asociado actualmente, debido a la necesidad
55 de encontrar la causa exacta entre muchos potenciales patógenos, a una complejidad de costes extremadamente altos de ensayos individuales.
Un objetivo también es proporcionar un procedimiento de ensayo para el ámbito veterinario, ya que también en este caso existe una gran necesidad de ensayos selectivos.
60 El objetivo de acuerdo con la invención se consiguió mediante el uso de antígenos recombinantes inmovilizados individualmente en lugar de lisados y cuerpos elementales usados convencionalmente y representa una considerable mejora en el ámbito del diagnóstico serológico de clamidias. La identificación de los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis está representada en los ejemplos.
65 La caracterización exitosa de proteínas de clamidias inmunodominantes y específicas de especie, que se pueden utilizar como antígenos para el diagnóstico, se pudo conseguir, inesperadamente, mediante expresión exclusiva in vivo, identificándose antígenos que escapan a los enfoques de diagnóstico convencionales. En este caso se identificaron todos los antígenos mediante inmunoelectroforesis 2D y transferencias de Western con ayuda de
5 sueros caracterizados de pacientes así como análisis consecutivo mediante espectrometría de masas de puntos reactivos. Esto también está descrito en los ejemplos.
La serorreactividad ventajosamente alta de los antígenos de acuerdo con la invención se consiguió clonándose los antígenos candidatos en vectores de expresión bacterianos y expresándose de forma recombinante y analizándose, después de una eventual optimización de la expresión y purificación de proteínas, en Ensayos de Línea para hallar una combinación óptima de antígenos recombinantes. En los "Ensayos de Línea" se aplican varios antígenos producidos, la mayoría de las veces, de forma recombinante como bandas estrechas sobre un soporte adecuado (por ejemplo, nitrocelulosa) y las tiras de ensayo se hacen reaccionar con el líquido de examen (por ejemplo, suero). Estos antígenos posibilitan de forma ventajosa, por un lado, una diferenciación precisa de especies y, por otro lado,
15 una diferenciación entre infecciones por clamidias activas y finalizadas. Esto, hasta ahora, solo era posible mediante procedimientos de PCR.
La serología específica de especie dependiente del estadio para el diagnóstico de infecciones por Chlamydia trachomatis tiene un papel importante en las decisiones terapéuticas, sin embargo, también en la valoración del pronóstico de los estados patológicos existentes.
Como ya se ha mencionado, el uso de los antígenos de acuerdo con la invención en un procedimiento multiparamétrico posibilita, de forma ventajosa, la comprobación simultánea de distintos patógenos, en particular la comprobación de los distintos patógenos de clamidia, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae y Chlamydia
25 psittaci. Una ventaja del uso de más de un antígeno en el procedimiento de comprobación consiste en que aumenta la seguridad del ensayo. Los antígenos de acuerdo con la invención, por un lado, poseen una mayor especificidad en infecciones clínicamente relevantes por Chlamydia trachomatis, así como, por otro lado, una menor reactividad cruzada con Chlamydia pneumoniae que los antígenos producidos de forma recombinante conocidos hasta ahora (véase la Tabla 3). Los antígenos de acuerdo con la invención hasta ahora no eran conocidos en relación con la comprobación selectiva de Chlamydia trachomatis.
El antígeno CT456-TARP ciertamente ya se ha descrito (Clifton et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2004, jul 6; 101 (27): 10166-71; Clifton et al., Infect Immun. 2005, jul; 73 (7): 3860-8; Jewett et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 oct 17; 103 (42): 15599-604.), sin embargo, no en relación con la comprobación de Chlamydia trachomatis. En el ámbito de
35 la presente invención se comprobó que, en este caso, se trata de un antígeno altamente específico y altamente sensible que es particularmente adecuado para el diagnóstico diferencial de infecciones por clamidias.
Ya se han descrito algunos otros antígenos inmunorreactivos de Chlamydia trachomatis: CT858-CPAF (Sharma et al., Infect Immun. 72 (12): 7164- 71); CT089 y CT795 (Sharma et al., Infect Immun. 74 (3): 1490- 99) y CT813 (Chen et al., Infect Immun. 74 (8): 4826- 40). Estas cuatro proteínas se examinaron con fines comparativos en el ámbito de la presente solicitud (Tabla 3). Los resultados muestran que los cuatro antígenos conocidos CT858-CPAF, CT089, CT795 y CT813 en infecciones por Chlamydia pneumoniae así como en donantes sanos de sangre reaccionan con anticuerpos contra Chlamydia trachomatis más frecuentemente que los antígenos de acuerdo con la invención (véase la Tabla 3).
45 La presente invención, por tanto, se refiere a un procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis, seleccionándose los antígenos del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 así como adicionalmente de forma preferente también de fragmentos y subsecuencias de los anteriores antígenos o de antígenos esencialmente iguales a esto que se usan para detectar anticuerpos en muestras. Se seleccionan al menos tres, preferentemente al menos cuatro, más preferentemente al menos cinco y mucho más preferentemente al menos seis antígenos del grupo de antígenos compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT603-TSAP y CT664.
En una forma de realización preferente de la invención para la comprobación de enfermedades crónicas, los
55 antígenos se seleccionan del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT603-TSAP y CT664. Son preferentes para la comprobación de enfermedades o infecciones crónicas los antígenos del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P y CT664, son particularmente preferidos los antígenos: CT603-TSAP y CT664.
En el procedimiento de acuerdo con la invención así como en los kits de ensayo o biochips se pueden usar los polipéptidos completos o prácticamente completos. Sin embargo, también es posible utilizar fragmentos de los mismos en los ensayos. Para la averiguación de qué fragmentos son particularmente adecuados para los ensayos inmunológicos, en primer lugar se averigua, gracias a la estructura tridimensional del polipéptido o debido a transferencias de hidrofilia/hidrofobia, qué zonas del polipéptido se encuentran en la superficie y, por tanto, en contacto con el sistema inmunitario del organismo hospedador. Estos fragmentos se producen entonces en 65 secciones de al menos 15, preferentemente al menos 20, más preferentemente al menos 30 y de forma particularmente preferente al menos 50 aminoácidos. La preparación se puede realizar mediante síntesis química o
de forma recombinante mediante expresión, por ejemplo, como polipéptido de fusión con una proteína portadora inmunológicamente inactiva. Estos fragmentos se hacen reaccionar entonces en ensayos adecuados, por ejemplo, los denominados Ensayos de Línea, ensayos ELISA o transferencias de Western con distintos sueros caracterizados lo más precisamente posible, de los que se sabe qué infección existe. En este caso es importante la determinación
5 exacta del patógeno así como el estado actual de la infección (aguda, hace tiempo o crónica). Entonces, a partir de los resultados de ensayo se puede deducir cuál de estos fragmentos es adecuado, bastante adecuado, particularmente adecuado o no adecuado para el uso en los procedimientos de ensayo de diagnóstico.
Otra forma de realización de la invención se refiere a un procedimiento que está caracterizado por que la detección de los anticuerpos comprende la comprobación de un complejo de antígeno/anticuerpo. Una forma preferente de realización de la invención se refiere a un procedimiento in vitro para el análisis de muestras de pacientes humanos. En una forma de realización preferente del procedimiento, las muestras a examinar se someten a una lisis celular antes de que se pongan en contacto con los antígenos. Por ello se liberan los patógenos, o los antígenos específicos de patógeno, de las células infectadas.
15 En otra forma de realización preferente del procedimiento se realiza la detección de los anticuerpos mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), transferencia de Western o ensayo de Línea, de forma particularmente preferente ELISA. En este caso es particularmente preferido el uso de ELISA, transferencia de Western y Ensayo de Línea con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, realizándose la comprobación de la reacción de antígeno-anticuerpo a través de un sustrato colorante (TMB, tetrametilbencidina).
Otra forma de realización preferente del procedimiento está caracterizada por que en el procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis se determina cuantitativamente la cantidad de anticuerpos en la muestra.
25 En una forma de realización preferente del procedimiento se realiza la comprobación de la reacción de antígenoanticuerpo mediante el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y el sustrato colorante (TMB).
Otra forma de realización de la invención se refiere a un procedimiento para el análisis de la evolución de la enfermedad de una infección por Chlamydia trachomatis, en el que se toman muestras de un paciente en determinados intervalos de tiempo y las muestras se examinan según el procedimiento de acuerdo con la invención. En este caso, es preferente que en el procedimiento de acuerdo con la invención para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis se determine cuantitativamente la cantidad de anticuerpos en la muestra.
35 Además, la invención se refiere a un kit de ensayo para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis, caracterizado por que se usan al menos tres antígenos seleccionados del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 para detectar anticuerpos en muestras de pacientes. Se seleccionan al menos tres, más preferentemente al menos cuatro y mucho más preferentemente al menos seis antígenos de los grupos mencionados anteriormente de antígenos. En una forma de realización particularmente preferente se usa todo el grupo de los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis para el procedimiento de comprobación.
Además, la invención se refiere a un biochip de los antígenos seleccionados del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 para la comprobación de anticuerpos específicos
45 de Chlamydia trachomatis. Se seleccionan al menos tres, preferentemente al menos cuatro y mucho más preferentemente al menos seis antígenos de los grupos mencionados anteriormente de antígenos.
Una forma de realización del biochip se caracteriza por que los antígenos seleccionados del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 están colocados en un punto de un soporte sólido, por ejemplo de vidrio o plástico o una membrana, preferentemente una membrana y puntos sobre el soporte sólido con otros antígenos están separados espacialmente de los mismos. En este caso es más preferente que los complejos de antígeno/anticuerpo se pueden detectar o hacer visibles mediante reacciones de formación de color sobre el soporte sólido, preferentemente una membrana. Más preferentemente se realiza la comprobación mediante el uso de reacciones de formación de color, preferentemente con TMB (tetrametilbencidina) o mediante
55 colorantes fluorescentes, tales como preferentemente colorante Cy3 o Cy5. En este caso es particularmente preferente que un colorante se una al complejo de antígeno/anticuerpo o se intercale en el mismo. Más preferente es que, de forma espacialmente separada de los puntos sobre la membrana con los antígenos de acuerdo con la invención, estén colocados otros antígenos que posibilitan una comprobación específica de Chlamydia pneumoniae. Para aplicaciones de biochip con superficies de biochip sólidas (plástico) se usan de forma particularmente preferente los colorantes Cy3, Cy5.
Para el procedimiento de comprobación de acuerdo con la invención se usan muestras biológicas. Estas muestras biológicas contienen los anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis. La muestra biológica puede proceder de pacientes humanos o animales, preferentemente de pacientes humanos. La muestra biológica puede ser cualquier 65 muestra que contenga líquido corporal o tejido tal como, por ejemplo, sangre o médula ósea. Preferentemente se usa suero o plasma. Adicionalmente se prefiere que las muestras se sometan a una lisis celular antes de que se
pongan en contacto con los antígenos. El experto conoce procedimientos para la preparación de muestras para inmunoensayos. En este caso, la preparación de las muestras puede comprender, por ejemplo, la centrifugación, precipitación, concentración, filtración, dializado o dilución de la muestra. En este caso, el tipo de preparación de las muestras depende de la técnica de detección de los anticuerpos.
5 El procedimiento de acuerdo con la invención se basa en técnicas habituales conocidas por el experto de la biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología. Estas técnicas están descritas exhaustivamente en la bibliografía. A este respecto se hace referencia en particular a: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición (1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover, Ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed,
10 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins, Eds., 1984); Transcription And Translation (B. D. Harnes & S. J. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Ed., 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Die Serien, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc. ); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos, Eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) , Methods in Enzymology vol. 154 y vol. 155 (Wu y Grossman o Wu), Mayer y Walker,
15 Eds. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes, (1987), Protein Purification: Principles And Practice, segunda edición, (Springer-Verlag, N. Y.) y Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, Eds, 1986).
La comprobación de una infección por Chlamydia trachomatis se realiza a través de la comprobación de anticuerpos
20 específicos de Chlamydia trachomatis en las muestras mediante los antígenos de acuerdo con la invención. El término "anticuerpo" indica una inmunoglobulina o un derivado de la misma que se puede unir a los antígenos de acuerdo con la invención.
Los "antígenos" de acuerdo con la invención se pueden unir a los anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis.
25 La invención se refiere a antígenos con las secuencias indicadas en las listas de secuencias y adicionalmente de forma preferente también a fragmentos inmunógenos o subsecuencias de las secuencias de aminoácidos que están indicados en las listas de secuencias y adicionalmente de forma preferente también a antígenos inmunógenos que son esencialmente iguales a las secuencias de aminoácidos de las listas de secuencias.
30 Los fragmentos o las subsecuencias adecuadas de las secuencias de aminoácidos de los antígenos habitualmente tienen una longitud de al menos 15 aminoácidos, preferentemente al menos 20 aminoácidos y más preferentemente al menos 25 aminoácidos. Para los ensayos se usan los fragmentos de los antígenos usados de acuerdo con la invención que presentan, al menos, un epítopo específico de especie diagnósticamente relevante. El experto habitual conoce distintos métodos para el cartografiado de antígenos. Mediante distintos métodos del mapeo
35 epitópico se puede determinar qué zonas son particularmente relevantes para el diagnóstico inmunológico. Los epítopos lineales se encuentran en secciones de aminoácidos cortas. Los epítopos conformacionales se producen debido a la configuración espacial del antígeno. Por tanto, los fragmentos preferidos que presentan epítopos conformacionales, por norma general, son más largos, habitualmente al menos 50 aminoácidos, preferentemente al menos 75 aminoácidos. No obstante, el experto habitual también sabe que solo algunos pocos aminoácidos
40 participan en el epítopo. Otros aminoácidos que se encuentran, por ejemplo, en el interior del antígeno pueden estar modificados, sin que esto cambie la importancia de diagnóstico del epítopo.
La expresión: "antígenos que son esencialmente iguales a las secuencias de aminoácidos de las listas de secuencias" en este caso comprende secuencias de aminoácidos en las que (por ejemplo, por mutación) de 1 a 20,
45 preferentemente de 1 a 15, más preferentemente de 1 a 10, de forma particularmente preferente de 1 a 5 y mucho más preferentemente de 1 a 3 aminoácidos se han sustituido, delecionado o añadido en comparación con las secuencias de las listas de secuencias.
El experto sabe que las propiedades antigénicas de una proteína o un polipéptido con frecuencia no cambian
50 cuando uno o algunos pocos aminoácidos cambian en puntos inmunológicamente no importantes. Por tanto, se pueden cambiar fácilmente aminoácidos cuando presentan un carácter similar o no influyen o no influyen considerablemente en la estructura terciaria de la proteína. Con frecuencia, por ejemplo, también una sustitución de Gly por Ala o a la inversa no influye en el carácter inmunológico.
55 En este caso son fragmentos o subsecuencias adecuadas o antígenos "esencialmente" iguales proteínas que presentan una selectividad frente a anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis. Preferentemente, durante la realización de un procedimiento de comprobación de acuerdo con la invención de acuerdo con los ejemplos con el uso de sueros de donantes de sangre positivos sin sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis en como máximo 3 de 6 personas, más preferentemente como máximo 2 de 6 personas y aún más preferentemente
60 como máximo 1 de 6 personas se produce un resultado de falso positivo.
Los antígenos se seleccionan del grupo compuesto por CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 o fragmentos de los mismos. Más preferentemente, los antígenos se seleccionan del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1 P, CT431, CT603-TSAP y CT664.
65 En una forma de realización preferente para la comprobación de enfermedades crónicas, los antígenos se seleccionan de forma particularmente preferente del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT603-TSAP y CT664. Aún más preferentes para la comprobación de enfermedades o infecciones crónicas son los antígenos del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P y CT664. Más preferentes son los antígenos:
5 CT603-TSAP y CT664.
La Tabla 1 muestra los antígenos de acuerdo con la invención con sus números de secuencia (SEC ID Nº), reproduciéndose las secuencias en la lista de secuencias.
10 Se seleccionan al menos tres, preferentemente al menos cuatro y más preferentemente al menos seis antígenos de los grupos que se han mencionado anteriormente de antígenos. En una forma de realización particularmente preferente se usa todo el grupo de los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis para el procedimiento de comprobación.
15 Adicionalmente a los antígenos que se han indicado anteriormente se pueden usar también otros antígenos específicos de Chlamydia trachomatis en el procedimiento de comprobación de acuerdo con la invención. En caso de que la detección de los complejos de antígeno/anticuerpo se realice de forma selectiva, adicionalmente y de forma simultánea se pueden usar también otros antígenos frente a otros patógenos en el mismo procedimiento de comprobación. Por ejemplo se pueden analizar los complejos de antígeno/anticuerpo de los distintos patógenos
20 debido a diferentes propiedades espectroscópicas uno al lado del otro.
Tabla 1. Antígenos de Chlamydia trachomatis (en el caso de los números de Genbank se trata de los números bajo los cuales se pueden encontrar los genomas completos de dos aislados de Chlamydia trachomatis. Hasta ahora no hay una entrada independiente para los genes individuales. Estos se diferencian mediante el número de la fase de
25 lectura abierta con CT antepuesto para Chlamydia trachomatis en el genoma total; sin embargo, son decisivas las listas de secuencias):
- Antígeno
- SEC ID Nº Número de Genbank
- CT017
- 1 NC000117
- CT098
- 2 NC000117
- CT318-L1P
- 3 CP000051
- CT431
- 4 NC000117
- CT456-TARP
- 5 NC000117
- C/603-TSAP
- 6 NC000117
- CT664
- 7 NC000117
La preparación de los antígenos se puede realizar mediante procedimientos conocidos. En particular, los antígenos
30 se pueden clonar y expresar de forma recombinante en vectores de expresión bacterianos. El experto conoce organismos adecuados para esto y estos comprenden, por ejemplo, la bacteria Escherichia coli. En el ejemplo 1 está descrita la preparación de los antígenos.
La comprobación de los anticuerpos se puede realizar, preferentemente, mediante inmunoensayos. En este caso se
35 pueden usar inmunoensayos directos o indirectos. Estos ensayos comprenden, sin embargo, sin limitación: ensayos de unión competitiva, ensayos de unión no competitiva, radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencia de Western, Ensayo de Línea, ensayos de tipo sándwich, reacciones de precipitación, ensayos de inmunodifusión de difusión en gel, ensayos de aglutinación, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de inmunoquimioluminiscencia, inmunoensayos de inmuno-PCR, inmunoensayos de
40 proteína A o proteína G e ensayos de inmunoelectroforesis.
Es particularmente ventajoso el uso de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia de Western o Ensayos de Línea, más preferentemente ELISA. Estos procedimientos se basan en interacciones de antígeno-anticuerpo, pudiéndose detectar el complejo que se produce de antígeno/anticuerpo mediante
45 procedimientos conocidos de comprobación. En este caso es particularmente preferente el uso de procedimientos de ELISA, transferencias de Western y Ensayos de Línea con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, realizándose la comprobación de la reacción de antígeno-anticuerpo a través de un sustrato colorante (TMB).
Son particularmente adecuados los procedimientos de ensayo de ELISA en los que los antígenos están unidos a
50 una fase sólida la mayoría de las veces de forma no covalente (interacciones hidrófobas) y se ponen en contacto con un líquido de muestra. Como fase sólida se puede usar, por ejemplo, una placa de microtitulación. La proteína (antígeno) puede interaccionar entonces con la fase sólida o con la superficie de la placa de microtitulación, habitualmente de poliestireno, por ejemplo, con un elevado valor de pH. Más preferentemente se usa un biochip como fase sólida.
El experto conoce sistemas de indicador para la comprobación de los complejos de antígeno/anticuerpo. Por
5 ejemplo, después de la formación del complejo de antígeno/anticuerpo se puede usar un segundo anticuerpo que reconoce la parte constante del primer anticuerpo o que se une de otro modo específicamente al complejo de antígeno/anticuerpo. El segundo anticuerpo o las uniones para la detección del complejo de antígeno/anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo, posee preferentemente una marca. Aún más preferentemente presenta una marca no radiactiva, tal como, por ejemplo, una marca enzimática, una marca fluorescente, una marca de emisión de luz, etc. De forma particularmente preferente presenta una marca enzimática tal como una fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o peroxidasa de rábano rusticano.
El segundo anticuerpo puede estar acoplado, por ejemplo, a una fosfatasa alcalina, catalizando la fosfatasa alcalina entonces una transformación enzimática de cromógeno. El cromógeno incoloro se hace reaccionar entonces hasta
15 dar un colorante y se mide. La cantidad de colorante liberado se correlaciona entonces con la cantidad del anticuerpo buscado. El experto conoce otros procedimientos de medición competitivos o no competitivos.
Además se pueden usar también compuestos o marcadores para la detección directa del complejo de antígeno/anticuerpo, tales como, por ejemplo, etiquetas radiactivas, fluorescentes, biológicas o enzimáticas. Es particularmente ventajoso que el complejo de antígeno/anticuerpo esté unido con el colorante y se pueda detectar el punto sobre la membrana en el que está aplicado el complejo de antígeno/anticuerpo con los antígenos de acuerdo con la invención. Esto posibilita la comprobación simultánea selectiva de diferentes patógenos de la enfermedad, por ejemplo, Chlamydia trachomatis o Chlamydia pneumoniae. Preferentemente, entonces, los resultados del ensayo se pueden evaluar ópticamente, indicando, por ejemplo, puntos con color la comprobación positiva de los patógenos de
25 la enfermedad, cuyos antígenos se colocaron en el punto. Además, se prefiere que los complejos de antígeno/anticuerpo detectables ópticamente se diferencien en cuanto al color o en su comportamiento de absorción de longitud de onda. De este modo, los complejos de antígeno/anticuerpo, adicionalmente o en lugar de un identificador espacial, se pueden caracterizar también por su comportamiento de absorción. Se prefiere el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, realizándose la comprobación de la reacción de antígenoanticuerpo a través de un sustrato colorante (TMB) o el uso de colorantes fluorescentes, tales como Cy3 o Cy5. Todos los procedimientos para la detección del complejo de antígeno/anticuerpo se pueden usar para los procedimientos tanto con como sin biochip o soporte sólido.
Otra forma de realización de la invención comprende un kit de ensayo para la comprobación selectiva de infecciones
35 por Chlamydia trachomatis. El kit de ensayo comprende los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis que se han indicado anteriormente. La cantidad descrita en otro punto de distintos antígenos específicos de Chlamydia trachomatis también es adecuada para el kit de ensayo. La realización del procedimiento y las técnicas para la detección de los complejos de antígeno/anticuerpo se pueden aplicar al kit de ensayo. En particular, el kit de ensayo adicionalmente puede contener las sustancias necesarias para la detección de los complejos de antígeno/anticuerpo.
Además, el kit de ensayo puede comprender adicionalmente otros componentes tales como tampón de lavado o composiciones que contienen un anticuerpo específico de Chlamydia trachomatis como patrón. Adicionalmente, el kit de ensayo puede comprender también una placa de microtitulación o un biochip, sobre el cual están
45 inmovilizados los anticuerpos. Además, el kit de ensayo puede contener también materiales informativos tales como, por ejemplo, una instrucción de uso que describe la preparación de las muestras y/o la especificación para la realización del ensayo.
Una forma de realización de la invención comprende un biochip sobre el cual están colocados los antígenos de acuerdo con la invención. La cantidad descrita en otro lugar de distintos antígenos específicos de Chlamydia trachomatis también es adecuada para el procedimiento con un biochip. La realización del procedimiento y las técnicas para la detección de los complejos antígeno/anticuerpo se pueden aplicar también al procedimiento con un biochip. En particular se pueden aplicar los antígenos sobre la membrana del biochip.
55 Para la membrana se pueden usar, por ejemplo, polímeros porosos de origen natural o sintéticos, vidrio, materiales cerámicos, materiales de celulosa o similares. Los materiales pueden fabricarse hasta dar una membrana, por ejemplo, a partir de películas, fibras o partículas (por ejemplo bolas que se mantienen juntas mediante materiales adhesivos o aglutinantes). De forma particularmente preferente, la membrana está compuesta de policarbonato, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poliamida, poliéster, polivinilidenfluoruro o nylon. Más preferentemente, la membrana está compuesta de nitrocelulosa. El término "nitrocelulosa" se refiere a celulosa de éster con grupos nitrato. El término "nitrocelulosa" además comprende celulosa de éster con grupos nitrato en solitario o con una mezcla de distintos ésteres que se generaron a partir de otros ácidos como ácido de nitración, en particular ácidos carbocíclicos alifáticos. La expresión "aplicado" se refiere a que los antígenos presentan una suficiente afinidad por la membrana o incluso están unidos químicamente con la misma, de tal manera que la aplicación del líquido de
65 muestra o de las soluciones de lavado y reacción eventualmente necesarias de forma adicional no conduce al desprendimiento de estos antígenos.
El procedimiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo del siguiente modo (véase también los ejemplos):
la primera etapa de la reacción de comprobación serológica es la inmovilización de los antígenos sobre el
5 soporte sólido o la fase sólida, por ejemplo, la membrana de nitrocelulosa, la placa de microtitulación o el biochip. En este caso, los antígenos de acuerdo con la invención o una selección del grupo de los antígenos de acuerdo con la invención se inmovilizan, por ejemplo, mediante interacciones hidrófobas en la superficie.
Después de una eventual etapa de lavado, los antígenos inmovilizados se ponen entonces en contacto con el líquido de la muestra. La preparación de las muestras se puede realizar según los procedimientos que se han descrito anteriormente y tal como se ha explicado en los ejemplos, sin embargo, no está limitada a esto. Mediante la interacción de antígeno/anticuerpo, los anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis del líquido de la muestra se unen a los antígenos de acuerdo con la invención. Se forman complejos de antígeno/anticuerpo.
15 Después de un tiempo adecuado de incubación se lava el soporte sólido y se libera de los residuos de la muestra. A continuación se pone en contacto una solución para la detección del complejo de antígeno/anticuerpo con los complejos de antígeno/anticuerpo, pudiéndose realizar una detección cuantitativa o cualitativa, por ejemplo, mediante espectroscopía. En este caso se puede realizar, por ejemplo, una medición automatizada de la profundidad de color del cromógeno.
En una forma de realización de la invención se evalúa el curso de la enfermedad de la infección por Chlamydia trachomatis. Para esta forma de realización del procedimiento se puede usar también el kit de ensayo de acuerdo con la invención o el biochip de acuerdo con la invención. Para esto se ensayan al menos dos, más preferentemente al menos tres, aún más preferentemente al menos cuatro y mucho más preferentemente al menos cinco muestras
25 del mismo paciente en diferentes momentos y se mide la presencia de Chlamydia trachomatis o la cantidad de los anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis. Este procedimiento puede incluir la recogida de datos a lo largo de un periodo determinado. Las muestras de los pacientes se pueden extraer en momentos regulares o irregulares, preferentemente regulares. La separación entre la extracción de dos muestras puede encontrarse entre una semana y doce meses, preferentemente entre dos semanas y cuatro meses y más preferentemente entre 4 y 6 semanas para seguir el aumento del título. Este procedimiento permite observar la progresión de la infección por Chlamydia trachomatis.
Ejemplo 1 – Identificación de los antígenos de acuerdo con la invención
35 La identificación y caracterización de los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis se llevó a cabo mediante electroforesis en gel 2D y espectrometría de masas.
Para esto, en primer lugar se preparó un banco de datos de expresión génica inducible para Chlamydia pneumoniae y Chlamydia trachomatis en Escherichia coli. Para esto se combinaron sueros de pacientes con infecciones por Chlamydia pneumoniae o Chlamydia trachomatis aseguradas de forma clínica y microbiológica y se pre-absorbieron frente a antígenos de clamidias expresados in vitro. Para esto se prepararon lisados de células HeLa229 infectadas por Chlamydia pneumoniae en diferentes momentos de la infección.
Después del análisis de gráfico de colonias con los sueros pre-absorbidos de este modo se aislaron los clones
45 reactivos y se secuenciaron los fragmentos de ADN clonados. Mediante comparación con las secuencias ya anotadas de Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae se pudo aclarar la identidad de los antígenos expresados in vivo.
Con detalle, la identificación de los antígenos se realizó del siguiente modo: Chlamydia trachomatis serovar D/UW3/Cx se cultivó en HeLa 229; 48-72 h después de la infección se recogieron y homogeneizaron las células. Se aisló Chlamydia trachomatis mediante posteriores etapas de centrifugación de los residuos celulares. Los cuerpos elementales obtenidos de Chlamydia trachomatis se lisaron con detergentes y se trataron con ultrasonidos. La primera etapa de la inmunoelectroforesis 2D se llevó a cabo con tiras Ready IPG, pH 3-10, 11 cm (BioRad); a continuación se llevó a cabo una SDS-PAGE con un gel de poliacrilamida al 10 %. Los geles se transfirieron para
55 transferencia de Western o se tiñeron con azul brillante de Commassie para el análisis de nanoCL-IEN-EMEM. Las transferencias de Western se realizaron con sueros de pacientes con un cuadro clínico de una infección crónica por Chlamydia trachomatis con una dilución de 1: 125. Se recortaron puntos reactivos de los geles teñidos y secados de la inmunoelectroforesis 2D y se analizaron con el procedimiento de nanoCL-IEN-EMEM. A este respecto las proteínas se digirieron en los puntos con tripsina, se desalinizaron y se concentraron. El análisis de nanoCL-IEN-EMEM se llevó a cabo con el aparato Esquire 3000 plus (Bruker Daltronics). Las proteínas se identificaron mediante búsqueda de iones por EM/EM (Matrix Science) y las secuencias se compararon con bancos de datos de acceso público.
Las secuencias genómicas de todos los antígenos se amplificaron mediante PCR y oligodesoxinucleótidos
65 específicos como cebadores del ADN genómico de Chlamydia trachomatis y los amplificados se purificaron. Los amplificados purificados se escindieron con endonucleasas de restricción adecuadas, cuyas secuencias de escisión estaban contenidas en los cebadores de PCR, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligaron en los vectores pUC8 o pDS1 que se habían escindido con las mismas endonucleasas de restricción. Se transformaron Escherichia coli competentes con los productos de ligación. Los clones positivos se aislaron y se caracterizaron mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN. La expresión de los antígenos se realizó en
5 Escherichia coli. La expresión de los antígenos se comprobó en SDS-PAGE con tinción con azul brillante de Commassie así como en transferencia de Western con sueros humanos específicos de pacientes con anticuerpos contra Chlamydia trachomatis. A continuación se purificaron los antígenos mediante métodos cromatográficos.
La Tabla 2 muestra los datos de clones de los antígenos de Chlamydia trachomatis. 10 Tabla 2. Datos de clones de antígenos de Chlamydia trachomatis:
- Antígeno
- Vector ER Inserción [pb] teoría [kDa] Expresión [kDa] Expresión [Cantidad]
- CT017
- pDS1 BamHI-PstI 58-1299 46 48 +++
- CT098
- pDS1 SalI-PstI 1-1707 64 66 ++
- CT318-L1P
- pDS1 BamHI-SalI 1-696 26 24 +++
- CT431
- pUC8 BamHI-PstI 1-534 20 21 ++
- CT456-TARP
- pDS1 BamHI-SalI 1-3015 113 >100 ++
- CT603-TSAP
- pDS1 BamHI-PstI 1-585 22 23 +++
- CT664
- pDS1 BamHI-Xho/ SalI* 1-2487 93 ∼100 +
Se verificó la serorreactividad de las proteínas expresadas recombinantes con los mismos sueros específicos que se emplearon para la identificación.
15 Para proteínas recombinantes individuales se llevó a cabo una caracterización de epítopos para identificar y delimitar epítopos específicos de especie. Esto se realizó mediante subclonación de subfragmentos individuales y análisis de la serorreactividad en transferencia de Western o mediante péptidos preparados en síntesis en fase sólida y análisis de la serorreactividad en Ensayo de Línea dependiendo de las homologías de secuencia. La
20 serorreactividad de los antígenos identificados y los subfragmentos o péptidos específicos de especie, después, se analizó en el Ensayo de Línea para encontrar una combinación óptima de los antígenos recombinantes que posibilite, por un lado, una diferenciación entre especies exacta, por otro lado, una diferenciación entre infecciones activas y finalizadas por clamidias.
25 Para comprobar que aparecen anticuerpos humanos contra los antígenos CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664, en particular con infecciones crónicas por Chlamydia trachomatis, se compararon los sueros de 24 pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por Chlamydia trachomatis así como 6 sueros de donantes sanos de sangre con anticuerpos contra Chlamydia trachomatis, pero sin sospecha de una infección crónica por Chlamydia trachomatis.
30 Los resultados se compararon con los antígenos que ya se han descrito MOMP, OMP2, Hsp60 y MIP de recomLine de clamidia y con 4 antígenos adicionales ya descritos como serológicamente relevantes (CT089, CT795, CT813 y CT858-CPAF). Los resultados están resumidos en la Tabla 3. A este respecto, se ve que los antígenos CT017, CT089, CT318-L1P, CT431, CT603-TSAP y CT664 reaccionan particularmente con sueros de pacientes con
35 sospecha clínica de una infección crónica por Chlamydia trachomatis (CT017 con el 45,8 %; CT096 con el 66,7 %; CT318 con el 58,3 %; CT431 con el 29,2 %; CT603 con el 25,0 %; CT664 con el 50,0 %), sin embargo, apenas con los sueros de los donantes sanos de sangre con anticuerpos contra Chlamydia trachomatis, pero sin sospecha de una infección crónica (CT017 con el 16,7 %; CT096 con el 16,7 %; CT318 con el 16,7 %; CT431 con el 16,7 %; CT603 con el 0,0 %; CT664 con el 0,0 %). A diferencia de esto, los antígenos ya conocidos MOMP, OMP2, Hsp60 y
40 MIP son menos adecuados para diferenciar entre pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por Chlamydia trachomatis (MOMP con el 91,7 %, OMP2 con el 79,2 %; HSP60 con el 54,2 %; MIP con el 62,5 %; CT089 con el 70,8 %; CT795 con el 87,5 %; CT813 con el 95,8 %; CT858 con el 37,5 %) y donantes sanos de sangre con anticuerpos contra Chlamydia trachomatis, pero sin sospecha de una infección crónica por Chlamydia trachomatis (MOMP con el 100,0 %; OMP2 con el 83,3 %; HSP60 con el 66,7 %; MIP con el 66,7 %; CT089 con el
45 33,3 %; CT795 con el 50,0 %; CT813 con el 100,0 %; CT858 con el 33,3 %). Los resultados ventajosos sorprendentes de los antígenos de acuerdo con la invención, por tanto, se obtienen a partir de una comparación de las columnas derecha y central de la Tabla 3.
Solamente 3 antígenos consiguieron, en todas las muestras seropositivas para Chlamydia trachomatis de ambos 50 grupos, una sensibilidad muy alta de al menos el 90 % con respecto a todas las muestras (CT456-TARP con el 90,0 %; MOMP con el 93,3 %; CT813 con el 96,7 %). El valor se calcula, por ejemplo, para CT456-TARP del siguiente modo: 22 + 5 = 27 dividido por 24 + 6 = 30 - 90 %. No obstante, tanto MOMP como CT813 reaccionaron más frecuentemente con los sueros de los donantes sanos de sangre con anticuerpos contra Chlamydia trachomatis, pero sin sospecha de una infección crónica (CT813 con el 100,0 %; MOMP con el 100,0 %; en comparación CT456
5 TARP con el 83,3 %) que con sueros de pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por Chlamydia trachomatis (CT813 con el 95,8 %; MOMP con el 91,7 %; CT456-TARP también con el 95,8 %). Esto significa que CT456-TARP presenta una mejor especificidad por sueros de pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por Chlamydia trachomatis que los antígenos ya conocidos MOMP y CT813.
10 Los antígenos CT431, CT603 y CT664, adicionalmente, tienen una menor reactividad cruzada con Chlamydophila pneumoniae que todos los demás antígenos ya conocidos.
La aplicación de diagnóstico de los antígenos CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664, con ello, posibilita una diferenciación claramente mejor entre pacientes con sospecha clínica de una
15 infección crónica por Chlamydia trachomatis y personas de ensayo sanas, pero seropositivas, de lo que es el caso con los antígenos conocidos actualmente.
Tabla 3. Caracterización serológica de los antígenos de Chlamydia trachomatis de acuerdo con la invención
- Antígeno
- Sueros positivos para C. pneumoniae sin sospecha de una infección por C. trachomatis n=20 Sueros de pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis n=24 Sueros de donantes de sangre positivos a C. trachomatis sin sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis n = 6
- n
- % n % n %
- CT017
- 4 20,0 11 45,8 1 16,7
- CT098
- 1 5,0 16 66,7 1 16,7
- CT318
- 4 20,0 14 58,3 1 16,7
- CT431
- 0 0,0 7 29,2 1 16,7
- CT456
- 3 15,0 22 91,7 5 83,3
- CT603
- 0 0,0 6 25,0 0 0,0
- CT664
- 0 0,0 12 50,0 0 0,0
- MOMP
- 1 5,0 22 91,7 6 100,0
- OMP2
- 2 10,0 19 79,2 5 83,3
- HSP60
- 3 15,0 13 54,2 4 66,7
- MIP
- 3 15,0 15 62,5 4 66,7
- CT089
- 3 15,0 17 70,8 2 33,3
- CT795
- 2 10,0 21 87,5 3 50,0
- CT813
- 7 35,0 23 95,8 6 100,0
- CT858
- 1 5,0 9 37,5 2 33,3
Ejemplo 2 – Realización del procedimiento de ensayo
La expresión de los antígenos se realizó en Escherichia coli, cultivada en matraces de agitación o en un fermentador. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se lisaron mediante detergentes y tratamiento
25 con ultrasonidos. Después, los antígenos estaban presentes en parte en "cuerpos de inclusión" o de forma soluble. Los antígenos existentes en "cuerpos de inclusión" se solubilizaron con urea.
A continuación se purificaron paso a paso los antígenos con métodos cromatográficos, particularmente intercambio aniónico y catiónico. Los antígenos purificados se aplicaron en diluciones halladas empíricamente sobre un gel de poliacrilamida y se separaron por tamaño en el campo eléctrico. Después de la electroforesis en gel se transfirieron los antígenos en el campo eléctrico sobre una membrana de nitrocelulosa y, de este modo, se inmovilizaron sobre la membrana.
5 Sin embargo, la aplicación sobre la membrana se puede realizar también directamente mediante pulverización sobre la membrana de nitrocelulosa de diluciones establecidas empíricamente de los antígenos purificados. Las membranas se trataron después de la transferencia con una solución que contenía proteínas para saturar los puntos de unión a proteína todavía no ocupados sobre la membrana de nitrocelulosa.
10 A continuación se secaron las membranas y se cortaron en tiras. Respectivamente una tira, a continuación, se incubó con un suero humano en una dilución de 1:250 durante una noche a temperatura ambiente con agitación suave. A este respecto, los anticuerpos en el suero del paciente se unen a los antígenos inmovilizados sobre la membrana de nitrocelulosa.
15 A continuación, las tiras de membrana de nitrocelulosa se lavaron 3 x y después se incubaron durante 60 min con un anticuerpo secundario que estaba conjugado con peroxidasa de rábano rusticano.
A continuación se lavaron nuevamente 3 x las tiras de membrana de nitrocelulosa y después se trataron con una solución de TMB (tetrametilbencidina). En los puntos en los que estaban inmovilizados los antígenos que habían
20 reaccionado con los anticuerpos del paciente se produjo después una precipitación de color sobre las tiras de membrana de nitrocelulosa. A continuación se secaron las tiras y se analizaron las tinciones (Tabla 3).
Ejemplo 3 – Reactividad de subsecuencias
25 En total se seleccionaron 22 péptidos de, respectivamente, 20 aminoácidos de las secuencias de los antígenos, se sintetizaron y se ensayaron en dos experimentos en ELISA (adsorción directa de los péptidos a la placa de microtitulación o unión covalente a la placa de microtitulación) con sueros positivos a Chlamydia trachomatis. Las secuencias de los péptidos, las posiciones en las proteínas totales y los resultados están resumidos en la Tabla 4. Por antígeno ha reaccionado, respectivamente, al menos uno de estos péptidos con al menos un suero.
Tabla 4
- SEC ID Nº
- Péptido Posición Secuencia Unión por absorción (n =5) Unión covalente *) (n = 5)
- 8
- CT017-1 P262 -V281 PAVEETPVVTKTEEQKVTTV 0 1
- 9
- CT017-2 M348 -E367 MESFYRDEQKKKRVLTGELE 0 n. d.
- 10
- CT017-3 V368 -D387 VYPHIVKNNPGDYLLKNGED 0 1
- 11
- CT098-1 S162 -E181 SQIDNKKIKNLDDYVGKVCE 1 0
- 12
- CT098-2 T252 -V271 TWKRIRHPSEMVELNQELEV 0 2
- 13
- CT098-3 Q289 -V308 QKEHNPWEDIEKKYPPGKRV 0 1
- 14
- CT098-4 F550 -D570 FLVHGGDAGHDAEEESSDRD 0 2
- 15
- CT318-1 M001 -S020 MTKHGKRIRGIQETYDLAKS 1 1
- 16
- CT318-2 I050 - T069 IDPRKSDQQIRGSVSLPHGT 0 0
- 17
- CT318-3 P138 -R157 PTPKAGTVTTDVVKTVAELR 0 0
- 18
- CT431-1 E005 - I024 EMMHKLQDVIDRKLLDSRRI 0 0
- 19
- CT431-2 A101 -S120 AVPGRRFATPHARIMIHQPS 1 3
- 20
- CT431-3 E152 -M171 EATGQSREVIEKAIDRDMWM 1 n. d.
- 21
- CT-456-1 T103 - I122 TSPDTSESSETSSTSSSDHI 3 n. d.
- 22
- CT-456-2 S273 -A292 SIGGSRTSGPENTSDGAAAA 1 0
- 23
- CT-456-3 S454 -D473 SQEASSGYTPSAWRRGHRVD 1 2
- 24
- CT-456-4 1569 -A588 INTNNQTDDINTTDKDSDGA 0 n. d.
- 25
- CT-456-5 T598 -N617 TESSSGDDSGSVSSSESDKN 0 3
- 26
- CT-456-6 S721 -T740 SSGDESGGVSSPSSESNKNT 0 n. d.
- 27
- CT603-1 G006 - I025 GRQAPDFSGKAVVCGEEKEI 0 n. d.
- 28
- CT603-2 A087 -F106 ARNAGGIEGTEYPLLADPSF 0 3
- 29
- CT603-3 N172 -F191 NWRSGERGMVPSEEGLKEYF 0 n. d.
- *) En la unión covalente no se pudieron ensayar todos los péptidos, ya que algunos se pudieron disolver solo en urea 8 M, sin embargo, la urea altera la unión covalente.
Ejemplo 4 – Caracterización serológica de los antígenos de C. trachomatis: sueros reactivos con los antígenos
5 Se ensayaron distintos sueros con un Ensayo de Línea para clamidias y los resultados de los antígenos se compararon con los nuevos antígenos. A este respecto se mostró que todos los nuevos antígenos posibilitan una mejor discriminación entre sueros de pacientes con infecciones clínicamente relevantes por Chlamydia trachomatis en comparación con sueros de donantes de sangre seropositivos, sin embargo, clínicamente inaparentes. Los resultados están resumidos en la Tabla 5.
10 Los resultados reproducidos en la Tabla 5 se corresponden sustancialmente con los resultados de la Tabla 3, sin embargo, se forma un cociente de los valores individuales que aclara la fuerza informativa de los antígenos.
- Antígeno
- Sueros positivos a C. pneumoniae sin sospecha de una infección por C. trachomatis n=20 Sueros de pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis n=24 Sueros de donantes de sangre positivos a C. trachomatis sin sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis n = 6 Especificidad para infecciones clínicamente relevantes
- N
- % n % N % %
- CT017
- 4 20,0 11 45,8 1 16,7 73,3
- CT098
- 1 5,0 16 66,7 1 16,7 80,0
- CT318
- 4 20,0 14 58,3 1 16,7 77,8
- CT431
- 0 0,0 7 29,2 1 16,7 63,6
- CT456
- 3 15,0 22 91,7 5 83,3 52,4
- CT603
- 0 0,0 6 25,0 0 0,0 100,0
- MOMP*
- 1 5,0 22 91,7 6 100,0 47,8
- OMP2*
- 2 10,0 19 79,2 5 83,3 48,7
- HSP60*
- 3 15,0 13 54,2 4 66,7 44,8
- MIP*
- 3 15,0 15 62,5 4 66,7 48,4
- * Los antígenos MOMP, OMP2, HSP60 y MIP se usan en el recomLine de clamidia y son conocidos por el estado de la técnica.
La especificidad de infecciones clínicamente relevantes se calculó como cociente del porcentaje de los sueros reconocidos de pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis así como la suma de los porcentajes de los sueros reconocidos de pacientes con sospecha clínica de una infección crónica por C.
20 trachomatis y los sueros de donantes de sangre positivos a C. trachomatis sin sospecha clínica de una infección crónica por C. trachomatis. A este respecto, todos los nuevos antígenos tienen una mayor especificidad para infecciones clínicamente relevantes (>50 % en comparación con <50 % para los antígenos ya conocidos) que los antígenos ya conocidos usados en el recomLine de clamidia.
Los antígenos CT431 y CT603 tienen, adicionalmente, una menor reactividad cruzada con C. pneumoniae que todos los antígenos ya conocidos.
Los antígenos se aplicaron mediante un procedimiento de dispensación sin contacto AD3050, Biodot) sobre un chip de plástico de aproximadamente 1 cm2 de tamaño que está compuesto, por ejemplo, de policarbonato o poliestireno con superficie correspondientemente activada. La separación entre los puntos de antígeno individuales asciende a 1,125 mm. En total se pueden aplicar hasta 99 antígenos sobre el biochip. Como antígenos se aplican sobre el biochip los antígenos CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 de Chlamydia trachomatis. Adicionalmente se pueden aplicar sobre el biochip antígenos, por ejemplo, de Chlamydia pneumoniae y Chlamydia psittaci para aclarar el estado de infecciones por clamidias patógenas para los seres humanos.
15 Además se pueden aplicar adicionalmente, por ejemplo, también antígenos de las bacterias Yersinia enterolitica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Streptococcus pyogenes, los virus parvovirus B19 y virus de Epstein-Barr así como de antígenos autoinmunitarios humanos para diagnosticar artritis reactiva o dependiente de infección y delimitar la misma de enfermedades autoinmunitarias. Además se pueden aplicar para otras cuestiones otros antígenos o combinaciones de los mismos con otros antígenos sobre el biochip.
El biochip se introduce en un cartucho de plástico. El cartucho de plástico forma un sistema cerrado con los componentes: cuerpos de cartucho con recipiente de suero y canales microfluídicos, chip de plástico con antígenos inmovilizados, lámina de cubrición para el sellado del cartucho y tabique elástico para el acoplamiento fluídico a un
25 procesador de ensayo que bombea las soluciones de reactivo requeridas, tales como tampón, conjugados de colorantes fluorescente y medios de acondicionamiento, al cartucho del biochip.
En la primera etapa del desarrollo del ensayo se carga el recipiente de suero del cartucho con suero diluido y el cartucho con el biochip integrado se introduce en el procesador de ensayo y se aspira el suero uniformemente a través de la serie de puntos. Después de la incubación del suero se realiza la reacción de los anticuerpos unidos con los conjugados de colorante fluorescente. Tanto después de la incubación del suero como del conjugado un ciclo de enjuagado sirve para la retirada de los restos no unidos de suero o de conjugado. A continuación se evalúa cuantitativamente la fluorescencia en un lector de fluorescencia mediante espectroscopía de fluorescencia. Mediante el uso de conjugados de colorante con diferentes inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG anti-ser humano e IgM anti-ser
35 humano se pueden comprobar cuantitativamente diferentes clases de inmunoglobulinas que están presentes en diferentes estadios de la infección en diferentes cantidades.
Ejemplo 6 – Realización del procedimiento de ensayo con un biochip
El procedimiento de ensayo de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo también mediante el uso de un biochip. La realización del procedimiento se realiza de forma análoga al ejemplo 2, realizándose la inmovilización de los antígenos sobre un biochip.
A este respecto, la superficie del biochip sobre la cual se inmovilizan los antígenos puede estar compuesta de una
45 membrana de nitrocelulosa, sin embargo, también de plástico activado (por ejemplo, poliestireno, policarbonato, cerámica) o vidrio activado. Los antígenos se pueden pulverizar con un aparato de dispensación, por ejemplo, BioDot AD3050 automáticamente de forma directa sobre la superficie del biochip.
Después de la inmovilización de los antígenos sobre el biochip, los biochips se tratan con una solución que contiene proteínas para saturar los puntos de unión a proteína todavía no ocupados sobre la superficie del biochip. El procedimiento de ensayo adicional se realiza de forma análoga al procesamiento de las tiras de membrana de nitrocelulosa, tal como se ha descrito en el ejemplo 2.
La comprobación de la reacción antígeno-anticuerpo se puede realizar adicionalmente a la coloración con un
55 anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y el sustrato colorante TMB también con un anticuerpo secundario al cual está conjugado un colorante fluorescente. Entonces se puede determinar la fluorescencia en un detector de fluorescencia, por ejemplo, Tecan LS 200.
<110> MIKROGEN molekularbiologische Entwicklungs-GmbH
<120> Procedimiento, kit de ensayo y biochip para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis
<130> MIKROGEN
<160> 29
<170> PatentIn versión 3.5
5 <210> 1
<211> 433
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis 10 <400> 1
<210> 2
<211> 569
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 2
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 3
<210> 4
<211> 192
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 4
<210> 5
<211> 1005
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 5
<210> 6
<211> 195
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 6
<210> 7
<211> 829
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 7
<210> 8
<211> 20
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> péptido 10
<400> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> PRT 10 <213> artificial
<220>
<223> péptido
15 <400> 10
<210> 11 20 <211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<400> 11 25
<210> 12
<211> 20 30 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> péptido 35
<400> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
45 <220>
<223> péptido
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> PRT 10 <213> artificial
<220>
<223> péptido
15 <400> 14
<210> 15 20 <211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220> 25 <223> péptido
<400> 15
30 <210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
35 <220>
<223> péptido
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> péptido
<400> 17
<210> 18
<211> 20 10 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> péptido 15
<400> 18
20 <210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
25 <220>
<223> péptido
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> PRT 35 <213> artificial
<220>
<223> péptido
40 <400> 20
<210> 21 45 <211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> péptido
<400> 21
- 10
- <210> 22
- <211> 20
- <212> PRT
- <213> artificial
- 15
- <220>
- <223> péptido
- <400> 22
- 20
<210> 23
<211> 20 25 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> péptido 30
<400> 23
35 <210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
40 <220>
<223> péptido
<400> 24
<210> 25
<211> 20
5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> péptido 10
<400> 25
15 <210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> péptido
<400> 26
<210> 27
<211> 20
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> péptido
35 <400> 27
<210> 28 40 <211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220> 45 <223> péptido
<400> 28
5 <210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<223> péptido
<400> 29
Claims (9)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis y para la averiguación de si se trata de una infección aguda por Chlamydia pneumoniae o de una infección crónica por Chlamydia trachomatis5 o de una infección aguda por Chlamydia trachomatis, caracterizado por que se usan al menos tres antígenos para la comprobación de anticuerpos en muestras, estando seleccionados los antígenos del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 así como de fragmentos y subsecuencias de los anteriores antígenos, presentando los fragmentos al menos 15 aminoácidos consecutivos de los antígenos y al menos un epítopo específico de especie diagnósticamente relevante.
- 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que se usan al menos cuatro antígenos para el procedimiento.
- 3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el procedimiento 15 para la detección de los anticuerpos comprende la comprobación de un complejo de antígeno/anticuerpo.
- 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el procedimiento para la detección de los anticuerpos se realiza mediante un procedimiento de ensayo de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), transferencias de Western o Ensayos de Línea.
- 5. Procedimiento para el análisis del curso de la enfermedad in vitro de una infección por Chlamydia trachomatis, caracterizado por que en determinados intervalos de tiempo se toman muestras de un paciente y las muestras se examinan según el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores.25 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las muestras a examinar se someten a una lisis celular antes de ponerse en contacto con los antígenos.
- 7. Kit de ensayo para la comprobación selectiva de infecciones por Chlamydia trachomatis, caracterizado por queel kit de ensayo contiene al menos tres antígenos seleccionados del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT31830 L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664.
- 8. Biochip, caracterizado por que presenta al menos tres antígenos seleccionados del grupo compuesto por: CT017, CT098, CT318-L1P, CT431, CT456-TARP, CT603-TSAP y CT664 para la comprobación de anticuerpos específicos de Chlamydia trachomatis.
- 9. Biochip de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis están aplicados sobre un punto de la membrana del biochip que está separado espacialmente de otros puntos sobre la membrana, sobre los cuales están aplicados otros antígenos.40 10. Biochip de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, caracterizado por que, separados espacialmente de los antígenos específicos de Chlamydia trachomatis, están aplicados otros antígenos sobre la membrana que posibilitan una comprobación específica de Chlamydia pneumoniae o Chlamydia psittaci.
- 11. Uso de un antígeno para el diagnóstico diferencial de una infección por clamidias, concretamente para la45 averiguación de si se trata de una infección aguda por Chlamydia pneumoniae, una infección crónica por Chlamydia trachomatis o una infección aguda por Chlamydia trachomatis, caracterizado por que el antígeno se selecciona de CT456-TARP así como subsecuencias de este antígeno que presentan al menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia con la SEC ID Nº: 5 y al menos un epítopo específico de especie diagnósticamente relevante.
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