ES2414279B2 - Procedimiento para la producción de péptidos y aminoácidos mediante hidrólisis ácida y básica en paralelo - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de péptidos y aminoácidos mediante hidrólisis ácida y básica en paralelo a partir de hemoglobina purificada, procedente de animales. Posteriormente, el medio ácido y básico se mezclan para detener las reacciones, y los productos obtenidos (péptidos y aminoácidos) son purificados. La invención tiene por objeto proporcionar un procedimiento adecuado para subsanar la pérdida de aminoácidos que tiene lugar cuando la hemoglobina es hidrolizada empleando únicamente ácidos o álcalis de forma independiente, a la vez que se consigue un importante ahorro de reactivos, ya que tanto los ácidos como los álcalis son empleados como agentes de hidrólisis y neutralizantes.#De aplicación en los sectores de la agricultura, química y farmacia, medioambiental o alimentario, y en particular en aquellas industrias agroalimentarias o cárnicas que generan un exceso de sangre y que requieren un método eficiente para el post-procesado de subproductos.
Description
- tROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE PÉPTIDOS y AMINOÁCIDOS MEDIANTE HIDRÓLISIS ÁCIDA Y BÁSICA EN PARALELO
- S 10
- La invención se refiere a un procedimiento para la producción de péptidos y aminoácidos a partir de hemoglobina purificada, procedente de animales, empleando para ello ácidos minerales y álcalis en un proceso de hidrólisis paralela. Posterionnente, el medio ácido y básico se mezclan para detener las reacciones, y los productos obtenidos (péptidos y aminoácidos) son purificados. La invención tiene por objeto proporcionar un procedimiento adecuado para subsanar la pérdida de aminoácidos que tiene lugar cuando la hemoglobina es hidrolizada empleando únicamente ácidos o álcalis de fonna independiente, a la vez que se consigue un importante ahorro de reactivos, ya que tanto los ácidos como los álcalis son empleados como agentes de hidrólisis y neutralizantes.
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- La invención resulta de aplicación en la obtención de péptidos y aminoácidos a partir de hemoglobina purificada, principalmente en los sectores de la agricultura, química y fannacia, medioambiental o alimentario, y en particular en aquellas industrias agroalimentarias o cárnicas que generan un exceso de sangre y que requieren un método eficiente para el post-procesado de subproductos.
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- ESTADO DE LA TÉCNICA
- En la actualidad~ la hemoglobina purificada puede ser hjdrolizada siguiendo procesos enzimáticos, hidrólisis química ácida (con ácidos orgánicos o minerales), hidrólisis química básica o hidrólisis a muy altas presiones y temperaturas.
- 25 30
- En el caso de las reacciones enzimáticas, se obtienen péptidos de manera predecible en cuanto a tamaño y secuencia sin pérdidas por degradación de aminoácidos; sin embargo, la concentración de proteína que puede ser tratada suele situarse habitualmente en un máximo de 5-50 giL. (Yike v., Jianen H., Xuefeng B., Yuguang D. & Bingcheng L. Preparation and function of oligopeptide-enriched hydrolysate from globin by pepsin. Process Biochem., 2006, 41, 1589-1593; Tauzin, J., Mielo, L., Roth, S., Mollé, D. & Gaillard, J.-L. Tryptic hydrolysis of bovine aS2
casein: identification and release kinetics of peptides. Int. Dairy J., 2003, 13, 15-27; Su, R.-X., Qi, W. & He, Z.-M. Time-dependent nature peptic hydrolysis of native bovine hemoglobin. Eur. Food Research Tech., 2007, 225, 637-647). Además, es necesario un control muy estricto y continuo del pH del medio, el cual varía constantemente a medida que la hidrólisis avanza. La temperatura es otro parámetro esencial, debido a que s6lo dentro de un margen estrecho de valores de temperatura se obtienen buenos rendimientos de hidrólisis. Una vez finalizada la reacción, la enzima empleada debe ser neutralizada en un paso posterior del proceso.
Cuando se emplean altas presiones y altas temperaturas, el producto final está compuesto principalmente por aminoácidos y por productos de degradación, como ácidos orgánicos y amoniaco (Rogalinski, T., Herrmann, S., Brunner, G., Production of amino acids from bovine serum albumin by continuous sub~critical water hydrolysis. Journal of Supercritical Fluids, 2005, 36: 49~58.), Con las condiciones de trabajo que se emplean habitualmente (15-27 MPa y 250-300 "C), no es posible obtener péptidos de alto O bajo peso molecular. Además la tasa de lransfonnación de proteína en aminoácidos se sitúa en tomo al 65% (Esteban, M. B.; Garcia, A. J.; Ramos, P.~ Márquez, M. C. Subcritical water hydrolysis of hog hair for amino acid production. Bioresour. Technol. 2010, 101,2472-2476; Rogalinski, T.; Herrmann, S.; Brunner, G. Production of aminoacids from bovine serum albumin by continuous subcritical water hydrolysis. 1. Supercrit. Fluids 2005, 36, 49-58; Xian, Z.; Chao, Z.; Liang, Z.; Cheng, H. Amino acids production from fish proteins hydrolysis in suhcritical water. Chino J. Chem. Eng. 2008, 16,456-460).
En el caso de emplearse ácidos como agentes hidrolizantes, se produce una degradación de ciertos aminoácidos: asparagina y glutamina son transfonnados en ácido aspártico y glutámico, mientras que el triptófano y la cisteína se destruyen por completo (Fountoulakis M., Hans~Wemer L. Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins. Journal ofChromatography A, 1998, 826, 109-\34).
En el segundo caso, cuando se emplea una base para hidrolizar proteínas, se causa la pérdida por degradación de serina, treonina, arginina y cisteína; y la asparagina y la glutamina son convertidas de igual modo en aspartato y glutamato (Ravindran, G. & Bryden, W.L. Tryptophan detennination in proteins and feedstuffs by ion exchange chromatography. Food Chemistry, 2004, 89, 309-3\4). Las cantidades procesadas y el control de los parámetros de la reacción son iguales que en el caso anterior. La pérdida de aminoácidos es un grave inconveniente, ya que algunos de ellos son esenciales y su carencia disminuye el valor nutricional del hidrolizado obtenido.
Como ventajas, los métodos químicos no precisan un control del pH y el rango de temperaturas a las que se aplica es mucho más amplio. Además, pueden procesarse hasta 500 giL de sustrato (US 2.657.232 A; US 4.874.893 A).
Habitualmente estos procesos químicos son empleados para la hidrólisis completa de las proteínas hasta obtener aminoácidos libres, nunca para la producción de péptidos con un tamaño final predecible. Un proceso que permita obtener péptidos con un tamaño predecible es significativo debido a que el tamaño de los mismos determina sus propiedades funcionales y antioxidantes. Por tanto, un método que permita determinar el tamaño final del hidrolizado es importante para conocer sus propiedades finales. Se sabe que péptidos de más de 2 kDa presentan muy buenas propiedades funcionales, mientras que los de menos de 1 kDa son muy buenos antioxidantes (Clemente, A., 2000, Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. Trends in Food Science and Technology, \\, 254-262; Suetsuna, K., Ukeda, H., & Ochi, H.,2000, ¡solation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein. The Joumal ofNutrition Biochemistry, 11(3), 128-131; Moure, A., Domínguez, H., & Parajo, J.C., 2006, Antioxidant properties of ultrafiltration-recovered soy protein fractions from industrial effiuents and their hydrolysates. Process Biochemistry. 41, 447-456). Una vez finalizado el proceso, el ácido debe ser neutralizado empleando álcalis o por dilución en agua, y lo mismo ocurre cuando se emplea álcali como hidrolizante, lo que incrementa notablemente la complejidad y el coste del proceso.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un proceso para la producción de péptidos y aminoácidos libres a partir de hemoglobina purificada, mediante la aplicación de
ácidos y álcalis como agentes hidrolizantes de fonna paralela, con una neutralización y purificación posterior de los productos obtenidos.
A los efectos de la presente invención y su descripción, se entiende por hidrólisis la ruptura ocurrida en un enlace peptídico mediante la acción de un agente hidrolizante, bien sea un ácido o un álcali. A los efectos de la presente invención y su descripción, se entiende por agente hidroJizante a los ácidos o álcalis añadidos a la disolución de proteínas que ocasionan la ruptura del enlace peptídico.
El procedimiento objeto de la invención para la producción de péptidos y aminoácidos a partir de hemoglobina comprende las siguientes etapas:
al Adición de ácido y álcali a dos disoluciones de hemoglobina purificada hasta alcanzar una concentración de 6 M de cada uno de los agentes hidrolizantes. Calentar estas mezclas hasta una temperatura entre los 50 y los 120 oC y mantenerlas en agitación constante durante un tiempo de agitación de entre 6 y 24 horas, dependiendo de la temperatura empleada. Preferentemente, la temperatura se fija en el valor adecuado bien sea para producir péptidos (50 oC), mezcla de péptidos y aminoácidos (80 OC) o solo aminoácidos (110 OC). Se deja transcurrir la reacción durante un periodo de tiempo tal que es de 24 horas cuando se emplean 50 oC y 110°C y de 6 horas cuando se emplean 80 oC.
b) Mezclar las disoluciones ácida y básica al término de la hidrólisis hasta alcanzar un pH entre 1 y 2.
e) Enfriar la mezcla hasta temperatura ambiente. A los efectos de la presente invención y su descripción, el término "temperatura ambiente" debe interpretarse como la temperatura que se puede medir con un termómetro y que se toma del ambiente actual.
d) Separar la fracción sólida (rica en péptidos) y la fracción liquida (rica en aminoácidos) mediante centrifugación o filtración. El producto una vez alcanza la temperatura ambiente es filtrado y se obtiene así un penneado rico en sales disueltas (como por ejemplo sulfato sódico) y en aminoácidos libres; y un retenido que contiene los péptidos y sal
- s
- e) f) precipitada. Esto es debido a que los péptidos son insolubles a este bajo pH, cosa que no les ocurre a los aminoácidos. Eliminar las sales en la fracción sólida o retenido mediante lavados con agua ácida o destilada, eliminar las sales en la fracción líquida o permeado mediante su precipitación con etanol y purificar ambas fracciones mediante filtración, decantación o centrifugación. Eliminar el exceso de agua mediante secado.
- 10
- En una realización preferida, la hemoglobina empleada procede de un animal. En una realización más preferida, el animal es del tipo porcino, vacuno, ovino, caprino, aviar o equino. Aún más preferidamente la hemoglobina se obtiene de la sangre de animales sacrificados en macelos.
- En otra realización preferida, una vez agregado el ácido o el álcali en la etapa a) la concentración de hemoglobina de ambas mezclas es de 50 mglrnL.
- 15
- En otra realización preferida, la relación de volúmenes de reacción de la etapa a) es de dos partes de disolución básica y una parte de disolución ácida.
- En una realización específica, la temperatura de la etapa a) para producir péptidos es de 50 oC. En una realización más especifica, el tiempo de agitación de la etapa a) es de 24 horas.
- 20
- En otra realización específica, la temperatura de la etapa a) para producir una mezcla de péptidos y aminoácidos es de 80 oC. En una realización más específica, el tiempo de agitación de la etapa a) es de 6 horas.
- En otra realización específica, la temperatura de la etapa a) para obtener aminoácidos es de 110 oC. En una realización más específica, el tiempo de agitación de la etapa a) es de 24 horas.
- 2S
- En otra realización especifica, el agua de lavado de la fracción sólida en la etapa e) es destilada o con un pH de entre 1 y 2. Preferentemente, el retenido (rico en péptidos) del paso e) es lavado sucesivamente con agua destilada o ácida, manteniendo el pH en valores dentro del rango de 1 a 2 unidades. El fin es eliminar los restos de sales precipitadas por medio de su disolución. Entre cada lavado se puede
realizar un nuevo filtrado o centrifugado. El retenido final puede ser secado o disuelto en disoluciones de un pH 7 o superior, en donde los péptidos ya separados de los aminoácidos y de las sales son completamente solubles.
En una realización preferida, la concentración de etanol empleado en la etapa
S e) es del 15% v/v. Preferentemente, al penneado rico en aminoácidos obtenido en el . paso e) se le añade etanol a196% hasta obtener una concentración final del 15%. Con esto se consigue precipitar la sal (por ejemplo sulfato sódico) presente, mientras que los aminoácidos siguen en disolución. A continuación, bien mediante filtración, decantación o centrifugación, se recupera un sobrenadante rico en aminoácidos libres
10 que puede ser secado o concentrado.
En otra realización preferida, la filtración de la fase sólida en la etapa e) es llevada a cabo por una membrana de 20 micras de diámetro de poro.
En otra realización preferida, la separación de la fase sólida mediante centrifugación en la etapa e) es llevada a cabo por una centrifugación durante 10 15 minutos con una fuerza de 10.000 g.
El rendimiento, entendido como gramos de hidrolizado por litro de reacción, obtenido con el proceso aquí descrito es ampliamente superior al que se obtiene empleando enzimas, ya que se multiplica hasta por 10 la concentración de proteína empleada. Comparado con los procesos químicos existentes, donde solo se emplea
20 ácido o base como agente hidrolizante, se consigue un mayor reaprovechamiento de los reactivos empleados, ya que ambos tienen el doble papel de agente hidrolizante y agente neutralizante y, por tanto, la misma cantidad de ácido produce el triple de hidrolizado final y la misma cantidad de base produce un 50% más de producto final.
Desde un punto de vista nutricional, los hidrolizados enzimáticos son más
25 completos ya que no existe degradación de aminoácidos. Los hidroJizados obtenidos químicamente son deficientes en varios aminoácidos según el método seguido, ya que degradan por completo las proteínas a aminoácidos y algunos se pierden irremediablemente. Sin embargo, el proceso descrito en esta invención permite la conservación de todos los aminoácidos, ya que se encuentran contenidos en los
30 péptidos, mientras que las degradaciones referidas a los aminoácidos libres se ven
- minimizadas~ esto es porque aminoácidos degradados en el proceso ácido son
- conservados en el proceso básico y viceversa. Con la invención propuesta, solo dos
- aminoAcidos esenciales están ausentes en su forma libre, treonina y metionina, que
- además son minoritarios en la molécula de hemoglobina (18 y 4 residuos
- S
- respectivamente de un total de 578).
- Con respecto a los métodos clásicos de hidrólisis química, en los que la
- hidrólisis se llevaba a cabo hasta obtener una completa degradación de la proteína en
- aminoácidos libres, el proceso aquí presentado, mediante el control de la temperatura
- y del tiempo de reacción, puede ser empleado para producir péptidos de diferente
- 10
- tamaño.
- Una aplicación preferente de este método se refiere al uso de hemoglobina
- procedente de la sangre de animales de abasto. La sangre es uno de los subproductos
- más abundantes de la industria cárnica, la cual se produce en grandes volúmenes y
- plantea un problema para su procesado y un grave problema medioambiental. La
- 15
- aplicación del método de la invención pennite aprovechar grandes cantidades de
- sangre y producir un hidrolizado de alto valor nutritivo que puede ser aplicado como
- ingrediente de piensos o fonnulaciones de alimento para mascotas.
- Con la presente invención se plantea un método de hidrólisis de proteínas y la
- posterior separación de los productos obtenidos en base a su solubilidad y tamaño. En
- 20
- este proceso se consigue además obtener péptidos con un tamaño predecible. El
- método de la presente invención proporciona una solución tecnológica capaz de
- procesar las grandes cantidades de hemoglobina que se generan diariamente en los
- macelos, disminuyendo la pérdida del valor nutricional de los productos causada por
- la degradación de ciertos aminoácidos inherente a1 proceso en sí. La hidrólisis de
- 25
- grandes cantidades de hemoglobina, con el método aquí presentado, es capaz de
- absorber gran parte del exceso de sangre generado y además revalorizar este
- subproducto al obtenerse un hidrolizado de una fonna barata y de amplia aplicación
- en la alimentación de animales de abasto o de mascotas.
- La invención resulta de aplicación en la obtención de péptidos y aminoácidos a
- 30
- partir de proteínas de origen animal, principalmente en los sectores de la agricultura,
- química y fannacia. medioambiental o alimentario, y en particular en aquellas industrias agroalimentarias o cárnicas que generan un exceso de subproductos (como la sangre) y que requieren un método eficiente para el post-procesado de los mismos.
- 5
- EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE
- Para una mejor comprensión de la presente invención, a continuación se describe el siguiente ejemplo de realización preferente descrito en detalle, que debe entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.
- 10
- Se realizó una hidrólisis química acida y básica en paralelo a pequeña escala a partir de una muestra de hemoglobina de porcino purificada. La pureza de dicha proteína era del 98%.
- lS 20
- Por un lado se disolvieron 7,5 gramos de hemoglobina en 100 mL de agua (disolución A); por otro lado, 15 gramos de hemoglobina se disolvieron en 120 mL de agua (disolución B). Ambas disoluciones fueron calentadas con constante agitación y cuando alcanzaron una temperatura de 40 oC se agregaron 50 mL de ácido sulfúrico concentrado (18 M) a la disolución A y 180 mL de hidróxido sódico (10 M) a la disolución B. Hay que tener en cuenta la gran cantidad de calor que genera la dilución de estos compuestos en agua, llegando a alcanzar temperaturas de 70 u 80 oC. Con estas cantidades se obtuvieron 150 mL de la disolución A en la que había 50 giL de hemoglobina y H2S04 6M; Y 300 mL de la disolución B a la misma concentración de hemoglobina y 6M de NaOH.
- 25
- Se fijó la temperatura en 50 oC, evitando en lo posible la evaporación de agua para no alterar las concentraciones de proteínas ni de ácido o base. Se mantuvo en constante agitación durante 24 horas, al final de las cuales se alcanzó la máxima producción de péptidos (74%) y el peso molecular medio deseado (16 kDa en el caso de empicar ácido sulfúrico y 13 kDa cn el caso del hidróxido sódico).
- En este punto se detuvo el control de temperatura y se procedió a traspasar los 150 mL de la disolución A y los 300 rnL de la disolución B a un depósito agitado. La adición ha de hacerse de manera lenta y controlada debido a la gran cantidad de calor
que se genera. La mezcla estaba calculada de tal modo que el pH final de la disolución e (disolución A más disolución B) estuviera situado entre los valores 1 y 2. Se dejó enfriar está disolución e hasta alcanzar la temperatura ambiente, sin detener en ningún momento la agitación.
Una vez a1canzada la temperatura ambiente se recuperó la disolución C. Se pudo observar cómo aparecía una fracción sólida en suspensión, fonnada por parte de los péptidos producidos durante la hidrólisis. A continuación, mediante una filtración por un filtro de 20 micras de diámetro de poro, se separó la fracción sólida o retenido (compuesta por péptidos no solubles y sulfato sódico precipitado) de la fracción líquida o penneado (compuesta por agua, sulfato sódico en disolución y aminoácidos libres). A partir de estas dos fracciones se obtuvieron dos productos diferentes que se purificaron con diferentes procedimientos.
1-Para recuperar los péptidos de la fracción sólida, se hizo un lavado con agua destilada para eliminar los restos de sales de sulfato. Para ello se añadieron 150 mL de agua destilada al sólido, se agitó durante 10 minutos y a continuación o bien se puede filtrar, o bien centrifugar para eliminar con la fase líquida los excesos de sales de sulfato formados durante la neutralización. En este caso concreto se realizó una filtración a través de un poro de 20 micras. Este proceso se repitió 3 veces. Al final se obtuvo un sólido que en peso seco estaba formado por más de un 90% de péptidos/proteína. Éste se secó por corrientes de aire caliente.
n-Para recuperar los aminoácidos de la fracción líquida, se precipitó el sulfato de sodio mediante la adición de etanol. Para ello se añadió etanol al 96% hasta alcanzar una concentración final del 15% (unos 18 mL de etanol por cada 100 mL de fracción líquida). Inmediatamente se obtuvo un precipitado blanco compuesto por sulfato de sodio. El sobrenadante, rico en aminoácidos, puede ser recuperado por filtración, decantación o centrifugación. Una vez obtenido puede ser secado por los métodos habituales (corriente de aire caliente,liofilización, etc), En este caso concreto, el medio rico en aminoácidos fue secado en una
estufa a 60 oC hasta su completo secado y el polvo resultante se recogió a un recipiente hennéticamente cerrado.
El rendimiento final se define como la masa de cada producto obtenida con respecto a la masa de la hemoglobina inicial. En este caso el rendimiento que se S obtuvo al final de la hidrólisis fue el siguiente: 5% de aminoácidos (1,1 gramos) y 74% de péptidos (16,6 gramos), cuya composición era la siguiente según el tamaño de los péptidos: 2% de entre 40 y 50 kDa; 5 % entre 30 y 40 kDa; 16% entre 20 y 30 kDa; 58% entre 10 Y 20 kDa y 19% menores de 10 kDa. Este rendimiento obtenido es muy alto, ya que el grado de conversión es muy elevado, así como la cantidad de
10 sustrato procesado. Además, se obtienen péptidos de diferente tamaño y de manera controlada. Finalmente, con la aplicación de este método se consigue una mayor conservación de los aminoácidos originalmente presentes en la proteína sustrato.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la producción de péptidos y aminoácidos a partir de hemoglobina que comprende las siguientes etapas:a) adición de ácido y álcali a dos disoluciones de hemoglobina purificada hasta alcanzar Wla concentración de 6 M de cada 000 de los agentes hidrolizantes, calentar estas mezclas hasta ooa temperatura entre los 50 y los 120 oC y mantenerlas en agitación constante durante 00 tiempo de agitación de entre 6 y 24 horas, dependiendo de la temperatura empleada;b) mezclar las disoluciones ácida y básica al ténnino de la hidrólisis hastaalcanzar un pH entre 1 y 2; c) enrnar la mezcla hasta temperatura ambiente; d) separar la fracción sólida (rica en péptidos) y la fracción liquida (ricaen aminoácidos) mediante centrifugación o filtración; e) eliminar las sales en la fracción sólida mediante lavados con agua ácidao destilada, eliminar las sales en la fracción líquida mediante su precipitación con etanol y purificar ambas fracciones mediante filtración, decantación o centrifugación;f) eliminar el exceso de agua mediante secado.
-
- 2.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la hemoglobina empleada procede de 00 animal.
-
- 3.
- Procedimiento, según la reivindicación 2 caracterizado por que el animal es del tipo porcino. vacuno. ovino. caprino. aviar o equino.
-
- 4.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que ooa vez agregado el ácido o el álcali en la etapa a) la concentración de hemoglobina de ambas mezclas es de 50 mg/rnL.
S. Procedimiento. según la reivindicación 1, caracterizado por que el ácido es ácido sulfúrico y el álcali es hidróxido sódico. -
- 6.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la relación de volúmenes de reacción de la etapa a) es de dos partes de disolución básica y una parte de disolución ácida.
-
- 7.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la temperatura de la etapa a) para producir péptidos es de 50 oc.
-
- 8.
- Procedimiento, según la reivindicación 7. caracterizado por que el tiempo de agitación de la etapa a) es de 24 horas.
5 9. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la temperatura de la etapa a) para producir una mezcla de péptidos y aminoácidos es de 80oc. - 10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado por que el tiempo de agitación de la etapa a) es de 6 horas.10 11. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la temperatura de la etapa a) para obtener aminoácidos es de 110 oC.
- 12. Procedimiento, según la reivindicación 11, caracterizado por que el tiempo de agitación de la etapa a) es de 24 horas.
- 13. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que el agua de 15 lavado de la fracción sólida en la etapa e) es destilada O con un pH de entre 1 y
- 2.
-
- 14.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración de etanol empleado en la etapa e) es del 15% v/v.
-
- 15.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la filtración de
20 la fase sólida en la etapa e) es llevada a cabo por una membrana de 20 micras de diámetro de poro. - 16. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la separación de la fase sólida mediante centrifugación en la etapa e) es llevada a cabo por una centrifugación durante 10 minutos con una fuerza de 10.000 g.
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