ES2413161T3 - Productos de combinación para tratar el cáncer - Google Patents

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Abstract

Productos que contienen: (i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del receptor de somatostatina 2 humana(sst2) que presenta la secuencia SEC ID nº:1, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de almenos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:1, (ii) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína desoxicitidina cinasa (dck) humana quepresenta la secuencia SEC ID nº:2, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos80% con la secuencia completa SEC ID nº:2, (iii) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína uridina monofosfato cinasa (umk) humanaque presenta la secuencia SEC ID nº:3, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de almenos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:3, y (iv) gemcitabina, como una preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de cánceren un sujeto.

Description

Productos de combinación para tratar el cáncer.
Campo de la invención
La invención se refiere al campo del cáncer, y en particular a nuevos productos, composiciones, vectores plasmídicos y métodos para la terapia contra el cáncer.
Antecedentes de la invención
Entre el cáncer, el cáncer pancreático es una de las neoplasias humanas más agresivas y devastadoras. Su agresividad se ilustra por el hecho de que el número de casos de cáncer pancreático estimados y el número de muertes relacionadas con cáncer pancreático son casi idénticos, con una tasa de supervivencia mínima de 5 años del 2%. El cáncer pancreático se encuentra en la quinta causa principal de muertes relacionadas con cáncer en los países occidentales. Hasta ahora, no es posible ni la detección temprana ni el tratamiento de la enfermedad avanzada: el 85% de las lesiones no son extirpables en el momento del diagnóstico, dando como resultado un tiempo de supervivencia medio de 4-5 meses.
Estas sombrías estadísticas son consistentes principalmente con la propensión de estos tumores a metastatizarse cuando son pequeños e indetectables, y a la resistencia intrínseca de las células de cáncer pancreático a agentes citotóxicos y a radioterapia.
Como otro cáncer agresivo, el carcinoma hepatocelular (hepatocarcinoma HCC) es la neoplasia primaria más habitual del hígado y el cuarto cáncer más habitual a nivel mundial, con una incidencia de 1.000.000 nuevos casos por año. Representa la 3ª causa de muerte por cáncer en el mundo. En Francia, como en otros países industrializados, su incidencia está aumentando de manera constante debido a la pandemia del virus de la hepatitis
C. HCC se desarrolla a partir de cirrosis. La probabilidad de 5 años para que los pacientes cirróticos desarrollen HCC es casi 20%. Las tres modalidades terapéuticas curativas principales usadas actualmente para HCC es la estirpación hepática, la destrucción percutánea del tumor (radiofrecuencia) y el transplante hepático ortotópico. Estas opciones se pueden usar en pacientes con el denominado HCC «pequeño» (< 5 cm), con buenos resultados (70% de supervivencia durante 5 años y < 25% de tasa de recurrencia para el transplante). Desafortunadamente, tales opciones terapéuticas son sólo accesibles a menos del 50% de los pacientes diagnosticados con HCC. Por lo tanto, el grueso de los pacientes no se puede beneficiar de opciones terapéuticas curativas debido al gran tamaño tumoral o a la enfermedad hepática subyacente. Por estas razones, se necesitan nuevas modalidades de diagnóstico y terapias. Hasta ahora, ninguna quimioterapia es eficaz, y de este modo está indicada en HCC.
En consecuencia, existe una necesidad urgente de terapias para tratar cáncer, como cáncer pancreático o cáncer hepatocelular, y específicamente cáncer metastásico, que sean más eficaces que los regímenes actuales.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a productos que contienen:
(i)
al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del receptor de somatostatina 2 humana (SST2) que presenta la secuencia SEC ID nº:1, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:1, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%,
(ii)
al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína desoxicitidina cinasa (DCK) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:2, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:2, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%,
(iii) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína uridina monofosfato cinasa (UMK) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:3, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:3, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%,
(iv) gemcitabina,
como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de cáncer en un sujeto.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende:
(i)
al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del receptor de somatostatina 2 humana (SST2) que presenta la secuencia SEC ID nº:1, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:1, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%,
(ii)
al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína desoxicitidina cinasa (DCK) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:2, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:2, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%,
(iii) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína uridina monofosfato cinasa (UMK) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:3, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:3, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 99%,
(iv) opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere finalmente a un vector plasmídico que presenta la secuencia SEC ID nº:11, y que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína del receptor de somatostatina 2 de Homo sapiens y un polipéptido que comprende las dos proteínas, proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens, enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el mapa esquemático del plásmido pHNeo Sst2 DCK::UMK (7548 pb) (SEC ID nº: 11).
La figura 2 muestra el mapa esquemático del vector plasmídico pHDuol4 LGFP-dckumk2A (7368 pb).
Descripción de las formas de realización preferidas
En el sentido de la presente solicitud, el cáncer es preferentemente un cáncer metastásico, como el cáncer pancreático y el carcinoma hepatocelular, y muy preferentemente un cáncer pancreático exocrino.
La metástasis corresponde al proceso mediante el cual un cáncer se extiende desde el lugar en el que surge en primer lugar como tumor primario hacia localizaciones distantes en el cuerpo. Puesto que este proceso es muy particular en la progresión del cáncer, generalmente es necesario usar un régimen específico a fin de inhibir la metástasis.
Se ha establecido que la inyección intratumoral combinada de un vector de expresión que codifica SST2, DCK y UMK, asociada con la administración de gemcitabina da como resultado una disminución amplia y sorprendente de los sitios de metástasis.
En consecuencia, y en una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a la inhibición de la extensión de tumores, es decir, la inhibición de la metástasis tumoral.
El término sujeto se refiere a un mamífero, y preferentemente a un ser humano.
Como se usa en la presente memoria, gemcitabina se refiere a gemcitabina HCl/clorhidrato, comercializado por ELI LILLY con la marca GEMZAR®, que es un análogo nucleosídico que muestra actividad antitumoral y pertenece a un grupo general de fármacos quimioterapéuticos conocidos como antimetabolitos. La gemcitabina evita que las células produzcan ADN y ARN interfiriendo con la síntesis de ácidos nucleicos, deteniendo de este modo el crecimiento de células cancerosas y haciendo que mueran.
La gemcitabina, que se describe en la solicitud PCT Internacional WO 97/21719, es un análogo glucosídico sintético de citosina, que se describe químicamente como hidrocloruro de 1-(2’-desoxi-2’,2’-difluoro-[beta]-D-ribofuranosil)-4aminopirimidin-2-ona o isómero [beta] del monohidrocloruro de 2’-desoxi-2’,2’-difluorocitidina.
Como se usa aquí, “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de aminoácidos significa el porcentaje de aminoácidos idénticos, entre las dos secuencias a comparar, obtenido con el mejor alineamiento de dichas secuencias, siendo este porcentaje puramente estadístico, y estando las diferencias entre estas dos secuencias extendidas al azar a lo largo de las secuencias de aminoácidos. Como se usa aquí, “mejor alineamiento” o “alineamiento óptimo” significa el alineamiento para el que el porcentaje determinado de identidad (véase más abajo) es el mayor. La comparación de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se realiza habitualmente comparando estas secuencias que se han alineado previamente según el mejor alineamiento; esta comparación se realiza en segmentos de comparación a fin de identificar y comparar las regiones locales de similitud. El mejor
alineamiento de secuencias para llevar a cabo la comparación se puede realizar, además de manera manual, usando el algoritmo de homología global desarrollado por SMITH y WATERMAN (Ad. App. Math., vol. 2, p: 482, 1981), usando el algoritmo de homología local desarrollado por NEDDLEMAN y WUNSCH (J. Mol. Biol., vol. 48, p: 443, 1970), usando el método de similitudes desarrollado por PEARSON y LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol. 85, p: 2444, 1988), usando software de ordenador que usan tales algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA en el Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), usando los algoritmos de alineamientos múltiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p: 1792, 2004). Para obtener el mejor alineamiento local, se puede usar preferentemente el software BLAST, con la matriz BLOSUM 62, o la matriz PAM 30. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas óptimamente, siendo capaces las secuencias de aminoácidos de comprender adiciones o supresiones con respecto a la secuencia de referencia a fin de obtener el mejor alineamiento entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre estas dos secuencias, y dividiendo este número entre el número total de posiciones comparadas, y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Según otra realización preferida, la proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens que presenta la secuencia SEC ID nº: 2, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº: 3, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%, y la proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens que presenta la secuencia SEC ID nº: 3, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº: 3, preferentemente de al menos 90%, como ejemplo de al menos 95%, y más preferentemente de al menos 99%, están codificadas por una única secuencia de aminoácido.
Preferentemente, dicha al menos una secuencia de aminoácido codifica un polipéptido que comprende las dos proteínas, proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens, enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible, polipéptido el cual tiene la secuencia SEC ID nº: 10.
Según todavía otra realización preferida, los ácidos nucleicos que codifican la proteína del receptor de somatostatina 2 (sst2), la proteína desoxicitidina cinasa (dck), y/o la proteína uridina monofosfato cinasa (umk), están enlazados operativamente a una secuencia de expresión génica, que dirige la expresión de ácidos nucleicos en una célula eucariota. La “secuencia de expresión génica” es cualquier secuencia nucleotídica reguladora, tal como una secuencia promotora o una combinación de promotor-potenciador, que facilita la transcripción y traducción eficientes del ácido nucleico al que está enlazada operativamente. La secuencia de expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o vírico, tal como un promotor constitutivo o inducible. En el plásmido diseñado para el presente concepto, los dos genes (sst2 y la fusión dck::umk) están bajo el control de dos promotores diferentes sensibles a hipoxia (la actividad basal de cada promotor aumenta drásticamente en el tumor debido al área hipóxica presente en tejidos de carcinoma pancreático): la región promotora del gen GRP78 (proteína 78 regulada por glucosa) y la región promotora del gen GRP94 (proteína 94 regulada por glucosa) para la fusión dck::umk y sst2, respectivamente. Los promotores constitutivos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosol transferasa (HPTR), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, promotor de beta-actina, promotor de creatina cinasa muscular, promotor del factor de alargamiento humano, y otros promotores constitutivos. Los promotores víricos ejemplares que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores procedentes del virus del simio (por ejemplo, SV40), virus del papiloma, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), citomegalovirus (CMV), virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la hepatitis B (HBV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney, y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Los expertos en la materia conocen otros promotores constitutivos. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína es inducido a promover la transcripción y traducción en presencia de ciertos iones metálicos. Los expertos en la materia conocen otros promotores inducibles.
En general, la secuencia de expresión génica debe incluir, como necesarias, secuencias no transcriptoras en 5’ y no traductoras en 5’ implicadas en la iniciación de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, secuencias de protección de los extremos, secuencia CAAT, y similares. Especialmente, tales secuencias no transcriptoras en 5’ incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico del antígeno operablemente unido. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en 5’, según se desee.
Como se usa aquí, se afirma que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas sst2, dck y umk, y la secuencia de expresión génica están “enlazadas operablemente” cuando están enlazadas covalentemente de tal forma para poner la expresión o transcripción y/o traducción de las secuencias que codifican las proteínas bajo la influencia o control de la secuencia de expresión génica. Se afirma que dos secuencias de ADN están enlazadas operablemente si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica de 5’ da como resultado la transcripción de las proteínas, y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como
resultado la introducción de una mutación de desplazamiento del marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción del polipéptido de la invención, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para ser traducido a una proteína.
El ácido nucleico que codifica las proteínas sst2, dck y umk se puede suministrar in vivo solo o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un “vector” es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico que codifica las proteínas sst2, dck y umk a las células. Preferentemente, el vector transporta el ácido nucleico a las células con degradación relativa con respecto al grado de degradación que daría como resultado si el vector estuviera ausente. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagómidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácidos nucleicos antagonistas peptídicos.
Los vectores víricos preferidos para ciertas aplicaciones son los adenovirus y los vinos adenoasociados, que son virus de ADN bicatenario que ya se han aceptado para uso humano en terapia génica. El virus adenoasociado se puede manipular para que sea deficiente en la replicación, y es capaz de infectar a un amplio abanico de tipos celulares y especies. Además, tiene ventajas tales como estabilidad al calor y a disolventes lipídicos, elevadas frecuencias de transducción en células de diversas estirpes, incluyendo células hematopoyéticas, y carece de la inhibición de superinfección, permitiendo así múltiples series de transducciones. Aparentemente, el virus adenoasociado se puede integrar en ADN celular humano de una manera específica del sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis de inserción y variabilidad de la expresión génica insertada, característica de la infección retrovírica. Además, las infecciones con virus adenoasociados de tipo salvaje han sido seguidas en cultivo tisular durante más de 100 pasadas en ausencia de presión selectiva, implicando que la integración genómica del virus adenoasociado es un suceso relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de una manera extracromosómica.
El vector de ácido nucleico puede incluir marcadores seleccionables que son activos tanto en células bacterianas como en células de mamíferos.
Según todavía otra realización, las secuencias de ácidos nucleicos previamente descritas corresponden a “ADN desnudo” como plásmidos, cósmidos o fagómidos, preferentemente a al menos un vector plasmídico, y más preferentemente a un vector plasmídico.
Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la técnica y son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, SANBROOK et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años recientes, se han usado vectores plasmídicos como vacunas de ADN para suministrar genes que codifican antígenos a células in vivo. Son particularmente ventajosos por esto debido a que no tienen los mismos problemas de seguridad que con muchos de los vectores víricos. Sin embargo, estos plásmidos, que tienen un promotor compatible con la célula hospedante, pueden expresar un péptido de un gen codificado operativamente en el plásmido. Algunos plásmidos usados habitualmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, y pBlueScript. Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, los plásmidos se pueden diseñar de forma personalizada usando enzimas de restricción y reacciones de ligación para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN. Los plásmidos se pueden suministrar mediante una variedad de vías parenterales, mucosales y tópicas. Por ejemplo, el plásmido de ADN se puede inyectar mediante vía intramuscular, intradérmica, subcutánea, u otras vías. También se puede administrar mediante pulverizaciones o gotas intranasales, supositorio rectal y oralmente. También se puede administrar en la epidermis o en una superficie mucosal usando una pistola génica. Los plásmidos se pueden proporcionar en una disolución acuosa, secos sobre partículas de oro, o en asociación con otro sistema de suministro de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, liposomas, dendrímeros, cocleatos y microencapsulamiento.
En otra realización preferida, el ácido nucleico que codifica las proteínas sst2, dck y umk está comprendido en un vector plasmídico.
Dicho vector plasmídico tiene la secuencia SEC ID nº:11, y comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína del receptor de somatostatina 2 de Homo sapiens y un polipéptido que comprende las dos proteínas, proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens, enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible.
Tal “ADN desnudo” o vector o vectores plasmídicos están asociados preferentemente a polímeros catiónicos no lipídicos (WU y WU J. Biol. Chem., vol. 263, p: 14621-4, 1988), tales como polietilenimina (PEI) como se describe en el documento EP 0770140, o liposomas (BRIGHMAN et al., Am. J. Med. Sci., vol. 298, p: 278-81, 1989), para formar complejos que potencian la captación celular.
Ventajosamente, tal ADN desnudo o vector o vectores plasmídicos están asociados con polímeros catiónicos no lipídicos, preferentemente con polietilenimina (PEI) como se describe en el documento EP 0770140.
En una realización específica, los productos de la invención comprenden además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son
5 fisiológicamente aceptables y no producen típicamente una reacción alérgica o desfavorable similar, tal como malestar gástrico, mareo y similar, cuando se administran a un ser humano. Preferentemente, como se usa aquí, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aceptado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o dado a conocer en la U.S. Pharmacopea u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
10 El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de haba de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similar. El agua o disolución salina acuosa y las disoluciones acuosas de
15 dextrosa y de glicerol se emplean preferentemente como vehículos, particularmente para disoluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin.
Las secuencias de ácidos nucleicos o los vectores de ácidos nucleicos o gemcitabina se pueden solubilizar en un tampón o agua, o se pueden incorporar en emulsiones y microemulsiones. Los tampones adecuados incluyen, pero
20 no se limitan a, disolución salina tamponada con fosfato libre de Ca++/Mg++ (PBS), disolución salina tamponada con fosfato (PBS), disolución salina normal (NaCl 150 mM en agua), tampón Tris, y tensioactivos.
Según todavía otra realización específica, las secuencias de ácidos nucleicos descritas previamente se administran mediante inyección intratumoral, preferentemente mediante inyección de ultrasonidos endoscópica intratumoral (es
25 decir, ecoendoscopia), como se describe en HECHT et al. (Clin. Cancer Res., vol. 9, p: 555-61, 2003) como ejemplo.
Según otra realización específica, la gemcitabina se administra por vía intravenosa.
Según la presente invención, una “cantidad eficaz” de una composición es aquella que es suficiente para lograr un
30 efecto biológico deseado, en este caso producir apoptosis en células tumorales e inhibir la metástasis. Se entiende que la dosis eficaz dependerá de la edad, sexo, salud y peso del receptor, del tipo de tratamiento concurrente, si existe, frecuencia de tratamiento, y de la naturaleza del efecto deseado. Sin embargo, la dosis preferida se puede adecuar al sujeto individual, como se entiende y es determinable por un experto en la materia, sin experimentación innecesaria.
35 Como ejemplo, una cantidad eficaz de un vector plasmídico que tiene una secuencia SEC ID nº:11 para una inyección intratumoral depende del volumen tumoral, y comprende entre 1 y 1.000 µg de ADN por cm3 de tumor, preferentemente entre 5 y 500 µg/cm3, más preferentemente entre 8 y 500 µg/cm3.
40 Como ejemplo, una cantidad eficaz de gemcitabina corresponde a una administración de gemcitabina a 1000 mg/cm2 (de superficie del paciente) por día. Tal administración se realiza una vez a la semana durante cuatro semanas consecutivas.
Sorprendentemente, se ha establecido que la inyección intratumoral del plásmido que presenta la secuencia SEC ID
45 nº:11 permite obtener una regresión tumoral en combinación con una dosis de gemcitabina menor que la dosis usada para el tratamiento convencional de cáncer pancreático (2/3 de la dosis normal de gemcitabina).
De este modo, en una realización preferida, una cantidad eficaz de gemcitabina corresponde a una dosis igual o menor que 750 mg/m2 por día. Tal administración se realiza una vez a la semana durante cuatro semanas
50 consecutivas, como antes.
Preferentemente, una cantidad eficaz de gemcitabina corresponde a una dosis de 500 mg/m2 por día, y una vez a la semana durante cuatro semanas consecutivas, como antes.
55 A continuación, la invención se describe con mayor detalle haciendo referencia a secuencias de ácidos nucleicos y a los ejemplos. No obstante, no se pretende ninguna limitación de la invención por los detalles de los ejemplos. Antes bien, la invención pertenece a cualquier forma de realización, que comprende detalles que no están mencionados explícitamente en la presente memoria en los ejemplos, pero que resulta evidente para el experto en la materia.
60 Ejemplos
I. Tratamiento de cáncer de páncreas
1) La combinación de sst2 y DCK:UMK/gemcitabina sensibiliza a las células de cáncer pancreático para morir in 65 vitro:
Unas células BxPC-3 y MiaPaca-2, derivadas de carcinoma ductal pancreático humano (DELESQUE et al., Cancer Research, vol. 57, p: 956-962, 1997) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (INVITROGEN) suplementado con 5% de suero fetal de ternera (FCS; INVITROGEN), fungizona (INVITROGEN), antibióticos (estreptomicina, penicilina, SIGMA), L-glutamina (INVITROGEN), y un reactivo anti-micoplásmico (PLASMOCIN™, CAYLA).
Se sembraron células de cáncer pancreático humano en placas de 35 mm de diámetro a 50 x 103 células/ml (2 ml por placa) en RPMI 1640 que contiene 5% de FCS. Después de una fase de adhesión de 12 h, las células se transfectaron con 5 µg de un vector simulado o con 5 µg de plásmido que comprende un ADNc de fusión DCK:UMK que comprende el péptido FMDV 2A de autoescisión insertado entre los ADNc de DCK y UMK con (pHNeo Sst2 DCK::UMK; figura 1) o sin (pHDuo14 LGFP DCK-UMK; figura 2) el ADNc de sst2 humana (CAYLA) usando polímeros lineales de etilenimina (PEI o L-PEI) con una masa molecular media de 22 kDa (POLYPLUS-Transfection) (relación de nitrógeno de PEI a fosfato de ADN N/P = 8 a 10). Los complejos de PEI-ADN se prepararon en glucosa al 5% (p/v). Después de 24 h de cultivo celular en RPMI 1640 que contiene 5% de FCS, el medio se sustituyó por medio reciente suplementado o no con concentraciones crecientes de gemcitabina (0,05 a 5 µg/ml), y se llevó a cabo el recuento celular después de 48 h de cultivo.
Los resultados muestran que la expresión combinada de UMK, DCK y SST2 sensibiliza a las células tumorales frente a gemcitabina.
2) La combinación de sst2 y DCK:UMK/gemcitabina inhibe el crecimiento de tumores pancreáticos in vivo:
Las células PC1.0, derivadas de un carcinoma ductal pancreático inducido por N-nitrosobis(2-oxopropil)amina en hámsters dorados sirios (BENALI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, p: 9180-9185, 2000), se mantuvieron en medio RPMI 1640 (INVITROGEN) suplementado con 5% de suero fetal de ternera (FCS; INVITROGEN), fungizona (INVITROGEN), antibióticos (estreptomicina, penicilina, SIGMA), L-glutamina (INVITROGEN), y un reactivo antimicoplásmico (PLASMOCIN™, CAYLA).
Para la transfección estable, las células PC1.0 se colocaron en placas de 60 mm de diámetro (2 x 105 células por placa) en 4 ml de RPMI 1640 que contiene 5% de FCS. Después de una fase de adhesión de 12 h, las células se transfectaron con 5 µg del vector simulado (VERNEJOUL et al., Cancer Research, vol. 62, p: 6124-31, 2002), de plásmido que comprende un ADNc de fusión DCK:UMK que comprende el péptido FMDV 2A de autoescisión insertado entre los ADNc de DCK y UMK (pHNeo Sst2 DCK::UMK; figura 1) o sin (pHDuo14 LGFP DCK-UMK; figura 2) el ADNc de sst2 humana (CAYLA) usando una molécula catiónica lipídica (Lyo-Vec™, CAYLA) (relación lípido a ADN p/p = 1:6). Se seleccionaron poblaciones clonales estables en presencia de 0,4 a 0,6 mg/ml de zeocina. Los transfectantes estables se cultivaron entonces en medio RPMI 1640 que contiene 5% de SVF y 0,3 mg/ml de zeocina.
Se aclimataron hámsters dorados sirios (GANNAT) machos de cinco semanas en una habitación de temperatura controlada bajo un programa de 12 h de luz/12 h de oscuridad, y recibieron una dieta peletizada y agua.
Células PC1.0 o poblaciones mixtas de PC1.0.DCK:UMK:SST2 y células de tipo salvaje PC1.0 se implantaron ortotópicamente en hámsters. De forma breve, con anestesia de pentobarbital y tras una pequeña laparotomía, se inyectaron 5 x 105 células PC1.0 resuspendidas en 0,1 ml de medio RPMI 1640 libre de FCS en la cola del páncreas bajo microscopio por medio de un conjunto de catéter de linfografía 29G estéril.
En el día 7, durante la fase exponencial de tumores pancreáticos primarios, los animales se trataron con gemcitabina
o vehículo, NaCl al 0,9%. La gemcitabina se administró intraperitonealmente tres veces a una dosis de 120 mg/kg/día en los días 9, 11 y 13 tras la implantación.
En el día 15, los resultados han mostrado una recesión completa del tumor para los animales que expresan DCK, UMK y SST2, mientras que la gemcitabina solamente ralentiza la progresión tumoral en los animales que no expresan estas proteínas.
3) Transferencia in vivo de la combinación de sst2 y DCK:UMK/gemcitabina
Se implantaron ortotópicamente células PC1.0 en hámster como se describe previamente. Ocho días más tarde, tras laparotomía mediana con anestesia, se midió el volumen del tumor y se llevó a cabo una transferencia génica intratumoral usando PEI de 22 kDa in vivo (relación nitrógeno de PEI a fosfato de ADN N/P = 10) en glucosa al 5%. Los complejos de PEI/ADN se inyectaron entonces en tumores que crecen exponencialmente usando un conjunto de catéter de linfografía de calibre 29 estéril con un caudal de 25 µl/min. Se inyectó un total de 25 a 50 µg de vectores de expresión de DCK:UMK o DCK:UMK:SST2. A los animales se les inyectó entonces i.p. con NaCl al 0,9% o gemcitabina (80 a 120 mg/kg/día cada tres días). Los volúmenes y progresión tumorales se evaluaron tras el sacrificio en el día 15 tras la implantación de las células.
Los resultados de la progresión tumoral tras la expresión génica ex vivo e in vivo y de la evolución de la metástasis se dan en las siguientes tablas I y II.
Tabla I: Progresión del tumor
Progresión del tumor (porcentaje)
Sin ADN, Sin Gemcitabina
+ 800 a 1060
Gemcitabina, Sin ADN
+ 150 a 378
DCK:UMK:SST2
+200
DCK:UMK, Gemcitabina
-60
DCK:UMK:SST2, Gemcitabina
-15 a -30
Tabla II: Número de sitios metastásicos
Número de sitios metastásicos (porcentaje)
Sin ADN, Sin Gemcitabina (control)
100
DCK:UMK
82
DCK:UMK:SST2
100
DCK:UMK, Gemcitabina
47,6
DCK:UMK:SST2, Gemcitabina
12,2
Los resultados establecen que la expresión de la fusión DCK:UMK en algunas células tumorales, en combinación con una administración de gemcitabina, da como resultado la regresión tumoral (tabla I).
10 Los resultados también establecieron que la inyección intratumoral de la fusión DCK::UMK y SST2 en combinación con gemcitabina da como resultado la regresión tumoral incluso a una dosis menor que la aplicada normalmente: 120 mg/kg aplicada en hámster corresponde a una dosis de 1000 mg/m2 en ser humano. De este modo, 80 mg/kg de gemcitabina en hámster (que también indujo una regresión tumoral cuando se coadministró con DCK::UMK y
15 SST2) corresponde a 2/3 de la dosis normal aplicada en el ser humano. La inyección intratumoral de DCK::UMK y SST2 permite reducir la dosis de gemcitabina sin alterar el efecto antitumoral.
Los resultados también establecieron que la expresión de SST2 (DCK:UMK:SST2 sin gemcitabina; tabla II) no inhibe la metástasis tumoral, mientras que la expresión combinada de DCK:UMK con el tratamiento con gemcitabina inhibe
20 la metástasis tumoral en dos veces. Inesperadamente, la coexpresión de SST2 con DCK:UMK asociado con el tratamiento con gemcitabina da como resultado una potente inhibición de la metástasis tumoral – es decir, una reducción de casi diez veces.
Finalmente, los resultados han establecido que la inyección de plásmidos nunca ha dado como resultado una
25 reacción alérgica inmediata o retrasada en ninguno de los animales tratados. Además, la administración intratumoral del vector terapéutico que coexpresa SST2 y DCK:UMK no da como resultado en ningún animal ninguna toxicidad general – es decir, supervivencia -, ninguna toxicidad regional – es decir, estómago, hígado, bazo o peritoneo – o ninguna toxicidad local – es decir, páncreas adyacente normal -.
30 4) Terapia génica humana usando la combinación de sst2 y DCK:UMK/gemcitabina
Se seleccionaron 24 pacientes que sufren cáncer pancreático por adenocarcinoma no estirpable.
Se complejaron 125 µg, 250 µg, 500 µg, y 1 mg de plásmido pHNeo Sst2 DCK::UMK (CAYLA, SEC ID nº: 11) en
35 glucosa al 5% con un derivado de polietilenimina lineal (jetPEI™, POLYPLUS, relación nitrógeno de PEI a fosfato de ADN N/P = 10) según la instrucción del fabricante. Los complejos resultantes se liofilizaron en viales de 5 ml. Antes de la inyección al paciente, los complejos se reconstituyeron en 2,5 ml de agua estéril para inyección, y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes del uso.
40 Cuatro grupos de 6 pacientes se sometieron a una administración intratumoral de los complejos que comprenden respectivamente 125 µg, 250 µg, 500 µg, y 1 mg de ADN (dosis en aumento partiendo de la dosis más baja, es decir, los primeros 6 pacientes recibieron 125 µg, los 6 nuevos pacientes 250 µg, etc.). Dicha etapa de administración se realiza mediante inyección ultrasónica endoscópica, que se lleva a cabo en el día uno.
45 En el día 3, a los pacientes tratados se les perfunde una administración intravenosa de 1000 mg/m2 de gemcitabina (GEMZAR®) durante 30 minutos. Se realizan perfusiones similares en los días 10, 17 y 24 tras la administración intratumoral del plásmido.
Se establece para todos los pacientes la evolución diaria de la progresión tumoral, y, en el día 29, se realiza una
50 segunda administración intratumoral del plásmido en los cuatro grupos de 6 pacientes como se describe anteriormente.
En los días 31, 38 y 45, a los pacientes tratados se les perfunde una administración intravenosa de gemcitabina como se describe previamente.
Se establece la evolución diaria de la progresión tumoral para todos los pacientes hasta el día 60.
5 La media del volumen tumoral del páncreas humano es 32 cm3 ± 8. Considerando los experimentos realizados en animales y en un tumor de 30 cm3, la dosis de 125 µg de ADN (4,17 µg/cm3) debería ser ineficaz para inhibir la progresión tumoral, mientras que la dosis de 250 µg de ADN (8,35 µg/cm3) y mayor debería ser eficaz para tratar cáncer de páncreas y para inhibir la metástasis del cáncer de páncreas.
II. Tratamiento de otros cánceres
1) La combinación de sst2 y DCK:UMK/gemcitabina sensibiliza a células de carcinoma hepatocelular y de hepatoma para morir in vitro:
15 Unas células HuH7, derivadas de carcinoma hepatocelular humano, y células HepG2, derivadas de hepatoma, se cultivaron en placas de 35 mm de diámetro a 50 x 103 células/ml (2 ml por placa) en medio de cultivo DMEM. Después de una fase de adhesión de 12 h, las células se transfectaron con 5 µg de un vector simulado o con 5 µg de plásmido que comprende un ADNc de fusión DCK:UMK que comprende el péptido FMDV 2A de autoescisión
20 insertado entre los ADNc de DCK y UMK con (pHNeo Sst2 DCK::UMK; figura 1) el ADNc de sst2 humana (CAYLA) usando polímeros lineales de etilenimina (PEI o L-PEI) con una masa molecular media de 22 kDa (POLYPLUS-Transfection) (relación nitrógeno de PEI a fosfato de ADN N/P = 8 a 10). Los complejos de PEI-ADN se prepararon en glucosa al 5% (p/v). Después de 24 h de cultivo celular en DMEM que contiene 10% de FCS, el medio se sustituyó por medio reciente suplementado o no con cantidades crecientes de gemcitabina (0,05 a 5 µg/ml), y se
25 llevó a cabo el recuento celular después de 48 h de cultivo.
Los resultados muestran que la expresión combinada de UMK, DCK y SST2 sensibiliza drásticamente a las células tumorales derivadas de HCC y de hepatoma frente a gemcitabina.
30 Listado de secuencias
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) CAYLA BUSCAIL, Louis
35 TIRABY, Gerard VERNEJOUL, Fabienne SUSINI, Christiane DROCOURT, Daniel
40 <120> PRODUCTOS DE COMBINACIÓN PARA TRATAR EL CÁNCER
<130> 353524D25724
<150> EP 07301447.1 45 <151> 10/10/2007
<160> 11
<170> PatentIn versión 3.3 50
<210> 1
<211> 369
<212> PRT
<213> Homo sapiens 55
<400> 1
<210> 2
<211> 260
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
<210> 5
<211> 369
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 5
<210> 6
<211> 260
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
<210> 7
<211> 260
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 7
<210> 8
<211> 260
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 8
<210> 9
<211> 227
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 9
<210> 10
<211> 507 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fusión DCK:UMK 10
<400> 10
<210> 11
<211> 7548 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pHNeo Sst2 DCK:UMK 10
<400> 11

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Productos que contienen:
    (i)
    al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del receptor de somatostatina 2 humana (sst2) que presenta la secuencia SEC ID nº:1, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:1,
    (ii)
    al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína desoxicitidina cinasa (dck) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:2, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:2,
    (iii) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína uridina monofosfato cinasa (umk) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:3, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:3, y
    (iv) gemcitabina,
    como una preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de cáncer en un sujeto.
  2. 2.
    Productos para la utilización según la reivindicación 1, en los que dichos productos se dirigen a la inhibición de la metástasis tumoral.
  3. 3.
    Productos para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en los que dichos productos son útiles para tratar el cáncer pancreático.
  4. 4.
    Productos para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en los que dichos productos son útiles para tratar el carcinoma hepatocelular.
  5. 5.
    Productos para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en los que dicho sujeto es un ser humano.
  6. 6.
    Productos para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en los que dichos productos comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica simultáneamente la proteína desoxicitidina cinasa (dck) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:2, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:2, y la proteína uridina monofosfato cinasa (umk) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:3, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:3.
  7. 7.
    Productos para la utilización según la reivindicación 6, en los que dichos productos comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende las dos proteínas proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens, enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible, presentando dicho polipéptido la secuencia SEC ID nº: 10.
  8. 8.
    Productos para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en los que dichas secuencias de ácidos nucleicos están comprendidas en al menos un vector, preferentemente un vector plasmídico.
  9. 9.
    Productos para la utilización según la reivindicación 8, en los que dicho vector plasmídico presenta la secuencia SEC ID nº: 11, y comprende unas secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína del receptor de somatostatina 2 de Homo sapiens y un polipéptido que comprende las dos proteínas proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible.
  10. 10.
    Productos para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en los que dichos vector o vectores plasmídicos están asociados con polímeros catiónicos no lipídicos, preferentemente con polietilenimina (PEI).
  11. 11.
    Composición farmacéutica que comprende:
    (i)
    al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del receptor de somatostatina 2 humana (SST2) que presenta la secuencia SEC ID nº:1, o una secuencia que presenta un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:1,
    (ii)
    al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína desoxicitidina cinasa (DCK) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:2, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:2,
    (iii) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína uridina monofosfato cinasa (UMK) humana que presenta la secuencia SEC ID nº:3, o una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80% con la secuencia completa SEC ID nº:3, y
    (iv) opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  12. 12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que dichas secuencias de ácidos nucleicos están comprendidas en el interior de un vector plasmídico que presenta la secuencia SEC ID nº: 11, y que comprende
    10 unas secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína del receptor de somatostatina 2 de Homo sapiens y un polipéptido que comprende las dos proteínas proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible.
    15 13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, en la que dicho vector plasmídico está asociado con la polietilenimina (PEI).
  13. 14. Vector plasmídico que presenta la secuencia SEC ID nº: 11, y que comprende unas secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína del receptor de somatostatina 2 de Homo sapiens y un polipéptido que
    20 comprende las dos proteínas proteína desoxicitidina cinasa (dck) de Homo sapiens y proteína uridina monofosfato cinasa (umk) de Homo sapiens enlazadas mediante el péptido FMDV (virus de la glosopeda) 2A escindible.
  14. 15. Productos para la utilización según la reivindicación 3, en los que dicha gemcitabina se administrará a una dosis
    igual o inferior a 750 mg/m2 por día. 25
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