ES2405657T3

ES2405657T3 - Moduladores de la función de los receptores de FAS y otras proteínas

Info

Publication number: ES2405657T3
Application number: ES08018971T
Authority: ES
Inventors: David Wallach; Mark Boldin; Tanya Goncharov; Yury Goltsev
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1995-07-16
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2013-05-31
Anticipated expiration: 2016-06-14
Also published as: DK2042509T3; KR19990029051A; PT914325E; HK1016990A1; US6586571B1; AU6180596A; EP0914325A1; NO980198D0; NO980198L; EP2042509A1; WO1997003998A1; DK0914325T3; ES2326704T3; IL114615A0; PT2042509E; EP2042509B1; US20070154905A1; ATE431357T1; WO1997003998A9; CN1198165A

Abstract

Una secuencia de DNA seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de DNA, SEQ ID NO: 14 o 17; (b) una secuencia de cDNA que codifica una proteína MACH que comprende SEQ ID NO: 7 o 18; (c) una secuencia de DNA capaz de hibridarse, en condiciones moderadamente rigurosas, con lassecuencias de (a) o (b), en donde la secuencia de DNA codifica una proteína MACH, que es capaz deunirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa; (d) una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético dando las secuenciasde DNA definidas en (a) o (b) y que codifica una proteína MACH que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 ytiene actividad de proteasa; y (e) un fragmento del DNA de una cualquiera de (a) a (d) que codifica una proteína que es capaz de unirse aFADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa

Description

Moduladores de la función de los receptores de FAS y otras proteínas

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de los receptores que pertenecen a la superfamilia de receptores de TNF/NGF y al control de sus funciones biológicas. La superfamilia de receptores de TNF/NGF incluye receptores tales como los receptores del factor de necrosis tumoral, p55 y p75 (los TNF-R, de aquí en adelante llamados p55-R (o p55-TNF-R) y p75-R (o p75-TNF-R)) y el receptor del ligando FAS (también llamado FAS/APO1 o FAS-R y de aquí en adelante será denominado FAS-R) y otros. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevas proteínas de unión a la proteína MORT-1 (o FADD), y más específicamente, se refiere a una de dichas proteínas, tal como la proteína de unión a MORT-1, aquí designada MACH.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Antecedentes de la técnica anterior

El factor de necrosis tumoral (TNF-a) y la linfotoxina (TNF-�) (de aquí en adelante, TNF, se refiere tanto a TNF-a como a TNF-�) son citoquinas proinflamatorias multifuncionales formadas principalmente por fagocitos mononucleares, que tienen muchos efectos sobre las células (Wallach, D. (1986) en: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; y Beutler and Cerami (1987)). Tanto TNF-a como TNF-� inician sus efectos uniéndose a receptores específicos de la superficie celular. Algunos de los efectos es probable que sean beneficiosos para el organismo: pueden destruir, por ejemplo, células tumorales o células infectadas por virus y aumentar las actividades antibacterianas de los granulocitos. De esta manera, el TNF contribuye a la defensa de los organismos contra tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación de lesiones. Así, el TNF se puede usar como un agente antitumoral en cuya aplicación se une a sus receptores en la superficie de células tumorales e inicia de ese modo los eventos que conducen a la muerte de las células tumorales. El TNF se puede usar también como un agente anti-infeccioso.

Sin embargo, tanto TNF-a como TNF-� también tienen efectos nocivos. Existen pruebas de que la sobreproducción de TNF-a puede desempeñar un papel patógeno principal en varias enfermedades. Por ejemplo, se sabe que los efectos del TNF-a, principalmente, sobre la vasculatura es una causa principal para los síntomas del choque séptico (Tracey et al., 1986). En algunas enfermedades, el TNF puede causar una pérdida excesiva de peso (caquexia) suprimiendo actividades de adipocitos y causando anorexia, y por eso el TNF-a fue llamado caquetina. Fue también descrito como mediador del daño a tejidos en enfermedades reumáticas (Beutler and Cerami, 1987) y como un mediador principal del daño observado en reacciones de injerto contra hospedante (Piquet et al., 1987). Además, se sabe que el TNF está implicado en el proceso de inflamación y en muchas otras enfermedades.

Dos receptores distintos, expresados de modo independiente, los p55-TNF-R, y p75-TNF-R, que se unen específicamente tanto al TNF-a como al TNF-�, inician y/o median los efectos biológicos anteriormente mencionados del TNF. Estos dos receptores tienen dominios intracelulares estructuralmente diferentes lo que sugiriere que señalizan de modo diferente (Véase Hohmann et al., 1989; Engelmann et al.; 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; y Heller et al., 1990). Sin embargo, aún no han sido elucidados los mecanismos celulares, por ejemplo, las diversas proteínas y posiblemente otros factores, que están implicados en la señalización intracelular de los p55-TNF-R y p75-TNF-R. Es esta señalización intracelular, que tiene lugar normalmente después de la unión del ligando, es decir, TNF (a o �), al receptor, la que es responsable del comienzo de la cascada de reacciones que dan como resultado final la respuesta observada de la célula al TNF.

En lo que se refiere al efecto citocida del TNF anteriormente mencionado, en la mayoría de las células estudiadas hasta ahora, este efecto es desencadenado principalmente por el p55-TNF-R. Los anticuerpos frente al dominio extracelular (dominio de unión al ligando) del p55-TNF-R, pueden desencadenar ellos mismos el efecto citocida (véase la patente europea EP 412486) que está correlacionado con la efectividad de la reticulación del receptor por los anticuerpos, que se cree que es la primera etapa en la generación del proceso de señalización intracelular. Además, los estudios mutacionales (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) han mostrado que la función biológica del p55-TNF-R depende de la integridad de su domino intracelular, y por consiguiente se ha sugerido que la iniciación de la señalización intracelular que conduce al efecto citocida del TNF tiene lugar como consecuencia de la asociación de dos o más dominios intracelulares del p55-TNF-R. Por otro lado, el TNF (a y �) está presente en forma de un homotrímero, y como tal, se ha sugerido que induce la señalización intracelular vía el p55-TNF-R, por medio de su capacidad para unirse a las moléculas receptoras y reticularse con ellas, es decir, causando la agregación de los receptores.

Otro miembro de la superfamilia de receptores del TNF/NGF es el receptor de FAS (FAS-R) que ha sido también llamado el antígeno FAS, una proteína de la superficie celular expresada en diversos tejidos y que comparte homología con un número de receptores de la superficie celular, incluyendo TNF-R y NGF-R. El FAS-R media la muerte celular en la forma de apoptosis (Itoh et al., 1991), y parece que sirve como un selector negativo de linfocitos

T auto-reactivos, es decir, durante la maduración de los linfocitos T, el FAS-R media la muerte celular apoptótica de los linfocitos T que reconocen auto-antígenos. También se ha encontrado que las mutaciones en el gen FAS-R (lpr) causa un trastorno linfoproliferante en ratones que se parece a la enfermedad autoinmunitaria humana lupus eritematoso sistémico (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Parece que el ligando para el FAS-R es una molécula asociada a la superficie celular llevada por, entre otras, los linfocitos T asesinos (o linfocitos T citotóxicos -CTL), y de ahí que cuando tales CTL entran en contacto con células que llevan FAS-R, éstas sean capaces de inducir la muerte celular por apoptosis de las células que llevan FAS-R. Además, se ha preparado un anticuerpo monoclonal que es específico para FAS-R, siendo este anticuerpo monoclonal capaz de inducir la muerte celular por apoptosis en células que llevan FAS-R, incluyendo células de ratón transformadas por cDNA que codifica FAS-R humano (Itoh et al., 1991).

Aunque algunos de los efectos citotóxicos de los linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos con el receptor de la superficie celular FAS-R (CD95) presente de manera abundante, que tiene la capacidad de desencadenar la muerte celular, se ha encontrado también que otras diversas células normales, además de los linfocitos T, expresan el FAS-R en sus superficies y pueden ser destruidas por la reacción desencadenada por este receptor. Se sospecha que la inducción descontrolada de tal proceso de muerte contribuye al daño tisular en ciertas enfermedades, por ejemplo, la destrucción de células hepáticas en la hepatitis aguda. Por consiguiente, encontrar medios para controlar la actividad citotóxica del FAS-R puede tener un potencial terapéutico.

Por el contrario, puesto que también se ha encontrado que ciertas células malignas y células infectadas por VIH llevan el FAS-R en sus superficies, los anticuerpo frente a FAS-R, o el ligando de FAS-R, pueden ser usados para desencadenar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en estas células y de ese modo proporcionar un medio para combatir tales células malignas o células infectadas por VIH (véase Itoh et al., 1991). Encontrar aún otros modos para potenciar la actividad citotóxica de FAS-R puede por lo tanto tener también un potencial terapéutico.

Ha sido una necesidad sentida durante mucho tiempo proporcionar un medio para modular la respuesta celular al TNF (a o ) y al ligando de FAS-R. Por ejemplo, en las situaciones patológicas anteriormente mencionadas, en las que el TNF o el ligando de FAS-R están sobre-expresados, es deseable inhibir los efectos citocidas inducidos por TNF o el ligando de FAS-R, mientras que en otras situaciones, por ejemplo, aplicaciones de curación de heridas, es deseable potenciar el efecto del TNF, o en el caso de FAS-R, en células tumorales o células infectadas por VIH, es deseable potenciar el efecto mediado por FAS-R.

El laboratorio de los inventores ha hecho cierto número de propuestas (véanse por ejemplo, las solicitudes de patentes europeas Nº EP 186833, EP 308378, EP 398327 y EP 412486) para regular los efectos perjudiciales del TNF por la inhibición de la unión del TNF a sus receptores usando anticuerpo anti-TNF o usando receptores de TNF solubles (que son esencialmente los dominios extracelulares solubles de los receptores) para competir con la unión del TNF a los TNF-R unidos a la superficie celular. Además, basándose en que la unión del TNF a sus receptores es requerida para los efectos celulares inducidos por el TNF, las propuestas por el laboratorio de los inventores (véase por ejemplo el documento EPO 568925) han sido hechas para modular el efecto del TNF modulando la actividad de los TNF-R.

Brevemente, el documento EPO 568925 se refiere a un método para modular la transducción de señales y/o la escisión en los TNF-R con lo que los péptidos u otras moléculas pueden interaccionar con el propio receptor o con las proteínas efectoras que interaccionan con el receptor, modulando, por tanto, la función normal de los TNF-R. En el documento EPO 568925, se describe la construcción y caracterización de diversos p55-TNF-R, mutantes, que tienen mutaciones en los dominios extracelular, transmembranal e intracelular del p55-TNF-R. De esta manera, se identificaron regiones dentro de los dominios anteriores del p55-TNF-R, que son esenciales para el funcionamiento del receptor, es decir, la unión del ligando (TNF) y la subsiguiente transducción de señales y señalización intracelular que finalmente da como resultado el efecto del TNF observado sobre las células. Además, se ha descrito también un número de propuestas para aislar e identificar proteínas, péptidos u otros factores que son capaces de unirse a las diversas regiones en los dominios anteriores del TNF-R, proteínas, péptidos y otros factores que pueden estar implicados en regular o modular la actividad del TNF-R. También se recogen en el documento EPO 568925 varias propuestas para aislar y clonar las secuencias de DNA que codifican tales proteínas y péptidos; para construir vectores de expresión para la producción de estas proteínas y péptidos; y para la preparación de anticuerpos o sus fragmentos que interaccionen con el TNF-R o con las proteínas y péptidos anteriores que se unen a diversas regiones del TNF-R. Sin embargo, el documento EPO 568925 no especifica las proteínas y péptidos reales que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-R (por ejemplo, el p55-TNF-R) ni describe la propuesta de dos híbridos en levadura para aislar e identificar tales proteínas o péptidos que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-R. De igual manera, hasta este momento no ha habido una descripción de proteínas o péptidos capaces de unirse al dominio intracelular de FAS-R.

Así, cuando se desea inhibir el efecto del TNF, o del ligando de FAS-R, sería deseable disminuir la cantidad o actividad de los TNF-R o FAS-R en la superficie celular, mientras que un aumento en la cantidad o la actividad de los TNF-R o FAS-R se desearían cuando se busque un efecto potenciado del TNF o ligando de FAS-R. Para este fin, los promotores tanto del p55-TNF-R, como del p75-TNF-R se han secuenciado, analizado y se ha encontrado un número de restos de secuencias claves que son específicos de diversos factores reguladores de la transcripción, y como tales la expresión de estos TNF-R puede ser controlada a su nivel de promotor, es decir, la inhibición de la

transcripción a partir de los promotores para una disminución en el número de receptores, y un potenciamiento de la transcripción a partir de los promotores para un aumento en el número de receptores (documento EP 606869 y el documento WO 9531206). Aún no se han documentados estudios correspondientes que se refieran al control de FAS-R al nivel del promotor del gen FAS-R. Aunque se sabe que los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), y el receptor de FAS-R relacionado estructuralmente desencadenan en las células, después de la estimulación con ligandos producidos por leucocitos, actividades destructoras que conducen a su propia destrucción, son aún poco conocidos los mecanismos de esta desencadenación. Estudios mutacionales indican que en la señalización de FAS-R y del receptor p55-TNF (p55-R) para la citotoxicidad implican distintas regiones dentro de sus dominios intracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Estas regiones (los “dominios de la muerte”) tienen similitudes de secuencias. Los “dominios de muerte” tanto de FAS-R como p55-R tienden a autoasociarse. Su autoasociación promueve aparentemente dicha agregación del receptor que es necesaria para la iniciación de la señalización (véase Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), y a niveles elevados de la expresión del receptor puede dar como resultado el desencadenamiento de la señalización independiente de ligandos (Boldin et al., 1995).

Así, previamente al documento WO 9531544 y a la presente invención, no se habían proporcionado proteínas que puedan regular el efecto de los ligandos que pertenecen a la superfamilia TNF/NGF, tal como el efecto de ligandos de TNF o FAS-R sobre las células, por mediación del proceso de señalización intracelular, señalización que se cree que está gobernada en gran extensión por los dominios intracelulares (IC) de los receptores que pertenecen a la superfamilia de receptores de TNF/NGF, tales como los de los dominios intracelulares de los TNF-R, es decir los p55-TNF-R y p75- TNF-R (p55IC y p75IC, respectivamente), así como el FAS-IC.

Algunos de los efectos citotóxicos de los linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos con FAS-R (CD95), con un receptor de superficie celular ampliamente existente que tiene la capacidad de desencadenar la muerte celular (véase Nagata and Golstein, 1995). La muerte celular producida por fagocitos mononucleares implica un acoplamiento ligando-receptor, el TNF y su receptor p55-R (CD120), que está estructuralmente relacionado con el FAS-R y su ligando (véase también Vandenabeele et al., 1995). Al igual que otros efectos inducidos por receptores, la inducción de la muerte celular por los receptores del TNF y el FAS-R tiene lugar vía una serie de interacciones proteína-proteína, que conducen a la unión ligando-receptor hasta la activación final de las funciones enzimáticas efectoras, que en el caso de estos receptores particulares da como resultado la muerte celular. Estudios previos han elucidado interacciones proteína-proteína no enzimáticas que inician la señalización para la muerte celular: la unión de las moléculas de TNF trímero o el ligando de FAS-R a los receptores, las interacciones resultantes de sus dominios intracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993) aumentadas por una propensión de los restos de los dominios de muerte a autoasociarse, (Boldin et al., 1995a), y la unión inducida de dos proteínas citoplasmáticas (que pueden también unirse entre sí) a los dominios intracelulares de los receptores-MORT-1 (o FADD) a FAS-R (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) y TRADD a p55-R (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996).

Se identifican por el procedimiento de cribado de dos híbridos en levadura tres proteínas que se unen al dominio intracelular de FAS-R y p55-R en la región del “dominio de muerte” implicada en la inducción de muerte celular por los receptores a través de la heteroasociación de las regiones homólogas y que de modo independiente son también capaces de desencadenar la muerte celular. Una de éstas es la proteína MORT-1 (Boldin et al., 1995b) también conocida como FADD (Chinnaiyan et al., 1995), que se une específicamente a FAS-R. Una segunda proteína, TRADD (véase también Hsu et al., 1995, 1996), se une a p55-R, y la tercera proteína, RIP (véase también Stanger et al., 1995), se une tanto a FAS-R como a p55-R. Además de su unión a FAS-R y p55-R, estas proteínas son también capaces de unirse entre sí, lo cual proporciona una acción cruzada (“cross-talk”) funcional entre FAS-R y p55-R. Estas uniones tienen lugar a través de un resto de secuencia conservado, el “módulo de dominio de muerte” común a los receptores y a sus proteínas asociadas. Además, aunque en el ensayo de dos híbridos en levadura, se demostró que MORT-1 se une espontáneamente a FAS-R, en células de mamífero esta unión tiene lugar sólo después de la estimulación del receptor, lo que sugiere que MORT-1 participa en los eventos de iniciación de la señalización de FAS-R. MORT-1 no contiene ningún resto de secuencia característico de actividad enzimática, y por lo tanto, su capacidad para desencadenar la muerte celular parece no implicar una actividad intrínseca de MORT-1 por sí misma, sino más bien, la activación de alguna(s) otra(s) proteína(s) que se une(n) a MORT-1 y actúa(n) aguas abajo en la cascada de señalización. Se ha demostrado que la expresión celular de los mutantes de MORT-1 que carecen de la parte N-terminal de la molécula bloquea la inducción de la citotoxicidad por FAS/APO1 (FAS-R) o p55-R (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), lo que indica que esta región N-terminal transmite la señalización para el efecto citocida de ambos receptores a través de las interacciones proteína-proteína.

Estudios recientes han implicado un grupo de tiolproteasas citoplásmicas que están estructuralmente relacionadas con la proteasa CED3 de Caenorhabditis elegans y con la enzima convertidora de interleuquina 1 (ICE) de mamífero en la iniciación de diversos procesos de muerte celular fisiológica (revisados por Kumar, 1995 y Henkart, 1996). También ha habido algunas indicaciones de que la(s) proteasa(s) de esta familia puede(n) tomar parte en la citotoxicidad celular inducida por FAS-R y los TNF-R. Se encontró que inhibidores peptídicos específicos de las proteasas y dos proteínas codificadas por virus que bloquean su función, la proteína crmA del virus de la viruela vacuna y la proteína p35 de baculovirus, proporcionan protección a las células frente a esta citotoxicidad celular (Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Se observó una

escisión rápida de ciertas proteínas celulares específicas, mediadas aparentemente por proteasa(s) de la familia CED3/ICE, en células poco después de la estimulación de FAS-R o los TNF-R. Hasta ahora, no se ha presentado información sobre la identidad de la(s) proteasa(s) específica(s) relacionada(s) con CED3/ICE, ni de los mecanismos de activación de esta(s) proteasa(s) por los receptores.

Compendio de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar nuevas proteínas incluyendo todos sus isoformas, análogos, fragmentos o derivados, que sean capaces de unirse a MORT-1, que se une ella misma al dominio intracelular del FAS-R, afectando dichas nuevas proteínas al proceso de señalización intracelular iniciado por la unión del ligando de FAS a su receptor y tienen actividad de proteasas.

Otro objeto de la invención es proporcionar antagonistas (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, compuestos orgánicos

o incluso algunas isoformas) de las nuevas proteínas o sus análogos, fragmentos y derivados anteriores, que se pueden usar para inhibir el proceso de señalización, o, más específicamente, la citotoxicidad celular, cuando se desee.

Un objeto más de la invención es usar las nuevas proteínas, sus análogos, fragmentos y derivados anteriores, para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales que puedan estar implicados en la regulación de la actividad de receptores, por ejemplo, otras proteasas que escindan las nuevas proteínas para hacerlas biológicamente activas, y/o aislar e identificar otros receptores más aguas arriba en el proceso de señalización a los cuales se unen estas nuevas proteínas, sus análogos, fragmentos y derivados (por ejemplo, otros FAS-R o receptores relacionados), y por tanto, en cuya función estén también implicadas.

Otro objeto adicional de la invención es proporcionar inhibidores que puedan ser introducidos en las células para unirse o interaccionar con las proteasas MACH e inhiban su actividad proteolítica.

Por otro lado, es un objeto de la presente invención usar las nuevas proteínas y sus análogos, fragmentos y derivados anteriormente mencionados como antígenos para la preparación de anticuerpos policlonales y/o monoclonales para estos. Los anticuerpos, a su vez, se pueden usar, por ejemplo, para la purificación de las nuevas proteínas de diferentes fuentes, tales como extractos celulares o líneas celulares transformadas.

Además, estos anticuerpos se pueden usar para fines de diagnóstico, por ejemplo, para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anómalo de los efectos celulares mediados por FAS-R u otros receptores relacionados.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden las nuevas proteínas o sus análogos, fragmentos o derivados anteriores, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anteriormente citados u otros antagonistas como están caracterizados en las reivindicaciones.

De acuerdo con la presente invención, se descubrió una nueva proteína, MACH, que es capaz de unirse a MORT-1,

o interaccionar con ella, que ella misma se une al dominio intracelular del FAS-R. MACH actúa probablemente como un componente efector de la vía de la muerte celular iniciada por la unión del ligando de FAS a FAS-R en la superficie celular, y esto en virtud del hecho de que al menos algunas de las isoformas de MACH parecen ser proteasas intracelulares activas. Las proteasas de la familia CED3/ICE han estado implicadas en el proceso apoptótico desencadenado por FAS-R. MORT-1 (o FADD) se une al dominio intracelular de FAS-R por activación de este receptor y las nuevas proteínas MACH de la presente invención se unen a MORT-1. La proteína MACH, clonada y caracterizada de acuerdo con la presente invención, existe en realidad en múltiples isoformas, algunas de las cuales tiene una región de homología CED3/ICE, que tiene actividad proteolítica (dominios proteolíticos), y causa la muerte de las células cuando se expresan en las células. Por tanto, la activación de este nuevo homólogo de CED3/ICE (es decir, las diversas isoformas de MACH, que tienen el dominio proteolítico) por FAS-R (vía interacción con MORT-1) parece constituir un componente efector de la vía de muerte celular mediada por FAS-R.

Además, MACH también parece actuar como un componente efector de la vía de la muerte celular iniciada por la unión de TNF a p55-R en la superficie celular, esto por medio de un mecanismo indirecto de unión de MORT-1 a TRADD, una proteína que se une al dominio intracelular de p55-R (Hsu et al., 1995), seguido, o junto con, la unión de MACH a MORT-1, con la activación de MACH en una proteasa activa implicada en efectuar la muerte celular.

También debe advertirse que mientras que MACH, en particular la isoforma MACHa1, muestra todas las características de secuencia críticas de la función de las proteasas CED3/ICE, tiene, sin embargo, algunas características de secuencia distintivas por sí mismas que pueden posiblemente dotarla con un modo de acción único y posiblemente específico de tejidos/células.

MORT-1 (por la expresión inglesa “Mediator of Receptor Toxicity”, Boldin et al., 1995b), designado anteriormente HF-1, es capaz de unirse al dominio intracelular del FAS-R. Esta proteína de unión a FAS-IC parece actuar como un mediador o modulador del efecto del ligando de FAS-R sobre las células mediando o modulando el proceso de señalización intracelular que normalmente tiene lugar después de la unión del ligando de FAS-R en la superficie

celular. Además de su especificidad de unión a FAS-IC, MORT-1 demostró tener otras características (véase el Ejemplo 1), por ejemplo, tiene una región homóloga a la de las regiones del “dominio de muerte” (DD) del p55-TNF-R y FAS-R (p55-DD y FAS-DD), y de ese modo es también capaz de autoasociación. MORT-1 es también capaz de activar la citotoxicidad celular por sí mismo, una actividad posiblemente relacionada con su capacidad de autoasociación. También se ha encontrado ahora que la coexpresión de la región en MORT-1 (HF-1) que contiene la secuencia de homología del “dominio de muerte” (MORT-DD, presente en la parte C-terminal de MORT-1) interfiere en gran medida con la muerte celular inducida por FAS, como se esperaría de su capacidad para unirse al “dominio de muerte” del FAS-IC. Además, en las mismas condiciones experimentales, se encontró que la coexpresión de la parte de MORT-1 que no contiene la región MORT-DD (la parte N-terminal de MORT-1, aminoácidos 1-117, “cabeza de MORT-1”) dio como resultado la no interferencia de la muerte celular inducida por FAS, y en todo caso, una citotoxicidad celular inducida por FAS algo potenciada.

Por consiguiente, es probable que MORT-1 también se una a otras proteínas implicadas en procesos de señalización intracelular. Estas proteínas de unión a MORT-1 pueden por lo tanto actuar también como mediadores

o moduladores indirectos del efecto del ligando de FAS-R sobre las células mediando o modulando la actividad de MORT-1; o estas proteínas de unión a MORT-1 pueden actuar directamente como mediadores o moduladores del proceso de señalización intracelular asociado a MORT-1 mediando o modulando la actividad de MORT-1, que, como se ha indicado anteriormente, tiene una capacidad aparentemente independiente para activar la citotoxicidad celular. Estas proteínas de unión a MORT-1 se pueden usar también en cualquiera de los procedimientos de cribado estándares para aislar, identificar y caracterizar proteínas, péptidos, factores, anticuerpos, etc., adicionales, que pueden estar implicados en el proceso de señalización asociado a MORT-1 o asociado a FAS-R o pueden ser elementos de otros procesos de señalización intracelular. Se han aislado dichas proteínas de unión a MORT-1 y están descritas en la presente memoria (véase el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3). Una de estas proteínas de unión a MORT-1, aquí designada MACH, fue inicialmente clonada, secuenciada, y parcialmente caracterizada, teniendo las siguientes propiedades: el cDNA de MACH codifica el marco de lectura abierto ORF-B; MACH se une a MORT-1 de una manera muy fuerte y específica; el sitio de unión de MACH en MORT-1 tiene lugar aguas arriba del resto del “dominio de muerte” MORT-1; la región ORF-B de MACH es su parte que interacciona con MORT-1; y MACH es capaz de autoasociación y de inducir citotoxicidad celular sobre sí misma.

De acuerdo con la presente invención, se ha demostrado ahora, como se ha mencionado antes, que MACH en realidad existe en un número de isoformas. Además, el ORF-B de MACH indicado anteriormente es de hecho una de las isoformas de MACH designadas en la presente memoria MACH 1 (véase más adelante).

Por consiguiente, la presente invención proporciona una secuencia de DNA que codifica una proteína o sus análogos o fragmentos, capaz de unirse a MORT-1 o interaccionar con él, siendo capaces dichas proteínas sus análogos o fragmentos, de mediar el efecto intracelular mediado por el FAS-R o p55-TNF-R, y de tener actividad de proteasa.

En particular, aunque la presente invención se refiere a las secuencias de DNA reivindicadas la presente descripción proporciona una secuencia de DNA seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de cDNA derivada de la región codificadora de una proteína de unión a MORT-1 natural;

(b): secuencias de DNA capaces de hibridación a una secuencia de (a) en condiciones moderadamente rigurosas y que codifica una proteína de unión a MORT-1 biológicamente activa; y

(c): secuencias de DNA que están degeneradas como resultado del código genético en relación a las secuencias de DNA definidas en (a) y (b) y que codifican una proteína MORT-1 biológicamente activa.

Otra realización específica de la secuencia de DNA anterior de la descripción es una secuencia de DNA que comprende al menos parte de la secuencia que codifica al menos una isoforma de la proteína MACH seleccionada de las isoformas de MACH designadas en la presente memoria: MACHa1, MACHa2, MACHa3, MACH 2, MACH 1, MACH 3, MACH 4 y MACH 5.

Otras realizaciones específicas de la secuencia de DNA de la descripción indicada anteriormente son las secuencias de DNA que codifican:

(a): una isoforma de MACH seleccionada de MACHa1, MACH 1 y MACH 3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 7, 5 y 8 respectivamente, y análogos y fragmentos de una cualquiera de ellas;

(b): MACHa1 que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:7, y sus análogos y fragmentos;

(c): MACH 1 que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:5, y sus análogos y fragmentos;

(d): MACH 3 que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:8, y sus análogos y fragmentos.

En la presente invención se proporcionan proteínas de unión a MORT-1, y sus análogos, fragmentos o derivados, codificados por cualquiera de las secuencias de la invención anteriores, siendo capaces dichas proteínas, o sus

análogos, fragmentos y derivados, de unirse o interaccionar con MORT-1 y mediar el efecto intracelular mediado por el FAS-R o p55-TNF-R, y de tener actividad de proteasa.

Una realización específica de la descripción es la proteína de unión a MORT-1, y sus análogos, fragmentos y derivados, que se seleccionan de al menos una isoforma de MACH del grupo que comprende MACHa1, MACHa2, MACHa3, MACH 1, MACH 2, MACH 3, MACH 4 y MACH 5 que tienen al menos parte de sus secuencias de aminoácidos.

También la presente invención proporciona vectores que codifican la proteína de unión a MORT-1 reivindicada, y sus análogos, fragmentos o derivados, de la invención que contienen la secuencia de DNA reivindicada de la invención, siendo estos vectores capaces de ser expresados en células hospedantes eucariotas o procariotas; células hospedantes eucariotas o procariotas transformadas que contienen dichos vectores; y un método para producir la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados, de la invención haciendo crecer dichas células hospedantes transformadas en condiciones adecuadas para la expresión de dichas proteína, y sus análogos, fragmentos o derivados, efectuando modificaciones post-traduccionales de dicha proteína, si en necesario, para obtener dicha proteína y extrayendo dicha proteína, o sus análogos, fragmentos o derivados, expresados del medio de cultivo de dichas células transformadas o de extractos celulares de dichas células transformadas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona también los anticuerpos, o sus derivados o fragmentos, activos reivindicados para la proteína de unión a MORT-1, y sus análogos, fragmentos y derivados, de la invención.

Incluso en otro aspecto de la invención, se proporcionan diversos usos de las secuencias de DNA reivindicadas o de las proteínas que codifican, de acuerdo con la invención, incluyendo dichos usos entre otros:

(i): Un método para la modulación del efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre las células que llevan un FAS-R o p55-R, que comprende tratar dichas células con una o más proteínas de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados, de la invención capaces de unirse a MORT-1, que se une al dominio intracelular de FAS-R

: o capaces de unirse a MORT-1 que se une a TRADD que se une al dominio intracelular de p55-R, y de este modo ser capaces de modular/mediar la actividad de dicho FAS-R o p55-TNF-R, en donde dicho tratamiento de dichas células comprende introducir en dichas células dicha una o más proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados, en una forma adecuada para su introducción intracelular, o introducir en dichas células una secuencia de DNA que codifica dicha una o más proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados, en forma de un vector adecuado que lleva dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células.

(ii): Un método para la modulación del efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre las células de acuerdo con el apartado (i) anterior, en donde dicho tratamiento de células comprende introducir en dichas células dicha proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados, en una forma adecuada para su introducción intracelular

: o introducir en dichas células una secuencia de DNA que codifica dicha proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados, en forma de un vector adecuado que lleve dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células.

(iii) Un método como el del apartado (ii) anterior en el que dicho tratamiento de dichas células es por transfección de dichas células con un vector viral recombinante de animal que comprende las etapas de:

(a): construir un vector viral recombinante de animal que lleve una secuencia que codifique una proteína de superficie viral (ligando) que sea capaz de unirse a un receptor específico de superficie celular sobre la superficie de una células que lleva FAS-R- o p55-R y una segunda secuencia que codifique una proteína seleccionada de una proteína de unión a MORT-1, y sus análogos, fragmentos y derivados, que cuando se expresa en dichas células sea capaz de modular/mediar la actividad de dicho FAS-R o p55-R; y

(b) infectar dichas células con dicho vector de (a).

(iv): Un método para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células que llevan un FAS-R o un p55-R que comprende tratar dichas células con anticuerpos, o sus fragmentos o derivados, activos de acuerdo con la invención, consistiendo dicho tratamiento en la aplicación de una composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, o sus fragmentos o derivados, activos para dichas células, en donde cuando la proteína de unión a MORT-1, o las porciones de dichas células, se exponen en la superficie extracelular, dicha composición se formula para aplicación extracelular, y cuando dichas proteínas de unión a MORT-1 son intracelulares, dicha composición se formula para aplicación intracelular.

(v): Un método para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células que llevan un FAS-R o p55-R que comprende tratar dichas células con una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de al menos parte de la secuencia de la proteína de unión a MORT-1 de la invención, siendo dicha secuencia de oligonucleótidos capaz de bloquear la expresión de la proteína de unión a MORT-1.

(vi): Un método como el del apartado (ii) anterior para tratar células tumorales o células infectadas por VIH u otras células patógenas, que comprende:

(a): construir un vector viral recombinante de animal que lleve una secuencia que codifique una proteína de superficie viral capaz de unirse a un receptor específico de superficie de una célula tumoral o un receptor de

5 superficie de una célula infectada por VIH o un receptor llevado por otras células patógenas y una secuencia que codifica una proteína seleccionada de proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos y derivados, de la invención, que cuando se expresa en dicha célula tumoral, infectada por VIH o patógena es capaz de matar a dicha célula; y

(b) infectar dichas células tumorales o infectadas por VIH u otras células patógenas con dicho vector de (a).

10 (vii) Un método para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células, que comprende aplicar el procedimiento con ribozimas en el que un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interaccionar con una secuencia de mRNA celular que codifica una proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con la invención, se introduce en dichas células en una forma que permita la expresión de dicha secuencia de ribozima en dichas células y en donde cuando dicha secuencia de ribozima se expresa en dichas células interacciona con dicha secuencia de

15 mRNA celular y escinde dicha secuencia de mRNA dando como resultado la inhibición de la expresión de dicha proteína de unión a MORT-1 en dichas células.

(viii) Un método seleccionado del método de acuerdo con la invención, en donde dicha secuencia que codifica la proteína de unión a MORT-1 comprende al menos una de las isoformas de MACH, o análogos, fragmentos y derivados de cualquiera de ellas, de acuerdo con la invención que son capaces de unirse específicamente a MORT

20 1 que a su vez se une específicamente a FAS-IC, o que son capaces de unirse a MORT-1 que a su vez se une a TRADD y que a su vez se une a la p55-IC.

(ix) Un método para aislar e identificar proteínas, de acuerdo con la invención, capaces de unirse a la proteína MORT-1, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos en levadura en el que una secuencia que codifica dicha proteína MORT-1 es llevada por un vector híbrido y una secuencia procedente de una genoteca de cDNA o

25 DNA genómico es llevada por el segundo vector híbrido, utilizándose a continuación los vectores para transformar células hospedantes de levadura y aislándose las células transformadas positivas, seguido por la extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicha proteína MORT-1, siendo dicha proteína las proteínas de unión a MORT-1.

(x) Un método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (i)-(ix) anteriores, en donde dicha proteína de

30 unión a MORT-1 es la isoforma de MACH de la presente memoria denominada MACHa1, o sus análogos, fragmentos y derivados.

(xi) Un método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (i)-(ix) anteriores, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es la isoforma de MACH de la presente memoria denominada MACH 1, o sus análogos, fragmentos y derivados.

35 (xii) Un método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (i)-(ix) anteriores, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es la isoforma de MACH de la presente memoria denominada MACH 3, o sus análogos, fragmentos y derivados.

Aunque la presente invención se refiere a los usos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas reivindicados, la presente descripción proporciona también una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando

40 de FAS-R o de TNF sobre células que comprende, como ingrediente activo, una cualquiera de las siguientes:

(i) una proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con la invención, y sus fragmentos, análogos, derivados o mezclas biológicamente activos;

(ii) un vector viral recombinante de animal que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie

celular y que codifica una proteína de unión a MORT-1, o sus fragmentos o análogos, biológicamente activos, de 45 acuerdo con la invención;

(iii) una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de la proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con la invención, en donde dicho oligonucleótido puede ser la segunda secuencia del vector viral recombinante de animal del apartado (ii) anterior.

50 La presente descripción proporciona también:

I. Un método para la modulación del efecto inducido por MORT-1 o el efecto inducido por la proteína de unión a MORT-1 sobre células, que comprende tratar dichas células de acuerdo con un método de uno cualquiera de los apartados (i)-(xi) anteriores, con proteínas de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados, o con secuencias que codifican proteínas de unión a MORT-1, sus análogos o fragmentos, dando como resultado dicho

55 tratamiento la mejora o inhibición de dicho efecto mediado por MORT-1 y por lo tanto también del efecto mediado por FAS-R o p55-R.

II. Un método como el anterior en el que dicha proteína de unión a MORT-1, su análogo, fragmento o derivado, es la parte de la proteína de unión a MORT-1 que está específicamente implicada en la unión a MORT-1 o una proteína de unión a MORT-1 propiamente dicha o dicha secuencia de la proteína de unión a MORT-1 codifica dicha parte de la proteína de unión a MORT-1 que está específicamente implicada en la unión a MORT-1 o la proteína de unión a MORT-1 propiamente dicha.

III. Un método como el anterior en el que dicha proteína de unión a MORT-1 es una cualquiera de las isoformas de MACH seleccionadas de MACHa1, MACH 1 y MACH 3, siendo dichas isoformas de MACH capaces de mejorar el efecto asociado a MORT-1 sobre células y por lo tanto también de mejorar el efecto asociado a FAS-R o p55-R sobre las células.

Como surge de todo lo anteriormente mencionado, así como de la descripción detallada aquí a continuación, MACH puede ser usada de modo independiente de MORT-1 para tratar células o tejidos. El aislamiento de las proteínas de unión a MORT-1, su identificación y caracterización pueden ser llevadas a cabo por cualquiera de las técnicas de cribado estándares usadas para aislar e identificar proteínas, por ejemplo, el método de dos híbridos en levadura, métodos de cromatografía de afinidad, y cualquiera de los otros procedimientos estándares bien conocidos usados para este fin.

Se proporcionan también otros aspectos y realizaciones de la presente invención que surgen de la siguiente descripción detallada de la invención.

Debe observarse que, cuando se usan a lo largo de esta descripción, los siguientes términos: “Modulación del efecto de ligando de FAS o de TNF sobre células”; y “Modulación del efecto de la proteína de unión a MORT-1 o MORT-1 sobre células” se entiende que abarcan tanto un tratamiento in vitro como in vivo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la interacción de MORT-1 con FAS-IC y la autoasociación de MORT-1 en levaduras transformadas según evaluadas por un ensayo de expresión de -galactosidasa en dos híbridos.

La Figura 2 representa esquemáticamente las secuencias de nucleótidos preliminar (SEQ ID NO: 1) y de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) de MORT-1 (HF1) en donde el “dominio de muerte” está subrayado, ya que es un posible sitio de iniciación de la traducción, es decir, el residuo de metionina subrayado en la posición 49 (en negrita, subrayado M). El asterisco indica el codón de parada de la traducción (nucleótidos 769-771). Al principio y en mitad de cada línea hay dos números que representan las posiciones relativas de los nucleótidos y aminoácidos de la secuencia con respecto al comienzo de la secuencia (extremo 5'), en donde el primer número indica el nucleótido y el segundo número indica el aminoácido.

La Figura 3 es una secuencia de nucleótidos parcial preliminar que codifica una proteína de unión a MORT-1 obtenida de un clon de cDNA.

Las Figuras 4 A-C representan esquemáticamente el cDNA de MACH y su proteína codificada, en donde en la Fig. 4A se muestra la estructura del cDNA de MACH que codifica dos marcos de lectura abiertos de MACH (ORF-A y ORF-B), indicando la zona rayada del ORF-B su región que tiene homología con la proteína MORT-1; en la Fig. 4B, se muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 5) para la región del ORF-B de MACH, siendo los residuos de aminoácidos subrayados la región que tiene homología con MORT-1 (correspondiente a la región rayada de la Fig. 4A); y en la Fig. 4C, se muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4) de la molécula de cDNA de MACH entera (designada MACH 1).

La Figura 5 representa los resultados que ilustran la interacción de MORT-1 y MACH en las células de levadura transfectadas.

La Figura 6 representa gráficamente el desencadenamiento, independiente de ligandos, de los efectos citocidas en células HeLa transfectadas con vectores de expresión controlados por tetraciclina que codifican MACH, comparado con los efectos en estas células transfectadas con tales vectores que codifican otras proteínas, tales como luciferasa (luc, control negativo), FAS-IC, MORT-1, y células cotransfectadas con vectores que codifican MORT-1 y MACH.

Las Figuras 7A y 7B muestran la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:5) de MACH 1 (Fig. 7A). La Fig. 7B muestra la homología de secuencias del módulo MORT en MACH 1, MORT-1 y PEA-15 (SEQ ID NO: 6).

La Figura 8 es una representación esquemática de las interacciones del receptor y la diana que participan en la inducción de la muerte celular por FAS/APO1 y p55, estando indicado el módulo del dominio de muerte por bandas, estando indicado el módulo MORT en gris y estando indicada la región CED3/ICE en negro.

Las Figuras 9 A-C representan los resultados que ilustran la interacción in vitro de MACH 1 y sus mutantes por deleción con MORT-1. La Fig. 9A muestra la evaluación de la expresión de las proteínas y sus tamaños moleculares por inmunoprecipitación de lisados celulares usando un anticuerpo anti-FLAG. La Fig. 9B muestra la unión por afinidad de las proteínas a GST-MORT-1, adsorbidas en perlas de glutation-agarosa (o, como control, a GST o GST

fusionado al dominio intracelular de FAS-APO-1). La Fig. 9C muestra los resultados de las inmunoprecipitaciones de las diversas construcciones de fusión MORT-1 y MACH usando diversos anticuerpos específicos.

La Figura 10 es una representación esquemática de las diversas isoformas de MACH.

La Figura 11 es un alineamiento esquemático de secuencias de aminoácidos colineales de las isoformas de MACH, MACHa1 (SEQ ID NO: 7), MACH 1 (SEQ ID NO: 5) y MACH 3 (SEQ ID NO: 8) y los diversos miembros conocidos de la familia de proteasas CED3/ICE, CED-3 (SEQ ID NO: 9), Ich-11/Nedd2 (SEQ ID NO: 10), ICErelIII (SEQ ID NO: 11), Tx/Ich2/ICErelII (SEQ ID NO: 12), ICE (SEQ ID NO: 13), CPP-32 (SEQ ID NO: 30), Mcn2a (SEQ ID NO: 31). Los residuos de aminoácidos están numerados tanto a la izquierda como a la derecha de cada secuencia. Líneas de puntos: huecos en la secuencia para permitir el alineamiento óptimo. Los aminoácidos que son idénticos en al menos tres de los miembros de la familia de proteasas CED3/ICE mostradas están enmarcados. Los módulos MORT aguas arriba de la región de homología CED3/ICE están enmarcados. Los sitios de las deleciones Cterminales empleados en este estudio están indicados por líneas discontinuas. Los bloques de cuatro aminoácidos aguas abajo de la región del módulo MORT, que varían entre las diversas isoformas de MACH (bloques 1-4) están indicados por líneas en la parte superior. Dentro de la región de homología CED3/ICE, los aminoácidos que se alinean con residuos en ICE implicados en la actividad catalítica por análisis de cristales por rayos X se indican como sigue: los residuos supuestamente implicados en catálisis, correspondientes a His237, Gly238 y Cys285 en ICE están marcados por círculos rellenos por debajo del alineamiento (•). Los residuos que constituyen la cavidad de unión para la cadena lateral de carboxilato del P1 Asp, corresponiente a Arg179, correspondiente a Arg179, Gln283, Arg341 y Ser347 en ICE, están marcados mediante círculos vacios por debajo del alineamiento (O). Los residuos de Ala aguas arriba de los residuos que corresponden a Cys285 en ICE, y los residuos Arg y Gly aguas abajo a esta Cys, están conservados en todas las proteasas previamente descritas de la familia CED3/ICE. Los residuos próximos a los residuos P1-P4 del sustrato están marcados por triángulos por debajo del alineamiento (L).Los sitios de escisión de Asp-X conocidos y supuestos y los sitios potenciales de escisión encontrados en localizaciones similares en MACH están enmarcados. Las flechas indican los extremos N- y C-terminales de las subunidades p20 y p10 de ICE y de las subunidades p17 y p12 de CPP32. Los extremos C-terminales de las proteínas están indicados por asteriscos (*).

Las Figuras 12A-F describen los resultados que ilustran la actividad de proteasa de MACHa1 a 15 minutos (Fig. 12A), 30 minutos (Fig. 12B), 60 minutos (Fig. 12C), 90 minutos (Fig 12D), 180 minutos (Fig. 12E). La Fig. 12F muestra la actividad proteolítica a lo largo del tiempo a una concentración específica de sustrato.

Las Figuras 13A y 13B muestran la actividad de proteasa de la región de homología de CED3/ICE en MACHa. A: Cinética de escisión del sustrato fluorogénico derivado de la secuencia de PARP, Ac-DEVD-AMC (50 µM), por extractos de E. coli que expresan una proteína de fusión con GST de la región de homología de CED3/ICE en MACHa1 (Ser217 hasta el extremo C-terminal de la proteína (�) en comparación con la falta de escisión por extractos de bacterias que expresan los productos de fusión con GST de MACHa1 de longitud completa (O), o de la región de homología de CED3/ICE en la que Cys360 estaba remplazada por Ser (∇), o por extractos de bacterias que expresan productos de fusión con GST de cada uno de los dos productos proteolíticos potenciales de la región de homología de CED3/ICE (Ser217 hasta Asp373 (L) y Ser375 hasta Asp479, el extremo C terminal de la proteína (L)). B: dependencia de la concentración del sustrato del escisión de Ac-DEVD-AMC. El sustrato se incubó durante 180 minutos con extractos de bacterias que expresan el producto de fusión con GST de la región de homología de CED3/ICE de MACHa1 (�). La escisión de este sustrato por los extractos fue inhibida en presencia de ácido yodoacético (5 mM, �). No fue escindido Ac-YVAD-AMC, un sustrato fluorogénico que corresponde a un sitio de escisión de ICE en el precursor de IL-1 (e).

Las Figuras 14A-D muestran la muerte celular mediada por MACHa1 y MACHa2.

La Figura 15 representa gráficamente la muerte celular mediada por MACHa1 y MACHa2.

Las Figuras 16A-D muestran la morfología de las células en las que la muerte celular fue inducida o bloqueada.

La Figura 17 muestra gráficamente que las moléculas MACHa que contienen una región CED3/ICE no funcional bloquean la inducción de la muerte celular por p55-R.

La Figura 18 muestra que las moléculas MACHa que contienen una región CED3/ICE no funcional bloquean la inducción de la muerte celular por FAS/APO1.

La Figura 19 muestra la muerte de células HeLa que expresan de modo transitorio FAS/APO1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere, en un aspecto, a nuevas proteínas de unión a MORT-1, que tienen actividad de proteasa y son capaces de unirse a MORT-1, o interaccionar con ella, y por ello de unirse al dominio intracelular del receptor FAS-R, al cual se une MORT-1, o de unirse al dominio intracelular del p55-TNF-R, al cual se une la proteína TRADD (véase el Ejemplo 2 y como se ha indicado antes) y al cual se une MORT-1 y la proteína TRADD. Por consiguiente, las proteínas de unión a MORT-1 de la presente invención son consideradas como mediadores o

moduladores de FAS-R, que tienen un papel en, por ejemplo, el proceso de señalización que es iniciado por la unión del ligando de FAS al FAS-R, e igualmente tienen también un papel en el proceso de señalización que es iniciado por la unión del TNF a p55-R. Entre las proteínas de unión a MORT-1 de la presente invención están las nuevas isoformas de MACH recientemente descubiertas con actividad de proteasa, cuyas secuencias de DNA y aminoácidos son nuevas secuencias que no aparecen en los bancos de datos de secuencias de DNA o aminoácidos “GENBANK” o “PROTEIN BANK”.

Más particularmente, según la presente descripción se han descrito diversos homólogos de mamíferos de la proteasa de nemátodo, CED3. Estos han sido designados isoformas de MACH (isoformas MACHa y MACH ) que, aunque están estrechamente relacionadas, muestran, sin embargo, algunas diferencias de estructura y de especificidad de sustrato, y como tales pueden servir para funciones algo diferentes en células de mamífero. Ciertamente, se conocen dos actividades diferentes de las proteasas. Parece que el papel principal de ICE es el procesamiento del precursor de IL-1 , mientras que se ha demostrado claramente que CED3 sirve como un efector de la muerte celular programada. Este último papel parece ser también el papel de al menos algunos de los homólogos de mamíferos (algunas isoformas de MACH). La secuencia de aminoácidos de MACHa1 muestra un estrecho parecido con CPP32, el homólogo de mamífero más próximo conocido de CED3. La especificidad de sustrato de MACH es también similar a la de CPP32, excepto que MACHa1 parece tener una especificidad de sustrato más restringida que la de CPP32. CPP32 escinde preferencialmente el péptido sustrato correspondiente a un sitio de escisión en poli (ADP ribosa) polimerasa (PARP), aunque también tiene cierta actividad proteolítica contra el péptido que corresponde al sitio de escisión de ICE en el precursor de IL-1 . Sin embargo, parece que MACHa1 sólo es capaz de escindir la secuencia derivada de PARP. Estas relaciones de MACHa1 para CPP32 y CED3, y sus disimilitudes con ICE, son concordantes con la idea de que MACHa1 sirve, de modo similar a CED3, como regulador de la muerte celular. MACHa1 muestra, sin embargo, algunas características de secuencias que la distinguen de CED3 y de CPP32, así como de todos los otros miembros de la familia CED3/ICE. La parte C terminal de MACHa1, aguas arriba de su región de homología con CED3/ICE, no muestra en absoluto similitud con la región aguas arriba de cualquiera de los otros homólogos. Hay también algunas características de secuencias únicas para la región de homología de CED3/ICE de la proteína. Estas diferencias sugieren que MACHa1 pertenece a una distinta rama evolutiva de la familia y que su contribución a la muerte celular difiere algo de la de los homólogos de CED3/ICE previamente descritos.

Una diferencia importante puede referirse al modo en el que es regulada la función de la proteasa. Estando ambas implicadas en los procesos de muerte celular relacionados con el desarrollo y en la inmunocitolisis inducida por el receptor, la escisión de las proteínas por proteasas de la familia CED3/ICE debe ser susceptible de regulación, tanto por las señales que se forman dentro de la célula como por señales que emanan de los receptores de la superficie celular. En procesos de muerte celular durante el desarrollo, la activación de tales proteasas parece implicar mecanismos que afectan a la expresión génica, dando como resultado una síntesis potenciada de las proteasas, así como una síntesis disminuida de proteínas similares a BCL-2, que antagonizan su efecto apoptótico. Este claramente no es el caso, sin embargo, de la citotoxicidad desencadenada por FAS-R o los receptores de TNF. Las células pueden ser destruidas por TNF o por el ligando de FAS-R aún cuando su actividad de síntesis de proteínas esté completamente bloqueada (son de hecho entonces destruidas más eficazmente) y en estas condiciones permanecen dependientes de estímulos. La activación de proteasas de la familia CED3/ICE por los receptores de TNF y FAS-R puede así tener lugar mediante un mecanismo que es independiente de la síntesis de proteínas. Las propiedades de secuencia únicas de MACHa1 pueden permitirle tomar parte en dicho mecanismo.

Según el conocimiento de los inventores, no se ha descrito hasta ahora otra proteasa que se asocie, directamente o a través de una proteína adaptadora, con el dominio intracelular de un receptor de la superficie celular. Incluso por inferencia del modo de acción de las proteínas asociadas a receptores que tienen otras actividades enzimáticas, parece plausible que la unión de MACHa1 a MORT-1 permite la estimulación de la actividad proteasa de MACHa1 por desencadenamiento de FAS-R. También puede permitir la activación de la proteasa por el p55-R, a través de la unión de MORT-1 a TRADD, que se une a p55-R.

Se encontraron que otros miembros de la familia CED3/ICE exhibían una actividad completa sólo después del procesamiento proteolítico, que tiene lugar por su autoescisión o por efectos de otras proteasas de esta familia (revisado por Kumar, 1995; Henkart, 1996). El efecto citotóxico resultante de la coexpresión de los dos potenciales productos principales de autoescisión de MACHa1, al contrario de la falta de citotoxicidad en las células que expresan la región de homología con CED3/ICE de longitud completa, es concordante con la posibilidad de que también MACHa1 alcanza actividad completa sólo después de su procesamiento. La actividad enzimática observada en lisados de bacterias que expresan la región de longitud completa refleja aparentemente el autoprocesamiento de la proteína producida en estas condiciones o el procesamiento por algunas proteasas de bacterias. Es desconocido el modo en que tiene lugar este procesamiento dentro de la célula de mamífero, y como puede ser provocado por desencadenamiento de FAS-R y p55-R, ni incluso está claro que contribución relativa tiene la actividad de proteasa de MACHa1 sobre la citotoxicidad inducida por FAS-R y TNF. La evaluación de esta contribución se complica por el hecho de que también la expresión de MACH 1, que carece de la región de homología con CED3/ICE, da como resultado una marcada citotoxicidad. Presumiblemente, esta citotoxicidad refleja la capacidad de MACH 1 para unirse a MACHa1. Debido a esta capacidad, las moléculas de MACH transfectadas pueden imponer, después de agregación, un cambio conformacional en las moléculas de MACHa1 que son endógenas de las células

transfectadas. Tal mecanismo puede explicar también la citotoxicidad observada cuando moléculas que actúan aguas arriba de MACH, (MORT-1, TRADD o los dominios de muerte del p55-R o FAS-R) están sobre-expresadas en las células. En este momento, sin embargo, no se puede excluir que la citotoxicidad observada después de la expresión inducida de MACH o de moléculas que actúan aguas arriba de ella, refleje, además de la actividad proteolítica de la región de homología con CED3/ICE en MACH, también la activación de algunos de los otros mecanismos que se creía que tomaban parte en el efecto citotóxico de FAS-R y p55-R (por ejemplo, la activación de la esfingomielinasa neutra o ácida). Tampoco se puede excluir que la actividad proteolítica de la región de homología de con CED3/ICE sirva para otras funciones aparte de la inducción de citotoxicidad. Una idea más clara de la función de MACHa1 debe deducirse mediante la identificación de las proteínas sustrato endógenas que son escindidas por activación de MACHa1. Encontrar modos de eliminar la actividad de MACHa1 según se desee, por ejemplo por expresión de moléculas inhibidoras, contribuirá también a comprender la función de esta proteína, y servirá como un modo de regular su actividad cuando se desee.

Dentro de células que expresan MACHa1 pueden existir inhibidores naturales de la proteasa abarcada por esta proteína. Se ha demostrado que la existencia de isoformas alternativamente empalmadas para algunos de los otros miembros de la familia CED3/ICE constituye un modo de restricción fisiológica de la función de estas proteasas. Se documentaron algunas de las isoformas de estas otras proteasas que actúan como inhibidores naturales de las isoformas de longitud completa, aparentemente formando heterodímeros inactivos con ellas. Este puede ser el caso también para algunas isoformas de MACH, por ejemplo, MACHa3, en las que no existe el sitio de escisión potencial del extremo N-terminal y los mutantes de MACHa1 cuya región de homología con CED3/ICE es deficiente. La expresión de tales isoformas inhibidoras puede constituir un mecanismo de autoprotección celular frente a la citotoxicidad de FAS-R y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas de MACH, que excede ampliamente la heterogeneidad observada para cualquiera de las otras proteasas de la familia CED3/ICE, puede permitir un ajuste particularmente refinado de la función de la forma activa de esta proteína. También parece posible que algunas de las isoformas de MACH cumplan otras funciones. La capacidad de MACH 1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACHa1 sugiere la posibilidad de que algunas de estas isoformas, y tal vez también otras isoformas de MACH, no tengan un efecto inhibidor, sino más bien un efecto potenciador sobre la función de las isoformas enzimáticamente activas. Parece posible que algunas isoformas no sirvan para un papel relacionado con la citotoxicidad, sino más bien para actuar como sitios de anclaje para moléculas que están implicadas en otros efectos, no citotóxicos, de FAS-R y TNF.

Debido a la capacidad única de FAS-R y los receptores de TNF de causar la muerte celular, así como la capacidad de los receptores de TNF de desencadenar otras diversas actividades de daño tisular, una anomalía de la función de estos receptores puede ser particularmente dañina para el organismo. Ciertamente, se ha demostrado que tanto una función excesiva como deficiente de estos receptores contribuyen a las manifestaciones patológicas de diversas enfermedades. Identificar moléculas que toman parte en la actividad de señalización de estos receptores, y encontrar modos de modular la función de estas moléculas, constituye una pista potencial para nuevas propuestas terapéuticas para estas enfermedades. En vista del papel central sospechado de MACHa1 en la toxicidad de FAS-R y TNF, parece particularmente importante diseñar fármacos que puedan bloquear la función proteolítica de esta molécula, como se ha hecho para algunos otros miembros de la familia CED3/ICE. Las características de secuencias únicas del homólogo CED3/ICE comprendidas en las moléculas de MACHa1 pueden permitir diseñar fármacos que pueden afectar a su protección frente a una citotoxicidad excesiva mediada por el sistema inmunitario sin interferir con los procesos de muerte celular fisiológica, en los que están implicados otros miembros de la familia CED3/ICE.

Por tanto, la presente invención también se refiere a la secuencia de DNA que codifica una proteína de unión a MORT-1 y a las proteínas de unión a MORT-1 codificadas por las secuencias de DNA, que tienen actividad de proteasa.

Por otro lado, la presente invención se refiere además a secuencias de DNA que codifican los análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos reivindicados de la proteína de unión a MORT-1, y los análogos, fragmentos y derivados codificados por las mismas. La preparación de tales análogos, fragmentos y derivados se realiza por un procedimiento estándar (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989) en el que en las secuencias de DNA que codifican la proteína de unión a MORT-1, uno o más codones pueden estar delecionados, añadidos o sustituidos por otro, para proporcionar análogos que tienen al menos un cambio de residuos de aminoácidos con respecto a la proteína natural.

Un polipéptido o proteína que “corresponde sustancialmente” a la proteína de unión a MORT-1 incluye no sólo la proteína de unión a MORT-1, sino también polipéptidos o proteínas que son análogos a la proteína de unión a MORT-1 y tienen actividad de proteasa.

Análogos que corresponden sustancialmente a la proteína de unión a MORT-1 son los polipéptidos en los que uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a MORT-1 han sido remplazados por otros aminoácidos, delecionados y/o insertados, siempre que las proteína resultante exhiba sustancialmente la misma o mayor actividad biológica que la proteína de unión a MORT-1 a la cual corresponde.

Con el fin de corresponder sustancialmente a la proteína de unión a MORT-1, los cambios en la secuencia de las proteínas de unión a MORT-1, tales como las isoformas de MACH son general y relativamente secundarios. Aunque el número de cambios puede ser más de diez, preferiblemente no hay más de diez cambios, más preferiblemente no más de cinco, y más preferiblemente no más de tres de dichos cambios. Aunque se puede usar cualquier técnica para encontrar proteínas potencial y biológicamente activas que correspondan sustancialmente a las proteínas de unión a MORT-1, una de dichas técnicas es el uso de técnicas de mutagénesis convencional en el DNA que codifica la proteína, dando como resultado unas pocas modificaciones. Las proteínas expresadas por tales clones pueden ser entonces cribadas para la unión a MORT-1 y/o para la actividad mediada por FAS-R y p55-R.

Los cambios “conservadores” son los cambios que no se esperaría que afecten a la actividad de la proteína y son normalmente los primeros en ser cribados ya que de estos no se esperaría que cambien sustancialmente el tamaño, la carga o la configuración de la proteína y por tanto no se esperaría que cambien sus propiedades biológicas.

Las sustituciones conservadoras de las proteínas de unión a MORT-1 incluyen un análogo en el que al menos un residuo de aminoácidos en el polipéptido ha sido remplazado de modo conservador por un aminoácido diferente. Tales sustituciones se realizan preferiblemente según la siguiente lista presentada en la Tabla IA, sustituciones que pueden ser determinadas mediante la experimentación de rutina para proporcionar propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula polipeptídica sintetizada mientras que se mantiene la actividad biológica característica de la proteína de unión a MORT-1.

Tabla IA

Residuo original: Sustitución ilustrativa

Ala: Gly; Ser

Arg: Lys

Asn: Gln; His

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Ala;Pro

His: Asn;Gln

Ile: Leu;Val

Leu: Ile;Val

Lys: Arg;Gln;Glu

Met: Leu;Tyr;Ile

Phe: Met;Leu;Tyr

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp;Phe

Val: Ile;Leu

Alternativamente, otro grupo de sustituciones de la proteína de unión a MORT-1 son aquellas en las que ha sido eliminado al menos un residuo de aminoácido en el polipéptido y en su lugar se ha insertado un residuo diferente según la Tabla IB siguiente. Los tipos de sustituciones que pueden realizarse en el polipéptido se pueden basar en el análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homóloga de diferente especie, tal como los presentados en la Tabla 1-2 de Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY, 1998, y las Figuras 3-9 de Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Co., San Francisco, CA 1983. Basadas en uno de tales análisis, las sustituciones conservadoras alternativas se definen en la presente memoria como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

TABLA IB

1.: Residuos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2.: Residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;

3.: Residuos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys;

4.: Residuos grandes alifáticos no polares: Met, Leu, Ile, Val (Cys); y

5.: Residuos grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp.

Los tres residuos de aminoácidos entre paréntesis en la tabla anterior tienen funciones especiales en la arquitectura de las proteínas: Gly es el único residuo que carece de una cadena lateral y por tanto imparte flexibilidad a la cadena. Esto tiende, sin embargo, a promover la formación de una estructura secundaria distinta de la hélice a. Pro, debido a su geometría inusual, restringe mucho la cadena y generalmente tiende a promover estructuras similares a giros , aunque en algunos casos Cys puede ser capaz de participar en la formación de enlaces disulfuro que es

importante en el plegamiento de la proteína. Obsérvese que Schulz et al., supra, unirán los Grupos 1 y 2 anteriores. Obsérvese también que Tyr, debido a su potencial de enlaces de hidrógeno, tiene un parentesco significativo con Ser y Thr, etc.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, como se presentan anteriormente, son conocidas en la técnica y se esperaría que mantuvieran las propiedades biológicas y estructurales del polipéptido después de una sustitución de aminoácidos. La mayoría de las deleciones y sustituciones de acuerdo con la presente invención son aquellas que no producen cambios radicales en las características de la proteína o molécula polipeptídica. El término “características” de una manera no inclusiva se define tanto para cambios en la estructura secundaria, por ejemplo, la hélice a o la lámina , así como cambios en la actividad biológica, por ejemplo, la unión de MORT-1 o mediación del efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre las células.

Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que se pueden usar para obtener análogos de proteínas de unión a MORT-1 para su uso en la presente invención incluyen cualquiera de las etapas de los métodos conocidos, tales como los presentados en las patentes de EE.UU. RE 33.653, 4.959.314, 4.588.585 y

4.737.462: de Mark et al.; 5.116.943 de Koths et al., 4.965.195 de Namen et al.: 4.879.111 de Chong et al., y

5.017.691: de Lee et al.; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de EE.UU. Nº. 4.904.584 (Shaw et al.).

Además de las sustituciones conservadoras tratadas anteriormente que no cambiarían significativamente la actividad de la proteína de unión a MORT-1, se pretende que las sustituciones conservadoras o menos conservadoras y cambios más aleatorios, que conduzcan a un aumento en la actividad biológica de los análogos de las proteínas de unión a MORT-1, estén dentro del alcance de la invención.

Cuando se ha de confirmar el efecto exacto de la sustitución o deleción, un experto en la técnica apreciará que el efecto de la(s) sustitución(es), deleción(es), etc., será evaluado por unión de rutina y ensayos de muerte celular. El cribado que usa tal ensayo estándar no implica una experimentación indebida.

Análogos aceptables son aquellos que conservan al menos la capacidad de unión a MORT-1 y tienen actividad de proteasa, y de ese modo, como se ha indicado anteriormente median la actividad (por ejemplo, por la actividad de proteasa) de FAS-R y p55-R. De tal modo, se pueden producir análogos que tienen el así llamado efecto dominante negativo, a saber, un análogo que es defectuoso en la unión a MORT-1, o en una señalización subsiguiente o actividad de proteasa que sigue a dicha unión. Tales análogos se pueden usar, por ejemplo, para inhibir el efecto del ligando de FAS compitiendo con las proteínas de unión a MORT-1 naturales. Por ejemplo, parece probable que las isoformas de MACH, MACHa2 y MACHa3 sean análogos “naturales” que sirven para inhibir la actividad de MACH compitiendo con la unión de las isoformas de MACH (proteasas) activas a MORT-1 que parece ser esencial en la activación de estas isoformas de MACH. Una vez que las isoformas activas de MACH no pueden unirse a MORT-1, las vías de señalización intracelular mediada por FAS-R y p55-R estarán por tanto también inhibidas. De igual modo, se pueden producir los llamados análogos dominante positivos que servirían para potencial el efecto del ligando de FAS o de TNF. Estos tendrían las mismas o mejores propiedades de unión a MORT-1 y las mismas o mejores propiedades de señalización de las proteínas de unión a MORT-1 naturales.

A nivel genético, estos análogos se preparan generalmente por mutagénesis dirigida a un sitio de nucleótidos en el DNA que codifica la proteína de unión a MORT-1, produciendo de ese modo un DNA que codifica el análogo, y después sintetizando el DNA y expresando el polipéptido en cultivo de células recombinantes. Los análogos exhiben típicamente la misma o mayor actividad biológica cualitativa que la proteína presente de origen natural, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley-Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

La preparación de una proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con lo anterior, o una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica el mismo polipéptido, pero que difiere de la secuencia natural debido a los cambios permitidos por la degeneración conocida del código genético, se puede conseguir mediante mutagénesis específica de sitio del DNA que codifica un análogo preparado anteriormente o una versión natural de una proteína de unión a MORT-1. La mutagénesis dirigida a un sitio permite la producción de análogos por el uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de DNA de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador del tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión por deleción que está siendo atravesada. Típicamente, se prefiere un cebador de una longitud de alrededor de 20 a 25 nucleótidos, con alrededor de 5 a 10 nucleótidos complementarios en cada lado de la secuencia que está siendo alterada. En general, la técnica de mutagénesis específica de un sitio es bien conocida, como se ilustra en publicaciones tales como la de Adelman et al., DNA 2:183 (1983), cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia.

Como se apreciará, la técnica de mutagénesis específica de un sitio emplea típicamente un vector fago que, existe tanto en la forma monocatenaria como la bicatenaria. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida a un sitio incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, como se ha descrito por Messing et al., Third Cleveland

Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA. Editor A. Walton, Elsevier, Ámsterdam (1981), cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia. Estos fagos están fácilmente disponibles en el comercio y su uso es generalmente muy conocido por los expertos en la técnica. Alternativamente, se pueden emplear vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación de fago monocatenario (Veira et al., Meth. Enzymol. 153;3, 1987) para obtener DNA monocatenario.

En general, la mutagénesis dirigida a un sitio de acuerdo con lo anterior se realiza obteniendo primero un vector monocatenario que incluye en su secuencia una secuencia de DNA que codifica el polipéptido relevante. Se prepara sintéticamente un cebador oligonucleotídico que lleva la secuencia mutada deseada mediante síntesis automatizada de DNA/oligonucleótidos. Este cebador se asocia luego con el vector que contiene la secuencia proteínica monocatenaria y se somete a enzimas de polimerización de DNA, tales como el fragmento de Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Así, una secuencia mutada y la segunda cadena llevan la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa luego para transformar las células apropiadas, tales como las células JM101 de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes que llevan el reordenamiento de la secuencia mutada.

Después de que se selecciona dicho clon, la proteína de unión a MORT-1 mutada se puede separar y colocarla en un vector apropiado, generalmente un vector de transferencia o de expresión del tipo que puede ser empleado para la transfección de un hospedante apropiado.

Por consiguiente, el gen o el ácido nucleico que codifica una proteína de unión a MORT-1 también se puede detectar, obtener y/o modificar in vitro, in situ y/o in vivo, por el uso de técnicas de amplificación del DNA o RNA conocidas, tales como PCR y síntesis química de oligonucleótidos. La PCR permite la amplificación (aumento en número) de secuencias de DNA específicas por reacciones repetidas con DNA-polimerasa. Esta reacción se puede usar como sustitución de la clonación; todo lo que se requiere es un conocimiento de la secuencia de ácidos nucleicos. Para llevar a cabo una PCR, se diseñan cebadores que sean complementarios a las secuencias de interés. Los cebadores se generan entonces por síntesis automatizada de DNA. Debido a que los cebadores pueden ser diseñados para hibridarse a cualquier parte del gen, se pueden crear condiciones de tal modo que puedan ser tolerados los desaparejamientos (mismatches) en el aparejamiento de bases complementarias. La amplificación de estas regiones desaparejadas puede conducir a la síntesis de un producto mutagenizado que da como resultado la generación de un péptido con nuevas propiedades (es decir, la mutagénesis dirigida a un sitio). Véase también, por ejemplo, Ausubel, supra Ch.16. También, acoplando la síntesis de DNA complementario (cDNA), que usa transcriptasa inversa, con PCR, se puede usar RNA como material de partida para la síntesis del dominio extracelular de un receptor de prolactina sin clonar.

Además, se pueden diseñar cebadores de PCR para incorporar nuevos sitios de restricción u otras características, tales como los codones de terminación en los extremos del segmento génico que ha de ser amplificado. Esta colocación de los sitios de restricción en los extremos 5’ y 3’ de la secuencia génica amplificada permite que los segmentos génicos que codifican la proteína de unión a MORT-1 o uno de sus fragmentos sean diseñados a la medida para la ligación de otras secuencias y/o sitios de clonación en vectores.

La PCR y otros métodos de amplificación de RNA y/o DNA son bien conocidos en la técnica y se pueden usar de acuerdo con la presente invención sin una experimentación indebida, basada en la enseñanza y guía presentadas en la presente memoria. Los métodos conocidos de amplificación de DNA o RNA incluyen, aunque sin limitación: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (véanse por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188 de Mullis et al.; 4.795.699 y 4.921.794, de Tabor et al.; 5.142.033 de Innis; 5.122.464 de Wilson et al.; 5.091.310 de Innis; 5.066.584 de Gyllesten et al.; 4.889.818 de Gelfand et al. 4.994.370 de Silver et al.; 4.766.067 de Biswas; 4.656.134 de Ringold; e Innis et al., eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) y amplificación mediada por RNA que usa RNA antisentido para la secuencia diana como molde para la síntesis de DNA bicatenario (patente de EE.UU. Nº: 5.130.238 de Malek et al., con la marca registrada NASBA): y la inmuno-PCR que combina el uso de la amplificación del DNA con marcado con anticuerpos (Ruzicka et al., Science 260:487 (1993); Sano et al., Science 258:120 (1992); Sano et al., Biotechniques 9: 1378 (1991)), incorporándose en la presente memoria, como referencia, en su totalidad los contenidos completos de dichas patentes y documentos.

De manera análoga, los fragmentos biológicamente activos de las proteínas de unión a MORT-1 (por ejemplo, los de cualquiera de las isoformas de MACH)se pueden preparar como se indica anteriormente con respecto a los análogos de las proteínas de unión a MORT-1. Fragmentos adecuados de las proteínas de unión a MORT-1 son los que conservan la capacidad de unión a MORT-1 y la actividad de proteasa y que pueden mediar la actividad biológica de FAS-R y p55-R como se indicó anteriormente. Por consiguiente, se pueden preparar fragmentos de la proteína de unión a MORT-1 que tengan un efecto dominante negativo o dominante positivo como se indicó antes con respecto a los análogos. Debe tenerse en cuenta que estos fragmentos representan una clase especial de los análogos de la invención, a saber, son porciones definidas de las proteínas de unión a MORT-1 derivadas de la secuencia completa de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, de la de una cualquiera de las isoformas de MACH), teniendo cada uno de tales porciones o fragmentos las actividades deseadas anteriormente indicadas. Tales fragmentos pueden ser, por ejemplo, un péptido.

Similarmente, se pueden preparar derivados por modificaciones estándares de los grupos laterales de uno o más residuos de aminoácidos de la proteína de unión a MORT-1, sus análogos o fragmentos, o por conjugación de la proteína de unión a MORT-1, sus análogos o fragmentos, a otra molécula, por ejemplo, un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como es muy conocido en la técnica. Consecuentemente, el término “derivados” como se usa en la presente memoria abarca derivados que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales que están presentes en las cadenas laterales en los residuos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y están incluidos en la invención. Los derivados pueden tener restos químicos, tales como residuos de carbohidrato o fosfato, siempre que tal fracción tenga la misma o mayor actividad biológica que las proteínas de unión a MORT-1.

Por ejemplo, los derivados pueden incluir ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo o grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, el de los residuos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

El término “derivado” se pretende que incluya sólo los derivados que no cambian un aminoácido por otro de los veinte aminoácidos normalmente presentes de manera natural.

Aunque la proteína de unión a MORT-1 es una proteína o polipéptido, es una secuencia de residuos de aminoácidos. Un polipéptido que consiste en una secuencia más larga que incluye la secuencia entera de una proteína de unión a MORT-1, de acuerdo con las definiciones de la presente memoria, se pretende que se incluya en el alcance de tal polipéptido siempre que las adiciones no afecten a las características básicas y nuevas de la invención, es decir, si conservan o aumentan la actividad biológica de la proteína de unión a MORT-1 o pueden ser escindidas para dejar una proteína o polipéptido que tenga la actividad biológica de la proteína de unión a MORT-1. Así, por ejemplo, se pretende que la presente descripción incluya las proteínas de fusión de la proteína de unión a MORT-1 con otros aminoácidos o péptidos.

Las nuevas proteínas de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos y derivados, tienen un diversos usos, por ejemplo:

(i): La proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos y derivados, se pueden usar para imitar o potenciar la función de MORT-1 y por tanto del ligando de FAS-R o de TNF, en situaciones en las que se desea un efecto potenciado del ligando de FAS-R o de TNF, tal como en aplicaciones antitumoral, anti-inflamatoria, anti-VIH, etc., en donde se desea citotoxicidad inducida por ligando de FAS-R o por TNF. En este caso, la proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados, que potencian el efecto del ligando de FAS-R o de TNF, es decir, el efecto citotóxico, se pueden introducir en las células por procedimientos estándares conocidos per se. Por ejemplo, como las proteínas de unión a MORT-1 son intracelulares y deben ser introducidas sólo en las células en las que se desea el efecto del ligando de FAS-R o de TNF, es necesario un sistema para la introducción específica de estas proteínas en las células. Un modo de hacer esto es creando un virus recombinante de animales, por ejemplo, uno derivado del virus de la viruela vacuna, cuyo DNA se introducirán los siguientes dos genes: el gen que codifica un ligando que se une a las proteínas de la superficie celular específicamente expresadas por las células, por ejemplo, tales como la proteína gp120 del virus del SIDA (VIH) que se une específicamente a algunas células (linfocitos CD4 y leucemias relacionadas), o cualquier otro ligando que se una específicamente a las células que llevan un FAS-R o p55-R, de tal modo que el vector viral recombinante será capaz de unirse a talas células que llevan FAS-R o p55-R; y el gen que codifica la proteína de unión a MORT-1. Así, la expresión de la proteína de unión a la superficie celular en la superficie del virus dirigirá el virus específicamente a la célula tumoral u otras células que lleven FAS-R o p55-R, después de lo cual la secuencia que codifica la proteína de unión a MORT-1 será introducida en las células vía el virus, y una vez expresada en las células, dará como resultado el potenciamiento del efecto del ligando de FAS-R o de TNF que conduce a la muerte de las células tumorales u otras células que llevan FAS-R o p55-R que se deseen matar. La construcción de tal virus recombinante de animal se realiza por procedimientos estándares (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, una cualquiera de las isoformas de MACH) en forma de oligonucleótidos que pueden ser absorbidos por las células y expresados en ellas.

(ii): Se pueden usar para inhibir el efecto del ligando de FAS-R o de TNF, por ejemplo, en casos tales como daño tisular en choque séptico, rechazo de injerto frente a hospedante o hepatitis aguda, en los que se desea bloquear la señalización intracelular de FAS-R o p55-R inducida por el ligando de FAS-R o por TNF. En esta situación, es posible, por ejemplo, introducir en las células, por procedimientos estándares, oligonucleótidos que tienen la secuencia codificadora antisentido de la proteína de unión a MORT-1, que bloquearía eficazmente la traducción de los mRNA que codifican la proteína MORT-1 o la proteína de unión a MORT-1 y de ese modo bloquean su expresión y conducen a la inhibición del efecto del ligando de FAS-R o de TNF. Tales oligonucleótidos se pueden introducir en las células usando la propuesta del virus recombinante anterior, siendo la segunda secuencia llevada por el virus la secuencia de oligonucleótidos.

Otra posibilidad es usar anticuerpos específicos para la proteína de unión a MORT-1 para inhibir su actividad de señalización intracelular.

Otra modo más de inhibir el efecto del ligando de FAS-R o de TNF es por la propuesta de ribozimas recientemente desarrollada. Las ribozimas son moléculas de RNA catalíticas que escinden específicamente los RNA. Las ribozimas se pueden modificar por ingeniería genética para escindir los RNA dianas de elección, por ejemplo, los mRNA que codifican las proteínas de unión a MORT-1 de la invención. Tales ribozimas tendrían una secuencia específica para el mRNA de la proteína de unión a MORT-1 y serían capaces de interaccionar con él (unión complementaria) seguido por escisión del mRNA, dando como resultado una disminución (o pérdida completa) de la expresión de la proteína de unión a MORT-1, dependiendo el nivel de la expresión disminuida del nivel de expresión de ribozimas en la célula diana. Para introducir ribozimas en las células de elección (por ejemplo, las que llevan FAS-R o p55-R) se puede usar cualquier vector adecuado, por ejemplo, plásmidos, vectores virales de animales (retrovirus) que se usan normalmente para este fin (véase también (i) anteriormente, en donde el virus tiene, como segunda secuencia, un cDNA que codifica la secuencia de ribozima de elección). (Para revisiones, métodos etc. referentes a ribozimas véase Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 y Koizumi et al., 1993).

(iii) La proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados se pueden usar también para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, es decir, las que se unen al dominio intracelular de FAS-R o a receptores funcionalmente relacionados, o las que se unen a MORT-1 y de ese modo a receptores funcionalmente relacionados tales como FAS-R y p55-R, e implicadas en el proceso de señalización intracelular. En esta solicitud se puede usar el sistema de dos híbridos en levadura anteriormente mencionado o se puede usar un sistema recientemente desarrollado que emplea una hibridación de Southern no rigurosa seguida por clonación por PCR (Wilks et al., 1989). En la publicación de Wilks et al., se describe la identificación y clonación de dos supuestas proteínas tirosina quinasas por la aplicación de hibridación de Southern no rigurosa seguida por clonación por PCR basada en la secuencia conocida del resto de quinasa, una secuencia de quinasa concebida. Esta propuesta se puede usar, de acuerdo con la presente invención, usando la secuencia de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, cualquiera de las isoformas de MACH) para identificar y clonar las proteínas de unión a MORT-1 relacionadas.

(iv): Otra propuesta más para utilizar la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados, de la invención es usarlos en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores a los que son capaces de unirse, por ejemplo, MORT-1, u otras proteínas o factores implicados en el proceso de señalización intracelular. En esta solicitud, la proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados, de la presente invención, se pueden unir individualmente a matrices de cromatografía de afinidad y después ponerse en contacto con extractos celulares o proteínas o factores aislados que se sospecha que están implicados en el proceso de señalización intracelular. Después del procedimiento de cromatografía de afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados de la invención, se pueden eluir, aislar y caracterizar.

(v): Como se indicó anteriormente, la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados, de la invención, se pueden usar también como inmunógenos (antígenos) para producir anticuerpos específicos para ellos. Estos anticuerpos se pueden usar también para fines de purificación de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, isoformas de MACH) a partir de extractos celulares o de líneas celulares transformadas que producen la proteína de unión a MORT-1 o sus análogos o fragmentos. Además, estos anticuerpos se pueden usar para fines de diagnóstico para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anómalo del sistema de ligando de FAS-R

: o de TNF, por ejemplo, efectores celulares inducidos por ligando de FAS-R o por TNF sobre-activos o sub-activos. Así, si tales trastornos estuvieran relacionados con un mal funcionamiento del sistema de señalización intracelular que implican la proteína MORT-1, o la proteína de unión a MORT-1, tales anticuerpos servirían como una importante herramienta de diagnóstico.

Se debe indicar también que el aislamiento, identificación y caracterización de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, las isoformas de MACH) de la invención se pueden realizar usando cualquiera de los procedimientos de cribado estándares muy conocidos. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de cribado, el procedimiento de dos híbridos en levadura como está expuesto en la presente memoria (Ejemplo 1), se usó para identificar la proteína MORT-1 y subsiguientemente las proteínas de unión a MORT-1 (Ejemplos 2-3) de la invención. Similarmente como se indicó anteriormente y a continuación, se pueden emplear otros procedimientos, tales como cromatografía de afinidad, procedimientos de hibridación de DNA, etc. como se conocen en la técnica, para aislar, identificar y caracterizar la proteína de unión a MORT-1 de la invención o para aislar, identificar y caracterizar proteínas, factores, receptores, etc. adicionales que son capaces de unirse a la proteína MORT-1 o a las proteínas de unión a MORT-1 de la invención.

Como se ha expuesto anteriormente, se puede usar la proteína de unión a MORT-1 para generar anticuerpos específicos para las proteínas de unión a MORT-1, por ejemplo, isoformas de MACH. Estos anticuerpos o sus fragmentos se pueden usar como se exponen en la presente memoria a continuación en detalle, debiéndose entender que en estas aplicaciones los anticuerpos o sus fragmentos son los específicos para las proteínas de unión a MORT-1.

Basándose en los hallazgos de acuerdo con la presente invención de que al menos algunas de las isoformas de MACH (véase anteriormente y en el Ejemplo 3 más adelante) son proteasas relacionadas con las proteasas de la

familia de proteasas CED3/ICE, se prevén las siguientes aplicaciones médicas específicas para estas isoformas de MACH: se ha encontrado que los inhibidores específicos de otras proteasas CED3/ICE, algunos de las cuales son permeables a las células, ya existen, y pueden bloquear eficazmente los procesos de muerte celular programada. Por lo tanto, es posible de acuerdo con la presente invención, diseñar inhibidores que puedan impedir la muerte celular inducida por el ligando de FAS-R o por TNF, las vías en las que están implicadas las isoformas de las proteasas MACH. Además, en vista de las características de secuencias únicas de estas nuevas proteasas MACH, parece posible diseñar inhibidores que serán altamente específicos para los efectos inducidos por TNF y por el ligando de FAS-R. Los hallazgos de la presente invención también proporcionan un modo de estudiar el mecanismo en el que se activa la “proteasa asesina” en respuesta al ligando de FAS-R y a TNF, permitiendo esto el desarrollo subsiguiente de fármacos que puedan controlar la extensión de esta activación. Hay muchas enfermedades en las que tales fármacos pueden ser de gran ayuda. Entre otras, hepatitis aguda en la que el daño agudo al hígado parece reflejar la muerte de las células hepáticas mediada por el ligando de FAS-R; la muerte celular inducida por autoinmunidad, tal como la muerte de las células de Langerhans del páncreas, que da como resultado diabetes; la muerte de células en el rechazo de injertos (por ejemplo, riñón, corazón e hígado); la muerte de los oligodendrocitos en el cerebro en esclerosis múltiple, y el suicidio de los linfocitos T inhibido en el SIDA que causa la proliferación del virus del SIDA y por tanto la enfermedad SIDA.

Como se ha mencionado anteriormente y a continuación en la presente memoria, parece que dos de las isoformas de MACH, MACHa2 y MACHa3, pueden servir como inhibidores “naturales” de las isoformas de las proteasas MACH, y éstas pueden por tanto ser empleadas como los inhibidores específicos anteriormente mencionados de estas proteasas MACH. De igual modo, pueden también ser cribadas otras sustancias, tales como péptidos, compuestos orgánicos, anticuerpos, etc., para obtener fármacos específicos que sean capaces de inhibir las proteasas MACH.

Un ejemplo no limitativo de como se diseñarían y cribarían los inhibidores peptídicos de las proteasas MACH se basa en estudios previos de inhibidores peptídicos de proteasas ICE o similares a ICE, la especificidad de sustrato de ICE y estrategias para el análisis de epítopos usando síntesis de péptidos. Se encontró que el requisito mínimo para escisión eficaz del péptido por ICE implica cuatro aminoácidos a la izquierda del sitio de escisión con una fuerte preferencia por el ácido aspártico en la posición P1 y siendo suficiente la metilamina a la parte derecha de la posición P1 (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). Además, el péptido sustrato fluorogénico (un tetrapéptido), acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metil-cumaril-7-amida) abreviadamente Ac-DEVD-AMC, corresponde a una secuencia de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) que se sabe que es escindida en las células poco después de la estimulación con FAS-R, así como otros procesos apoptóticos (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994), y es escindida de modo eficaz por CPP32 (un miembro de la familia de proteasas CED3/ICE) y proteasas MACH.

Como parece que Asp en la posición P1 la posición del sustrato es importante, los tetrapéptidos que tienen Asp como cuarto residuo de aminoácido y diversas combinaciones de aminoácidos en las tres primeras posiciones de los residuos pueden ser cribados rápidamente para la unión al sitio activo de las proteasas MACH usando, por ejemplo, el método desarrollado por Geysen (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987) en el que se cribó un gran número de péptidos en soportes sólidos para las interacciones específicas con anticuerpos. La unión de las proteasas MACH a péptidos específicos se puede detectar por una variedad de métodos de detección muy conocidos por los expertos en la técnica, tal como radiomarcado de la proteasa MACH, etc. Este método de Geysen demostró ser capaz de analizar al menos 4000 péptido cada día laboral.

Puesto que puede ser ventajoso diseñar inhibidores peptídicos que inhiban selectivamente las proteasas MACH sin interferir con los procesos de muerte celular fisiológica en los que están implicados otros miembros de la familia de proteasas CED3/ICE, la mezcla de péptidos que se unen a las proteasas MACH en un ensayo, tal como el descrito anteriormente, se puede sintetizar además como un péptido sustrato fluorogénico para el análisis de la escisión selectiva por proteasas MACH sin ser escindidas por otras proteasas CED3/ICE. Los péptidos que se determina que son escindidos selectivamente por las proteasas MACH, pueden ser luego modificados para potenciar la permeabilidad celular e inhibir la actividad de muerte celular de MACH reversible o irreversiblemente. Thornberry et al., (1994) documentaron que un tetrapéptido (aciloxi)metil-cetona Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2,6-(CF3)2]Ph fue un potente inactivador de ICE. De igual modo, Milligan et al., (1995) documentaron que los inhibidores tetrapeptídicos que tienen un grupo clorometilcetona (irreversiblemente) o aldehído (reversiblemente) inhibían ICE. Además, se demostró que un grupo benciloxicarboxil-Asp-CH2OC(O)-2,6-diclorobenceno (DCB) inhibía ICE (Mashima et al., 1995). Por consiguiente, los tetrapéptidos que se unen selectivamente a las proteasas MACH pueden ser modificados con, por ejemplo, un grupo aldehído, clorometilcetona, (aciloxi) metil-cetona o un grupo CH2OC(O)-DCB para crear un inhibidor peptídico de la actividad de proteasa de MACH.

Aunque algunos inhibidores específicos de otras proteasas CED3/ICE son permeables en las células, puede necesitarse potenciar la permeabilidad celular de los inhibidores peptídicos. Por ejemplo, los péptidos se pueden modificar o derivatizar químicamente para potenciar su permeabilidad a través de la membrana celular y facilitar el transporte de tales péptidos a través de la membrana y en el citoplasma. Muranishi et al., (1991) documentaron la derivatización de la hormona liberadora de tirotropina con ácido láurico para formar un derivado de lauroilo lipófilo con buenas características de penetración a través de las membranas celulares. Zacharia et al., (1991) también documentaron la oxidación de la metionina a sulfóxido y la sustitución del enlace peptídico por su isoéster de

cetometileno (COCH2) para facilitar el transporte de péptidos a través de la membrana celular. Estos son sólo algunas de los derivados y modificaciones que son muy conocidos por los expertos en la técnica.

Además, los fármacos o inhibidores peptídicos, que son capaces de inhibir la actividad de muerte celular de MACHa1 y MACHa2, pueden ser conjugados o complejados con moléculas que facilitan la entrada en la célula.

La patente de EE.UU. 5.149.782 describe la conjugación de una molécula que ha ser transportada a través de la membrana celular con un agente de unión a membranas, tales como polipéptidos fusogénicos, polipéptidos formadores de canales iónicos, otros polipéptidos de membrana y ácidos grasos de cadena larga, por ejemplo, ácido mirístico, ácido palmítico. Estos agentes de unión a membranas insertan los conjugados moleculares en la bicapa lipídica de las membranas celulares y facilitan su entrada en el citoplasma.

Low et al., en la Patente de EE.UU. 5.108.921, revisa los métodos disponibles para el suministro transmembranal de moléculas tales como, aunque sin limitación: proteínas y ácidos nucleicos por el mecanismo de actividad endocítica mediada por receptores. Estos sistemas de receptores incluyen los que reconocen galactosa, manosa, manosa-6fosfato, transferrina, asialoglicoproteína, transcobalamina (vitamina B12), macroglobulinas a-2, insulina y otros factores de crecimiento peptídicos, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF). Low et al., enseñan que los receptores de nutrientes, tales como receptores para biotina y folato, se pueden usar ventajosamente para potenciar el transporte a través de la membrana celular debido a la localización y multiplicidad de los receptores de biotina y folato en las superficies de membranas de la mayoría de las células y los procesos asociados de transporte transmembranal mediados por receptores. Así, un complejo formado entre un compuesto que ha de ser introducido en el citoplasma y un ligando, tal como biotina o folato, se pone en contacto con una membrana celular que lleva o receptores de biotina o folato para iniciar el mecanismo de transporte transmembranal mediado por los receptores y permitir de ese modo la entrada del compuesto deseado en la célula.

Se sabe que ICE tiene capacidad para tolerar las sustituciones liberales en la posición P2 y se explotó esta tolerancia a las sustituciones liberales para desarrollar un marcado por afinidad potente y altamente selectivo que contiene una etiqueta de biotina (Thornberry et al., 1994). Por consiguiente, la posición P2, así como posiblemente el extremo Nterminal del inhibidor tetrapeptídico, se puede modificar o derivatizar, tal como por la adición de una molécula de biotina, para potenciar la permeabilidad de estos inhibidores peptídicos a través de la membrana celular.

Además, se sabe en la técnica que fusionar una secuencia peptídica deseada con una secuencia de péptido líder/señal para crear un “péptido quimérico” permitirá que dicho péptido quimérico sea transportado a través de la membrana celular y que entre en el citoplasma.

Como se apreciará por los expertos en la técnica de péptidos, se que los inhibidores peptídicos de la actividad proteolítica de MACH de acuerdo con la presente invención, incluyen fármacos o inhibidores peptidomiméticos, que también pueden ser rápidamente cribados para la unión a la proteasa MACH para diseñar tal vez inhibidores más estables.

También se apreciará que los mismos medios para facilitar o potenciar el transporte de los inhibidores peptídicos a través de la membrana celular como se ha indicado anteriormente son también aplicables a las isoformas de MACH propiamente dichas, así como a otros péptidos y proteínas que ejercen sus efectos intracelularmente.

Con respecto a los anticuerpo mencionados a lo largo de la presente memoria, el término “anticuerpo” pretende significar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos quiméricos, anticuerpo antiidiotípicos (anti-Id) para anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como sus fragmentos proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, aunque sin limitación: escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, conteniendo sustancialmente dicha población sitios de unión de epítopos similares. Los mAb se pueden obtener por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse por ejemplo Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); Patente de EE.UU. Nº 4.376.110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Intersciences N.Y., (1992-1996), el contenido de cuyas referencias está completamente incorporado en la presente memoria como referencia. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquiera de sus subclases. Un hibridoma que produce un mAb de la presente invención puede ser cultivado in vitro, in situ o in vivo. La producción de altos títulos de los mAb in vivo o in situ hace de éste el método de producción actualmente preferido.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas de las cuales se derivan diferentes porciones a partir de diferentes especies animales, tales como las que tienen la región variable derivada de un mAb de múridos y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en su aplicación y aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los mAb de

múridos tienen mayores rendimientos a partir de hibridomas, pero una mayor inmunogenicidad en seres humanos, de modo que se usan los mAb quiméricos humanos/de múridos. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., solicitud de patente europea 125023 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., solicitud de patente europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison et al., solicitud de patente europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger et al., solicitud de patente PCT WO 8601533 (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo et al., solicitud de patente europea 184187 (publicada el 11 de Junio de 1986); Sahagan et al., J. Immunol 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., solicitud de patente internacional Nº WO 8702671 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Estos documentos se incorporan en su totalidad en la presente memoria como referencia.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, raza de ratón) como la fuente de los mAb frente a los cuales se prepara un anticuerpo anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo frente a estos determinantes idiotípicos (el anticuerpos anti-Id). Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº: 4.699.880, la cual en su totalidad se incorpora como referencia en la presente memoria.

El anticuerpo anti-Id se puede usar también como un “inmunógeno” para inducir una respuesta inmunitaria incluso en otro animal, produciendo el llamado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Así, usando anticuerpos frente a los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

Por consiguiente, los mAb generados frente a las proteínas de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados, de la presente invención se pueden usar para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células del bazo de tales ratones inmunizados se usan para producir híbridomas anti-Id que secretan los mAb anti-Id. Además los mAb anti-Id pueden acoplarse a un vehículo, tal como la hemocianina de lapa bocallave (KLH) y usarse para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tendrán las propiedades de unión del mAb original específico para un epítopo de la proteína de unión a MORT-1 o sus análogos, fragmentos y derivados anteriores.

Los mAb anti-Id tienen, por tanto, sus propios epítopos idiotípicos, o “idiotopos” estructuralmente similares al epítopo que se evalúa, tal como la proteína GRB-a.

El término “anticuerpo” también pretende incluir tanto moléculas intactas como sus fragmentos, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab’)2, que son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab’)2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Se apreciará que Fab y F(ab’)2 y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden usar para la detección y cuantificación de la proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria para moléculas de anticuerpo intactos. Tales fragmentos son típicamente producidos por escisión proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2).

Se dice que un anticuerpo es “capaz de unirse” a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para de ese modo unir la molécula al anticuerpo. El término “epítopo” pretende referirse a la porción de cualquier molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que puede también ser reconocida por ese anticuerpo. Los epítopos o “determinantes antigénicos” consisten normalmente en agrupaciones de moléculas en la superficie químicamente activa, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Un “antígeno” es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que es además capaz de inducir a un animal a producir un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. La reacción específica a la que se hace referencia anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpos útiles en la presente invención, se pueden usar para detectar cuantitativamente o cualitativamente la proteína de unión a MORT-1 en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan la proteína de unión a MORT-1 de la presente invención. Esto puede lograrse mediante técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase más adelante) acopladas a detección por microscopía óptica, citometría de flujo o por fluorometría.

Los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la presente invención se pueden emplear histológicamente, como en inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica, para la detección in situ de la proteína de unión a MORT-1 de la presente invención. La detección in situ se puede realizar tomando una muestra histológica de un paciente, y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo (o fragmento) se proporciona preferiblemente aplicando o solapando el anticuerpo (o fragmento) marcado a una muestra biológica. Utilizando dicho procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de la proteína de unión MORT-1, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que cualquiera de la amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) se pueden modificar para lograr dicha detección in situ.

Tales ensayos para la proteína de unión a MORT-1 de la presente invención comprenden típicamente incubar una muestra biológica, tal como un líquido biológico, un extracto tisular, células recién recogidas, tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo tisular, en presencia de un anticuerpo marcado detectablemente capaz de identificar la proteína de unión a MORT-1, y detectar el anticuerpo por cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica.

La muestra biológica se puede tratar con un soporte o vehículo en fase sólida, tal como nitrocelulosa, u otro soporte o vehículo sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte o vehículo se puede lavar luego con tampones adecuados, seguido por tratamiento con un anticuerpo marcado detectablemente de acuerdo con la presente invención, como se ha indicado anteriormente. El soporte o vehículo en fase sólida se puede lavar una segunda vez con el tampón para eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido en dicho soporte o vehículo sólido se puede detectar luego por medios convencionales.

Por “soporte en fase sólida”, “vehículo en fase sólida”, “soporte sólido”, “vehículo sólido”, “soporte” o “vehículo” se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de fijar antígenos o anticuerpos. Soportes o vehículos muy conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilón, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabro y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble en cierta medida o insoluble para los fines de la presente invención. El material soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Así, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una perla, cilíndrica como la superficie interior de un tubo de ensayo,

o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana como una lámina, tira de ensayo, etc. Los soportes o vehículos preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para la unión de anticuerpos o antígenos, o serán capaces de deducirlos usando experimentación rutinaria.

La actividad de unión de un lote de anticuerpos dado, de la invención como se ha indicado anteriormente se puede determinar de acuerdo con métodos muy conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación rutinaria.

Se pueden añadir a los ensayos otras de dicha etapas como lavado, agitación, remoción, filtración y similares como se acostumbra o sea necesario para una situación particular.

Uno de los modos por los que un anticuerpo de acuerdo con la presente invención se puede marcar detectablemente es uniéndolo el mismo a una enzima y usarlo en un inmunoensayo enzimático (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando luego es expuesta a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal manera que produzca un resto químico que pueda ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar detectablemente el anticuerpo incluyen, aunque sin limitación: malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano silvestre, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina-esterasa. La detección puede ser realizada por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también ser realizada por comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de un modo similar.

La detección se puede realizar usando cualquiera de la variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, por marcado radiactivo de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible detectar R-PTPasa usando un radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción de RIA se puede encontrar en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, de Works, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo titulado “An Introduction to Radioinmune Assay and Related Techniques” de Chard, T., incorporadas como referencias en la presente memoria. El isótopo radiactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de un contador Geiger o un contador de centelleo o por auto-radiografía.

También es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescentemente es expuesto a la luz con la apropiada longitud de onda su presencia puede ser detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes más comúnmente usados están el isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina, oftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo se puede marcar detectablemente también usando metales emisores de fluorescencia, tales como152E, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo usando grupos quelantes de metales como el ácido dietilentriaminapentaacético (ETPA).

El anticuerpo se puede marcar detectablemente también acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscente se determina luego detectando la presencia de la luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato.

De igual modo se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrado en sistemas biológicos en los que la proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción de quimioluminiscencia. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para fines de marcado son luciferina, luciferasa y aequorina.

Se puede adaptar una molécula de anticuerpo de la presente invención para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como el ensayo de “dos sitios” o “sándwich”. En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) sin marcar se une a un soporte o vehículo sólido y se añade una cantidad del anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o la cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Ensayos inmunométricos típicos, y preferidos, incluyen ensayos “directos” (“forward”) en los que el anticuerpo unido a la fase sólida se pone primeramente en contacto con la muestra que se analiza para extraer el antígeno de la muestra por formación de un complejo binario anticuerpo-antígeno en fase sólida. Después de un período de incubación adecuado, el soporte o vehículo sólido se lava para eliminar el residuo de la muestra de líquido, incluyendo el antígeno sin reaccionar, si lo hay, y después se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida del anticuerpo marcado (que actúa como una “molécula indicadora”). Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme complejo con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo sin marcar, el soporte o vehículo sólido se lava una segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado sin reaccionar.

En otro tipo de ensayo “sándwich”, que también puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se usa los ensayos denominados “simultáneo” e “inverso”. Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación cuando el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado se añaden ambos al mismo tiempo a la muestra que se analiza. Después de que se completa la incubación, el soporte o vehículo sólido se lava para eliminar el residuo de muestra fluida y el anticuerpo marcado no complejado. La presencia de anticuerpo marcado asociados al soporte o vehículo sólido se determina luego como se haría en un ensayo sándwich “directo” convencional.

En el ensayo “inverso” se utiliza una primera adición por etapas de una solución del anticuerpo marcado a la muestra de líquido seguida por la adición de anticuerpo sin marcar unido a un soporte o vehículo sólido después de un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, se lava la fase sólida de una manera convencional para liberarla del residuo de la muestra que se analiza y de la solución del anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado a un soporte o vehículo sólido se determina luego como en los ensayos “simultáneo” y “directo”.

Las proteínas de unión a MORT-1 de la invención pueden ser producidas por cualquier procedimiento de DNA recombinante estándar (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989 y Ansabel et al., 1987-1995, supra) en el que las células hospedantes eucarióticas o procarióticas adecuadas muy conocidas en la técnica son transformadas por vectores eucarióticos o procarióticos apropiados que contiene las secuencias que codifican las proteínas. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a dichos vectores de expresión y a hospedantes transformados para la producción de las proteínas de la invención. Como se mencionó anteriormente, estas proteínas incluyen también sus análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos, y por tanto los vectores que las codifican también incluyen vectores que codifican análogos y fragmentos de estas proteínas, y los hospedantes transformados incluyen los que producen tales análogos y fragmentos. Los derivados de estas proteínas producidas por los hospedantes transformados, son los derivados producidos por la modificación estándar de las proteínas o sus análogos o fragmentos.

La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden vectores virales recombinantes de animales que codifican las proteínas de unión a MORT-1, codificando también dichos vectores una proteína de superficie del virus capaz de unirse a proteínas de superficie específicas de las células diana (por ejemplo, células cancerosas) para dirigir la inserción de las secuencias de las proteínas de unión a MORT-1 en las células. Otras composiciones farmacéuticas de la invención comprenden como ingrediente activo: (a) una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia anti-sentido de la secuencia de la proteína de unión a MORT-1, o (b) fármacos que bloquean la actividad proteolítica de las isoformas de MACH.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen una cantidad suficiente del ingrediente activo para lograr el fin buscado. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados, que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden ser usadas farmacéuticamente y que pueden estabilizar tales preparaciones para la administración al sujeto que las necesita, como es conocido por los expertos en la técnica.

La proteína MACH de unión a MORT-1, se expresa en diferentes tejidos en niveles marcadamente diferentes y aparentemente también con diferentes patrones de isotipos. Esas diferencias contribuyen probablemente a las características específicas de tejidos de respuesta al ligando de FAS/APO-1 y al TNF. Como en el caso de otros homólogos de CED3/ICE (Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995) se encontró que las isoformas de MACH que contienen las regiones incompletas de CED3/ICE (por ejemplo, MACHa3) tienen un efecto inhibidor sobre la actividad de las moléculas MACHa1 o MACHa2 co-expresadas; también se encontró que bloquean la inducción de muerte por FAS/APO1 y p55-R. La expresión de tales isoformas inhibidoras en las células puede constituir un mecanismo de autoprotección celular frente a la citotoxicidad mediada por FAS/APO1 y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas de MACH, que excede ampliamente la observada para cualquiera de las otras proteasas de la familia CED3/ICE, debe permitir un ajuste particularmente fino de la función de las isoformas de MACH activas.

También es posible que algunas de las isoformas de MACH sirvan para otras funciones. La capacidad de MACHa1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACHa1 sugiere que esta isoforma podría en realidad potenciar la actividad de las isoformas enzimáticamente activas. Es probable que la suave citotoxicidad observada en los cultivos de 293-EBNA y MCF7 transfectados con esta isoforma y el efecto citotóxico bastante significativo que ejerce en células HeLa reflejen la activación de las moléculas MACHa endógenamente expresadas por unión a las moléculas MACH 1 transfectadas. Es imaginable, que algunas de las isoformas de MACH puedan actuar también como sitios de anclaje para moléculas que están implicadas en otros efectos no citotóxicos de los receptores de FAS/APO1 y TNF.

Debido a la capacidad única de los receptores de FAS/APO1 y de TNF para causar la muerte celular, así como la capacidad de los receptores de TNF para desencadenar otras actividades de daño tisular, las anomalías en la función de estos receptores podrían ser particularmente nocivas para el organismo. Efectivamente, se ha demostrado que tanto un funcionamiento excesivo como deficiente de estos receptores contribuye a manifestaciones patológicas de diversas enfermedades (Vassalli, 1992; Nagata and Golstein, 1995). La identificación de las moléculas que participan en la actividad de señalización de los receptores y el hallazgo de medios para modular la actividad de estas moléculas, podría dirigir a nuevas propuestas terapéuticas. En vista del papel central que se sospecha de MACHa en la toxicidad mediada por FAS/APO1 y TNF, parece particularmente importante diseñar fármacos que puedan bloquear la actividad proteolítica de MACHa, como se hizo para otras proteínas de la familia CED3/ICE (Thornberry et al., 1994; Millar et al., 1995; Mashima et al., 1995; Milligan et al., 1995; Enari et al., 1995, Los et al., 1995). Las características de secuencias únicas del homólogo CED3/ICE dentro de las moléculas MACHa podría permitir el diseño de fármacos que afectarían específicamente a su actividad. Tales fármacos podrían proporcionar protección frente a la citotoxicidad excesiva mediada por el sistema inmunitario que implica MACHa sin interferir con los procesos de muerte celular fisiológica en los que están implicados otros miembros de la familia CED3/ICE.

Otros aspectos de la invención serán evidentes de los siguientes ejemplos.

La invención será ahora descrita con más detalle en los siguientes ejemplos no limitativos y en los dibujos que se acompañan.

Debe advertirse también que los procedimientos de: i) cribado de dos híbridos y ensayo de expresión de galactosidasa de dos híbridos; (ii) expresión inducida, marcado metabólico e inmunoprecipitación de proteínas: (iii) unión in vitro; (iv) determinación de la citotoxicidad; y (v) análisis de Northern y de secuencias, como se exponen en los Ejemplos 1 (véase también Boldin et al., 1995b) y 2 a continuación, con respecto a MORT-1 y a una proteína de unión a MORT-1, son igualmente aplicables (con algunas modificaciones) para el aislamiento, clonación y caracterización correspondientes de MACH y sus isoformas. Estos procedimientos deben por tanto ser interpretados como la descripción completa de los mismos procedimientos usados para el aislamiento, clonación y caracterización de MACH de acuerdo con la presente invención, como se detalla en el Ejemplo 3 más adelante.

EJEMPLO 1: Clonación y aislamiento de la proteína MORT-1 que se une al dominio intracelular del FAS-R

(i) Cribado de dos híbridos y ensayo de expresión de -galactosidasa de dos híbridos

Para aislar proteínas que interaccionan con el dominio intracelular del FAS-R se usó el sistema de dos híbridos en levadura (Fields and Song, 1989). Brevemente, este sistema de dos híbridos es un ensayo genético basado en levaduras para detectar interacciones específicas proteína–proteína in vivo por restauración de un activador transcripcional eucariótico, tal como GAL4, que tiene dos dominios separados, un dominio de unión a DNA y un dominio de activación, los cuales dominios cuando se expresan y unen entre sí forman una proteína GAL4

restaurada, es capaz de unirse a una secuencia activadora aguas arriba que a su vez activa un promotor que controla la expresión de un gen indicador, tal como lacZ o HIS3, cuya expresión es fácilmente observada en las células cultivadas. En este sistema, los genes para las proteínas de interacción candidatas se clonan en vectores de expresión separados. En un vector de expresión, la secuencia de una proteína candidata se clona en fase con la secuencia del dominio de unión a DNA de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de unión a DNA de GAL4, y en el otro vector la secuencia de una segunda proteína candidata se clona en fase con la secuencia del dominio de activación de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de activación de GAL4. Los dos vectores híbridos se co-transforman luego en una cepa hospedante de levadura que tienen un gen indicador lacZ o HIS3 bajo el control de los sitios de unión a GAL4 aguas arriba. Sólo las células hospedantes transformadas (cotransformantes) en las que se expresan las dos proteínas híbridas y son capaces de interaccionar entre sí, serán capaces de expresar el gen indicador. En el caso del gen indicador lacZ, las células hospedantes que expresan este gen se volverán de color azul cuando se añade a los cultivos X-gal. De este modo, las colonias azules son indicadoras del hecho que las dos proteínas candidatas clonadas son capaces de interaccionar entre sí.

Usando este sistema de dos híbridos, el dominio intracelular, FAS-IC, se clonó, separadamente, en el vector pGBT9 (que lleva la secuencia de unión al DNA de GAL4, proporcionada por CLONTECH, USA, véase más adelante), para crear proteínas de fusión con el dominio de unión al DNA de GAL4. Para la clonación de FAS-R en pGBT9, se usó un clon que codifica la secuencia de cDNA de longitud completa de FAS-R (documento WO 9531544) a partir del cual el dominio intracelular (IC) fue escindido por procedimientos estándares usando diversas enzimas de restricción y aislado luego por procedimientos estándares e insertado en el vector pGBT9, abierto en su región de sitios de clonación múltiples (MCS), con las correspondientes enzimas de restricción adecuadas. Debe indicarse que el FAS-IC se extiende desde los residuos de aminoácidos 175-319 del FAS-R intacto, siendo esta porción que contienen los residuos 175-319 el FAS-IC insertado en el vector pGBT9.

El vector híbrido (quimérico) anterior se co-transfectó luego junto con una genoteca de cDNA de células HeLa humanas clonadas en el vector pGAD GH, que lleva el dominio de activación GAL4, en la cepa hospedante de levadura HF7c (todos los vectores observados anteriormente, pGBT9 y pGAD GH que llevan la genoteca de cDNA de células HeLa, y la cepa de levadura fueron comprados a Clontech Laboratories, Inc., USA, como parte del sistema de dos híbridos MATCHMAKER, Nº PT 1265-1). Las levaduras co-transfectadas se seleccionaron por su capacidad de crecer en medio carente de histidina (medio Hiso), siendo el crecimiento de colonias indicativo de transformantes positivos. Los clones de levadura seleccionados se analizaron luego para determinar su capacidad para expresar el gen lacZ, es decir, su actividad de lacZ, y esto se hace añadiendo X-gal al medio de cultivo, que es catabolizado para formar un producto de color azul por -galactosidasa, la enzima codificada por el gen lacZ. Por tanto, las colonias azules son indicadoras de un gen lacZ activo. Para la actividad del gen lacZ, es necesario que el activador de la transcripción de GAL4 esté presente en una forma activa en los clones transformados, a saber, que el dominio de unión a DNA de GAL4 codificado por el vector híbrido anterior esté combinado apropiadamente con el dominio de activación de GAL4 codificado por el otro vector híbrido. Dicha combinación sólo es posible si las dos proteínas fusionadas a cada uno de los dominios de GAL4 son capaces de interaccionar (unirse) de manera estable entre sí. Por tanto, las colonias His+ y azules (lacZ+) que fueron aisladas son colonias que fueron co-transfectadas con un vector que codifica FAS-IC y un vector que codifica un producto proteico de origen de células HeLa humanas que es capaz de unirse de modo estable a FAS-IC.

Se aisló el DNA plasmídico a partir de las colonias de levadura His+, lacZ+ anteriores y se sometió a electroporación en la cepa HB101 de E. coli por procedimientos estándares seguido por la selección de transformantes Leu+ y resistentes a ampicilina, siendo estos transformantes los que llevan el vector pGAD GH híbrido que tiene tanto las secuencias que codifican AmpR como Leu2. Dichos transformantes son por lo tanto clones que llevan las secuencias que codifican proteínas recientemente identificadas capaces de unirse al FAS-IC. El DNA plasmídico se aisló luego de estas E. coli transformadas y se volvió a analizar por:

(a): retransformación de éstas con el plásmido híbrido del dominio intracelular de FAS-R original (pGTB9 híbrido que lleva el FAS-IC) en la cepa HF7de levadura como se expuso anteriormente. Como controles, se usaron vectores que llevaban secuencias que codifican proteínas irrelevantes, por ejemplo, pACT-lamina o pGBT9 solas para la co-transformación con el plásmido que codifica la proteína de unión a FAS-IC (es decir, MORT-1). Las levaduras co-transformadas se analizaron luego para determinar su crecimiento en medio Hiso solo, o con niveles diferentes de 3-aminotriazol; y

(b): retransformación del DNA plasmídico y el plásmido híbrido de FAS-IC original y los plásmidos de control descritos en (a) en células hospedantes de levaduras de la cepa SFY526 y determinación de la actividad de lacZ+ (efectividad de la formación de -gal, es decir, formación de color azul)

Los resultados de los ensayos anteriores revelaron que el patrón de crecimiento de las colonias en medio Hisa fue idéntico al patrón de actividad de lacZ, como se determinó por el color de la colonia, es decir, las colonias His+ fueron también lacZ+. Además, se determinó la actividad de lacZ en cultivo líquido (condiciones de cultivo preferidas) después de la transfección de los híbridos de dominios de unión y de activación al DNA de GAL4 en los hospedantes de levadura SFY526 que tienen una mejor inducibilidad de lacZ con el activador de transcripción de GAL4 que la de las células hospedantes de levadura HF7.

Usando el procedimiento anterior, se identificó, aisló y caracterizó una proteína llamada anteriormente FADD, y ahora denominada MORT-1 por “Mediador de la toxicidad inducida por el receptor” (“Mediator of Receptor-induced Toxicity”).

Además, debe mencionarse también que en varios de los ensayos de expresión de la -galactosidasa en dos híbridos antes citado, se determinó también la expresión de la -galactosidasa por un ensayo de filtración preferido. En el cribado, se encontró que cinco de alrededor de 3x106 cDNA contenían el inserto MORT-1. Los insertos de cDNA de MORT-1 clonados, así aislados se secuenciaron luego usando procedimientos de secuenciación de DNA estándares. La secuencia de aminoácidos de MORT-1 (SEQ ID NO: 2) se dedujo a partir de la secuencia del DNA. La numeración de residuos en las proteínas codificadas por los insertos de cDNA son como en la base de datos Swiss Prot. Se produjeron mutantes por deleción por PCR, y los mutantes puntuales por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

(ii) Expresión inducida, marcado metabólico e inmunoprecipitación de proteínas

Se expresaron en células HeLa: MORT-1, unido por N al octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), FAS-IC, FAS-R, p55-R, una quimera constituida por el dominio extracelular de p55-R (aminoácidos 1-168) fusionado al dominio transmembranal e intracelular de FAS-R (aminoácidos 153-319), y el cDNA de luciferasa que sirve como control. La expresión se llevó a cabo usando un vector de expresión controlado por tetraciclina, en un clon de células HeLa (HtTa-1) que expresa un transactivador controlado por tetraciclina (Gossen and Bujard, 1992); véase también Boldin et al., 1995). El marcado metabólico con [35S]metionina y [35S]cisteína (DUPONT, Wilmington, DE, USA y Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) se realizó 18 horas después de la transfección, por una incubación adicional de 4 horas a 37ºC en medio de Eagle modificado por Dulbecco que carece de metionina y cisteína, pero suplementado de suero de ternera fetal dializado al 2%. Las células se lisaron luego en tampón RIPA (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato al 1%, SDS al 0,1% y EDTA 1 mM) y el lisado se preclarificó por incubación con antisuero de conejo irrelevante (3 µl/ml) y perlas de Proteína G-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia; 60 µl/ml). La inmunoprecipitación se realizó por incubación de 1 hora a 4ºC de partes alícuotas de 0,3 ml de lisado con anticuerpos monoclonales de ratón (5 µl/parte alícuota) frente al octapéptido FLAG (M2; Eastman Kodak), p55-R (Nº 18 y Nº 20; Engelmann et al., 1990), o FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) o con anticuerpos de ratón de isotipo igualado como controles, seguido por una incubación adicional de 1 hora con perlas de proteína G Sepharose (30 µl/ parte alícuota).

(iii) Unión in vitro

Se produjeron fusiones de glutation-S-transferasa (GST) con el tipo natural o mutado de FAS-IC y se adsorbieron en perlas de glutation-agarosa; véase Boldin et al., 1995; Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Frangioni and Neel, 1993). Se determinó la unión de proteínas de fusión FLAG-MORT-1 metabólicamente marcadas a GST-FAS-IC incubando las perlas durante 2 horas a 4ºC con extractos de células HeLa, metabólicamente marcadas con [35S]metionina (60 µCi/ml), que expresan FLAG-MORT-1. Se prepararon extractos en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 al 0,1%, ditiotreitol 1 mM, EDTA 1mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 20 µg/ml de aprotinina, 20 µg/ml de leupeptina, fluoruro sódico 10 mM y vanadato sódico 0,1 mM (1 ml por 5x105 células).

(iv) Determinación de la citotoxicidad desencadenada por la expresión inducida de MORT-1

Se insertaron los cDNA de MORT-1, FAS-IC, p55-IC y luciferasa en un vector de expresión controlado por tetraciclina y se transfectaron a células HtTA-1 (una línea de células HeLa) (Gossen and Bujard, 1992) junto con el cDNA de fosfatasa alcalina de placenta secretada, bajo el control del promotor SV40 (el vector pSBC-2, Dirks et al., 1993). Se determinó la muerte celular 40 horas después de la transfección, por el ensayo de captación de rojo neutro (Wallach, 1984) o para determinar específicamente la muerte en las células que expresan los cDNA transfectados, determinando las cantidades de fosfatasa alcalina de placenta (Berger et al., 1988) secretada al medio de crecimiento en las últimas 5 horas de incubación.

En otra serie de experimentos para analizar la región de la proteína MORT-1 implicada en la unión a FAS-IC, las siguientes proteínas se expresaron de modo transitorio en células HeLa que contenían un transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1), usando un vector de expresión controlado por tetraciclina (pUHD10-3): FAS-R humano solo; FAS-R humano así como la parte N-terminal de MORT-1 (aminoácidos 1-117, la “cabeza de MORT-1"); FAS-R humano así como la parte C-terminal de MORT-1, que contiene su región de homología del “dominio de muerte” (aminoácidos 130-245, la “MORT-1 DD”); FLAG-55.11 (aminoácidos 309-900 de la proteína 55.11 fusionada al extremo N-terminal del octapéptido FLAG, siendo la proteína 55.11 una proteína de unión específica a p55-IC. Doce horas después de la transfección, las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar a una concentración de

30.000 células/pocillo. Después de 24 horas más de incubación, las células se trataron durante 6 horas con un anticuerpo monoclonal frente al dominio extracelular de FAS-R (anticuerpo monoclonal CH-11, Oncor, Gaithersburg, MD, USA) a diversas concentraciones (0,001-10 µg/ml de anticuerpo monoclonal), en presencia de 10 µg/ml de cicloheximida. Se determinó luego viabilidad celular por el ensayo de captación de rojo neutro y los resultados se presentaron en términos de % de células viables en comparación con las células que han sido incubadas con cicloheximida sola (en ausencia del anticuerpo monoclonal CH-11 anti-FAS-R)

(v) Análisis de Northern y de secuencias

Se aisló RNA de poli A+ de RNA total de células HeLa (Oligotex-dT mRNA kit. QIAGEN, Hilden, Alemania). El análisis de Northern usando el cDNA de MORT-1 como sonda se realizó por métodos convencionales (véase Boldin et al., 1995). La secuencia de nucleótidos de MORT-1 se determinó en ambas direcciones por el método de terminación de cadena didesoxi.

El análisis de secuencias del cDNA de MORT-1 clonado por el procedimiento de dos híbridos indicó que codifica una proteína nueva. Aplicando adicionalmente el ensayo de dos híbridos para evaluar la especificidad de la unión de esta proteína (MORT-1 por “Mediador de la toxicidad inducida por receptor”) a FAS-IC, y para definir la región particular en FAS-IC a la cual se une, condujo a los siguientes hallazgos (Figura 1): (a) La proteína MORT-1 se une tanto a FAS-IC humano como de ratón, pero no a otras diversas proteínas ensayadas, incluyendo tres receptores de la familia de receptores de TNF/NGF (receptores p55 y p75 del TNF y CD40); (b) mutaciones de sustitución en la posición 225 (Ile) en el “dominio de muerte” de FAS-R, mostraron que suprimen la señalización tanto in vitro como in vivo (la mutación lprcg (Watanabe-Fukunaga et al., 1992; Itoh and Nagata, 1993), también impide la unión de MORT1 al FAS-IC; (c) el sitio de unión de MORT-1 en FAS-R se encuentra dentro del “dominio de muerte” de este receptor; y (d) MORT-1 se une a sí mismo. Esta autounión, y la unión de MORT-1 a FAS-R implican diferentes regiones de la proteína: un fragmento de MORT-1 que corresponde a los residuos 1-117 se une a MORT-1 de longitud completa, pero no se une a sí mismo ni al FAS-IC. Por el contrario, un fragmento que corresponde a los residuos 130-245 se une al FAS-R, pero no se une a MORT-1 (Fig. 1). Además, es evidente de los resultados de la Fig. 1 que la región del “dominio de muerte” de FAS-R es crítica para la autoasociación de FAS-IC, como lo es la región del “dominio de unión” de p55-R para la autoasociación de p55-IC. Las deleciones en ambos lados de estos “dominios de muerte” no afectan a su capacidad de autoasociación, mientras que, sin embargo, una deleción en estos “dominios de muerte” afecta a la autoasociación. En el caso de MORT-1, la unión de MORT-1 a FAS-IC también depende del “dominio de muerte” completo (entero) de FAS-R, mientras que, sin embargo, tampoco depende de las regiones fuera de la región del “dominio de muerte” de FAS-R para la unión a FAS-IC.

En la Fig.1, se representa la interacción de las proteínas codificadas por el dominio de unión de DNA de GAL4 y las construcciones del dominio de activación (pGBT9 y pGAD-GH) dentro de levaduras transfectadas SFY526 como se determina por el ensayo de filtración de la expresión de -galactosidasa. Las construcciones del dominio de unión a DNA incluían cuatro construcciones del FAS-IC humano, cuatro construcciones del FAS-IC de ratón que incluyen dos construcciones de longitud completa que tienen mutaciones por sustitución de Ile por Leu o Ile por Ala en la posición 225 (I225N e I225A, respectivamente) y tres construcciones de MORT-1, todas las cuales se muestran esquemáticamente en el lado izquierdo de la Fig. 1. Las construcciones del dominio de activación incluían tres construcciones de MORT-1, siendo la porción MORT-1 como en las construcciones del dominio de unión a DNA; y una construcción de FAS-IC humana de longitud completa, siendo la porción FAS-IC la misma que en la construcción del dominio de unión a DNA anterior. Los dominios intracelulares del receptor p55 de TNF humano (residuos 206-426 de p55-IC), CD40 humano (residuos 216-277 de CD40-IC) y receptor p75 de TNF humano (residuos 287-461 de p75-IC), así como los vectores lamina, ciclina D y GAL4 “vacío” (pGBT9) sirvieron como controles negativos en la forma de construcciones de dominio de unión a DNA. SNF-1 y SNF-4 sirvieron como controles positivos en la forma construcciones de dominio de unión a DNA (SNF-1) y de dominio de activación (SNF4). Los vectores GAL4 “vacíos” (pGAD-GH) sirvieron también como controles negativos en la forma de construcciones de dominios de activacion. Los símbolos “++” y “+” indican el desarrollo de un color intenso a los 30 y 90 minutos del ensayo, respectivamente; y “-” indica que no hay desarrollo de color a las 24 horas. Las combinaciones que no tienen puntuación no han sido analizadas.

La expresión de moléculas de MORT-1 fusionadas a su extremo N terminal con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT1) proporcionó en células HeLa proteínas de cuatro tamaños distintos - alrededor de 27, 28, 32 y 34 kD. Se observó in vitro la interacción de MORT-1 con FAS-IC realizando un inmunoprecipitado de proteínas de extractos de células HeLa transfectadas con la proteína de fusión FLAG-MORT-1 o con cDNA de luciferasa como control, realizándose la inmunoprecipitación con anticuerpo anti-FLAG (aFLAG). También se demostró la interacción in vitro entre MORT-1 y FAS-IC en la que MORT-1 está en la forma de proteínas de fusión FLAG-MORT-1 metabólicamente marcadas con [35S]metionina obtenidas de extractos de células HeLa transfectadas y FAS-IC está en la forma de proteínas de fusión GST-FAS-IC humana y de ratón incluyendo una que tiene una mutación por sustitución en la posición 225 en FAS-IC, habiendo sido producidas todas las proteínas de fusión GST-FAS-IC en E. coli. Las proteínas de fusión a GST se unieron a perlas de glutation antes de la interacción con los extractos que contenían la proteína de fusión MORT-1-FLAG y después de esta interacción se realizó una SDS-PAGE. Así, la interacción in vitro se evaluó por auto-radiografía después de SDS-PAGE, determinando la unión de MORT-1 metabólicamente marcada con [35S], producida en células HeLa transfectadas en forma de una fusión con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1), a GST, fusión de GST con el FAS-IC humano o de ratón (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-IC) o a fusión de GST con FAS-IC que contenía una mutación por sustitución de Ile por Ala en la posición 225. Se mostró que las cuatro proteínas FLAG-MORT-1 mostraron capacidad para unirse a FAS-IC por incubación con una proteína de fusión GST-FAS-IC. Como en el ensayo de dos híbridos en levadura (Fig. 1), MORT-1 no se unió a la proteína de fusión GST-FAS-IC con una sustitución en el sitio de mutación lprcg (I225A).

Las proteínas codificadas por el cDNA de FLAG-MORT-1 mostraron también capacidad para unirse al dominio intracelular de FAS-R, así como al dominio intracelular de la quimera de FAS-R cuyo dominio extracelular estaba

reemplazado por el de p55-R (p55-FAS), cuando se co-expresó con estos receptores en células HeLa. En este caso, la interacción de MORT-1 con FAS-IC en las células HeLa transfectadas, es decir, in vivo, como se observó con inmunoprecipitados de diversas células HeLa transfectadas demostraron la interacción in vivo y la especificidad de la interacción entre MORT-1 y FAS-IC en células co-transfectadas con construcciones que codifican estas proteínas. Así, la proteína de fusión FLAG-MORT-1 se expresó y se marcó metabólicamente con [35S]cisteína (20 µCi/ml) y [35S]metionina (40 µCi/ml) en células HeLa sola o junto con FAS-R humano, quimera de FAS-R en la que el dominio extracelular de FAS-R estaba remplazado por la correspondiente región en el p55-R humano (p55-FAS), o p55-R humano, como control negativo. Se realizó una inmunoprecipitación cruzada de MORT-1 con el receptor coexpresado usando diversos anticuerpos específicos. Los resultados indicaron que, FLAG-MORT-1 es capaz de unirse al dominio intracelular de FAS-R, así como al dominio intracelular de una quimera de FAS-R-p55-R que tiene el dominio extracelular de p55-R y el dominio intracelular de FAS-R, cuando se co-expresa con estos receptores en las células HeLa. Además, la inmunoprecipitación de FLAG-MORT-1 de extractos de las células transfectadas también dio como resultado la precipitación del FAS-R co-expresado o la quimera de p55-FAS co-expresada. Por el contrario, la inmunoprecipitación de estos receptores dio como resultado la co-precipitación de FLAG-MORT-1.

El análisis de Northern que usa el cDNA de MORT-1 como sonda reveló un transcrito de hibridación único en células HeLa. En una transferencia de Northern en la que el RNA de poli A+ (0,3 µg) a partir de células transfectadas se hibridó con cDNA de MORT-1, se encontró que el tamaño del transcrito de RNA (alrededor de 1,8 kb) era próximo al tamaño del cDNA de MORT-1 (alrededor de 1702 nucleótidos).

En el análisis de secuencias, se encontró que el cDNA contenía un marco de lectura abierto de alrededor de 250 aminoácidos. La Fig. 2 representa el nucleótido preliminar (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) de MORT-1 en la que el resto del “dominio de muerte” está subrayado, ya que es un posible residuo de iniciación Met (posición 49; en negrita, subrayado M) y el codón de parada de la traducción (el asterisco bajo el codón en la posición 769-771). Este resto de “dominio de muerte” comparte homología con los restos de “dominio de muerte” de p55-R y FAS-R (p55DD y FAS-DD). Para determinar el extremo C-terminal preciso de MORT-1 y obtener evidencia que concierne al extremo N-terminal preciso (residuo Met inicial) de MORT-1, se realizaron experimentos adicionales como se indica a continuación:

Usando los métodos descritos anteriormente, se prepararon un número de construcciones que codifican las moléculas de MORT-1 fusionadas en su extremo N-terminal con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1) y se expresaron en células HeLa como marcado metabólico de las proteínas expresadas usando 35S-cisteína y 35Smetionina. Las moléculas MORT-1-FLAG estaban codificadas por los siguiente cDNA que contenían diferentes porciones de la secuencia codificadora de MORT-1:

i) El cDNA del octapéptido FLAG enlazado al extremo 5' del cDNA de MORT-1 del cual se han delecionado los nucleótidos 1-145 de la SEQ ID NO: 1 (véase la Fig. 2):

ii) El cDNA del octapéptido FLAG enlazado al extremo 5' del cDNA de longitud completa de MORT-1;

iii) El cDNA del octapéptido FLAG enlazado al extremo 5' del cDNA de MORT-1 del cual se han delecionado los nucleótidos 1-145, así como los nucleótidos 832-1701 de la SEQ ID NO:1 (Fig. 2) y el codón GCC en la posición 142-144 fue mutado a TCC para impedir la iniciación de la traducción en este sitio.

Después de la expresión de los productos de fusión FLAG-MORT-1 anteriores, se llevó a cabo la inmunoprecipitación como se ha mencionado anteriormente, usando los anticuerpos monoclonales anti-FLAG (M2) o, como control, los anticuerpos anti-p75-TNF-R (Nº 9), seguido por SDS-PAGE (acrilamida al 10%) y autoradiografía. Los resultados de los análisis con los productos de fusión FLAG-MORT-1 anteriores confirmaron (validaron) el extremo C-terminal de MORT-1 y han proporcionado evidencia de que el extremo N-terminal de MORT-1 puede estar en la posición 49 de la secuencia de la Fig. 2.

Ciertamente, se ha demostrado por experimentos adicionales de expresión de MORT-1 sin el octapéptido FLAG fusionado a su extremo 5', que Met49 sirve como un sitio eficaz de iniciación de la traducción.

Una búsqueda llevada a cabo en las bases de datos “Gene Bank” y “Protein Bank” reveló que no hay secuencia correspondiente a la de la secuencia de MORT-1 aislada anterior. Por tanto, MORT-1 representa una nueva proteína de unión específica a FAS-IC.

La elevada expresión de p55-IC da como resultado el desencadenamiento de un efecto citocida (Boldin et al., 1995). La expresión de FAS-IC en células HeLa también tiene tal efecto, aunque en menor grado, que el que podría ser detectado sólo con el uso de un ensayo sensible. Por tanto, se analizó el desencadenamiento, independiente de ligandos, de los efectos citocidas en las células transfectadas con MORT-1, así como en p55-IC y FAS-IC humanos. Se determinó el efecto de la expresión transitoria de MORT-1, FAS-IC humano, p55-IC humano o luciferasa que sirvió como control, sobre la viabilidad de las células HeLa usando un vector de expresión controlado por tetraciclina. La viabilidad celular se evaluó 40 minutos después de transfectar estos cDNA en presencia o ausencia de tetraciclina (1 µg/ml, para bloquear la expresión), junto con un cDNA que codifica la fosfatasa alcalina placentaria secretada. La viabilidad celular se evaluó por el ensayo de captación de rojo neutro o para determinar

específicamente la viabilidad de las células en particular que expresan el DNA transfectado, midiendo las cantidades de fosfatasa alcalina de placenta secretada al medio de crecimiento.

El análisis anterior reveló que la expresión de MORT-1 en células HeLa dio como resultado una muerte celular significativa, mayor que la causada por la expresión de FAS-IC. Parece que estos efectos citotóxicos de todos los p55-IC, FAS-IC y MORT-1 están relacionados con las regiones de "dominios de muerte", presentes en todas estas proteínas, teniendo dichos “dominios de muerte” una propensión a autoasociarse, y de ese modo provocando posiblemente los efectos citotóxicos.

En vista de las características anteriormente mencionadas de MORT-1, a saber, la asociación específica de MORT-1 con esa región particular en FAS-R que está implicada en la inducción de la muerte celular, y el hecho de que incluso un pequeño cambio en la estructura de esa región, que impide la señalización (la mutación lprcg) suprima también la unión de MORT-1, indica que esta proteína juega un papel en la señalización o el desencadenamiento de la muerte celular. Este concepto es apoyado además por la capacidad observada de MORT-1 para desencadenar por sí misma un efecto citocida. Por tanto, MORT-1 puede funcionar como: (i) un modulador de la autoasociación de FAS-R por su propia capacidad para unirse a FAS-R así como a sí misma, o (ii) servir como un sitio de anclaje para proteínas adicionales que están implicadas en la señalización por FAS-R, es decir, MORT-1 puede ser una proteína de "anclaje" y puede por lo tanto unirse a otros receptores además de a FAS-R, o (iii) constituir parte de un sistema de señalización distinto que interacciona con la señalización por FAS-R.

Para analizar más las regiones de MORT-1 implicadas en la unión a FAS-IC y la modulación de los efectos celulares mediados por FAS-R (citotoxicidad), se llevaron a cabo los experimentos anteriormente mencionados usando vectores que codifican porciones de MORT-1 (la “cabeza de MORT-1”, aminoácidos 1-117 y “MORT-1 DD”, aminoácidos 130-245) (separadamente), con un vector que codifica el FAS-R humano para co-transfecciones de células HeLa. En estos experimentos, las diversas proteínas y combinaciones de proteínas se expresaron de modo transitorio en células HeLa que contenían un transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1) insertando las secuencias que codifican las proteínas en un vector de expresión pUHD10-3 controlado por tetraciclina. Las transfecciones de control emplearon vectores que codifican sólo el FAS-R y vectores que codifican la proteína de fusión FLAG-55.11 (siendo la proteína 55.11 una proteína de unión específica a p55-IC de la cual una porción que contiene los aminoácidos 309-900 estaba fusionada (en su extremo N-terminal) al octapéptido FLAG).

Después de los períodos transfección e incubación las células transfectadas se trataron con diversas concentraciones de un anticuerpo monoclonal anti-FAS-R (CH-11) que se une específicamente al dominio extracelular de FAS-R expresado por las células. Esta unión de anticuerpo anti-FAS-R induce la agregación del FAS-R en la superficie celular (muy similar al ligando de FAS-R) e induce la vía de señalización intracelular mediada por FAS-IC, dando como resultado finalmente la muerte celular (citotoxicidad celular mediada por FAS-R). Las concentraciones del anticuerpo monoclonal anti FAS-R (CH-11) usadas estaban en el intervalo de 0,01-10 µg/ml, normalmente concentraciones tales como 0,005; 0,05; 0,5 y 5 µg/ml. Las células se trataron con el anticuerpo anti-FAS en presencia de 10 µg/ml de cicloheximida.

Los resultados de los análisis anteriores muestran que la expresión de FAS-R en las células transfectadas transmite una sensibilidad aumentada a los efectos citocidas de los anticuerpo anti-FAS-R (compárese “FAS” con “55.11”). Además, la co-expresión de la región en MORT-1 que contiene la región de homología del “dominio de muerte” y FAS-R (“FAS + MORT-1 DD") interfiere fuertemente con la muerte celular inducida por FAS (es decir, mediada por FAS-R) como se esperaría por la capacidad de la región del “dominio de muerte” (DD) de MORT-1 para unirse al “dominio de muerte” de FAS-R (FAS-DD). Por otro lado, la co-expresión de la parte N-terminal de MORT-1 y FAS-R (“FAS + MORT-1 he”) no interfiere con la muerte celular mediada por FAS-R y, como mucho, potencia algo la citotoxicidad (es decir, aumenta ligeramente la muerte celular).

Por tanto, los resultados anteriores indicaron claramente que la proteína MORT-1 tiene dos regiones distintas en lo que se refiere a la unión a FAS-IC y mediación de la actividad citotóxica celular de FAS-IC.

Estos resultados por tanto proporcionan también una base para el uso de diferentes partes (es decir, fragmentos o análogos activos) de la proteína MORT-1 para diferentes aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, sus análogos o fragmentos o derivados de la proteína MORT-1 que contienen esencialmente sólo la porción C-terminal de MORT-1 incluyendo su región de “dominios de muerte” pueden ser usados para inhibir los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en células o tejidos que contienen FAS-R y de ese modo proteger estas células o tejidos de los efectos nocivos del ligando de FAS-R en casos, tales como por ejemplo, la hepatitis aguda. Alternativamente, sus análogos

o fragmentos o derivados de la proteína MORT-1 que contienen esencialmente sólo la porción N-terminal de MORT1 se pueden usar para potenciar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en células y tejidos que contienen FAS-R, conduciendo de ese modo a la destrucción potenciada de estas células o tejidos cuando se desee en casos, tales como por ejemplo, células tumorales y linfocitos T y B auto-reactivos. Como se ha detallado anteriormente, los usos anteriores de las diferentes regiones de MORT-1 se pueden aplicar usando diversos virus recombinantes (por ejemplo, virus de la viruela vacuna) para insertar la secuencia codificadora de la región de MORT-1 en células o tejidos específicos que se desean tratar.

Además, es también posible preparar y usar otras varias moléculas, tales como anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas que tienen secuencias o estructuras moleculares correspondientes a las regiones de MORT-1 anteriormente mencionadas para lograr los mismos efectos deseados mediados por estas regiones de MORT-1.

Por otro lado, MORT-1 se puede utilizar para identificar, aislar y caracterizar específicamente otras proteínas que son capaces de unirse a MORT-1 (es decir, proteínas de unión a MORT-1); véanse los Ejemplos 2 y 3.

EJEMPLO 2: Aislamiento de una proteína de unión a MORT-1

(i) Cribado de dos híbridos y ensayo de expresión de l-galactosidasa en dos híbridos.

De una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando el dominio intracelular de p55-TNF-R (p55-IC) y MORT-1 como cebos, y un cribado de una genoteca de linfocitos B humanos, se obtuvieron dos clones de cDNA, que codifican una proteína capaz de unirse tanto a MORT-1 como a p55-IC. Ambos clones tienen idénticas secuencias de nucleótidoss en el extremo 5' como se muestra en la Fig. 3 (SEQ ID NO: 3).

(ii) Propiedades de unión del DNA recientemente clonado, en cribados de dos híbridos

Usando el procedimiento de dos híbridos en levadura anteriormente mencionado, se empleó una construcción que contenía el nuevo cDNA de la proteína de unión a MORT-1 como “presa” a la cual se añadieron las construcciones de cierto número de “cebos” en reacciones separadas, para determinar la especificidad de unión de la proteína de unión a MORT-1 codificada por este cDNA. Estos “cebos” incluían construcciones que codifican MORT-1, porciones de MORT-1 (“cabeza” de MORT, aa 1-117, “cola” de MORT, aa 130-245), p55-IC (206-426 p55) o una de sus porciones (el “dominio de muerte”, 326-426 p55; y otros aguas arriba del “dominio de muerte” es decir 206-326). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Cebo: Datos de expresión de lgalactosidasa

MORT-1: +++

130-245 MORT-1: +

1-117 MORT-1: -

206-426 p55: +++

326-426 p55: +++

206-326 p55: -

206-308 p55: -

206-345 p55: -

p55 L35INI: -

FAS IC: -

233-319 FAS: -

p75 IC: -

CD40 IC: -

pGBT10: -

SNF1: -

Ciclina D: -

Lamina: -

Los resultados anteriores del ensayo de expresión de -galactosidasa en dos híbridos de la unión del clon a un panel grande de cebos confirmó que la proteína codificada por este clon se une específicamente a los dominios de muerte tanto del p55-TNF-R como de MORT-1.

En general, la proteína de unión a MORT-1 puede ser utilizada directamente para modular o mediar los efectos asociados a MORT-1 sobre las células, o, indirectamente, para modular o mediar el efecto del ligando de FAS-R sobre las células cuando este efecto es modulado o mediado por MORT-1. Lo mismo es cierto con respecto a otras proteínas intracelulares o dominios intracelulares de proteínas transmembranales, como se demuestra específicamente en la presente memoria para p55-TNF-R.

Las proteínas de unión a MORT-1 incluyen las que se unen específicamente a la proteína MORT-1 completa o las que se unen a diferentes regiones de la proteína MORT-1, por ejemplo, las regiones N y C terminales indicadas anteriormente de MORT-1. Las proteínas de unión a MORT-1 que se unen específicamente a tales regiones se pueden usar para modular la actividad de estas regiones y por tanto la actividad específica de MORT-1 determinada por estas regiones.

EJEMPLO 3: Aislamiento y caracterización de la proteína MACH. Otra proteína de unión a MORT-1

(i) Cribado de dos híbridos, ensayo de l-galactosidasa de dos híbridos, secuenciación y análisis de secuencias.

Usando el procedimiento expuesto en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, se empleó una construcción de longitud completa que codifica la proteína MORT-1 humana como “cebo” en el sistema de dos híbridos en levadura para aislar un clon de cDNA que codifica una nueva proteína de unión a MORT-1. Esta nueva proteína se denominó originalmente MORT-2, y ahora se le ha cambiado el nombre a MACH (por homóloga de CED3 asociada a MORT1), en virtud de sus características como se detallan en la presente memoria más adelante.

Este clon de cDNA se secuenció por procedimientos estándares como se expuso en los Ejemplos 1 y 2 anteriores. Los análisis de secuencias por procedimientos estándares y programas informáticos (véase los Ejemplos 1 y 2) revelaron que este cDNA tiene una nueva secuencia y codifica una nueva proteína (ni el DNA ni las secuencias de aminoácidos se encontraron en las bases de datos de secuencias GENBANK o PROTEIN BANK). Además, se reveló que el cDNA que codifica MACH tenía un marco de lectura abierto ORF-B con fuerte homología con la región anterior (5' aguas arriba) del resto de “dominio de muerte” de la proteína MORT-1 (véase el Ejemplo 1). En las Figuras 4A-C se muestran la estructura de esa parte del clon de cDNA de MACH que contiene el ORF-B (235 residuos de aminoácidos; Fig. 4A); la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:5) del ORF-B de MACH (Fig. 4B); y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO 4) de la molécula de cDNA de MACH (Fig. 4C). En la Fig. 4A, la región rayada del ORF-B es la región que comparte alta homología con la región de MORT-1 aguas arriba del resto del “dominio de muerte” de MORT-1, consistiendo esta región de homología de ORF-B de MACH en los residuos de aminoácidos subrayados en la Fig. 4B.

El ensayo de dos híbridos en levadura se aplicó adicionalmente para evaluar la especificidad de unión de MACH a MORT-1, en particular, para definir la región en MORT-1 a la cual se une MACH, así como para determinar cuál de los ORF de MACH interacciona con MORT-1, siendo los procedimientos como los expuestos anteriormente en los Ejemplos 1 y 2. Brevemente, se prepararon diversas construcciones de MORT-1 y MACH para analizar la interacción de las proteínas codificadas por las construcciones del dominio de unión y activación al DNA de GAL4 en las células de levadura SFY526 transfectadas como se evalúa mediante el ensayo de filtración de expresión de galactosidasa. Las construcciones del dominio de unión a DNA se prepararon en vectores pGBT9 y las construcciones del dominio de activación se prepararon en vectores pGAD-GM. Para las construcciones del dominio de activación se usó el cDNA de MACH de longitud completa (MACH), así como una construcción que codifica sólo la región ORF-B (MACH B). Las construcciones del dominio de activación de control fueron las que contenían la secuencia que codifica MORT-1 completa (MORT-1, control positivo) y las que no tienen insertos, es decir, vectores “vacíos” (pGAD-GM). Para las construcciones del dominio de unión al DNA se usó el cDNA de MORT-1 de longitud completa (MORT-1), como lo fueron las construcciones que codifican sólo la región aguas arriba de MORT-1 (MORT-1 DD, aa 130-245). Las construcciones del dominio de unión a DNA de control, que fueron construidas para determinar también la especificidad de la unión a MACH, incluían las construcciones que codifican lamina, los residuos 287-461 del dominio intracelular del p75-TNF-R humano (p75 IC humano), ciclina D (cyc D), SNF1, residuos 206-426 del dominio intracelular del p55-TNF-R humano (p55-IC humano), la región del “dominio de muerte” del dominio intracelular del FAS-R humano (FAS DD humano), residuos 216-277 del dominio intracelular del CD40 humano (CD40 IC humano), vectores sin inserto o vectores pGBT9 “vacíos” (pGBT9, control negativo), y una construcción que codifica la región ORF-B de MACH (MACH B). En el ensayo se determinó el desarrollo de color en el que cuanto mayor fue el desarrollo del color, mayor era la interacción entre las construcciones codificadas por el dominio de unión a DNA y el dominio de activación. El desarrollo del color se representó por símbolos, en los que “+++” y “+” indican el desarrollos de un color fuerte a los 30 y 90 minutos del ensayo respectivamente, y “---“ indican la falta de desarrollo de color a las 24 horas del ensayo. En los casos en los que las interacciones no fueron ensayadas, no se indican ningún símbolo. Los resultados de las diversas interacciones para el caso anterior se recogen en la Tabla 3, mientras que los resultados de las diversas interacciones de las isoformas de MACH se representan en la Fig. 5.

TABLA 3

HÍBRIDO DE DOMINIO

Híbrido del dominio de unión a DNA: MACH MACH B MORT-1 pGAD-GH

MORT-1: +++ +++ +++ ---

Región de unión en MORT-1

MORT-1 (-117)

MORT-1 DD (130-245): --- ---

Ensayos de especificidad

Lamina: --- ---

p75 IC humano: ---

Cyc D

SNF1

p55 IC humano

FAS DD humano: ---

CD40 IC humano: ---

pGBT9: ---

MACH B: + + ---

Así, como se deduce de los resultados mostrados en la Tabla 3 anterior, es evidente que:

(a): MACH se une a MORT-1 en una manera muy fuerte y específica;

(b): El sitio de unión a MACH en MORT-1 tiene lugar antes (aguas arriba) del resto del “dominio de muerte” en MORT-1, es decir, está en la región de MORT-1 definida por los aa 1-117 de MORT-1;

(c): La región ORF-B de MACH es la región de la proteína MACH que interacciona con MORT-1; y

(d): La región ORF-B de MACH es capaz de autoasociación.

(ii) Efectos citotóxicos celulares mediados por la capacidad de autoasociación de la proteína MACH

La observación de que MACH se puede autoasociar, en particular, que la región ORF-B de MACH se autoasocia y la correlación previa entre la autoasociación y la citotoxicidad celular como se observa para los dominios intracelulares del p55-TNF-R y FAS-R, y como se observa para MORT-1 (véase el Ejemplo 1), sugirieron que la autoasociación de MACH puede estar implicada también en la citotoxicidad celular

Para analizar esta posibilidad, se prepararon construcciones que codifican MACH con un vector de expresión controlado por tetraciclina (para detalles véase el Ejemplo 1). Estas construcciones se usaron para transfectar células HeLa en las que los vectores se expresaron de modo transitorio. Además de las construcciones de MACH, se usaron otras construcciones de control para evaluar el efecto de la expresión transitoria sobre la viabilidad de las células HeLa con el que podría compararse el efecto de las construcciones MACH. Estas otras construcciones incluyeron MORT-1, FAS-IC humano y luciferasa (Luc). Además, la co-transfección de las células HeLa se analizó también usando MORT-1 y las construcciones de MACH para determinar los efectos que podrían causar la interacción entre estas proteínas. Después de la transfección, se incubaron las células HeLa y se evaluó la viabilidad celular 48 horas después de la transfección en presencia o en ausencia de tetraciclina (1 µg/ml) para bloquear la expresión. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de captación de rojo neutro.

Los resultados se muestran en la Fig. 6, que representa gráficamente el desencadenamiento independiente de ligandos de los efectos citocidas en las células transfectadas con MACH en comparación con las células transfectadas con construcciones que codifican las otras proteínas, así como las células co-transfectadas (MORT-1

+ MACH). Los resultados se muestran como la viabilidad celular en unidades de DO a 540 nm para cada construcción, en donde para cada construcción, una barra rayada indica incubación de células después de la transfección en ausencia de tetraciclina, y una barra rellena indica incubación de las células transfectadas en presencia de tetraciclina.

A partir de los resultados mostrados en la Fig. 6, es evidente que MACH induce un efecto citotóxico acusado en células HeLa, es decir, la sobre-expresión inducida del cDNA de MACH en células HeLa, dando como resultado un efecto citotóxico acusado. Este efecto citotóxico es probable que esté relacionado con la capacidad de autoasociación de MACH.

(iii) Análisis de Northern

Usando procedimientos bien conocidos (véase el Ejemplo 1), se realizaron análisis de Northern de diversas líneas celulares usando el cDNA de MACH como sonda. Los resultados de este análisis muestran que en un gran número

de líneas celulares, en particular, las líneas celulares CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Juskat y A673, existen dos transcritos hibridantes de un tamaño de aproximadamente 3,2 kb.

En vista a lo anterior, la proteína MACH, particularmente la proteína MACH 1 (ORF-B de MACH) puede ser utilizada directamente para modular o mediar los efectos asociados a MORT-1 sobre las células, o indirectamente, para modular o mediar el efecto del ligando de FAS-R sobre las células cuando este efecto es modulado o mediado por MORT-1. El hecho de que MACH se una específicamente a la región aguas arriba de MORT-1 y comparta homología con MORT-1 proporciona una manera específica en la que se puede usar MACH u ORF-B de MACH para modular esta región específica de MORT-1 y por tanto la actividad específica de MORT-1 determinada por esta región aguas arriba. Además, se puede usar MACH u ORF-B de MACH como modulador o mediador de los efectos intracelulares de un modo análogo a la propia MORT-1 (véase anteriormente) en virtud de la capacidad de MACH de autoasociarse e inducir la citotoxicidad celular sobre sí misma.

Se han realizados más análisis de la proteína MACH y las secuencias de DNA que la codifican como se expone más adelante. Además, se reveló que el ORF-B de MACH no representa más que una de las isoformas de MACH. Por tanto, la proteína MACH y las secuencias de DNA que la codifican han sido ahora renombradas, como será evidente a partir de lo siguiente.

(a) El cribado de dos híbridos para proteínas que se unen a MORT-1 revela una proteína nueva que comparte un resto de secuencia con MORT-1:

Como se mencionó anteriormente, para identificar proteínas que participan en la inducción de la muerte celular por MORT-1, se usó la técnica de dos híbridos para cribar genotecas de cDNA para proteínas que se unen a MORT-1. Un cribado de dos híbridos de una colección de linfocitos B humanos (Durfee et al., 1993) usando cDNA de MORT-1 como cebo dio clones de cDNA de la propia MORT-1, reflejando la capacidad de esta proteína para autoasociarse, así como clones de TRADD, a los cuales MORT-1 se une eficazmente (véase el Ejemplo 2). El cribado también proporcionó clones de cDNA de una secuencia nueva cuyo producto se unió específicamente a MORT-1. La proteína, que inicialmente fue llamada MACH, y más tarde, después de encontrarse que está presente en múltiples isoformas (véase más adelante) fue renombrada MACH 1, mostró también una capacidad para unirse a sí misma en un ensayo de dos híbridos, pero fue incapaz de unirse al FAS-R.

En la Fig. 5, se muestran los resultados de la interacción de MORT-1 y MACH en células de levaduras transfectadas. Brevemente, se expresaron, MORT-1 y MACH 1 y sus construcciones por deleción, así como MACHa1, un mutante de MACHa1 en el que la cisteína catalítica Cys360 está remplazada por Ser (MACHa1 (C360S)) y el dominio intracelular del FAS-R (FAS-IC) humano dentro de la levadura SFY526 transfectada en construcciones del dominio de unión al DNA y el dominio de activación de GAL4 (pGBT9 y pGAD-GH). Su interacción fue evaluada por un ensayo de filtración de expresión de -galactosidasa como se describe en Boldin et al., (1995b). Los resultados se presentan en términos del tiempo requerido para el desarrollo de un color fuerte. ND indica que el ensayo no se hizo. Ninguno de los insertos examinados interaccionó con un número de controles negativos ensayados, incluyendo los dominios intracelulares del receptor p55-TNF, receptor p75-TNF, y CD40 humanos, y los vectores lamina, ciclina D, GAL4 “vacío”. MACH 1 se clonó por el cribado de dos híbridos de una colección de linfocitos B humanos etiquetados con GAL4-AD (Durfee et al., 1993) para las proteínas que se unen a MORT-1, usando la cepa indicadora de levadura HF7c. Excepto cuando se indica lo contrario, todos los procedimientos experimentales para los hallazgos presentados son como se describieron anteriormente (véase también Boldin et al., 1995). Los análisis por deleción mostraron que MACH 1 se une a la parte N-terminal de MORT-1, que está implicada en la inducción de la muerte celular (Chinnaiyan et al., 1995). MACH 1 también se autoasocia en la levadura transfectada. Sin embargo, no se unió a varias proteínas de control y a diferencia de MORT-1 no fue capaz de unirse a FAS-R (Fig. 5). La expresión de las moléculas de MACH 1 en células de mamífero proporcionó una proteína de 34 kDa que se unió a las moléculas de MORT-1 co-expresadas con ella. También fue capaz de unirse in vitro a la proteína de fusión GST-MORT-1.

La comparación de las secuencias de aminoácidos en MACH 1 y MORT-1 reveló un resto de secuencia compartido (designado “Módulo Mort”) en estas dos proteínas, distinto del resto de muerte a través del cual MORT-1 se une a FAS-R. Este resto está presente una vez en MORT-1 y dos veces en MACH 1. El mismo resto se encuentra también en PEA-15, una fosfoproteína de astrocitos de función desconocida. Datos preliminares sugieren que el resto MORT está implicado en la unión de MACH 1 (y de otras isoformas de MACH) a MORT-1.

La Fig. 7A representa la secuencia de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO:5) de MACH 1. Los dos módulos de MORT enmarcados y los extremos C terminales de los dos mutantes por deleción de MACH 1 empleados (Fig. 7) están indicados por asteriscos. La Fig. 7B muestra la homología de secuencias de los módulos en MACH 1 (designado MACH en la Fig 7 B), MORT-1 y el gen PEA-15 (número de acceso X86809). Residuos idénticos y similares están indicados mediante zonas enmarcadas y sombreadas, respectivamente.

La Fig. 8 muestra una representación esquemática del dominio de muerte y los módulos de MORT y de la región de homología de CED3/ICE en FAS/APO1, MACH 1 y MACHa1.

Se ha demostrado que la región en MORT-1 que contiene este “módulo” MORT toma parte en la inducción de muerte celular por esta proteína (véase el Ejemplo 1 anterior). Se ha demostrado también que contribuye, aunque no suficientemente, a la autoasociación de MORT-1 (véase el Ejemplo 1). Como se muestra en la Fig. 5, el análisis de las propiedades de unión de las construcciones por deleción de MACH 1 en levaduras transfectadas reveló una implicación similar de los módulos MORT en autoasociación de MACH 1, así como en su unión a MORT-1. Las construcciones por deleción, en las que falta la región inferior (aguas abajo) del módulo de MORT fueron incapaces de unirse entre sí, aunque mantuvieron la capacidad para unirse a la MORT-1 de longitud completa y a la MACH 1 de longitud completa. Un truncamiento adicional en el que estaba también delecionada parte de la secuencia del módulo MORT, dio como resultado la pérdida de la capacidad de unión de las proteínas. Para evaluar adicionalmente la implicación de los módulos MORT en estas interacciones, los mutantes por deleción de MACH 1, fusionados con el octapéptido FLAG (FLAG-MACH 1) se expresaron en células HeLa y se evaluó su unión in vitro a la proteína de fusión glutatión-S-transferasa- MORT-1 (GST-MORT-1) producida en bacterias. Como se muestra en las Figuras 9A-C, de igual modo que la unión observada en el ensayo de dos híbridos en levadura, se encontró que esta unión in vitro dependía de la interacción de la región en los módulos de MACH 1. Las Figs. 9A y 9B mostraron los resultados (auto-radiogramas) de la interacción in vitro de MACH 1 y sus mutantes por deleción con MORT-1. Brevemente, se produjeron en células HeLa transfectadas MACH 1 metabólicamente marcada con 35[S], MACH 1 fusionada en su extremo N-terminal al octapéptido FLAG (FLAG-MACH 1), los mutantes de truncamiento en el Cterminal de FLAG-MACH 1 y, como control, luciferasa. La expresión se hizo usando un vector de expresión controlado por tetraciclina, en un clon de células HeLa (HtTA-1) que expresa un transactivador controlado por tetraciclina.

La Fig. 9A muestra la determinación de la expresión de las proteínas y sus tamaños moleculares por inmunoprecipitación de lisados celulares, usando un anticuerpo anti-FLAG. Los anticuerpos usados son como se indica a continuación: Se generaron antisueros de conejo anti-MACH 1 y anti-MORT-1 frente a las proteínas de fusión GST-MACH 1 Y GST-MORT-1. Los anticuerpos monoclonales de ratón frente al octapéptido FLAG (M2) y frente a FAS/APO1 (CH11, Yonehara et al., 1989) fueron adquiridos a Eastman Kodak y Oncor (Gaithersburg, MD) respectivamente. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-epítopo HA (12CA5, Field et al., 1988) y el anticuerpo anti-TNF fueron producidos en el laboratorio de los inventores según los métodos usuales muy conocidos en la técnica. La Fig. 9B muestra una unión por afinidad de las proteínas a GST-MORT-1, adsorbidas a perlas de glutationagarosa (o, como control, a GST o GST fusionada al dominio intracelular de FAS-APO1). La Fig. 9C muestra los resultados de las inmunoprecipitaciones de las diversas construcciones de fusión de MORT-1 y MACH usando los diversos anticuerpos específicos.

(b) MACH está presente en múltiples isoformas

El análisis de Northern que usa cDNA de MACH 1 como sonda reveló transcrito(s) poco abundante(s) de un tamaño de aproximadamente 3 kb en varias líneas celulares diferentes. Brevemente, se realizaron análisis de transferencia de Northern de RNA total (14 µg/pista) o RNA de poli A+ (2 µg) de varias líneas celulares, usando cDNA de MACH 1 como sonda. Las líneas celulares examinadas, T47D, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat y A673, son todas de origen humano y procedían de un carcinoma ductal de mama, de leucemia de linfocitos T linfoblástica aguda, de un linfoma de Burkitt, de un carcinoma epiteloide, de un hepatoma humano, de una leucemia aguda de linfocitos T y de un rabdomiosarcoma, respectivamente. La forma más bien difusa de la banda de hibridación en las transferencias de Northern sugirió que estos transcritos son de tamaños heterogéneos que oscilan entre 2,85 y 3,5 Kb. Tanto las cantidades como los tamaños de los transcritos variaron entre diferentes tejidos humanos y no estuvieron correlacionados con la expresión de MORT-1 (Chinnaiyan et al., 1995) o de FAS/APO1 (Watanabe et al., 1992). Se radiomarcaron sondas de cDNA con el kit de cebadores aleatorios (Boehringer Mannheim) y se aplicó para su análisis de transferencias de múltiples tejidos humanos (Clontech) según las instrucciones del fabricante. En testículo y músculo esquelético, por ejemplo, los transcritos de MACH apenas fueron detectables, aún cuando estos tejidos expresan cantidades significativas de MORT-1. Por el contrario, se encontró que leucocitos mononucleares de sangre periférica en reposo, en los que la expresión de MORT-1 es muy baja, expresan MACH a niveles elevados. La activación por lectina de los leucocitos da como resultado un cambio notable en el patrón de tamaños de los transcritos de MACH, junto con una inducción de MORT-1.

Explorando la naturaleza de esta heterogeneidad de tamaños, se cribaron genotecas de cDNA para transcritos que se hibridan con la sonda de cDNA de MACH 1. Se clonaron MACHa1 y MACHa2 de una genoteca de cDNA de Charon BS procedente del mRNA de timo humano. La genoteca se cribó en condiciones rigurosas con una sonda de cDNA de MACH 1 marcada usando un kit de cebadores aleatorios (Boehringer Mannheim). Las otras isoformas de MACH se clonaron por RT-PCR realizada en el RNA total de células linfoblastoides humanas Raji (MACHa1, a2, a3, 3, 4 y 5) y Daudi (MACHa2, 2, 3, 4, y 5). Se realizó la reacción con transcriptasa inversa con un adaptadorcebador de oligo-dT (5’-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)17-3’; SEQ ID NO: 26) y la transcriptasa inversa SuperScript II (GIBCO-BRL), usada según las instrucciones del fabricante. La primera ronda de PCR se realizó con Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim) usando los siguientes cebadores con sentido y antisentido: 5’-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3’, correspondiente a los nucleótidos 530-551 del cDNA de MACH 1 (SEQ ID NO: 4), y 5’-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3’ (SEQ ID NO: 27), respectivamente. La segunda ronda se realizó con polimerasa Vent (NEB) usando los siguientes cebadores anidados con sentido y antisentido: 5’-GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3’ (SEQ ID NO: 28) y 5’-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3’; 5

(correspondiente a los nucleótidos 962-939 de la SEQ ID NO: 4) de cDNA de MACH 1, respectivamente. Para confirmar que MACH 3 y MACH 4 tienen codones de iniciación, se clonó una secuencia 5’ más de estas isoformas del RNA de las células Raji. La reacción RT-PCR, realizada usando el adaptador-cebador olido-dT como se ha descrito anteriormente, fue seguida por dos rondas de PCR (con polimerasa Vent (NEB)) usando los siguientes oligonucleótidos con sentido y antisentido: 5’-TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3’ (SEQ ID NO: 29) y 5’-ATTCTCAAACCCTGCATCCAAGTG-3’ (correspondiente a los nucleótidos 946-923 de la SEQ ID NO: 4) en MACH 1. El último oligonucleótido es específico para las isoformas . Entre los clones obtenidos de esta manera, se secuenciaron completamente los que se encontró que contenían los nucleótidos que codifican los aminoácidos del “bloque 2” (cuya presencia distingue MACH 3 y MACH 4 de MACH 1 y MACH 2 como se analiza más adelante). Las secuencias de nucleótidos en todas las isoformas clonadas se determinaron en ambas direcciones por el método de terminación de cadena didesoxi. Sólo se obtuvieron clones de cDNA parciales de MACHa3 y MACH 2. Este cribado reveló la existencia de múltiples isoformas de MACH. Las secuencias de aminoácidos de ocho de estas isoformas se estudiaron con detalle. Los resultados se ilustran esquemáticamente en la Fig. 12 y se ponen de ejemplos en la Fig. 13 en la que se comparan las secuencias de aminoácidos de tres de las isoformas con homólogos conocidos.

La Fig. 10 muestra una representación esquemática de las diversas isoformas de MACH. Las regiones codificadoras están representadas mediante áreas enmarcadas. Los diversos dominios dentro de las regiones codificadoras están

indicados por diferentes sombreados como se indica a continuación: los módulos MORT ( ); los tres bloques de secuencias de aminoácidos que están presentes en diferentes combinaciones en las isoformas. Se muestran las posiciones de los residuos en la región de homología de CED3/ICE implicada en la actividad catalítica de ICE basada en su estructura cristalina por rayos X. El residuo de cisteína catalítico está también indicado por una estrella (*). Estas partes de la secuencia de nucleótidos de MACHa1 que faltan en las secuencias de otras isoformas están indicadas en los esquemas de las últimas isoformas por líneas conectoras en forma de V. Las longitudes de estas regiones de cDNA, que probablemente corresponden a distintos exones, están indicadas por debajo del esquema de MACHa1. La falta de 65 nucleótidos que en MACHa1 codifican el “bloque 2” causa la alteración en MACH 1 y MACH 2 del marco de lectura de los nucleótidos que codifican el “bloque 3”. En estas isoformas, por lo tanto, estos nucleótidos codifican otros aminoácidos que juntos constituyen su región C-terminal única. Por otro lado, en MACH 3 y MACH 4 se mantiene el marco de lectura del bloque 3, pero la ausencia de los nucleótidos que codifican la región CED3/ICE y parte de la región 3’ no codificadora da como resultado la alteración del marco de lectura de los nucleótidos aguas más abajo. Debido a esta alteración, la parte más 5’ de esta región aguas abajo no codificadora codifica 10 aminoácidos, que constituyen la región C terminal única de estas dos isoformas (rayadas). Como se indica en la figura, solo se obtuvieron clones de cDNA parciales de MACHa3 y MACH 2.

Se clonaron las isoformas de una genoteca de cDNA de linfocitos B humanos (MACH 1), de genotecas de cDNA de timo humanas (MACHa1 y a2) y del mRNA de células linfoblastoides humanas Raji (MACHa1, a2, a3, 3, 4 y 5) y Daudi (MACHa2, 2, 3, 4 y 5). La clonación del mRNA de las células Raji y Daudi se hizo por RT-PCR, usando oligonucleótidos correspondientes a una región 3’ no codificadora y a una secuencia dentro del segundo módulo MORT en MACH 1. El codón de iniciación de clones aislados de ese modo está por tanto localizado dentro del segundo módulo MORT. La secuencia de cDNA y la secuencia de aminoácidos de las isoformas de MACH se presentan en el listado de secuencias y se identifican como sigue en la Tabla 4.

TABLA 4

Isoforma de MACH: Secuencia de cDNA Secuencia de aminoácidos

MACHa1 MACHa2 MACHa3 MACH 1 MACH 2 MACH 3 MACH 4 MACH 5: SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:34

Las secuencias de las diferentes isoformas se relacionan entre sí como sigue: (a) todas las isoformas de MACH comparten una región N-terminal común de 182 aminoácidos que comprende los módulos MORT, aunque varían en los extremos carboxilo terminales (3’ aguas abajo) de estos módulos, así como en sus regiones no codificadoras. (b) en base a sus secuencias C terminales, las isoformas se clasifican en dos subgrupos: cuatro isoformas definidas como subgrupo , tienen diferentes extremos C terminales debido a la alteración en el marco de lectura. Dos (MACH 1 y 2) comparten el extremo C-terminal encontrado en la isoforma inicialmente clonada en el cribado de dos híbridos y dos (MACH 3 y 4), comparten un extremo C-terminal diferente; tres isoformas, definidas como subgrupo a, tienen una región C-terminal mucho más larga que se asemeja mucho a las proteasas de la familia CED3/ICE (véase más adelante); (c) las regiones que se extienden entre la región del módulo MORT y la región C terminal que define los subgrupos variaba de una isoforma a otra. Sin embargo, un examen cuidadoso mostró que estas regiones intermedias consisten en diferentes combinaciones de los tres mismos bloques de secuencias de

aminoácidos (bloques 1, 2 y 3). Las variaciones de secuencias de aminoácidos entre los diferentes clones reflejan dos clases de variaciones en la secuencia de nucleótidos que muy probablemente están presentes por corte y empalme alternativo: (a) inserción o ausencia de cualquiera de las dos secuencias de nucleótidos, una de 45 nucleótidos (nts) y la otra de 65 nts, o de ambas por debajo de los nucleótidos que codifican Lys 184; (b) presencia de un inserto adicional dentro de la región que en MACH 1 constituye la parte 3’ no codificadora. Estas variaciones afectan tanto al marco de lectura como a la longitud de la proteína.

Parte de las isoformas de MACH abarcan un homólogo de CED3/ICE. Una búsqueda en bancos de datos reveló que la región C terminal de las isoformas de MACHa incluyendo el bloque 3 y la secuencia que se extiende aguas abajo de él, se asemeja mucho a proteasas de la familia CED3/ICE. La Fig. 11 presenta la comparación de secuencias de esta región en MACH y los diversos miembros humanos conocidos de esta familia, así como la proteína CED3 de Caenorhabditis elegans. CED3 (Ellis and Horvitz, 1986; Yuan et al., 1993) y las proteasas humanas conocidas de la familia de proteasas CED3/ICE. CPP32 (Fernandes-Alnemri et al., 1994), también llamada apopaína (Nicholson et al., 1995) y Yama (Tewari et al., 1995b), MCH2a (Fernandes-Alnemri et al., 1995), Ich-1 (Wang et al., 1994; el homólogo humano de la proteína Nedd2 de ratón, Kumar et al., 1994), ICErclII (Munday et al., 1995), ICErclII (Munday et al., 1995), también llamada TX e Ich-2 (Faucheu et al., 1995; Kamens et al., 1995), e ICE (Thornberry et al., 1992; Cerretti et al., 1992). La Fig. 11 representa esquemáticamente el alineamiento de secuencias de aminoácidos colineales de las isoformas de MACH y los diversos miembros conocidos de la familia de proteasas CED3/ICE. Se muestran las secuencias de aminoácidos de MACHa1, MACH 1, MACH 3, así como la de la proteasa CED3, de Caenorhabditis elegans y de las proteasas humanas conocidas de la familia de proteasas CED3/ICE.

La región C-terminal arriba indicada de MACH se asemeja mucho a CPP32 (con un 41% de identidad y 62% de homología) y a CED3 (con un 34% de identidad y 56% de homología). Muestra una similitud significativamente menor con ICE (con un 28% de identidad y 50% de homología) y con sus homólogos ICErclII próximamente relacionados (también llamados TX e Ich2) e ICErclIII. La similitud se observó a través de casi toda la región comenzando desde la Tyr226 dentro del bloque 3, hasta el extremo C-terminal de las isoformas MACHa.

Dos puntos de similitud son particularmente notables:

(a): Todas las proteasas conocidas de la familia CED3/ICE escinden las proteínas en los sitios definidos por la presencia de Asp en la posición P1 y un residuo de aminoácido hidrófobo pequeño en la posición P1'. Su especificidad difiere, sin embargo, en otras características estructurales del sustrato, incluyendo la naturaleza de los residuos en las posiciones P2-P4. Consecuentemente, están conservados entre estas proteasas los residuos del sitio activo implicados en catálisis (correspondiente a His237, Gly238 y Cys285 en ICE) y en la cavidad de unión para la cadena lateral carboxilato del Asp en P1 (Arg179, Gln283, Arg 341 y probablemente también Ser347). Como se muestra en la Fig. 11, estos residuos (marcados por el sombreado de los residuos y por círculos rellenos o vacíos debajo de las secuencias) están también conservados en MACHa1. Hay una excepción, un cambio conservador de Ser a Thr en el sitio correspondiente a Ser347 de ICE. Otra ligera, pero potencialmente importante, diferencia de secuencia entre las isoformas MACHa y otros miembros de la familia de proteasas es una sustitución de Arg por Gln del residuo correspondiente a Arg286 de ICE. Este residuo, que es adyacente al supuesto residuo de cisteína catalítico, está completamente conservado en todos los otros miembros de la familia CED3/ICE. También parte de los residuos en los sitios situados cerca de los residuos P2-P4 del sustrato (marcados por triángulos debajo de las secuencias en la Fig. 11) difieren en las isoformas MACHa de los encontrados en otros miembros de la familia CED3/ICE.

(b): Las proteasas de la familia CED3/ICE contienen sitios de autoescisión. Se sabe ciertamente que varias de las proteasas se autoprocesan, y dependen de este procesamiento para mostrar la actividad catalítica máxima. Su forma completamente bioactiva está compuesta de dos productos de escisión asociados de modo no covalente, que difieren en tamaño (p20 y p17 en ICE; p17 y p12 en CPP32, como se indica por flechas en la Fig. 11). La presencia de sitios potenciales de autoescisión en otros miembros de la familia sugiere que están sometidas a un procesamiento similar y, de igual modo, dependen de este procesamiento para exhibir la actividad máxima. Tales sitos potenciales de autoescisión están presentes en MACHa1 casi en las mismas localizaciones que en CPP32 (véanse los recuadros sombreados en la Fig. 11). El sitio correspondiente al extremo N de la subunidad p17 de CPP32 está situado en el segundo bloque de aminoácidos conservado, justo unos pocos aminoácidos aguas arriba del extremo N terminal de la región de homología a CED3/ICE (por debajo de Asp216). El sitio correspondiente al punto de escisión entre las dos subunidades de CPP32 está situado, como en los otros miembros de la familia CED3/ICE que se sabe que están escindidos, unos pocos aminoácidos aguas abajo del residuo de cisteína catalítico (debajo de Asp374). Esta conservación sugiere que la región de homología a CED3/ICE en MACHa1 está sometida al procesamiento proteolítico. Los tamaños de los dos productos esperados de esta escisión están muy próximos a los de las dos subunidades de la molécula CPP32 procesada.

(c): La región de homología a CED3/ICE en MACH tiene actividad proteolítica

Para averiguar si la región de homología a CED3/ICE en MACHa posee actividad proteolítica, los inventores expresaron la región que se extiende desde el sitio de escisión potencial aguas arriba de esta región, entre Asp216 y Ser217, hasta el extremo C terminal de la proteína en bacterias, como una proteína de fusión con GST. Se examinó

la capacidad de los lisados bacterianos para escindir los sustratos peptídicos fluorogénicos, mostrados antes de ser escindidos por otros homólogos de CED3/ICE. Se usaron dos sustratos peptídicos: el primero, acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metil-cumaril-7-amida)(AC-DEVD-AMC), corresponde a una secuencia de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), una proteína nuclear que se sabe que se escinde en las células poco después de la estimulación por FAS-R (Tewari et al., 1995b), así como en otros procesos apoptóticos (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994). Este sustrato fluorogénico es escindido de modo eficaz por CPP32. El segundo sustrato fluorogénico, acetil-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC (Ac-YVAD-AMC), corresponde a un sitio de sustrato para ICE en el precursor de IL-1 . Este sustrato fluorogénico es escindido por ICE. Como se muestra en las Figuras 12A-F y 13A-B, lisados de bacteria que expresan la región de homología a CED3/ICE en MACHa1 escindieron de modo eficaz el sustrato fluorogénico derivado de la secuencia PARP. Dichos lisados no tuvieron actividad proteolítica medible, aunque, si frente al sustrato fluorogénico derivado de la secuencia precursora IL-1 (controles), Ac-YVAD-AMC, que es un sitio de escisión de ICE en el precursor de IL-1 (Thornberry et al., 1992). La actividad proteolítica fue bloqueada por ácido yodoacético (5 mM), confirmando que está mediada por una tiol-proteasa. No se observó ninguna escisión con lisados que contenían la región de homología a CED3/ICE en MACH fusionada a GST, en la que el residuo de la cisteína catalítico Cys360 estaba sustituido por Ser. También, los lisados de las bacterias que expresaron la proteína MACHa1 de longitud completa como una proteína de fusión con GST no escindieron Ac-DEVD-AMC, debido probablemente a la ausencia de enzimas bacterianas capaces de procesar la molécula de longitud completa. Tampoco tuvo lugar un escisión con los lisados que contenían cualquiera de los dos productos de escisión potenciales de la región de homología a CED3/ICE.

Las Figuras 12A-F y 13A muestran las cinéticas de escisión del sustrato fluorogénico derivado de la secuencia PARP, Ac-DEVD-AMC (50 µm), por extractos de E. coli que expresan una proteína de fusión con GST de la región de homología a CED3/ICE en MACHa1 (Ser 217 hasta el extremo C terminal de la proteína) comparado con la falta de escisión por extractos de bacterias que expresan las proteínas de fusión con GST de la molécula de MACHa1 de longitud completa o de cualquiera de los dos producto proteolíticos potenciales de la región de homología a CED3/ICE (Ser217 hasta Asp 374 y Asp374 hasta el extremo C-terminal de la proteína).

También se muestra la dependencia de la concentración de sustrato de la escisión de Ac-DEVD-AMC, incubada durante 180 minutos con extractos de bacterias que expresan la región de homología a CED3/ICE en MACHa1 fusionada con GST (véase la Fig. 13 B). No se observó ninguna escisión en presencia de ácido yodoacético (5 mM). Los extractos no tuvieron actividad en Ac-YVAD-AMC, un sustrato fluorogénico correspondiente al sitio de sustrato para ICE en el precursor de IL-1 .

Brevemente, se produjeron proteínas de fusión con GST en bacterias "XL1-blue" usando el vector de expresión pGEX3. Las bacterias se lisaron por tratamiento con ultrasonidos en un tampón que contenía HEPES 25 mM (pH 7,5), 3-[3-colamidopropil)dimetilamino]-1-propanosulfonato al 0,1%, EDTA 5 mM y DDT2 mM, seguido por centrifugación a 16.000Xg durante 10 minutos. El análisis por SDS-PAGE confirmó la presencia de niveles similares de las diversas proteínas de fusión en los lisados (no mostrado). Se incubaron partes alícuotas de 50 µl de los extractos (4 mg/ml de proteína total) a temperatura ambiente durante los períodos indicados en un volumen de reacción total de 500 µl con los sustratos fluorogénicos a las concentraciones indicadas. La liberación de AMC se midió por espectrofluorometría a una longitud de onda de excitación de 380 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. La concentración de AMC se determinó por una curva patrón. Ambos péptidos sustratos fluorogénicos se obtuvieron de Peptide Institute Inc. (Osaka, Japón). Se demostró que otras proteasas CED3/ICE exhibían una actividad completa sólo después del procesamiento proteolítico, que tiene lugar por autoescisión o mediante su escisión por otras proteasas (revisado en Kumar, 1995; Henkart, 1996). La observación de los inventores de que los lisados de bacterias que expresan moléculas GST-MACHa1 no poseen actividad enzimática, en contra de la actividad observada en lisados de bacterias que expresan la región de homología a CED3/ICE, sugirió que el procesamiento se requiere también para la actividad de MACHa. No se conoce el modo por el que tiene lugar el procesamiento de MACHa dentro de las células de mamíferos, y como este procesamiento es realizado por la provocación de FAS-R o p55-R. Se ha demostrado que MORT-1 se une en las células a FAS-R activado junto con algunas otras proteínas (Kischkel et al., 1995). Es probable que estas proteínas incluyan MACHa1 y otras isoformas de MACH. Parece plausible que la unión de MORT-1 en asociación con MACHa a FAS-R una varias moléculas MACH entre sí, o induzca cambios conformacionales en ellas, y que estos cambios desencadenen el procesamiento autolítico de MACHa o hagan a MACHa susceptible de ser escindidas por otras proteasas. La estimulación de p55-R puede desencadenar el autoprocesamiento de MACHa de una manera similar, aunque menos directa, juntando varias moléculas de TRADD, o induciendo un cambio conformacional en ellas, que a su vez induzca un cambio en la formación o estado de agregación de MORT-1 y su molécula MACH asociada.

La especificidad de sustrato de MACHa parece estar más bien “orientada a la muerte”. Aunque podría escindir un sustrato peptídico correspondiente a un sitio de escisión en el sustrato de muerte PARP (Ac-DEVD-AMC), MACHa no mostró ninguna actividad proteolítica hacia un péptido correspondiente al sitio de procesamiento del precursor IL1 por ICE (Ac-YVAD-AMC). La identificación de las proteínas celulares que sirven como sustratos para la escisión por MACHa elucidarán los eventos más aguas abajo en la inducción de muerte por esta proteasa. Probablemente los sustratos para la escisión por MACHa son otros miembros de la familia CED3/ICE, como CPP32 e ICE. Algunas de estas proteasas son ciertamente procesadas después del desencadenamiento de FAS-R o del receptor de TNF (Miura et al., 1995; Schlegel et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996). Tal vez proteasas que no pertenecen a la familia

CED3/ICE puedan también ser activadas por MACHa, directamente o por la acción de otras proteasas CED3/ICE. La implicación de múltiples proteasas en el proceso de muerte celular es consistente con la capacidad documentada de los inhibidores de diversas proteasas, incluyendo los inhibidores de las serina-proteasas y un inhibidor del escisión por ICE, así como el cDNA antisentido de ICE, para proteger las células de la toxicidad inducida por FAS-R receptor y el receptor de TNF (Weitzen and Granger, 1980; Ruggiero et al., 1987; Enari et al., 1995; Los et al., 1995).

Una variedad de otras enzimas, incluyendo fosfolipasas, esfingomielinasas y proteína-quinasas, pueden participar en la inducción de muerte celular por los receptores del TNF y FAS-R (véase Eischen et al., 1994; Vandenabeele et al., 1995; Cifone et al., 1995 y las referencias contenidas en dichos trabajos). Algunas de estas enzimas pueden llegar a ser activadas por la escisión proteolítica iniciada por MACHa. También parece posible, sin embargo, que al menos parte de estas otras actividades relacionadas con la muerte celular sean estimuladas por distintas rutas de señalización, independientemente de la estimulación por MACHa. La implicación de más de una cascada de señalización en la inducción de la muerte celular, algunas comunes a p55-R y FAS/APO1 y algunas inducidas sólo por una de ellas, sería consistente con los informes sobre las características tanto compartidas como distintas de los procesos de muerte celular inducida por los dos receptores (Grell et al., 1994; Schulze-Osthoff et al., 1994; Wong and Goeddel, 1994; Clement and Stamenkovic, 1994).

(d) MACHa1 se une a MORT-1 así como a MACHl1:

Para encontrar si MACHa1 se puede unir a MORT-1, como lo hace MACH 1, se examinó primeramente la interacción de las proteínas en levaduras transfectadas. Parecía que MACHa1 tenía un efecto citotóxico significativo sobre las levaduras. Este efecto se manifestó en una disminución marcada en la producción de colonias en levaduras que expresaron la proteína en el vector del dominio de activación (AD) (cuyo nivel de expresión es mayor que el del vector del dominio de unión a DNA (DBD)). Por otro lado, MACH 1 en la que el residuo de cisteína catalítico, Cys360, estaba sustituido por Ser (MACHa1 (C360S)) no era citotóxica ni para células de mamífero (véase a continuación) ni para levadura. Al igual que MACH 1, MACHa1 (C360S) se unió en levaduras transfectadas a MORT-1 y también a sí misma. También se unió a MACH 1. También, las levaduras que expresan MACHa1 de tipo natural junto con MORT-1 o MACH 1 exhibieron interacción de las proteínas transfectadas. La intensidad del color del producto lacZ varió, sin embargo, entre las colonias de levaduras; en levaduras transfectadas con MACHa1 tanto en los vectores AD como DBD no se observó ningún producto coloreado, debido probablemente al efecto citotóxico del MACHa1 de tipo natural. Aún así, pese a esta variación, las levaduras que expresan MACHa1 en combinación con MORT-1 o en combinación con MACH 1 fueron claramente positivas para la interacción de las proteínas transfectadas. A diferencia de MACH 1, MACHa1 no exhibió una autointeracción en el ensayo de dos híbridos (Fig. 5).

Tanto MACHa1 (C360S) como MACH 1 coinmunoprecipitaron con MORT-1 en lisados de células renales embrionarias humanas 293-EBNA, lo que indica que se unen a MORT-1 también en células de mamíferos. Analizando adicionalmente si MACHa1 puede unirse a MORT-1 también en células de mamíferos, MACHa1 o MACH 1, fusionadas con el octapéptido FLAG se expresó junto con las moléculas MORT-1 marcadas con el epítopo HA. MACHa1 y MACH 1 marcadas metabólicamente con 35[S] fusionadas en sus extremos N-terminales al octapéptido FLAG (FLAG-MACHa1 y 1), y MORT-1 fusionada por su extremo N terminal al epítopo HA (Field et al., 1988) se expresaron en células HeLa. La inmunoprecipitación de las proteínas de los lisados de las células se realizó usando anticuerpos monoclonales de ratón frente al octapéptido FLAG (M2; Eastman Kodak), epítopo HA (12CA5, Field et al., 1988) o el receptor p75-TNF (Nº 9, Bigda et al., 1994) como control. Las proteínas se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (acrilamida al 12%) seguido por auto-radiografía. Tanto MACHa1 como MACH 1 coinmunoprecipitaron con MORT-1 de lisados de las células, lo que indica que se unen a MORT-1. Pareció que la eficacia de interacción de MACHa1 con MORT-1 era menor que la de MACH 1.

(e) Las moléculas MACH que contienen la región de homología a CED3/ICE pueden mediar la muerte celular:

Para explorar la implicación de MACH en la inducción de muerte celular se examinó el efecto de la sobreexpresión de diversas isoformas de MACH sobre la viabilidad celular. El ensayo se realizó transfectando vectores de expresión de MACH junto con un vector de expresión de -galactosidasa como un marcador de transfección en células embrionarias renales humanas 293-EBNA y células de carcinoma de mama MCF7.

Brevemente, se hicieron crecer células 293-EBNA, células de carcinoma de mama humanas MCF7 y células HeLa HtTA-1 en medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10%, aminoácidos no esenciales, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml estreptomicina. Se transfectaron de modo transitorio placas de cultivo celular (5 x 105 células 293-EBNA, 3 x 105 células MCF7 o 3 x 105 células HeLa en placas de 6 cm), usando el método de precipitación por fosfato cálcico, con los cDNA de las proteínas indicadas junto con el vector de expresión de -galactosidasa. En los experimentos presentados en las Figuras 14a-d y 15, cada placa se transfectó con 3,5 µg de la construcción de MACH indicada y 1,5 µg de pSV--gal. En los experimentos presentados en las Figuras 16A-D y 17-19, cada placa fue transfectada con 2,5 µg de la construcción MACH o MORT-1 indicadas (o como control, un vector vacío) y 1,5 µg de pSV--gal. Las células se lavaron 6 a 10 horas después de la transfección. Las células 293-EBNA y MCF7 se incubaron durante 18 horas más sin tratamiento adicional. Las células HeLa se incubaron durante 26 horas después de la transfección y luego durante 5 horas en presencia de un anticuerpo anti-FAS/APO1 (CH11, 0,5 µg/ml) o TNF (100 ng/ml), junto con cicloheximida (10 µg/ml).

Se evaluó la extensión de la muerte celular al final de los períodos de incubación por determinación de la expresión de -galactosidasa, como ha sido descrito por Kumar et al., 1994.

Cultivos transfectados con un vector de expresión de MACHa1 o MACHa2 exhibieron una muerte celular masiva, manifestada por redondeamiento, vesiculación, contracción, y finalmente desprendimiento de las células de la placa (Fig. 14B). 20 horas después de la transfección, la mayoría de las células transfectadas, identificadas por tinción con

-: galactosidasa (X-Gal), mostraron una morfología condensada típica de apoptosis (Figura 14B). Por el contrario, las células que expresaban el vector vacío permanecieron viables.

En particular, las Figs. 14A-D muestran la morfología de las células renales embrionarias humanas 293-EBNA que expresan de modo transitorio las isoformas de MACH indicadas. Las flechas (Fig. 14B) señalan las células apoptóticas. Las fotografías se tomaron 26 horas después de la transfección. La Fig. 15 muestra la cuantificación de muerte inducida por MACH de las células 293-EBNA (retángulos rayados) y MCF7 (rectángulos negros) por determinación de la porción de las células que expresan -galactosidasa que exhiben morfología apoptótica 20 horas después de la transfección de las construcciones indicadas. Los datos son de tres experimentos independientes con las células 293-EBNA y dos experimentos independientes con las células MCF7. Se expresan como el porcentaje medio de las células azules que exhiben signos de apoptosis como una fracción del número total de células azules contadas (alrededor de 500 células por muestra).

Para examinar la implicación de la región de homología a CED3/ICE dentro de las isoformas MACHa en sus efectos apoptóticos, las células se transfectaron con el vector de expresión para la isoforma MACH 1, que carece de la región de homología a CED3/ICE, así como con los vectores de expresión para MACHa3, que carece de una parte N-terminal de la región, y con vectores de expresión para MACHa1 (C360S) y para un mutante truncado en el extremo C terminal de MACHa1 (MACHa1 (1-415)), que carece de uno de los residuos que se cree que son críticos para la función de la proteasa CED3/ICE (correspondiente a Ser347 en ICE). No ocurrió ninguna muerte (más allá de la ligera cantidad observada en las células transfectadas con un vector de expresión vacio) en las células 293-EBNA

o MCF7 transfectadas con los vectores de expresión para MACHa3, MACHa1 (1-415) o MACHa1 (C360S). Por otro lado, las células transfectadas con MACHa1 junto con estos vectores también exhibieron muy poca muerte celular, indicando que las moléculas de MACH que contienen una región CED3/ICE incompleta tienen un efecto dominante negativo sobre la actividad de las moléculas de tipo natural. Los cultivos que expresan MACH 1, que no contiene la región CED3/ICE, exhibieron alguna ligera muerte celular (Figura 15). Este efecto de MACH 1, que más probablemente resulta de la activación de las moléculas MACHa1 endógenas, fue por alguna razón más pronunciado en las células HeLa transfectadas. Por otro lado, en las células HeLa también fueron algo citotóxicas MACHa3, MACHa1 (1-415) y MACHa1 (C360S) (Figura 19).

La Figura 8 presenta esquemáticamente las interacciones del receptor y la proteína diana que participan en la inducción de muerte celular por FAS/APO1 (FAS-R) y p55-R. Parece que la actividad de MACHa constituye la etapa enzimática más aguas arriba en la cascada de señalización para los efectos citocidas de FAS/APO1 y p55-R. La capacidad de MACH 1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACHa1 sugiere que esta isoforma potencia la actividad de las isoformas enzimáticamente activas.

Es posible que algunas de las isoformas de MACH tengan funciones adicionales. La capacidad de MACH 1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACHa1 sugiere que esta isoforma puede potenciar la actividad de las isoforma enzimática-mente activas. La citotoxicidad moderada observada en cultivos de 293-EBNA y MCF7 transfectados con esta isoforma y el efecto citotóxico bastante significativo que ejerce en células HeLa refleja probablemente la activación de las moléculas MACHa expresadas endógenamente por unión a las moléculas MACH 1 transfectadas. Posiblemente, algunas de las isoformas de MACH podrían también actuar como sitios de anclaje para moléculas que están implicadas en otros efectos no citotóxicos de los receptores de FAS/APO1 y de TNF.

f) El bloqueo de la función MACHa interfiere con la inducción de muerte celular por FAS/APO1 y p55-R.

Para determinar la contribución de MACHa a la citotoxicidad de FAS/APO1 (FAS-R) y p55-R, se expresaron MACHa3, así como los mutantes de MACHa1 no funcionales, MACHa1 (1-415) y MACHa (C360S) en células que fueron inducidas para exhibir esta citotoxicidad. La citotoxicidad inducida por p55-R fue desencadenada en las células 293-EBNA por sobre-expresión transitoria de este receptor (Boldin et al., 1995a), y la citotoxicidad de FAS/APO1 por sobre-expresión de moléculas quiméricas constituidas por el dominio extracelular del p55-R y los dominios transmembranales e intracelulares de FAS/APO1. Por alguna razón, esta quimera tenía un efecto citotóxico mucho mayor que el del FAS/APO1 normal. Las actividades citotóxicas en células HeLa se indujeron también tratándolas con TNF o anticuerpo anti-FAS/APO1 en presencia del agente bloqueante de la síntesis proteica, cicloheximida. Las células HeLa se hicieron sensibles a FAS/APO1 por expresión transitoria de este receptor. En todos los sistemas examinados, MACHa3 y los mutantes de MACHa1 no funcionales proporcionaron una protección eficaz frente a la citotoxicidad inducida por el desencadenamiento de FAS/APO1 o p55-R (Figuras 16-19). Tal protección se observó también, como se describió previamente (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), en células transfectadas con un mutante por deleción N-terminal de MORT-1 que carece de la región de unión a MACH (MORT-1 (92-208)). Estos efectos protectores indican que MACHa es un componente necesario de las cascadas de señalización para muerte celular inducidas tanto por FAS/APO1 como por p55-R.

En particular, las Figs. 16A-D muestran la morfología de células 293-EBNA en las que la muerte celular fue inducida por la expresión transitoria de una quimera que comprende el dominio extracelular de p55-R (aminoácidos 1-168) fusionado a los dominios transmembranales e intracelulares de FAS/APO1 (aminoácidos 153-319) (quimera p55-FAS) (Figs. 16A y 16B), o por expresión del p55-R (Figs. 16C y 16D), y de células que fueron protegidas de estos efectos citotóxicos por su transfección simultánea con MACHa1 (C360S) (Figs. 16B y 16D). Las fotografías fueron tomadas 26 horas después de la transfección. La Fig. 17 ilustra la cuantificación de la muerte inducida en células 293-EBNA por su transfección con la quimera p55-FAS o con p55-R, junto con un vector vacío, un mutante por deleción de MORT-1 que carece de la región de unión a MACH (MORT-1 (92-208)), o moléculas de MACHa que contienen una región de CED3/ICE no funcional. La Fig. 18 muestra la muerte de células HeLa que expresan de modo transitorio FAS/APO1, inducida por el tratamiento con el anticuerpo anti-FAS/APO1 (aFAS) y cicloheximida (CHI), y su prevención por la co-transfección de MORT-1 DD (92-208), MACHa (C360S) o MACHa3. La Fig. 19 muestra la muerte de las células HeLa inducida por aplicación de TNF y cicloheximida (CHI), y su prevención como en la Fig. 18. Los datos son de al menos dos experimentos independientes y están expresados como en las Figuras 14A-F y 15.

MACH se expresa en diferentes tejidos en niveles marcadamente diferentes y aparentemente también con diferentes patrones de isotipo. Estas diferencias contribuyen probablemente a las características específicas de tejido de respuesta al ligando de Fas/APO1 y al TNF. Como en el caso de otros homólogos a CED3/ICE (Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995), se encuentra que las isoformas de MACH que contienen regiones de CED3/ICE incompletas (por ejemplo MACHa3) inhiben las actividades de las moléculas MACHa1 o MACHa2 co-expresadas. También se encuentra que bloquean la inducción de muerte por FAS/APO1 y p55-R. La expresión de tales isoformas inhibidoras en células puede constituir un mecanismo de autoprotección celular frente la citotoxicidad mediada por FAS/APO1 y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas de MACH, que excede ampliamente la observada para cualquiera de las otras proteasas de la familia CED3/ICE, debe permitir un ajuste particularmente fino de la función de las isoformas de MACH activas.

Las solicitudes de patentes extranjeras, las patentes expedidas en EE.UU. o las extranjeras o cualesquiera otras referencias, se incorporan enteramente como referencia en la presente memoria, incluyendo todos los datos, tablas, figuras, y texto presentados en dichas referencias. Adicionalmente, el contenido completo de las referencias citadas dentro de las referencias citadas a su vez en la presente memoria se incorpora enteramente como referencia.

La referencia a etapas de métodos conocidos, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es de ningún modo una admisión de que cualquier aspecto, descripción o realización de la presente invención sea descrita, enseñada o sugerida en la técnica relevante.

La descripción precedente de las realizaciones específicas revelará de modo completo la naturaleza general de la invención que otros, aplicando conocimientos comunes a la técnica (incluyendo los contenidos en las referencias citadas en la presente memoria), pueden modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones, tales como realizaciones específicas, sin una experimentación excesiva, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que tales adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado y gama de equivalentes de las realizaciones descritas, basadas en la enseñanza y guía incluidas en la presente memoria. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente memoria es para fines de descripción y no de limitación, de tal modo que la terminología o fraseología de la presente memoria ha de ser interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y guías incluidas en la presente memoria, en combinación con el conocimiento de los expertos en la técnica.

REFERENCIAS

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Tewari, M. et al. (1995b) Cell 81:1-20. Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356:768-774. Thornberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33:3934-3940. Tracey, J.T. et al. (1987) Nature, 330:662-664.

5 Vandenabeele, P. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5:392-400. Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10:411-452. Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132:2464-9. Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London. Wallach, D. et al. (1994) Cytokine 6:556.

10 Wang, L. et al. (1994) Cell 78:739-750. Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature, 356:314-317. Watanabe, F.R. et al. (1992) J. Immunol. 148:1274-1279. Weitzen, M. et al. (1980) J. Immunol. 125:719-24. Wilks, A.F, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1603-1607.

15 Wong, et al. (1994) J. Immunol. 152:1751-1755. Xue, D. et al. (1995) Nature 377:248-251. Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:1747-1756. Yuan, J. et al. (1993) Cell 75:641-652. Zaccharia, S. et al. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203:353-357.

20 Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature (England) 365:448-51.

LISTA DE SECUENCIAS

(1): INFORMACIÓN GENERAL

5: (i) SOLICITANTE:

(A) NOMBRE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD. at the Weizmann Institute

of Science

(B) CALLE : P.O. Box 95

(C) CIUDAD: Rehovot

(E) PAIS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL: 76100

(G) TELEFONO: 011-972-847-0617

(H) TELEFAX: 011-972-847-0733

15

(A) NOMBRE: David WALLACH

(B) CALLE: 24 Borochov Street

(C) CIUDAD: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL : 76406

(G) TELEFONO: 011-972-8946-3302

(A) NOMBRE: Mark P. BOLDIN

(B) CALLE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore 303

25: (C) CIUDAD: Rehovot

(D) ESTADO:

(E) PAIS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL: 76000

(A) NOMBRE: Tanya M. GONCHAROV

(B) CALLE: Derekh Yavne 17-15

(C) CIUDAD: Rehovot

(D) ESTADO:

(E) PAIS: Israel

35: (F) CODIGO POSTAL: 76000

(A) NOMBRE: Yury V. GOLTSEV

(B) CALLE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore 402

(C) CIUDAD: Rehovot

(D) ESTADO:

(E) PAIS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL: 76000

(A) NOMBRE: Henry WEINWURZEL

45: (B) CALLE: Herzl Street 43

(C) CIUDAD: Raanana

(E) PAIS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL: 43353

(ii) TITULO DE LA INVENCION: MODULADORES DE LA FUNCIÓN DE LOS RECEPTORES DE FAS Y OTRAS PROTEÍNAS

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 34

55: (iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A) TIPO DE MEDIO: Disquete

(B) ORDENADOR: Compatible con IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

65: (A) NUMERO DE SOLICITUD: IL 114,615 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-JUL-1995

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A) (B): NUMERO DE SOLICITUD: IL 114,986 FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-AG-1995

5

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A) (B): NUMERO DE SOLICITUD: IL 115,319 FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-SEP-1995

10

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A) (B): NUMERO DE SOLICITUD: IL 116,588 FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-DIC-1995

15

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A) (B): NUMERO DE SOLICITUD: IL 117,932 FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-ABR-1996

20

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 1:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

25: (A) LONGITUD: 1701 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: única(D) TOPOLOGÍA: lineal

30: (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA

(ix): CARACTERISTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

35: (B) SITUACION:1..768

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 2:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 256 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGIA: lineal

10

(ii): TIPO DE MOLECULA : proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

5: (2) INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 3:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 200 pares de bases

10: (B) TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

15

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 4:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1036 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

15

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 5:

20: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 235 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

25: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

-47-

5: (2) INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 6:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 78 aminoácidos

10: (B) TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

15

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 7: 5 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 479 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única 10 (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 8:

5

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 277 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

10: (C) TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

15: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

5: (2) INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 9:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 489 aminoácidos

10: (B) TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

-52-

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 10:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 421 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 11:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 376 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 12:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 377 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 13: .

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 404 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA; proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

15

(2) INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 14:

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2887 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única -63-

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

5: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 15: 5

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1323 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico 10 (C) TIPO DE CADENA: única

(D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 16:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 335 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

15

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 17:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 2619 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

10: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 18: 5 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 464 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única 10 (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

(2) INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 21:

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 22: 15 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 91 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única 20 (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

(2) INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 23:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 30

(A): LONGITUD: 829 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal 35

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 19:

5

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1301 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

10: (C) TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

15: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 20:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

5

(A): LONGITUD: 266 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

10

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

(A): LONGITUD: 334 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

5: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

10

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 24:

5

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 784 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

10: (C) TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

15: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 25:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 261 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

10: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 26:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 37 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 27:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 28:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 29:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 30:

(2): IMFORMATIOM PARA SEC ID NO: 31:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 33:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 277 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

5: (C) TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

10: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

5

(A): LONGITUD: 293 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

10

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 32:

5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 398 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: única

10: (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:

15

5: (ii) (A) LONGITUD: 1443 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGIA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:

(2): INFORMACIÓN DE SEC ID NO: 34:

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

15

(A): LONGITUD: 91 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: única

(D): TOPOLOGIA: lineal

20

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

La presente descripción proporciona los siguientes puntos:

1. Una secuencia de DNA que codifica una proteína, o sus fragmentos y análogos, siendo capaces dicha proteína, o sus fragmentos y análogos de unirse o interaccionar con la proteína MORT-1 y mediar el efecto intracelular mediado por el FAS-R o p55-TNF-R.

2. Una secuencia de DNA de acuerdo con el punto 1, seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de cDNA que codifica una proteína de unión a MORT-1 natural;

(b): secuencias de DNA capaces de hibridarse a una secuencia de (a) en condiciones moderadamente restrictivas y que codifican una proteína de unión a MORT-1 biológicamente activa; y

(c): secuencias de DNA que están degeneradas como resultado del código genético dando las secuencias de DNA definidas en (a) y (b) y que codifican una proteína de unión a MORT-1 biológicamente activa.

3.: Una secuencia de DNA de acuerdo con el punto 1, que comprende al menos parte de la secuencia de SEQ ID NO:4 y que codifica al menos una isoforma de la proteína MACH seleccionada de las isoformas de MACH designadas en la presente memoria, MACHa1, MACHa2, MACHa3, MACH 1, MACH 2, MACH 3, MACH 4 y MACH 5, y sus fragmentos y análogos.

4.: Una secuencia de DNA de acuerdo con el punto 3, que codifica una isoforma de MACH seleccionada de MACHa1, MACH 1 y MACH 3 que tiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:8, respectivamente, y sus fragmentos y análogos.

5.: Una secuencia de DNA de acuerdo con el punto 4, que codifica MACHa1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, sus fragmentos y análogos.

6.: Una secuencia de DNA de acuerdo con el punto 4, que codifica MACH 1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5, sus fragmentos y análogos.

7.: Una secuencia de DNA de acuerdo con el punto 4, que codifica MACH 3 que tiene aminoácido

8.: Un vector que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-7.

9.: Un vector de acuerdo con el punto 8, capaz de expresarse en una célula hospedante eucariota.

10.: Un vector de acuerdo con el punto 8, capaz de expresarse en una célula hospedante procariota.

11. Células hospedantes eucariotas o procariotas transformadas que contienen un vector de acuerdo con el punto 8.

12. Una proteína de unión a MORT-1, fragmentos, o sus análogos o derivados funcionales capaces de unirse

o interaccionar con MORT-1 y mediar el efecto intracelular mediado por FAS-R o p55-TNF-R.

13.: Una proteína de unión a MORT-1, sus fragmentos, análogos y derivados de acuerdo con el punto 12, donde dicha proteína, análogos, fragmentos y derivados son al menos una isoforma de MACH seleccionada de: MACHa1, MACHa2, MACHa3, MACH 1, MACH 2, MACH 3, MACH 4 MACH 5.

14.: Una isoforma de MACH de acuerdo con el punto 13, seleccionada de: MACHa1, MACH 1 MACH 3 que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:8, respectivamente, y sus fragmentos, análogos y derivados.

15.: MACH 1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, sus fragmentos, análogos y derivados.

16.: MACH 1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5, sus fragmentos, análogos y derivados.

17.: MACH 3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8, sus fragmentos, análogos y derivados.

18.: Un método para producir la proteína de unión a MORT-1, sus fragmentos, análogos o derivados, que comprende hacer crecer las células hospedantes transformadas de acuerdo con el punto 11, en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, análogos o derivados, efectuando modificaciones posttraduccionales, si es necesario, para obtener dicha proteína, fragmentos, análogos o derivados, y aislar dicha proteína, fragmentos, análogos o derivados expresados.

19.: Anticuerpos, o sus fragmentos o derivados activos, específicos para la proteína de unión a MORT-1, fragmentos, análogos o derivados de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12-17.

20.: Un método para la modulación del efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células que llevan un FAS-R o p55-R, que comprende tratar dichas células con una o más proteínas de unión a MORT-1, análogos, fragmentos o derivados de acuerdo con el punto 12, capaces de unirse a MORT-1, que se une al dominio

intracelular de FAS-R o capaces de unirse a MORT-1 que se une a TRADD que se une al dominio intracelular de p55-R y de este modo ser capaces de modular/mediar la actividad de dicho FAS-R o p55-TNF-R, en donde dicho tratamiento de dichas células comprende introducir en dichas células dicha una o más proteínas, análogos, fragmentos o derivados en una forma adecuada para su introducción intracelular, o introducir en dichas células una secuencia de DNA que codifica dicha una o más proteínas, análogos, fragmentos o derivados en forma de un vector adecuado que lleva dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células.

21.: Un método para la modulación del efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre las células de acuerdo con el punto 20, en donde dicho tratamiento de células comprende introducir en dichas células dicha proteína de unión a MORT-1, análogos, fragmentos o derivados, una secuencia de DNA que codifica dicha proteína de unión a MORT-1, análogos, fragmentos o derivados en forma de un vector adecuado que lleva dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células.

22.: Un método de acuerdo con el punto 20 o 21, en donde dicho tratamiento de dichas células es la transfección de dichas células con un vector viral recombinante de animal, que comprende las etapas de:

(a) construir un vector viral recombinante de animal que lleva una secuencia que codifica una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor específico de la superficie celular sobre la superficie de una célula que lleva FAS-R o p55-R y una segunda secuencia que codifica dicha proteína seleccionada de la proteína de unión a MORT-1, análogos, fragmentos y derivados, que cuando se expresa en dichas células es capaz de modular/mediar la actividad de dicho FAS-R o p55-R; y

(b) infectar dichas células con dicho vector de (a).

23. Un método para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células que llevan un FAS-R o un p55-R, que comprende tratar dichas células con anticuerpos, o sus fragmentos o derivados activos, de acuerdo con el punto 19, siendo dicho tratamiento la aplicación de una composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, sus fragmentos o derivados activos a dichas células, en donde cuando la proteína de unión a MORT-1

o porciones de dichas células se exponen a la superficie extracelular, dicha composición se formula para aplicación extracelular y cuando dichas proteínas de unión a MORT-1 son intracelulares dicha composición se formula para aplicación intracelular.

24.: Un método para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células que llevan un FAS-R o p55-R que comprende tratar dichas células con una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido para al menos parte de la secuencia de DNA que codifica una proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-7, siendo dicha secuencia de oligonucleótidos capaz de bloquear la expresión de la proteína de unión a MORT-1.

25.: Un método de acuerdo con el punto 24, en el que dicha secuencia de oligonucleótidos se introduce en dichas células por medio de un vector viral recombinante de animal, en donde dicha segunda secuencia de dicho virus codifica dicha secuencia de oligonucleótidos.

26.: Un método para tratar células tumorales o células infectadas por VIH u otras células patógenas, que comprende:

(a) construir un vector viral recombinante de animal que lleva una secuencia que codifica una proteína de superficie viral capaz de unirse a un receptor específico de superficie de célula tumorales o un receptor de superficie de células infectadas por VIH o un receptor llevado por otras células patógenas y una secuencia que codifica una proteína seleccionada de la proteína de unión a MORT-1, análogos, fragmentos y derivados de uno cualquiera de los puntos 12-17, que cuando se expresa en dichas células tumorales, infectadas por VIH u otras células patógenas es capaz de matar a dicha célula; y

27.: Un método para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células, que comprende aplicar el procedimiento con ribozimas en el que un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interaccionar con una secuencia de mRNA celular que codifica una proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12-17, se introduce en dichas células en una forma que permita la expresión de dicha secuencia de ribozima en dicha células y en donde cuando dicha secuencia de ribozima se expresa en dichas células interacciona con dicha secuencia de mRNA celular y escinde dicha secuencia de mRNA dando como resultado la inhibición de la expresión de dicha proteína de unión a MORT-1 en dichas células.

28.: Un método seleccionado del método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 20-27, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 o dicha secuencia que codifica la proteína de unión a MORT-1 comprende al menos una de las isoformas de MACH, o análogos, fragmentos y derivados de cualquiera de ellas de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13-17, que son capaces de unirse específicamente a MORT-1 que a su vez se une específicamente a FAS-IC, o que son capaces de unirse a MORT-1 que a su vez se une a TRADD y que a su vez se une a p55-IC.

29.: Un método para aislar e identificar proteínas, de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12-17, capaces de unirse a la proteína MORT-1, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos en levadura en el que una secuencia que codifica dicha proteína MORT-1 es llevada por un vector híbrido y una secuencia procedente de una genoteca de DNA genómico o cDNA es llevada por el segundo vector híbrido, utilizándose a continuación los vectores para transformar células hospedantes de levadura y aislándose las células transformadas positivas, seguido por la extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicha proteína MORT-1, siendo dicha proteína la proteína de unión a MORT-1.

30.: Un método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 20-29, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es la isoforma de MACH denominada en la presente memoria MACHa1, sus análogos, fragmentos y derivados.

31.: Un método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 20-29, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es la isoforma de MACH denominada en la presente memoria MACH 1, sus análogos, fragmentos y derivados.

32.: Un método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 20-29, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es la isoforma de MACH denominada en la presente memoria MACH 3, sus análogos, fragmentos y derivados.

33.: Una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células, que comprende, como ingrediente activo, una proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12-17, sus fragmentos, análogos, derivados o mezclas biológicamente activos.

34.: Una composición farmacéutica para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células, que comprende, como ingrediente activo, un vector viral recombinante de animal que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de la superficie celular y que codifica una proteína de unión a MORT-1 o sus fragmentos o análogos biológicamente activos, de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12-17.

35.: Una composición farmacéutica para modular el efecto del ligando de FAS-R o de TNF sobre células, que comprende, como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de mRNA de la proteína de unión a MORT-1 de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-7.

36.: Un método para la modulación del efecto inducido por MORT-1 o el efecto inducido por la proteína de unión a MORT-1 sobre células, que comprende tratar dichas células con proteínas de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados, o con secuencias que codifican proteínas de unión a MORT-1, sus análogos o fragmentos, dando como resultado dicho tratamiento la potenciación o inhibición de dicho efecto mediado por MORT-1 y por ello también del efecto mediado por FAS-R o p55-R.

37.: Un método de acuerdo con el punto 36, en donde dicha proteína de unión a MORT-1, su análogo, fragmento o derivado, es la parte de la proteína de unión a MORT-1 que está específicamente implicada en la unión a MORT-1 o la proteína de unión a MORT-1 propiamente dicha o dicha secuencia de la proteína de unión a MORT1 codifica dicha parte de la proteína de unión a MORT-1 que está específicamente implicada en la unión a MORT-1

o la proteína de unión a MORT-1 propiamente dicha.

38.: Un método de acuerdo con el punto 36 o 37, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es una cualquiera de las isoformas de MACH seleccionadas de: MACHa1, MACH 1 y MACH 3, siendo dichas isoformas de MACH capaces de potenciar el efecto asociado a MORT-1 sobre células y de este modo también el efecto asociado a FAS-R o p55-R sobre las células.

39.: Un método de acuerdo con el punto 36 o 37, en donde dicha proteína de unión a MORT-1 es una cualquiera de las isoformas de MACH seleccionadas de MACHa2 o MACHa3, siendo dichas isoformas de MACH capaces de inhibir intracelularmente la actividad de las isoforma de MACH y de este modo inhibir el efecto celular asociado a MORT-1 y de este modo también el efecto asociado a FAS-R o p55-R sobre las células.

40.: Un método de modular procesos apoptóticos o procesos de muerte celular programada, que comprende tratar dichas células con una o más proteínas de unión a MORT-1, análogos, fragmentos o derivados, de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 12-17, capaces de unirse a MORT-1, que se une al dominio intracelular de FAS-R,

o capaces de unirse a MORT-1 que se une a TRADD que se une al dominio intracelular de p55-R y de este modo ser capaces de modular/mediar la actividad de dicho FAS-R o p55-TNF-R, en donde dicho tratamiento de dichas células comprende introducir en dichas células dicha una o más proteínas, análogos, fragmentos o derivados en una forma adecuada para su introducción intracelular o introducir en dichas células una secuencia de DNA que codifica dichos una o más proteínas, análogos, fragmentos o derivados en forma de un vector adecuado que lleve dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células.

41. Un fragmento de acuerdo con el punto 12, que es un péptido.

42.: Un inhibidor de la actividad proteolítica de una proteasa MACH, que comprende un compuesto que se une al sitio activo de la proteasa de dicha proteasa MACH de modo que interfiere la actividad proteolítica de dicha proteasa MACH.

43.: Un inhibidor de acuerdo con el punto 42, que comprende un péptido que tiene una secuencia de al menos los cuatro aminoácidos que son el sustrato peptídico de longitud mínima para dicha proteasa MACH, incluyendo además dicho péptido un resto que interfiere con la actividad proteolítica de dicha proteasa MACH.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Yeda Research and Development Co., Ltd. 5

<120> Moduladores de la función de los receptores de FAS y otras proteínas

<130> C1185 EP/1 S3 10 <160> 34

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 15 <211> 1701

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220> 20 <221> CDS

<222> (1)..(768)

<400> 1

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 200

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1036

<212> DNA 15 <213> Homo sapiens

<400> 4 5

<210> 5

<211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 5

<210> 6

<211> 78

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 479

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>

<210> 8

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 489

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 9

<210> 10

<211> 421

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 376

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 376

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 404

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 2887

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 1323

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 335

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 2619

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 1301

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 266

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 334

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

10 <210> 22

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 22

<210> 23

<211> 829

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 784

<212> DNA

<213> Homo sapiens 10

<400> 24

<210> 25

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial (Cebador)

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial (Cebador)

<400> 27

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial (Cebador)

<400> 28

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

5

<220>

<223> Artificial (Cebador)

<400> 29

10

<210> 30

<211>: 277 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 293

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 398

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211>: 1443 10 <212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de DNA seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de DNA, SEQ ID NO: 14 o 17;

(b)

una secuencia de cDNA que codifica una proteína MACH que comprende SEQ ID NO: 7 o 18;

(c)

una secuencia de DNA capaz de hibridarse, en condiciones moderadamente rigurosas, con las secuencias de (a) o (b), en donde la secuencia de DNA codifica una proteína MACH, que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa;

(d)

una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético dando las secuencias de DNA definidas en (a) o (b) y que codifica una proteína MACH que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa; y

(e)

un fragmento del DNA de una cualquiera de (a) a (d) que codifica una proteína que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa.
2.

Un vector que comprende una secuencia de DNA de la reivindicación 1.
3.

El vector de la reivindicación 2, capaz de ser expresado un una célula hospedante procariota o eucariota.
4.

Células hospedantes procariotas o eucariotas transformadas que contienen un vector de la reivindicación
2.
5. Una proteína MACH codificada por el DNA de la reivindicación 1.
6.

Un método para producir una proteína MACH codificada por la secuencia de DNA de la reivindicación 1, que comprende hacer crecer las células hospedantes transformadas de la reivindicación 4 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, efectuar modificaciones post-traduccionales para obtener dicha proteína y aislar dicha proteína expresada.
7.

Anticuerpos específicos para la proteína MACH de la reivindicación 5, o fragmentos Fab o F(ab’)2 de dichos anticuerpos.
8.

Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una proteína MACH de la reivindicación 5 o una proteína aislada según el método de la reivindicación 6, o sus mezclas.
9.

Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un vector viral recombinante de animal que codifica una proteína MACH de la reivindicación 5.
10.

Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de MACH de la reivindicación 1.
11.

Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo de la reivindicación 7.
12.

Uso de una proteína MACH de la reivindicación 5, o secuencias que codifican dicha proteína, en la preparación de una composición farmacéutica para tratar tumores o inflamación.
13.

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de tumores o inflamación, que comprende una proteína MACH de la reivindicación 5 o secuencias que codifican dicha proteína.

FIG 18