ES2402417T3 - Plantas resistentes a hongos y sus usos - Google Patents

Abstract

Un método para generar o incrementar la resistenciUn método para generar o incrementar la resistencia de una planta a un patógeno vegetal del filum Ooa de una planta a un patógeno vegetal del filum Oomiceta quecomprende incrementar la actividad de unmiceta quecomprende incrementar la actividad de una proteína Rpi-blb2 en una planta o en un tejido, a proteína Rpi-blb2 en una planta o en un tejido, órgano o célula de una plantao una parte de los miórgano o célula de una plantao una parte de los mismos expresando una proteína Rpi-blb2 transgénica smos expresando una proteína Rpi-blb2 transgénica que codifica una molécula de ácido nucleicoy/o incque codifica una molécula de ácido nucleicoy/o incrementar el número de copias de una proteína de larementar el número de copias de una proteína de la Rpi-blb2 que codifica una molécula de ácido nucle Rpi-blb2 que codifica una molécula de ácido nucleico, endonde dicha proteína de la Rpi-blb2 es codiico, endonde dicha proteína de la Rpi-blb2 es codificada por un polinucleótido que comprende una molficada por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleicoseleccionada del grupo consécula de ácido nucleicoseleccionada del grupo consistente de: (a) molécula de ácido nucleico que codistente de: (a) molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido comifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ IDNO: 2 o 4; (b) molécula do se representa en SEQ IDNO: 2 o 4; (b) molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de code ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 oificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 o5 o 6 que codifica al menos la forma madura del po5 o 6 que codifica al menos la forma madura del polipéptido; (c) molécula de ácido nucleico que codilipéptido; (c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codiffica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por una molécula de ácidonucleico de (a) o (icado por una molécula de ácidonucleico de (a) o (b) por medio de sustitución, eliminación y/o adicib) por medio de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia deaón de uno o varios aminoácidos de la secuencia deaminoácidos del polipéptido codificado por una moléminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como recula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como resultado unahomología de más de 85% de identidad; (sultado unahomología de más de 85% de identidad; (d) molécula de ácido nucleico que comprende un frad) molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento biológicamente activo de un polipéptido codgmento biológicamente activo de un polipéptido codificado por unamolécula de ácido nucleico de uno cificado por unamolécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (c); (e) molécula de ácido nuclualquiera de (a) a (c); (e) molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida bajo condieico cuya cadena complementaria hibrida bajo condiciones restrictivas con una molécula deácido nucleciones restrictivas con una molécula deácido nucleico de cualquiera de (a) a (d) y que codifica una ico de cualquiera de (a) a (d) y que codifica una proteína Rpi-blb2; o la cadena complementaria de uproteína Rpi-blb2; o la cadena complementaria de uno cualquiera de (a) a (e). no cualquiera de (a) a (e).

Description

Plantas resistentes a hongos y sus usos

La presente invención se relaciona con un método novedoso para incrementar la resistencia de una planta, en particular de una Solanaceae, preferiblemente de patata y tomate, frente a patógenos del filum Oomycetes que comprende el incremento de la actividad del polipéptido de la presente invención. La invención se relaciona adicionalmente con polinucleótidos y vectores que comprenden estos polinucleótidos. La invención adicionalmente se relaciona con vectores, células, plantas transgénicas y material de propagación transgénico correspondiente y derivado de ellos, métodos para producirlos y su uso para la producción de materiales alimenticios, materiales de pienso, semillas, productos farmacéuticos o productos químicos finos.

El objetivo del trabajo de la biotecnología con plantas es la generación de plantas con propiedades novedosas ventajosas, por ejemplo para incrementar la productividad agrícola, incrementando la calidad en el caso de los productos alimenticios o para producir agentes químicos o farmacéuticos específicos (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96). Los mecanismos naturales de defensas de las plantas contra patógenos son frecuentemente insuficientes. Las enfermedades fúngicas solas dan como resultado pérdidas en rendimientos anuales de muchos miles de millones de dólares. La introducción de genes foráneos de fuentes vegetales, animales o microbianas pueden incrementar las defensas. Ejemplos es la protección del trabajo contra el daño producido por la alimentación de insectos que expresan endotoxinas de Bacillus thuringiensis bajo el control del promotor 35S CaMV (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección del tabaco contra infección fúngica por la expresión de una quitinasa de judía bajo el control del promotor CaMV (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayor parte de las metodologías descritas solamente ofrecen resistencia a un patógeno individual o a un espectro estrecho de patógenos.

A pesar de la notable hambruna por la patata irlandesa a mitad del siglo 19, la mildiú continúa siendo una de las enfermedades más devastadoras en plantas de cultivo. La mildiú es causada por el hongo oomiceto Phytophthora infestans un patógeno especializado, que produce primariamente enfermedades en el follaje y frutos de un amplio rango de especies de Solanaceae, especialmente patata y tomate. El hongo fue observado primero en México y por diversas razones se cree que México es el centro de origen del hongo. Ambos tipos coincidentes A1 y A2 están presentes permanentemente por ejemplo en el área de Toluca. También se reporta el P. infestans en especies nativas de Solanum en áreas remotas de México. Adicionalmente, muchas especies de Solanum que llevan tubérculos con alto nivel de resistencia al mildiú se encuentran en México. Las medidas prevalentes para prevenir los fallos en cultivos o rendimientos reducidos implican la aplicación de fungicidas que evitan o curan la infección por parte de parte de P. infestans. En vez del uso masivo de pesticidas químicos podría ser ventajosa una metodología alternativa para controlar el mildiú: el uso de cultivares, que acogen una resistencia parcial o completa al mildiú. Para obtener resistencia al mildiú, los cultivadores se han enfocado en el pasado en la introgresión de genes R dominantes de Solanum demissum, una especie de patata silvestre nativa de México. Se han identificado once de tales genes de R, varios de los cuales han sido mapeados en cuanto a loci específicos en el mapa genético de la patata (revisados en Gebhardt and Valkonen, 2001) y recientemente se ha clonado el gen R1. El R1 y el R2 están localizados en los cromosomas 5 y 4 respectivamente. R3, R6 y R7 están localizados en el cromosoma 11. Genes R desconocidos que confieren resistencia específica de la raza al mildiú también han sido descritos en S. tuberosum ssp andigena y S. berthaultii y S. pinnatisectum. La resistencia inducida por los genes R fue casi completa pero no pareció ser muy durable en ningún caso. Debido al alto nivel de resistencia y facilidad de transferencia, mucho cultivares contienen resistencia derivada de

S. demissum. Desafortunadamente, la resistencia específica de raza derivada de S. demissum, aunque casi completa, no es durable. Una vez que crecen cultivares recientemente sembrados de patata en gran escala en campos comerciales, emergieron nuevas virulencias en P. infestans. Los cuales hicieron que el patógeno fuera capaz de superar la resistencia introgresada. Puede encontrarse una resistencia de campo más durable al mildiú, frecuentemente cuantitativa en naturaleza y presumiblemente no específica de la raza en varias especies Mexicanas y de América Central y de América del Sur de Solanum. Sin embargo este tipo de resistencia es difícil de transferir a cultivares de patata a través de cruzamiento y selección fenotípica.

El S. bulbocastanum diploide de México y Guatemala es una de las especies portadora de tubérculos que es suficientemente conocida por sus altos niveles de resistencia al mildiú. Desafortunadamente, la transferencia clásica de resistencia de especies de Solanum silvestres a la patata cultivada es evitada frecuentemente debido a diferencias en ploidia y en el Número de Balance de Endospermas (EBN). A pesar de estos problemas, la introgresión de la resistencia de S. bulbocastanum característica ha sido exitosa. Recientemente, se encontró que híbridos somáticos de S. bulbocastanum y S. tuberosum y germoplasma retrocruzado eran altamente resistentes al mildiú, incluso bajo presión extrema de la enfermedad (Helgeson et al., 1998). A pesar de los reportes de supresión de recombinación, la resistencia en el material retrocruzado parece estar en el cromosoma 8 dentro de un intervalo de aproximadamente 6 cM entre los marcadores RFLP CP53 y CT64. Un marcador CAPS derivado del tomate RFLP sonda CT88 se segregó con resistencia.

De acuerdo con lo anterior, en los años recientes el desarrollo de plantas resistentes a patógenos del filum Oomiceta ha estado avanzando. Sin embargo, 40 años de investigación intensa y continua y esfuerzos de cruzamiento con germoplasma disponible no ha dado aún resultados en la introducción al mercado de cultivares resistentes. El número prevalente de genes identificados en los años recientes confieren solamente resistencia específica de raza. Adicionalmente, la resistencia alcanzada no fue durable. Además, la aplicación de protectores de cultivos se considera ampliamente como una carga para el ambiente. Así, en varios países occidentales, la legislación se hace más restrictiva y parcialmente prohibitiva a la aplicación de fungicidas específicos, haciendo más difícil el control químico de la enfermedad. Adicionalmente, el control químico es costoso. Finalmente, otra restricción es el desarrollo de resistencia por parte del hongo a fungicidas específicos tales como metalaxil, lo cual ha sido reportado desde muchos países en el mundo.

De acuerdo con lo anterior, el programa que subyace a la presente invención es proveer medios y métodos novedosos para una protección eficiente de plantas contra el mildiú y enfermedades relacionadas.

La solución del problema técnico se logra proveyendo las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención se relaciona con un método para generar o incrementar la resistencia de una planta a un patógeno vegetal del filum Oomicetes que comprende incrementar la actividad de la proteína Rplblb2 en la planta o un tejido, órgano o célula de la planta o parte de la misma.

La Rpi-blb2 es un tipo LZ-NBS-LRR de gen R y muestra homología de secuencia con el gen Mi-1 del tomate, que confiere resistencia a tres especies de nematodos de los nódulos radiculares (Meloidogyne spp) así como al áfido de la patata Macrosiphum euphorbiae (Vos et al., 1998; Rossi et al., 1998; WO 98106750; Milligan et al., 1998) y a los dos biotipos B y Q de la mosca blanca Bermisia tabaci (Nombela et al., 2003). Tal como se encontró para Rpi-blb, el Rpiblb2 también confiere resistencia completa a un rango de aislados de P. infestans que portan múltiples factores de virulencia y no se ha demostrado aún especificidad en la raza.

El término “Rpi-blb2” se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad proteínica Rpi-blb2 aquí mencionada o un polipéptido que tiene dicha actividad proteínica de la Rpi-blb2. Si en lo que sigue el término “Rpiblb2” se relaciona con un polipéptido o un polinucleótido será claro a partir del contexto de su uso.

Con el término “generar” o “incrementar” o “estimular” la resistencia de una planta se entiende que la resistencia de una planta o parte de la misma se incrementa o genera o estimula en comparación con una referencia.

“Conferir”, “existir”, “generar”, “estimular” o “incrementar” una resistencia a un patógeno significa que los mecanismos de defensa de una especie específica de una especie o variedad específica de una planta es crecientemente resistente a uno o más patógenos debido al uso del método de acuerdo con la invención en comparación con el tipo silvestre de la planta, al cual el método de acuerdo con la invención no ha sido aplicado, bajo condiciones de otra manera idénticas (tales como, por ejemplo, condiciones climáticas, condiciones de crecimiento, especies patógenas y similares). La resistencia incrementada se manifiesta así misma preferiblemente en una manifestación reducida de síntomas de la enfermedad, síntomas de la enfermedad que comprenden – además de los efectos adversos antes mencionados – por ejemplo también la eficiencia de la penetración de un patógeno en la planta o células de la planta o la eficiencia en la proliferación en o sobre la misma. En este contexto, los síntomas de la enfermedad se reducen preferiblemente en al menos 10% o al menos 20%, especialmente de manera preferible en al menos 40% o 60%, muy especialmente de manera preferible en al menos 70% u 80%, lo más preferiblemente en al menos 90% o 95%.

Con el término “incrementado” se entiende aquí que una actividad de un producto genético es superior que en una referencia. Así, el término “incrementado” incluye que una actividad, por ejemplo la actividad del producto genético Rpiblb2 o de otro producto genético, se genera de novo, si esa actividad, por ejemplo la actividad Rpi-blb2 aquí descrita, no se encuentra en la referencia. El término “incrementado” también se refiere a la estimulación de la actividad de un producto genético. Una expresión incrementada de un gen, esto es, su activación puede ser estimulada de diversas maneras, por ejemplo, aplicando agentes químicos o por tensión biótica a un organismo. Por ejemplo, una resistencia a infectar un gen que media en parásitos puede ser activada por infección con un parásito, por ejemplo, con P. infestans y confiere una resistencia incrementada al mismo y/o otros patógenos.

Así, en lo que sigue, el término “incrementar” también comprende los términos “estimular” y “generar”.

“Resistencia a patógenos” denota la reducción o debilitamiento de síntomas de la enfermedad de una planta después de una infección con un patógeno. Los síntomas pueden ser distribuidos, pero preferiblemente abarcan aquellos que directa o indirectamente tienen un efecto adverso en la calidad de la planta, la calidad del rendimiento, la estabilidad para uso como material de alimentación o pienso, o además que hace difícil la siembra, plantación, recolección o procesamiento del cultivo.

“Patógeno” dentro del alcance de la invención significa a manera de ejemplo pero no como limitación virus o viroides, bacterias, hongos, plagas animales tales como, por ejemplo, insectos o nematodos.

El término “proteína de la Rpi-blb2” se relaciona con una proteína o polipéptido cuya expresión en una planta o una parte confiere resistencia de la planta o de una parte de la planta a uno de los patógenos descritos aquí en comparación con una cepa no resistente.

La planta o un tejido, órgano o célula de la planta o una parte de la misma que comprende la actividad incrementada de la proteína Rpi-blb2 es menos susceptible de una infección por parte de un patógeno, en particular por un patógeno del filum oomicetes o preferiblemente P. infestans, que una planta o parte de la misma que tiene un fondo genético idéntico pero no los elementos genéticos necesarios para permitir una expresión de la Rpi-blb2 (aquí denominada “tipo silvestre”

o “referencias”). Los ensayos para probar la resistencia de una planta o parte de la misma son bien conocidos para una persona experimentada en la técnica. La resistencia a P. infestans puede ser definida como índice de esporulación de acuerdo con Flier, 2001. Flier describe el índice de esporulación como un nivel de esporulación por 1 cm2. Así, una reducción de esporulación por 1 cm2 de 20% comparada con un tipo silvestre se define aquí como resistencia. En los ejemplos que ilustran la presente invención, el índice de esporulación fue definido como el nivel de esporulación por lesión. Así, con el término “resistencia” se puede entender alternativamente una reducción de la esporulación por lesión del 20% en comparación con el tipo silvestre. Se prefiere esta última definición.

En realizaciones preferidas la esporulación en una prueba reducida en un 30%, más preferiblemente es una reducción de 50%, e incluso más preferida es 70%, incluso aún más preferida más de 80%, más preferida es 85% y 90%. La más preferida es una reducción de 95% o más.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención por “actividad” de una proteína Rpi-blb2 se indica, que la expresión de la proteína confiere dicha reducción en el índice de esporulación. Además, se observa, que una respuesta típica para plantas que contienen Rpi-blb2 a una infección por parte de P. infestans es la presencia de pequeñas lesiones, sin ninguna esporulación clara, al final de la estación de crecimiento. Así, en una realización, la actividad de la Rpi-blb2 está definida como la presencia de pequeñas lesiones sin ninguna esporulación clara en experimentos tal como se describen. La resistencia de la Rpi-blb2 muestra regiones necróticas que contienen un bajo nivel de esporulación. Un experimento llevado a cabo con hojas desprendidas ejemplifica la actividad de la Rpi-blb2. El experimento se describe en el ejemplo 17 y la figura 18. La diferencia entre la Rpi-blb2 y otros genes de resistencia a P. infestans es que la Rpiblb2 permite un bajo nivel de esporulación (figura 18). Un ensayo con hoja desprendida en el cual las lesiones se presentan sobre genotipo Rpi-blb2 (ARD 92-1197-16) muestra un bajo nivel de esporangia en relación con ausencia completa de esporangias sobre un genotipo que contiene el gen R2 de S. demissum. El índice de esporulación es solamente 1.1% de un fenotipo susceptible (cv. Bintje) (Tabla 7 y figura 8).

Experimentos de campo han mostrado también que la Rpi-blb2 permite un bajo nivel de infección. Los síntomas de mildiú se desarrollaron a bajo nivel durante la estación de crecimiento (figura 3, ARF87-801) o al final de la estación de crecimiento (figura 2, ARF87-601; figura 3 ARF87-507 y ARF87-601).

Así, en una realización, la actividad de la Rpi-blb2 se define adicionalmente como resultante después de la expresión en una planta en regiones necróticas que contienen un bajo nivel de esporulación en experimentos como los descritos.

Así, en una realización, el método de la presente invención produce plantas que muestran regiones necróticas que contienen un bajo nivel de esporulación o menos.

El término “referencia” se relaciona con un organismo o una parte del mismo, por ejemplo, una célula que es esencialmente idéntica tanto como sea posible en genoma, proteoma, y/o metaboloma al organismo relevante o partes del mismo, por ejemplo una célula, por ejemplo a la planta de la presente invención.

Así, el término “referencia” se relaciona por ejemplo a un organismo o a una parte del mismo, por ejemplo una célula, el cual es esencialmente idéntico genéticamente, proteómicamente y/o metabólicamente al organismo de la presente invención o a una parte del mismo pero una actividad de un producto genético específico, por ejemplo, Rpi-blb2, no puede ser observada y hay una diferencia relevante en el genoma, proteoma o metaboloma de la referencia. Así, la referencia puede ser una planta o una parte de la misma que no exprese o exprese demasiado poco de un producto genético activo relevante, por ejemplo, no codifique una Rpi-blb2 o no transcriba un gen codificador de la Rpi-blb2 o no traduzca un ARNm activo de la Rpi-blb2. Así, la referencia no provee la modificación creando un producto genético activo en una cantidad suficiente para dar como resultado un fenotipo como el descrito. Si dos plantas son genéticamente idénticas esencialmente puede probarse con ensayos conocidos para una persona experimentada en la técnica, por ejemplo, a través de análisis de huellas digitales, por ejemplo, como las descritas en Roldán-Ruíz, Theor. Appl. Genet. 2001, 1138-1150. El patrón de expresión de las proteínas puede ser probado como se describe en la técnica, por ejemplo a través de electroforesis en gel (1D, 2D, 3D), análisis espectrométrico de masas y otros métodos como los descritos por ejemplo en www.waters.com. www.proteine.org.au, www.proteomesci.com, www.sdu.dk/Nat/CPA. El metaboloma puede ser analizado por la persona experimentada tal como se describe en la técnica, por ejemplo mediante HPLC, GC, OPLC, LC-MS, GC-MS, LC-MSMS, y otros métodos según se describen por ejemplo en www.metabolic-explorer.com, www.ki.se/icsb2002/pdf/ICSB_209.pdf, www.genomics.rug.nl/technologies.htm, Fiehn et al., Nature Biotech, 18 (2000), 1157, Raamsdonk et al., Nature Biotech, 19 (2991), 45-50, Buchholz, Anal. Biochem, 295 (2001) 129-137, Soga et al., Anal Chem. 74 (2002) 2233-2239.

Con el fin de incrementar la resistencia a un patógeno el organismo de referencia o la parte del mismo es susceptible de la infección con el patógeno, por ejemplo un patógeno vegetal, por ejemplo P. infestans.

Preferiblemente, la referencia es un clon de ese organismo en el cual ha sido introducido por ejemplo un polinucleótido relevante, por ejemplo el polinucleótido de la invención o un activador, por ejemplo un activador de un producto genético relevante que media la actividad, por ejemplo de un polipéptido relevante, por ejemplo del polipéptido de la presente invención, y/o un vector que codifica el producto genético relevante correspondiente. Por ejemplo, una referencia preferida en el método de la presente invención es un organismo o una parte del mismo, que es un clon o parte del mismo, por ejemplo una célula que ha sido transfectada o transformada con el polinucleótido o vector de la invención.

Si el clon como se describe no puede ser identificado está en el estado de la técnica escindir, anular o apagar aquellos elementos que esencialmente medien la actividad relevante, por ejemplo mediando una actividad incrementada de la Rpi-blb2, por ejemplo mediando una expresión incrementada, en el organismo, por ejemplo en la planta. Es bien sabido por la persona experimentada en la técnica, como reducir o inhibir la actividad de un producto genético relevante, por ejemplo, reduciendo o inhibiendo la expresión de por ejemplo Rpi-blb2. Tal clon puede ser comparado con un organismo producido de acuerdo con el método de la presente invención, por ejemplo, un fenotipo que expresa Rpi-blb2 resistente a P. infestans.

El término “planta” tal como se utiliza aquí se refiere a todos los géneros y especies de plantas superiores e inferiores del Reino Vegetal. El término incluye las plantas maduras, semillas, brotes y plantones o sus partes derivadas, material de propagación, órganos, tejidos, protoplastos, callus y otros cultivos de plantas, por ejemplo cultivos de células, y cualquier otro tipo de célula vegetal agrupada para dar unidades funcionales o estructurales. “Planta madura” se refiere a una planta en cualquier estado de desarrollo deseado más allá del plantón. Plantón se refiere a una planta inmadura joven que está en una etapa de desarrollo temprana. “Planta” abarca todas las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas anuales y perennes. Preferidas dentro del alcance de la invención están aquellas plantas que son empleadas como materiales alimenticios o pienso, por ejemplo géneros monocotiledóneos o dicotiledóneos, en particular especies, tales como las descritas anteriormente, por ejemplo especies de cereales o miembros de la familia de la Solanaceae, respectivamente, lo más preferiblemente patata y tomate.

Como es conocido para una persona experimentada en la técnica, el método de la presente invención comprende seleccionar adicionalmente aquellas plantas en las cuales, en oposición o en comparación con la planta en referencia, existe o se incrementa la resistencia a al menos uno de dichos patógenos.

“Selección” con respecto a las plantas en las cuales – en oposición o en comparación con la planta de referencia – la resistencia a al menos un patógeno existe o es incrementada significa todos aquellos métodos que son adecuados para reconocer una resistencia existente o incrementada a patógenos. Estos pueden ser síntomas de infección patogénica pero también pueden comprender los síntomas aquí descritos que se relacionan con la calidad de la planta, la cantidad de rendimiento, la adecuabilidad para uso como material alimenticio o pienso y similares.

De acuerdo con lo anterior, en una realización del método de la presente invención la proteína Rpi-blb2 es codificada por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura del polipéptido representado en SEQ ID NO: 2 o

4.

b) moléculas de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3, o 5 o 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

c) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido derivado del polipéptido codificado por un polinucleótido de

(a) a (b) a manera de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) a (b) resultante en un homólogo de más de 85% de identidad;

d) moléculas de ácido nucleico que comprenden fragmentos biológicamente activos de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (c);

e) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) o (d) que codifica una proteína de la Rpi-blb2

o la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (e).

En una realización, el polinucleótido del método de la invención no consiste de la secuencia representada en SEQ ID NO: 7 y/o 9 y/o no consiste de la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína representada en SEQ ID NO: 8 y/o 10.

En una realización, el polinucleótido del método de la invención no consiste de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de Mi1.1 o Mi1.2 y/o de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de Mi1.1 o Mi1.2.

Así, en una realización, el polinucleótido del método de la presente invención puede no consistir de las secuencias mostradas en Rossi et al., 1998, PNAS USA 95:9750-9754, Milligan et al., 1998. Plant Cell 10:1307-1319; y/o WO 9806750. Se muestra una comparación de las secuencias de la Rpi-blb2, Mi1.1 y Mi1.2 en las figuras 15 a 17.

Por ejemplo, la región más concreta del cromosoma 6 que cosegrega con Rpi-blb2 es el brazo corto que, en el tomate, porta el marcador morfológico Mi.

De acuerdo con lo anterior, en una realización la presente invención se relaciona con el método de la presente invención, en donde la proteína Rpi-blb2 es codificada por el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, codificada por un polinucleótido mostrado en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 o un fragmento del mismo.

Sobre la base de una búsqueda BLASTX los genes con la homología más alta identificada con las secuencias de la Rpiblb2 identificadas fueron los genes y proteínas Mi1.1 y Mi1.2; véase figuras 15 a 17. Ambos genes tienen una alta identidad con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 pero no confieren resistencia al patógeno vegetal del filum oomicetes. Por lo tanto, la actividad de Mi1.1 y Mi1.2 es otra actividad diferente a la actividad del polipéptido de la presente invención. La secuencia de Mi1.1 y Mi1.2 ORF y las proteínas codificadas se muestra aquí en SEQ ID NO: 7 a 10. Adicionalmente, la solicitud EP 401764.4 se relaciona con los genes Mi. La secuencia de los genes de la técnica anterior de Mi1.1 y Mi1.2 está excluida del polinucleótido de la presente invención, en particular SEQ ID NO: 7 y 9 están excluidos. También pueden incluirse las secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido de SEQ ID NO: 8 o

10. Así, en una realización también las secuencias que codifican la proteína Mi1.1 y Mi1.2 están excluidas. Las proteínas con una homología inferior al polipéptido codificado por el polinucleótido de la presente invención son proteínas de Hero Resistance 1 y 2 (Genbank AccNo.: gi26190252 and gi26190254), proteínas de resistencia a Tospovirus A, B, C, D y E [Genbank AccNos.:gi15418709, gi15418710, gi15418712, gi15418713, gi15418714]; R1 [Genbank AccNo.: gi17432423] y Prf [Genbank AccNo.: gi8547237] cuyas secuencias o secuencias codificadas están excluidas también de las secuencias de la presente invención.

Los términos “genes”, “polinucleótidos”, “secuencia de ácidos nucleicos”, “secuencia de nucleótidos” o “molécula de ácidos nucleicos” tal como se utilizan aquí se refieren a forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula.

Así, este término incluye ADN y ARN de cadena doble y sencilla. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, metilación, sustituciones con “tapas” de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo. Preferiblemente, la secuencia de ADN de la invención comprende una secuencia de codificación que codifica el polipéptido aquí definido.

Una “secuencia de codificación” es una secuencia de nucleótidos que están escritas en ARNm y/o traducida en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Las fronteras de la secuencia de codificación son determinadas por un codón de inicio de traducción en el terminal 5´ y un codón de detención de la traducción en el terminal 3´. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes o ADN genómico, mientras que pueden estar presentes intrones también bajo ciertas circunstancias.

Por “hibridar” se entiende que tales moléculas de acido nucleico hibridan bajo condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente bajo condiciones restrictivas tales como las descritas por, por ejemplo, Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Un ejemplo de tal condición de hibridación restrictiva es hibridación a 4XSSC a 65°C, seguida por un lavado en 0.1XSSC a 65ºC durante una hora. Alternativamente, una condición de hibridación restrictiva de ejemplo es en formamida al 50%, 4XSSC a 42ºC. Adicionalmente, las condiciones durante la etapa de lavado pueden ser seleccionadas del rango de condiciones delimitadas por las condiciones de baja restricción (aproximadamente 2XSSC a 50ºC) y condiciones de alta restricción (aproximadamente 0.2XSSC a 50ºC, preferiblemente a 65ºC) (20XSSC: citrato de sodio 0.3M, NaCl 3M, pH 7.0). Además, la temperatura durante la etapa de lavado puede ser elevada desde condiciones de baja restricción a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta condiciones de restricción más alta a aproximadamente 65ºC. Tanto los parámetros de concentración de sal como de temperatura pueden ser variados simultáneamente, o más uno de los dos parámetros puede ser mantenido constante mientras que solo se varía el otro. Los desnaturalizantes, por ejemplo, formamida o SDS también pueden ser empleados durante la hibridación. En la presencia de formamida al 50%, la hibridación se efectúa preferiblemente a 42ºC. Algunos ejemplos adicionales de condiciones para hibridación y etapa de lavado se muestran aquí a continuación:

(1)

Las condiciones de hibridación pueden ser seleccionadas, por ejemplo, de las siguientes condiciones: a) 4X SSC a 65°C, b) 6X SSC a 45°C, c) 6X SSC, 100 mg/ml ADN desnaturalizado fragmentado de esperma de pescado a 68°C, d) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 mg/ml ADN desnaturalizado de esperma de pescado a 68°C, e) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 mg/ml ADN fragmentado de esperma de salmón, 50% formamida at 42°C, f) 50% formamida, 4X SSC at 42°C, g) 50% (vol/vol) formamida, 0.1 % albúmina de suero bovino, 0.1% Ficoll, 0.1 % polvinilpirrolidona, 50 mM regulador de

fosfato de sodio pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM citrato de sodio a 42°C, h) 2X o 4X SSC a 50°C (condición de baja restricción), o i) 30 a 40% formamida, 2X o 4X SSC a 42°C (condición de baja restricción).

(2)

Las etapas de lavado pueden ser seleccionadas, por ejemplo, de las siguientes condiciones:

a) 0.015 M NaCl/0.0015 M citrato de sodio/0.1% SDS a 50°C.

b) 0.1X SSC a 65°C.

c) 0.1X SSC, 0.5 % SDS a 68°C.

d) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50% formamida a 42°C.

e) 0.2X SSC, 0.1% SDS a 42°C.

f) 2X SSC a 65°C (condición de baja restricción).

En una realización de la presente invención, el polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido que hibridiza a una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No: 1 o 3 o 5 o 6 o un fragmento de los mismos; el fragmento comprende o consiste preferiblemente de 15, 20, 30, 40, 70, 100, 300, 500, 700, 1000 o más residuos de SEQ ID No. 1 o 3 o 5 o 6.

En una realización preferida, el polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de hibridación “restrictiva” por una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID No 1 o 3 o 5 o 6 o un fragmento de las mismas.

El término “bajo condiciones de hibridación restrictiva” tal como se utiliza aquí se refiere a cualquiera de las condiciones de hibridación restrictivas mencionadas aquí. En una realización adicional, el término “bajo condiciones de hibridación restrictiva” se refiere a las condiciones de hibridación mencionadas en los ejemplos o usadas en Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

En una realización preferida, el término “bajo condiciones de hibridación restrictivas” tal como se utiliza aquí se refiere a todas las condiciones de hibridación restrictivas mencionadas aquí, indicando que un polinucleótido hibrida bajo todas las condiciones restrictivas mencionadas.

La Rpi-blb2 derivada de otros organismos, puede ser codificada por otras secuencias de ADN que hibridan a las secuencias mostradas en SEQ ID NO. 1 o 3 o 5 o 6 bajo condiciones de hibridación relajadas y las cuales codifican sobre la expresión para péptidos que tienen actividad de la Rpi-blb2. Adicionalmente, algunas aplicaciones tienen que ejecutarse en condiciones de hibridación de baja restricción, sin ninguna consecuencia para la especificidad de la hibridación. Por ejemplo, un análisis por inmunoprecipitación Southern de ADN total podría ser sondeado con un polinucleótido de la presente invención y lavado con baja restricción (55ºC en 2xSSPE, 0.1% SDS). El análisis de hibridación podría revelar un patrón simple de solo genes que codifican Rpi-blb2. Un ejemplo adicional de tales

40 condiciones de hibridación de restricción baja son 4XSSC a 50ºC o hibridación con 30 o 40% de formamida a 42ºC. Tales moléculas incluyen aquellas que son fragmentos, análogos o derivados de la Rpi-blb2 de la invención y difieren, por ejemplo, en razón de eliminaciones, inserciones, sustituciones, adiciones y/o recombinaciones de aminoácidos y/o nucleótidos o cualesquiera otras modificaciones conocidas en la técnica bien sea solas o en combinación de las secuencias de aminoácidos descritos anteriormente o sus secuencias de nucleótidos subyacentes. Sin embargo, se prefiere utilizar condiciones de hibridación de alta restricción.

El término “homología” significa que las moléculas de ácido nucleico respectivas o las proteínas codificadas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las moléculas de ácido nucleico que son homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente y que son derivadas de dichas moléculas de ácido nucleico son, por ejemplo, variaciones de dichas moléculas de ácido nucleico que representan modificaciones que tienen la misma función bilógica, en particular proteínas codificadoras con la misma o sustancialmente la misma función biológica. Pueden ser variaciones de origen natural, tales como las secuencias de otras variedades o especies o mutaciones de plantas. Estas mutaciones pueden tener origen natural o pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis. Las variaciones alélicas pueden ser variantes alélicas de origen natural así como variantes sintéticas producidas o manipuladas genéticamente. Los equivalentes estructurales pueden ser, identificados, por ejemplo, probando el enlazamiento de dicho polipéptido a los anticuerpos. Un equivalente estructuralmente tiene las mismas características inmunológicas, por ejemplo comprende epítopos similares.

Los términos “fragmentos”, “fragmento de una secuencia” o “parte de una secuencia” significan una secuencia truncada de la secuencia original a la que se hace referencia. La secuencia truncada (secuencia de ácido nucleico o proteína) puede variar ampliamente en longitud; el tamaño mínimo es una secuencia de tamaño suficiente para proveer una secuencia con al menos una función y/o actividad comparable de la secuencia original a la que se hace referencia, mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente mayor que el requerido para proveer la actividad y/o funciones deseadas de la secuencia original.

Típicamente, la secuencia de aminoácidos truncada varía desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 1260 aminoácidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia tendrá máximo de aproximadamente 1000 aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de aproximadamente 500 o 100 aminoácidos. Usualmente es deseable seleccionar secuencias de al menos 10, 12 o 15 aminoácidos, hasta un máximo de aproximadamente 20 o 25 aminoácidos.

El término “epítopo” se relaciona a sitios inmunorreactivos específicos dentro de un antígeno, también conocidos como determinantes antigénicos. Estos epítopos pueden ser una disposición lineal de monómeros de composición polimérica

-

tales como aminoácidos en una proteína - o consisten de o comprenden una estructura secundaria o terciaria más compleja. Las personas experimentadas en la técnica reconocerán que todos los inmunógenos (esto es sustancias capaces de disparar una respuesta inmune) son antígenos; sin embargo, algunos antígenos tales como los haptenos, no son inmunógenos pero pueden hacerse inmunogénicos acoplándolos a una molécula portadora. El término “antígeno” incluye referencias a una sustancia para la cual puede generarse un anticuerpo y/o para la cual el anticuerpo es específicamente inmunorreactivo. En una realización la presente invención se relaciona con un epítopo de la Rpiblb2.

El término “uno o varios aminoácidos” se refiere a al menos un aminoácido pero no más del número de aminoácidos que resultaría en una homología de más de 85%, 90% o 95%, siendo preferido 96%, 97%, 98%, 99% de identidad.

Los términos “polinucleótidos” y “molécula de ácido nucleico” también se relacionan con moléculas de polinucleótidos o ácidos nucleicos “aislados”. Una molécula de ácido nucleico “aislada” es aquella que está separada de otras moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico “aislado” está libre de secuencias que flanquean de manera natural el ácido nucleico (esto es secuencias localizadas en los extremos 5´ y 3´ en el ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb o menos de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Además, los polinucleótidos de la presente invención, en particular una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, puede estar libre y sustancialmente de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

Adicionalmente, el polinucleótido de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos antes mencionados o una porción de los mismos. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1

o 3 o 5 o 6 es aquella que es suficientemente complementaria a una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 de tal forma que puede hibridar a una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, formando por lo tanto un dúplex estable.

El polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90% o 95%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, o una porción de las mismas. El polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida, preferiblemente hibrida bajo condiciones restrictivas como se define aquí, a una de las secuencias de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, o una porción de las mismas.

Además, el polinucleótido de la divulgación puede comprender solamente una porción de la región codificadora de una de las secuencias de SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, por ejemplo un fragmento que puede ser utilizado como sonda o cebador de un fragmento que codifica una porción bilógicamente activa del gen que codifica la proteína Rpi-blb2. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación del presente gen que codifica la proteína Rpi-blb2 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de sus homólogos en otros tipos de células y organismos. La sonda/cebador comprende típicamente oligonucleótidos sustancialmente purificados. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótido que hibrida bajo condiciones restrictivas a al menos 12, 15, preferiblemente aproximadamente 20 a 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50, 75 nucleótidos consecutivos de una cadena en sentido de una de las secuencias definidas, por ejemplo, en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, una secuencia antisentido de una de las secuencias, por ejemplo, definidas en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, o mutantes de origen natural de las mismas. Los cebadores basados en un nucleótido de la invención pueden ser utilizados en reacciones de PCR para clonar homólogos de la Rpi-blb2, por ejemplo, como los cebadores descritos en los ejemplos de la presente invención, por ejemplo, como se muestra en tab 3a o 3b, preferiblemente se usan los cebadores ARF1 F y ARF1 R. Un PCR con los cebadores univ24R y univ14L darán como resultado un fragmento de la Rpi-blb2 que puede ser utilizado tal como se describe aquí. Dichos conjuntos de cebadores son intercambiables. La persona experimentada en la técnica sabe combinar dichos cebadores para dar como resultado el producto deseado, por ejemplo, en un clon de longitud completa o una secuencia parcial. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de la Rpi-blb2 pueden ser utilizadas para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas u homólogas. La sonda puede comprender adicionalmente un grupo etiqueta unido a las mismas, por ejemplo, el grupo etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden ser utilizadas como parte de kit de prueba de un marcador genético para identificar células que expresen una Rpi-blb2, por ejemplo midiendo un nivel de una molécula de ácido nucleico que codifica Rpi-blb2 en una muestra de células, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de la Rpi-blb2 o determinando si un gen de la Rpi-blb2 genómico ha sido mutado o eliminado.

El polinucleótido de la divulgación codifica un polipéptido o porción del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4 de tal forma que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad de participar en la resistencia a los patógenos, en particular la actividad de la proteína Rpi-blb2 como se describe en los ejemplos en plantas. Tal como se utiliza aquí, la expresión “suficientemente homóloga” se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen un número mínimo de ácidos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar que un residuo de aminoácidos en una de las secuencia del polipéptido de la presente invención) a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4 de tal forma que la proteína

o porción de la misma es capaz de participar en la resistencia de plantas a dichos patógenos. Ejemplos de la actividad de la proteína Rpi-blb2 se describen aquí. Así, la función de la proteína Rpi-blb2 contribuye bien sea directa o indirectamente a la resistencia a patógenos de plantas, preferiblemente a los patógenos mencionados aquí, siendo más preferido el P. infestans.

La proteína es aproximadamente 90%, 95% y preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 2 o 4.

Porciones de proteínas codificadas por el polinucleótido de la divulgación son preferiblemente activas biológicamente. Tal como se menciona aquí el término “porción biológicamente activa” pretende incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, que confiere resistencia a un patógeno vegetal oomiceto y/o Bemisia tabaci y/o áfidos o tiene una actividad inmunológica tal que se enlazan a un anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína Rpi-blb2 o tiene una actividad como la definida en los ejemplos o como se describe aquí.

Los fragmentos de ácidos nucleicos adicionales que codifican porciones biológicamente activas del polipéptido de la presente divulgación pueden ser preparados aislando una porción de una de las secuencias en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, que expresan la porción codificada de la proteína o péptido Rpi-blb2 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y estableciendo la actividad de la porción codificada de la proteína.

La divulgación abarca adicionalmente polinucleótidos que difieren de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 (y porciones de las mismas) debido a la degeneración del código genético y codifican así un polipéptido Rpi-blb2 como el codificado por las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 2 o 4. Adicionalmente el polinucleótido de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 2 o 4. El polinucleótido de la divulgación codifica una proteína de longitud completa la cual es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4.

Además, será evidente para las personas experimentadas en la técnica que los polimorfismos en la secuencia de ADN que llevan a cambios en las secuencias de aminoácidos pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población de S. bulbocastanum). Tal polimorfismo genético en el gen Rpi-blb2 puede existir entre individuos con una población debido a variaciones naturales. Tal como se utilizan aquí, los términos “gen” y “gen recombinante” se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica a una Rpi-blb2, preferiblemente una Rpi-blb2 de S. bulbocastanum. Tales variaciones naturales pueden dar como resultado típicamente una varianza de 1-5% en la secuencia de nucleótidos del gen de la Rpi-blb2. Cualquiera y todas de tales variaciones de nucleótidos y los polimorfismos en aminoácidos resultantes en la Rpi-blb2 que son el resultado de la variación natural y no alteran la actividad funcional de la Rpi-blb2 se entienden dentro del alcance de la invención.

Los polinucleótidos correspondientes a variantes naturales de homólogos diferentes de S. bulbocastanum del ADNc de la Rpi-blb2 de la divulgación pueden ser aislados con base en su homología con los polinucleótidos de la Rpi-blb2 de S. bulbocastanum divulgados aquí utilizando el polinucleótido de la divulgación o una porción del mismo, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar bajo condiciones de hibridación restrictivas. De acuerdo con lo anterior, en otra realización, un polinucleótido de la divulgación tiene al menos 20 nucleótidos de longitud. Preferiblemente hibrida bajo condiciones restrictivas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos del nucleótido de la presente divulgación, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6. En otras realizaciones el ácido nucleico tiene al menos 20, 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud. El término “hibridado bajo condiciones restrictivas” se define anteriormente y pretende describir condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos al menos 65% idéntica unas a otra permanecen típicamente hibridadas a cada una de las otras. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 75% u 80%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% o más idénticas una a otra típicamente permanecen hibridadas una a otra. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente divulgación que hibrida bajo condiciones restrictivas a una secuencia de SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural.

Tal como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico “de origen natural” se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se presentan en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). Preferiblemente, el polinucleótido codifica una Rpi-blb2 de S. bulbocastanum natural.

Además de las variantes de origen natural de la secuencia de la Rpi-blb2 que pueden existir en la población, la persona experimentada apreciará que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de la Rpi-blb2 que codifica al polinucleótido, llevando por lo tanto a cambios en las secuencia de aminoácidos de la Rpi-blb2 codificada, sin alterar la capacidad funcional de la Rpi-blb2. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos que llevan a sustituciones en aminoácidos en residuos de aminoácidos “no esenciales” pueden hacerse en una secuencia del polinucleótido que codifica la Rpi-blb2, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6. Un residuo de aminoácido “no esencial” es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia tipo silvestre de la proteína de la Rpi-blb2 sin alterar actividad de dicha proteína de la Rpi-blb2, mientras que un residuo de aminoácido “esencial” es requerido para la actividad de la proteína Rpi-blb2. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo, (por ejemplo aquellos que no son conservados o solamente son semiconservados en el dominio que tiene actividad de la Rpi-blb2) pueden no ser esenciales para la actividad y así probablemente son susceptibles de alteración sin alterar la actividad de la Rpi-blb2.

De acuerdo con lo anterior, una persona experimentada en la técnica sabe que el uso de codón entre organismos puede diferir. Por lo tanto, adaptará el uso de codón en el polinucleótido de la presente invención al uso del organismo en el cual se expresan el polinucleótido o el polipéptido.

De acuerdo con lo anterior, la divulgación se relaciona con polinucleótidos que codifican Rpi-blb2 que contiene cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de la Rpi-blb2. Tales Rpi-blb2 difieren en secuencias de aminoácidos a partir de una secuencia contenida en SEQ ID NO: 2 o 4 que aún retiene la actividad de la Rpi-blb2 descrita aquí. El polinucleótido puede comprender una secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4 y es capaz de participar en la resistencia a un patógeno vegetal. Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos 90%, 95% homóloga a la secuencia en SEQ ID NO: 2

o 4, y preferiblemente al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia en SEQ ID NO: 2 o 4.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una de las secuencias de SEQ ID NO: 2 o 4 y una forma mutante de la misma) o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse brechas en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para un alineamiento óptico con la otra proteína o ácido nucleico). Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan entonces. Cuando una posición o una secuencia (por ejemplo una de las secuencias de SEQ ID NO: 2 o 4) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de las secuencias seleccionadas), las moléculas entonces son homólogas en esa posición (esto es, tal como se utiliza aquí la “homología” de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a la “identidad” en aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, % de homología = números de posiciones idénticas / número total de posiciones x 100).

La homología puede ser calculada por comparación con ayuda del programa de algoritmo GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et seq.), fijando los siguientes parámetros:

Peso de brecha 50 Pesos de longitud 3

Coincidencia promedio: 10 No coincidencia promedio: 0

Por ejemplo, una secuencia que tiene al menos 80% de homología con la secuencia SEQ ID NO: 1 a nivel de ácido nucleico se entiende con el significado de una secuencia que, por comparación con la secuencia SEQ ID NO: 1 con el algoritmo de programa anterior con el parámetro anteriormente fijado, mantiene al menos 80% de homología.

La homología entre dos polipéptidos se entiende con el significado de que la identidad de la secuencia de aminoácidos calculándose cada caso la longitud de la secuencia completa por comparación con ayuda del programa de algoritmo GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) Madison, USA), fijando los siguientes parámetros:

Peso de brecha 8 Peso de longitud 2

Coincidencia promedio: 2.912 No coincidencia promedio: -2.003:

Por ejemplo una secuencia que tiene menos de 80% de homología con la secuencia SEQ ID NO. 2 a nivel de proteína se entiende con el significado de una secuencia que, en comparación con una secuencia de SEQ ID NO: 2 mediante por algoritmo del programa anterior con el parámetro anterior fijado, tiene menos 80% de homología.

En la presente solicitud, la homología se determino con el programa clustalW el cual puede ser encontrado en www.ebi.ac.uk/tools, análisis de secuencia de selección y la opción de selección clustalW (alineamiento de secuencias múltiples). Todas las opciones fueron ejecutadas bajo condiciones estándar como sigue:

alignment: full; output format aln w/numbers; output order: aligned; color alignment: no; ktup (word size): def; window length: def; score type: percent; topdlag: def; pairgap: def; matrix: def; gap open: def; end gaps: def; gap extension: def; gap distances: def; cpu mode: single; tree graph/ type: cladogram; tree graph / distances: hide; philoogenetic tree/tree type: none; philoogenetic tree/correct dist.: off; philoogenetic tree/ ignore gaps: off. Por lo tanto se prefiere un cálculo de homología de acuerdo con clustalW.

Los equivalentes funcionales derivados de uno de los polipéptidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 o 4 de acuerdo con la invención por sustitución, inserción o eliminación tienen al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, especialmente de manera preferible al menos 98% de homología con uno de los polipéptidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 o 4 de acuerdo con la invención y se distinguen esencialmente por las mismas propiedades que el polipéptido como se muestra en SEQ ID NO: 2 o 4.

Los equivalentes funcionales derivados de la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5

o 6 de acuerdo con la invención por sustitución, inserción o eliminación tienen al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, especialmente de manera preferible al menos 98% de homología con uno de los polipéptidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 o 4 de acuerdo con la invención y codifican polipéptidos que tienen esencialmente las mismas propiedades que el polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 2 o 4.

“Esencialmente las mismas propiedades” de un equivalente funcional se entiende en lo anterior con el significado de conferir un fenotipo resistente a patógenos o que confiere o incrementa la resistencia a al menos un patógeno a la vez que incrementa la cantidad de proteína, actividad o función de dicho equivalente de Rpì-blb2 funcional en una planta o en un tejido, parte o células de la misma. La esporulación y el fenotipo de la lesión después de la infección en combinación con dicho incremento de dicha cantidad de proteína, actividad o función del equivalente funcional se entiende adicionalmente como una propiedad esencial.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un homólogo de la Rpi-blb2 a una secuencia de proteína de SEQ ID NO: 2

o 4 puede ser creada introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido de la presente divulgación, en particular de SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 de tal forma que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en las secuencias de por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una “sustitución de aminoácidos conservadora” es una en la cual el residuo de aminoácidos es reemplazado con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una Rpi-blb2 es reemplazado preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o una parte de una secuencia de codificación de la Rpi-blb2, tal como por una mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados para una actividad de la Rpi-blb2 descrita aquí para identificar mutantes que retienen la actividad de la Rpi-blb2. Después de la mutagénesis de una de las secuencias de SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, la proteína codificada puede ser expresada en forma recombinante y la actividad de la proteína puede determinarse utilizando, por ejemplo, ensayos descritos aquí (véase Ejemplos).

En una realización, en el método de la presente invención se incrementa la actividad de la proteína Rpi-blb2 y de una proteína de resistencia adicional.

Se espera que bajo las condiciones de campo la presencia de más de un gen de resistencia sea benéfica, en particular genes que confieren resistencia al mismo patógeno. En caso de un aislado patogénico, por ejemplo, una raza de P. infestans, está presente que es capaz de superar la resistencia de uno de los genes R, el otro o más genes R es/son aún funcionales haciendo posible infectar la planta. La presencia de dos genes R no controlados reduce fuertemente la oportunidad de que un patógeno, en particular una raza de P. infestans, sea capaz de mutar en una raza que supere dos o más genes R.

En lo que sigue “polipéptido de resistencia” o “proteína de resistencia” se refieren a un polipéptido que (incrementado) conferirá resistencia a un genotipo susceptible (“tipo silvestre” o “referencia”). De acuerdo con lo anterior la Rpi-blb2 es una proteína de resistencia así como por ejemplo Rpi-blb2 (o RB o Sbu 1). Una “proteína de resistencia adicional” se refiere a otra proteína de resistencia diferente de la proteína de la presente divulgación en donde el término “proteína de resistencia” comprende el polipéptido de la presente divulgación así como una o más proteínas de resistencia adicional. Se entiende adicionalmente, que el término “y una proteína de resistencia adicional” se relaciona con una o más proteínas de resistencia adicional. Así, la actividad de una o más proteínas de resistencia puede incrementarse. Las proteínas de resistencia adicional se describen más adelante. Sin embargo, en general cualquier otra proteína de resistencia conocida puede ser coexpresada por el polipéptido de la presente divulgación o su actividad puede ser incrementada por cualquiera de los métodos descritos aquí para Rpi-blb2.

En una realización preferida, la proteína de resistencia adicional comprende un dominio LLR y un bucle P.

La caracterización de clonación y molecular de más de 30 genes (R) de resistencia a enfermedades en plantas que confieren resistencia a bacterias, hongos, oomicetos, virus, nematodos o insectos ha permitido su clasificación en clases estructurales independientemente de la especificidad patogénica (revisados en Dangl and Jones, 2001). La clase más abundante de genes R caracterizados, que comprende aproximadamente 0.5 % de los genes predichos en el genoma de Arabidopsis, está predicho para codificar proteínas intracelulares que portan dominios y motivos de repetición ricos en leucina (LRR) y sitios de enlazamiento de nucleótidos (NBS), también encontrados en otras proteínas de receptores y de transducción de señales. Las proteínas R NBS-LRR difieren primariamente en el terminal N que exhibe similitud de secuencia a la proteína de Drosophila Toll y el dominio de receptor de interleucina 1 de mamíferos (TIR-NBS-LRR), o codifica para una estructura de espiral espiralada (CC-NBS-LRR), algunas veces en la forma de una cremallera de leucina (LZ-NBS-LRR). Aunque pueden estar asociados a la membrana, las proteínas NBS-LRR están predichas para ser citoplásmicas. En contraste, se predicen otras dos clases de proteínas R que portan LRR para barrer la membrana celular, con un dominio extracelular LRR: las proteínas de transmembrana LRR (LRR-TM) Cf y la proteína LRR-TM-quinasa Xa21. Las proteínas R caracterizadas que carecen de LRR son el gen Pto de tomate, el gen Hs1pro-1 de la remolacha, el gen mlo de la cebada, los genes Rpw8 de Arabidopsis y el gen Rpg1 de cebada.

De acuerdo con la hipótesis de gen-a-gen, la resistencia a la enfermedad sigue a la percepción de las proteínas R de las plantas de moléculas efectoras del patógeno con función antivirulencia (Avr), iniciando por lo tanto a través de algún tipo de complejo de reconocimiento disparador, las rutas de transducción de señales que llevan a una respuesta hipersensible (HR). En común con otros sectores se considera generalmente que las proteínas R NBS-LRR tienen una estructura modular con dominios de reconocimiento y señalización separados, con lo cual la LRR es el dominio de reconocimiento candidato y la región N terminal incluyendo el NBS, el dominio de señalización principal. El análisis funcional de las proteínas R recombinantes indica que el reconocimiento de la especificidad reside en efecto en la LRR. Además, la LRR es la región más variable en proteínas NBS-LRR cercanamente relacionadas y está bajo selección para divergir. Sin embargo, se está acumulando evidencia acerca de que las LRR también contribuyen a la señalización a través de regulación negativa que involucra interacciones intramoleculares putativas. En consecuencia, se han clonado cinco genes R de patata, incluyendo dos genes R que confieren resistencia al mildiú, pertenecientes todos a la clase CC/LZ-NBS-LRR de los genes R vegetales. Mientras que el gen R1 derivado de S. demissum confiere resistencia específica a la raza al mildiú, el gen Rpi-blb (o RB o Sbu 1) derivado de S. bulbocastanum recientemente clonado, confiere resistencia completa a un rango de aislados de P. infestans que portan múltiples factores de virulencia y especificidad a la raza, y no ha sido demostrado todavía. Adicionalmente, como se describió anteriormente, las plantas de progenie de híbridos somáticos que contienen Rpi-blb no fueron afectados por mildiú en experimentos de campo en México, donde se encuentra casi cada raza del hongo. A través de la complementación del fenotipo susceptible en patata y tomates cultivados se demostró el potencial de la transferencia interespecífica de resistencia de amplio espectro a mildiú para solanáceas cultivadas a partir de especies anfitrionas sexualmente incompatibles por transformación con genes R clonados individuales. La US 6,127,607 describe proteínas de resistencia con dominios LRR y bucles P. El contenido de la US 6,127,607 se incorpora aquí como referencia. En particular, las columnas 6 y 8 y la columna 11 describen dominios de LRR y bucles P. Adicionalmente, Song, 2003, PNAS 100 (16), 9128-9133 muestra una comparación de motivos de LRR de la Rpi-blb en la figura 4 y da en la páginas 9132 una revisión acerca de los dominios LRR. Los dominios del polipéptido de la presente invención se muestran en la figura 14 así como en la figura

15.

Preferiblemente la actividad de una o más proteínas de resistencia seleccionada del grupo consistente de todas Rpi-blb (sinónimo RB o Sbu1), Rpi-ABPT1, Rpi-blb3, Rpi-mcd, R1, R-ber (sinónimo R12), Rpi1, R2, R3a, R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, Ph-1, Ph-2 and Ph-3 se incrementa. Se prefiere que además de la actividad de la Rpi-blb2 se incremente también al menos la de la Rpi-blb.

En una realización de la presente invención, la expresión de, por ejemplo, proteína de la Rpi-blb2 transgénica se incremente y se incremente además la expresión del gen de resistencia transgénico. La proteína de resistencia coexpresada con la Rpi-blb2 (o RB o Sbu 1) es preferiblemente una de las proteínas de resistencia mencionadas aquí, en particular Rpi-blb, Rpi-ABPT1, Rpi-blb3, R1, Rpi1, R-ber, Rpi-mcd, R2, R3a, R3b, R6, R7, Ph-1, Ph-2 o Ph-3 pero también puede ser una de las otras proteínas que confieren resistencia a patógenos de plantas conocidas por una persona experimentada en la técnica.

Como se mencionó, el término “expresión incrementada” de acuerdo con esta invención también incluye una expresión de novo de un polinucleótido o polipéptido.

Lo más preferido es un incremento de la resistencia a través de la coexpresión del polipéptido de la presente invención junto con Rpi-blb. Rpi-blb y Rpi-blb2 proveen resistencia completa en ensayos en hojas desprendidas a aislados de P. infestans tal como se describe en los ejemplos, y en Song 2003, PNAS 100 (16), 9128.

Dichos genes que confieren resistencia están descritos por ejemplo en

RB o Sbu1 (sinónimo de la Rpi-blb): AY336128 [gi: 32693280], (Song et al. 2003). clones BAC 177 013 y CB3A14 que comprende el gen Rpi-blb que ha sido depositado en GenBank con números de acceso AY303171 y AY303170.

R1: AF447489 [gi: 9117432422], (Ballvora et al., 2002)

Rpi1: Kuhl, J.C., Hanneman, R.E., and Havey, M.J., (2201) Characterization and mapping of Rpi1, a late blight resistance locus from diploid (1 EBN) Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265: 977-985.

R-ber: Ewing, E.E., Simko, I., Smart, C.D., Bonierbale, M.W., Mizubuti, E.S.G., May, G.D., and Fry, W.E., (2000) Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Molecular breeding 6:25-36.

R2: Li, X., vanEck, H.J., vanderVoort, J.N.A.M., Huigen, D.J., Stam, P., and Jacobsen, E. (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121-112.

R3, R6, R7: Elkharbotly, A., Palominosanchez, C., Salamini, F., Jacobsen, E., and Gebhardt, C. (1996) R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theoretical and Applied.Genetics 92 (7): 880-884.

Ph-1: Bonde and Murphy (1952) Main Agric. Exp. Stn. Bull. No 497

Ph-2: Moreau, P., Thoquet, P., Olivier, J., Laterrot, H., and Grimsley, N.H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4): 259

269.

Ph-3: Chunwongse, J., Chunwongse, C., Black, L., and Hanson, P. (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77 (3): 281-286.

Rpi-blb3, Rpi-ABPT1 and Rpi-mcd: Park, T.H., Van der Vossen, E., Vleeshouwers, V.G.A.A., Tan, A., Visser, R.G.F. and Van Eck, H.J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD pro-ject. Crop Functional Genomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, page 93.

R3a and R3b: Huang, S., Vleeshouwers, V.G.A.A., Werij, J.S., Hutten, R.C.B., Van Eck, H.J., Visser, R.G.F, and Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI 17 (4), 428-435.

En una realización, la actividad de la Rpi-blb2 incrementada de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, la expresión del polinucleótido de la invención se incrementa y la expresión de al menos una molécula de ácido nucleico se incrementa codificando Rpi-blb, Rpi-ABPT1, Rpi-blb3, Rpi-mcd R1, R-ber, Rpi1, R2, R3a, R3b, R6, R7, Ph-1, Ph-2 y/o Ph-3 con lo cual la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo consistente de:

a) una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una forma madura de al menos

un polipéptido Rpi-blb (o RB- o Sbu1-), preferiblemente tal como es codificado por la secuencia mostrada en GenBank Accession no.: AY336128 [gi: 32693280];

un polipéptido R1, preferiblemente como el codificado por la secuencia mostrada en GenBank Accession no.: AF447489 [gi9117432422];

un polipéptido Rpi-blb3, Rpi-ABPT1 y/o Rpi-mcd, codificado preferiblemente por la secuencia mostrada en o derivada por la información dada en Park, T.H., Van der Vossen, E., Vleeshouwers, V.G.A.A., Tan, A., Visser, R.G.F. and Van Eck, H.J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD pro-ject. Crop Functional Genomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, page 93;

un polipéptido R3a y/o R3b, codificado preferiblemente por la secuencia mostrada en o derivada a partir de la información dada en Huang, S., Vleeshouwers, V.G.A.A., Werij, J.S., Hutten, R.C.B., Van Eck, H.J., Visser, R.G.F, and Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI 17 (4), 428-435 y/o

una proteína que confiere resistencia a un patógeno, preferiblemente P. infestans, material caracterizado como se describe, por ejemplo, para Rpi1 en Kuhl, J.C., Hanneman, R.E., and Havey, M.J., (2001) Characterization and mapping of Rpi1, a late blight resistance locus from diploid (1 EBN) Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics

265: 977-985; for R-ber in Ewing, E.E., Simko, I., Smart, C.D., Bonierbale, M.W., Mizubuti, E.S.G., May, G.D., and Fry, W.E., (2000) Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Molecular breeding 6:25-36;

para R2 en Li, X., vanEck, H.J., vanderVoort, J.N.A.M., Huigen, D.J., Stam, P., and Jacobsen, E. (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121-1128;

para R3, R6, R7 en Elkharbotly, A., Palominosanchez, C., Salamini, F., Jacobsen, E., and Gebhardt, C. (1996) R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theoretical and Applied.Genetics 92 (7): 880-884;

para Ph-1 en Bonde and Murphy (1952) Main Agric. Exp. Stn. Bull. No 497; o

para Ph-2 in Moreau, P., Thoquet, P., Olivier, J., Laterrot, H., and Grimsley, N.H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4): 259-269; y/o

para Ph-3 in Chunwongse, J., Chunwongse, C., Black, L., and Hanson, P. (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77 (3): 281-286;

o un polipéptido que confiere resistencia a un patógeno, preferiblemente un polipéptido que confiere resistencia a P. infestans derivable de dichas publicaciones;

b) molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos está degenerada como resultado del código genético en una secuencia de nucleótidos de (a);

c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por un polinucleótido

(a) o (b) a manera de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el polinucleótido de (a) o (b);

d) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia tiene una identidad del 70% o más con la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a);

e) moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento o una porción portadora de epítopo de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (b);

f) molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento que comienza con aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 500 o 1000, y que se detiene con aminoácido 1267, 1000, 500, 300, 200, 50, 30 o 1 de un polipéptido codificado por uno cualquiera de (a) a (e) y con una de dichas actividades;

g) molécula de ácido nucleico que comprende al menos 20 nucleótidos de un polinucleótido de cualquiera de (a) o (b);

h) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es reconocido por un anticuerpo monoclonal que ha sido elevado contra un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de uno de cualquiera (a) a (f);

i) molécula de ácido nucleico obtenible por selección de una biblioteca apropiada bajo condiciones restrictivas con una sonda que tiene la secuencia de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (h) o de un fragmento de la misma de al menos 20, preferiblemente 30 o más nucleótidos; y

j) molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) o (i);

o la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (j).

De acuerdo con lo anterior, el método de la presente invención confiere resistencia a una de dichas plantas, tejido vegetal o célula vegetal de la presente invención, a un patógeno vegetal del filum oomicetes, preferiblemente a un patógeno del orden Pythiales o Peronosperales, más preferiblemente de la familia Pythiaceae o Peronosporaceae, más preferible el género Phytophthora o Bremia o Peronospera o Plasmopara, lo más preferido en donde patógenos de la especie Phytophthora parasítica variedad nicotianae (que produce, entre otras cosas la pierna negra en el tabaco), Phytophthora sojae (que produce la roya en la raíz de Phytophthora en soja), Phytophthora capsici (que produce daños en pimienta y cucúrbitas y tomates), Phytophthora erythroseptica (que produce la roya rosa en la patata), Plasmopara viticola (que produce el mildiú inferior en vides), Bremia lactuca (que produce el mildiú bajo en lechuga) o Peronospora tabaci (que produce el moho azul en el tabaco).

La actividad de la Rpi-blb2 en una planta, célula vegetal, un tejido vegetal, un órgano de una planta o parte de los mismos de acuerdo con la presente invención puede incrementarse, generarse o estimularse a través de métodos que son bien conocidos para una persona experimentada en la técnica y están descritos por ejemplo en Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989.

Así, en una realización preferida, la presente invención se relaciona con el método de la invención, en donde la expresión es una expresión de novo.

El término “expresión de novo” en una célula, un tejido o en un organismo o en una parte de los mismos se entiende aquí como relacionado con la expresión de un producto genético después de una no detectabilidad previa de dicho producto genético o una actividad de dicho producto genético, en particular de un polipéptido o polinucleótido correspondiente en una célula, un tejido o en un organismo o en una parte de los mismos. Se prefiere que el gen que codifica un polipéptido o un polinucleótido en una célula, un tejido o en un organismo o en partes del mismo y que debería ser expresado de novo no está presente en el genoma, en una célula, en un tejido, o en un organismo o en parte de los mismos. Si la expresión de un producto genético no puede ser detectada en una célula, en un tejido o en un organismo o partes de los mismos, se asume en general que no hay expresión en una célula, un tejido o en un organismo o en partes de los mismos. De acuerdo con lo anterior, si la actividad no puede ser detectada, se asume en general que no existe actividad correspondiente. Una persona experimentada en la técnica, sin embargo, sabe que los métodos y medios de detección desarrollan la sensibilidad más alta. Así, en una realización preferida, el término “expresión de novo” se relaciona con una expresión novedosa o adicional en los sistemas, en donde el nivel de actividad, por ejemplo debido a un nivel de expresión bajo o la expresión de un producto genético inactivo (o casi) es demasiado bajo para conferir cualquier resistencia a un patógeno vegetal, en particular a P. infestans. Una comparación de una cepa de anulación y un fenotipo de cepa de expresión baja y/o alta puede demostrar, si es observable cualquier diferencia en resistencia a cualquiera de los patógenos aquí mencionados.

De acuerdo con lo anterior, en otra realización de la presente invención, se incrementa la actividad endógena de una proteína de la Rpi-blb2 y/o de resistencia adicional .

El nivel de expresión en una célula puede ser incrementado por métodos conocidos por una persona experimentada en la técnica. Se describen aquí varias técnicas, por ejemplo, la expresión transgénica del polinucleótido o polipéptido de la presente invención. El polinucleótido o polipéptido puede ser de origen foráneo. Se prefiere que se introduzca un polinucleótido de la misma célula, célula vegetal, tejido vegetal o planta anfitrionas.

La actividad, en particular una actividad endógena pero también la actividad de una Rpi-blb2 expresada transgénica puede ser incrementada por varios métodos. De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida, la actividad de las proteínas de resistencia descritas aquí se incrementa mediante una o más de las siguientes etapas

a) estabilización de la proteína de resistencia;

b) estabilización de la proteína de resistencia que codifica ARNm;

c) incremento de la actividad específica de la proteína de resistencia;

d) expresión o incremento de la expresión de un factor de transcripción homólogo o artificial para expresión de la resistencia;

e) estimulación de la actividad de la proteína de resistencia a través de la inducción de factores exógenos;

f) expresión de un gen de resistencia transgénica; y/o

g) incremento del número de copias del gen que codifica la resistencia.

En general una actividad en un organismo, en particular en una célula vegetal, una planta o un tejido vegetal puede incrementarse incrementando la cantidad de la proteína específica, esto es, la proteína de resistencia, en dicho organismo. “Cantidad de proteína” se mide con el significado de la cantidad de un polipéptido preferiblemente la Rpiblb2, en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento de célula. “Incremento” de la cantidad de proteína significa el incremento cuantitativo de la cantidad de una proteína en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento de la célula – por ejemplo por uno de los métodos descritos aquí a continuación - en comparación con el tipo silvestre del mismo género y especie, al cual este método no ha sido aplicado, bajo condiciones de otra forma idénticas (tales como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de la planta y similares). El incremento se eleva a al menos 10%, preferiblemente al menos 20% o al menos 50%, preferiblemente a al menos 70% o 90%, muy especialmente de manera preferible al menos 100%, lo más preferiblemente al menos 200% o más.

“Incremento” de la actividad se entiende con el significado del incremento de la actividad total de una proteína en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento de una célula en comparación con el tipo silvestre del mismo género y especie, al cual este método no ha sido aplicado, de otra forma bajo condiciones idénticas (tales como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de la planta y similares). El incremento se eleva a al menos 10%, preferiblemente a al menos 20%, al menos 50%, especialmente de manera preferible al menos 70% o 90%, muy especialmente de manera preferible al menos 100%, lo más preferiblemente al menos 200% o más.

En este contexto, la eficacia de la resistencia al patógeno puede desviarse bien hacia abajo o hacia arriba en comparación con un valor obtenido cuando se incrementa una de las proteínas Rpi-blb2 como se muestra en SEQ ID NO: 2 o 4. Equivalentes funcionales preferidos son aquellos en los cuales la eficacia de la resistencia al patógeno – medida, por ejemplo, por la eficacia en penetración de un patógeno o como se describe aquí - difiere por no más de 50%, preferiblemente 25%, especialmente de manera preferible 10% de un valor comparativo obtenido reduciendo una proteína Rpi-blb2 como la mostrada en SEQ ID NO: 2 o 4. Especialmente preferidas son aquellas secuencias en donde el incremento aumenta la eficacia de la resistencia al patógeno cuantitativamente en más de 50%, preferiblemente 100%, especialmente preferible 500%, muy especialmente preferible 1000% con base en un valor comparativo obtenido reduciendo una de las proteínas Rpi-blb2 como las mostradas en la SEQ ID NO: 2 o 4.

Cualquier comparación se lleva a cabo preferiblemente bajo condiciones análogas. “Condiciones análogas” significa que todas las condiciones tales como por ejemplo, cultivo o condiciones de crecimiento, condiciones de ensayo (tales como regulador, temperatura, sustratos, concentración de patógeno y similares) se mantienen idénticas entre los experimentos que se van a comparar y que los parámetros difieren solamente por la secuencia de los polipéptidos de Rip-blb2 que se van a comparar, su organismo de origen y, si es apropiado, el patógeno. Cuando se escoge el patógeno, cada comparación requiere que el patógeno sea escogido de tal forma que sea el más similar al otro equivalente, teniendo en consideración la especificidad de la especie.

Debido a la actividad de la Rpi-blb2 incrementada, se incrementa la resistencia de una planta o parte de la misma. En una realización preferida, el método de la presente invención da como resultado una reducción en el índice de esporulación de al menos 30% después de la infección con P. infestans, en comparación con un tipo silvestre, más preferida es una reducción de 50%, aún más preferidas 70% incluso aún más preferida más del 80%, más preferida de 85% y 95%. La más preferida es 95% o más.

El polinucleótido de la presente divulgación es derivado o aislado a partir del genoma de un organismo seleccionado del grupo consistente de Menyanthaceae, Solanaceae, Sclerophiloacaceae, Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Polemoniaceae, e Hydrophilolaceae de acuerdo con el Systema Naturae 2000, Brands, S.J., Amsterdam o tiene su origen en las mismas, más preferiblemente se selecciona el grupo consistente de Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Fabiana, Franciscea, Hyoscyamus, Lycium, Mandragora, Nicandra, Nicotiana, Petunia, Physalis, Schizanthus y Solanum de acuerdo con el Systema Naturae 2000, Brands, S.J., Amsterdam o tiene su origen en las mismas, siendo más preferida una selección del grupo consistente de la familia Solanaceae, preferiblemente S. bulbocastanum, patata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum), petunia, tomate de árbol (S. betaceum), melón pera (S. muricatum) y berenjena (S. melongena). Aún más preferidos son tomate

o patata o S. bulbocastanum como fuente del polinucleótido de la presente divulgación. El más preferido es el S. bulbocastanum como fuente.

La Rpi-blb2 ha sido aislada de material de S. tuberosum derivado de ABPT. Así, desde la perspectiva taxonómica la Rpi-blb2 descrita es también derivada de S. tuberosum. Sin embargo, el gen estaba presente en un fragmento de introgresión presumiblemente derivado de S. bulbocastanum. Un gran número de variedades de S. tuberosum contiene fragmentos de introgresión de especies de Solanum relacionadas, pero aún son S. tuberosum. Por lo tanto, el S. tuberosum puede también ser de acuerdo con el sistema taxonómico una fuente para el polinucleótido de la presente divulgación, en particular S. tuberosum derivado de ABPT, así como otras variedades de otras variedades de especies de Solanum derivadas de manera similar.

De acuerdo con lo anterior, el polinucleótido de la presente divulgación se deriva de S. tuberosum.

Un polinucleótido de la presente divulgación, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6, o una porción de las mismas puede aislarse utilizando técnicas estándar de bilogía molecular y la información de secuencia provista aquí. Por ejemplo el ADNc de la Rpi-blb2 puede ser aislado a partir de una biblioteca utilizando toda o una porción de una de las secuencia de los polinucleótidos de la presente divulgación como sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (por ejemplo, como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, un polinucleótido que abarca toda o una porción de una de las secuencias del polinucleótido de la presente divulgación puede ser aislado por las reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos diseñados con base en esta secuencia (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de una de las secuencias de polinucleótidos de la presente invención). Por ejemplo, el ARNm puede ser aislado a partir de células, por ejemplo, de S. bulbocastanum u otra planta (por ejemplo, por el procedimiento de extracción con guanidinio-tiocianato de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse el ADNc utilizando transcriptasa reversa (por ejemplo transcriptasa reversa Molone MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa reversa AMV, disponible de Seikagaku América, Inc., San Petersburgo, FL). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación por reacción en cadena de polimerasa pueden diseñarse con base en una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6. Un polinucleótido de la divulgación puede ser amplificado utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como patrón y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación estándar por PCR. El polinucleótido amplificado de esta manera puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de nucleótidos de la Rpi-blb2 pueden ser preparados mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.

Una persona experimentada en la técnica sabe cómo obtener un segmento de cromosoma, por ejemplo, clonando fragmentos de cromosoma en BAC, por ejemplo como lo hace Song, 2003, PNAS 100 (16), 9128 o como se describe aquí y en las referencias aquí citadas.

La presente divulgación se relaciona adicionalmente con un método para hacer un vector recombinante que comprende insertar el polinucleótido de la presente invención en un vector o insertar dicho polinucleótido y una proteína de resistencia adicional en un vector.

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se relaciona con un vector que contiene el polinucleótido de la presente invención o dicho polinucleótido y un gen de resistencia adicional producido por el método de la presente invención.

Tal como se utiliza aquí, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar un polinucleótido al cual ha sido enlazado. Un tipo de vector es un “plásmido”, el cual se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular al cual pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos adicionales de ADN o ARN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula anfitriona en la cual son introducidos (por ejemplo vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo vectores no episomales de mamíferos) están integrados en el genoma de una célula anfitriona por introducción en la célula anfitriona y por lo tanto son replicados junto con el genoma anfitrión. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan aquí como “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos. En la presente especificación, “plásmido” y “vector” pueden ser utilizados de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la divulgación pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación defectuosos), los cuales sirven para funciones equivalentes.

La presente divulgación también se relaciona con cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores utilizados convencionalmente en ingeniería genética que contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos para las personas experimentadas en la técnica para construir diversos plásmidos y vectores; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico y vectores de la divulgación pueden ser preconstituidos en liposomas para administración a células objetivo.

En otra realización, el vector de la presente divulgación o el método de la presente invención se caracteriza porque el polinucleótido que codifica la proteína Rpi-blb2 o una proteína de resistencia adicionales esta enlazado operativamente a las secuencias de control de expresión y/o enlazados a una secuencia de ácido nucleico que codifica una expresión transgénica que regula la expresión que permite la señal en células anfitrionas procariotes o eucariote.

En una realización preferida, la presente invención se relaciona con un vector de la presente divulgación o con el método de la presente invención en el cual el polinucleótido que codifica la proteína Rpi-blb2 y/o la proteína de resistencia adicional está enlazado operativamente a las secuencias de control de expresión de la misma especie de origen así como el polinucleótido que codifica la proteína de la Rpi-blb2 y/o la proteína de resistencia adicional.

En el caso de que una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación se exprese en una célula es en principio posible modificar la secuencia de codificación de manera tal que la proteína está localizada en cualquier compartimiento deseado de la célula vegetal. Estos incluyen el núcleo, el retículo endoplasmático, la vacuola, la mitocondria, los plástidos como aminoplastos, cloroplastos, cromoplastos, el apoplasto, el citoplasma, el espacio extracelular, los cuerpos oleosos, peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales (para una revisión véase Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423 y referencias citadas allí). El polinucleótido puede ser fusionado operativamente entonces a un polinucleótido apropiado, por ejemplo, un vector, que codifica una señal para el transporte hacia el compartimiento deseable.

La presente divulgación se relaciona con un vector en el cual el polinucleótido de la presente invención está enlazado operativamente a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células anfitrionas procariotes o eucariotes. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrión. En los procariotes, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, sitios de enlazamiento ribosómicos y terminadores. En los eucariotes, las secuencias de control en general incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores; o factores de transcripción.

El término “secuencia de control” pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y pueden incluir también componentes ventajosos adicionales.

El término “enlazado operativamente” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control “enlazado operativamente” a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso de que la secuencia de control sea un promotor, es obvio para una persona experimentada en la técnica que se utiliza un ácido nucleico de cadena doble.

El enlazamiento operativo debe entenderse con el significado de que, por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor con la secuencia de ácido nucleico se va a expresar y, si es apropiado, los elementos reguladores adicionales tales como, por ejemplo, un terminador, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda satisfacer su función cuando la secuencia de ácido nucleico se expresa de manera recombinante, dependiendo de la disposición de la secuencia del ácido nucleico en relación con el ARN en sentido o antisentido. Con este fin, el enlazamiento directo en el sentido químico no se requiere necesariamente. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, las secuencias potenciadoras, también pueden ejercer su función sobre la secuencia objetivo a partir de posiciones que están más alejadas, o en efecto desde otras moléculas de ADN. Las disposiciones preferidas son aquellas en las cuales la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar de manera recombinante está posicionada por detrás de la secuencia que actúa como promotora, de tal manera que las dos secuencias estén enlazadas covalentemente una a otra. La distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar de manera recombinante es preferiblemente menor de 200 pares de bases, especialmente de preferencia menor de 100 pares de bases, muy especialmente de manera preferible menos de 50 pares de bases.

El enlazamiento operativo, y un casete de expresión, pueden generarse por medio de técnicas de recombinación y clonación habituales como las descritas, por ejemplo, en Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), en Silhavy TJ, Berman ML and Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), en Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience y en Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual. Sin embargo, también pueden posicionarse secuencias adicionales las cuales, por ejemplo, actúan como enlazante con sitios de escisión específicos para enzimas de restricción, o como péptidos de señal, entre las dos secuencias. La diserción de secuencias también puede llevar a la expresión de proteínas de fusión. Preferiblemente, el casete de expresión, que consiste en un enlazamiento de promotor y la secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada, puede existir en una forma integrada a un vector y ser insertada en un genoma de una planta, por ejemplo por transformación.

Tales secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o véase: Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds.:Glick and Thompson, Capítulo 7, 89-108 incluyendo las referencias citadas allí. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos a muchos tipos de células anfitrionas y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células anfitrionas o bajo ciertas condiciones. Será evidente para las personas experimentadas en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula anfitriona que va a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la divulgación pueden ser introducidos en células anfitrionas para de esa forma producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por polinucleótidos como se describe aquí.

Los vectores de expresión recombinante de la divulgación pueden ser diseñados para la expresión de dichas proteínas de resistencia, preferiblemente la Rpi-blb2, en células procariotes o eucariotes. Por ejemplo, los genes que codifican los polinucleótidos de la divulgación pueden ser expresadas en células bacterianas tales como E. coli, C. glutámico, Agrobacterium tumefaciens, células de insectos (usando vectores de expresión de vaculovirus), células de levaduras y otras células fúngicas (véase Romanos, (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, (1991) J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, (1991) en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3:239-251), y células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. (1988), Plant Cell Rep.: 583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, capítulo 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (y referencias citadas allí) o células de mamíferos. Se discuten células anfitrionas adecuadas adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa.

La expresión de proteínas en procariotes se lleva a cabo lo más frecuentemente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al terminal amino de la proteína recombinante pero también al terminal C o se fusionan dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión típicamente sirven para tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en una purificación por afinidad. Adicionalmente, el vector de fusión también puede codificar proteínas adicionales, cuya expresión soporta un incremento en la actividad de la Rpi-blb2 o de la resistencia de una planta contra patógenos vegetales, por ejemplo, otras proteínas de resistencia. Frecuentemente, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión de la unidad estructural de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la unidad estructural de fusión subsecuente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognatas, incluyen el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa.

Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX ((Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann (1988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes es expresar la proteína en una bacteria anfitriona con una capacidad disminuida para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico que se va insertar en un vector de expresión de tal manera que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos utilizados preferencialmente en la bacteria escogida para la expresión, tal como E. coli o C. glutámico (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de las secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación puede llevarse a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN.

Adicionalmente, el vector puede ser un vector de expresión en levaduras. Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Preferiblemente, el polinucleótido de la presente divulgación o descrito aquí está enlazado operativamente a una secuencia de control de expresión en plantas, por ejemplo un casete de expresión. Un casete de expresión en plantas contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de conducir la expresión genética en células de plantas y que están enlazados operativamente de tal manera que cada secuencia puede satisfacer su función tal como la terminación de la transcripción tal como señales de poliadenilación. Señales de poliadenilación preferidas son las que se originan de t-ADN de Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintetasa del plásmido pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) o equivalentes funcionales de los mismos pero también todos los otros terminadores funcionalmente activos en plantas son adecuados.

Puesto que la expresión genética en plantas frecuentemente no es muy limitada sobre los niveles transcripcionales los casetes de expresión de las plantas contienen preferiblemente otras secuencias enlazadas operativamente como los potenciadores transnacionales tales como la secuencia de sobreconducción que contiene la secuencia líder no traducida 5´ del virus mosaico del tabaco que potencia la proteína por relación de ARN (Gallie et al 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

De acuerdo con lo anterior, el polinucleótido descrito aquí puede estar enlazado operativamente a un promotor apropiado que confiere una expresión genética en una forma oportuna específica para una célula o tejido. Preferiblemente son promotores que guían la expresión constitutiva (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202) como los derivados de virus de plantas tales como el 35S CAMV (Franck et al., Cell 21(1980) 285-294), el 19S CaMV (véase también US5352605 y W08402913) o promotores de plantas como los de la subunidad pequeña Rubisco descrita en US 4962028.

El término promotores específicos para plantas se entiende con el significado de que, en principio, cualquier promotor es capaz de gobernar la expresión de los genes, en particular genes foráneos, en plantas o en partes de plantas, células de plantas, tejidos de plantas o cultivos de plantas. En este contexto, la expresión puede ser, por ejemplo, constitutiva, inducible o dependiente del desarrollo.

Se prefieren los siguientes:

a) Promotores constitutivos

Vectores preferidos son aquellos que hacen posible la expresión constitutiva en plantas (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). Un promotor “constitutivo” se entiende con el significado de aquellos promotores que aseguran la expresión en un número grande de, preferiblemente todos, los tejidos durante un periodo sustancial del desarrollo de la planta, preferiblemente en todas las etapas del desarrollo de la planta. En particular se usa preferiblemente un promotor de planta o un promotor derivado de un virus de planta. Particularmente preferido es el promotor del transcripto 35S del virus mosaico de la coliflor CaMV (Franck et al., (1908) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228) o el promotor 19S CaMV (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Otro promotor constitutivo adecuado es el promotor de “subunidad (SSU) pequeña de Rubisco” (US 4,962,028), el promotor leguminB (GenBank Acc. No. X03677), el promotor de nopalina sintasa de Agrobacterium, el promotor dual TR, el promotor de Agrobacterium OCS (octopina sintasa), el promotor de ubiquitina (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), el promotor de ubiquitina 1 (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692-9696), el promotor Smas, el promotor de cinamil alcohol deshidrogenasa (US 5,683,439), los promotores de las subunidades vacuolares de ATPasa o el promotor de la proteína rica en prolina de trigo (WO 91/13991), y promotores adicionales de genes cuya expresión constitutiva en plantas es conocida para los expertos.

b) Promotores específicos para tejidos

Se prefieren adicionalmente promotores con especificidad para las anteras, ovarios, flores, hojas, tallos, raíces y semillas.

Promotores específicos para las semillas tales como, por ejemplo, el promotor faseolina (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9):839-53), el promotor de gen de albúmina 2S (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), el promotor de legúmina (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), el promotor USP (proteína de semilla desconocida) (Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), el promotor del gen de napina (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), el promotor de proteína de enlazamiento a sacarosa (WO 00/26388) o el promotor de legúmina B4 (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090f), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de Brassica Bce4 (WO 91/13980). Promotores específicos de semillas adecuados adicionales son aquellos de los genes que codifican la glutenina de alto peso molecular (HMWG), gliadina, enzima de ramificación, la ADP glucosa pirofosfatasa (AGPasa) o la almidón sintasa. Preferidos adicionalmente son promotores que permiten la expresión específica en semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Pueden emplearse los siguientes ventajosamente: el promotor del gen lpt2 o lpt1 (WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores para el gen hordeína, el gen glutelina, el gen orizina, el gen prolamina, el gen gliadina, el gen glutelina, el gen zeína, el gen kasirina o el gen secalina).

Promotores específicos para tubérculos, raíces de almacenamiento o raíces tales como, por ejemplo, el promotor de patatina clase I (B33), el promotor inhibidor de la patata catepsina D.

Promotores específicos para hojas tales como el promotor citosólico de patata FBPasa (WO 97/05900), el promotor SSU (subunidad pequeña) de Rubisco (ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa) o el promotor ST-LSI de patata (Stockhaus et al., (1989) EMBO J 8: 2445-2451). Muy especialmente preferidos son los promotores específicos de la epidermis tales como, por ejemplo, el promotor del gen OXLP (proteína similar a oxalato-oxidasa) (Wei et al. (1998) Plant mol. Biol. 35: 101-112).

Promotores específicos para flores tales como, por ejemplo, el promotor de fitoena sintasa (WO 92/16635) o el promotor del gen P-rr (WO 98/22593).

Otros promotores específicos tales como el promotor 5126 (US 5,689,049, US 5,689,051), el promotor glob-I y el promotor y-zeína.

c) Promotores inducibles químicamente

Los casetes de expresión también pueden comprender un promotor inducible químicamente (artículo de revisión: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), mediante el cual la expresión del gen exógeno en la planta en un punto particular en el tiempo puede ser controlado. Tales promotores tales como, por ejemplo, el promotor PRP1 (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible por benceno sulfonamida (EP 0 388186), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), un promotor inducible por ácido abscísico (EP 0 335 528) o un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (WO 93/21334) pueden ser usados de la misma forma.

d) Promotores inducibles por estrés o patógenos

Se prefieren adicionalmente promotores que son inducidos por estrés biótico o abiótico, tales como, por ejemplo, el promotor inducible por patógenos del gen PRP1 (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), el promotor hsp70 o hsp80 de tomate inducible por alta temperatura (US 5,187,267), el promotor de alfa amilasa inducible en patata por baja temperatura (WO 96/12814), el promotor PPDK inducible por la luz, o el promotor pinII inducido por lesiones (EP 375091).

Los promotores inducidos por patógenos abarcan los de los genes que son inducidos como consecuencia de infección por parte de patógenos, tales como, por ejemplo, genes de proteínas PR, proteínas SAR, �-1,3-glucanasa, quitinasa y similares (por ejemplo Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4:645656; Van Loon (1985) Plant Mol Virol 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant- Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961968(1989).

También se abarcan promotores inducibles por lesiones tales como los del gen pinII (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), del gen wun1 y wun2 (US 5,428,148), del gen win1 y win2 (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), de la sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), del gen WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. Letters 323:73-76), del gen MPI (Corderok et al. (1994) The Plant J 6(2):141-150) y similares.

e) Promotores dependientes del desarrollo

Promotores adecuados adicionales son, por ejemplo, promotores específicos para la maduración de los frutos tales como, por ejemplo, el promotor específico para maduración de los frutos del tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Los promotores dependientes de desarrollo comprenden parcialmente los promotores específicos para tejidos, puesto que los tejidos individuales se desarrollan por naturaleza en una forma dependiente del desarrollo.

Puede ser ventajoso que el polipéptido de la presente divulgación sea activo solamente o tenga solamente una actividad incrementada en el tejido que es transfectado o penetrado por el patógeno mencionado aquí. Se prefieren especialmente promotores constitutivos y promotores específicos de hojas y/o tallos, con promotores inducibles por patógenos y específicos de la epidermis, los más preferidos. También se prefiere el promotor natural, que está comprendido, por ejemplo, en el fragmento genómico representado en SEQ ID NO: 5 y 6.

Adicionalmente, pueden enlazarse promotores adicionales de manera operativa a la secuencia de ácidos nucleicos que se va a expresar, promotores que hacen posible la expresión en tejidos de planta adicionales o en otros organismos, tales como, por ejemplo, bacterias de E. coli. Promotores de plantas adecuados son, en principio, todos los promotores antes descritos.

El término “secuencias de control genético” debe entenderse en el sentido amplio y se refiere también a todas aquellas secuencias que tienen un efecto sobre la materialización o la función del casete de expresión de acuerdo con la invención. Por ejemplo, las secuencias de control genético modifican la transcripción y traducción en organismos procariotes o eucariotes. Preferiblemente, los casetes de expresión de acuerdo con la divulgación abarcan el promotor con especificidad para la epidermis del embrión y/o la flor 5´ corriente arriba de la secuencia de ácido nucleico en cuestión que se va a expresar de manera recombinante, y 3´ corriente abajo una secuencia terminadora como secuencia de control genético y, si es apropiado, elementos reguladores habituales adicionales, en cada caso enlazados operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar de manera recombinante.

Las secuencias de control genético también abarcan promotores adicionales, elementos promotores o promotores mínimos, todos los cuales pueden modificar las propiedades que gobiernan la expresión. Así, por ejemplo, la expresión específica para tejidos puede depender adicionalmente de ciertos tensionadores, que obedecen a secuencias de control genético. Tales elementos han sido descritos, por ejemplo, para las tensiones por agua, el ácido abscísico (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135) y estrés por calor (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53, 1989).

Secuencias de control ventajosas adicionales son, por ejemplo, los promotores gram-positivos amy y SPO2, y los promotores de levaduras o fúngicos ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

En principio, todos los promotores naturales con sus secuencias reguladoras como las mencionadas anteriormente pueden ser utilizados para el método de acuerdo con la invención. Además, pueden utilizarse también ventajosamente promotores sintéticos.

Las secuencias de control genético adicionalmente abarcan también las regiones no traducidas 5´, los intrones o regiones de genes no codificantes 3´, tales como, por ejemplo, el actin-1intron, los intrones Adh 1-S, 1, 2 y 6 (referencia general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Se ha demostrado que pueden jugar un papel significativo en la regulación de la expresión genética. Así, se ha demostrado que las secuencias 5´ no traducidas pueden potenciar la expresión transiente de genes heterólogos. Ejemplos de potenciadores de la traducción que pueden ser mencionado son la secuencia líder 5´ del virus mosaico del tabaco (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) y similares. Adicionalmente, pueden promover especificidad a los tejidos (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).

El casete de expresión puede comprender ventajosamente una o más de las que son conocidas como secuencias potenciadoras, enlazadas operativamente al promotor, lo que hace posible una expresión recombinante incrementada de la secuencia de ácido nucleico. Secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores o terminadores adicionales, pueden ser insertadas también en el extremo 3´ de las secuencias de ácido nucleico que se van a expresar de manera recombinante. Una o más copias de las secuencias de ácido nucleico que se van a expresar de manera recombinante pueden estar presentes en el constructo genético.

En una realización se usa la secuencia terminadora natural comprendida en el fragmento genómico representado en SEQ ID NO: 5 y/o 6.

Las señales de poliadenilación que son adecuadas como secuencias de control son señales de poliadenilación de plantas, preferiblemente de las que esencialmente corresponden a señales de poliadenilación de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, en particular el gen 3´ de T-ADN (octopin sintasa) del plásmido Ti de pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835 et seq.) o equivalentes funcionales de la misma. Ejemplos de secuencias terminadoras que son especialmente adecuadas son el terminador OCS (octopin sintasa) y el terminador NOS (nopalin sintasa).

Las secuencias de control deben entenderse adicionalmente como aquellas que hacen posible la recombinación o inserción homóloga en el genoma de un organismo anfitrión o que permiten la eliminación desde el genoma. En el caso de recombinación homóloga, por ejemplo el promotor natural de un gen particular puede ser intercambiado por un promotor con especificidad por la epidermis embriónica y/o la flor. Métodos tales como la tecnología crellox permiten una eliminación específica para el tejido, si es apropiado, del casete de expresión del genoma del organismo anfitrión (Sauer B (1998) Methods. 14(4):381-92). En este método, las secuencias flanqueantes específicas (secuencias lox), que permiten eliminación posterior es decir por medio de la recombinasa cre están enlazadas al gen objetivo.

Un casete de expresión y los vectores derivados de el pueden comprender elementos funcionales adicionales. El término funcional elemento debe entenderse en el sentido amplio y se refiere a todos aquellos elementos que tienen efectos sobre la generación, amplificación o función de los casetes de expresión, vectores u organismos transgénicos de acuerdo con la divulgación. Los siguientes pueden ser mencionados a manera de ejemplo, pero no como limitación:

a) Marcadores de selección que confieren una resistencia a un inhibidor del metabolismo tal como 2-deoxyglucose-6phosphate (WO 98/45456), antibióticos o biocidas, preferiblemente herbicidas, tales como, por ejemplo kanamicina, G 418, bleomicina o higromicina, o incluso fosfinotricina y similares. Marcadores de selección preferidos especialmente son aquellos que confieren resistencia a herbicidas. Ejemplos que pueden ser mencionados son secuencias de ADN que codifican la fosfinotricina acetil transferasas (PAT) y que inactivan los inhibidores de glutamina sintasa (genes bar y pat), genes de 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (genes de EPSP sintasa), que confieren resistencia al Glifosater (N-(fosfonometil)glicina), el gen gox, que codifica enzimas degradantes del Glifosater (Glifosfato oxidorreductasa), el gen deh (que codifica una deshalogenasa que inactiva el dalapon), acetolactato sintasas que inactivan sulfonilurea e imidazolina, y genes bxn que codifican enzimas de nitrilasa degradantes de bromoxinilo, el gen aasa, que confiere resistencia al antibiótico apectinomicina, el gen de estreptomicin fosfotransferasa (SPT), el cual permite resistencia a la estreptomicina, el gen neomicin fosfotransferasa (NPTII), el cual confiere resistencia a la kanamicina o geneticidina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT), el cual media la resistencia a la higromicina, el gen acetolactato sintasa (ALS), el cual confiere resistencia a herbicidas de sulfonilurea (por ejemplo variantes mutantes de ALS con, por ejemplo, mutación en S4 y/o Hra).

b) Genes reportadores que codifican proteínas cuantificables fácilmente y, a través de su color o actividad enzimática, hacen posible establecer la eficacia de transformación, el sitio de expresión o el tiempo de expresión. Muy especialmente preferidos en este contexto son los genes que codifican proteínas informadoras (Schenbom E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) tales como la proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8), cloranfenicol transferasa, una luciferasa (Ow et al. (1986) Science 234:856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), el gen aequorina (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), el gen de �-galactosidasa, del locus R (que codifica una proteína que regula la producción de pigmentos de antocianina (colorante rojo) en tejidos vegetales y así hace posible dirigir el análisis de la actividad del promotor sin adición de sustancias auxiliares adicionales o sustratos cromogénicos; Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), siendo la �-glucoronidasa muy especialmente preferida (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 39013907).

c) Orígenes de la replicación, que aseguran la amplificación de los casetes o vectores de expresión de acuerdo con la invención en, por ejemplo, E. coli. Ejemplos que pueden ser mencionados son ORI (origen de la replicación de ADN), el ori pBR322 o el ori P15A (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

d) Elementos que son necesarios para la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, tales como, por ejemplo, la frontera derecha o izquierda del T-ADN o de la región vir.

Para seleccionar las células que han sufrido recombinación homóloga exitosamente, o incluso para seleccionar células transformadas, es necesario, como regla, introducir adicionalmente un marcador seleccionable, el cual confiere resistencia a un biocida (herbicidas), un inhibidor del metabolismo tal como 2-desoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456) o un antibiótico a las células que han sufrido exitosamente la recombinación. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas a partir de las no transformadas (McCormick et al. (1986) Plant cell Reports 5:8184).

La introducción de un casete de expresión de acuerdo con la divulgación en un organismo o células, tejidos, órganos, partes o semillas de los mismos (preferiblemente en plantas o células vegetales, tejidos, órganos, partes de semillas) puede efectuarse ventajosamente utilizando vectores que comprenden los casetes de expresión. El casete de expresión puede ser introducido en el vector (por ejemplo un plásmido) a través de un sitio de escisión de restricción adecuado. El plásmido formado se introduce primero en E. coli. Las E. coli transformadas correctamente se seleccionan, cultivan y se obtiene el plásmido recombinante por métodos familiares para la persona experimentada. Los análisis de restricción y secuenciamiento pueden servir para verificar la etapa de clonación.

Promotores adicionales para expresión en partes específicas de las plantas son, por ejemplo, el gen promotor de napina de semilla de colza (US5608152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):45967), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 9845461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5504200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 9113980) o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), así como promotores que confieren expresión específica en semillas en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados para anotar son el promotor del gen Ipt2 o Ipt1 de cebada (WO 9515389 y WO 9523230) o los descritos en WO 9916890 (promotores del gen de hordeína de cebada, el gen glutelina de arroz, el gen orizina de arroz, el gen prolamina de arroz, el gen gliadina de trigo, el gen glutelina de trigo, el gen zeína de maíz, el gen glutelina de cebada, el gen kasirina de sorgo, y el gen secalina de centeno).

Adicionalmente, el polinucleótido de la divulgación puede ser clonado en el vector de expresión en una orientación antisentido. Esto es, la molécula de ADN está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de una manera tal que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNn codificado por el polinucleótido de la presente invención. Secuencias reguladoras enlazadas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido puede escogerse de tal manera que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo promotores y/o potenciadores virales,

o secuencias reguladoras que pueden escogerse de tal forma que dirijan la expresión específica de tejido o específica de célula del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado fagémido o virus atenuado en el cual las moléculas de ácido nucleico antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad puede ser determinada por el tipo de célula en el cual se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión genética utilizando genes antisentido véase Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 and Mol et al., 1990, FEBS Letters 268:427-430.

La presente divulgación se relaciona con un método para hacer una célula anfitriona recombinante que comprende introducir el vector o el polinucleótido de la presente invención o dicho vector de dicho polinucleótido y un vector para expresar una proteína de resistencia adicional en una célula anfitriona.

El vector de ADN puede ser introducido en células procariotes o eucariotes a través de técnicas convencionales de transformación o transfección. Tal como se utilizan aquí, los términos “transformación” y “transfección”, conjugación y transducción se entienden como referencia a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo ADN) en una célula anfitriona, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por dextrano DEAE, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por agentes químicos, o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas incluyendo células vegetales pueden encontrarse en Sambrook et al., Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.

Para la transfección estable de células eucariotes, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo resistente a antibióticos) se introduce generalmente en las células anfitrionas junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia a un herbicida tal como glifosfato o glucosinato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede ser introducido en una célula anfitriona en el mismo vector que codifica el polipéptido de la presente invención o puede ser introducido en un vector separado. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por, por ejemplo, selección de fármacos (por ejemplo, células que hayan incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirá mientras que las otras células morirán).

Pueden producirse células anfitrionas adicionales que contienen sistemas de selección que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión del polinucleótido de la invención en un vector que lo coloca bajo el control del operón lac permite la expresión del polinucleótido solamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico introducida es foránea para la célula anfitriona.

Por “foráneo” se entiende que la molécula de ácido nucleico es heteróloga con respecto a la célula anfitriona, esto significa derivada de una célula u organismo con un fondo genómico diferente, o es homóloga con respecto a la célula anfitriona pero localizada en un ambiente genómico diferente a la contraparte de origen natural de dicha molécula de ácido nucleico. Esto significa que, si la molécula de ácido nucleico es homóloga con respecto a la célula huésped, no está localizada en su localización natural en el genoma de dicha célula huésped, en particular está rodeada por genes diferentes. En este caso la molécula agregada de ácido nucleico puede estar bien bajo el control de su propio promotor

o bajo el control de un promotor heterólogo. El vector o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación está presente en la célula anfitriona bien sea integrada en el genoma de la célula anfitriona o puede ser mantenida en alguna forma extracromosómica. En este aspecto, también debe entenderse que la molécula de ácido nucleico de la divulgación puede ser utilizada para restaurar o crear un gen mutante a través de recombinación homóloga (Paszkowski (ed.), Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994).

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se relaciona con una célula anfitriona manipulada genéticamente con el polinucleótido de la divulgación o el vector de la divulgación, o dicho vector de dicho polinucleótido y un vector o un polinucleótido para expresar una proteína de resistencia adicional.

Los términos “célula anfitriona” y “célula anfitriona recombinante” se utilizan de manera intercambiable aquí. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a la célula objetivo particular sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Puesto que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, en efecto, idéntica a la célula original, pero está aún incluida dentro del alcance del término tal como se usa aquí.

Por ejemplo, un polinucleótido de la presente divulgación puede ser introducido en células bacterianas, células de insectos, células fúngicas o células de mamíferos (tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) o células Cos), algas, ciliados, células vegetales o de hongos. Células anfitrionas adecuadas son conocidas para los experimentados en la técnica. Se prefieren E. coli, baculovirus, Agrobacterium, o células vegetales.

Adicionalmente, la célula anfitriona puede ser transformada también de tal forma que las enzimas y proteínas adicionales están (sobre)expresadas cuya expresión soporta un incremento de resistencia de una planta a patógenos. Preferiblemente, un gen de resistencia adicional se expresa también, preferiblemente uno o más genes de resistencia, preferiblemente los genes como se mencionan aquí, son también expresados. Lo más preferido es una coexpresión de la Rpi-blb2 y Rpi-blb.

Se prefieren adicionalmente células de una planta mencionada aquí, en particular, de una de las solanáceas antes mencionadas, siendo las más preferidas patata, tomate, petunia, tomate de árbol, pera melón o berenjena.

La presente divulgación, se relaciona con un proceso para la producción del polipéptido de la presente divulgación, en particular de una proteína que tiene actividad de Rip-blb2 que comprende cultivar la célula huésped de la divulgación y recuperar el polipéptido codificado por dicho polinucleótido y expresado por la célula anfitriona a partir del cultivo o las células.

El término “expresión” significa la producción de una proteína o secuencia de nucleótidos en la célula. Sin embargo, dicho término también incluye la expresión de la proteína en un sistema libre de células. Incluye transcripción en un producto de ARN, modificación por y/o traducción postranscripción a un producto proteínico o polipéptido de un ADN que codifica ese producto, así como posibles modificaciones postraducción.

Dependiendo de los constructos y condiciones específicos usados, la proteína puede ser recuperada de las células, del medio de cultivo o de ambos. Para la persona experimentada en la técnica es bien sabido que no solamente es posible expresar una proteína nativa sino también expresar la proteína como péptidos de fusión o agregar secuencias de señal que dirigen la proteína a compartimientos específicos de la célula anfitriona, por ejemplo, asegurando la secreción de la proteína hacia el medio de cultivo, etc. Además, tal proteína y fragmentos de la misma pueden ser sintetizados y/o modificados químicamente de acuerdo con métodos estándar descritas, por ejemplo, aquí más adelante.

Una célula anfitriona de la divulgación, tal como una célula anfitriona procariote o eucariote en cultivo, puede ser utilizada para producir (esto es, expresar) el polipéptido codificado por el polinucleótido de la divulgación, preferiblemente un polipéptido que tiene actividad de la Rpi-blb2. Puede aplicarse un método alterno además en plantas por la transferencia directa de ADN en las flores en desarrollo mediante electroporación o transferencia genética mediada por Agrobacterium. De acuerdo con lo anterior, la divulgación provee adicionalmente métodos para producir Rpi-blb2 utilizando las células anfitrionas de la divulgación. El método comprende cultivar la célula anfitriona de la divulgación en un medio adecuado tal que se produzca el polipéptido de la presente divulgación. Adicionalmente, el método comprende aislar y/o recuperar dicho polipéptido a partir del medio o la célula anfitriona.

El polipéptido de la presente divulgación es producido preferiblemente por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína es clonada en un vector de expresión (tal como se describió anteriormente), el vector de expresión es introducido en una célula anfitriona (tal como se describió anteriormente) y dicho polipéptido se expresa en la célula anfitriona. Dicho polipéptido puede ser aislado a partir de las células mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas estándar. Alternativamente a la expresión recombinante, el polipéptido o péptido de la presente divulgación puede ser sintetizado químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptidos. Además, el Rpi-blb2 nativo puede ser aislado a partir de células (por ejemplo, células endoteliales), por ejemplo utilizando el anticuerpo de la presente divulgación como se describe más adelante, en particular, un anticuerpo anti-Rpi-blb2, el cual puede ser producido por técnicas estándar utilizando el polipéptido de la presente divulgación o un fragmento del mismo, esto es, el polipéptido de esta divulgación.

La presente divulgación se relaciona con una proteína Rpi-blb2 o una proteína que tiene actividad de la Rpi-blb2.

La presente divulgación se relaciona con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de la divulgación u obtenible mediante un proceso de la divulgación.

En una realización el polipéptido de la divulgación no consiste de la secuencia representada en SEQ ID NO: 8 y/o 10 y/o no consiste de la secuencia codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 7 y/o 9.

En una realización, el polipéptido de la presente invención no consiste de la secuencia de las proteínas Mi1.1 o Mi1.2 y/o de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína Mi1.1 o Mi1.2.

Así, en una realización, el polipéptido de la presente invención puede no consistir de las secuencias mostradas en Rossi et al 1998, PNAS USA 95:9750-9754, Milligan et al, 1998. Plant Cell 10:1307-1319; y/o WO 9806750.

Los términos “proteína” y “polipéptido” usados en esta solicitud son intercambiables. “Polipéptidos” se refiere a un polímero de aminoácidos (secuencia de aminoácidos) y no se refiere a la longitud específica de la molécula. Así se incluyen péptidos y polipéptidos dentro de la definición del polipéptido. Este término también se refiere o incluye modificaciones postraducción del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.

Preferiblemente, el polipéptido es aislado. Una proteína o porción biológicamente activa de la misma “aislada” o “purificada” esta sustancialmente libre de material celular cuando se produce por técnicas de ADN, o de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones del polipéptido de la divulgación, en los cuales la proteína se separa de los componentes celulares de las células en las cuales se produce de manera natural o recombinante. En una realización, la expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones que tienen menos de aproximadamente 30% (por peso seco) de “proteína contaminante”, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de “proteína contaminante”, o aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de “proteína contaminante”, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de “proteína contaminante”. El término “proteína contaminante” se refiere a polipéptidos que no son polipéptidos de la presente divulgación. Cuando el polipéptido de la presente divulgación o una porción bilógicamente activa del mismo se produce de manera recombinante, también preferiblemente libre de manera sustancial de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión “sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos” incluye preparaciones en las cuales el sujeto de la presente divulgación, por ejemplo el polipéptido de la presente divulgación, se separa a partir de los precursores químicos u otros agentes químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. La expresión “sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos” incluye preparaciones que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o agentes químicos que no son Rpi-blb2, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o agentes químicos que no son Rpi-blb2, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o agentes químicos que no son Rpi-blb2, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o agentes químicos que no son Rpi-blb2. En realizaciones preferidas, las proteínas aisladas o porciones activas biológicamente de las mismas carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del cual se deriva el polipéptido de la presente invención. Típicamente, tales proteínas se producen por técnicas de ADN recombinante.

Un polipéptido de la divulgación puede participar en el polipéptido o porción del mismo que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4 de tal manera que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad de conferir la resistencia de la presente invención. La porción de la proteína es preferiblemente una porción biológicamente activa tal como se describe aquí.

Preferiblemente, el polipéptido de la divulgación tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en SEQ ID NO: 2 o 4. Adicionalmente, el polipéptido puede tener una secuencia de aminoácido que es codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida, preferiblemente hibrida bajo condiciones restrictivas según se describió anteriormente, a una secuencia de nucleótidos del polinucleótido de la presente invención. De acuerdo con lo anterior, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 70%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4. El polipéptido preferido de la presente invención posee preferiblemente al menos una de las actividades de proteína Rpi-blb2 descritas aquí, por ejemplo, su resistencia o actividades inmunológicas. Un polipéptido preferido de la presente divulgación incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida, preferiblemente hibrida bajo condiciones restrictivas, a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 o la cual es homóloga de los mismos, tal como se definió anteriormente.

De acuerdo con lo anterior el polipéptido de la presente divulgación puede variar desde SEQ ID NO: 2 o 4 en secuencia de aminoácidos debido a una variación o mutagénesis natural, tal como se describe en detalle aquí.

Las porciones bilógicamente activas de un polipéptido de la presente divulgación incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivados de las secuencias de aminoácidos de una proteína Rpi-blb2, por ejemplo la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o 4 o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a las mismas, la cual incluye menos aminoácidos que una longitud completa de proteína Rpi-blb2 o la proteína de longitud completa la cual es homóloga a una proteína Rpi-blb2 representada aquí, y exhibe al menos una actividad de proteína Rpi-blb2. Típicamente, las porciones activas biológicamente (o inmunológicamente), esto es, péptidos, por ejemplo, péptidos que tienen 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad o epítopo de una proteína Rpi-blb2. Además, otras porciones biológicamente activas, en las cuales se eliminan otras regiones de polipéptidos, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse en cuanto a una o más de las actividades descritas aquí.

La manipulación del polinucleótido de la Rpi-blb2 de la divulgación puede dar como resultado la producción de la Rpiblb2 que tiene diferencias funcionales con respecto a la proteína Rpi-blb2 tipo silvestre. Estas proteínas pueden mejorarse en eficiencia y actividad, pueden estar presentes en números más grandes en la célula de lo usual, o pueden disminuir en eficiencia o actividad.

Cualquier estrategia de mutagénesis para Rpi-blb2 que dé como resultado una dicha resistencia incrementada o una resistencia a otra especie de patógeno vegetal o a otra cepa de una especie de patógeno vegetal antes mencionadas, de dicho compuesto no se entienden como limitantes. Las variaciones en estas estrategias serán evidentes para una persona experimentada en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos divulgados aquí, pueden utilizarse el polinucleótido y el polipéptido de la divulgación para generar plantas o partes de las mismas, que expresan las moléculas de polinucleótidos y proteína de Rip-blb2 o Rpi-blb2 mutantes, de tal manera que se mejoren el rendimiento, producción y/o eficiencia de producción de un compuesto determinado. Este compuesto deseado puede ser un producto natural de las plantas, el cual incluye los productos finales de las rutas de biosíntesis e intermedios de rutas metabólicas de origen natural, así como moléculas que no se presentan de forma natural en el metabolismo de dichas células, pero que son producidos por dichas células de la invención.

La divulgación también provee proteínas quiméricas o de fusión.

Tal como se utiliza aquí, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” comprende un polipéptido enlazado operativamente a un polipéptido que no es Rpi-blb2.

Un “polipéptido Rpi-blb2” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que tiene actividad de la Rpi-blb2, mientras que un “polipéptido que no es Rpi-blb2” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la Rpi-blb2, por ejemplo, una proteína que no confiere la resistencia descrita aquí, en particular no confiere resistencia a P. infestans, y que es derivada del mismo organismo o uno diferente. Dentro de proteína de fusión, el término “enlazado operativamente” pretende indicar que el polipéptido de Rpì-blb2 y el polipéptido que no es Rpi-blb2 se fusionan uno con otro de tal manera que ambas secuencias satisfacen la función propuesta agregada a la secuencia utilizada. El polipéptido que no es Rpi-blb2 puede ser utilizado para el terminal N o terminal C del polipéptido Rpi-blb2. Por ejemplo, en una realización la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-LMRP en la cual las secuencias Rpi-blb2 están fusionadas con el terminal C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación del Rpi-blb2 recombinante. En otra realización, la proteína de fusión es una Rpi-blb2 que contiene una secuencia de señales heterólogas en su terminal N. En ciertas células anfitrionas (por ejemplo, células anfitrionas de mamíferos), la expresión y/o secreción de una Rpi-blb2 puede incrementarse a través del uso de una secuencia de señales heterólogas.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión de la Rpi-blb2 de la divulgación es producida por técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan entre sí en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando un terminal con extremo romo o extremo agudo, digestión de una enzima de restricción para proveer términos apropiados, y llenado de extremos cohesivos como apropiados, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar enlazamientos indeseables, y ligación enzimática. El gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos del gen puede ser llevada a cabo utilizando cebadores ancla que dan lugar a superposiciones complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden ser subsecuentemente fusionados y reamplificados para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente que ya codifican una unidad estructural de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). El polinucleótido de la divulgación puede ser clonado en tal vector de expresión de tal manera que la unidad estructural de fusión se enlaza en marco a la proteína codificada.

Adicionalmente, pueden ejecutarse simulaciones de plegamiento y rediseño por ordenador de motivos estructurales de la proteína de la divulgación utilizando programas de ordenador apropiado (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). La modelación por ordenador del plegamiento de proteínas puede ser utilizado para el análisis conformacional y energético de modelos detallados de péptidos y proteínas (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). En particular, los programas apropiados pueden utilizarse para la identificación de sitios interactivos de la ciplina mitogénica y su receptor, su ligando u otras proteínas interactuantes mediante búsquedas asistidas por ordenador para la secuencia de péptidos complementarios ((Fassina, immunomethods (1994), 114-120. Sistemas de ordenador apropiados adicionales para el diseño de proteína y péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Los resultados obtenidos a partir de los análisis por ordenador antes descritos pueden ser utilizados para, por ejemplo, la preparación de peptidomiméticos de la proteína de la invención o fragmentos de la misma. Tales análogos seudopéptidos de la secuencia natural de aminoácidos de la proteína pueden imitar de manera muy eficiente la proteína original (Benkirane,

J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de residuos de aminoácidos aquirales Q disponibles fácilmente en una proteína de la invención o un fragmento de la misma da como resultado la sustitución de enlaces amida por unidades polietileno de una cadena alifática, proveyendo mediante ello una estrategia conveniente para construir un peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777).

Análogos peptidomiméticos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas están descritos en la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Peptidomiméticos apropiados de la proteína de la presente invención también pueden ser identificados mediante la síntesis de bibliotecas combinacionales de peptidomiméticos a través de alquilación sucesiva de amidas y prueba de los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus propiedades de enlazamiento e inmunológicas. Métodos para la generación y uso de bibliotecas combinacionales peptidomiméticas están descritos en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4(1996), 709-715.

Adicionalmente, una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína de la invención puede ser utilizada para el diseño de inhibidores peptidomiméticos de la actividad biológica de la proteína de la invención (Rose, Biochemistry 35 1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

La presente divulgación se relaciona con un anticuerpo que se enlaza específicamente al polipéptido de la presente divulgación o partes del mismo, por ejemplo fragmentos específicos o epítopos de tal proteína.

Los anticuerpos de la divulgación pueden ser utilizados para identificar y aislar Rpi-blb2 y genes en cualquier organismo, preferiblemente plantas, preparados en plantas descritos aquí. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos sintéticos así como fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fv o scFv, etc. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados, por ejemplo, por las técnicas descritas originalmente por Köhler y Milstein, Nature 256 (1975), 495, y Galfr6, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón en células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados.

Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos para los péptidos antes mencionados pueden obtenerse utilizando métodos que son descritos, por ejemplo, en Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estos anticuerpos pueden ser utilizados, por ejemplo, para la inmunoprecipitación e inmunolocalización de proteínas de acuerdo con la invención así como para el monitoreo de las síntesis de tales proteínas, por ejemplo, en organismos recombinantes, y para la identificación de compuestos que interactúan con la proteína de acuerdo con la divulgación. Por ejemplo, la resonancia de plasmón en superficie tal como se emplea en el sistema BIAcore puede ser utilizada para incrementar la eficiencia de las selecciones de anticuerpos de fago, produciendo un alto incremento de afinidad a partir de una biblioteca sencilla de anticuerpos de fago que se enlaza a un epítopo de la proteína de la divulgación (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). En muchos casos, los fenómenos de enlazamiento de los anticuerpos a los antígenos son equivalentes a otros enlazamientos ligando/antiligando.

La presente divulgación se relaciona con una molécula de ácido nucleico antisentido que comprende la secuencia complementaria del polipéptido de la presente invención.

Los métodos para modificar los niveles de expresión y/o la actividad son conocidos para personas experimentadas en la técnica e incluyen por ejemplo sobreexpresión, cosupresión, el uso de ribozimas, estrategias sentido y antisentido, metodologías de silenciamiento genético. “Cadena en sentido” se refiere a la cadena de una molécula de ADN de cadena doble que es homóloga a un transcrito de ARNm de la misma. La “cadena antisentido” contiene una secuencia invertida que es complementaria a la de la “cadena en sentido”.

La molécula de ácido nucleico “antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una molécula de ácido nucleico “en sentido” que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena de codificación de una molécula de ADNc de doble cadena o complementaria a una secuencia de ARNm. De acuerdo con lo anterior, una molécula de ácido nucleico antisentido puede enlazarse mediante hidrógeno a una molécula de ácido nucleico en sentido. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a una cadena de codificación completa de la Rpi-blb2, o solo a una porción de la misma. De acuerdo con lo anterior, una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una “región de codificación” de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la presente divulgación. El término “región de codificación” se refiere a la región de la secuencia de nucleótido que comprende codones que son traducidos en residuos de aminoácidos. Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una “región no codificadora” de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica Rpi-blb2. El término “región no codificadora” se refiere a secuencias 5´ y 3´ que flanquean la región de codificación que no son traducidas en un polipéptido, esto es, también denominadas como regiones 5´ y 3´ no traducidas (5´-UTR o 3´-UTR).

Dadas las secuencias de cadena de codificación que codifican la Rpi-blb2 divulgada aquí, las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención pueden ser diseñadas de acuerdo con la reglas del apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región de codificación completa del ARNm de la Rpi-blb2, pero también puede ser un nucleótido el cual es antisentido a solamente una porción de la región codificadora o no codificadora del ARNm de la Rpi-blb2. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de la Rpi-blb2. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Una molécula de ácido nucleico antisentido de la divulgación puede ser construida utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede ser sintetizado químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de manera diversa diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y en sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5(carboxihidroxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-Dgalactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniloadenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6isopenteniloadenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, uracil-5- oxiacético metiléster, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3amino-3-N-2-carboxipropilo) uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede ser producido bilógicamente utilizando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un polinucleótido en una orientación antisentido (esto es, ARN transcrito desde el polinucleótido insertado será de una orientación antisentido a un polinucleótido objetivo de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal forma que hibridan con o se enlazan a ARNm celular y/o ADN genómico codificando una Rpi-blb2 para de esa manera inhibir la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se enlaza a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. La molécula antisentido puede ser modificada de tal manera que se enlaza específicamente a un receptor o a un antígeno expresado sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, enlazando la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o a un anticuerpo que se enlaza a un receptor de una superficie celular o antígeno. La molécula de ácido nucleico antisentido también puede ser administrada a células utilizando los vectores descritos aquí. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor procariote, viral o eucariote incluyendo de plantas.

La molécula de ácido nucleico antisentido de la divulgación puede ser una molécula de ácido nucleico anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos de cadena doble específicos con ARN complementario, en el cual, en contra de las unidades usuales, las cadenas corren paralelas una a otra (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids.

Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2’-o-metil-ribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo quimérico ARN-ADN (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

Adicionalmente la molécula de ácido nucleico antisentido de la divulgación puede ser una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla, tal como un ARNm, con el cual tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) pueden ser utilizadas para escindir catalíticamente los transcriptos de ARNm de la Rpi-blb2 para de esa manera inhibir la traducción del ARNm. Una ribozima que tiene especificidad por una molécula de ácido nucleico que codifica Rp-blb2 puede ser diseñada con base en la secuencia de nucleótidos del ADNc de la Rpi-blb2 divulgado aquí o sobre la base de una secuencia heteróloga que se va a aislar de acuerdo con métodos enseñados en la divulgación. Por ejemplo, puede construirse un derivado de una Tetrahymena L-19 IVS RNA en el cual la secuencia de nucleótido del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se va a escindir en una ARNm. Véase, por ejemplo, Cech et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,987,071 y Cech et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,116,742. Alternativamente, puede utilizarse ARNm de la Rpi-blb2 para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica a partir de una reserva de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

La molécula antisentido de la presente divulgación, comprende también un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una región reguladora de la secuencia de nucleótidos de la Rpi-blb2, por ejemplo, sus promotores y/o potenciadores, por ejemplo, para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripción del gen en células objetivo. Véase en general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.

Además, en una realización, la presente invención se relaciona con un método para la producción de plantas, células de plantas o tejido vegetal transgénicos, que comprenden la introducción del polinucleótido o el vector de la presente invención en el genoma de dicha planta, tejido vegetal o célula vegetal. En una realización preferida, dicho vector o dicho polinucleótido y un vector o un polinucleótido para la expresión de un gen de resistencia adicional, en particular para Rpi-blb, se introduce también en el genoma de dicha planta, tejido vegetal o célula vegetal, antes, después o juntos.

Para la expresión de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación en orientación en sentido o antisentido en células vegetales, las moléculas se colocan bajo el control de elementos reguladores que aseguran la expresión en células vegetales. Estos elementos reguladores pueden ser heterólogos u homólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico que se va a expresar así como con respecto a las especies vegetales que se van a transformar y que se describen anteriormente en detalle.

En general, tales elementos reguladores comprenden un promotor activo en células vegetales. Para obtener expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, por ejemplo, se utilizan promotores constitutivos, tales como el promotor 35S de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o promotores de los genes de poliubiquitina del maíz (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Con el fin de alcanzar la expresión en tejidos específicos de una planta transgénica es posible utilizar promotores específicos de tejido (véase, por ejemplo, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). También son conocidos promotores que son específicamente activos en tubérculos de patatas o en semillas de diferentes especies vegetales, tales como maíz, Vicia, trigo, cebada, etc. Los promotores inducibles pueden ser utilizados para ser capaz de controlar exactamente la expresión. Los promotores inducibles comprenden también promotores que son inducidos por infecciones en plantas.

En una realización, la presente invención se relaciona con un método para producir una planta o una parte de la misma resistente a un patógeno del filum oomicetes que comprende las etapas de: expresar en la planta o en una parte de la misma el polipéptido de la presente divulgación y una proteína de resistencia adicional.

De acuerdo con lo anterior en una realización adicional, la presente invención se relaciona con una planta transgénica o tejido vegetal de la invención, los cuales por presencia del polinucleótido o del vector son resistentes a dichos patógenos.

La generación de un organismo transformador (o de una célula o tejido transformados) requiere introducción del ADN, ARN o proteína en cuestión en la célula anfitriona relevante.

Hay disponible una multiplicidad de métodos para este procedimiento, el cual se denomina transformación (o transducción o transfección) (Keown et al., (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). Por ejemplo puede introducirse ADN o ARN directamente por microinyección o por bombardeo con micropartículas recubiertas con ADN. También la célula puede ser permeabilizada químicamente, por ejemplo utilizando polietilen glicol, de tal manera que el ADN pueda entrar a la célula por difusión. El ADN también puede ser introducido por fusión del protoplasto con otras unidades que contienen ADN tales como minicélulas, células, lisosomas, o liposomas. Otro método adecuado de introducción de ADN es la electroporación, donde las células son permeabilizadas de manera reversible por un pulso eléctrico. Métodos adecuados han sido descritos (por ejemplo por Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

En plantas, los métodos antes descritos de transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales se explotan para la transformación transiente o estable. Métodos adecuados son especialmente transformación de protoplasto por consumo de ADN inducido por polietilen glicol, el método balístico con la pistola de genes, el cual es conocido como el método de bombardeo con partículas, electroporación, incubación de embriones secos en soluciones que contienen ADN, y microinyección.

Además de estas técnicas de transformación “directas”, la transformación también puede ser efectuada por infección bacteriana por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rizogenes. La transformación mediada por Agrobacterium es más adecuada para células vegetales de dicotiledóneas. Los métodos están descritos, por ejemplo, por Horsch RB et al. (1985) Science 225: 129f.

Cuando se utilizan agrobacterias, el casete de expresión debe ser integrado en plásmidos específicos, bien sea en un vector disparador o intermedio, o en un vector binario. Si se va a utilizar plásmido Ti o Ri para la transformación puede introducirse al menos la frontera derecha, pero en la mayoría de los casos la frontera derecha e izquierda, del plásmido de Ti o Ri de T-ADN enlazado al casete de expresión en la forma de un región flanqueante.

Se usan preferiblemente vectores binarios. Los vectores binarios son capaces de replicación tanto en E. coli como en Agrobacterium. Como regla, comprenden un gen marcador de selección y un enlazante o polienlazante flanqueado por la secuencia de frontera derecha e izquierda de T-ADN. Pueden ser transferidos directamente en Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). El gen marcador de selección permite la selección de agrobacterias transformadas y es, por ejemplo, el gen nptll, el cual confiere resistencia a la kanamicina. El Agrobacterium que actúa como organismo anfitrión en este caso debería contener ya un plásmido con la región vir. Esta última es requerida para transferir el T-ADN a la célula vegetal. Un Agrobacterium transformado de esta manera puede ser utilizado para transformar células vegetales. El uso de T-ADN para la transformación de células vegetales ha sido estudiado y descrito intensamente (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Se conocen diversos vectores binarios, algunos de los cuales son disponibles comercialmente tales como, por ejemplo, pBI101.2 o pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).

Promotores adicionales que son adecuados para la expresión en plantas han sido descritos (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:84028406).

Las técnicas de transformación directa son adecuadas para cualquier organismo y tipo celular.

El plásmido usado no necesita satisfacer ningún requerimiento particular en el caso de la inyección o electroporación de ADN o ARN en células vegetales. Los plásmidos simples tales como los de la serie pUC pueden ser utilizados. Si se van a regenerar plantas completas a partir de las células transformadas, es necesario que se localice un marcador genético seleccionable adicional en el plásmido.

Las células transformadas de manera estable, esto es, aquellas que contienen el ADN introducido integrado en el ADN de las células anfitriona, pueden seleccionarse a partir de células no transformadas cuando un marcador seleccionable es parte del ADN introducido. Ejemplos de genes que pueden actuar como marcadores son todos aquellos que son capaces de conferir resistencia a antibióticos o herbicidas (tales como Kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina) (véase más arriba). Las células transformadas que expresan tales genes marcadores son capaces de sobrevivir en la presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida correspondiente el cual mata un tipo silvestre no transformado. Se menciona antes ejemplos y comprenden preferiblemente el gen bar, el cual confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5):871-884), el gen nptll, el cual confiere resistencia a la kanamicina, el gen hpt, que confiere resistencia a la higromicina, o el gen EPSP, el cual confiere resistencia al herbicida glifosfato. El marcador de selección permite la selección de células transformadas a partir de células no transformadas (Mcormick et al. (1988) Plant Cell Reports 5:81-84). Las plantas de resultantes pueden ser cruzadas e hibridadas de la manera habitual. Deben cultivarse dos o más generaciones con el fin de asegurar que la integración genómica es estable y hereditaria.

Los métodos antes mencionados se describen, por ejemplo, en Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R Wu, Academic Press, pp. 128-143 and in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). El constructo que se va a expresar es clonado preferiblemente en un vector que es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f).

Tan pronto como una célula vegetal transformada ha sido generada, puede obtenerse una planta completa utilizando métodos conocidos para el experimentado en la técnica. Por ejemplo, se utilizan cultivos de callus como material de partida. El desarrollo de brotes y raíces puede ser inducido en esta biomasa celular todavía no diferenciada en una manera conocida. Los brotes obtenidos pueden ser plantados y cruzados.

El operario experimentado está familiarizado con tales métodos para la regeneración de plantas intactas a partir de células vegetales y partes de plantas. Los métodos para hacerlo están descritos, por ejemplo, en Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533.

El método de acuerdo con la invención puede ser combinado ventajosamente con métodos adicionales que aportan resistencia a patógenos (por ejemplo insectos, hongos, bacterias, nematodos y similares), resistencia al estrés u otra mejora de las propiedades de las plantas. Se mencionan ejemplos, entre otros, por Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; páginas 487-96.

Cepas adecuadas de Agrobacterium tumefaciens y vectores así como la transformación de agrobacteria y el crecimiento apropiado y medios de selección son bien conocidos para los experimentados en la técnica y están descritos en la técnica anterior (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12(1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963-976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. In: Plant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin and Schilperoort (Eds.), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287).

Aunque el uso de Agrobacterium tumefaciens es preferido en el método de la invención, pueden utilizarse otras cepas de Agrobacterium, tales como Agrobacterium rhizogenes, por ejemplo si se desea un fenotipo conferido por dicha cepa.

La transformación de la mayoría de las plantas dicotiledóneas es posible con los métodos descritos anteriormente. Pero también para la transformación de plantas monocotiledóneas se han desarrollado varias técnicas de transformación exitosas. Estás incluyen la transformación utilizando métodos biolísticos, por ejemplo, los descritos anteriormente así como transformación del protoplasto, electroporación de células parcialmente permeabilizadas, introducción de ADN utilizando fibras de vidrio, etc.

El término “transformación” tal como se utiliza aquí, se refiere a la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula anfitriona, con independencia del método utilizado para la transferencia. El polinucleótido puede ser introducido de manera transiente o estable en la célula anfitriona y puede ser mantenido sin integrarse, por ejemplo, como un plásmido o un enlace quimérico, o alternativamente, puede ser integrado en el genoma anfitrión. La célula vegetal transformada resultante puede ser utilizada entonces para regenerar una planta transformada de una manera conocida por una persona experimentada.

De acuerdo con lo anterior, en una realización, la presente invención se relaciona con una célula vegetal que comprende el polinucleótido del vector de la presente divulgación. Preferiblemente, la célula comprende un polinucleótido o vector que confieren resistencia adicional, siendo más preferido un vector o polinucleótido que codifica Rpi-blb.

Así, la presente invención se relaciona también con células de una planta transgénica que contiene “preferiblemente integrada de manera estable en el genoma” un polinucleótido de acuerdo con la divulgación enlazado a elementos reguladores que permiten la expresión del polinucleótido en células vegetales y donde el polinucleótido es foráneo a la célula vegetal transgénica. Para el significado de foráneo, véase más arriba.

Así, la presente invención también se relaciona con plantas transgénicas y tejidos vegetales que comprenden plantas transgénicas de acuerdo con la invención. Debido a la (sobre)expresión de un polipéptido de la divulgación, dicha planta

o tejidos vegetales son resistentes a patógenos de plantas, en particular a oomicetes. Preferiblemente las plantas son también resistentes a otros patógenos, por ejemplo a patógenos de plantas chupadores. Se describen aquí patógenos adicionales. Se prefiere que dichas plantas o tejidos vegetales sean resistentes a las especies Phytophthora, más preferiblemente a P. infestans.

Por ejemplo, para obtener plantas transgénicas que expresen el gen Rpi-blb2, su región de codificación puede ser clonada, por ejemplo, en el vector pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant-Science, 66, 1990, 221-230). Por ejemplo, siguiendo una tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR) la región de codificación de la Rpi-blb2 puede ser amplificado utilizando cebadores como se muestra en los ejemplo y figuras, por ejemplo en la Tabla 3b en particular ARF1F y ARF1R. El fragmento de PCR obtenido puede ser purificado y subsecuentemente el fragmento puede ser clonado en un vector. El vector resultante puede ser transferido a Agrobacterium tumefaciens. Está cepa también puede ser utilizada para transformar y puede seleccionarse plantas transgénicas. En otra realización, la presente invención se relaciona con una planta transgénica o tejido vegetal que comprende la célula vegetal de la presente invención.

“Transgénico” por ejemplo con respecto a una secuencia de un ácido nucleico, o un casete de expresión o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con dicha secuencia de ácido nucleico, casete de expresión o vector, se refiere a todos aquellos constructos que se originan por métodos recombinantes en los cuales

a) la secuencia de ácido nucleico de la Rpi-blb2, o

b) una secuencia de control genético enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico de la Rpi-blb2, por ejemplo un promotor, o

c) (a) y (b)

no están localizados en su ambiente genético natural o han sido modificados por métodos recombinantes, siendo un ejemplo de una modificación, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Ambiente genético natural se refiere al locus cromosómico natural en el organismo de origen, o a la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferiblemente al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una secuencia de al menos 50 bp, preferiblemente al menos 500 bp, especialmente de manera preferible al menos 1000 bp, muy especialmente preferible a al menos 5000 bp, de longitud. Un casete de expresión de origen natural – por ejemplo la combinación de origen natural del promotor de la Rpi-blb2 correspondiente gen de la Rpi-blb2 - se convierte en un casete de expresión transgénica cuando es modificado por métodos no naturales, sintéticos, “artificiales” tales como, por ejemplo, la mutagenización. Tales métodos han sido descritos (US 5,565,350; WO 00/15815; véase también más arriba).

Adicionalmente, la célula vegetal, el tejido vegetal o la planta puede ser también transformados de tal manera que las enzimas y proteínas son (sobre)expresadas cuya expresión soporta un incremento de la resistencia de la planta o del tejido vegetal, por ejemplo, Rpi-blb (sinónimos Rpi-blb1, RB o Sbu1), R1, Rpi-mcd, R-ber (sinónimo R12), Rpi1, Rpiblb3, Rpi-ABPT1, R2, R3a o R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, proteínas Ph-1, Ph-2 y/o Ph-3. Se prefiere la coexpresión de la Rpi-blb y Rpi-blb2.

La presente invención también se relaciona con tejidos vegetales cultivados que comprenden células de plantas transgénicas como se describió anteriormente las cuales muestran la expresión de una proteína de acuerdo con la divulgación.

Los organismos anfitriones o de partida que son preferidos como organismos transgénicos son principalmente plantas de acuerdo con la definición anterior. Incluidos dentro del alcance de la invención están todos los géneros y especies de plantas superiores e inferiores del Reino Vegetal. Se incluyen adicionalmente plantas maduras, semillas, brotes y plantones, y partes, material de propagación de cultivos derivados de los mismos, por ejemplo cultivos celulares que tengan una actividad de la Rpi-blb2 incrementada. Con plantas maduras se hace referencia a plantas en cualquier etapa de desarrollo más allá del plantón. El término plantón se refiere a una planta inmadura joven en una etapa de desarrollo temprana.

Cualquier planta transformada de acuerdo con la invención puede ser utilizada en un esquema de cruce convencional o en propagación de plantas in vitro para producir plantas más transformadas con las mismas características y/o pueden ser utilizadas para introducir las mismas características en otras variedades de la misma o de especies relacionadas. Tales plantas también son parte de la invención. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas genéticamente también contienen la misma característica y son parte de la invención. Como se mencionó anteriormente, la presente invención es el principio aplicable a cualquier planta y cultivo que pueda ser transformado con cualquiera de los métodos de transformación conocidas por los experimentados en la técnica.

En general, las plantas que pueden ser modificadas de acuerdo con la invención y que muestran sobreexpresión de una proteína de acuerdo con la divulgación o también una reducción de la síntesis de tal proteína pueden derivarse a partir de cualquier especie vegetal deseada. Pueden ser plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, preferiblemente pertenecen a especies de plantas de interés en agricultura, cultivo de bosques o de interés en horticultura, tales como plantas de cultivo (por ejemplo maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, avena, etc.), patatas, plantas productoras de aceite (por ejemplo colza, girasol, cacahuete, soja, etc.), algodón, remolacha de azúcar, caña de azúcar, plantas leguminosas (por ejemplo, judías, guisantes, etc.), plantas para producción de madera, preferiblemente árboles, etc. Sin embargo, se prefieren plantas que puedan ser infectadas por especies de Phytophthora.

De acuerdo con lo anterior, en una realización la planta, célula vegetal o tejido vegetal de la invención o producidos de acuerdo con el método de la invención se selecciona del grupo consistente de Menyanthaceae, Solanaceae, Sclerophiloacaceae, Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Polemoniaceae, and Hydrophilolaceae de acuerdo con la Systema Naturae 2000, Brands, S.J., Amsterdam o tiene su origen en las mismas. Preferiblemente dicha planta, célula vegetal o tejido vegetal de la invención producidos de acuerdo con el método de la invención es una Solanaceae, preferiblemente seleccionada del grupo de Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Fabiana, Franciscea, Hyoscyamus, Lycium, Mandragora, Nicandra, Nicotiana, Petunia, Physalis, Schizanthus y Solanum de acuerdo con el Systema Naturae 2000, Brands, S.J., Amsterdam o tiene su origen en las mismas.

Más preferiblemente, la planta, célula vegetal o tejido vegetal de la invención o producidos de acuerdo con el método de la presente invención es un S. bulbocastanum, S. tuberosum (patata), S. lycopersicum (tomate), petunia, S. betaceum (tomate de árbol), S. muricatum (melón pera) o S.melongena (berenjena). Aún más preferiblemente, la planta, tejido vegetal o célula vegetal es un S. tuberosum o S. lycopersicum. Más preferido es el S. tuberosum. En otros sistemas la clasificación será similar. La persona experimentada en la técnica conoce las diferencias, por ejemplo, más comunes, el tomate es denominado sistemáticamente Lycopersicon lyropersicum (L.) Karsten ex Farwell.

En aún otro aspecto, la invención también se relaciona con partes recolectables y con material de propagación de las plantas transgénicas de acuerdo con la invención las cuales bien contienen células vegetales transgénicas se expresa en una molécula de ácido nucleico y/o el polipéptido de acuerdo con la divulgación o que contienen células que muestran un nivel incrementado del polipéptido de la divulgación.

Partes recolectables pueden ser en principio cualquier parte útil de una planta, por ejemplo, flores, polen, plantones, tubérculos, hojas, tallos, frutos, semillas, raíces, etc. El material de propagación incluye, por ejemplo, semillas, frutos, cortes, plantones, tubérculos, enraizamientos, etc. Se prefieren patatas, tomates, berenjenas o melones pera como material recolectable o de propagación. En el caso de que la planta de la invención sea petunia, la presente invención se relaciona en una realización con las flores de petunia como parte recolectable.

La divulgación se relaciona adicionalmente con el uso de organismos transgénicos de acuerdo con la invención y con las células, cultivos celulares, partes – tales como, por ejemplo raíces, hojas y similares en el caso de organismos vegetales transgénicos – derivados de ellos, y con material de propagación transgénico tales como semillas o frutos, para la producción de materiales alimenticios o materiales de pienso, productos farmacéuticos o químicos finos. En particular, las patatas pueden servir para la producción de productos químicos finos.

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se relaciona con el uso del polinucleótido, la planta, célula vegetal o tejido vegetal, el vector, o el polipéptido de la presente divulgación haciendo ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, lípidos, ésteres cerosos, (poli)sacáridos y/o polihidroxi alcanoatos, y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esteroides, colesterol, prostaglandina, triacil gliceroles, ácidos biliares y/o cuerpos cetónicos producidos, por células, tejidos y/o plantas. Hay un cierto número de mecanismos mediante los cuales pueden ser afectados el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, ésteres cerosos, lípidos, (poli)sacáridos y/o polihidroxialcanoatos y/o sus productos de metabolismo, en particular hormonas esteroidales, colesterol, triacil gliceroles, prostaglandina, ácidos biliares y/o cuerpos cetónicos o adicionalmente de los productos químicos finos antes definidos que incorporan tal proteína alterada. En el caso de plantas, por ejemplo el incremento de la expresión de la acetil-CoA que es la base para muchos productos, por ejemplo ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, lípidos (poli)sacáridos, ésteres cerosos y/o polihidroxialcanoatos, y/o sus productos de metabolismo, en particular, prostaglandina, hormonas esteroidales, colesterol, triacil gliceroles, ácidos biliares y/o cuerpos cetónicos en una célula, puede ser posible incrementar la cantidad de los dichos compuestos producidos permitiendo así una mayor facilidad de recolección y purificación o en caso de las plantas una partición más eficiente. Además, pueden requerirse uno o más de dichos productos de metabolismo, cantidades incrementadas de los cofactores, moléculas precursoras y compuestos intermedios para las rutas biosintéticas apropiadas. Por lo tanto, al incrementar el número y/o actividad de proteínas transportadoras involucradas en la importación de nutrientes, tales como fuentes de carbono (esto es, azúcares), fuentes de nitrógeno (esto es, aminoácidos, sales de amonio), fosfato y azufre, puede ser posible mejorar la producción de la acetil CoA y sus productos de metabolismo como se mencionó anteriormente, debido a la eliminación de cualquier limitación de suministro de nutrientes en el proceso biosintético. En particular, puede ser posible incrementar el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de dichos compuestos, por ejemplo ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, ésteres cerosos, lípidos, (poli) sacáridos y/o polihidroxialcanoatos, y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esteroidales, colesterol, prostaglandina, triacil gliceroles, ácidos biliares y/o moléculas de cuerpos cetónicos etc. en plantas.

Se prefiere adicionalmente, un método para la producción recombinante de agentes farmacéuticos o químicos finos en organismos anfitriones, en donde un organismo anfitrión es transformado con uno de los casetes de expresión antes descritos y este casete de expresión comprende uno o más genes estructurales que codifican el producto químico fino deseado o catalizan la biosíntesis del producto químico fino deseado, el organismos anfitrión transformado es cultivado, y el producto químico fino deseado es aislado a partir del medio de cultivo. Este método puede ser aplicado ampliamente a productos químicos finos tales como enzimas, vitaminas, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos y sabores naturales y sintéticos, sustancias aromáticas y colorantes. Especialmente preferida es la producción de tocoferoles y tocotrienoles y carotenoides. Los organismos anfitriones transformados se cultivan y los productos se aíslan a partir de los organismos anfitriones o del medio de cultivo por métodos conocidos por un operario experimentado. La producción de agentes farmacéuticos tales como, por ejemplo, anticuerpos o vacunas, es descrita por Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236:275-92.

En una realización, la presente invención también se relaciona con el uso del polinucleótido, el vector o el polipéptido de la presente invención para producir una planta o un tejido vegetal, órgano vegetal o célula vegetal o una parte de los mismos resistente a lo dicho.

Adicionalmente, la presente divulgación se relaciona con un método para la identificación de un compuesto que estimula la resistencia a dicho patógeno vegetal que comprende:

a) poner en contacto células que expresan el polipéptido de la presente invención o su ARNm con un compuesto candidato bajo condiciones de cultivo celular;

b) probar un incremento en la expresión de dicho polipéptido o dicho ARNm;

c) comparar el nivel de expresión a una respuesta estándar hecha en ausencia de dicho compuesto candidato; con lo cual una expresión incrementada sobre el estándar indica que el compuesto está estimulando la resistencia.

Dicho compuesto puede ser químicamente sintetizado o producido microbiológicamente y/o comprendido en, por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos, por ejemplo patógenos. Adicionalmente, dicho compuesto puede ser conocido en la técnica pero hasta ahora no se ha conocido por ser capaz de suprimir o activar la Rpi-blb2. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede comprender un cultivo celular o de tejidos. Parámetros adecuados para el método de la divulgación conocidos para la persona experimentada en la técnica y están, por ejemplo, descritos en general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, third edition (1994), en particular el capítulo 17. Los compuestos pueden ser agregados, por ejemplo, a la mezcla de reacción, medio de cultivo, inyectados en la célula o asperjado sobre la planta.

Si una muestra que contiene un compuesto es identificada en el método de la divulgación, entonces es bien posible aislar el compuesto de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de activar o incrementar la resistencia de dicho patógeno, o se puede subdividir adicionalmente la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de compuestos diferentes, de tal manera que se reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y se repite el método con subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden ser ejecutadas varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método de la divulgación contenga solamente un número limitado o solamente una sustancia. Preferiblemente dicha muestra comprende sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más preferiblemente dichas sustancias son idénticas. Preferiblemente, el compuesto identificado de acuerdo con el método antes descrito o su derivado se formula adicionalmente en una forma adecuada para la aplicación en el cultivo de plantas o células vegetales o cultivo de tejidos.

Los compuestos que pueden ser probados o identificados de acuerdo con un método de la divulgación pueden ser bibliotecas de expresión por ejemplo, bibliotecas de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, ADN o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y referencias citadas anteriormente). Dichos compuestos también pueden ser derivados funcionales o análogos de inhibidores o activadores conocidos. Los métodos para la preparación de derivados químicos y análogos son bien conocidos para los experimentados en la técnica y están descritos, por ejemplo, en Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Adicionalmente, dichos derivados y análogos pueden ser probados en cuanto a sus efectos de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los peptidomiméticos y/o el diseño auxiliado por ordenador de derivados y análogos apropiados pueden utilizarse, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. La célula o tejido que puede ser empleada en el método de la divulgación preferiblemente es una célula anfitriona, célula vegetal o tejido vegetal de la invención descritos en las realizaciones hasta aquí.

La determinación de si un compuesto es capaz de suprimir o activar dicha resistencia puede hacerse, como se describe en los ejemplos, en particular a través de la determinación del índice de esporulación. El activador identificado por el método antes descrito puede mostrarse útil como fungicida o protector de cultivos. Así, la divulgación se relaciona con un compuesto obtenido o identificado de acuerdo con el método de la divulgación, siendo dicho compuesto un agonista de la Rpi-blb2.

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se relaciona adicionalmente con un compuesto identificado por el método de la presente divulgación.

Dicho compuesto es, por ejemplo, un homólogo de la Rpi-blb2. Homólogos de los polipéptidos de la presente divulgación `pueden generarse por mutagénesis, por ejemplo, mutación o truncación en un punto discreto de la Rpiblb2. Tal como se utiliza aquí, el término “homólogo” se refiere a una variante de la proteína que actúa como agonista de la actividad de la Rpi-blb2. Un agonista de dicha proteína puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto de las actividades biológicas de la Rpi-blb2.

La divulgación se relaciona con un anticuerpo que reconoce específicamente el compuesto de la presente divulgación.

La divulgación también se relaciona con una composición de diagnóstico que comprende al menos uno de los polinucleótidos, moléculas de ácidos nucleicos, vectores, proteínas, anticuerpos o compuestos antes mencionados de la divulgación y opcionalmente medios adecuados para la detección.

La composición diagnóstica de la presente divulgación es adecuada para el aislamiento de ARNm a partir de una célula y poner en contacto el ARNm así obtenido con una sonda que comprende una sonda de ácido nucleico como se describió anteriormente bajo las condiciones de hibridación, detectando la presencia de ARNm hibridado en la sonda, y por lo tanto detectando la expresión de la proteína en la célula. Métodos adicionales para detectar la presencia de una proteína de acuerdo con la presente divulgación comprende inmunotécnicas muy conocidas en el arte, por ejemplo el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima. Adicionalmente, es posible utilizar las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación en particular los marcadores descritos en los ejemplo, por ejemplo, en las tablas 3a o 3b como marcadores moleculares o cebadores en cultivo de plantas.

Medios adecuados para la detección son bien conocidos para una persona experimentada en la técnica, por ejemplo, reguladores y soluciones para ensayos de hibridación, por ejemplo las soluciones y reguladores antes mencionados, adicionalmente y medios para inmunoprecipìtaciones Southern-, Western-, Northern- etc. como por ejemplo los descritos en Sambrook et al que son conocidos.

La presente divulgación también se relaciona con un kit que comprende el polinucleótido, el vector, la célula anfitriona, el polipéptido, el ácido nucleico antisentido, el anticuerpo, la célula vegetal, la planta o tejido de la planta, la parte recolectable, el material de propagación o el compuesto de la divulgación.

Los compuestos del kit de la presente divulgación pueden ser empacados en contenedores tales como viales, opcionalmente con/en reguladores y/o en solución. Si es apropiado, uno o más de dichos componentes pueden ser empacados en uno y el mismo contenedor. Adicional o alternativamente, uno o más de dichos componentes puede ser adsorbido en un soporte sólido, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa, una placa de vidrio, un chip, o una membrana de nilón o el pozo de una placa de microtitulación. El kit puede ser utilizado para cualquiera de los métodos y realizaciones aquí descritos, por ejemplo, para la producción de células anfitrionas, plantas transgénicas, composiciones farmacéuticas, la detección de secuencias homólogas, identificación de antagonistas o agonistas, etc.

Adicionalmente, el kit puede comprender instrucciones para el uso del kit para cualquiera de dichas realizaciones, en particular para su uso para incrementar la resistencia a uno o más de dicho patógenos de una célula vegetal, tejido vegetal o planta.

En una realización preferida dicho kit comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica uno o más de la una o más de las proteínas de resistencia antes mencionadas, preferiblemente la Rpi-blb2 y/o un anticuerpo, un vector, una célula huésped, un ácido nucleico antisentido, una célula vegetal o tejido vegetal y/o una planta relacionados con dicha proteína de resistencia, preferiblemente con la Rpi-blb.

En una realización adicional, la presente invención se relaciona con un método para la producción de un protector de cultivos que provee el polinucleótido, el vector o el polipéptido de la divulgación que comprende las etapas del método de la invención y la formulación del polinucleótido, identificados el vector o el polipéptido de la invención o el compuesto en la etapa (c) de dicho método en una forma aplicable como composición agrícola para plantas.

En otra realización, la presente invención se relaciona con un método para la producción de una composición protectora de cultivos que comprende las etapas del método de la presente invención; y

(a) utilizar el compuesto identificado en la etapa (c) en una forma aceptable como composición agrícola.

“Aceptable como composición agrícola” se entiende que tal composición está de acuerdo con las leyes que regulan el contenido de fungicidas, nutrientes vegetales, herbicidas, etc. Preferiblemente tal composición no tiene ningún riesgo para las plantas protegidas y los animales (incluidos los humanos) alimentados con las mismas.

La presente divulgación también es pertinente a varias realizaciones relativas con usos y métodos adicionales. El

5 polinucleótido, polipéptido, homólogos de proteína, proteínas de fusión, cebadores, vectores, células anfitrionas, descritas aquí pueden ser utilizadas en uno o más de los siguientes métodos: identificación de las plantas resistente a patógenos de plantas tal como se mencionó y organismos relacionados; mapeo de genomas; identificación y localización de secuencias de interés, estudios evolutivos; determinación de regiones requeridas por función; modulación de una actividad.

10 De acuerdo con lo anterior, los polinucleótidos de la presente divulgación tienen una variedad de usos. Primero, pueden ser utilizados para identificar un organismo como S. bulbocastanum o un pariente cercano del mismo. También, pueden ser utilizados para identificar la presencia de S. bulbocastanum o un pariente del mismo en una población mixta de plantas. Al sondear el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de plantas bajo condiciones restrictivas con una sonda que barre una región del gen de la presente divulgación que es única para este S.

15 bulbocastanum, se puede establecer si la presente invención ha sido utilizada o si el S. bulbocastanum es un pariente, por ejemplo, un pariente cercano, y está presente.

Adicionalmente, el polinucleótido de la divulgación puede ser suficientemente homólogo a las secuencias de especies relacionadas de tal manera que estas moléculas de ácido nucleico puedan servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en un organismo relacionado.

20 Los polinucleótidos de la divulgación también son útiles para estudios estructurales evolutivos y de proteínas. Por comparación de las secuencias del Rpi-blb2 de la presente invención a aquellos que codifican enzimas similares para otros organismos, puede establecerse la relación evolutiva de los organismos. De la misma forma, tal comparación permite un establecimiento de aquellas regiones de las secuencias que son conservadas y las que no, lo cual puede ayudar en la determinación de estas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima.

25 Este tipo de determinación es de valor para los estudios de ingeniería de proteínas y pueden dar un indicativo de lo que la proteína puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder su función.

Estas y otras realizaciones se divulgan y abarcan mediante la descripción y ejemplos de la presente invención. Literatura adicional concerniente a cualquiera de los métodos, usos y compuestos que se van a emplear de acuerdo con la presente invención puede ser recuperada a partir de bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos 30 electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública “Medina” puede ser utilizada estando disponible en internet, por ejemplo, bajo HTTP.//wwwncbi.nlm.nih.gov/Puede/medline.html. bases de datos y direcciones adicionales, tales como hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/, hftp://www.infobiogen.fr/,hftp://www.fmi.ch/biology/research-tools.html, hftp://www.tigr.org/, son conocidos por las personas experimentadas en la técnica y también pueden ser obtenidas utilizando, por ejemplo, hftp://www.lycos.com. Una supervisión de la información de patentes en biotecnología y una búsqueda de fuentes

35 relevantes de información de patentes útiles para la búsqueda retrospectiva para cuidados actuales se da en Burks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Tablas:

Tabla 1: Secuencias:

Tabla 2. Segregación de resistencia en 2851 clones de progenie de poblaciones de mapeado BC4 de ARG 95-3 y ARP

40 96-11 en el ensayo de campo de 2000 en Marínese, Países Bajos. Número de clones clasificados por tener un fenotipo resistente, susceptible o desconocido, se presenta con porcentajes en paréntesis.

Población de

No clones con No clones con No clones con

Mapeo

fenotipo fenotipo fenotipo Totales

susceptible

resistente desconocido

ARG 95-3

846 (37) 886 (39) 551 (24) 2283

ARP 96-11

256 (45) 170 (30) 142 (25) 568

Totales

1102 (39) 1156 (37) 693 (24) 2851

Tabla 3A. Revisión de marcadores usados para el mapeo de la Rpi-blb2

Marcador

Ori1) Secuencia Temperatura Enzima de

de fusión (°C)

restricción2)

E46M52

F TTGTGGTTATCGATGAGAAT 56,5 SCAR (b)

R

GAAACAACAGCAGGATAGTGAG

E46M52e

F TTGTGGTTATCGATGAGAAT 61 SCAR (a,b);Mbol (c)

R

GAAACAACAGCAGGATAGTGAG

E40M58

F GAATTCAGCACAAATACCAA 50 DdeI (a)

R

TTAACGTTTACTATCACGAG

E40M58e

F GTAGAAACAGCAGCCTCATAAGC 55 SCAR (a)

R

TTCTGCCTAATTGCCCTGTG

S1E00

F GGGGTTGGGAAGACAACGACAC 50 AFLP

R

AATTCCAAGATACAGTCAAATAC

41 L

F AGGCAGGATTAACAGTAGAAG 58 Taql (a)

R

CATGCTTTTAGGAAGAAGCTC

36L

F TTGAGACAAAGCAGCTCCAC 59 Apol (a,b)

R

ACGTTTCTCACACCTACAGG

69L

F TGATGGCACGTTTGATCGTG 61 Taql (a,b);Hpall (c)

R

TAAGATCCAAACCAGCCACC

69R

F CCTTATCACACATGTGGCTAC 58 RsaI( a,b); Apol (c)

R

ATTGAAACGGAGGAAGTACAAC

141R

F TTCTTCATATGGCAGACCAAC 60 Rsal (a,b); DdeI (c)

R

CTACTCTGCTGACATGCAGG

24L

F GAGATTCTCAAAGGTGTCTTCC 60 SCAR (a,b,c)

R

AACCTGTGCTTTCCCATTCG

24R

F CTTTCACAAGCGTCACTTTGG 58 SCAR (a,b)

R

TAAAAAGAATCAACAGGGCAAC

14L

F ACGACTGCTCAAAGTTGGCC 58 SCAR (a,b,c)

R

CCAAGAAGCCAGTTGAGAGC

123L

F GTAGATTACACTATGGATATGG 60 SCAR (a,b)

R

CAGTTAGCAGCAATGTCAGC

Marcador

Ori1) Secuencia Temperatura Enzima de

de fusión (°C)

restricción2)

123L2

F ATTCAACTAGGCCAAAAGTGG 59 SCAR (a,b); DraI (c)

R

CCAGGTAGGTGTTTTCTTCC

123R

F GTTCTAAGTCAGATGCCACC 62 SCAR (a,b)

R

AAGTGCTCCAACACGAGCC

133R

F TGAGTTCTCTTACCCTGCG 60 SCAR (a,b)

R

GGATATCCAGCATCAATGCC

133R2

F GGTGAGCCTCCTTGCATTCC 60 SCAR (a,b)

R

CCTGAGGGAAGATGTCACG

99L

F CCTAGTTTAGAGTGAGTAGAC 58 SCAR (a,b)

R

GTGATATATTGCTCAAGGATCC

113R

F GTTGCTGGCTGTCACTGATC 59 SCAR (a,b)

R

GTGATGTGCAGGGTTCAAGG

67L

F GATTAGTGTAGATCTTAGCTTG 62 Mbol (a,b)

R

AAATCTCTCTCACAATTATCCC

112L

F CTATTGACTGAACCTGCTGAG 56 HaeIII (a); HinfI (c)

R

TGAAGTCATTTAGTCCACAGC

CT216(RFLP)

F AGATCGGAGTGTGAACATGG 56

R

CTTCTACTTCTAGTCGACTGC

CT216

F CGTAGTCCATCTGAAGCTCC 65 SCAR (a, b)

R

TCTTCTTCTGCTAGTCGTCG

CT119

F ACTATTCTCACGTAAGGGGACAC 60 Hindlll (a,b)

R

GTGTACATGTATGAAACTCTAGC

CT119N

F GTTCCTTTCAATCAGAAAGTAG 55 SCAR (a)

R

CTTTGGATGAGTCAAAAGGCT

14L24L

F univ14L 60 Cfol (c)

R

univ24L

SPB30L

F CAAGTTACGGCAACCAAGAG 57 HpaII (c)

R

CTTTGACACAGTGTTAGAATGC

Marcador

Ori1) Secuencia Temperatura Enzima de

de fusión (°C)

restricción2)

SPB39L

F CGTGATCTAGGAGTTACGAC 52 SCAR (c)

R CTTATTTTAAATACAAGACATCTGG

24L9spec F univ. 14L 56 HhaI (c) R CAGAGGAAAGTCAACCAACG

24Lspec F univ. 14L 60 CfoI (c) R CAGAGGAAAGTCAACCAACG

NptII F TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA 70 R AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG

M13 F TGTAAAACGACGGCCAGT 55

R GGAAACAGCTATGACCATG

1) Ori: Orientación del cebador; F: cebador de avance; R: cebadores de reversa

2) a: ARG95-3, b: ARP96-11, c: B6a

Tabla 3B. Revisión de cebadores usados para el mapeo de la Rpi-blb2

Cebador Ori Secuencia1) 1) N=A+T+G+C, S=G+C,W=A+T Tabla 4. Complementación de susceptibilidad a mildiú en patata

ARO 73

F TTCAGCACAAATACCAAT

ARO 74

R GATGTTCCCCTTCTTTTA

ARO 77

R TTGTGGTTATCGATGAGAAT

ARO 79

R ACCTGGCGTTCCTTATTTTT

Cebador

Ori Secuencia1)

ARO 94

NGTCASWGANAWGAA

ARO 128

F GATGGAGCGGAAAAGCCGGTG

ARO 129

F GGTGTTTTGTAGCATCTCCAG

ARO 295

CCATGATTACGCCAAGCTGG

ARO 296

GGTTTTCCCAGTCACGACGT

univ14L

F AGAAAGCTCACCAGTGGACC

univ24L

R ATTTATGGCTGCAGAGGACC

123Mi

R AAGTCCAATTGCTCATCCATC

14L2

R TGCACCATGCACGAAGGTC

Cebador

Ori Secuencia1)

24L2

F CAATWTTGGTTCCCGAAATTGG

ARF1F

F ATGGAAAAACGAAAAGATAATGAAG

ARF1R

R CTACTTAAATAACGGGATATCCTTC

ARO 602

F CCCATGACTCCTTGAGTTTG

S1

GGTGGGGTTGGGAAGACAACG

EcoR1+0

GTAGACTGCGTACCAATTC

MseI+0

GATGAGTCCTGAGTAA

ARO 769

GTGCTTCATTCAAACTCAAGGAG

ARO 770

CTGAACTAGAAAAACTCACTGTAGA

ARO 771

GTTTGAAAAGATTGCAATTGCATG

ARO 772

CTCAGCCATCAGTTGAAACAGAGA

ARO 774

GAGAGAGATTCAAGAGGAGGAAGC

cv Impala cv Kondor Plantas/ Plantas que Plantas/ Plantas que transformantes contienen transformantes contienen

Biblioteca Fuente que contienen plantas que contienen plantas BAC BAC Genotipo1 RGC R/RGC RGC R/RGC ARD 1197-16 24 R0 (RGC1) 12/15a 0/12

8/10b 0/8 24 R0 (RGC2) 8/11a 0/8 5/6b 0/5 24 R0 (RGC3) 11/13a 0/11

5/7b 0/5 211 R0 (RGC4) 5/7a 0/5 10/12a 0/10 242 R0 (RGC4) 5/7a 0/5 8/8a 0/8 211 R0 (RGC5) 5/7a 4/5 12/13a 12/12

cv Impala cv Kondor Plantas/ Plantas que Plantas/ Plantas que transformantes contienen transformantes contienen

Biblioteca Fuente que contienen plantas que contienen plantas BAC BAC Genotipo1 RGC R/RGC RGC R/RGC

ARD 211 R0 (RGC6) ----211 R0 (RGC24L) ---

Blb 2002 SPB39 R0 (RGC4) 5/6a 0/5 3/3a 0/3

SPB39 R0 (RGC5) 11/15ª 11/11 8/8a 7/8

SPB39 R0 (RGC6) 3/3a 0/3 6/6a 0/6

SPB30 R0 (RGC7) 3/4a 0/3 9/9a 0/9

SPB30 R0 (RGC8) 1/1a 0/1 --

SPB39 R0 (24L) --

R0(pBINPLUS) 3/3 0/3 8/10 0/8 Los genotipos 1 R0 son transformantes primarios obtenidos a partir de la transformación de cultivares de patatas susceptible Impala o Kondor con constructos de T-ADN que contienen los candidatos para el gen Rpi-blb2 RGC1 a

RGC8 y RGC24L o un vector vacío pBINPLUS. Las cepas de Agrobacterium tumefaciens UIA143a o AGL0b fueron utilizadas para la transformación de los cultivares Impala y Kondor de patatas susceptibles a P. infestans. Tabla 5. Condiciones de ciclización para TAIL-PCR Reacción Ciclo No. Condición térmica Primaria 1 92°C (2 min), 95°C (1 min)

5 94°C (15s), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 1 94°C (15s), 30°C (3 min), con rampa hasta 72°C durante 3 min, 72°C (2 min) 10 94°C (5s), 44°C (1 min),72°C (2 min) 12a 94°C (5s), 63°C (1 min), 72°C (2 min)

94°C (5s), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (5s), 44°C (1 min), 72°C (2 min) 1

72°C (5 min) Secundaria 10a 94°C (5s), 63°C (1 min), 72°C (2 min)

94°C (5s), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (5s) 44°C (1 min), 72°C (2 min)

Reacción Ciclo No. Condición térmica

1 72°C (5 min)

Terciaria 20 94°C (10s), 44°C (1 min), 72°C (2 min)

1 72°C (5 min)

5 a estos son superciclos de nueve segmentos que consisten cada uno de dos ciclos de alta restricción y uno de restricción reducida.

Tabla 6. Complementación de susceptibilidad a mildiú en cultivo de tomate MoneyMaker por Rpi-blb2

Biblioteca BAC de Plantas/transformantes Plantas que contienen

BAC fuente Genotipo que contien en RGC plantas R/RGC

10 Blb 2002 SPB39 R0 (RGC5) 24/25 22/24

Los genotipos R0 son transformantes primarios obtenidos a partir de la transformación de cultivares de tomate susceptibles Moneymaker con el constructo T-ADN que contiene el gen RGC5 de la Rpi-blb2. Las cepas de Agrobacterium tumefaciens UIA143a fueron utilizadas para transformación del cultivar de tomate susceptible a P. infestans.

15 Las figuras muestran:

Figura 1. Representación esquemática del desarrollo de clones híbridos interespecíficos complejos designados como “ABPT” (1a) y las poblaciones de mapeo de S. tuberosum que fueron derivados a partir de dos de estos clones: clon ABPT 55 y clon ABPT 60 (1b a d). A; cultivares Solanum acaule, B; S. bulbocastanum, P; S. pureja, T; S. tubersosum, 2x ; diploide (2n=2x=24), 3x; triploide, 4x ; tetraploide, 6x ; hexaploide, cv;. Códigos en itálicas indican poblaciones de

20 mapeo.

Figura 2. Curvas de progreso de enfermedad para una ARF 87-601 y cultivares de control susceptibles (cv) Bildtstar, Eersteling y el cultivar de control resistente parcial Pimpernel en una prueba de campo para resistencia foliar a mildiú en el valle de Toluca, México, 1991. En ocho puntos de tiempo después de la plantación, el porcentaje de follaje infectado debido a infección natural por mildiú fue calificado de 1 a 9 en la escala CIP (Estrada-Ramos, 1983).

25 Figura 3. Curvas de progreso de enfermedad para clones ARF 87-507, ARF 87-601, ARF 87-801, el cultivar de control susceptible (cv) de granola y el clon AR 85-96-13 de cruzamiento resistente parcial en una prueba de campo para resistencia foliar a mildiú en la provincia de Benguet, Filipinas en 1992. En seis puntos de tiempo entre agosto 25 a noviembre 24, el porcentaje de follaje infestado con mildiú debido a una infección natural con mildiú fue calificado de 1 a 9 en la escala CIP (Estrada-Ramos, 1983).

30 Figura 4. Fenotipos típicos en clones madre tetraploides resistentes y susceptibles y clones de progenie que se agregan la resistencia mediada por Rpi-blb2 a mildiú en la prueba de campo anual en Marínese, Países Bajos, aproximadamente 6 semanas después de la inoculación con el aislado IPO82001 de P. infestans. Cinco gráficas de plantas con un clon que muestra el fenotipo resistente (dentro de la línea sólida negra) que no muestra o difícil muestra cualquier alguna lesión por esporulación y con un clon que muestra el fenotipo susceptible (dentro de la línea punteada blanca) que

35 muestra un follaje completamente infectado por mildiú.

Figura 5. Mapa genético basado en clones de la progenie 109 de la población de mapeo de S. tuberosum a ARG 95-15 que muestra siete marcadores AFLP que fueron encontrados para cosegregar con el locus Rpi-blb2. Los números a la izquierda de la línea vertical indican la distancia genética entre los marcadores que flanquean o el locus Rpi-blb2 en centimorgan (cM).

40 Figura 6. Mapa genético basado en 137 clones de progenie de una población de mapeo de S, tuberosum ARG 95-3 que muestra 15 marcadores AFLP y el marcador RGA S1E00 que fueron encontrados por cosegregar con el locus Rpi-blb2. Los fenotipos de los clones de progenie fueron obtenidos con ensayos con hojas desprendidas. Los números a la izquierda de la línea vertical indican la distancia genética entre los marcadores flanqueantes o el locus de la Rpi-blb2 en centimorgan (cM).

45 Figura 7. Mapa genético basado en 178 clones de progenie de población de mapeo de S. tuberosum ARG 95-3 que muestra 5 marcadores que fueron encontrados por cosegregar con el locus de la Rpi-blb2 en el grupo de enlazamiento 6 de S. tuberosum. Los fenotipos de los clones de la progenie fueron determinados en la prueba de campo en Marínese, Países Bajos en 1998. Los marcadores E40M58 y E46M52 fueron calificados bien sea como marcadores AFLP, CAPS, SCAR o extendidos (sufijo: e) (Tabla 3A). Parcialmente, el marcador CT119 fue calificado como marcador CT119N (Tabla 3a). El marcador CT216 fue calificado como marcador SCAR. El número a la izquierda de la línea vertical indica la distancia genética entre marcadores flanqueantes o el locus Rpi-blb2 en centimorgan (cM). Para cada marcador, el número de recombinantes entre el marcador y el fenotipo y el número total de clones de progenie calificados se da en paréntesis.

Figura 8. Mapas genéticos con base en 886 clones de progenie de población de mapeo de S. tuberosum ARG 95-3 y en 170 clones de progenie de población de mapeo de S. tuberosum ARP 96-11, que muestran marcadores que fueron encontrados por cosegregar con el locus de la Rpi-blb2 en el grupo de enlazamiento 6 de S. tuberosum. Los fenotipos de los clones de progenie fueron determinados en el ensayo de campo Marínese, Países Bajos en el año 2000. El número a la izquierda de la línea vertical indica la distancia genética entre los marcadores flanqueantes en centimorgan (cM). El intervalo de marcador que delimita la posición en el gen Rpi-blb2, con base en eventos de recombinación detectados en clones de progenie, está indicado por líneas dobles encabezadas por flechas.

Figura 9. Mapa físico de la región genómica que contiende la Rpi-blb2 en S. tuberosum (línea horizontal superior) y S. bulbocastanum (línea horizontal inferior). Las líneas verticales indican la posición relativa de los marcadores enlazados a la resistencia. Los números por encima de las líneas horizontales son el número de recombinantes identificados entre los marcadores flanqueantes en 1056 y 1899 plantas de progenie de S. tuberosum, derivados de los híbridos de especies complejas “ABPT” (Figura 1), y plantas de progenie de S. bulbocastanum respectivamente. La progenie derivada de ABPT comprende clones de tanto de las poblaciones mapeadas ARG 95-3 como de ARP 96-11. Los rectángulos representan clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de la biblioteca ARD 1197-16 BAC excepto para los clones BAC con el prefijo “Blb” los cuales fueron de la biblioteca de S. bulbocastanum Blb 2002 BAC. El intervalo del marcador que delimita la posición del gen Rpi-blb2, con base en los eventos de recombinación detectados en los clones de progenie, se indica mediante líneas dobles con cabeza de flecha. Flechas pequeñas indican posiciones de Candidatos a Gen de Resistencia (RGC).

Figura 10. Representación esquemática del desarrollo de población B6 de mapeo intraespecífica, diploide de S. bulbocastanum. Los códigos en itálica indican poblaciones de mapeo.

Figura 11. Mapa genético basado en 1899 clones de progenie de la población B6 de mapeo de S. bulbocastanum, que muestra marcadores que fueron encontrados por cosegregar con el locus de la Rpi-blb2 en el cromosoma 6 de S. bulbocastanum. Los fenotipos de los clones de progenie fueron determinados por ensayos en hojas desprendidas. El número a la izquierda de la línea vertical indica la distancia genética entre marcadores de flanqueo en centimorgan (cM). El intervalo de marcador que delimita la posición del gen Rpi-blb2, con base en eventos de recombinación detectados en clones de progenie, está indicada por una línea doble con cabeza de flecha.

Figura 12. Complementación genética para susceptibilidad al mildiú. Fenotípicos típicos de la enfermedad de hojas de patata (S. tuberosum), 6 días después de la inoculación con suspensiones de esporangiosporas de aislados de P. infestans 655-2A. Hojas derivadas de plantas cv Kondor resistentes a la kanamicina transformados con pBINPLUS (Control: A), hojas derivadas de plantas de cv Kondor que acogen BAC SPB39 derivados (B) o RGC5 derivado de BAC 211 (C), hojas derivadas de plantas de cv Impala resistentes a kanamicina transformadas con pBINPLUS (control; D), hojas derivadas de plantas de cv Impala que alojan BAC SPB39 derivado (E) o RGC5 derivado de BAC 211 (F). Los paneles A y D representan respuestas susceptibles típicas con lesiones de esporulación extensas de P. infestans. Los paneles B, C, E y F representan reacciones de resistencias típicas observadas en los sitios de inoculación sobre plantas transgénicas de patata que alojan Rpi-blb2.

Figura 13. Secuencias de ácidos nucleicos que codifican para el gen de la Rpi-blb2. A. Secuencia de codificación de ácido nucleico del gen Rpi-blb2. B. Secuencia de codificación de ácido nucleico del gen de la Rpi-blb2 incluyendo la secuencia del intrón (posición 43-128). C. Secuencia del fragmento de ADN genómico Sau3AI de 7967 bp de ARD 1197-16 BAC 211 presente en p211F-C12, uno de los dos constructos genéticos usados para la complementación genética para resistencia a mildiú. Un fragmento genómico aloja el gen Rpi-blb2 incluyendo elementos reguladores naturales necesarios para corregir la expresión del gen. El codón de iniciación (posición ATG 1546-1548) y el codón de terminación (posición TAG 5433-5435) están indefinidos. D. La secuencia del fragmento de ADN genómico 9949 bp Sau3AI de S. bulbocastanum 2002 BAC BlbSP39 presente en pSP39-20, uno de los dos constructos genéticos usados para la complementación genética para resistencia a mildiú. El fragmento genómico aloja el gen de la Rpi-blb2 incluye elementos reguladores naturales necesarios para una expresión correcta del gen. El codón de iniciación (posición ATG 1413-1415) y el codón de terminación (posición TAG 5300-5303) están subrayados.

Figura 14. Estructura del gen Rpi-blb2 putativo y secuencia de proteína deducida para Rpi-blb2. A. Representación esquemática de la estructura genética de la Rpi-blb2. Las señales horizontales indican exones. Las cajas abiertas representan secuencia de codificación. Las líneas anguladas hacia abajo indican la posición de secuencias de intrón. B. Secuencia de proteínas deducidas de la Rpi-blb2. La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia del ADN de la Rpi-blb2 se divide en tres dominios (LZ, NBS y LRR), residuos hidrofóbicos en el domino A que forman el primer residuo de repeticiones de heptad del dominio en cremallera de leucina potencial (LZ) están indefinidos. Los motivos conservados en proteínas R están escritos en minúscula y en itálica en el dominio NBS. Los residuos que coinciden con el consenso del LRR citoplasmáticos están indicados en negrilla en el dominio del LRR. Los puntos en la secuencia han sido introducidos para alinear la secuencia de consenso LRR de citoplasma LRRS.

Figura 15. Alineamiento de los productos proteínicos deducidos codificados por Rpi-blb2, Mi-1.1 y Mi-1.2. Se muestra la secuencia completa de aminoácidos de la Rpi-blb2 y los residuos de aminoácidos de Mi-1.1 y Mi-1.2 que difieren del residuo correspondiente en Rpi-blb2. Las líneas punteadas indican brechas insertadas para mantener el alineamiento óptimo. Los residuos de aminoácidos que son específicos para Rpi-blb2, cuando se comparan con las posiciones correspondientes en Mi-1.1 y Mi-1.2 son resaltadas en negrilla y rojo. Las regiones del LRR que corresponden al motivo xxLxLxxxx de la cadena �/giro � están subrayadas. Los motivos conservados en el dominio NBS están indicados en minúsculas. Una línea vertical indica la división entre las regiones CC-NBS y LRR. La posición del motivo VLDL se conserva en el tercer LRR de muchas proteínas R de plantas pero no en Rpi-blb2 como se indica mediante un rectángulo sombreado.

Figura 16. CLUSTAL W (1.82) Alineamientos de secuencias múltiples Mi1.1, Mi1.2 y ácidos nucleicos de la Rpi-blb2.

Figure 17. CLUSTAL W (1.82) Alineamientos de secuencias múltiples Mi1.1, Mi1.2 y proteínas de la Rpi-blb2.

Figura 18. Fenotipos típicos de los genes de resistencia R2 (A) y Rpi-blb2 (B) en comparación con un fenotipo susceptible de cv Bintje (C). El panel A representa una reacción de respuesta hipersensible típica con muy pocas manchas necróticas, mientras que el panel B muestra regiones necróticas grandes que contienen un bajo nivel de esporulación. El panel C representa una reacción susceptible típica con esporulación clara.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos los cuales no deben ser considerados como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Evaluación de la resistencia en clones y población en retrocruce derivados de ABPT

Los clones de BC2 ARF 87-507 y ARF 87-801 fueron seleccionados a partir de una progenie de BC2 obtenida después de dos rondas de retrocruzamiento sobre el clon hibrido ABPT de especies complejas número 55 (Figura 1a) con el cultivar Oberarnbacher Frühe de S. tuberosum susceptible a mildiú (LB), como el primer padre y cultivares de S. tuberosum Arkula (Figura 1b) y Blanka (Figura 1c) respectivamente como segundos padres. De la misma forma, se obtuvo el clon de BC2 ARF 87-601 por cruzamiento sucesivo sobre el clon de ABPT 60 con cultivares de S. tuberosum susceptibles a LB Alcmaria y Blanka (Figura 1d).

El clon ARF 87-601 fue probado como parte de una prueba de campo para seleccionar resistencia a LB en el área de Toluca en México en 1991. Se evaluó una zona de clon ARF 87-601 con siete plantas en comparación con zonas con nueve plantas cada una de los cultivares de control Bildtstar, Eersteling y Pimpernel. De acuerdo con las calificaciones de resistencia de mildiú en la lista nacional Holandesa de cultivadores de patata recomendadas de 1988, estos cultivadores de control dieron calificaciones de 3, 3 y 8 respectivamente en una escala de 3 a 8 de resistencia incrementada. El cultivar Pimpernel se considera como una fuente de resistencia parcial (Colon et al., 1985). Alrededor de 40 días después de la plantación, se estableció una infección natural por P. infestans. El desarrollo de LB en el follaje fue monitoreado entonces ocho veces durante el periodo del 16 de julio al 2 de septiembre (Figura 2). Esta fue una diferencia clara entre las curvas de progreso de la enfermedad para ARF 87-601 en comparación con los cultivadores de control. A los 74 días después de la plantación, el follaje de los cultivares de control fue completa o casi completamente infestado mientras que el clon ARF 87-601 no mostró síntomas visibles (Figura 2). Los clones ARF 87507 y ARF 87-801 y de nuevo el clon ARF 87-601 mostraron resultados comparables en una prueba de campo para seleccionar la resistencia a LB en la provincia Benguet de las Filipinas en 1992 (Figura 3). Diez plantas cada una de los tres clones BC2, cultivar de control granola y el clon cruzado moderadamente resistente a LB AR 85-96-13, el cual se utilizó como progenitor hembra para obtener AR 92-1197 (Figura 1) fueron plantados el 25 de agosto. El porcentaje de follaje infestado fue calificado seis veces después de la presencia de la infección natural por P. infestans. Las curvas de progreso de la enfermedad de los clones BC2 derivados de ABPT fueron marcadamente diferentes en comparación con el cultivar granola y el clon AR 85-96-13 (Figura 3). Los clones BC2 mostraron ninguno o pocos síntomas de LB y ningún progreso claro de la enfermedad durante el periodo de calificación mientras que el cultivar granola tenía un follaje casi completamente infestado en la tercera fecha de calificación.

Los clones ARF 87-601, ARF 87-507 y ARF 87-801 fueron utilizados para retrocruzamiento adicional con cultivares susceptibles a LB y clones de cruzamiento de S. tuberosum (Figuras 1b a 1d). Este trabajo de cruzamiento dio como resultado cuatro poblaciones de mapeo diferentes, la población BC3 tetraploide ARG 95-15, las poblaciones BC4 tetraploides ARG 95-3 y ARP 96-11 y la población BC4 diploide DP1. Durante las etapas sucesivas de este trabajo de cruzamiento se seleccionaron los clones resistentes ARF 87-507, ARF 87-601, ARF 87-801, AR 91-1263, AR 91-1292 y AR 92-1197 sobre la base de rendimiento agronómico en evaluaciones de cruzamiento en práctica común así como por selección de sus progenitores y progenie relevantes en un ensayo de campo en Marínese, Países Bajos, que fue inoculado con el aislado complejo IPO82001 de P. infestans. El clon diploide (2n=2x=24) ARD 1197-16 fue seleccionado entre la progenie de cruces AR 92-1197 x Phu 81-101 (Figura 1d), siendo conocido el último clon progenitor por su capacidad para inducir fijación de semillas partenogénicas en el progenitor hembra (Hermsen y Verdenius, 1973). Inicialmente, se encontró resistencia a LB en ARD 1197-16 en pruebas repetidas de hojas desprendidas utilizando aislados de P. infestans IPO82001, IPO 655-2A e IPO428-2 y se verifico en un ensayo de campo en 1998 en Marínese. El estatus diploide del clon ARD 1197-16 fue confirmado por citometría de flujo (Plant citometry services, Schijndel, Países Bajos).

La segregación clara de la característica de resistencia a LB en la progenie derivada de ABPT y las poblaciones de mapeo fueron observados durante años sucesivos de pruebas de campo en el sitio de ensayos de Marínese, aproximadamente 6 semanas después de la inoculación con el aislado IPO82001 de P. infestans. Típicamente, los clones resistentes no mostraron o mostraron difícilmente lesiones de esporulación mientras que los clones susceptibles mostraron un follaje completamente infestado (Figura 4). En el 2000, un total de 2851 clones de las poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11 fueron seleccionados como zonas de plantas individuales. En promedio, el 24% de los clones mostró fenotipos que no podrían ser clasificados de manera no ambigua como resistentes o susceptibles. Los clones que podrían ser clasificados como tales mostraron relaciones de segregación desde fenotipos resistentes hasta susceptibles de 1 a 1 y de 1 a 1.5 para las poblaciones ARG 95-3 y ARP 96-11, respectivamente (Tabla 2).

Los ensayos con hojas desprendidas con progenie derivada de ABPT y las poblaciones de mapeo fueron encontradas menos exactas para la fenotipificación que la selección bajo condiciones de campo. No obstante, los resultados de los ensayos con hojas desprendidas fueron considerados adecuados para la determinación inicial del fenotipo de clones individuales y así, para la construcción de poblaciones de mapeo.

Ejemplo 2: Mapeo genético del locus de resistencia de la Rpi-blb2 en poblaciones de retrocruzamiento derivadas de ABPT.

En todas las cuatro poblaciones de mapeo (Figura 1), la resistencia se segregó según se esperaba para una característica monogenética, que sugería la presencia de un alelo de resistencia dominante en un locus sencillo (Tabla 2). Este locus fue designado como locus Rpi-blb2.

Con el fin de identificar los marcadores enlazados a Rpi-blb2, se llevo a cabo un análisis de AFLP inicial con 14 combinaciones de cebadores (pc) sobre el ADN de 10 plantas de progenie resistentes y 10 susceptibles de ARG 95-15, con base en el ensayo de hojas desprendidas, incluyendo los clones progenitores. La prueba de 21 marcadores potencialmente enlazados sobre 89 plantas adicionales identifico varios marcadores relacionados con la resistencia (Figura 5). El análisis de segregación en volumen subsecuente (BSA) con 160 pc sobre 2 grupos de ADN resistente y 2 susceptible, conteniendo cada uno ADN genómico de 8 plantas de progenie resistente o susceptible de ARG 95-15, respectivamente, identifico un total de 58 marcadores de AFLP potencialmente relacionados con la resistencia (Figura 5). Cuando se probó un cierto número de estos marcadores sobre 137 plantas de progenie de ARG 95-3, también se relacionaron con la resistencia en esta población, sugiriendo que la resistencia a las dos poblaciones fue determinada por el mismo locus (Figura 6). Estos marcadores cosegregadores mapearon de 3 a 28 centimorgan (cM) y de 1 a 7.2 cM en un lado del locus en ARG 95-15 y ARG 95-3 respectivamente, sugiriendo que los Rpi-blb2 podrían estar situados a posiciones distales en un cromosoma.

Para determinar la posición de la Rpi-blb2 en el mapa genético de la patata, los dos marcadores cosegregadores AFLP E40M58 y E46M52 (Figura 6) fueron clonados en el vector pGEM-T (Promega, Países Bajos) y se secuenciaron. Los cebadores diseñados en los extremos de las secuencias de los fragmentos AFLP clonados (Tabla 3) fueron utilizados para desarrollar el marcador E40M58 con secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS) que fue encontrado como cosegregador con la característica de resistencia en 25 clones resistentes y 25 susceptibles de ARG 95-3. El marcador CAPS E40M58 fue probado subsecuentemente en 46 plantas de progenie de la población de mapeo CxE (van Eck et al., 1995). Estos datos fueron añadidos a las calificaciones de marcadores existentes de la población CxE. El análisis de enlazamiento de mapa conjunto (Stam, 1993) mapeo el E40M58 de 8 cM distal a GP79 (Gebhardt et al., 1991), posicionando la Rpi-blb2 en el brazo corto del cromosoma 6. En 178 plantas de progenie de la población ARG 95-3 no se observo recombinación entre los marcadores de la Rpi-blb2 y AFLP E40M58, E40M60 y CAPS de CT119. El marcador E46M52 de AFLP y el marcador de región amplificada caracterizada por secuencia (SCAR) se mapeo a 2.2 cM próximo al gen (Figura 7).

Ejemplo 3: Identificación del marcador de RGA enlazado a Rpi-blb2

En un intento para identificar marcadores relevantes de la funcionalidad enlazados a la resistencia, los cebadores diseñados sobre los motivos conservados del dominio NBS de genes R de plantas (Leister et al., 1996), fueron utilizados en un protocolo AFLP adaptado (RGA-AFLP) para identificar marcadores específicos (RGA) de resistencia análoga a genes.

Utilizando el cebador S1 basado en el bucle P de Leister et al. (1996) en combinación con el cebador Eco00 AFLP, un marcador específico de RGA, se desarrollo el S1E00 el cual cosegregó con la corresistencia y los marcadores E40M58 y CT119 en la población de mapeo ARG 95-3 (Figura 6 y 7).

Ejemplo 4: Desarrollo de los marcadores SCAR E40M58e y E46M52e para selección recombinante

Utilizando el ADN genómico de AR 91-1263 como patrón, el fragmento clonado del marcador de AFLP E46M52 fue extendido por TAIL-PCR. El TAIL-PCR primario fue ejecutado utilizando cebadores ARO 77 (sp1) y ARO 94 (AD). Subsecuentemente, el PCR secundario fue ejecutado utilizando ARO 128 (sp2) y el PCR terciario utilizando ARO 129 (sp3) ambos en combinación con el cebador AD. Esto dio como resultado un fragmento E46M52e que fue extendido sobre el extremo 5´ con aproximadamente 500 bp. El fragmento E46M52e fue clonado en pGEM-T y secuenciado. Se diseño un nuevo cebador de avance sobre esta secuencia y el PCR en combinación con el cebador ARO 77 dieron como resultado el marcador SCAR E46M52e que cosegrego con el fenotipo resistente en las cuatro poblaciones de mapeo de S. tuberosum y el marcador CAPS también en la población B6.

Utilizando el ADN genómico del ARD 1197-16 como patrón, el fragmento clonado del marcador de AFLP E40M58 también fue extendido por TAIL-PCR. El TAIL-PCR primario fue ejecutado tanto en las direcciones 5´ como 3´ utilizando cebadores sp1 ARO 73 (3´) y 74 (5´) en combinación con el cebador AD (294). Subsecuentemente, el PCR secundario fue ejecutado utilizando el sp2 ARO 82 o 79 respectivamente. Los fragmentos obtenidos del PCR secundario, de 750 bp desde el extremo 3´ y de 400 bp desde el extremo 5´ fueron clonados en pGEM-T y secuenciados. Sobre la base de ambas secuencias, se diseñaron dos nuevos cebadores que dieron como resultado un marcador SCAR que cosegrego con resistencia en la población de mapeo ARG 95-3 y DP1 (Tabla 3). El fragmento del marcador SCAR E40M58e podría ser amplificado en los progenitores resistentes de las poblaciones de mapeo ARG 95-3 y DP1, los cuales fueron derivados ambos del clon 55 de ABPT (Figura 1), pero la amplificación por PCR en los clones progenitores o de progenie de las poblaciones de mapeo ARP 96-11 y ARG 95-15, que fueron derivadas ambas del clon 60 de ABPT, no dieron ningún producto de PCR detectable. Se asume que esto podría haber sido causado por diferencias menores en las secuencia genómica, y por lo tanto, se extendió un fragmento AFLP por TAIL-PCR utilizando ADN genómico del clon AR 91-1292 como patrón. Se obtuvo un fragmento de E40M58e2 de aproximadamente 300 bp, se clonó y se secuencio. La comparación de la secuencia con el fragmento original del marcador AFLP E40M58 mostró que solamente en los primeros 37 bp del fragmento extendido eran idénticos. El PCR con cebadores diseñados sobre la secuencia de E40M58e2 no dieron como resultado un marcador polimórfico. Ambos marcadores extendidos E40M48e y E40M58e2 fueron probados sobre cinco clones resistentes o susceptibles de S. bulbocastanum (BGRC 8005 y 8006). Solamente el fragmento del marcador SCAR E40M58e pudo ser amplificado en cuatro clones de S. bulbocastanum, indicando que parte de la secuencia de E40M58e2 no era derivada de S. bulbocastanum. Esta observación sugirió que el E40M58e estaba localizado en la frontera del fragmento de introgresión de S. bulbocastanum en el clon AR 91-1292 y que la posición del locus Rpi-blb2 era próxima al marcador E40M58e.

Ejemplo 5: Mapeo de la Rpi-blb2 en una población de mapeo diploide derivada de material ABPT

Se selecciono un total de 149 clones de progenie de población de mapeo diploide DP1 con marcadores E40M58e y E46M52e. No se encontró recombinación entre estos marcadores sugiriendo recombinación suprimida en región genómica estudiada cuando se compara con la población de mapeo tetraploide ARG 95-3 (Figura 7). Se selecciono un subconjunto de 112 clones para resistencia a aislados de P. infestans e IPO82001, IPO655-2A e IPO428-2 en un ensayo de hojas desprendidas repetido. Once de los clones (11%) mostraron reacciones intermedias y fueron clasificadas por tener fenotipos desconocidos. Otros 51 y 50 clones fueron clasificados como resistentes y susceptibles respectivamente. Tres clones de progenie DP1-28, DP1-79 y DP1-81 fueron identificados por haber sido recombinados putativamente entre locus Rpi-blb2 y los marcadores E40M58e y E46M52e. En el 2000, se probó un subconjunto de 50 de los 112 clones fenotipificados en cuanto a la resistencia a LB en campo y en el sitio de ensayo de Marínese. Los resultados concluyentes sobre el fenotipo para la resistencia a LB fueron obtenidos para 33 de los 50 clones. El fenotipo de los clones 28 a 81 determinado con la prueba de hojas desprendidas pareció ser erróneo. Así, se concluyo que estos clones no representan eventos de recombinación entre la Rpi-blb2 y los marcadores usados. El fenotipo de clon DP1-79 no pudo ser verificado de manera concluyente bajo condiciones de campo y este clon puede representar el único evento de recombinación entre el locus Rpi-blb2 y los marcadores E40M58e y E46M52e en 101 clones de progenie de DP1 (1 cM). Puesto que se demuestra que dos marcadores, enlazados a las características de resistencia en ARG 95-15, ARG 95-3 y ARP 96-11, cosegregaron con el mismo locus para la resistencia a LB en DP1, se concluyó que el clon progenitor DP1 ARD 1197-16 era adecuado como fuente de aislamiento del gen Rpi-blb2 en una metodología de clonación basada en mapas.

Ejemplo 6: Mapeo físico sobre el locus Rpi-blb2 derivado de ABPT

El clon resistente ARD 1197-16, heterocigoto para el locus Rpi-blb2, se utilizo como ADN fuente para la construcción de la biblioteca BAC (de aquí en adelante denominada como la biblioteca ARD 1197-16 BAC. Se llevaron a cabo la preparación de ADN de alto peso molecular y la construcción de la biblioteca BAC tal como se describe en Rouppe van der Voort et al. (1999). Inicialmente, un total de 67968 clones con un tamaño de inserción promedio de 100 kb, que corresponde a aproximadamente 7 equivalentes genómicos, fueron almacenados individualmente en 177 placas de microtitulación de 384 pozos a -80ºC. La selección de marcador de la biblioteca ARD 1197-16 BAC fue llevada a cabo tal como lo describen Rouppe van der Voort et al. (1999). Esencialmente, las reservas de ADN generadas para cada una de las placas de 384 pozos fue seleccionada por PCR con marcadores SCAR o CAPS enlazados al locus Rpi-blb2 para construir un contiguo BAC a través del locus Rpi-blb2.

La selección de la biblioteca ARD 1197-16 BAC con marcadores E40M58e, S1E00 y CT119 identifico varios clones positivos BAC, que sirvieron como BAC semilla a partir de los cuales se inicio una caminata de cromosoma a través del locus Rpi-blb2. El marcador E40M58e fue utilizado para aislar los clones BAC 69 y 141 mientras que los clones BAC 14, 24,123 y 133 fueron positivos para el marcador S1E00. El marcador CT119 fue utilizado para aislar BAC 67. Después de secuenciar las fronteras izquierda (L) y derecha (R) de estos clones BAC, se desarrollo un nuevo conjunto de marcadores; 14L, 24L, 24R, 69L, 69R, 141R, 123L, 123R, 133R y 67L. La selección de los clones BAC aislados con estos marcadores mostraron que los siguientes pares de clones BAC compartían superposición; el lado derecho de 123 con el lado izquierdo de 133, 14 completamente con 24, y el lado izquierdo de 69 con el lado derecho de 141. BAC 67 no compartía su preposición con los otros clones BAC. El hallazgo de que los clones S1E00 positivos BAC 12, 24, 123 y 133 no forman un contiguo individual indicaron que la S1E00 era una secuencia repetitiva. Esto, junto con el hallazgo de que las secuencias derechas de extremo de BAC de los clones BAC 24 y 123 mostraban alta homología con regiones diferentes del gen de resistencia Mi1 del tomate (Milligan et al., 1998, Simons et al., 1998) sugieren que el locus de la Rpi-blb2 acoge más de un RGA. La selección de la biblioteca ARD 1197-16 BAC inicial con los marcadores 141R, 24L, 24R y 123L no lleva a la extensión de la contigüidad. Sin embargo, la selección de la biblioteca con los marcadores 123R y 133R dio como resultado el aislamiento de los clones BAC 99 y 113, extendiendo por lo tanto la contigüidad de BAC 123/133 en una dirección. El secuenciamiento del extremo de BAC de estos dos clones de BAC llevo al desarrollo de dos nuevos marcadores, 99L y 113R. La selección de la biblioteca ARD 1197-16 BAC con 69R llevo a la extensión de la contigüidad 141/69. La selección consecutiva de la biblioteca BAC con marcadores derivados de los clones de BAC que extendieron adicionalmente esta contigüidad llevo al aislamiento de los clones BAC 36, 41 y 112, y al desarrollo de marcadores 36L, 41L y 112L.

En un intento para completar la contigüidad de BAC a través del locus Rpi-blb2, la biblioteca ARD 1197-16 BAC fue agrandada con 38864 clones BAC adicionales de aproximadamente 100 kb (números de placa de 384 pozos 178-273). Esta segunda biblioteca fue seleccionada con marcadores 24L, 24R, 123L y 141R, llevando la identificación de los clones BAC positivos tanto para 24R como 123L (por ejemplo 191), y los clones BAC positivos para 24L (211, 242). De esta manera, la brecha entre BAC 24 y 123 fue cerrada y la contigüidad 24/14 fue extendida hasta el clon BAC 141. No hubo nuevos clones en la biblioteca ARD 1197-16 extendida que fueran positivos para el marcador 141R.

Ejemplo 7: Construcción de marcadores adicionales en la región BAC 123/133.

En un intento para desarrollar marcadores polimórficos adicionales de BAC 123 y 133, se construyo una biblioteca de subclones de 10 kb de BAC 123 y 133. El ADN de BAC fue escindido parcialmente con Sau3AI y se clonaron fragmentos de aproximadamente 10 kbp en el sitio BamHI del vector pBINPLUS. Con el fin de seleccionar clones que contenían la secuencia de extremo de BAC original, se seleccionaron 288 subclones de BAC 123 y 192 de BAC 133 con los marcadores de extremo de BAC 123L o 133R. En total 14 subclones fueron positivos para el marcador 123L y 11 para el marcador 133R. Subsecuentemente, la orientación de los clones positivos del extremo de BAC fue determinada por varios PCR utilizando bien sea el cebador de avance o reverso del marcador de extremo de BAC relevante en combinación con los cebadores M13F o M13R (Tabla 3). Para el marcador 123L se seleccionaron tres subclones y dos subclones para el marcador 133R y los extremos que no contenían el marcador 123L o 133R fueron secuenciados (aproximadamente 500 bp). Con base en la nueva secuencia se diseñaron dos nuevos cebadores para el subclon 123 dando como resultado el marcador 123L2 y se diseñaron dos nuevos cebadores para el subclon 133 dando como resultado el marcador 123R2. El marcador SCAR 123L2, que estaba localizado a 10 kbp próximo al marcador 123L, parece ser polimórfico en las poblaciones de mapeo ARG 95-3, ARP 96-11 y como CAPS en B6. El marcador SCAR 133R2, que estaba localizado a 10 kph distal al marcador 133R, era polimórfico solamente en las poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11.

Ejemplo 8: Mapeo fino del locus Rpi-blb2 en poblaciones de mapeo derivadas de ABPT.

Con el fin de un mapeo fino del locus Rpi-blb2 en poblaciones de mapeo derivadas de ABPT se probaron un total de 2283 nuevos clones de progenie de la población de mapeo ARG 95-3 y 598 clones de la población de mapeo ARP 9611 en cuanto a la resistencia a LB en campo en el sitio de pruebas de Marínese en el año 2000 (Tabla 2). En la población ARG 95-3 se calificaron 846 clones (37%) como susceptibles y 886 clones como resistentes (39%). Los fenotipos de los 551 clones restantes no fueron claros. En la población ARP 96-11 256 clones (45%) fueron calificados como susceptibles y 170 clones (30%) como resistentes. Los fenotipos de los restantes 142 (25%) no fueron claros (Tabla 2). Los clones resistentes 846 y 170 de las poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11, fueron seleccionados en cuanto a selección recombinante con el marcador SCAR CT 216 y el marcador CAPS 41L o 36L respectivamente. En total se obtuvieron 85 (9.6 cM) y 22 (12.9 cM) recombinantes en las poblaciones de mapeo ARG 95-3 y ARP 96-11, respectivamente, que fueron seleccionadas subsecuentemente con el marcador CAPS 67L, reduciendo el número de recombinantes a 5 (0.56 cM) en el intervalo de marcador 67L – 36L en el caso de la población de mapeo ARG 95-3 y a 4 recombinantes (2.35 cM) en el intervalo de marcador 67L – 41L en el caso de la población de mapeo ARP 96-11 (Figura 8). Estos 9 recombinantes restantes fueron avisados adicionalmente con marcadores SCAR y CAPS 113R, 99L, 133R, 133R2, 123R, 123L, 24R, 14L, 24L, 141R, 69L, E40M58e y 69R. Los dos últimos marcadores fueron seleccionados solamente en la población de mapeo ARG 95-3.

En la población ARG 95-3 dos clones mostraron recombinación entre los marcadores E40M58e y 69L, posicionado el gen Rpi-blb2 a 0.23 cM próximo al marcador E40M58e. Otros dos clones fueron recombinados entre los marcadores 113R y 67L y uno fue recombinado entre los marcadores 133R2 y 133R, posicionando el gen Rpi-blb2 a 0.11 cM distal al marcador 133R.

En la población ARP 96-11, no se detecto recombinación entre los marcadores 41L y 69L, posicionando el gen Rpi-blb2 a 0.58cM próximo al marcador 36L. Se recomendaron dos clones de progenie entre los marcadores 113R y 67L, y un clon fue recombinado entre los marcadores 99L y 133R, posicionando el gen Rpi-blb2 a 0.58 cM distal al marcador 99L (Figura 8; Figura 9).

Ejemplo 9: Evaluación y mapeo genético de resistencia a mildiú en una población de mapeo intraespecífica de S. bulbocastanum.

Con el fin de desarrollar una población de mapeo intraespecífica de S. bulbocastanum, se obtuvo un clon Blb 2002 resistente a partir de un cruzamiento de interacceso (Figura 10). Este clon fue cruzado recíprocamente con un clon susceptible Blb 48-5 que fue seleccionado también en progenie de un cruzamiento de interacceso (Figura 10). La población resultante fue designada B6 con los sinónimos B6a, blb 99-229, Blb 00-7 y Blb 00-8.

Inicialmente se selecciono un pequeño grupo de 47 plantas de progenie de la población B6 para resistencia a P. infestans en un ensayo de hoja desprendida repetido parcialmente utilizando una solución de esporangiosporas del aislado IPO655-2A de P. infestans como inóculo. Se considero que las plantas con hojas que mostraban claramente lesiones esporulantes de 6 a 9 días después de la inoculación tenían un fenotipo susceptible mientras que las plantas que no mostraban síntomas visibles o necrosis en el lado de la inoculación o ausencia de esporulación clara se consideraban como resistentes. De los 47 plantones, 23 se calificaron como resistentes y 24 como susceptibles. Estos datos indicaron que la progenie de la población de mapeo B6 dio una segregación clara de las características de resistencia en el ensayo de hoja desprendida y que la resistencia podría ser debida a un gen dominante individual o a una aglomeración de genes apretadamente enlazados. Con el fin de determinar la posición en el cromosoma de este locus, se analizaron 46 plantones con marcadores 112L y E46M52e. El marcador 112L se encontró enlazado en repulsión con el fenotipo resistente, puesto que solo dos recombinantes fueron obtenidos entre este marcador y el fenotipo de los 46 plantones (4 cM). También, se encontró que el marcador E46M52e estaba enlazado en repulsión con el fenotipo resistente. Aquí, se obtuvieron 5 recombinantes entre el marcador E46M52e y el fenotipo (11 cM). Adicionalmente, los marcadores 69R, 69L y 141R fueron utilizados para el análisis de 7 recombinantes entre los marcadores 112L y E40M58e con un grupo adicional de 6, 15 y 14 plantones no recombinados respectivamente, y se encontró que estaba completamente enlazado bien sea en fase de acoplamiento (marcador 69R) o de repulsión (marcadores 69L y 141R) a la resistencia, indicando que el gen de resistencia estaba localizado en el mismo locus, esto es, Rpi-blb2, como en las poblaciones de mapeo derivadas de ABPT.

Con el fin de determinar la posición del Rpi-blb2 con mayor precisión con respecto a los marcadores disponibles, otros 849 plantones de la población de mapeo B6 y 1054 plantones del cruzamiento recíproco (Figura 10) fueron cultivados y analizados en cuanto a recombinación entre los marcadores E46M52e y 112L. Así, además de los 47 plantones iniciales, se selecciono un total de 1903 clones individuales de aparición de la población B6. La recombinación entre los marcadores E46M52e y 112L fue detectada en un total de 138 de estos plantones (7.25 cM). El mapeo fino del locus Rpi-blb2 fue llevado a cabo en dos etapas. En primer lugar, el grupo de 138 recombinantes fue reducido a 19 por selección adicional con marcadores 14Lb, 113R, 123L2, 24L, 141R y 69L (Tabla 3) derivados de la secuencia de frontera izquierda (L) y derecha (R) de los clones BAC aislados a partir de la biblioteca ARD 1197-16 BAC y selección subsecuente de todos los plantones que fueron recombinados entre los marcadores 113R y 69L. Posiblemente debido a una recombinación, cuatro recombinantes dieron patrones para los marcadores calificados que se derivaban de calificaciones esperadas en el caso de eventos de recombinación individual en el intervalo genético estudiado y cuando se asumía colinealidad de marcadores. Estos fueron retirados de los análisis posteriores. En segundo lugar, los 15 recombinantes restantes fueron analizados con marcadores de secuencias fronteras de clones BAC aislados a partir de la biblioteca Blb 2002, SPB39L y SPB30L, o con marcadores MiGA 24L9spec, 24Lspec y 14L24L (Tabla 3). Los resultados de los análisis de marcadores de estos 15 recombinantes restantes, que dieron calificaciones de marcador y fenotipos claramente interpretables, posicionaron el locus Rpi-blb2 entre los marcadores 69L y 24L, en un intervalo genético de 0.11 cM (n=1899) (Figura 11).

Ejemplo 10: Marcadores de MiGA

El análisis Southern de los clones BAC 14, 24, 123 y 133 utilizando los marcadores 123R, 14L o 24L como sondas mostro que estos clones BAC contienen varios análogos de genes de resistencia (RGA). A la vista de la homología entre las secuencias de los marcadores 14L. 24L y 123R con el gen Mi1 de tomate, los RGA dentro de la región Rpiblb2 se denominan de aquí en adelante como análogos del gen Mi (MiGA). En un intento para desarrollar marcadores polimórficos adicionales dentro del intervalo Rpi-blb2, los fragmentos de PCR generados de los clones BAC 24 y 123 con la combinación del cebador 14LR y 24LF fueron clonados en el vector pGEM-T (Promega, Países Bajos) y secuenciados parcialmente. Con base en el alineamiento de estas secuencias parciales, se diseño un conjunto de cebadores universales, univ14L y univ24L (Tabla 3), con el objetivo de amplificar la región correspondiente de tantos MiGA como sea posible dentro del intervalo de la Rpi-blb2. Este conjunto de cebadores universal fue usado subsecuentemente para desarrollar marcadores específicos de MiGA SCAR/CAPS enlazados a Rpi-blb2 (por ejemplo, los marcadores 14L24L, 24Lspec, 24L9spec; (Figura 9).

Ejemplo 11: Mapeo físico del locus Rpi-blb2 derivado de S. bulbocastanum

El clon resistente Blb 2002 heterocigótico para el locus Rpi-blb2, fue utilizado como ADN fuente para la construcción de la biblioteca BAC de S. bulbocastanum de aquí en adelante denominada como la biblioteca Blb 2002 BAC. La preparación de ADN de alto peso molecular y la construcción de la biblioteca BAC fueron llevadas a cabo como se describió previamente. Se genero un total de aproximadamente 100.000 clones y se almaceno como 50 reservas bacterianas que contenían aproximadamente 2000 colonias blancas. Estas reservas bacterianas fueron generadas raspando las colonias de las placas de agar en medio Luria Broth que contenía 18% de glicerol y 12.5 μg/ml de cloranfenicol utilizando un esparcidor de vidrio estéril. Para la selección de la biblioteca Blb 2002 BAC, se aisló ADN de plásmido de cada reserva de clones utilizando el protocolo de lisis alcalina estándar y se lleva a cabo el PCR para identificar las reservas positivas. Las bacterias correspondientes a las reservas positivas fueron diluidas y sembradas sobre placa de agar Luria Broth que contenían cloranfenicol (12.5 μg/ml). Las colonias blancas individuales fueron tomadas subsecuentemente en placas de microtitulación de 384 pozos y los clones BAC sencillos positivos fueron identificados subsecuentemente como se describió previamente. Los nombres de los clones BAC aislados a partir de la biblioteca Blb 2002 BAC portan el prefijo BlbSP.

Con el fin de construir un contiguo de BAC derivado de Blb 2002 a través del intervalo de marcador genético de la Rpiblb2 (69L-24L) la biblioteca Blb 2002 BAC fue seleccionada con los marcadores 141R y 24L. Esto llevó al aislamiento de los clones BAC BlbSP39 y BlbSP30, los cuales se superponen uno con otro y barren el intervalo del marcador 141R24L. Las secuencias terminales BAC de ambos clones BAC fueron utilizadas para desarrollar los marcadores de SPB30L y SPB39L (Figura 9).

Ejemplo 12: Análisis de complementación

Para propósitos de complementación, todos los candidatos de genes Rpi-blb2, esto es, todos los MiGA presentes en los clones BAC BlbSP30, BlbSP39, 24, 242 y 211 fueron direccionados para subclonación en el vector binario pBINPLUS (van Engelen et al., 1996). Esto fue hecho como sigue. Se digirieron alícuotas de aproximadamente 1 μg de ADN de BAC con 1 U, 0.1 U o 0.01 U de la enzima de restricción Sau3AI durante 30 minutos. El ADN de BAC digerido parcialmente fue sometido a electroforesis de campo eléctrico homogéneo con contorno restringido (CHEF) a 4ºC en 0.5 X TBE utilizando un tiempo de pulso creciente lineal de 1-10 segundos y una fuerza de campo de 6 V/cm durante 16 horas. Después de la electroforesis, el gel de agarosa fue teñido con bromuro de etidio para localizar la región del gel que contenía fragmentos de ADN de aproximadamente 10 kbp en tamaño. Esta región fue escindida del gel y tratada con GELASE (Epicentre Technologies, Estados Unidos) de acuerdo con el fabricante. El ADN seleccionado por tamaño fue ligado al vector binario digerido con BamHI y desfosforilado pBINPLUS (van Engelen et al., 1995) seguido por transformación a células competentes de E. coli DH10B ElectroMAX (Life Technologies, Reino Unido). Por cada clon de BAC se selecciono un total de 384 clones por PCR en cuanto a la presencia de secuencias de MiGA utilizando los cebadores univ24L y univ14L (Tabla 3). Se seleccionaron clones positivos para caracterización posterior. Con base en el patrón de restricción de los fragmentos 14L24L digeridos con las enzimas RsaI, TaqI, Alul, Dpnll o Msel, se identificaron los diferentes grupos de MiGAs. El MiGA que acoge el marcador 24L, el cual estaba completamente presente en los clones BAC BlbSP39, 211 y 242 no fue detectado con los cebadores universales univ14L y univ24L.

La posición relativa de la secuencia de MiGA en los subclones de 10 kbp fue determinada por PCR utilizando cebadores internos, 123Mi y 14L2 para el extremo 5´ y univ14L y 24L2 para el extremo 3´ en combinación con los cebadores derivados de la secuencias de vector pBINPLUS (ARO 295 y 296; Tabla 3). Los subclones por RGA de cada biblioteca BAC fueron seleccionados para transformación.

Para análisis de complementación, los subclones seleccionados fueron transferidos a los cultivares de patatas susceptibles Impala y Kondor a través de transformación mediada por Agrobacterium utilizando el aislado UIA 143 (Farrand et al., 1989) o AGLO (Lazo et al., 1991). Los transformantes primarios que acogen los trasgenes de interés fueron probados en cuanto a resistencia a P. infestans en ensayos de hoja desprendida utilizando el aislado IPO655-2A e IPO82001 (Tabla 4). Solamente los constructos genéticos que acogen RGC5, ambos derivados de S. tuberosum y S. bulbocastanum, fueron capaces de completar el fenotipo susceptible en ambos cultivares Impala y en Kondor; en total 18 de 19 RGC5 que contenían transformantes primarios fueron resistentes (Tabla 4, Figura 12), mientras que todos los genes RGC1, RGC2, RGC3, RGC4, RGC6, RGC7 o RGC8 que contenían transformantes primarios eran susceptibles a

P. infestans. Todos los transformantes RGC5 mostraron fenotipos de resistencia similares al progenitor de S. bulbocastanum resistente de la población de mapeo B6, RGC5 designado como gen Rpi-blb2. El homólogo RGC24L puede también ser transferido a los cultivares de patatas susceptibles descritos y probado en cuanto a resistencia a P. infestans en un ensayo de hoja desprendida.

Una selección de transformantes primarios que contienen RGC5 fue analizada en cuanto al número de copias por análisis Southern. El ADN genómico digerido EcoRI fue hibridado con una sonda nptll (Tabla 3). Con base en la presencia del número de fragmentos hibridantes nptll, los transformantes primarios contenían al menos 1 a 11 insertos de transgenes. En total, se observaron 4 integraciones de copias sencillas en el cultivar Impala y 6 en el cultivar Kondor de los cuales un transformante del cultivar Kondor apareció con un fenotipo susceptible a P. infestans.

Para investigar si el Rpi-blb2 puede también complementar el fenotipo susceptible en tomate, se produjeron transformantes primarios del cultivar Moneymaker que acoge el constructo del gen Rpi-blb2 y se probaron con los aislados derivados de patata IPO8200 e IPO655-2A. El ensayo de resistencia a la enfermedad revelo que el RGC5 también es capaz de complementar un fenotipo de tomate susceptible (Tabla 6).

Ejemplo 13: Estructura del gen Rpi-blb2 y secuencia de aminoácidos putativa

Los insertos de los subclones 211F/C12 y SP39-20 binarios que contienen el RGC5 fueron secuenciados mediante una estrategia de avance de cebador mediante la cual se llevaron a cabo rondas consecutivas de secuenciamiento utilizando un conjunto de cebadores anidados los cuales fueron diseñados a medida que la secuencia contigua se extendía. El primer conjunto de secuencias fue generado utilizando los cebadores M13F y M13R. Las secuencias completas de los insertos de los clones 211F/C12 y SP39-20 consistían de 7967 y 9949 nucleótidos (nt), respectivamente (Figura 13). La secuencia del clon 211F/C12 era idéntica a la secuencia correspondiente dentro del clon SP39-20. La posición de la estructura putativa de la Rpi-blb2 fue predicha utilizando GEN-SCAN (Burge and Karlin, 1997) GeneMark (Lukashin and Borodovsky 1998) y a través del alineamiento a las secuencias genéticas de Mi1.1 y Mi1.2.

La longitud y estructura exactas de las secuencia de codificación fueron determinadas a través de amplificación rápida en 5´ y 3´ de los extremos de ADNc (RACE) utilizando el kit GeneRacerTM (InvitrogenTM,Groningen, Países Bajos). El RACE identificó fragmentos de ADNc específicos de la Rpi-blb2 en 5´ y 3´ que comprenden regiones no traducidas 5´ y 3´ (UTR) de 767 y 201 nucleótidos (nt), respectivamente. El gen Rpi-blb2 contenía dos intrones. El intrón 1 tiene 626 nt de longitud y esta posicionado dentro de la corriente de 32 nucleótidos de terminación de 5´ UTR del codón de inicio ATG. El intrón 2 tiene 86 nt de longitud que inicia la corriente de 43 nucleótidos del codón de iniciación ATG del gen. La secuencia de codificación del transcripto de la Rpi-blb2 es de 3804 nucleótidos.

El marco de lectura abierto deducido del gen Rpi-blb2 codifica un polipéptido predicho de 1267 aminoácidos con un peso molecular estimado de 146 kD (Figura 14). Varios motivos funcionales presente en los genes R en la clase NBS-LRR de los genes R vegetales son evidentes en la proteína codificada. Como se ilustra en la Figura 14, la proteína Rpiblb2 pertenece al subconjunto de cremallera de leucina (LZ) de proteínas de resistencia NBS-LRR. La mitad terminal en N de la proteína Rpi-blb2 contienen una región LZ potencial entre los aminoácidos 413 y 434 y seis motivos conservados indicativos de un sitio de enlazamiento de nucleótidos (van der Biezen y Jones, 1998). La mitad terminal en C de la Rpi-blb comprende una serie de 15 LRR irregulares que pueden ser alineados de acuerdo con la secuencia de consenso hxxhxxLxxLxLxxC/NSx(x)LxxLPxx observada en otras proteínas R citoplasmáticas, en donde h puede ser L, I, M, V o F, y x puede ser cualquier residuo de aminoácidos (Jones and Jones, 1997).

Ejemplo 14: Homología de las secuencias del gen R conocido en el estado de la técnica

Para identificar homólogos in silico del gen Rpi-blb2, se llevaron a cabo búsquedas BLAST (Altschul et al., 1990) con la secuencia de codificación del gen Rpi-blb2. Las búsquedas BLASTN identificaron un número de secuencias con homología significativa al gen Rpi-blb2. Utilizando el programa de alineamiento ClustalW (parámetros estándar) en el paquete de software ADNStar, determinamos que la secuencia de codificación de la Rpi-blb2 comparte la más alta homología con Mi-1.1 (89.8%) y Mi-1.2 (89.7%) (número de acceso GenBank AF039681 y AF039682, respectivamente). La última secuencia corresponde al gen Mi de tomate y confiere resistencia a tres de las especies más nocivas de los nematodos de los nódulos radiculares (Meloidogyne spp.) (Milligan et al., 1998). Además los nucleótidos 2410-3461 de la secuencia de codificación de la Rpi-blb2 comparte un 87.8% de homología en secuencia con una secuencia NBS-LRR parcial de Solanum nigrum (número de acceso en GenBank AY055116.1). A nivel de aminoácidos la secuencia de proteínas putativa Rpi-blb2, comparte la homología más alta con Mi-1.1 (82% de identidad) y Mi-1.2 (81% de identidad) (número de acceso GenBank AF039681 y AF039682).

A través del alineamiento ClustaIW de las secuencias de aminoácidos deducidos de la Rpi-blb2, Mi-1.1 y Mi-1.2 hemos identificado 200 residuos de aminoácidos (aa) que son únicos para Rpi-blb2 (Figura 15). De estos, 31 se encuentran en posiciones hipervariables, esto es, el residuo en esta posición es diferente en todas las tres secuencias y 11 son codificados por inserciones pequeñas (una inserción de 3 residuos de aa y una inserción de 8 residuos de aa). El resto son específicos de la Rpi-blb2 en cuanto a los residuos de aa encontrados en las posiciones correspondientes en Mi-1.1 y Mi-1.2 son diferentes del residuo de la Rpi-blb2 pero conservados en las dos secuencias de proteínas Mi (Figura 15).

De manera interesante, el motivo VLDL que está conservado en el tercer LRR de muchas proteínas NBS-LRR incluyendo Mi (Axtell et al., 2001; Banerjee et al., 2001) no se conserva en Rpi-blb2 Ffigura 15).

Ejemplo 15: Búsqueda de alelo Rpi-blb2 en especies silvestres de Solanum

Utilizando los cebadores ARF1F y ARF1R (Tabla 3B), diseñados alrededor del codón de inicio y detención del gen Rpiblb2, es posible amplificar por PCR los alelos de la Rpi-blb2 de cualquier especie de Solanum. Los productos de amplificación pueden ser clonados entre secuencias reguladoras transcripcionales en un plásmido binario y transferidos a S. tuberosum a través de transformación mediada por Agrobacterium o cualquier método conocido para los expertos en la técnica. Los transformantes primarios resultantes pueden ser analizados subsecuentemente en cuanto a resistencia a P. infestans o a cualquier patógeno para el cual la patata sea una planta anfitriona.

Ejemplo 16: Material y métodos

El material vegetal y el desarrollo de las poblaciones de mapeo en (1) Solanum tuberosum, clones híbridos interespecíficos completos, designados ABPT, fueron hechos por Hermsen y colaboradores (Hermsen, 1996; Hermsen and Ramanna, 1969; Ramanna and Hermsen, 1971; Hermsen and Ramanna, 1973; Hermsen, 1983; Hermsen, 1994) (Figura 1a). La etapa de duplicación del cromosoma con colchicinas fue descrita por Hermsen (1966) y Hermsen and De Boer (1971). La resistencia en algunos de los clones ABPT a P. infestans se considera derivada bien sea de uno o ambos accesos de S. bulbocastanum BGRC 8007 (CGN 21306; Pi 275196) y BGRC 8008 (CGN 17693; Pi 275198) que fueron utilizados en el cruce inicial para producir híbridos entre S. acaule y S. bulbocastanum, puesto que todos los progenitores que fueron utilizados en el esquema de cruzamiento para los clones ABPT eran susceptibles o solamente parcialmente resistentes a P. infestans en los ensayos de hoja desprendida (Hermsen and Ramanna, 1973). Los tubérculos de 19 clones de la población [(número de clon ABPT 55 x cultivar (cv) Oberarnbacher Frühe) x cv Arkula], a partir de 7 clones de población [(número de clon ABPT 55 x cv Oberarnbacher Frühe) x cv Blanka] y de 5 clones de población [(número de clon ABPT 60 x cv Alcmaria) x cv Blanka] fueron recibidos en 1988 del antiguo Department of Plant Breeding of the Wageningen Agricultural University (Wageningen, Países Bajos). Los clones ARF 87-507, ARF 87801 y ARF 87-601 fueron seleccionados de estas poblaciones respectivamente. Representaban la aparición de un segundo retrocruzamiento (BC2) con los clones ABPT interespecíficos complejos y fueron utilizados para retrocruzamientos adicionales que dieron como resultado una población tetraploide BC3, dos poblaciones tetraploides BC4 y una población diploide BC4 que fueron utilizados para el mapeo genético del gen de la Rpi-blb2 (Figure 1). La población ARG 95-15 de mapeo tetraploide de Solanum tuberosum fue producida cruzando el clon ARF 87-507 resistente a P. infestans con el cultivar susceptible Alkon. La población de ARG 95-3 tetraploide fue producida cruzando el clon AR 91-1263 resistente a P. infestans con el cultivar susceptible Cosmos. La población ARP 96-11 tetraploide fue producida cruzando el clon AR 92-1292 resistente con el cultivar susceptible Celeste. La población diploide DP1 fue obtenida cruzando el clon resistente ARD 1197-16 con el clon susceptible ARD 93-2090 (Figura 1).

Material vegetal y desarrollo de poblaciones de mapeo en (2) Solanum bulbocastanum.

La población de mapeo diploide S. bulbocastanum, designada como B6 (sinónimos B6a, Bib 99-229, Bib 00-7 y Bib 008), fue desarrollado cruzando un clon Blb 2002 (sinónimo M94-81-C) resistente a P. infestans con un clon susceptible Blb 48-5. Los resultados de los cruzamientos recíprocos de la población B6 fueron combinados. El clon progenitor resistente de la población B6 obtenida a partir de un cruzamiento entre el clon Blb 93-D26-3 de S. bulbocastanum (acceso BGRC 8002; CGN 17690; Pi 275187) como progenitor hembra y el clon Blb 93-60-10 de S. bulbocastanum (acceso BGRC 8006; Pi 275194) como progenitor macho. El clon progenitor susceptible de la población B6 fue obtenido a partir de un cruzamiento entre clones de S. bulbocastanum con accesos BGRC 8005 (CGN 17692; PI 275193) y BGRC 8006 (Figura 2).

Ensayos de enfermedad; (1) aislados de Phytophthora infestans

Se obtuvieron tres diferente aislados de P. infestans a partir de Plant Research International B.V. (Wageningen, Países Bajos). Los aislados tenían diferentes estructuras de raza y tipos de coincidencia como sigue: IPO82001: race structure 1.2.3.4.5.6.7.10.11, mating type A2; IPO655-2A: race structure 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, mating type A1; IPO428-2: race structure 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, mating type A2 (Flier et al., 2003).

Ensayos de enfermedad; (2) pruebas de campo

Tubérculos de plantones cultivados en invernaderos o semillas de patatas cultivadas en campo fueron plantados en sitios de ensayo en Marínese, Países bajos, desde 1985 a 2002, en el área de Toluca en México en 1991 o en un sitio en la provincia Benguet en las Filipinas en 1992. Para clones individuales se sembraron en grupos consistentes de 1 a 10 tubérculos. Aproximadamente 8 semanas después de la plantación, el campo en Marínese fue inoculado con una solución de esporangiosporas de P. infestans, aislado IPO82001 y se recolectaron las calificaciones de enfermedad de tres a seis semanas después de la inoculación. Los clones que estaban libres o casi libres de mildiú fueron clasificados por tener un fenotipo resistente mediante que los clones con un follaje completo o casi completo con mildiú fueron clasificados como susceptibles. Los clones con reacciones intermedias al mildiú fueron clasificados como poseedores de un fenotipo desconocido. En los ensayos de campo en México y las Filipinas, tuvo que ocurrir la infección natural. Una vez que esta infección natural por P. infestans se había establecido, se calificó el porcentaje de follaje con mildiú de plantas en cada grupo a los días 8 y 6 respectivamente en una escala de 1-9 con lo cual se estimaron los porcentajes de follaje con mildiú de 1 a 9 los cuales fueron 0, 3, 10, 25, 50, 75, 90, 97 y 100 (Estrada- Ramos et al., 1983).

Ensayos de enfermedad; (3) hojas desprendidas

Para el ensayo de hojas desprendidas, las hojas de las plantas que habían crecido de 6 a 12 semanas en el invernadero fueron colocadas en piezas de espuma de florista saturadas con agua, aproximadamente de 35x4x4 cm, y puestos en una bandeja (40 cm de ancho, 60 cm de longitud y 6 cm de altura) con un fondo perforado. Cada hoja fue inoculada con dos gotitas (25 μl cada una) de solución de esporangiosporas sobre el lado abaxial. Subsecuentemente la bandeja fue colocada en una bolsa plástica sobre la parte superior de una bandeja, en la cual se coloco un papel de filtro saturado con agua, e incubado en un cuarto climatizado a 17ºC y un fotoperiodo de 16h/8h día/noche con luz fluorescente (Philips TLD50W/84HF y OSRAM L58W/21-840). Después de 6 a 9 días se evaluaron las hojas en cuanto al desarrollo de síntomas de la enfermedad con P. infestans.

Evaluación:

Las plantas con hojas que claramente mostraron lesiones esporulantes 6 a 9 días después de la inoculación fueron consideradas con un fenotipo susceptible, mientras que las plantas con hojas que no mostraban síntomas visibles o necrosis en el sitio de inoculación en ausencia de esporulación clara se consideraron como resistentes.

Selección de un marcador de ADN de plantas

El ADN genómico fue extraído de hojas jóvenes de acuerdo con Bendahmane et al., (1997). Para análisis por PCR, se prepararon mezclas de reacción de 15 μl que contenían 0.5 μg de ADN, 15 ng de cada cebador, 0.2 mM de cada dNTP,

0.6 unidades de Taq-polimerasa (15 U/μl, SphaeroQ, Leiden, Países Bajos), Tris-HCl 10 mM pH 9, MgCl2 1.5 mM, KCl 50 mM, 0.1% de Tritón X-100 y 0.01% (p/v) de gelatina. Los PCR fueron llevados a cabo utilizando el siguiente perfil de ciclo: 25 segundos para desnaturalización de ADN a 24ºC, 30 segundos de fusión y 40 segundos de elongación a 72ºC. Como primera etapa en la amplificación por PCR se desnaturalizo el ADN durante 5 minutos a 94ºC y se finalizó mediante una etapa extra de elongación de 5 minutos a 72ºC. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador Biometra® T-Gradient o Biometra® Uno-II (Westburg, Leusden, Países Bajos). Dependiendo del marcador, el producto de PCR fue digerido con una enzima de restricción apropiada. Una revisión de los marcadores incluyendo las secuencias cebadoras, la temperatura de fusión y las enzimas de reacción si son apropiadas, se da en la Tabla 3. Subsecuentemente, los productos de PCR (escindidos) fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa o acrilamida. Para el análisis en gel de acrilamida, se utilizaron el CleanGel ADN Análisis Kit y ADN Silver Staining Kit (Amersham Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, Países Bajos).

Elongación de fragmentos de AFLP por PCR interlazado térmico asimétrico (TAIL)

La elongación de la secuencia de un fragmento AFLP fue llevada a cabo por TAIL-PCR de acuerdo con Liu y Whittier (1995). En resumen, la elongación de los fragmentos de AFLP fue llevada a cabo utilizando dos o tres cebadores específicos anidados (sp) en combinación con un cebador arbitrario degenerado (AD). El primer PCR fue llevado a cabo con observadores sp1 y AD, el segundo con sp2 y AD y el tercero con sp3 y AD de acuerdo con el esquema descrito en la Tabla 5. El PCR fue llevado a cabo en realizaciones de 25 μl que contenían la mezcla de PCR como se describió anteriormente, excepto que se utilizaron 30 ng del cebador AD. Los fragmentos elongados fueron clonados en pGEM-T (Promega, Países Bajos) y secuenciados.

Construcción y selección de biblioteca BAC

El clon resistente ARD 1197-16, heterocigoto para el locus Rpi-blb2, fue utilizado como ADN fuente para la construcción de la biblioteca de BAC de S. tuberosum. El clon resultante Blb 2002 heterocigoto para el locus Rpi-blb2, fue utilizado como ADN fuente para la construcción de la biblioteca BAC de S, bulbocastanum. La preparación de ADN de alto peso molecular y la construcción de la biblioteca de BAC fueron llevados a cabo como se describe en Rouppe van der Voort et al., (1999). Para la biblioteca de S. tuberosum BAC, aproximadamente 120.000 clones con un tamaño de inserto promedio de 100 kb, que corresponde a 8 a 10 equivalentes de genoma fueron obtenidos finalmente. Se almacenó un total de aproximadamente 70.000 clones individualmente en 177 placas de microtitulación de 384 pozos a -80ºC. Se almacenaron otros 50 clones como reservas bacterianas que contienen aproximadamente 4000 colonias blancas. Estas son generadas raspando las colonias de las placas de agar hacia medio Luria Broth que contenía 18% de glicerol y 12.5 μg/ml de cloranfenicol utilizando un aspersor de vidrio estéril. Estas llamadas superreservas también fueron almacenadas a -80ºC. Finalmente se agregaron otros 37000 clones a la biblioteca de BAC de S. tuberosum. La biblioteca de BAC de S. bulbocastanum consistió de 48 superreservas de aproximadamente 2000 colonias.

La selección por marcador de la biblioteca de BAC que acoge los clones de BAC almacenados individualmente se llevo a cabo como se describe en Rouppe van der Voort et al. (1999). Para la selección de la biblioteca de BAC almacenada como superreservas, el plásmido de ADN fue dado de cada reserva de clones utilizando el protocolo de lisis alcalina estándar y el PCR se llevo a cabo para identificar reservas positivas. Las bacterias correspondientes a reservas positivas fueron diluidas y sembradas sobre placas de agar Luria Broth que contenían cloranfenicol (12.5 μg/ml). Las colonias blancas individuales fueron tomadas subsecuentemente en placas de microtitulación de 384 pozos y los clones de BAC positivos individuales fueron identificados subsecuentemente como se describió anteriormente. Los nombres de los clones de BAC aislados de las superreservas portan el prefijo SP (por ejemplo SP39).

Subclonación de los genes candidatos

Los RGA candidatos fueron subclonados a partir del clon BAC 24, 211, 242, BLBSP39 y BLBSP30 como sigue: se digirieron alícuotas de aproximadamente 1 μg de BAC ADN con 1 U, 0.1 U o 0.01 U de enzima de restricción Sau3AI durante 30 minutos. El ADN de BAC parcialmente escindido fue sometido a electroforesis CHEF a 4ºC en 0.5 X TBE utilizando un tiempo de pulso con incremento lineal de 1 – 10 segundos y una fuerza de campo de 6 V/cm durante 16 horas. Después de la electroforesis, el gel de agarosa fue sometido a tinción con bromuro de etidio para localizar la región del gel que contenía los fragmentos de ADN de aproximadamente 10 kbp en tamaño. Esta región fue escindida en gel y tratada con GELASE (Epicentre Technologies, Estados Unidos) de acuerdo con el fabricante. El ADN seleccionado por tamaño fue ligado al vector pBINPLUS binario escindido con BamHI y desfosforilado (van Engelen et al., 1995) seguido por transformación a células competentes de E. coli DH10B ElectroMAX E(Life Technologies, Reino Unido). Un total de 192 clones fueron seleccionados para caracterización posterior. La identificación de los clones que acogían RGC1, RGC2, RGC3, RGC4, RG5, RGC6, RGC7, RGC8 y RGC24L se llevo a cabo secuenciando fragmentos del 14L24L de PCR derivados de clones positivos. La posición relativa de los RGA con un subclon se determinó por análisis por PCR utilizando cebadores internos (24L2, 123Mi) en combinación con los cebadores específicos pBINPLUS (Tabla 3).

Transformación de patata mediada por Agrobacterium tumefaciens

Plásmidos binarios que acogen los genes candidatos fueron transformados en cepas de A. tumefaciens AGLO (Lazo et al. 1991) y UIA143 (Farrand et al., 1989), conteniendo esta última el plásmido auxiliar pCH32 (Hamilton et al. 1996). El cultivo durante la noche de las cepas de A. tumefaciens transformadas se utilizó para transformar los discos de tubérculo de patata (cvs Impala y Kondor) de acuerdo con los protocolos estándar (Hoekema et al., 1989; Fillati et al., 1987). En resumen, semillas certificadas de patata de cultivares Impala y Kondor fueron peladas y esterilizadas en superficie durante 30 minutos en una solución de hipoclorato de sodio al 1% que contenía 0.1% de Tween-20. Los tubérculos fueron entonces lavados en grandes volúmenes de agua destilada estéril (4 veces, 10 minutos). Discos de aproximadamente 2 mm de espesor y 7 mm de diámetro fueron tajados de los cilindros de tejido tuberoso preparado con un tapón. Los discos de tubérculo fueron transferidos en un medio MS30 líquido que contiene A. tumefaciens y se incubaron durante 15 minutos. Después de eliminar la solución de A. tumefaciens, los discos de tubérculo fueron transferidos a medio de regeneración que contiene MS30, 0.9 mg/l de IAA, 3.6 mg/l de ribosida de zeatina, y 8 g/l de agar (Hoekema et al., 1989). Las placas fueron incubadas a 24ºC con una duración de 16 horas de día (con una lámpara Philips TLD50W/84HF). Después de 48 horas de cocultivo, los discos de tubérculo fueron enjuagados durante 5 minutos en medio líquido MS que incluye antibióticos, 200 mg/l de vancomicina, 250 mg/l de cefotaxima y 75 mg/l de kanamicina, y se transfirieron a un medio de regeneración complementado con los mismos antibióticos. Las placas fueron incubadas a 24ºC, durante 16 horas por día (Philips TLD50W/84HF). Cada tres semanas los discos de tubérculo fueron transferidos a un medio fresco. Los brotes de regeneración fueron transferidos al medio MS30 que contenía 75 mg/l de kanamicina. Los brotes de las raíces fueron propagados in vitro y probados en cuanto a ausencia de células de

A. tumefaciens incubando un trozo de tallo en 3 ml de medio Luria Broth (3 semanas, 37ºC, 400 rpm). Una planta de cada regenerante transformado fue transferida al invernadero.

Transformación de tomate mediada por Agrobacterium tumefaciens

Se enjuagaron semillas de la línea de tomate susceptible Moneymarker en etanol al 70% para disolver el recubrimiento de las semillas y se lavaron con agua estéril. Subsecuentemente, las semillas fueron esterilizadas en superficie en solución de hipoclorito de sodio al 1.5% durante 15 minutos, se enjuagaron 3 veces en agua estéril y se colocaron en contenedores que contenían 140 ml de medio MS pH 6.0 (Murashige and Skoog, 1962), suplementada con 10 g/l de sacarosa (MS10) y 160 ml de vermiculita. Las semillas se dejaron germinar durante 8 días a 25ºC y 0.5 W/M2 de luz.

Los explantes de cotiledones de ocho días de edad fueron precultivados durante 24 horas en cajas de Petri que contenían una capa de alimentador de dos semanas de edad de células de tabaco en suspensión colocadas en medio de cocultivo (MS30 pH 5.8 suplementado con vitaminas Nitsch (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos), 0.5 g/l de regulador MES y 8 g/l de agar Daichin).

Se centrifugaron los cultivos nocturnos de A. tumefaciens y la pella fue resuspendida en medio de suspensión de células (MAS30 pH 5.8 suplementado con vitaminas Nitsch, 0.5 g/l de regulador MES, pH 5.8) que contenía 200 μM de acetosiringona hasta un O.D.600 final de 0.25. Los explantes fueron infectados entonces con el cultivo nocturno diluido de A. tumefaciens UIA 143 que contenía pBINRGC5 durante 25 minutos, se embotelló seco en papel de filtro y se cocultivo durante 48 horas en las placas de capa de alimentación originales. Las condiciones de cultivo fueron como se describió más arriba.

Después del cocultivo, los explantes de los cotiledones fueron transferidos a cajas de Petri con medio inductor de brotes selectivo (MS pH 5.8 suplementado con 10 g/l de glucosa, incluyendo vitaminas Nitsch, 0.5 g/l de regulador MES, 5 g/l de agargel, 2 mg/l de zeatina ribósido, 400 mg/l de carbenicilina, 100 mg/l de kanamicina, 0.1 mg/l de IAA) y se cultivo a 25ºC con 3-5 W/M2 de luz. Los explantes fueron cultivados cada 3 semanas sobre medio fresco. Los brotes emergentes fueron diseccionados del callus subyacente y transferidos a contenedores con medio inductor de raíces selectivo (MS10 pH 5.8 suplementado con vitaminas Nitsch 0.5 g/l de regulador MES, 5 g/l de agargel, 0.25 mg/l de IBA, 200 mg/l carbenicilina y 100 mg/l de kanamicina).

Extracción de ARN

El ARN total fue aislado utilizando Trizol® de acuerdo con el protocolo suministrado por el fabricante (InvitrogenTM, Groningen, Países Bajos) con modificaciones menores. En resumen, 0.5 g de tejido de hoja joven fue triturado en nitrógeno líquido y el polvo suspendido en 5 ml de Trizol®. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente (RT), se agregaron 0.5 ml de cloroformo, la suspensión fue sometida a vórtex y se incubó durante 2 minutos. Después de la centrifugación (15 minutos, 11404 x g, 4ºC) el sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y se agregaron 2.5 ml de isopropanol. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, los ácidos nucleicos fueron precipitados (10 minutos, 11404 x g, 4ºC). La pella fue lavada con 5 ml de etanol al 70% (5 minutos, a temperatura ambiente) y después de centrifugación (5 minutos, 6415 x g 4ºC), la pella fue secada y resuspendida en 100 μl de agua destilada estéril. Se extrajo el poliA + ARN del ARN total utilizando el kit OligotexTM mRNA midi (Qiagen, GmbH, Alemania).

Amplificación rápida de los extremos ADNc

Los extremos 5´ y 3´ del ADNc de la Rpi-blb2 y la confirmación de las posiciones del intrón putativo fueron determinados por amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) utilizando el kit GeneRacerTM (InvitrogenTM, Groningen, Países Bajos). El 5´ RACE fue llevado a cabo en ADNc sintetizado con el cebador GSP4 (ARO 772). Subsecuentemente, el cebador GSP6 (ARO 774) fue utilizado en combinación con el cebador 5´ GeneRacerTM y la amplificación final fue llevada a cabo con el GSP6 en combinación con el cebador anidado 5´ GeneRacerTM . El 3´ RACE fue llevado a cabo con los cebadores anidados GSP1 (ARO 769) y GSP2 (ARO 770) en combinación con el cebador 3´ GeneRacer. La amplificación final fue llevada a cabo con GSP3 (ARO 771) en combinación con el cebador 3´ anidado GeneRacer.

Las etapas de amplificación de RACE de 3´ y 5´ fueron llevadas a cabo utilizando Accuprime (InvitrogenTM, Groningen, Países Bajos) en vez de la Taq polimerasa suministrada por el kit GeneRacerTM.

Huellas digitales de AFLP y clonación de los fragmentos de AFLP

La preparación del patrón y las huellas digitales de AFLP fueron llevadas a cabo esencialmente como se describe en Vos et al. (1995). Con el fin de clonar fragmentos específicos se escindieron fragmentos de AFLP marcados con 33P del gel de acrilamida superponiendo los geles de acrilamida, secados sobre papel Whatmann 3MM, con imágenes de autorradiogramas en el medio. Las piezas de gel/papel bajo la banda de interés fueron cortadas y transferidas a 200 μl de TE e incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizaron cinco microlitros de sobrenadante para reamplificar el fragmento, utilizando un PCR en el cual EcoRI+0 en combinación con MseI+0 fueron utilizados como cebadores. El fragmento de AFLP reamplificado fue clonado subsecuentemente en el vector de clonación pGEM-T (Promega, Países Bajos) y los insertos de varios clones secuenciados.

La secuencia de ADN de la banda de AFLP escindida fue utilizada para diseñar cebadores específicos para el locus. El producto de amplificación obtenido con tales cebadores fue seleccionado en cuanto a polimorfismos internos con enzimas de restricción, después de la restricción, los fragmentos fueron separados sobre un gel de agarosa al 2-3% incluyendo bromuro de etidio.

Análisis de RGA-AFLP

La preparación del patrón fue ejecutada esencialmente como se describe en Vos et al., (1995). Sin embargo la segunda etapa de amplificación fue llevada a cabo con el cebador S1 basado en el bucle P de Leister et al. (1996) en combinación con el cebador de AFLP EcoRI+0. Una mezcla de reacción de 10 μl [0.5 μl de cebador S1 marcado con 33P (10 ng/μl); 0.5 μl de cebador EcoR1+0 (10 ng/μl); 0.8 μl de dNTPs (5mM); 2 μl de regulador de PCR 10xGoldstar™ (Eurogenetc, Bélgica); 1.2 μl de MgCl2 (25 mM); 0.06 μl de Goldstar™ ADN polimerasa (5U/mμ) (Eurogentec, Bélgica);

14.94 μl de agua MQ] fueron agregados a 10 μl de patrón diluido (20x diluido en agua MQ) y se llevo a cabo una reacción de PCR utilizando el siguiente perfil de ciclos: 45 segundos de desnaturalización de ADN a 94°C, 45 segundos de fusión de cebador a 49°C y 2 minutos de etapa de elongación a 72ºC (35 ciclos). Antes de la ciclización el patrón de ADN fue desnaturalizado durante 2 minutos a 94°C y el PCR fue finalizado aplicando una etapa de elongación extra de 5 minutos a 72ºC. Las reacciones de amplificación fueron ejecutadas en un termociclador Perkin Elmer 9600. Los fragmentos de los productos de PCR marcados fueron separados sobre un gel de poliacrilamida al 6% y las bandas individuales fueron visualizadas por autorradiografía de acuerdo con procedimientos estándar.

Ejemplo 17: Fenotipo de la expresión de la Rpi-blb2

Materiales y métodos

Cuatro lesiones (6 días después de la inoculación en condiciones estándar) de hojillas infectadas (IPO82001) fueron enjuagadas en 3 ml de H20. La concentración fue determinada utilizando un hemocitómetro Fuchs-Rosenthal (W. Schreck Hofheim/Ts)

Definición:

El índice de esporulación es la cantidad de esporangias por ml detectada en lesiones de hojillas infectadas.

Tabla 7. Índice de esporulación de diferentes fenotipos después de infección por parte de P. infestans en un ensayo de

hojas desprendidas Genotipo cv. Bintje ARD 92-1197-16

Índice de esporulación esporangias/ml 1.840.000 20.000

Diferencial R2

0

La diferencia entre la Rpi-blb2 y otros genes de resistencia a P. infestans es que la Rpi-blb2 permite un bajo nivel de esporulación (Figura 18). Eso se demuestra por un ensayo de hojas desprendidas en el cual las lesiones presentes en el genotipo Rpi-blb2 (ARD 92-1197-16) muestra un bajo nivel de esporangias en relación con la ausencia completa de esporangias en un genotipo que contiene el gen S. demissum. Sin embargo, el índice de esporulación es solamente 1.1% de un fenotipo susceptible (cv. Binjte) (Tabla 7 y Figura 18).

Los experimentos de campo también muestran que la Rpi-blb2 permite un bajo nivel de infección. Los síntomas de mildiú se desarrollaron a un bajo nivel durante la estación de crecimiento (Figura 3, ARF87-801) o al final de la estación de crecimiento (Figura 2, ARF 87-601; Figura 3, ARF 87-507 y ARF 87-601).

Listado de secuencias

<110> Agrico

<120> Plantas resistentes y usos de las mismas

<130> AE 20030596

<160> 94

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3804

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (3804)

<223>

<400> 1

<210> 3 5 <211> 3890

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221>

gene 10 <222> (1)..(3890)

<223> Codificación de la secuencia de ácidos nucleicos del gen Rpi-blb2 incluyendo la secuencia del intrón (posición 43-128).

<220>

<221>

Intrón 15 <222> (43)..(128)

<223> Codificación de la secuencia de ácidos nucleicos del gen Rpi-blb2 incluyendo la secuencia del intrón (posición 43-128).

<400> 3

<210> 4 5 <211> 1267

<212> PRT

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> proteína 10 <222> (1)..(1267)

<223> Secuencia de proteína de la Rpi-blb2 deducida

<400> 4

<210> 5

<211> 7967

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Fragmento de ADN genómico

<222> (1)..(7967)

<223> Secuencia del fragmento de ADN genómico de 7967 bp Sau3AIARD 1197-1 6 BAC 211 presente en p211F-C12, Gen Rpi-blb2 que incluye elementos reguladores naturales necesarios para la expresión correcta del gen. El codón de iniciación (ATG posición 1546-1548) y el codón de terminación (TAG posición 5433-5435)

5 <220>

<221> codón de detención

<222> (5433)..(5435)

<223> Secuencia del fragmento de ADN genómico de 7967 bp Sau3AIARD 1197-1 6 BAC 211 presente en p211F-C12,

Gen Rpi-blb2 que incluye elementos reguladores naturales necesarios para la expresión correcta del gen. El codón de 10 iniciación (ATG posición 1546-1548) y el codón de terminación (TAG posición 5433-5435)

<220>

<221> codón de iniciación

<222> (1546)..(1548)

<223> Secuencia del fragmento de ADN genómico de 7967 bp Sau3AIARD 1197-1 6 BAC 211 presente en p211F-C12,

15 Gen Rpi-blb2 que incluye elementos reguladores naturales necesarios para la expresión correcta del gen. El codón de iniciación (ATG posición 1546-1548) y el codón de terminación (TAG posición 5433-5435)

<400> 5

<210> 6

<211> 9949 5 <212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Fragmento de ADN genómico

<222> (1)..(9949)

10 <223> Secuencia de fragmento de ADN genómico de 9949 bp Sau3AI S. bulbocastan um 2002 BAC BlbSP39 presente en pSP39-20. El fragmento genómico acoge el gen Rpi-blb2 incluyendo elementos naturales necesarios para la expresión.Codón de iniciación (ATG posición 1413-1415), el codón de terminación (TAG posición 5300-5303)

<220>

<221> codón de iniciación 15 <222> (1413)..(1415)

<223> Secuencia de fragmento de ADN genómico de 9949 bp Sau3AI S. bulbocastan um 2002 BAC BlbSP39 presente en pSP39-20. El fragmento genómico acoge el gen Rpi-blb2 incluyendo elementos naturales necesarios para la expresión. Codón de iniciación (ATG posición 1413-1415), el codón de terminación (TAG posición 5300-5303) <220>

<221> codón de detención

<222> (5300)..(5303)

<223> Secuencia de fragmento de ADN genómico de 9949 bp Sau3AI S. bulbocastan um 2002 BAC BlbSP39 presente en pSP39-20. El fragmento genómico acoge el gen Rpi-blb2 incluyendo elementos naturales necesarios para la expresión. Codón de iniciación (ATG posición 1413-1415), el codón de terminación (TAG posición 5300-5303)

<400> 6

<210> 7

<211> 3768 5 <212> ADN

<213> Lycopersicon lycopersicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3768) 10 <223> Mi1.1 de tomate

<400> 7

<210> 8

<211> 1255 5 <212> PRT

<213> Lycopersicon lycopersicum

<220>

<221> características misceláneas

<222> (178)..(178) 10 <223> La ‘Xaa’ en la localización 178 significa Leu.

<400> 8

<210> 9 5 <211> 3774

<212> ADN

<213> Lycopersicon lycopersicum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(3774)

<223> Mi1.2 de tomate

<400> 9

<210> 10

<211> 1257

<212> PRT

<213> Lycopersicon lycopersicum

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 11 ttgtggttat cgatgagaat 20

<210> 12

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 12 gaaacaacag caggatagtg ag 22

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220> <221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 13 ttgtggttat cgatgagaat 20

<210> 14

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 14 gaaacaacag caggatagtg ag 22

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 15 gaattcagca caaataccaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1) .. (20)

<223>

<400> 16 ttaacgttta ctatcacgag 20

<210> 17

<211> 23

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 17 gtagaaacag cagcctcata agc 23

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 18 ttctgcctaa ttgccctgtg 20

<210> 19

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 19 ggggttggga agacaacgac ac

<210> 20

<211> 23

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 20 aattccaaga tacagtcaaa tac

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 21 aggcaggatt aacagtagaa g

<210> 22

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 22 catgctttta ggaagaagct c 21

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 23 ttgagacaaa gcagctccac 20

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<400> 24 acgtttctca cacctacagg 20

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 25 tgatggcacg tttgatcgtg 20

<210> 26

<211> 20

<212> ADN <213> Solanum bulbocastanum

<400> 26 taagatccaa accagccacc 20

<210> 27

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 27 ccttatcaca catgtggcta c 21

<210> 28

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 28 attgaaacgg aggaagtaca ac 22

<210> 29

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223> <400> 29 ttcttcatat ggcagaccaa c 21

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 30 ctactctgct gacatgcagg 20

<210> 31

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 31 gagattctca aaggtgtctt cc 22

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 32 aacctgtgct ttcccattcg 20

<210> 33

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 33 ctttcacaag cgtcactttg g 21

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 34 taaaaagaat caacagggca ac 22

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 35 acgactgctc aaagttggcc 20

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> Marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 36 ccaagaagcc agttgagagc 20

<210> 37

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 37 gtagattaca ctatggatat gg 22

<210> 38

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 38 cagttagcag caatgtcagc 20

<210> 39

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 39 cattcaacta ggccaaaagt gg 22

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 40 ccaggtaggt gttttcttcc 20

<210> 41

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 41 gttctaagtc agatgccacc 20

<210> 42

<211> 19

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 42 aagtgctcca acacgagcc 19

<210> 43

<211> 19

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 43 tgagttctct taccctgcg 19

<210> 44

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 44 ggatatccag catcaatgcc 20

<210> 45

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 45 ggtgagcctc cttgcattcc 20

<210> 46

<211> 19

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 46 cctgagggaa gatgtcacg 19

<210> 47

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 47 cctagtttag agtgagtaga c 21

<210> 48

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 48 gtgatatatt gctcaaggat cc 22

<210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 49 gttgctggct gtcactgatc 20

<210> 50

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 50 gtgatgtgca gggttcaagg 20

<210> 51

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum <220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 51 gattagtgta gatcttagct tg 22

<210> 52

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 52 aaatctctct cacaattatc cc 22

<210> 53

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 53 ctattgactg aacctgctga g 21

<210> 54

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220> <221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 54 tgaagtcatt tagtccacag c 21

<210> 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 55 agatcggagt gtgaacatgg 20

<210> 56

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 56 cttctacttc tagtcgactg c 21

<210> 57

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 57 cgtagtccat ctgaagctcc 20

<210> 58

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 58 tcttcttctg ctagtcgtcg 20

<210> 59

<211> 23

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 59 actattctca cgtaagggga cac 23

<210> 60

<211> 23

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 60 gtgtacatgt atgaaactct agc 23

<210> 61

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 61 gttcctttca atcagaaagt ag 22

<210> 62

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 62 ctttggatga gtcaaaaggc t 21

<210> 63

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223> <400> 63 caagttacgg caaccaagag 20

<210> 64

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 64 ctttgacaca gtgttagaat gc 22

<210> 65

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 65 cgtgatctag gagttacgac 20

<210> 66

<211> 25

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 66 cttattttaa atacaagaca tctgg 25

<210> 67

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 67 cagaggaaag tcaaccaacg 20

<210> 68

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 68 cagaggaaag tcaaccaacg 20

<210> 69

<211> 24

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(24)

<223>

<400> 69

tcggctatga ctgggcacaa caga

24

<210> 70

<211> 24

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(24)

<223>

<400> 70

aagaaggcga tagaaggcga tgcg

24

<210> 71

<211> 18

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(18)

<223>

<400> 71

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 72

<211> 19

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> marcador de mapeo

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 72

ggaaacagct atgaccatg 19

<210> 73

<211> 18

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(18)

<223>

<400> 73 ttcagcacaa ataccaat 18

<210> 74

<211> 18

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(18)

<223>

<400> 74 gatgttcccc ttctttta 18

<210> 75

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 75 ttgtggttat cgatgagaat 20

<210> 76

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 76 acctggcgtt ccttattttt 20

<210> 77

<211> 15

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> características misceláneas

<222> (1)..(1)

<223> N= A+T+G+C

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(15)

<223>

<220>

<221> características misceláneas

<222> (7)..(7)

<223> W=A+T

<220>

<221> características misceláneas

<222> (6)..(6)

<223> S=G+C

<220>

<221> características misceláneas

<222> (10)..(10)

<223> N=A+T+G+C

<220>

<221> características misceláneas

<222> (12)..(12)

<223> W=A+T

<400> 77 ngtcaswgan awgaa 15

<210> 78

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 78 gatggagcgg aaaagccggt g 21

<210> 79

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 79 ggtgttttgt agcatctcca g 21

<210> 80

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 80 ccatgattac gccaagctgg 20

<210> 81

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 81 ggttttccca gtcacgacgt 20

<210> 82

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 82 agaaagctca ccagtggacc 20

<210> 83

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum <220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 83 atttatggct gcagaggacc 20

<210> 84

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<400> 84 aagtccaatt gctcatccat c 21

<210> 85

<211> 19

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 85 tgcaccatgc acgaaggtc 19

<210> 86

<211> 22

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 86 caatwttggt tcccgaaatt gg 22

<210> 87

<211> 25

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 87 atggaaaaac gaaaagataa tgaag 25

<210> 88

<211> 25

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 88 ctacttaaat aacgggatat ccttc

<210> 89

<211> 20

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 89 cccatgactc cttgagtttg 20

<210> 90

<211> 21

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 90 ggtggggttg ggaagacaac g 21

<210> 91

<211> 19

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 91 gtagactgcg taccaattc 19

<210> 92

<211> 16

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> cebador

<222> (1)..(16)

<223>

<400> 92 gatgagtcct gagtaa 16

<210> 93

<211> 2913

<212> ADN

<213> Solanum bulbocastanum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2913)

<223> Rpi-blb o RB (Song, PNAS, 2003, 9128-9133)

<400> 93

<210> 94

<211> 970

<212> PRT

<213> Solanum bulbocastanum

<400> 94

Referencias

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Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para generar o incrementar la resistencia de una planta a un patógeno vegetal del filum Oomiceta que comprende incrementar la actividad de una proteína Rpi-blb2 en una planta o en un tejido, órgano o célula de una planta

   o una parte de los mismos expresando una proteína Rpi-blb2 transgénica que codifica una molécula de ácido nucleico y/o incrementar el número de copias de una proteína de la Rpi-blb2 que codifica una molécula de ácido nucleico, en donde dicha proteína de la Rpi-blb2 es codificada por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

   (a)

   molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2 o 4;

   (b)

   molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

   (c)

   molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) por medio de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como resultado una homología de más de 85% de identidad;

   (d)

   molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento biológicamente activo de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (c);

   (e)

   molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (d) y que codifica una proteína Rpi-blb2;

   o la cadena complementaria de uno cualquiera de (a) a (e).

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en donde se incrementa la actividad de una proteína de resistencia adicional.

3. 3.

   El método de las reivindicaciones 1 o 2, donde la actividad se incrementa debido a una expresión de novo.

4. 4.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se incrementa la actividad endógena de una proteína Rpi-blb2 y/o de una de resistencia adicional.

5. 5.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una o más de las siguientes etapas: a) estabilizar la proteína de resistencia; b) estabilizar la proteína de resistencia que codifica ARNm; c) incrementar la actividad específica de la proteína de resistencia; d) expresar e incrementar la expresión de un factor de transcripción homólogo o artificial para la expresión de la

   proteína de resistencia; e) estimular la actividad de la proteína de resistencia a través de factores inductores exógenos; f) expresar un gen que codifica una proteína de resistencia transgénica; y/o g) incrementar el número de copias del gen que codifica la proteína de resistencia.

6. 6.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que da como resultado la reducción en el índice de esporulación de al menos 30% después de infección con P. infestans en comparación con un tipo silvestre.

7. 7.

   Un método para la producción de una planta, célula vegetal o tejido vegetal transgénicos o una parte de los mismos que tiene una resistencia incrementada a un patógeno vegetal del filum Oomiceta, comprendiendo dicho método

   (i)

   la introducción de un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

   (a)

   molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2 o 4;

   (b)

   moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3

   o 5 o 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

   (c)

   molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) por medio de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como resultado una homología de más de 85% de identidad;

   (d)

   moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento biológicamente activo de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (c);

   (e)

   molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (d) y que codifica una proteína Rpi-blb2;

   o (f) la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (e):

   o (g) el polinucleótido de cualquiera de (a) a (f) y un polinucleótido que codifica una proteína de resistencia adicional,

   en el genoma de dicha planta, tejido vegetal o célula vegetal o una parte de los mismos; y

   (ii)

   la selección de plantas en la cual, en oposición o en comparación con la planta de referencia, la resistencia a dicho patógeno existe o se incrementa.

8. 8. Planta transgénica o tejido vegetal que tiene una resistencia a Oomicetos, que comprende células de la planta transgénica que contiene un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

   (a)

   molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2 o 4;

   (b)

   moléculas de ácido nucleico que comprende las secuencias de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 o 5 o 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido; o la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (b);

   enlazado a elementos reguladores que permiten la expresión del polinucleótido en células vegetales, en donde el polinucleótido es foráneo para la célula vegetal transgénica.
9. 9. Un método para producir una planta o parte de la misma resistente a un patógeno vegetal del filum Oomiceta que comprende la etapa de:

   expresar en una planta o una parte de la misma un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

   (a)

   molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2 o 4;

   (b)

   moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3

   o 5 o 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

   (c)

   molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) por medio de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como resultado una homología de más de 85% de identidad;

   (d)

   moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento biológicamente activo de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c);

   (e)

   molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (d) y que codifica una proteína Rpi-blb2;

   o la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (e) y una proteína de resistencia adicional, en donde la proteína de resistencia adicional es Rpi-blb, R1, R-ber, Rpi1, R2, R3a, R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, Ph-1, Ph-2 y/o Ph-3.

10. 10. Planta transgénica o tejido vegetal que expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

    (a)

    molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2 o 4;

    (b)

    moléculas de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3

    o 5 o 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

    (c)

    molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) por medio de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como resultado una homología de más de 85% de identidad;

    (d)

    moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento biológicamente activo de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c);

    (e)

    molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (d) y que codifica una proteína Rpi-blb2;

    o la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (e);

    y una proteína de resistencia adicional, en donde la proteína de resistencia adicional es Rpi-blb, R1, R-ber, Rpi1, R2, R3a, R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, Ph-1, Ph-2 y/o Ph-3, y la cual por presencia del polinucleótido es resistente a un patógeno vegetal del filum Oomiceta.
11. 11. Uso de un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

    (a)

    molécula de ácido nucleico que codifica al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2 o 4;

    (b)

    moléculas de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación como se representa en SEQ ID NO: 1 o 3

    o 5 o 6 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

    (c)

    molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b) por medio de sustitución, eliminación y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de (a) o (b), dando como resultado una homología de más de 85% de identidad;

    (d)

    moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento biológicamente activo de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c);

    (e)

    molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida bajo condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (d) y que codifica una proteína Rpi-blb2;

    o la cadena complementaria de cualquiera de (a) a (e), un vector que contiene dicho polinucleótido o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificado por dicho polinucleótido para producir una planta o un tejido vegetal, órgano vegetal o una célula vegetal o una parte de los mismos resistente a un patógeno vegetal del filum Oomiceta.

12. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 9, en donde el patógeno vegetal es del orden Pythiales

    o Peronosperales.

13. 13.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 9 o 12, en donde el patógeno vegetal es de la especie P. infestans, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora capsici, Phytophthora sojae, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Bremia lactuca, Peronospera tabaci o Plasmopara viticola.

14. 14.

    El método de la reivindicación 9, en donde la proteína de resistencia adicional es la proteína Rpi-blb.

15. 15.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 9 o 12 a 14, en donde el polinucleótido, el polipéptido, la célula vegetal, el tejido vegetal o la planta se derivan de la familia Solanaceae, preferiblemente S. bulbocastanum,

    patata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum o Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farwell), petunia, tomate de árbol (S. betaceum), melón pera (S. muricatum) o berenjena (S. melongena).

16. 16.

    El tejido vegetal o planta de la reivindicación 8 o 10, en donde el patógeno vegetal es del orden Pythiales o Peronosperales.

    5 17. El tejido vegetal o planta de la reivindicación 8 o 10, en donde el patógeno vegetal es de la especie P. infestans, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora capsici, Phytophthora sojae, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Bremia lactuca, Peronospera tabaci o Plasmopara viticola.

17. 18.

    El tejido vegetal o planta de la reivindicación 10, en donde la proteína de resistencia adicional es la proteína Rpi-blb.

18. 19.

    El tejido vegetal o planta de la reivindicación 8 o 10, en donde el tejido vegetal o la planta se derivan de la familia

    10 Solanaceae, preferiblemente S. bulbocastanum, patata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum o Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farwell), petunia, tomate de árbol (S. betaceum), melón pera (S. muricatum) o berenjena

    (S. melongena).

19. 20.

    El uso de la reivindicación 11, en donde el patógeno vegetal es del orden Pythiales o Peronosperales.

20. 21.

    El uso de la reivindicación 11, en donde el patógeno vegetal es de la especie P. infestans, Phytophthora

    15 erythroseptica, Phytophthora capsici, Phytophthora sojae, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Bremia lactuca, Peronospera tabaco o Plasmopara viticola.
21. 22. El uso de la reivindicación 11, en donde el polinucleótido, el polipéptido, la célula vegetal, el tejido vegetal o la planta se derivan de la familia Solanaceae, preferiblemente S. bulbocastanum, patata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum

    o Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farwell), petunia, tomate de árbol (S. betaceum), melón pera (S.20 muricatum) o berenjena (S. melongena).

    Figura 4 dia 3 Figura 4 dia 4 Figura 4 dia 5 Figura 4 dia 6 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8

    Figura 11 Figura 12

    Figura 13

    Figura 13B

    Figura 13C

    Figura 13D

    FIGURA 14 FIGURA 15

    Figura 18