ES2399000B1

ES2399000B1 - Método para producir una estructura porosa de polisfosfato cálcico

Info

Publication number: ES2399000B1
Application number: ES201201225A
Authority: ES
Inventors: Eduardo Anitua Aldecoa
Original assignee: BTI Biotechnology Insttitute
Current assignee: BTI Biotechnology Insttitute
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-01-28
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: US20140162364A1; AR093930A1; WO2014091036A1; ES2399000A1; EP2933241A1; ES2670068T3; TW201427728A; EP2933241B1

Abstract

Método para producir una estructura porosa de polifosfato cálcico, que comprende los pasos de mezclar fosfato monocálcico (MCP) con ácido silícico, y sinterizar la mezcla a una temperatura o temperaturas predeterminadas durante un tiempo predeterminado, obteniéndose un polifosfato cálcico poroso. El método permite obtener un biomaterial poroso de porosidad regulable, que además presenta la capacidad de activar las plaquetas de un plasma rico en plaquetas y producir la liberación de factores de crecimiento de las plaquetas.

Description

Sector de la técnica

La invención se refiere a un método para producir una estructura porosa de polifosfato cálcico que sirva como biomaterial utilizable en regeneración Ósea u otras aplicaciones de diferentes campos de la medicina.

Estado de la técnica

Los procedimientos de regeneración ósea son una práctica frecuente en ortopedia, odontología y otros campos de la medicina para tratar pacientes que han sufrido perdida ósea debido a trauma, infecciones o tumores. En los procedimientos de regeneración ósea suelen utilizarse biomateriales para conseguir ciertos efectos: servir de material de relleno, servir de soporte para la regeneración ósea, favorecer la regeneración ósea, entre otros. Los biomateriales son materiales que se caracterizan por ser capaces de interactuar con el sistema biológico del paciente, estando más concretamente diseñados para actuar interfacialmente con sistemas biológicos con el fin de evaluar, tratar, aumentar o reemplazar algún tejido, órgano o función del cuerpo (Planell E, Gil M, Ginebra M. Biomateriales. En: Viladot V. Lecciones básicas de biomecánica del aparato locomotor. 1a ed. Barcelona: Springer-Verlag Iberica: 2000. p. 291-304).

En el campo de la regeneración ósea, el mejor biomaterial es el hueso autólogo, es decir, el hueso proveniente del propio paciente. Sin embargo, el hueso autólogo presenta limitaciones en cantidad y forma , y además exige una cirugía aparte para ser obtenido, lo que aumenta el riesgo de complicaciones quirúrgicas. Por ello, con el avance del tiempo y la tecnología han ido surgiendo alternativas al uso de hueso autólogo que resultan menos traumáticas para el paciente. De forma especialmente relevante, los fosfatos cálcicos forman una alternativa eficiente al hueso autólogo ya que se caracterizan por ser biocompatibles, osteoconductores y reabsorbibles. De entre los fosfatos cálcicos, los ortofosfatos cálcicos han prevalecido en ocupar el interés de la comunidad científica; no obstante, los pOlifosfatos cálcicos (también denominados metafosfatos cálcicos) son otra alternativa biocompatible y reabsorbible.

Normalmente, para optimizar la regeneración ósea catalizada por un biomaterial es necesario que éste sea poroso, a semejanza del hueso, que es también poroso. Es decir, es necesario que el biomaterial sea capaz de ser convertido o conformado en una estructura porosa. En el caso de utilizarse pOlifosfato cálcico, la generación de estructuras porosas del mismo se realiza mediante un tratamiento térmico de fosfato mono cálcico (MCP), es decir, de Ca(H,PO.),.H,O o Ca(H,PO,). En el estado de la técnica se conocen diversos ejemplos de métodos de fabricación de estructuras porosas de pOlifosfato cálcico basadas en este tratamiento.

Un ejemplo de método, descrito en PiUiar RM, et al. Biomaterials 2001 ;22:963-973, es el siguiente: se calienta el MCP a 500'C durante 10 horas y luego se funde a 1100'C durante una hora; seguidamente, se enfría muy rápidamente el material para producir un compuesto amorfo; entonces, se seleccionan las partículas que presenten un tamaño de granulo dentro de un rango adecuado; finalmente, se calientan las partículas seleccionadas a una temperatura de 970°C durante 2 horas.

En otro ejemplo, la solicitud de patente W09745147A1 describe un método de obtención de polifosfato cálcico poroso para su uso en la regeneración de la interfase entre el hueso y otros tejidos conectivos, donde dicho método comprende también varios pasos de calentamiento de un monofosfato cálcico para sintetizar finalmente una estructura porosa de polifosfato cálcico. En el método se emplea ácido clorhídrico para disolver parte del polifosfato cálcico y contribuir a la formación de porosidad. El polifosfato cálcico obtenido presenta una forma cristalina exclusivamente de tipo beta.

En otro ejempto, la patente US7494614 describe un método de producir estructura porosa de polifosfato cálcico beta que incluye también varios pasos de calentamiento. En resumen, se procesa monofosfato cálcico (MCP) para producir polifosfato cálcico amorfo a temperatura final de 11 OO'C. El polifosfato cálcico amorfo se tritura en gránulos, eligiéndose después los gránulos que presentan un diámetro dentro de un rango. Los gránulos seleccionados se introducen dentro de un molde. Seguidamente, se calienta el contenido del molde a varias temperaturas hasta producir la cristalización del pOlifosfato cálcico amorfo.

En otro ejemplo aún, la solicitud de patente W003055418A1 describe la producción de estructuras porosas de varios fosfatos cálcicos mediante la ejecución de varios pasos de calentamiento de un material inicial. Además, se utilizan ácidos orgánicos o inorgánicos como catalizadores, por ejemplo ácido clorhídrico, para disolver parte del material y ayudar en la formación de una estructura porosa.

Por otra parte, según evoluciona la tecnología están apareciendo nuevos requisitos que deben cumplir los biomateriales utilizados en regeneración ósea. Así, una característica que va tornándose cada vez más deseable en los nuevos biomateriales es que presenten cierta o mucha capacidad para, puestos en contacto con una formulación rica en plaquetas, favorecer la activación de las plaquetas de dicha formulación de manera que se libere su contenido de factores de crecimiento y se provoque también la formación de fibrina (la activación de plaquetas y la formación de fibrina son necesarias para fomentar la regeneración de los tejidos). Evidentemente, no todos los biomateriales presentan esta capacidad. Por ejemplo, en un estudio reciente de Cho HS, Park SY, Kim S, et al. titulado MEffect of different bone substitutes on the concentration of growth factors in platelet-rich plasma" (J Biomed Appl 2008;22:545557), se ha estudiado la capacidad de dos cerámicas utilizadas muy comúnmente como biomaterial en regeneración ósea (la hidroxiapatita yel polifosfato cálcico) para activar las plaquetas. Los resultados de dicho estudio apuntan a que ninguno de estos materiales es capaz de activar las plaquetas.

La presente invención tiene como objetivo proponer un nuevo procedimiento de obtención de una estructura porosa de polifosfato cálcico, que solucione al menos uno de los problemas anteriores.

Es decir, por un lado el procedimiento deberá ser sencillo de ejecutar y deberá comprender pocos pasos en comparación con los procedimientos conocidos en el estado de la técnica.

Además, al menos en alguno de sus modos de realización, el procedimiento deberá permitir obtener un nuevo biomaterial que, en contacto con una formulación rica en plaquetas, tenga capacidad de activar plaquetas contenidas en dicha formulación para liberar su contenido de factores de crecimiento e inducir la formación de fibrina.

El biomaterial obtenido mediante el procedimiento de la invención podrá ser apto para ser utilizado en regeneración ósea y en otras aplicaciones de diferentes campos de la medicina.

Descripción breve de la invención

Con el objetivo de resolver uno o más de los problemas descritos anteriormente, se propone un método para producir una estructura porosa de polifosfato cálcico, que comprende los pasos de mezclar fosfato monocálcico (MCP) con ácido silícico y de sinterizar la mezcla a una temperatura o temperaturas predeterminadas durante un tiempo predeterminado, obteniéndose un polifosfato cálcico poroso. Por sinterizar se entiende calentar la mezcla a una temperatura inferior a la temperatura de fusión de la mezcla.

La ventaja de partir de una mezcla de fosfato monocálcico (MCP) con ácido silicico, en lugar de partir de MCP sin mezclar, como es conocido en el estado de la técnica, es que variando la proporción entre ácido silícico y el MCP y variando la temperatura de sinterización es posible conseguir biomateriales de diferente porosidad y de diferente fase cristalina (beta o beta+gamma). Además, el biomaterial resultante presenta la capacidad de activar las plaquetas de un posible compuesto rico en plaquetas en contacto con el biomaterial, gracias a la presencia de los iones de silicio en el biomaterial. El método según la invención es además un método de sencilla ejecución.

Descripción breve de las figuras

Los detalles de la invención se aprecian en las figuras que se acompañan, no pretendiendo éstas ser limitativas del alcance de la invención:

La Figura 1 muestra diferentes fotografías de biomateriales obtenidos según el método de la invención a diferentes proporciones de mezcla de MCP y ácido silícico. La Figura 2 muestra una fotografía de un material fundido obtenido tras una sinterización a 100QoC. La Figura 3 muestra una fotografía de un biomaterial obtenido con un precalentamiento a 7S'C y de un material no inflado obtenido con un precalentamiento de 230°C. La Figura 4 muestra unas fotografías de biomateriales obtenidos con la adición de diferentes cantidades de carbonato cálcico. La Figura 5 muestra imágenes de microscopia electrónica de un polifosfato cálcico sintetizado a partir de MCP en solitario y de un pOlifosfato cálcico sintetizado a partir de MCP mezclado con ácido silícico modificado con carbonato cálcico al 10%. La Figura 6 muestra el patrón de difracción de rayos X de una cerámica preparada según un modo de realización del método de la invención. La Figura 7 muestra el patrón de difracción de rayos X de una cerámica preparada según otro modo de realización del método de la invención. La Figura 8 muestra la formación de membrana de fibrina aglutinando la cerámica preparada según el método de la invención. La Figura 9 muestra una gráfica de la proliferación celular en dos composites de plasma rico en factores de crecimiento y, respectivamente, un polifosfato cálcico obtenido a partir de solamente MCP y un polifosfato cálcico obtenido según la invención.

5 Descripción detallada de la invención

Se define un método para producir una estructura porosa de polifosfato cálcico, que comprende los pasos de:

lOa) Mezclar fosfato monocálcico (MCP) con ácido silícico.

b) Sinlerizar la mezcla a una temperatura predeterminada durante un tiempo predeterminado, de manera que la mezcla se infla y se obtiene un polifosfato cálcico poroso. Por sinterizar se entiende

15 calentar la mezcla a una temperatura inferior a la temperatura de fusión de la mezcla. La estructura porosa del polifosfato cálcico se produce mediante un mecanismo de inflación de la masa al calentar el MCP.

20 Por una parte, el método combina la producción de una estructura porosa y la formación del pOlifosfato cálcico en el mismo paso (la sinterización), resultando en un método muy simplificado que, en comparación con el estado del arte, reduce notablemente el número de pasos necesarios para generar la estructura porosa. Por ejemplo,

25 recuérdese que en el método de PiUiar RM, et al. Biomaterials 2001;22:963-973, se ejecutaban cinco pasos para conseguir la estructura de polifosfato cálcico porosa: un primer calentamiento de MCP, una segunda fase en la que se funde el MCP, una tercera fase en la que se enfría muy rápidamente el material, una cuarta fase de selección de

30 gránulos adecuados y una quinta fase de calentamiento. En el método descrito en la patente US7494614 se ejecutaban también varias fases de calentamiento.

El procedimiento según la invención permite obtener biomateriales 35 polifosfatos cálcicos de diferente porosidad, en función de la proporción de la mezcla de MCP y ácido silícico, y en función de la temperatura de sinterización. En consecuencia, el procedimiento permite obtener biomateriales de porosidad controlada y por lo tanto estables. Dado que la porosidad de un biomaterial influye directamente en su degradación y en sus propiedades mecánicas (ver por ejemplo Wang a, Wang Q, Wan C. 5 The etreet of porosity on the structure and properties of calcium polyphosphate bioceramics. Ceramics-Silikaty 2011 ;55:43-48, donde se describe que la disolución y la fuerza de compresión de un biomaterial aumenta y disminuye respectivamente al incrementarse la porosidad del mismo), el poder controlar la porosidad del biomaterial final permite a la 10 invención obtener biomateriales que no se rompen fácilmente. Además, la porosidad también es factor importante que controla la liberación de bioactivos y de medicamentos desde una matriz. El aumento de la porosidad acelera la liberación de estos bioactivos de las cerámicas y cementos cálcicos [Alkhraisat MH, Rueda C, Cabrejo-Azama J, et al.

15 Loading and release of doxycycline hyclate from strontium-substituted calcium phosphate cement. Acta Biomater 2010;6:1522-1528).

Es más, el ajuste de la proporción de la mezcla de MCP y ácido silícico y/o el ajuste de la temperatura de sinterización permiten controlar 20 no s610 la porosidad total sino también la distribución de los poros según su tamaM (macro-, meso-, y micro-poros). Cada tamano de poro puede ser interesante por motivos diferentes y en función de la aplicación. Por ejemplo, la presencia de macro-poros ('i!': 100 ~m) y meso-poros (10-100 ~m) influye en la degradación del biomaterial in vivo y permite la 25 penetración de las células en la estructura porosa y el crecimiento vascular que garantiza el riego sangufneos del nuevo tejido formado dentro de la estructura porosa. También es importante que la estructura porosa tenga una población de micro-poros « 10 ~m) ya que ello garantiza la interconectividad entre los poros y aumenta el área de

30 superficie específica [Wei J et al. Hierarchically microporous/macroporous scaffold of magnesium-calcium phosphate for bone tissue regeneration; Biomaterials 2010;31: 1260-1269). Esta interconectividad también garantiza la difusión de nutrientes y de productos secundarios del metabolismo celular.

35 La tabla siguiente muestra diferentes porosidades en biomateriales

•

obtenidos de las formas siguientes: sinterizando MCP en solitario (lo que se corresponde con el estado del arte) y sinlerizando a diferentes temperaturas distintas mezclas de MCP y ácido silícico en diferentes concentraciones, estando las mezclas realizadas en diferentes

5 proporciones entre el MCP (polvo) y el ácido silícico (liquido). Las

porosidades han sido medidas por un procedimiento de medida por porosimetria de mercurio a alta presión.

Como puede observarse en la tabla anterior, el procedimiento según la invención no sólo aumenta la porosidad con respecto al biomaterial obtenido a partir de MCP en solitario, sino que también mejora la distribución del tamat'lo de poros dado que permite obtener un biomaterial con mayor población de micro-poros. Ha de recordarse que el aumento de la población de micro-poros mejora la inlerconectividad ente los macro-y meso-poros. A su vez, la población de macro-poros se mantiene o aumenta en comparación con el biomaterial preparado a partir de MCP en solitario.

Preferentemente, la mezcla de MCP con ácido silícico se realiza en una proporción peso/volumen menor o igual a 100 g/mi, ya que a partir de este valor no se produce una variación sustancial de la porosidad. De forma especialmente ventajosa, se mezcla MCP con ácido silícico en una proporción peso/volumen entre 1 y 50 g/mi ya que éste es el rango dónde se producen variaciones en las propiedades que resultan en los mejores resultados obtenidos.

Por ejemplo, en un caso práctico se efectuaron diferentes mezclas de fosfato monocálcico con una solución de ácido silícico al 75,6% (v/v), a diferentes proporciones de mezcla de 1, 4,5, 7,5, 20, 40, 50 Y 100 g/mi (gramos de MCP en polvo por mililitros de ácido sillcico en liquido). Se calentaron las mezclas a una temperatura de 75°C durante 5 horas, y posteriormente a una temperatura de 650°C durante 10 horas. Un polifosfato cálcico producido a partir de solamente MCP y siguiendo el mismo protocolo sirvió como control. Se obtuvieron diferentes biomateriales, los cuales se muestran en las fotografías de la Figura 1, Y cuyas porosidades fueron comparadas entre sí. Los resultados indican que la estructura porosa producida según este protocolo fue parecida para el polifosfato cálcico producido a una relación polvo-líquido de 40, 50 Y 100 g/mi (tres últimas fotografias de la figura) y para el biomaterial de control (primera fotografia del a figura), siendo la forma de estas estructuras no excesivamente resistente y rompiéndose la misma con cierta facilidad. En cambio, las estructuras porosas obtenidas a partir de proporciones polvo-liquido de 4,5 (no fotografiado), 7,5 y 20 g/mi (tercera y cuarta fotografía respectivamente) fueron capaces de producir

estructuras porosas mas resistentes y de una forma estable. Por último, la relación polvo-líquido de 1 g/mi resultó en una estructura densa, visible en la segunda fotografia.

En otro ejemplo, se efectuaron diferentes mezclas de fosfato monocálcico con una solución de ácido silícico al 75,6% (vlv), a diferentes proporciones de mezcla de 1, 20, 40, Y 50 g/mI. El polifosfato cálcico fue producido calentando la mezcla a una temperatura de 75°C durante 5 horas seguido por una temperatura de 650°C durante 10 horas. Después de la sinterización, se trituraron las cerámicas eligiendo un tamaño de gránulo de entre 0,5 y 0,8 mm. Se incubaron 0,15 gr del granulado de cada material en tampón fosfato (PBS; pH=7,3) durante 24 horas. La evaluación del pH indicó unos valores de pH de 2 y entre 6 y 7 para las muestras preparadas respectivamente con una relación polvo-líquido de 1 Y 20 g/mI. El pH del PBS no varió en el caso de las muestras preparadas con una relación polvo-líquida de 40 y 50 g/mi. Esto demuestra que la solubilidad (degradabilidad) del polifosfato cálcico se puede variar mediante la elección del valor de la relación polvo líquido (masa de MCP por volumen de ácido silícico).

En lo que se refiere al paso de sinterizar la mezcla con el fin de obtener una estructura porosa de polifosfato cálcico, dicha sinterización se realiza preferentemente a una temperatura inferior de 980°C. Ello permite que se consiga formar con éxito polifosfato cálcico poroso en la estructura cristalina del biomaterial. Así, sinterizar el polifosfato cálcico a una temperatura mayor o igual de 980°C produciría en cambio la fusión del polifosfato cálcico (Wang K. The effect of polymericchain-likestructure on the degradation and cellular biocompatibility of calcium polyphosphate. Materials Science and Engineering e 2008;28:1572-1578) y también la producción de polifosfato cálcico amorfo, no interesando ninguno de estos efectos a la presente invención.

En un ejemplo práctico se mezclaron 15 9 de MCP con 2 mi de una solución de ácido silícico con una concentración de iones de silicio de 86,1 % (vlv». Se sinterizó la mezcla a una temperatura de 1000'C durante 10 horas, produciéndose la fusión del polifosfato cálcico e impidiéndose la

formación de una estructura porosa. La Figura 2 muestra una fotografía del material fundido obtenido.

De forma especialmente ventajosa, la sinterización se realiza a una

5 temperatura de entre 500 y 750°C. Asf, aunque se obtiene una estructura porosa de polifosfato cálcico a una temperatura de 500°C, aumentar la temperatura a valores de 650°C y 750°C endurece más la estructura porosa y permite regular la porosidad. Además, a la hora de triturar los polifosfatos cálcicos para producir el granulado (lo cual es interesante

10 para elegir un tamal"lo de gránulo adecuado para rellenar los defectos óseos y estimular la formación de nuevo hueso, para facilitar su uso para aumentar el volumen de injerto de hueso autólogo obtenido durante la cirugía, para facilitar su mezcla con líquidos tales como plasma rico en plaquetas o sangre, y para facilitar su aplicación en defectos óseos de

15 distintas geometrías y tamaños) se ha observado que se necesita más fuerza para romper el polifosfato cálcico producido a temperaturas de 650°C y 750'C que el polifosfato cálcico sintetizado a 500'C.

Por ejemplo, se sinterizó una mezcla de MCP y ácido silícico 75,6%

20 realizada en una proporción de 7,5 g/mi a tres temperaturas diferentes, de 500, 650 Y 750'C durante 10 horas. Los resultados, visibles en la tabla siguiente, la cual es un extracto de la tabla 1, muestran que el aumento en la temperatura permitió conseguir estructuras con diferente número de macro-poros, meso-poros y micro-poros y con una porosidad total también

25 variable.

Material: Relación Poro- Macro- Meso- Micro

polvo-líquido: sidad poros poros poros

Sinterizado a 500°C durante 10 horas

MCP + ácido: 7,5 g/mi 49,01% 55,20% 35,20% 20%

silícico 75,6%

Sinterizado a 650°C durante 10 horas

MCP + ácido: 7,5 g/mi 50,46% 68,67% 16,50% 14,83%

silícico 75,6%

Material: Relación polvo-líquido Porosidad Macro-poros Meso-poros Micro-poros

Sinterizado a 750·C durante 10 horas

MCP + ácido silícico 75,6%: 7,5 g/mt 48,62% 64,28% 22,36% 13,36%

Tabla 2. Porosidad de polifosfato cálcico preparado a partir de MCP modificado con ácido silícico al 75,6% a 7,5 g/mi y a diferentes temperaturas.

5 En caso de realizarse la sinterización a una temperatura de entre 500 y 750°C, el método según la invención opcionalmente comprende el paso de calentar la mezcla a una temperatura inferior a 20QoC, el cual se ejecuta previo a la sinterización. Este paso previo permite la máxima inflación de la masa del fosfato monocálcico.

Por ejemplo, una mezcla de MCP y una solución de ácido silícico con una concentración de iones de silicio de 75,6% (v/v) fue sinteri2ada siguiendo dos protocolos: calentar a una temperatura de 75°C durante 5 horas seguido por una temperatura de 650°C durante 10 horas; calentar a

15 una temperatura de 230°C durante 5 horas seguido por una temperatura de 650·C durante 10 horas. El resultado fue que en et primer protocolo se produjo una inflación, mientras que en el segundo protocolo no se produjo una inflación (véase en la Figura 3 cómo el primer material se encuentra inflado mientras que el segundo mantiene la consistencia inicial).

Preferentemente, la sinterización se realiza durante un tiempo mayor o igual a 2 horas. Ello permite garantizar ta transformación de la mezcla en polifosfato cálcico. De forma especialmente ventajosa, la sinterización se realiza durante un tiempo de entre 5 y 10 horas para

25 garantizar que la sinterización no es excesiva en el tiempo y asegurar que se obtiene una estructura porosa y no un material con otra forma (por ejemplo un polvo). Así, en un ejemplo se realizó una mezcla de MCP y una solución de ácido silícico con una concentración de iones de silicio (v/v) de 76,5% y se sinterizó dicha mezcla a una temperatura de 500°C

30 durante dos tiempos diferentes de 10 horas y 20 horas. la sinterizaci6n de 10 horas dio lugar a una estructura sólida porosa mientras que ta

sinterización de 20 horas dio lugar a un polvo.

Opcionalmente, en el paso de mezclar MCP con ácido silícico se mezcla también una fuente de iones de calcio, que es preferentemente 5 carbonato cálcico y/o hidróxido cálcico, dado que estos compuestos no aportan otros iones adicionales que puedan no ser convenientes para el biomaterial. Los iones de calcio permiten aumentar en mayor medida la porosidad, como puede observarse en la tabla siguiente, que muestra la porosidad de los biomateriales resultantes de sinterizar a 650°C los

10 siguientes materiales de partida: MCP en solitario (estado de la técnica), MCP mezclado con ácido silícico al 75,6% en una proporción de 7,5 g/mi, MCP mezclado con ácido silícico al 86,1% en una proporción de 7,5 g/mi, y los dos materiales anteriores mezclados además con hidróxido cálcico, que sirve como fuente de iones de calcio.

Material Relación

Poro-

Macro-Meso-

Micropolvo-líquido

sidad

poros poros

poros 650°C durante 10 horas MCP solo

56,19%

73,40% 19,46% 7,40%

-

%

MCP + ácido 7,5 g/mi

50,46%

68,67%

16,50%

14,83% silícico 75,6% MCP + ácido

7,5 g/mi

54,30%

60,47%

28,79%

10,74% silícico 86,1% MCP + ácido

7,5 g/mi +

68,05%

69,17%

24,04%

6,79% silícico 86,1 %

5%Ca(OH)2 MCP + ácido

7,5 g/mi +

72,81 %

53,09% 34 ,81 % 12,1%

silícico 86,1% 10%Ca(OH)2

Tabla 3. Porosidad de polifosfato cálcico preparado a partir de MCP

modificado con ácido silícico, opcionalmente con hidróxido cálcico.

En lo que respecta al uso de carbonato cálcico (CaC03), en un ejemplo, a la mezcla de MCP y una solución de ácido silicico al 75,6% (vlv) (en una relación polvo-líquida de 7,5 g/mi) se añadió carbonato cálcico en una relación (peso/peso) de 5%, 10%, 20%, Y 60%. Los resultados indicaron que la porosidad del polifosfato cálcico aumentó a concentraciones inferiores al 20% mientras concentraciones iguales o mayores del 20% compactaban el polifosfato cálcico y producía estructuras de poca cohesión que se reducían en polvo, como se ilustra en la Figura 4.

En otro ejemplo aún, la producción del palitos tato cálcico desde s610 MCP, sinterizado a 50QoC durante 10 horas, resultó en un compuesto que al incubarlo en agua redujo el pH a un valor cerca de 2. El empleo del carbonato cálcico mejoró este aspecto reduciendo la bajada del pH del agua hasta obtener un pH alcalino a unas concentraciones de CaC03 superiores al 20%. Esta modificación ha contribuido a mejorar la estabilidad de la fibrina en un medio de cultivo. La mezcla de plasma rico en factores de crecimiento con dos polifosfato cálcicos sintetizados a partir de MCP y MCP mezclado con ácido silícico modificado con carbonato cálcico al 10%. Tras 7 días de incubación en medio de cultivo, la inspección visual y también con microscopia electrónica de barrido confirmó la presencia de fibrina sólo en el politostato cálcico modificado con carbonato cálcico. La Figura 5 muestra la estabilidad de fibrina formada en dos polifosfatos cálcicos: un polifosfato cálcico preparado de sólo MCP y un politostato cálcico preparado desde una mezcla del MCP con ácido silicico al 75,6% (v/v) modificado con 10% (peso/peso) de carbonato cálcico. Las muestras se han incubado en medio de cultivo durante 7 días.

La invención también contempla la posibilidad de anadir conjuntamente carbonato cálcico e hidróxido cálcico. En este sentido, se han realizado ensayos en los que se han anadido ambos compuestos conjuntamente, variando la concentración de cada uno de ellos entre 10 Y 40%. Como resultado, se obtuvieron estructuras compactas. Estas estructuras fueron de baja consistencia y se redujeron en un granulado al manipularlas. La incubación de este granulado en agua dio lugar a un pH alcalino.

Opcionalmente, el método según la invención comprende el paso de añadir una fuente de iones de calcio después de la fase de sinterización, En un ejemplo, se procedió a anadir carbonato cálcico e hidróxido cálcico de manera separada y en una concentración de 40% a un polifosfato cálcico previamente sintetizado a 650°C de una mezcla de MCP y una solución de ácido silicio al 75,6% (vlv) (relación polvo-liquido de 7,5 g/mi). El resultado fue que el pH del agua fue alcalino tras incubar la muestra. No se obtuvieron estructuras sino un granulado.

Opcionalmente, el método según la invención comprende el paso previo de obtener ácido silícico hidrolizando una fuente de iones de silicio en solución acuosa ácida. El objetivo principal de utilizar la solución acuosa de iones de silicio no es dopar el MCP con iones de silicio sino producir estructuras de distintos grados de porosidad (variando su valor y también la distribución del tamaño de poros), obteniendo una estructura policristalina calentando a sólo una temperatura en el rango de temperaturas 500·C-980·C.

Preferentemente, la relación entre el volumen de la fuente de iones de silicio y el volumen total de la solución es de entre el 10 Y el 90%. La variación en la concentración de esta fuente de silicio es un parámetro eficaz para controlar la porosidad del pOlifosfato cálcico. Por ejemplo, utilizando una solución de ácido clorhídrico con un pH igual a dos, se puede preparar una solución de ácido silícico mediante hidrólisis de tetraetilo ortosilicato (TE OS). Se mezclan (por agitación magnética) 0,1, 1,99, 3,83, 5,5, 6,08, 7,56 mi de TEOS con 9,9, 8,01 , 6,17, 4,5, 3,92, 2,44, Y 1,39 mi de 0,01 M HCI hasta obtener una solución clara. Después se almacena las mezclas a 4°C durante la noche para completar la hidrólisis del TEOS. El resultado es que se obtienen soluciones con concentraciones de silicio de 1%, 19,9%, 38,3%, 55%, 60,8%, 75,6%, 86,1%. Estas soluciones pueden ser empleadas para producir el biomalerial descrito en esta invención como se muestra en los ejemplos descritos en esta memoria.

Un efecto adicional del procedimiento según la invención es que permite obtener estructuras porosas de polifosfato cálcico de diferentes estructuras cristalinas (fase beta y/o fase gamma) a partir de MCP, a diferencia de en los métodos convencionales, donde a partir de MCP solamente es posible obtener una estructura cristalina, o donde para

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obtener una coexistencia de las fases beta y gamma es necesario partir de polifosfato cálcico amorfo [Gua L et al. ; Phase transformations and structure characterization of calcium polyphosphate during sintering process; Journal of Materials Science 39 (2004) 7041-7047]. Cada 5 estructura cristalina o combinación de estructuras cristalinas presenta diferentes propiedades y por lo tanto puede ser interesante para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, se ha descrito que la fase gamma del polifosfato cálcico es mas soluble que la fase beta del mismo [Jackson LE, et al. Key Engineering Materials 2008;361-363:11-14]. La coexistencia

10 de las fases beta y gamma puede por tanto influir en la solubilidad del biomaterial permitiendo el control de su reabsorción in vivo. Además, puede ser de interés científico para estudiar las propiedades físicoquímicas de la fase gamma y su combinación con la fase beta.

15 Por ejemplo, se mezclaron 15 g de MCP con 2 mi de una solución que contenía Si-OH preparada utilizando TEaS con una concentración de iones de silicio de 86,1% (v/v). Se sinterizó la mezcla a una temperatura de 500°C durante 10 horas. La difracción de rayos X muestra que la cerámica resultante estaba compuesta por la forma beta y gamma del

20 polifosfato cálcico, como puede observarse en la gráfica de la Figura 6. Dicha gráfica muestra el patrón de difracción de rayos X de la cerámica, donde el símbolo {3 indica los picos de difracción que corresponden a la forma beta y el sfmbolo y indica los picos de la forma gamma.

25 En otro ejem·plo, se mezclaron 15 g de MCP con 2 mi de una solución que contenía Si-OH preparada utilizando el TEaS con una concentración de iones de silicio de 86,1% (v/v). Se sinlerizó la mezcla a una temperatura de 650°C durante 10 horas. La difracción de rayos X muestra que la cerámica resultante estaba compuesta por la forma beta,

30 como puede observarse en la gráfica de la Figura 7. Dicha gráfica muestra el patrón de difracción de rayos X de la cerámica, donde el sfmbolo {3 indica los picos de difracción que corresponden a la forma beta y el símbolo y indica los picos de la forma gamma.

35 Opcionalmente, el método según la invención comprende el paso previo de añadir al MCP ylo al ácido silicico iones con efecto biológico como pueden ser iones de magnesio, zinc, estroncio, sodio, potasio, cobre y hierro. Alternativa o complementariamente, el método puede comprender el paso de mezclar la estructura porosa obtenida tras la sinlerización con soluciones o liquidas que contengan dichos iones. El fin de estas dos opciones es permitir que el biomaterial incorpore en su estructura dichos iones de efecto biológico, de manera que al degradarse el biomaterial se van liberando los iones en el lugar donde se sitúe el biomaterial.

En resumen, la mezcla de fosfalo monocálcico (MCP) con ácido silícico permite obtener un biomaterial poroso estable y resistente cuya porosidad puede variarse en función de determinados parámetros del procedimiento. Los parámetros del procedimiento que pueden variarse para regular y controlar la porosidad y las fases cristalinas del biomaterial son: la concentración del ácido silícico, la proporción entre MCP y ácido silícico de la mezcla, la temperatura de la sinterización, la duración de la sinterizadón, un posible precalentamiento ylo una posible adición de iones de calcio.

Una ventaja adicional del método según la invención es que permite producir estructuras porosas válidas en condiciones bajo las cuales no podrían producirse en caso de utilizarse solamente fosfato mono cálcico como malerial de partida. Por ejemplo, en un caso práctico se partió de MCP en solitario y se sometió al mismo a una temperatura inferior a 200°C durante al menos un segundo, seguida de una sinterización a una temperatura por debajo de 9800C. Se obtuvo una estructura porosa frágil e incapaz de mantener su forma. En cambio, partiéndose de MCP mezclado con ácido silícico, como se ha demostrado en los ejemplos de este documento, se obtiene bajo dichas condiciones un biomaterial estable, poroso y con porosidad variable en función de las condiciones exactas de concentración de silicio y de relación polvoliquido.

Otra ventaja del método de acuerdo con la invención es que permite la producción de estructuras porosas parecidas al hueso en su forma. Más concretamente, las estructuras porosas obtenidas por el

,.

método presentan una capa exterior más densa y una capa interior más porosa, a semejanza de la capa cortical de hueso muy denso y el tejido óseo interior más poroso.

Otra ventaja del método de acuerdo con la invención es que la

estructura porosa de pOlifosfato cálcico obtenida presenta a capacidad de

activar plaquetas contenidas en una formulación rica en plaquetas y favorecer de este modo que formulaciones ricas en plaquetas y con finalidad regeneradora de tejidos realicen óptimamente su función regeneradora.

Por ejemplo , se mezclaron 0,3 9 del biomaterial poroso (preparado

con una solución de ácido silfcico al 86,1% Y con una sinterización a

650'C durante 10 horas) con 600 ~I de la fracción más rica en plaquetas

(y por tanto en factores de crecimiento) de un plasma sanguíneo centrifugado de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente

US6569204B1 . Se incubó la mezcla a 37'C durante 10 minutos. En la

Figura 8 se puede observar la formación de una membrana de fibrina aglutinando las partículas de la cerámica, la cual indica que se ha producido la activación de las plaquetas contenidas en la fracción de plasma, es decir, la liberación de los factores de crecimiento contenidos

en dichas plaquetas.

En otro ejemplo, se mezclaron 0,02 9 del biomaterial poroso

(preparado con una concentración de ácido sillcico al 75,6% y 10% CaC03) con 500 1-11 de un plasma sanguineo centrifugado de acuerdo con

el procedimiento descrito en ta patente US6569204B1 . Transcurridos

entre 30 y 40 minutos a temperatura ambiente se formó y produjo la retracción de la fibrina. Se recogió el sobrenadante para analizar el contenido de factores de crecimiento en el mismo. los resultados indicaron que las concentraciones del factor de crecimiento derivado de

plaqueta (PDG F-AB) y el factor transformante de crecimiento beta (TGF-~) fueron de 10039,59 pg/ml ± 368,28 y 42700 pg/ml ± 2121,

respectivamente. Es decir, la presencia del biomaterial poroso preparado de acuerdo con la invención ocasionó la liberación de los factores de crecimiento contenidos en las plaquetas presentes en el plasma, es decir,

lo que se conoce como la activación de las plaquetas, quedando demostrado el potencial del biomaterial preparado según esta invención de activar las plaquetas y de inducir la formación de fibrina .

Otra ventaja del método de acuerdo con la invención es que el biomaterial obtenido puede presentar una notable capacidad de promocionar el crecimiento celular, como medio de cultivo. En este sentido, en un ejemplo se ensayó la capacidad de dos composites formados por un polifosfato cálcico poroso y un plasma rico en factores de crecimiento en promocionar el crecimiento celular. Uno de los composites comprendla polifosfato cálcico sintetizado a partir de solo el MCP y el otro composite comprendia pOlifosfato cálcico sintetizado a partir de MCP y ácido silícico al 75,6% (PLR = 7,5 g/mi), de acuerdo con la invención. Se realizaron cultivos celulares en medio de cultivo sin suero fetal bovino. Los resultados, ilustrados en la Figura 9, claramente indicaron que el polifosfato cálcico de la mezcla modificada con ácido silícico (representado en color negro) mejoró de manera significativamente mayor la proliferación de las células osteoblásticas de MG 63 que el polifosfato cálcico sintetizado a partir de MCP solamente (representado en color blanco).

Opcionalmente, durante la sinterización se realiza una compactación de la mezcla para dotar al material de una forma determinada.

Preferentemente, el biomaterial poroso obtenido es un fosfato cálcico que presenta una porosidad mayor o igual de 30%, preferiblemente entre 40 y 80%, con una población de macro-poros mayor

o igual a 40%, preferiblemente entre 50 y 75%, una población de meso-poros mayor o igual que 10%, preferiblemente entre 10-50%, y una población de micro-poros mayor o igual a 4%, preferiblemente entre 5 y 30%.

Es objeto de la invención asimismo el uso del biomaterial obtenido según el método de la invención para fabricar un material de relleno, destinado a rellenar el espacio generado por la producción de un defecto

en un tejido óseo.

Es objeto de la invención asimismo el uso del biomaterial obtenido según el método de la invención como un medio de soporte para el 5 crecimiento celular, es decir, como un medio para permitir que las células

(por ejemplo osteoblastos) proliferen encima de la superficie del material.

Es objeto de la invención asimismo el uso del biomaterial obtenido según el método de la invención para reforzar matrices orgánicas tales 10 como los polímeros, o geles tales como fibrina, ácido hialurónico, sales de hialuronalo, condroitín 4 sulfato, condroitín 6 sulfato, dextrano, gel de sílice, alginato, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de quitina, preferiblemente quitosano, goma xanthan, agarosa, polietilenglicol (PEG), polihidroxietilenometacrilato (HEMA), proteínas sintéticas o naturales,

15 colágenos o cualquier combinación de los mismos.

Es Objeto de la invención asimismo el uso del biomaterial obtenido

según el método de la invención como matriz para la liberación in situ de

medicamentos, proteínas y factores de crecimiento. Es decir, el

20 biomaterial puede ser cargado con al menos un medicamento, proteína o factor de crecimiento, para que posteriormente sea liberado dicho medicamento, dicha proteína o dicho factor de crecimiento en el lugar donde se sitúe el biomateriaL

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir una estructura porosa de polifosfato cálcico, que comprende los pasos de:

mezclar fosfato monocalcico (MCP) con ácido silícico;

sinlerizar la mezcla a una temperatura o temperaturas

predeterminadas durante un tiempo predeterminado,

obteniéndose un polifosfatb cálcico poroso.
2.

Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que se mezcla fosfato monocálcico (MCP) con ácido silícico en una proporción peso/volumen menor o igual a 100 g/mI.
3.

Método, según la reivindicación 2, que se caracteriza por que se mezcla fosfato monocálcico (MCP) con ácido silícico en una proporción peso/volumen entre 1 y 50 g/mI.
4.

Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que la sinterización se realiza a una temperatura inferior a 980°C.
5.

Método, según la reivindicación 4, que se caracteriza por que la sinterización se realiza a una temperatura de entre 500 y 750°C.
6.

Método, según la reivindicación 5, que se caracteriza por que comprende un paso de calentar la mezcla a una temperatura inferior a 200°C, el cual se ejecuta previo a la sinterización.
7.

Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que la sinterización se realiza durante un tiempo mayor o igual a 2 horas.
8.

Método, según la reivindicación 7, que se caracteriza por que la sinterización se realiza durante un tiempo de entre 5 y 10 horas.
9. Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que en el paso de mezclar fosfato monocálcico (MCP) con ácido silícico se mezcla también una fuente de iones de calcio.
10. Mélodo, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que comprende al paso de anadir una fuente de iones de calcio después de la fase de sinterización.
11.Método, según la reivindicación 10, que se caracteriza por que la fuente de iones de calcio comprende carbonato cálcico.
12.Método, según la reivindicación 10, que se caracteriza por que la fuente de iones de calcio comprende hidróxido cálcico.
13. Mélodo, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que comprende el paso previo de obtener ácido silícico hidrolizando una fuente de iones de silicio en solución acuosa ácida con una relación entre el volumen de dicha fuente de iones de silicio y el volumen total de la saludón de entre el 1 y el 99%.
14.Método, según la reivindicación 13, que se caracteriza por que la relación entre el volumen de la fuente de iones de silicio y el volumen total de la solución es de entre el 10 Y el 90%.
15.

Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que durante la sinterización se realiza una compactación de la mezcla para dotar al material de una forma determinada.
16.

Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que comprende el paso previo de añadir al MCP ylo al ácido silicico iones con efecto biológico.
17.Método, según la reivindicación 1, que se caracteriza por que comprende el paso de mezclar la estructura porosa obtenida tras la sinterización con soluciones o líquidos que contienen iones con efecto biológico.
18. Un fosfato cálcico que se caracteriza por que presenta una porosidad mayor o igual de 30%, preferiblemente entre 40 y 80%, con una población de macro-poros mayor o igual a 40%. preferiblemenle entre 50 y 75%, una población de meso-poros mayor o igual que 10%,

5 preferiblemente entre 10 y 50%, Y una población de micro-poros mayor o igual a 4%, preferiblemente entre 5 y 30%.
19. Un material de relleno de espacios 6seos, que comprende una

estructura porosa de polifosfato cálcico fabricada según el método de la 10 reivindicación 1.
20.Un medio de soporte para el crecimiento celular, que comprende una estructura porosa de polifosfato cálcico fabricada según el método de la reivindicación 1.
21.Un material de refuerzo de matrices orgánicas, que comprende

una estructura porosa de polifosfato cálcico fabricada según el método de la reivindicación 1.

20 22. Un material matriz para recibir la carga de un medicamento, protefna o factor de crecimiento y permitir la liberación de los mismos sobre él, que comprende una estructura porosa de polifosfato cálcico fabricada según el método de la reivindicación 1.