ES2397339T3 - Desinfección de productos alimenticios - Google Patents

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ES2397339T3 ES04768322T ES04768322T ES2397339T3 ES 2397339 T3 ES2397339 T3 ES 2397339T3 ES 04768322 T ES04768322 T ES 04768322T ES 04768322 T ES04768322 T ES 04768322T ES 2397339 T3 ES2397339 T3 ES 2397339T3
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Abstract

Un procedimiento de desinfección de ganado que comprende administrar al menos un bacteriófago, seleccionadodel grupo que consiste en CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) y CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) en una cantidadeficaz a dicho ganado para reducir el número de Campylobacter spp presentes en el tubo digestivo de dicho ganado.

Description

Desinfección de productos alimenticios
La presente invención se refiere al uso de bacteriófagos en la desinfección de productos alimenticios y, en particular, pero no exclusivamente, ganado o productos alimenticios contaminados con Campylobacter spp, a un procedimiento5 de uso de dichos bacteriófagos para la desinfección y a bacteriófagos para su uso en dicho procedimiento.
Campylobacter spp. es una causa importante de enfermedad diarreica transmitida por producto alimenticios. La contaminación por Campylobacter spp. persistente de carne de ave es un problema significativo para productores e, igualmente, para minoristas. Se sabe que las aves actúan como reservorio para este patógeno; un porcentaje alto (aproximadamente 60 a 80 %) de aves alojan Campylobacter jejuni en sus tubos digestivos.
10 En pollos de engorde, las especies de Campylobacter son organismos comensales más que una infección. La colonización del tubo digestivo de aves tiene lugar a una edad temprana, por ejemplo por medio de contaminación de agua de bebida o por el medio ambiente. La transferencia horizontal posterior dentro del recinto de engorde en el que los pollos se guardan es progresiva y rápida, de modo que todo el grupo se infectará antes de su sacrificio.
Las aves se mantienen frecuentemente en ayunas antes de su sacrificio, lo que reduce la eliminación fecal de
15 Campylobacter spp, pero puede dar como resultado niveles superiores en el animal sacrificado. Un objetivo de la presente invención es reducir los niveles de Campylobacter jejuni y/o Campylobacter coli presentes en las aves antes de su sacrificio y presentes en la carne de ave resultante.
En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento de desinfección de ganado según lareivindicación 1.
20 Campylobacter spp. son organismos comensales que no afectan al ganado (especialmente aves y animales de caza); en consecuencia, la presente invención no está relacionada con el tratamiento de ninguna enfermedad presente en el ganado.
Es una ventaja de la presente invención usar los bacteriófagos para tratamiento de fagos profiláctico, es decir, losbacteriófagos se administran a los pollos antes de su sacrificio con el fin de reducir la cantidad de especies de
25 Campylobacter spp que contaminan la carne de ave y que entran en la cadena alimenticia humana.
Al menos uno de los bacteriófagos es de la familia Myoviridae.
Los bacteriófagos, o cada bacteriófago, pueden administrarse al ganado en un intervalo de entre 102 y 109 ufp/ml-1. Preferentemente, los bacteriófagos se administran al ganado a 105 ufp/ml-1.
El ganado son preferentemente pollos. En particular, el ganado pueden ser pollos de engorde. Alternativamente, el30 ganado se selecciona del grupo que consiste en patos, pavos, cerdos, ganado vacuno, cabras y ovejas.
Los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran preferentemente por vía oral por medio de una solución antiácida y más preferentemente en el agua de bebida del ganado.
Los bacteriófagos o cada bacteriófago pueden administrarse entre 1 y 4 días antes del sacrificio. Preferentemente, los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran 2 días antes del sacrificio.
35 Campylobacter spp. es preferentemente Campylobacter jejuni.
Alternativamente, Campylobacter spp. puede ser Campylobacter coli.
La presente invención también proporciona un procedimiento de desinfección de productos alimenticios según la reivindicación 11.
Al menos uno de los bacteriófagos es de la familia Myoviridae.
40 Los bacteriófagos, o cada bacteriófago, pueden administrarse al producto alimenticio en un intervalo de entre 102 y109 ufp/ml-1. Preferentemente los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran al producto alimenticio a 105 ufp/ml-1.
El producto alimenticio es preferentemente carne de ave fresca. Alternativamente, el producto alimenticio puede sercarne de ave congelada.
45 El producto alimenticio puede seleccionarse también del grupo que consiste en carne de ternero, cordero, pato, pavo, cerdo o cabra, fresca o congelada.
La Campylobacter spp. es preferentemente Campylobacter jejuni. Alternativamente, la Campylobacter spp. puede ser Campylobacter coli.
La presente invención también proporciona el bacteriófago CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) aislado.
50 La presente invención también proporciona el bacteriófago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) aislado.
La presente invención también proporciona el uso del bacteriófago CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) aislado como desinfectante según la invención.
La presente invención también proporciona el uso del bacteriófago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) aislado como desinfectante según la invención.
La presente invención también proporciona un kit según la reivindicación 23.
Opcionalmente, el kit contiene aparatos para administrar el bacteriófago a ganado o producto alimenticios. El5 aparato es preferentemente un dispensador con bomba de pulverización, un aerosol o una pipeta.
Opcionalmente, el kit contiene uno o varios tampones para preparar el bacteriófago. Los tampones o cada tampónse seleccionan preferentemene de un tampón de almacenamiento y un tampón de administración. El tampón de almacenamiento puede comprender NaCl 100 mM, MgSO4 10 mM, Tris 20 mM, pH 7,4, y gelatina al 0,1 %.
La presente invención se describirá ahora meramente a modo de ejemplo, con referencia a los ejemplos y la figura10 siguiente, de la que:
La figura 1 (a) es una micrografía electrónica del bacteriófago CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) aislado.
La figura 1 (b) es una micrografía electrónica del bacteriófago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185).
1. Materiales y procedimientos
El procedimiento usado para el aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras de ave se desarrolló por 15 modificación de los procedimientos descritos por Gradjewski y col., (1985) y Salama y col., (1989).
Aislamiento de Campylobacter a partir de heces de pollo, hisopos cloacales y cuerpo de pollos sacrificados para suuso como bacteria huésped para el aislamiento de bacteriófagos.
Campylobacter spp. se aisló a partir de pollos mediante plaqueo directo usando agar CCDA modificado. Las diluciones se realizaron en diluyente de recuperación máxima (MRD; Nº Oxoid CM 733). Las placas se incubaron a
20 42 °C durante 48 h en condiciones microaerobias (5 % de oxígeno). Se confirmó que las colonias eran de Campylobacter spp. porque tenían una morfología de colonia típica, una morfología celular típica (por tinción Gram) y por ser positivas a oxidasa y catalasa. Se realizó un ensayo de hidrólisis del hipurato para distinguir C. jejuni de otras Campylobacter spp.
Preparación de un césped de bacterias huésped para el aislamiento de bacteriófagos
25 Las bacterias huésped para aislamiento de bacteriófagos se cultivaron como céspedes en placas con agar sangre (sangre de caballo desfibrinada al 5 % en base de agar sangre Nº 2) incubadas de forma microaerobia durante 18 ha 42 ºC. Las bacterias se rascaron usando un hisopo estéril y se suspendieron en MgSO4 10 mM helado. Para cada césped, se añadieron 100 μl de suspensión celular a 5 ml de medio de recubrimiento NZCYM líquido (0,6 % de agar Select en caldo NZCYM), se mantuvieron a 45 °C y se vertieron inmediatamente sobre un agar NZCYM
30 precalentado (1,2 % de agar Select en caldo NZCYM con 10 μg/ml de vancomicina). Se dejó que las placas se fijaran durante 10 min y después se secaron a 42 ºC durante 30 min puestas boca abajo con las tapas abiertas.Cada muestra para el aislamiento de bacteriófagos se aplicó como una mancha de 10 μl al césped preparado.
Preparación de muestras para el aislamiento de fagos a partir de hisopos con heces/cloacales usando césped de bacterias huésped preparado
35 Una suspensión al 10 % de heces se preparó en tampón SM (NaCl 100 mM, MgSO4 10 mM, Tris 20 mM, pH 7,4, ygelatina al 0,1 %). Los hisopos cloacales se emulsionaron en 2 ml de tampón SM. Después de 24 h de incubación a 4 °C (para permitir la disociación de los fagos), se centrifugó 1 ml de esta suspensión a 3.000 rpm durante 5 minutos para eliminar residuos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 13.000 rpm para eliminar bacterias. El sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro de 0,2 μm para eliminar cualquier bacteria
40 remanente. El filtrado se dispuso después sobre céspedes bacterianos preparados como anteriormente. El filtrado también se dispuso en césped bacteriano de la cepa de C. jejuni permisiva universal PT14 (NCTC 12662),preparado como anteriormente. Se dejó que la suspensión de fagos se absorbiera en el agar blando durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Después, las placas se incubaron durante 24 h a 42 °C encondiciones microaerobias (5 % de O2).
45 Recogida de bacteriófagos después de la incubación en céspedes huésped y purificación de placas por el procedimiento de vertido en placa
Se extrajeron placas de bacteriófago individuales a partir del recubrimiento usando una punta de pipeta y se suspendieron en 200 μl de medio SM. La multiplicación de los bacteriófagos se realizó añadiendo 10 μl de una suspensión de placas de fago individuales a 100 μl de suspensión celular de bacterias huésped. Se dejó que los
50 bacteriófagos se absorbieran durante 30 minutos a 42 °C. Esta suspensión se añadió después a agar blando fundido y se vertió sobre la superficie de una placa con NZCYM precalentada. Una vez fijada, la placa se incubó durante 24h a 42 °C en condiciones microaerobias (5 % de O2).
Después se recogió una única placa en 200 μl de SM y el procedimiento completo se repitió un total de 3 veces.
2. Caracterización y selección de bacteriófagos
55 Primera etapa de amplificación para permitir la caracterización y la selección
Se prepararon diez placas de vertido para cada bacteriófago exactamente como para la purificación de placas (anteriormente) usando la placa final recogida. Después de la incubación, se añadieron 5 ml de tampón SM a cada placa. Las placas se agitaron después cuidadosamente durante 16 h a 4°C para arrastrar el bacteriófago por lavado de la superficie de las placas. La suspensión de bacteriófagos resultante se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,2 μm para eliminar las bacterias. La valoración de bacteriófagos de esta suspensión se determinó usando latécnica de Miles y Misra y se encontró que era aproximadamente de 108 ufp/ml (unidades formadoras de placas/ml).
5 Caracterización y selección
El espectro lítico de cada bacteriófago nuevo se determinó disponiendo 10 μl de cada bacteriófago sobre céspedes bacterianos de un banco de cepas de Campylobacter de ensayo. Estas cepas incluían cepas de referencia NCTC, cepas con tipos de fagos conocidos (cepas PT), aislados de pollos de engorde, aislados de pollos de corral, aislados de carne de ave y de muestras fecales humanas. Solo los bacteriófagos que mostraron lisis confluente en una
10 variedad amplia de cepas se seleccionaron como candidatos para el ensayo. Se ha encontrado que algunos fagos no se comportan bien en los ensayos a pesar de tener una amplia variedad de huéspedes. Estos se han eliminado de las soluciones madre de fagos potencialmente útiles.
Estabilidad
La estabilidad de los bacteriófagos seleccionados se evaluó mediante valoración periódica de material mantenido a
15 4 °C en tampón SM. Las valoraciones disminuyeron en más de 2 puntos logarítmicos después de la liofilización, por lo que este procedimiento de conservación no se siguió posteriormente. Se encontró que las valoraciones de algunos de los bacteriófagos disminuían rápidamente en varios puntos logarítmicos incluso a 4 °C en tampón SM. Solo se seleccionaron los bacteriófagos que mantuvieron su valoración durante 3 meses a 4 °C, en tampón SM.
Unión de bacteriófagos a material no específico
20 Se encontró que los fagos tanto de pollo de engorde como de fuentes de carne de ave variaban significativamente en su capacidad para adherirse a superficies (plástico) y (no específicamente) a bacterias que no estimulan sureplicación. Los fagos que presentan adherencia no específica no serán eficaces para la aplicación de tratamiento con fagos. Los fagos se seleccionaron, por lo tanto, basándose en su recuperación eficaz a partir de superficies plásticas para iniciar la infección por Campylobacter, y su recuperación después de la exposición a bacterias no
25 permisivas y vesículas de membrana generadas por estas bacterias.
Electroforesis en gel de campo pulsado
Los bacteriófagos de Campylobacter tienen genomas inusualmente grandes (Sails y col., 1998). A pesar de ello su ADN es resistente a un gran número de enzimas de restricción (un mecanismo de supervivencia esencial para fagos). Por lo tanto, la caracterización y discriminación de fagos usando procedimientos moleculares es difícil. Sails 30 y col., (1998) informaron de que el fago usado en su estudio se incluye en 3 clases basadas en el tamaño del genoma (determinado por PFGE (electroforesis en gel de campo pulsado). Se usó PFGE para caracterizar los fagos recién aislados a partir de aves y determinar los tamaños de sus genomas. Los tamaños de todos los aislados de pollos de engorde fueron aproximadamente de 130 kb. Estos fagos se incluyen en la clase III de la distribución engrupos avanzada por Sails y col., (1998). No obstante, algunos fagos aislados a partir de carne de ave fueron de
35 aproximadamente 180 kpb y pertenecían al grupo II.
Microscopia electrónica
Las micrografías electrónicas del fago (figuras 1 a y b) han revelado hasta la fecha que todos los fagos de pollos de engorde son similares a los examinados por Sails y col., (1998), que tienen cabezas icosaédricas con colas contráctiles largas y que pertenecen a la familia Myoviridae. Los fagos más grandes aislados a partir de carne de
40 ave eran de la misma familia pero tenían estructuras de collar distintas.
3. Producción en masa de la mayor parte del bacteriófago más adecuado en el laboratorio
Las bacterias multiplicadas en un cultivo en placa de agar sangre durante la noche de una cepa apropiada sesuspendiron en 2 ml de MgSO4 10 mM. Se añadió un ml de esta suspensión bacteriana a un matraz cónico de 150 ml que contenía 40 ml de caldo nutriente Nº 2 (CM 67). A esto, se añadieron 100 μl de aproximadamente 108 ufp/ml
45 de fagos. El matraz se dispuso en un frasco de gases en condiciones microaerobias y se incubó con agitación a 100 rpm a 42 °C durante 48 h. Los residuos bacterianos se eliminaron por centrifugación y filtración a través de un filtrode 0,2 μm. La valoración de la suspensión de bacteriófagos fue aproximadamente de 109 ufp/ml.
Concentración de bacteriófagos por centrifugación
Después, se recogieron bacteriófagos por centrifugación a 40.000 g durante 2 h a 4 °C. Los sedimentos se
50 resuspendieron en tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0 (un tampón adecuado para alimentar pollos). La valoración de este bacteriófago concentrado fue generalmente de aproximadamente 1010 ufp/ml. La estabilidad eneste tampón a 4 ºC se encontró que era equivalente a la del tampón SM, es decir, disminuyó muy poco en viabilidaddurante un periodo de 3 meses. Se pueden preparar lotes de hasta 1 litro aumentando la escala del procedimiento.
4. Seguimiento
55 Resistencia a fagos
La selección de cepas de Campylobacter resistentes a fagos se consideró como un problema posible en el uso de tratamiento de fagos. Las bacterias desarrollan resistencia a fagos mediante mutación espontánea y las colonias resistentes a fagos son visibles después de una incubación prolongada a una multiplicidad de infección alta. Ningunade las cepas de Campylobacter aisladas en el ejemplo 1 (véase más adelante) era resistente a CP8 (Nº de acceso 60 NCIMB 41184) (aunque pudieron producirse colonias resistentes mezclando fagos y bacterias in vitro). No obstante,
fue posible aislar colonias resistentes a fagos CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) en las aves tratadas con fagos pero no en las no tratadas del ejemplo 2 (véase más adelante). Con el fin de establecer la frecuencia de resistencia a CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) después de la intervención, se seleccionaron 10 colonias de las placas deaislamiento de cada ave y se analizaron para determinar la resistencia a CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185). Durante los primeros 3 días después de la intervención no se detectaron cepas de Campylobacter resistentes. No obstante, en los días 4 y 5, 2 de cada 10 aislados de colonias individuales recuperados a partir de un ave tratada con un fago individual demostraron resistencia al fago. No hubo correlación entre aves que tenían recuentos másaltos que la media de Campylobacter y el aislamiento de colonias resistentes. Esto, junto con la baja frecuencia de resistencia (20 % o inferior), añade peso a observaciones anteriores de que la adquisición de resistencia a fagos está asociada con una ventaja competitiva reducida.
Para investigar adicionalmente la naturaleza de la resistencia a fagos y establecer si las variantes resistentes erantan eficaces en la colonización como la cepa original, se usaron dos aislados de HPC5 (HPC5-14 y HPC5-20) para recolonizar aves. Se advirtió que estas cepas crecían poco en placas de agar sangre, dando colonias discretas pequeñas pero conservaban la motilidad. Los resultados mostraron que, mientras que la colonización se logró en 5días, los aislados de colonias de Campylobacter recuperados a partir de estas aves habían recuperado su sensibilidad a fagos CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) lo que indica una presión de selección fuerte contra resistencia a fagos in vivo. Este experimento demuestra que, aunque puede tener lugar una resistencia a fagos, almenos con esta combinación huésped/fago, no es probable que se reduzca significativamente la eficacia del tratamiento. Las variantes resistentes parecen ser menos aptas y deben volver a su estado sensible para colonizar eficazmente, y ya que el fago también persiste probablemente estas cepas sensibles serán una vez más vulnerables al ataque. La aplicación de fagos justo antes del sacrificio se considera como el mejor modo para evitar problemas asociados con el desarrollo de resistencia a fagos dentro del recinto de engorde.
Presencia y supervivencia de fagos en pollos para venta al por menor
La recuperación de fagos a partir de muestras de pollo enriquecidas se investigó durante un periodo de 11 días a 4ºC usando los procedimientos de Atterbury y col. (2003). La recuperación permaneció constante entre el 40-44 % de la valoración inoculada durante un periodo de 7 días. El día 7 hubo un descenso de la valoración del 44 % al 35 %.Esta disminución continuó durante el transcurso del periodo de tiempo hasta alcanzar el 19 % al final del estudio.Esto contrasta con la recuperación de fagos a partir de pollo congelado en la que la recuperación inicial fue cercana al 100 % pero descendió rápidamente al 22 % un día después de la inoculación. La recuperación posterior se encontraba en el intervalo del 22 al 28 %.
Se encontró que el límite de detección de fagos era de 2 x 103 ufp por 10 cm2 de área de piel de pollo.
Por lo tanto, los bacteriófagos están presentes de forma natural en la superficie de aves y pueden sobrevivir durante periodos relativamente largos en ausencia de un huésped que se replica e incluso sobrevivir a la congelación a -20°C. Los bacteriófagos permanecerán activos contra la Campylobacter presente en la piel de pollo y es capaz de reducir la contaminación superficial (véase el ejemplo 3).
Obtención de segmentos de secuencias de nucleótidos genómicos de fagos
El ADN genómico de fagos se digirió con la enzima de restricción Dral y se ligó en el plásmido pUC18 (Ready to Go, Pharmacia). Después de la transformación, los plásmidos con insertos de ADN se secuenciaron usando cebadores M13 directos (I.D. de secuencia Nº 8) e inversos (I.D. de secuencia Nº 9) y la secuencia se comparó con bases de datos de ADN. La traducción de las secuencias también se comparó con bases de datos de proteínas. Las bases de datos usadas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Aunque la mayor parte de los insertos contenían ADN originario claramente de Campylobacter, se obtuvieron secuencias huésped únicas que parecían derivar defagos. La clonación de ADN de fagos es extremadamente problemática debido a la amplia sustitución y modificación de bases, lo que evita la replicación en el huésped de E. coli. Los cebadores (véase la tabla 1 y el listado de secuencias adjunto) se diseñaron basándose en las secuencias de fagos presuntas y se usaron para amplificar ADN a partir de aislados de bacteriófagos. Uno de estos pares de cebadores amplifica fácilmente el producto de ADN genómico de CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) pero no de ninguno de los otros fagos y representa un procedimiento para distinguir CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) y fagos similares. Estos cebadores son útiles para realizar un seguimiento de fagos CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) a lo largo de las fases de postratamiento,sacrificio, preparación y almacenamiento, ya que distinguen el fago de ensayo de cualquier bacteriófago natural encontrado en la superficie de carne de ave.
Tabla 1
Secuencia del fago
ID de secuencia Nº Cebadores ID de secuencia Nº
CP8-85
1 CPPP1 2
CPPP2
3
CP8-92
2 CPPP3 5
CPPP4
6
CP8-93
7 M13F 8
M13R
9
Se apreciará que la clonación de ADN a partir de estos bacteriófagos es difícil. Esto es debido a niveles altos de 55 metilación y sustitución que sirven para proteger el genoma del bacteriófago de endonucleasas de restricciónpresentes en las bacterias.
Como tal, solo se clonaron fragmentos pequeños de ADN. No se encontraron homologías significativas cuando se
analizaron bases de datos de secuencias de ADN y secuencias de proteínas usando el ADN clonado aislado.
Ejemplo 1 Uso del fago CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) para reducir Campylobacter en pollos
Un aislado de pollo de engorde de pasaje bajo, GII C8 de C. jejuni (tipo de fago: 35; serotipo termoestable: no tipable), se seleccionó para su uso como la cepa de colonización debido a que era sensible a CP8 (Nº de acceso 5 NCIMB 41184) y era típica de las cepas aisladas de recintos de engorde. Los grupos fueron tal como se han descrito en la tabla 1. Las aves se dividieron en 4 grupos (n = 10 aves cada uno) dependiendo del régimen de infección y loscontroles usados. Las aves del grupo 1 fueron controles no infectados. Las aves de los grupos 3 y 4 se infectaron eldía 22 con 108 ufc de GII C8 de C. jejuni. A las aves de los grupos 2 y 3 se les administraron 5 x 108 ufp de CP8 (Nºde acceso NCIMB 41184) en CaCO3 al 30 % (antiácido) el día 25. Se sacrificaron dos aves de cada grupo cada día10 durante 5 días. Los puntos de muestreo de las aves sacrificadas incluyeron: buche, molleja, intestino delgado, intestino grueso, ciego, músculo y órganos, incluidos hígado, páncreas, cerebro y corazón. Se enumeraron fagos y Campylobacter. Las aves de control negativo de Campylobacter permanecieron negativas a lo largo del ensayo mostrando que se habían logrado medidas de contención suficientes. En la tabla 1 se proporciona un resumen de los resultados de este experimento. Las muestras de heces mostraron que las aves analizadas fueron colonizadas
15 por Campylobacter a aproximadamente 107 ufc/ml en el momento de administrar el fago (periodo de 3 días). La Campylobacter se aisló solo a partir del sistema digestivo de las aves, no de cualquier otro órgano.
Tabla 1 Resumen de la intervención con fagos que muestra el número promedio de las Campylobacterrecuperadas a partir de contenidos del ciego por día
Día
Grupo de control Campylobacter Grupo fago + Campylobacter (ufc/g
(ufc/g promedio) GRUPO 4
promedio) GRUPO 3
1
1,6 x 107 < 102
2
2,5 x 108 < 102
3
7,6 x 108 4,0 x 105
4
5,6 x 107 2,5 x 107
5
2,1 x 107 3,1 x 107
20 Estos resultados indican una reducción amplia del número de Campylobacter durante 2 días después del tratamientocon fagos. Después de este periodo, el número aumentó a un nivel comparable a los controles los días 4 y 5. Los aislados de Campylobacter de recolonización de este experimento no eran resistentes a fagos y pudo demostrarse que eran genotípicamente idénticos a la cepa colonizadora inicial (tipo fla).
Ejemplo 2 Uso de bacteriófagos CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) para reducir el número de las 25 Campylobacter en pollos y determinación de la dosis óptima de este bacteriófago
Un aislado de fagos de pollo de engorde CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185), se seleccionó por dos motivos:
1) Tenía una variedad amplia de huéspedes contra aislados de recintos de engorde similar al CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184).
2) La disponibilidad de la cepa de C. jejuni HPC5 (serotipo termoestable UT; tipo de fago: RDNC; reacciona con
30 fagos pero no se ajusta a un tipo de fagos designado) que se aisló al mismo tiempo que el fago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) y que se había usado previamente en el ensayo de colonización para determinar su potencial de colonización. La cepa se usó para multiplicar el fago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) en el laboratorio minimizando la restricción de huéspedes potencial.
El experimento de intervención se realizó del mismo modo que en el ejemplo previo. Brevemente, los pollos se
35 infectaron con 109 ufc de la cepa de C. jejuni HPC5 de 20 días de edad (2 días antes que previamente para realizar un seguimiento del número de Campylobacter en los controles durante un periodo más largo antes de laadministración de fagos). Los fagos se administraron a un intervalo de dosis (105 upf, 107 ufp y 109 ufp) en CaCO3 al 30 % (antiácido) a los 25 días de edad. Las valoraciones tanto de fagos como de bacterias en aves sacrificadas se realizaron durante 5 días y se compararon con controles colonizados con HPC5 de C. jejuni. En las primeras 24 h
40 después de la intervención hubo un descenso brusco de 4 puntos logarítmicos en la valoración de Campylobacter en el ciego con las dosis de 105 y 107 y un descenso de 2 puntos logartímicos en el intestino superior e inferior en los animales tratados con fagos en comparación con los controles. La dosis más elevada de fagos (109 ufp) fue inesperadamente la menos eficaz en las primeras 24 h pero aun así dio como resultado un descenso superior a 2puntos logarítmicos en la valoración de Campylobacter en el ciego de aves tratadas con fagos en comparación con
45 los controles 48 h después del tratamiento.
Los resultados muestran que un descenso reproducible en el número de Campylobacter de al menos 2 puntos logarítmicos para CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185), un descenso brusco inicial que se mantuvo durante 4 a 5 días. Una dosis de entre 105 ufp y 107 ufp se encontró que era óptima en este experimento. El número de fagos alcanzó un máximo a aproximadamente 107 ufp/g en el intestino superior e inferior a los 27 días y en el ciego a los 50 29 días. No hubo correlación entre la dosis inicial y el número de fagos aislados después del tratamiento con fagos. Todas las muestras contenían entre 105 y 108 ufp/g. Los picos altos de fagos corresponden aproximadamente a los valles mínimos de la bacteria tal como cabría esperar de una relación huésped-presa. Después, el número de Campylobacter comenzó a aumentar, lo que corresponde a una caída en niveles de fagos. Esto se había anticipado y confirma la suposición de los inventores de que el periodo apropiado de intervención (antes del sacrifico) es crítico
para alcanzar el beneficio máximo.
Las aves de control negativo de Campylobacter permanecieron negativas a lo largo del ensayo mostrando que sehabían logrado medidas de contención suficientes. Un resumen de los resultados de este experimento con fagos CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) se da en la tabla 2 y se comparan con los resultados de los que se informó
5 previamente para fagos CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184). La reducción inicial en el número de Campylobacter de colonización con fagos CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) no fue tan grande como se había observado con los fagos CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) donde se observó una caída superior a 5 puntos logarítmicos en niveles de Campylobacter. Esta comparación ilustra la importancia de una selección de fagos cuidadosa para el éxito de la intervención.
10 Tabla 2 Resumen de la intervención con CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) en comparación con el ensayo CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) que muestra el número promedio de Campylobacter recuperadas a partir de los contenidos del ciego por día
CP34 (Nº DE ACCESO NCIMB 41185) Ensayo con huésped HPC5
CP8 (Nº DE ACCESO NCIMB 41184) Ensayo con huésped GIIC8
Día
Grupo de control Campylobacter: (ufc/g promedio) Grupo fago + Campylobacter: (ufc/g promedio)
12 1,6 x 107 < 102 3 2,5 x 108 < 102 4 7,6 x 108 4,0 x 105 5 5,6 x 107 2,5 x 107 2,1 x 107 3,1 x 107
Día
Grupo de control Campylobacter: (ufc/g promedio) Grupo fago + Campylobacter: (ufc/g promedio)
Dosis 105 ufp
Dosis 107 ufp Dosis 109 ufp
1 2 5
5,0 x 106 3,7 x 106 6,3 x 106 1,0 x 103 4,6 x 102 1,8 x 105 4,5 x 103 2,9 x 104 3,5 x 104 1,8 x 104 9,5 x 102 1,1 x 105
Ejemplo 3 Desinfección de pollo usando bacteriófagos
La desinfección directa de productos de ave procesados con fagos puede no ser un medio eficaz para controlarCampylobacter porque los fagos requieren el crecimiento de su huésped para su replicación. Las Campylobacter no se multiplican a temperaturas de refrigeración y niveles de oxígeno atmosféricos. No obstante, los fagos son bien
20 conocidos por su capacidad para sobrevivir permaneciendo latentes durante largos periodos, hasta que la multiplicación del huésped es posible. Por ejemplo, al ingerir material contaminado un huésped nuevo. Usando un bacteriófago seleccionado para unirse a Campylobacter eficazmente y no unirse a bacterias no huéspedes, usando los procedimientos indicados, se ha analizado la capacidad del fago para reducir el número de Campylobacterañadiéndolo a Campylobacter que no crece en la superficie de la piel de pollos.
25 Este experimento se llevó a cabo usando la cepa de C. jejuni de referencia NCTC 12662 y el fago CP8 (Nº deacceso NCIMB 41184). Seis aves negativas a Campylobacter y fagos se sacrificaron, desplumaron y pelaron. Se dispusieron secciones de piel que medían 2 cm2 en placas de Petri estériles. Se añadieron Campylobacter a diferentes densidades celulares (entre 106 y 102 ufc/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Losfagos se aplicaron después a diferentes densidades (107, 105 y 103 ufp/ml) para proporcionar un intervalo de
30 diferentes valores de multiplicidad de infección de entre 105 y 10-3. Las muestras de piel de pollo se almacenaron después a 4 °C. Los fagos y Campylobacter se enumeraron a 24 h, 72 h y 120 h después de la inoculación y se compararon con los controles inoculados solo con Campylobacter. Las muestras se digirieron en 20 ml de MRD y los recuentos de Campylobacter y fagos se realizaron tal como se ha descrito previamente. A la multiplicidad de infección más elevada, hubo una reducción de 1 punto logarítmico (90 %) en el número de Campylobacter en
35 comparación con controles en cada uno de los días de muestra. Esto representa la capacidad de los fagos para absorberse a Campylobacter y permanecen funcionales hasta que el crecimiento de Campylobacter es posible debido a requisitos de temperatura y gaseosos adecuados. Después, los fagos pueden lisar sus huéspedes y producir una reducción en el número de Campylobacter.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Universidad de Nottingham
<120> Desinfección de productos alimenticios
<130> JL4509 5 <140> documento PCT/GB2004/003775
<141> 06/09/2004
<160> 9
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<210>1 10 <211> 701
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Bacteriófago CP8 15 <400> 1
<210>2
<211> 22 20 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Bacteriófago CP8
<400> 2
<210>3
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Bacteriófago CP8
<400> 3
10 <210>4
<211> 433
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Bacteriófago CP8
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> “n” puede ser cualquier nucleótido 20 <400> 4
<210> 5
<211> 21 25 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Bacteriófago CP8
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Bacteriófago CP8
<400> 6
<210> 7
<211> 101
<212> ADN
<213> Artificial 15 <220>
<223> Bacteriófago CP8
<400> 7
20 <210> 8
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 25 <223> Bacteriófago M13
<400> 8
<210> 9 30 <211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Bacteriófago M13 35 <400> 9

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de desinfección de ganado que comprende administrar al menos un bacteriófago, seleccionado del grupo que consiste en CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) y CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) en una cantidadeficaz a dicho ganado para reducir el número de Campylobacter spp presentes en el tubo digestivo de dicho ganado.
    5 2. Un procedimiento tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1 en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran al ganado en un intervalo de 102 a 109 ufp/ml-1.
  2. 3. Un procedimiento tal como se ha reivindicado en la reivindicación 2 en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran al ganado a 105 ufp/ml-1.
  3. 4.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el ganado son10 pollos.
  4. 5.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en la reivindicación 4 en el que el ganado son pollos de engorde.
  5. 6.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que elganado se selecciona del grupo que consiste en patos, pavos, cerdos, ganado vacuno, cabras y ovejas.
  6. 7.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que los 15 bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran por vía oral por medio de solución antiácida.
  7. 8.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran por vía oral en el agua de bebida del ganado.
  8. 9.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran entre 1 y 4 días antes del sacrificio.
    20 10. Un procedimiento tal como se ha reivindicado en la reivindicación 9 en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran 2 días antes del sacrificio.
  9. 11. Un procedimiento de desinfección de productos alimenticios que comprende administrar al menos un bacteriófago, seleccionado del grupo que consiste en CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) y CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185), en una cantidad eficaz al producto alimenticio para reducir la cantidad de Campylobacter spp en
    25 dicho producto alimenticio.
  10. 12.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en la reivindicación 11 en el que los bacterófagos, o cada bacteriófago, se administran al producto alimenticio en un intervalo de 102 a 109 pfu/ml-1.
  11. 13.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en la reivindicación 12 en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran al producto alimenticio a 105 ufp/ml-1.
    30 14. Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que el producto alimenticio es preferentemente carne de ave fresca.
  12. 15. Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que el productoalimenticio es carne de ave congelada.
  13. 16.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que el producto35 alimenticio se selecciona del grupo que consiste en carne fresca o congelada de ternera, cordero, pato, pavo, cerdo
    o cabra.
  14. 17. Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en el que los bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran a dicho producto alimenticio en forma de aerosol.
  15. 18.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 en el que los 40 bacteriófagos, o cada bacteriófago, se administran antes del sacrificio.
  16. 19.
    Bacteriófago CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) aislado.
  17. 20.
    Bacteriófago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) aislado.
  18. 21.
    El uso del bacteriófago CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) aislado como desinfectante.
  19. 22. El uso del bacteriófago CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185) aislado como desinfectante. 45 23. Un kit que comprende:
    a) al menos un bacteriófago aislado seleccionado del grupo que consiste en CP8 (Nº de acceso NCIMB 41184) y CP34 (Nº de acceso NCIMB 41185); y opcionalmente b) instrucciones de uso del kit.
    50 24. Un kit tal como se ha reivindicado en la reivindicación 23 en el que el kit contiene aparatos para administrar los bacteriófagos, o cada bacteriófago, al ganado o al producto alimenticio.
  20. 25.
    Un kit tal como se ha reivindicado en la reivindicación 23 o 24 en el que el aparato es una dispensador conbomba de pulverización, un aerosol o una pipeta.
  21. 26.
    Un kit tal como se ha reivindicado en la reivindicación 23, 24 o 25 en el que el kit contiene uno o varios tampones para preparar los bacteriófagos o cada bacteriófago.
  22. 27.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en el que Campylobacter spp es Campylobacter jejuni.
  23. 28.
    Un procedimiento tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en el que Campylobacter spp es Campylobacter coli.
    Figura 1a Figura 1b
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