ES2395524T3 - Acido nucleico y proteina correspondiente denominada 158P1D7 util para el tratamiento y la detección del cancer de vejiga y otros canceres - Google Patents

Abstract

Una proteína para uso en el tratamiento de cáncer de vejiga, en la que la proteína provoca una respuesta inmunecontra una célula de cáncer de vejiga que expresa una proteína, en la que la proteína comprende una secuenciaidéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 657, en la que el medicamento se proporciona al sistemainmune del mamífero y por medio de lo cual se provoca con el que tiene lugar la respuesta inmune contra dichacélula de cáncer de vejiga que expresa la proteína.

Description

Ácido Nucleico y Proteína Correspondiente Denominada 158P1D7 útil para el Tratamiento y la Detección del Cáncer de Vejiga y otros Cánceres

Campo de la Invenci6n

La invención descrita en este documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico nueva y a su proteína codificada, designada como 158P1D7, y a procedimientos de diagnóstico y terapéuticos y composiciones útiles en el tratamiento de diversos cánceres que expresan 158P1D7.

Antecedentes de la invenci6n

El cáncer es la segunda causa principal de muerte humana después de la enfermedad coronaria. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en Estados Unidos, según la Sociedad Americana del Cáncer, el cáncer provoca la muerte de más de medio millón de personas anualmente, con más de 1,2 millones de nuevos casos diagnosticados al año. Si bien las muertes por cardiopatía han ido disminuyendo notablemente, en general las que se deben al cáncer están aumentando. A principios del próximo siglo se prevé que el cáncer sea la causa de muerte más importante.

De todos los nuevos casos de cáncer en Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente un 5 por ciento en los hombres (quinto neoplasma más común) y el 3 por ciento en las mujeres (octavo neoplasma más común). La incidencia va aumentando lentamente, a la vez que envejece la población. En 1998, se estimaron 54.500 casos, 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia según la edad en Estados Unidos es del 32 cada

100.000 para los hombres y del 8 cada 100.000 en las mujeres. La proporción histórica varón/mujer de 3:1 puede estar disminuyendo debido a los hábitos de fumar en las mujeres. Se estimaron 11.000 muertes de cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia del cáncer de vejiga y la mortalidad aumentan en gran medida con la edad y representarán un problema creciente a medida que la población vaya envejeciendo.

Los cánceres de vejiga comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades. Los principales determinantes del control de la enfermedad y la supervivencia son la histología y la amplitud de la enfermedad. Los códigos principales para estos factores incluyen la clasificación de la patología, la Clasificación Internacional de Enfermedades-Oncología (ICDO) y la clasificación por etapas de la amplitud de la enfermedad, la clasificación TNM (Tabla XXI). Para una discusión general sobre los cánceres de vejiga y otros cánceres urogenitales, véase por ejemplo, Volgelzang y col., Eds. Comprehensive Textbook of Genitourinary Oncology, (Williams & Wilkins, Baltimore 1996), en particular páginas 295-556.

Se ha informado de tres tipos principales de tumores en la vejiga. El tipo más común de cáncer de vejiga es el carcinoma de célula transicional (TCC); esto explica aproximadamente el 90% de todos los cánceres de vejiga. La segunda forma de cáncer de vejiga es el carcinoma de célula escamosa, que explica aproximadamente el 8% de todos los cánceres de vejiga en los cuales la esquistosomiasis no es endémica, y aproximadamente el 75% de los carcinomas de vejiga en los cuales la esquistosomiasis es endémica. Los carcinomas de célula escamosa tienden a invadir las capas más profundas de la vejiga. El tercer tipo de cáncer de vejiga es el adenocarcinoma, que explica el 1%-2% de los cánceres de vejiga; éstas son las principales formas invasivas del cáncer.

Normalmente el cáncer de vejiga se detecta y diagnostica por citoscopia y citología urinaria. Sin embargo, estos procedimientos presentan poca sensibilidad. Procedimientos de detección relativamente más fiables actualmente utilizados en clínica incluyen la prueba del antígeno tumoral vesical (BTA) stat, el ensayo de la proteína NMP22, la expresión de la telomerasa y el ensayo en orina de ácido hialurónico e hialuronidasa (HA-HAasa). La ventaja de utilizar estos marcadores en el diagnóstico del cáncer de vejiga es su relativa alta sensibilidad en las etapas tumorales tempranas en comparación con la citología estándar.

Por ejemplo, la prueba BTA stat tiene una sensibilidad del 60-80% y una especificidad del 50-70% para el cáncer de vejiga, mientras que la prueba de orina de HA-HAasa presenta una sensibilidad del 90-92% y una especificidad del 80-84% para el cáncer de vejiga (J Urol 2001 165:1067). En general, la sensibilidad para los tumores en etapa T era del 81% para la proteína de la matriz nuclear (NMP22), del 70% para la telomerasa, del 32% para el antígeno tumoral vesical (BTA) y del 26% para la citología (J Urol 2001 166:470; J Urol 1999, 161:810). Aunque el ensayo de repetición telomérica que mide la actividad de la telomerasa sea relativamente sensible, la inestabilidad de la telomerasa en orina hace que este procedimiento de detección sea poco fiable actualmente.

La mayoría de los cánceres de vejiga reaparecen en la vejiga. Generalmente, el cáncer de vejiga se trata mediante una combinación de resección transuretral de la vejiga (TUR) y quimioterapia o inmunoterapia intravesical. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga señala las limitaciones de la TUR. La mayoría de los cánceres invasivos de músculo no se curan por TUR sólo. La cistectomía radical y la diversión urinaria es el medio más eficaz para eliminar el cáncer, pero tiene un impacto innegable sobre la función urinaria y sexual.

El bacilo de Calmette-Guerin (BCG) intravesical es un agente inmunoterapéutico común y eficaz utilizado en el tratamiento del cáncer de vejiga. El BCG se utiliza también como agente profiláctico para impedir la reaparición del

cáncer de vejiga. Sin embargo, el 30% de los pacientes no responden a la terapia con BCG y siguen desarrollando la enfermedad invasiva y metastática (Catalona y col., J Urol 1987, 137:220-224). Con frecuencia se observan efectos secundarios relacionados con el BCG, tales como cistitis inducidas por el medicamento, riesgo de infección bacteriana y hematuria, entre otros. Se han utilizado otras inmunoterapias alternativas para el tratamiento del cáncer de vejiga, por ejemplo KLH (Flamm y col. Urologe 1994; 33:138-143), interferones (Bazarbashi y col., J Surg Oncol. 2000; 74:181-4) y células dendríticas cargadas con el péptido MAGE-3 (Nishiyama y col., Clin Cancer Res 2001; 7:23-31). Todos estos enfoques siguen siendo experimentales (Zlotta y col., Eur Urol 2000; 37 Suppl 3:10-15). Sigue existiendo una necesidad notable de modalidades de diagnóstico y tratamiento que sean provechosas para los pacientes de cáncer de vejiga. Además, desde un punto de vista mundial, varios cánceres destacan como asesinos principales. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovario son las principales causas de muerte por cáncer. Estos y virtualmente todos los demás carcinomas comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática procedente de un carcinoma es fatal. Además, incluso en aquellos pacientes con cáncer que sobreviven inicialmente a sus cánceres primarios, sus vidas quedan alteradas drásticamente. Muchos pacientes de cáncer experimentan una fuerte ansiedad reforzada por ser conscientes de la posibilidad de reaparición o fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan una debilidad física después del tratamiento. Además, muchos pacientes de cáncer sufren una reaparición del cáncer.

El cáncer de próstata es el cuarto cáncer predominante en los hombres en todo el mundo. En América del Norte y Europa del Norte, es con diferencia el cáncer más común en los varones y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres. Sólo en Estados Unidos más de 30.000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad, sólo superada por el cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, sigue sin existir tratamiento eficaz alguno para el cáncer metastático de próstata. La prostatectomía quirúrgica, la terapia de radiación, la terapia de ablación hormonal, la castración quirúrgica y la quimioterapia siguen siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y a menudo se asocian con consecuencias no deseables.

En cuanto al diagnóstico, la falta de un marcador tumoral prostático que pueda detectar con precisión tumores en la etapa temprana localizados sigue siendo una limitación notable en el diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo del antígeno específico de la próstata (PSA) en suero haya sido una herramienta muy útil, su especificidad y utilidad general, sin embargo, en gemeral se consideran como carentes en varios aspectos importantes. Aunque los marcadores previamente identificados tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA hayan facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe la necesidad de una identificación de marcadores y dianas terapéuticas adicionales para los cánceres de próstata y asociados con el fin de mejorar posteriormente el diagnóstico y la terapia.

El carcinoma de células renales (RCC) explica aproximadamente el 3 por ciento de la malignidad en el adulto. Una vez los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, aparece el potencial maligno. En el adulto, los dos principales tumores renales malignos son el adenocarcinoma de células renales y el carcinoma de células transicionales de la pelvis renal o del uréter. La incidencia del adenocarcinoma de células renales se estima en más de 29.000 casos en Estados Unidos y más de 11.600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de células transicionales es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos al año en Estados Unidos.

La cirugía ha sido la terapia principal para el adenocarcinoma de células renales durante muchas décadas. Hasta hace poco, la enfermedad metastática ha sido rebelde a cualquier terapia sistémica. Con el desarrollo reciente de las terapias sistémicas, en particular de inmunoterapias, el carcinoma metastático de células renales puede ser abordado agresivamente en pacientes adecuados con una posibilidad de respuesta duradera. Sin embargo, sigue habiendo necesidad de terapias eficaces para estos pacientes.

En el año 2000, en Estados Unidos se produjeron unos 130.200 casos de cáncer colorrectal, incluidos 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 de cáncer rectal. Los cánceres colorrectales son los terceros más comunes en hombres y mujeres. Los índices de incidencia disminuyeron notablemente durante 1992-1996 (-2,1% por año). La investigación sugiere que esta disminución se debe a un aumento de las exploraciones y a la eliminación de pólipos, impidiendo la progresión de tales pólipos hacia cánceres invasivos. Se estimaron 56.300 muertes (47.700 por cáncer de colon, 8.600 por cáncer rectal) en el año 2000, suponiendo aproximadamente un 11% de todas las muertes por cáncer en Estados Unidos.

Actualmente, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal y, para los cánceres que no se han propagado, es frecuentemente curativa. La quimioterapia o quimioterapia junto con radiación se da antes o después de la cirugía en la mayoría de los pacientes donde el cáncer ha perforado profundamente la pared del intestino o se ha extendido hasta los nódulos linfáticos. Se necesita ocasionalmente una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de residuos corporales) para el cáncer de colon y raras veces en el cáncer rectal. Siguen siendo necesarias unas modalidades eficaces de diagnóstico y tratamiento para el cáncer rectal.

Se estimaron unos 164.100 nuevos casos de cáncer de pulmón y bronquial en el año 2000, suponiendo un 14% de todos los diagnósticos de cáncer en Estados Unidos. El índice de incidencia del cáncer de pulmón y bronquial está disminuyendo notablemente en los hombres, partiendo de un máximo de 86,5 por cada 100.000 en 1984 hasta un

70,0 en 1996. En los años 90, el índice de aumento entre las mujeres empezó a reducirse. En 1996, la incidencia en las mujeres fue de 42,3 por cada 100.000.

El cáncer de pulmón y bronquial provocó 156.900 muertes estimadas en el 2000, suponiendo un 28% de todas las muertes por cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad por cáncer de pulmón disminuyó notablemente entre los hombres (-1,7% por año), mientras que los índices para las mujeres siguieron aumentando notablemente (0,9% por año). Desde 1987, cada año han muerto más mujeres de cáncer de pulmón que de cáncer de mama, que, durante más de 40 años, fue la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres. La disminución de la incidencia del cáncer de pulmón y de los índices de mortalidad se debió probablemente a la reducción de los índices de fumadores durante los 30 años anteriores; sin embargo, la reducción de los hábitos fumadores entre las mujeres se inferior que para los hombres. Es preocupante que, aunque los descensos en el uso de tabaco por los adultos hayan disminuido, el uso del tabaco en la juventud esté aumentando de nuevo.

Las opciones de tratamiento para el cáncer de pulmón y bronquial vienen determinadas por el tipo y la etapa del cáncer e incluyen la cirugía, terapia de radiación y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía suele ser el tratamiento elegido. Debido a que normalmente la enfermedad se extiende, con el tiempo se descubre que a menudo la terapia de radiación y la quimioterapia son necesarias en combinación con la cirugía. La quimioterapia, sola o combinada con la radiación, es el tratamiento elegido para el cáncer de pulmón de células pequeñas; con este régimen, un gran porcentaje de pacientes experimenta una remisión, que en algunos casos es de larga duración. Sin embargo, existe una necesidad continua de un tratamiento eficaz y de unos diagnósticos para los cánceres de pulmón y bronquial.

Se esperaba una estimación de 182.800 nuevos casos de cáncer de mama invasivo entre las mujeres en Estados Unidos durante el año 2000. Además, se esperaba diagnosticar aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama en los hombres en el año 2000. Después de un aumento aproximadamente del 4% por año en los años 80, la incidencia del cáncer de mama en las mujeres se ha estabilizado en los 90 en aproximadamente 110,6 casos por cada 100.000.

Sólo en Estados Unidos hubo unas 41.200 muertes estimadas (40.800 mujeres, 400 hombres) en el año 2000 debido al cáncer de mama. El cáncer de mama figura en segundo lugar entre las muertes por cáncer en las mujeres. Según los datos más recientes, los índices de mortalidad disminuyeron notablemente durante 1992-1996, encontrándose las mayores reducciones en las mujeres más jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones fueron probablemente resultado de una detección más temprana y de un mejor tratamiento.

Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias de los pacientes, el tratamiento del cáncer de mama puede implicar la lumpectomía (extirpación local del tumor) y la eliminación de los nódulos linfáticos debajo del brazo; la mastectomía (extirpación quirúrgica de la mama) y la eliminación de los nódulos linfáticos debajo del brazo; la terapia de radiación; la quimioterapia; o la terapia hormonal. A menudo, se utilizan dos o más procedimientos combinados. Numerosos estudios han demostrado que, para la enfermedad en su etapa temprana, los índices de supervivencia a largo plazo después de la lumpectomía con radioterapia son similares a los índices de supervivencia después de la mastectomía radical modificada. Los avances notables en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, esta reconstrucción se lleva a cabo al mismo tiempo que la mastectomía.

La extirpación local del carcinoma ductal in situ (DCIS) con cantidades adecuadas de tejido circundante sano de la mama puede impedir la reaparición local del DCIS. La radiación de la mama y/o el tamoxifén pueden reducir el riesgo de reaparición del DCIS en el resto del tejido mamario. Esto es importante porque el DCIS, si se deja sin tratar, puede desarrollar un cáncer de mama invasivo. Sin embargo, existen serios efectos secundarios o secuelas de estos tratamientos. Por tanto, existe la necesidad de tratamientos eficaces del cáncer de mama.

Se estimaron unos 23.100 nuevos casos de cáncer de ovario en Estados Unidos en el año 2000. Esto supone un 4% de todos los cánceres entre las mujeres y figura en el segundo lugar entre los cánceres ginecológicos. Durante 1992-1996, los índices de incidencia del cáncer de ovario disminuyeron notablemente. Como consecuencia del cáncer de ovario, se estimaron unas 14.000 muertes en el año 2000. El cáncer de ovario provoca más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductor femenino.

La cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de ovario. La cirugía incluye generalmente la extirpación de uno o ambos ovarios, de las trompas de Falopio (salpingo-ooforectomía) y del útero (histerectomía). En algunos tumores muy tempranos, se elimina solamente el ovario involucrado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener niños. Con la enfermedad avanzada se intenta eliminar toda la enfermedad intraabdominal para intensificar el efecto de la quimioterapia. Sigue habiendo una necesidad importante en opciones de tratamiento eficaz para el cáncer de ovario.

Se estimaron unos 28.300 nuevos casos de cáncer pancreático en Estados Unidos en el año 2000. Durante los últimos 20 años, los índices de cáncer pancreático han disminuido en los hombres. Los índices entre las mujeres han quedado aproximadamente constantes, pero pueden empezar a disminuir. El cáncer pancreático provocó unas

28.200 muertes estimadas en el año 2000 en Estados Unidos. Durante los últimos 20 años, ha habido una

disminución ligera pero notable en los índices de mortalidad entre los hombres (aproximadamente -0,9% por año) mientras que los índices han aumentado ligeramente entre las mujeres.

La cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia son las opciones de tratamiento para el cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden ampliar la supervivencia y/o atenuar los síntomas en muchos pacientes, pero es probable que no produzcan curación alguna para la mayoría. Existe una necesidad significativa de opciones terapéuticas y de diagnóstico adicionales para el cáncer pancreático.

Sumario de la Invenci6n

La presente invención se refiere a una nueva secuencia de ácido nucleico y a su polipéptido codificado, denominado 158P1D7. Tal como se utiliza aquí, "158P1D7" puede referirse a los nuevos polinucleótidos o polipéptidos de la invención divulgada o a ambos.

Los ácidos nucleicos que codifican 158P1D7 están sobreexpresados en el(los) cáncer(es) relacionados en la Tabla

1. El análisis de expresión Northern Blot de la expresión de 158P1D7 en tejidos sanos muestra un patrón de expresión restringido en los tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias del nucleótido (Figura 2) y del aminoácido (Figura 2 y Figura 3) de 158P1D7. El perfil asociado al tejido de 158P1D7 en los tejidos adultos sanos combinado con la sobreexpresión observada en los tumores de vejiga muestra que 158P1D7 se sobreexpresa de forma aberrante en al menos algunos cánceres.

Se describen aquí polinucleótidos que se corresponden o son complementarios a los ácidos nucleicos de 158P1D7, ARNm y/o secuencias de codificación, preferiblemente en forma aislada, así como también los péptidos/proteínas propiamente: híbridos de ADN, ARN, ADN/ARN y moléculas asociadas (como PNAs), polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a las secuencias del ácido nucleico de 158P1D7 o las secuencias de ARNm o partes de las mismas, o con los polinucleótidos que codifican 158P1D7.

La invención proporciona además varias composiciones inmunogénicas o terapéuticas y estrategias para tratar los cánceres que expresan 158P1D7, tales como cánceres de vejiga, incluidas las terapias enfocadas a la inhibición de la transcripción, tratraducción, procesamiento o función de 158P1D7, así como vacunas contra el cáncer.

Breve Descripci6n de las Figuras

Figura 1. Secuencia de ácido nucleico 158P1D7 SSH. La Secuencia de 158P1D7 SSH contiene 231 pb. (SEQ ID. NO.: 655).

Figura 2. Secuencias de ADNc (SEQ ID. NO.: 656) y del aminoácido (SEQ ID. NO.: 657) de 158P1D7. Se subraya la metionina de inicio. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 23 hasta el 2.548, incluido el codón de parada.

Figura 3. Secuencia del aminoácido de 158P1D7 (SEQ ID. NO.: 657).

Figura 4. Alineación de la secuencia de 158P1D7 con la proteína hipotética FLJ22774 humana, clon KAIA1575 (SEQ ID. NO.: 658).

Figura 5a. Alineación de la secuencia del aminoácido de 158P1D7 con la proteína humana (FLJ227744, SEQ ID. NO.: 659).

Figura 5b. Alineación de la secuencia del aminoácido de 158P1D7 con la proteína humana similar a IGFALS (SEQ ID. NO.: 660).

Figura 6. Expresi6n de15BP1D7 por RT-PCR. La primera hebra de ADNc se preparó a partir del grupo vital 1 (VP1: hígado, pulmón y riñón), grupo vital 2 (VP2, páncreas, colon y estómago), grupo de xenoinjerto de próstata (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD, LAPC-9AI), grupo de cáncer de próstata, grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de colon, grupo de cáncer de pulmón, grupo de cáncer de ovario, grupo de cáncer de mama y grupo de metástasis. La normalización se realizó por PCR utilizando cebadores a actina y GAPDH. Se realizó una PCR semicuantitativa utilizando iniciadores de 158P1D7, a 30 ciclos de amplificación. Se observa una fuerte expresión de 158P1D7 en el grupo de cáncer de vejiga y en el grupo de cáncer de mama. Se observan niveles inferiores de expresión en VP1, VP2, grupo de xenoinjerto, grupo de cáncer de próstata, grupo de cáncer de colon, grupo de cáncer de pulmón, grupo de cáncer de ovario y grupo de metástasis.

Figura 7. Expresi6n de 15BP1D7 en tejidos humanos sanos. Se investigaron con el fragmento de 158P1D7 dos northern blots de múltiples tejidos con 2 Ig de ARNm/banda. Se indican en el lateral los estándares de tamaño en kilobases (kb). Los resultados muestran la expresión de 158P1D7 en la próstata, hígado, placenta, corazón y, a niveles inferiores, en el intestino delgado y el colon.

Figura BAY BB. Expresi6n de 15BP1D7 en muestras de pacientes con cancer de vejiga. Se extrajo ARN de las líneas celulares (CL) del cáncer de vejiga, vejiga normal (N), tumores de vejiga (T) y se hizo

coincidir con tejido adyacente sano (NAT) aislado de pacientes con cáncer de vejiga. Se investigaron con el fragmento de 158P1D7 unos northern blots con 10 Ig de ARN total/banda. Se indican en el lateral los estándares de tamaño en kilobases (kb). Los resultados muestran la expresión de 158P1D7 en 1 de 3 líneas celulares de cáncer de vejiga. En muestras de pacientes, se detecta la expresión de 158P1D7 en 4 de 6 tumores sometidos a ensayo (8A). En otro estudio, se detecta la expresión de 158P1D7 en todos los tumores de pacientes ensayados (8B). La expresión observada en los tejidos adyacentes sanos (aislados de tejidos enfermos) pero no en tejido sano, aislado de donantes sanos, puede indicar que estos tejidos no son completamente sanos y que 158P1D7 puede expresarse en tumores en la etapa temprana.

Figura 9. Expresi6n de 15BP1D7 en muestras de pacientes con cancer de pulm6n. Se extrajo ARN de líneas celulares (CL) de cáncer de pulmón, tumores de pulmón (T) y de sus tejidos adyacentes sanos (NAT) aislados de pacientes con cáncer de pulmón. Se investigó con el fragmento de 158P1D7 un northern blot con 10 Ig de ARN total/banda. Se indican en el lateral los estándares de tamaño en kilobases (kb). Los resultados muestran la expresión de 158P1D7 en 1 de 3 líneas celulares de cáncer de pulmón y en los 3 tumores de pulmón ensayados, pero no en tejidos pulmonares sanos.

Figura 10. Expresi6n de15BP1D7 enmuestras de pacientes con cancer de mama. Se extrajo ARN de líneas celulares (CL) de cáncer de mama, de mama sana (N) y de tumores de mama (T) aislados de pacientes con cáncer de mama. Se investigó con el fragmento de 158P1D7 un northern blot con 10 Ig de ARN total/banda. Se indican en el lateral los estándares de tamaño en kilobases (kb). Los resultados muestran la expresión de 158P1D7 en 2 de 3 líneas celulares de cáncer de mama y en 2 tumores de mama, pero no en tejido de mama sano.

Figura 11. Perfil de hidrofilicidad de aminoácidos de 158P1D7 determinado por análisis informático de Secuencias algorítmico utilizando el procedimiento de Hopp y Woods (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828) accesible de la web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 12. Perfil de hidropaticidad de aminoácidos de 158P1D7 determinado por análisis informático de secuencias algorítmico utilizando el procedimiento de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982.

J. Mol. Biol. 157:105-132) accesible de la web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 13. Perfil residual de aminoácidos accesibles en porcentaje de 158P1D7 determinado por análisis informático de secuencias algorítmico utilizando el procedimiento de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) accesible de la web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 14. Perfil de aminoácidos de flexibilidad media de 158P1D7 determinado por análisis informático de Secuencias algorítmico utilizando el procedimiento de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) accesible de la web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 15. Perfil aminoácidos beta-turn de 158P1D7 determinado por análisis informático de Secuencias algorítmico utilizando el procedimiento de Deleage y Roux (Deleage G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294) accesible de la web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figuras 16A y 16B. Región transmembrana y predicción de orientación para 158P1D7.

Descripci6n Detallada de la Invenci6n

Esquema de las Secciones

I.) Definiciones

II.) Polinucleótidos de 158P1D7

II.A) Utilización de los polinucleótidos de 158P1D7

II.A.1.) Control de Anormalidades Genéticas

II.A.2.) Realizaciones Antisentido

II.A.3) Cebadores y Pares de Cebadores

II.A.4) Aislamiento de Moléculas de Ácido Nucleico que codifican 158P1D7

II.A.5) Moléculas de Ácidos Nucleicos Recombinantes y Sistemas Vector-Huésped

III.) Proteínas asociadas a 158P1D7 III.A) Realizaciones de Proteínas Portadoras de Motivos III.B) Expresión de Proteínas asociadas a 158P1D7 III.C) Modificaciones de Proteínas asociadas a 158P1D7 III.D) Utilización de Proteínas asociadas a 158P1D7

IV.) Anticuerpos de 158P1D7 V.) Respuestas Inmunes Celulares a 158P1D7 VI.) Animales Transgénicos con 158P1D7 VII.) Procedimientos para la Detección de 158P1D7 VIII.) Procedimientos para Controlar el Estado de los Genes Asociados a 158P1D7 y Sus Productos IX.) Identificación de las Moléculas que Interactúan con 158P1D7 X.) Procedimientos Terapéuticos y Composiciones

X.A.) Vacunas Anticáncer X.B.) 158P1D7 como Diana para la Terapia basada en Anticuerpos X.C.) 158P1D7 como Diana para Respuestas Inmunes Celulares

X.C.1. Vacunas de Minigenes

X.C.2. Combinaciones de Péptidos CTL con Péptidos Auxiliares

X.C.3. Combinaciones de Péptidos CTL con Agentes Iniciadores de Células-T

X.C.4. Composición de Vacunas que Comprenden DC Pulsadas con Péptidos CTL y/o HTL X.D.) Inmunoterapia Adoptiva X.E.) Administración de Vacunas con Propósitos Terapéuticos o Profilácticos XI.) Realizaciones de Diagnóstico y Pronóstico de 158P1D7 XII.) Inhibición de la Función de la Proteína 158P1D7 XII.A.) Inhibición de 158P1D7 con Anticuerpos Intracelulares XII.B.) Inhibición de 158P1D7 con Proteínas Recombinantes XII.C.) Inhibición de la Transcripción o Traducción de 158P1D7 XII.D.) Consideraciones Generales para las Estrategias

Terapéuticas XIII.) KITS

I.) De finiciones

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y demás términos científicos o terminología utilizados aquí pretenden tener los significados habitualmente entendidos por los especialistas en la materia a la que pertenece esta invención. En algunos casos, se definen aquí los términos con su significado habitual por claridad y/o por fácil referencia, y la inclusión de estas definiciones aquí no debe interpretarse necesariamente como que implican una diferencia sustancial con respecto a lo que se entiende generalmente en la materia. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referenciados aquí son bien entendidos y habitualmente empleados utilizando la metodología convencional de los especialistas en la materia, por ejemplo los 40 procedimientos de clonación molecular, muy utilizados, descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según el

caso, en genral los procedimientos que implican la utilización de kits y reactivos comerciales se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, salvo que se advierta de otro modo.

Los términos "cáncer de vejiga invasivo" aluden a cánceres de vejiga que se han extendido dentro de la pared muscular de la vejiga, e implican la inclusión de las etapas T2-T4 y la enfermedad bajo el sistema TNM (tumor, nódulo, metástasis). En general, estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables en comparación con los pacientes de cáncer no invasivo. Después de la cistectomía, el 50% o más de los pacientes con cáncer invasivo desarrollarán metástasis (Whittmore, Semin Urol 1983; 1:4-10).

Por "alteración del patrón de glicosilación nativa" se pretende indicar, con el propósito aquí mencionado, la deleción de una o más partes carbohidrato que se encuentran en la secuencia nativa 158P1D7 (bien sea mediante la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o mediante la deleción de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa 158P1D7. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y en la proporción de las distintas partes carbohidrato presentes.

El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo una proteína asociada a 158P1D7). Por ejemplo, un análogo de la proteína 158P1D7 puede unirse específicamente mediante un anticuerpo o célula-T que se une específicamente a la proteína 158P1D7.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio. Por tanto, un "anticuerpo" puede ser natural o artificial, tal como los anticuerpos monoclonales producidos por técnicas de hibridoma convencionales. Los anticuerpos anti158P1D7 se unen a las proteínas 158P1D7, o a un fragmento de las mismas, y comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos.

Un "fragmento de anticuerpo" se define como aquel que es al menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión al antígeno. En una realización, cubre específicamente los únicos anticuerpos anti-158P1D7 y los clones de los mismos (incluidos los anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y las composiciones de anticuerpos anti-158P1D7 con especificidad poliepitópica.

El término "secuencias optimizadas por codón" se refiere a las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie huésped particular mediante la sustitución de uno cualquiera o de más de un codón que tenga una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20%, preferentemente inferior a aproximadamente el 30% o el 40%. Una secuencia puede ser "completamente optimizada" para no contener ningún codón que tenga una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20%, preferentemente inferior a aproximadamente el 30% o el 40%. Las Secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para su expresión en determinada especie huésped por eliminación de las Secuencias parásitas de poliadenilación, eliminación de las señales de empalme exón/intrón, eliminación de las repeticiones similares al transposón y/o la optimización del contenido en GC, además de la optimización del codón, se denominan aquí "secuencias mejoradas por expresión".

El término "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o impide una o más de las funciones de las células y/o provoca la destrucción celular. Se pretende que el término incluya los agentes quimioterapéuticos de isótopos radioactivos y toxinas tales como las toxinas moleculares pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de las mismas. Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, sin limitarse a los mismos, maitansinoides, Ytrio, bismuto, ricina, cadena-A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxiantracinodiona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Saponaria officina/is y glucocorticoides y demás agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. También se pueden conjugar los anticuerpos con una enzima activadora de un promedicamento anticáncer capaz de convertir el promedicamento en su forma activa.

El término "homólogo" se refiere a una molécula que muestra homología con otra molécula, por ejemplo teniendo secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en las posiciones correspondientes.

El "Antígeno de Leucocitos Humanos" o "HLA" es una proteína humana del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase I o clase II (véase por ejemplo, Stites y col., IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)).

Los términos "hibridizar", "hibridación", "hibridiza" y similares utilizados en el contexto de los polinucleótidos se refieren a condiciones convencionales de hibridación, preferentemente tal como hibridación en un 50% de formamida/6XSSC/0,1% de SDS/100 Ig/ml de ssADN, donde las temperaturas de hibridación se sitúan por encima de 37ºC y las temperaturas de el lavado con 0,1XSSC/0,1% de SDS se encuentran por encima de 55ºC.

Las expresiones "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que acompañan normalmente el material tal como se encuentra en su estado nativo. Así, los péptidos aislados según la invención preferentemente no contienen los materiales normalmente asociados o presentes en los péptidos en su entorno in situ . Por ejemplo, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando está sustancialmente separado de los polinucleótidos contaminantes que se corresponden con o son complementarios a aquellos ácidos nucleicos distintos de los de 158P1D7 o a quellos que codifican polipéptidos distintos del producto génico 158P1D7 o fragmentos del mismo. Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido aislado de 158P1D7. Se dice que una proteína está "aislada", por ejemplo, cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos y/o químicos para eliminar de la proteína 158P1D7 constituyentes celulares normalmente asociados con o presentes en la proteína. Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos estándar de purificación para obtener una proteína aislada 158P1D7. Alternativamente, se puede preparar una proteína aislada por medios sintéticos o químicos.

El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, incluidos los ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y humanos. En una realización de la invención el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención el mamífero es un ser humano.

Los términos "cáncer metastático de vejiga" y "enfermedad metastática" aluden a cánceres de vejiga que se han extendido hacia los nódulos linfáticos regionales o hacia sitios distantes y que están en la etapa TxNxM+ en el sistema TNM. El sitio más común para la metástasis del cáncer de vejiga es el nódulo linfático. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen el pulmón, huesos e hígado.

El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales presentes en cantidades menores.

Un "motivo", tal como el motivo biológico de una proteína asociada al 158P1D7, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de una proteína, es decir asociada a una función particular (por ejemplo interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o a una modificación (por ejemplo fosforilación, glicosilación o amidación), o a una localización (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o a una secuencia que guarda relación por ser inmunogénica, bien sea humoral o celularmente. Un motivo puede ser contiguo o capaz de estar alineado a ciertas posiciones que tienen generalmente relación con cierta función o propiedad. En el contexto de los motivos de HLA, "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, normalmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo de HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo de HLA de clase II, que es reconocido por una molécula particular de HLA. Los motivos de péptidos para la unión de HLA son típicamente distintos para cada proteína codificada por cada alelo humano HLA y difieren en el patrón de los residuos primarios y secundarios de anclaje.

Un "excipiente farmacéutico" comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes de ajuste del pH y tampón, agentes de ajuste de la tonicidad, humidificantes, conservantes y similares.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica inerte y/o a una composición que es fisiológicamente compatible con los mamíferos, por ejemplo con los seres humanos.

El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases o pares de bases de longitud, bien sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleótidos, y pretende incluir formas monocatenarias o bicatenarias de ADN y/o ARN. En este campo a menudo se utiliza este término de forma intercambiable con "oligonucleótido", aunque "oligonucleótido" pueda utilizarse para referirse al subconjunto de polinucleótidos de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Un polinucleótido puede comprender una Secuencia de nucleótidos aquí descrita en la cual la timidina (T) (tal como se muestra por ejemplo en la SEQ ID NO.: 656) también puede ser uracilo (U); esta definición pertenece a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y el ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales del ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).

El término "polipéptido" significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. En toda la especificación, se utilizan designaciones estándar para los aminoácidos de una letra o de tres letras. En la materia se utiliza a menudo este término de forma intercambiable con "péptido" o "proteína", así "péptido" puede utilizarse para referirse al subconjunto de polipéptidos de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

Un "residuo primario de anclaje" de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una Secuencia peptídica que se entiende proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. De uno a tres, normalmente dos, residuos primarios de anclaje dentro de un péptido de longitud definida define generalmente un "motivo" para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos residuos encajan en estrecho contacto con la ranura de unión del péptido de una molécula de HLA, con sus cadenas laterales enclavadas en bolsillos específicos de la ranura de unión. En una realización, por ejemplo, los residuos primarios de anclaje para una molécula de HLA de clase I están colocados en la posición 2 (desde la posición amino terminal) y en la posición

carboxilo terminal de un epítope de péptido de 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos de acuerdo con la invención. En otra realización, por ejemplo los residuos primarios de anclaje de un péptido que se unirá a una molécula de HLA de clase II están espaciados uno con respecto al otro, más que con respecto a los terminales de un péptido, donde generalmente el péptido es de al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones primarias de anclaje para cada motivo y supermotivo se exponen en la Tabla IV. Por ejemplo, se pueden crear péptidos análogos alterando la presencia o ausencia de residuos determinados en las posiciones primarias y/o secundarias de anclaje mostradas en la Tabla IV. Estos análogos se utilizan para modular la afinidad de unión y/o la amplitud de la población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo particular de HLA.

Una molécula de ADN o ARN "recombinante" es una molécula de ADN o ARN que ha sido sometida a manipulación molecular in vitro.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un especialista medio en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para un anillamiento (annealing) adecuado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. En general, la hibridación depende de la capacidad de las Secuencias de ácido nucleico desnaturalizado para reanillarse cuando las hebras complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, más alta será la temperatura relativa que se puede utilizar. En consecuencia, se deduce que temperaturas relativas más altas tenderían a que las condiciones de reacción fueran más rigurosas, mientras que temperaturas más bajas menos. Para más detalles y explicación sobre la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones de gran rigurosidad", tal como se definen aquí, se identifican, pero no limitadamente, con aquellas donde: (1) se emplea una baja fuerza iónica y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) durante la hibridación se emplea un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (volumen/volumen) con un 0,1% de seroalbúmina bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM tampón fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM cloruro de sodio, 75 mM citrato de sodio a 42ºC; o (3) se emplea un 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 Ig/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad compuesto por 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC. Las "condiciones moderadamente rigurosas" son descritas, pero no se limitan a, por aquellas que figuran en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: un 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de trisodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN recortado de esperma de salmón desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. Un técnico especializado reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

Un "supermotivo" de HLA es una especificidad de unión de péptido compartida por moléculas de HLA codificadas por dos o más alelos de HLA.

Un "animal transgénico" (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal cuyas células contienen un transgén, transgén que ha sido introducido en el animal o en un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo una etapa embriónica. Un "transgén" es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir del cual se desarrolla un animal transgénico.

Tal como se emplea aquí, una "vacuna" contra el HLA o de respuesta inmune celular es una composición que contiene o codifica uno o más péptidos de la invención. Existen numerosas realizaciones de estas vacunas, tal como un cóctel de uno o más péptidos individuales; uno o más péptidos de la invención compuestos por un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican estos péptidos o polipéptidos individuales, por ejemplo un minigén que codifica un péptido poliepitópico. Los péptidos o polipéptidos pueden modificarse opcionalmente, tal como por lipidación, adición de dianas u otras secuencias. Los péptidos de HLA de clase I de la invención pueden mezclarse por adición con, o ligarse a, péptidos de HLA de clase II, para facilitar la activación tanto de los linfocitos T citotóxicos como de los linfocitos T auxiliares. Las vacunas contra HLA pueden comprender también células de presentación de un antígeno pulsado con un péptido, por ejemplo, células dendríticas.

El término "variante" se refiere a una molécula que muestra una variación de un tipo o norma descrita, tal como una proteína que tiene uno o más residuos distintos de aminoácidos en la(s) posición(es) correspondiente(s) de una proteína específicamente descrita (por ejemplo, la proteína 158P1D7 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3). Un análogo es un ejemplo de una proteína variante.

Las proteínas asociadas a 158P1D7 de la invención incluyen aquellas específicamente identificadas aquí, así como las variantes alélicas, variantes de sustitución conservadora, análogos y homólogos que se pueden aislar/generar y caracterizadas sin experimentación indebida siguiendo los procedimientos señalados aquí o de los que se dispone fácilmente en la técnica. Se incluyen también proteínas de fusión que combinan partes de distintas proteínas de 158P1D7 o fragmentos de las mismas, y se incluyen también las proteínas de fusión de una proteína 158P1D7 y un polipéptido heterólogo. Estas proteínas 158P1D7 se denominan colectivamente como proteínas asociadas a 158P1D7 o 158P1D7. El término "proteína asociada a 158P1D7" se refiere a un fragmento de polipéptido o a una secuencia de proteína 158P1D7 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o, de al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o más de 100 aminoácidos.

II.) Polinucle6tid os de 15BP1D7

Se describen aquí polinucleótidos que corresponden o son complementarios a la totalidad o parte de un gen de 158P1D7, ARNm y/o secuencia de codificación, preferentemente en forma aislada, incluidos los polinucleótidos que codifican una proteína asociada a 158P1D7 y fragmentos de la misma, híbridos de ADN, ARN, ADN/ARN y moléculas asociadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un gen de 158P1D7 o a una secuencia de ARNm o a una parte de la misma y los polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridizan a un gen de 158P1D7, un ARNm o a un polinucleótido que codifica 158P1D7 (colectivamente, "polinucleótidos 158P1D7"). En todos los casos, cuando se a ello se hace referencia en esta sección, T puede ser también U en la Figura 2.

Las realizaciones de un polinucleótido 158P1D7 incluyen: un polinucleótido 158P1D7 que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleótido de 158P1D7 tal como se muestra en la Figura 2, en la cual T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2; o, al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2 en la cual T es

U. Por ejemplo, las realizaciones de los nucleótidos de 158P1D7 comprenden sin limitación:

(a) un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 2, en la cual T puede ser también U;

b) un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 2, desde el

número de residuo de nucleótido 23 hasta el número de residuo de nucleótido 2.548, en la cual T

puede ser también U;

c) un polinucleótido que codifica una proteína asociada a 158P1D7 cuya secuencia es codificada por los ADNc contenidos en el plásmido designado p158P1D7-Turbo/3PX depositado en la American Type culture Collection con Nº de acceso PTA-_ el 22 de agosto de 2001 (enviado a través de Federal Express el 20 de agosto de 2001);

(d)

un polinucleótido que codifica una proteína asociada a 158P1D7 que es al menos en un 90% homólogo a la secuencia entera de aminoácidos mostrada en la Figura 2;

(e)

un polinucleótido que codifica una proteína asociada a 158P1D7 que es al menos en un 90% idéntico a la secuencia entera de aminoácidos mostrada en la Figura 2;

(f)

un polinucleótido que codifica al menos un péptido que figura en las Tablas V-XVIII;

(g)

un polinucleótido que codifica una región de péptidos de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 841 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 11;

(h)

un polinucleótido que codifica una región de péptidos de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 841 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor inferior a 0,5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 12;

(i)

un polinucleótido que codifica una región de péptidos de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 841 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil por Porcentaje de Residuos Accesibles de la Figura 13;

(j)

un polinucleótido que codifica una región de péptidos de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 841 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media en la Figura 14;

(k)

un polinucleótido que codifica una región de péptidos de al menos 5 aminoácidos de la Figura 3 en cualquier incremento de número entero hasta 841 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil Beta-turn de la Figura 15;

(l)

un polinucleótido que es totalmente complementario a un polinucleótido de cualquiera de (a)-(k);

(m)

un polinucleótido que hibridiza selectivamente en condiciones rigurosas a un polinucleótido de (a)(l);

(n)

un péptido que es codificado por cualquiera de (a)-(k); y

(o)

un polinucleótido de cualquiera de (a)-(m) o el péptido de (n) junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana.

Tal como se utiliza aquí, se entiende que un rango revela específicamente todas las posiciones de unidades enteras del mismo.

II.A.) Utilizaci6n de los Polinucle6tidos de 15BP1D7

II.A.1.) Control de las Anormalidades Geneticas

Los polinucleótidos de los párrafos anteriores tienen múltiples distintos usos específicos. El gen humano de 158P1D7 representa el emplazamiento cromosómico mencionado en el Ejemplo 3. Por ejemplo, como el gen de 158P1D7 representa este cromosoma, los polinucleótidos que codifican distintas regiones de la proteína 158P1D7 se utilizan para caracterizar anormalidades citogenéticas de este emplazamiento cromosómico, tales como aquellas que se identifican por su asociación a diversos cánceres. En ciertos genes, se han identificado diversas anormalidades cromosómicas, incluidas reordenaciones, como anormalidades citogenéticas frecuentes en una diversos cánceres distintos (véase por ejemplo Krajinovic y col., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson y col., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger y col., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Así, los polinucleótidos que codifican las regiones específicas de la proteína 158P1D7 proporcionan nuevas herramientas que pueden ser utilizadas para definir, con mayor precisión de la que era posible anteriormente, las anormalidades citogenéticas en la región cromosómica que codifica 158P1D7 que puede contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen a la necesidad de la técnica de ampliar la sensibilidad del examen cromosómico con el fin de identificar las anormalidades cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase por ejemplo Evan y col., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)).

Además, como se demostró que 158P1D7 estaba altamente expresado en el cáncer de vejiga y otros cánceres, se utilizan los polinucleótidos 158P1D7 en procedimientos que valoran el estado de los productos génicos de 158P1D7 en los tejidos sanos frente a los cancerosos. Típicamente, los polinucleótidos que codifican las regiones específicas de la proteína 158P1D7 se utilizan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que resultan en una pérdida de un antígeno, etc.) en las regiones específicas del gen de 158P1D7, como aquellas regiones que contienen uno o más motivos. Los ensayos ejemplo incluyen tanto ensayos RT-PCR como análisis de polimorfismos de conformación monocatenarios (SSCP) (véase por ejemplo, Marrogi y col., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)), utilizando ambos los polinucleótidos que codifican las regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones dentro de la proteína.

II.A.4.) Aislamiento de Moleculas del Acido Nucleico que Codifica 15BP1D7

Las Secuencias de ADNc de 158P1D7 descritas aquí permiten aislar otros polinucleótidos que codifican el(los) producto(s) del gen de 158P1D7, así como aislar los polinucleótidos que codifican homólogos del producto génico de 158P1D7, isoformas alternativamente empalmadas, variantes alélicas y formas mutantes del producto génico de 158P1D7, así como los polinucleótidos que codifican análogos de las proteínas asociadas a 158P1D7. Se conocen bien varios procedimientos de clonación molecular que pueden emplearse para aislar los ADNc de longitud completa que codifican un gen de 158P1D7 (véase por ejemplo Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Eds., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo, pueden emplearse adecuadamente procedimientos de clonación del fago lambda utilizando sistemas de clonación comerciales (por ejemplo Lambda ZAP Express, Stratagene). Los clones de fago que contienen los ADNc del gen de 158P1D7 pueden identificarse mediante sondeo con un ADNc de 158P1D7 marcado o de un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el ADNc de 158P1D7 (Figura 2) o una parte del mismo, puede ser sintetizado y utilizado como sonda para recuperar los ADNc de longitud completa y de solape que corresponden a un gen de 158P1D7. El gen mismo de 158P1D7 puede aislarse mediante el examen de las librerías de ADN genómico, librerías de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), librerías de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con las sondas o cebadores de ADN de 158P1D7.

II.A.5.) Moleculas de Acidos Nucleicos Recombinantes Y Sistemas Vector-Huesped

Moléculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleótido 158P1D7, un fragmento, análogo u homólogo del mismo, incluidos, pero no limitados a, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YACs, BACs, así como varios vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con estas moléculas de ADN o ARN recombinante. Los procedimientos para generar estas moléculas son bien conocidos (véase por ejemplo, Sambrook y col., 1989, más arriba). La invención proporciona además un sistema vectorhuésped que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido 158P1D7, un fragmento, un análogo u homólogo del mismo, dentro de una célula huésped procariótica o eucariótica adecuada. Ejemplos de células huésped eucarióticas adecuadas incluyen células de levadura, vegetales o células animales, tal

como una célula de mamífero o de inSEQto (por ejemplo, una célula infectable por el baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Ejemplos de células adecuadas de mamífero son diversas líneas celulares de cáncer de vejiga tales como SCaBER, UM-UC3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 y SW780, otras líneas celulares de cáncer de vejiga transfectables o transducibles, así como diversas células de mamíferos utilizadas normalmente para la expresión de las proteínas recombinantes (por ejemplo células COS, CHO, 293, 293T). De forma más particular, puede emplearse un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de 158P1D7 o un fragmento, análogo u homólogo del mismo para generar las proteínas 158P1D7 o fragmentos de las mismas utilizando cualquier número de sistemas vector-huésped de los empleados normalmente y bien conocidos en este campo.

Se dispone de una amplia gama de sistemas vector-huésped adecuados para la expresión de las proteínas 158P1D7 o de fragmentos de las mismas, véase por ejemplo Sambrook y col., 1989, más arriba; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, más arriba. Los vectores preferentes para la expresión en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pADNc 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y al vector retroviral pSRatkneo (Muller y col., 1991, MCB 11:1785). Utilizando estos vectores de expresión se puede expresar 158P1D7 en varias líneas celulares de cáncer de vejiga y no de vejiga, incluidas por ejemplo SCaBER, UM-UC3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 y SW780. Los sistemas vector-huésped de la invención sirven para producir una proteína 158P1D7 o un fragmento de la misma. Estos sistemas vector-huésped pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de 158P1D7 y mutaciones o análogos de 158P1D7.

La proteína humana recombinante 158P1D7 o un análogo u homólogo o fragmento de la misma puede ser producida por células de mamíferos transfectadas con un constructo que codifica un nucleótido asociado a 158P1D7. Por ejemplo, las células 293T pueden ser transfectadas con un plásmido de expresión que codifica 158P1D7 o un fragmento, análogo u homólogo de la misma, la 158P1D7 o la proteína asociada se expresa en las células 293T, y la proteína 158P1D7 recombinante se aísla por procedimientos estándar de purificación (por ejemplo purificación por afinidad mediante anticuerpos anti-158P1D7). En otra realización, una Secuencia que codifica 158P1D7 es subclonada en el vector retroviral pSRaMSVtkneo y utilizada para infectar varias líneas celulares de mamífero, tales como NIH 3T3, TsuPr1, 293 y rata-1 con el fin de establecer las líneas celulares que expresan 158P1D7. Se pueden emplear también varios otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Los constructos de expresión que codifican un péptido líder unido por el marco a la secuencia de codificación de 158P1D7 pueden utilizarse para generar una forma secretada de la proteína 158P1D7 recombinante.

Tal como se expone aquí, la redundancia en el código genético permite la variación en las Secuencias génicas de 158P1D7. En particular, se sabe en la técnica que especies huésped específicas tienen a menudo preferencias específicas para el codón y, por tanto, se puede adaptar la secuencia descrita para que sea preferente para un huésped deseado. Por ejemplo, las secuencias preferidas para el codón análogo tienen típicamente codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20% en las Secuencias conocidas del huésped deseado) sustituidos por codones de frecuencia más alta. Las preferencias de codón para una especie específica se calculan, por ejemplo, mediante tablas de uso de codones disponibles en INTERNET, por ejemplo en la URL www.dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html.

Se conocen modificaciones adicionales de secuencias que mejoran la expresión de la proteína en un huéspedcelular. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales parásitas de poliadenilación, de señales del sitio de empalme exón/intrón, de repeticiones similares al transposón y/u otras secuencias bien caracterizadas que son deletéreas para la expresión génica. El contenido en GC de la secuencia se ajusta a un nivel promedio para un huésped celular determinado, según se calcula en base a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar posibles estructuras secundarias de horquilla del ARNm. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de iniciación de traducción al principio del marco de lectura abierto, tal como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Los expertos entenderán que la regla general de que los ribosomas eucarióticos inicien la traducción exclusivamente en el codón AUG próximo a 5' es derogada solamente en condiciones especiales (véase por ejemplo Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).

En general, las variantes alélicas naturales de la 158P1D7 humana comparten un alto grado de identidad y homología estructural (por ejemplo, homología del 90% o más). Típicamente, las variantes alélicas de la proteína 158P1D7 contienen sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de las secuencias de 158P1D7 descritas aquí o contienen una sustitución de un aminoácido desde una posición correspondiente en un homólogo de 158P1D7. Una clase de variantes alélicas de 158P1D7 son las proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una pequeña región de una secuencia particular de aminoácido de 158P1D7, pero que contienen además una salida radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservadora, un truncamiento, inserción o desplazamiento del marco. En las comparaciones de Secuencias de proteínas, los términos, similitud, identidad y homología tienen cada uno un significado diferente según se valora en el campo de la genética. Además, ortología y paralogía pueden ser conceptos importantes que describen la relación entre los miembros de determinada familia de proteínas en un organismo con respecto a los miembros de la misma familia en otros organismos.

En la Tabla II se muestran las abreviaturas para los aminoácidos. Con frecuencia se realizan sustituciones conservadoras de aminoácidos en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más sustituciones conservadoras.

Estos cambios incluyen la sustitución de cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Se pueden considerar como conservadoras otras sustituciones, dependiendo del entorno del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) con frecuencia son intercambiables, como pueden serlo también la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, puede a menudo se intercambia por leucina e isoleucina, y a veces por valina. La lisina (K) y arginina (R) son intercambiables en emplazamientos en los cuales la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y los diferentes pKs de estos dos residuos de aminoácido no son significativos. Otros cambios pueden ser considerados todavía como "conservadores" en entornos particulares (véase por ejemplo la Tabla III aquí; páginas 13-15 "Biochemistry" 2nd ED. Lubert Stryer Ed. (Standord University); Henikoff y col., PNAS 1992 Vol. 89 10915-10919; Lei y col., J. Biol. Chem. 19 de mayo de 1995; 270(20): 11882-6).

Las variantes de 158P1D7 pueden obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis sitio-dirigida, examen de alanina y mutagénesis por PCR. Pueden llevarse a cabo mutagénesis sitio-dirigida (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), la mutagénesis en cassette (Wells y col., Gene, 34:315 (1985)), la mutagénesis por selección de restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN con variantes de 158P1D7.

El análisis examen de aminoácidos puede emplearse también para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está implicada en una actividad biológica específica, tal como una interacción proteínaproteína. Dentro del examen preferente, los aminoácidos son aminoácidos relativamente pequeños neutros. Estos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido preferente para examinar dentro de este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina es también típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en las posiciones tanto enclavadas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isostérico.

Tal como se define aquí, las variantes, análogos u homólogos de 158P1D7 tienen el atributo distintivo de tener al menos un epítope que es "reactivo cruzado" con una proteína 158P1D7 que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.: 657. Tal como se utiliza en esta expresión, "reactivo cruzado" significa que un anticuerpo o célula T que se une específicamente a una variante de 158P1D7 se une también específicamente a la proteína 158P1D7 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.: 657. Un polipéptido deja de ser una variante de la proteína mostrada en SEQ ID NO.: 657 cuando ya no contiene ningún epítope capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une específicamente a la proteína 158P1D7. Los especialistas en la materia entenderán que los anticuerpos que reconocen las proteínas se unen a epítopes de tamaño variable y un agrupamiento del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera como un número típico de aminoácidos en un epítope mínimo. Véase por ejemplo Nair y col., J. Immunol. 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes y col., Mol Immunol. (1989) 26(9):865-73; Schwartz y col., J. Immunol. (1985) 135(4):2598-608.

Otra clase de variantes de proteínas asociadas a 158P1D7 comparten una similitud del 70%, 75%, 80%, 85% ó 90%

o más con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.: 657 o con un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de las proteínas 158P1D7 comprenden uno o más de los motivos biológicos de 158P1D7 descritos aquí o actualmente conocidos en la técnica. Así, la presente invención abarca análogos de los fragmentos de 158P1D7 (ácido nucleico o aminoácido) que han alterado las propiedades funcionales (por ejemplo inmunogénicas) en comparación con el fragmento de inicio. Se debe valorar que los motivos actuales o que empiezan a formar parte de la técnica deben aplicarse a las Secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3.

III.A.) Realizaciones de Proteinas Portadoras de Motivos

Se conocen en la técnica varios motivos y se puede evaluar una proteína en cuanto a la presencia de estos motivos en diversas páginas web públicas en Internet (véanse por ejemplo las direcciones URL: pfam.wustl.edu/;searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/strucpredict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/ tools/scnpsit1.html; EpimatrixTM y EpimerTM, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV Lab/epimatrix/epimatrix.html y BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

Las subsecuencias portadoras de motivos de la proteína 158P1D7 figuran y se identifican en la Tabla XIX.

La Tabla XX muestra varios motivos que se presentan frecuentemente basados en investigaciones pfam (véase la dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla XX relacionan (1) abreviatura del nombre del motivo, (2) porcentaje de identidad encontrado entre los distintos miembros de la familia de motivos, (3) nombre o descripción del motivo y (4) función más común; se incluye la información del emplazamiento si el motivo es relevante en cuanto a su emplazamiento.

Los polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos de 158P1D7 mencionados anteriormente sirven para aclarar las características específicas de un fenotipo maligno considerando la observación de que los motivos de 158P1D7 expuestos anteriormente están asociados a la desregulación del crecimiento y porque 158P1D7 está demasiado desordenada en algunos cánceres (véase por ejemplo la Tabla I). La caseína quinasa-II, cAMP y proteína quinasa dependiente del campo y la proteína quinasa C, por ejemplo, son enzimas conocidas por asociarse al desarrollo del fenotipo maligno (véase por ejemplo Chen y col., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon y col., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall y col., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel y col., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O’Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glicosilación como la miristoilación son modificaciones de proteínas asociadas también al cáncer y a la progresión del cáncer (véase por ejemplo Dennis y col., Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju y col., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación de proteína también asociada al cáncer y a la progresión del cáncer (véase por ejemplo Treston y col., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)).

En otra realización, las proteínas de la invención comprenden uno o más de los epítopes inmunoreactivos identificados mediante los procedimientos aceptados en este campo, tales como los péptidos expuestos en las Tablas V-XVIII. Los epítopes CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar aquellos péptidos dentro de una proteína 158P1D7 que son capaces de unirse óptimamente a los alelos HLA especificados (por ejemplo, Tabla IV; EpimatrixTM y EpimerTM, Brown University, URL www.brown.edu/Research/TB-HIV Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.). Además, los procesos para identificar los péptidos que tienen suficiente afinidad de unión para las moléculas de HLA y que tienen correlación con el hecho de ser epítopes inmunogénicos son bien conocidos en la técnica y se llevan a cabo sin experimentación indebida. Además son bien conocidos en la técnica procedimientos para la identificación de péptidos que son epítopos inmunogénicos y se llevan a cabo sin experimentación indebida bien sea in vitro o in vivo.

También son conocidos en este campo los principios para crear análogos de estos epítopes con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se empieza con un epítope que lleva un motivo CTL o HTL (véanse por ejemplo los motivos/supermotivos de Clase I de HLA y de Clase II de HLA de la Tabla IV). El epítope se transforma en un análogo eliminando un aminoácido en una de las posiciones especificadas y reemplazándolo por otro aminoácido determinado en esta posición. Por ejemplo, se puede eliminar un residuo deletéreo a favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferente como se define en la Tabla IV; sustituir un residuo menos preferente por un residuo preferente tal como se define en la Tabla IV; o sustituir un residuo preferente original por otro residuo preferente tal como se define en la Tabla IV. Las sustituciones pueden tener lugar en las posiciones de anclaje primarias o en otras posiciones en un péptido; véase por ejemplo la Tabla IV.

Diversas referencias reflejan la técnica en cuanto a la identificación y generación de epítopes en una proteína de interés, así como en análogos de la misma. Véase por ejemplo la WO 9733602 de Chesnut y col.; Sette, Immunogenetics 1999 50 (3-4): 201-212; Sette y col., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney y col., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo y col., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney y col., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk y col., Nature 351:290-6 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast y col., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta y Col., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander y col., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 16251633; Alexander y col., PMID: 7895164, UI: 95202582; O’Sullivan y col., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.

Una molécula de la proteína 158P1D7 estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que deterioren la unión de 158P1D7 al anticuerpo, célula T o a otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso que se pretenda.

Los polipéptidos asociados a 158P1D7 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden ser previstos y/o identificados mediante diversas técnicas analíticas bien conocidas en este campo, incluidos, por ejemplo, los procedimientos de análisis Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Fameson-Wolf, o en base a la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen estas estructuras sirven particularmente para la generación de anticuerpos anti-158P1D7 específicos de la subunidad, o células T o en la identificación de factores celulares que se unen a 158P1D7.

Los epítopes de CTL pueden determinarse por medio de algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 158P1D7, los cuales son capaces de unirse óptimamente a los alelos especificados de HLA (por ejemplo utilizando el sitio SYFPEITHI de la Web Mundial URL syfpeithi-bmi-heidelberg.com/; las listas de la Tabla IV(A)-(E); EpimatrixTM y EpimerTM Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV; Lab/epymatrix/epimatrix.html; y BIMA, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Para ilustrar esto, se previeron los epítopes de los péptidos procedentes de 158P1D7 que se presentan en el contexto de las moléculas humanas de Clase I de MHC HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35 (TablasV-XVIII). Específicamente, se introdujo la secuencia completa de aminoácidos de la proteína 158P1D7 en el algoritmo de Búsqueda de los Motivos de los Péptidos de HLA encontrado en el sitio web de Bioinformatics and Molecular Analysis SEQtion (BIMAS) mencionado anteriormente. El algoritmo de búsqueda de los motivos de los péptidos de HLA fue desarrollado por el Dr. Ken Parker basándose en la unión de Secuencias específicas de péptidos en la ranura de las moléculas de HLA de Clase I, en particular la HLA-A2 (véase por ejemplo Falk y col., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite el emplazamiento y la clasificación de los péptidos 8-mer, 9-mer y 10-mer procedentes de una Secuencia completa de proteínas para la unión prevista a HLA-A2, así como a muchas otras moléculas de HLA de Clase I. Muchos péptidos de unión de HLA de Clase I son 8-, 9-, 10-, u 11-mers. Por ejemplo, para HLA-A2 de clase I, los epítopes contienen preferentemente leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y valina (V) o leucina (L) en el C-terminal (véase por ejemplo, Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Los resultados seleccionados de los péptidos de unión previstos de 158P1D7 se muestran aquí en las Tablas V-XVIII. En las Tablas V-XVIII se muestran, junto con su emplazamiento, los 50 candidatos superiores de clasificación, 9-mers y 10-mers, para cada miembro de la familia, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación estimada de unión. La puntuación de unión corresponde a la mitad del tiempo estimado de disociación de los complejos que contienen el péptido a 37ºC, a pH 6,5. Se prevé que los péptidos con la puntuación más alta de unión son los más estrechamente unidos al HLA de clase I en la superficie de la célula durante el período de tiempo más largo y, por tanto, representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de células T.

La unión real de péptidos a un alelo de HLA puede evaluarse mediante la estabilización de la expresión de HLA sobre la línea celular defectuosa T2 de procesamiento del antígeno (véase por ejemplo Xue y col., Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa y col., Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de los péptidos específicos puede evaluarse in vi tro por estimulación de los linfocitos T citotóxicos de CD8+ (CTL) en presencia del antígeno que presenta células tales como células dendríticas.

Se debe valorar que cada epítope previsto por el sitio BIMAS, los sitios EpimerTM y EpimatrixTM o especificados por los motivos de clase I o clase II de HLA disponibles en la técnica o que empiezan a formar parte de ella tal, como la forma establecida en la Tablas IV (o determinados utilizando el sitio web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/) deben ser “aplicados” a la proteína 158P1D7. Tal como se emplea en este contexto “aplicado” significa que la proteína 158P1D7 se evalúa, por ejemplo, visualmente o por procedimientos de búsqueda de patrones basados en la informática, tal como lo valoran los especialistas en la materia relevantes.

III.B.) Expresi6n de las Proteinas Asociadas a 15BP1D7

La 158P1D7 puede expresarse adecuadamente en células (tales como células 293T) transfectadas con un vector de expresión comercial, tal como un vector de expresión conducido por CMV que codifica 158P1D7 con una 6XHis Cterminal y tag MYC (pADNc3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona una señal de secreción IgGK que puede utilizarse para facilitar la producción de una proteína 158P1D7 secretada en las células transfectadas. La 158P1D7 secretada marcada-HIS en los medios de cultivo puede purificarse, por ejemplo mediante una columna de níquel, aplicando técnicas estándar.

III.C.) Modificaci6n de las Proteinas Asociadas a 15BP1D7

Un tipo de modificación covalente incluye residuos-diana de aminoácidos de un polipéptido de 158P1D7 reactivos frente a un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales de la 158P1D7. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de 158P1D7 comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo de una proteína de la invención. Otro tipo de modificación covalente de la 158P1D7 comprende la unión del polipéptido de 158P1D7 a uno de diversos polímeros no proteínicos, por ejemplo polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma mencionada en las Patentes de Estados Unidos Nºs 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ó 4.179.337.

Las proteínas asociadas a la 158P1D7 pueden modificarse también para formar una molécula quimérica que comprende la 158P1D7 fusionada con otra secuencia polipeptídica o aminoacídica heteróloga. Esta molécula quimérica puede sintetizarse de forma química o recombinante. Una molécula quimérica puede tener una proteína de la invención fusionada con otro antígeno asociado al tumor o a un fragmento del mismo. Alternativamente, una proteína según la invención puede comprender una fusión de fragmentos de la secuencia de 158P1D7 (aminoácido

o ácido nucleico) de modo tal que se cree una molécula que no es, en toda su longitud, directamente homóloga a las secuencias del ácido nucleico o aminoácido mostradas en la Figura 2 o la Figura 3. Esta molécula quimérica puede comprender múltiplos de la misma subsecuencia de 158P1D7. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína asociada a 158P1D7 con una etiqueta del epítope de polihistidina, que proporciona un epítope al cual se puede unir selectivamente el níquel inmovilizado, con citoquinas o con factores de crecimiento. La etiqueta del epítope se coloca generalmente en el terminal amino o carboxilo de la 158P1D7. La molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína asociada a 158P1D7 con una inmunoglobulina o con una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada “inmunoadhesina”), esta fusión podría ser a la región Fc o una molécula IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido de 158P1D7 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. La fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra CH2 y CH3, o la bisagra de regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgGI. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina, véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.428.130 concedida a 27 de junio de 1995.

III.D.) Utilizaci6n de las Proteinas Asociadas a 15BP1D7

Como la 158P1D7 es altamente expresada en el cáncer de vejiga y otros cánceres, se utilizan las proteínas asociadas a 158P1D7 en procedimientos que evalúan el estado de los productos génicos de 158P1D7 en tejidos sanos en comparación con tejidos cancerosos, aclarando así el fenotipo maligno. Típicamente, los polipéptidos procedentes de regiones específicas de la proteína 158P1D7 se utilizan para valorar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en estas regiones (tales como las regiones que contienen uno o más motivos). Los ensayos ejemplo utilizan anticuerpos o células T que se dirigen a las proteínas asociadas a 158P1D7 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de polipéptidos de 158P1D7 con el fin de evaluar las características de esta región en tejidos sanos en comparación con cancerosos o para aclarar una respuesta inmune al epítope. Alternativamente, las proteínas asociadas a 158P1D7 que contienen residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos de la proteína 158P1D7 se utilizan para examinar los factores que interactúan con aquella región de 158P1D7.

Los fragmentos/subsecuencias de la proteína 158P1D7 son particularmente útiles en la generación y caracterización de anticuerpos específicos del dominio (por ejemplo los anticuerpos que reconocen un epítope extracelular o intracelular de una proteína 158P1D7), para identificar los agentes o factores celulares que se unen a la 158P1D7 o a un dominio estructural particular de la misma, y en varios contextos terapéuticos y de diagnóstico, incluidos, pero no limitados a, ensayos de diagnóstico, vacunas contra el cáncer y procedimientos para preparar estas vacunas.

Las proteínas codificadas por los genes 158P1D7, o por los análogos, homólogos o fragmentos de las mismas, tienen múltiples usos, incluidos, pero no limitados a, la generación de anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y demás agentes, así como constituyentes celulares que se unen a un producto génico de 158P1D7. Los anticuerpos que surgen contra una proteína 158P1D7 o contra un fragmento de la misma se emplean en ensayos de diagnóstico y pronóstico, así como en metodologías de formación de imágenes, en la gestión de los cánceres humanos caracterizados por la expresión de la proteína 158P1D7, tales como los que citados en la Tabla I. Estos anticuerpos pueden expresarse intracelularmente y utilizarse en procedimientos de tratamiento de pacientes con estos cánceres. Las proteínas o ácidos nucleicos asociados a la 158P1D7 se utilizan también en la generación de respuestas HTL o CTL.

Se emplean varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas 158P1D7, incluidos, pero no limitados a, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA), procedimientos inmunocitoquímicos y similares. Los anticuerpos pueden etiquetarse y utilizarse como reactivos de formación de imágenes inmunológicas, capaces de detectar las células que expresan la 158P1D7 (por ejemplo en los procedimientos de imagen radioescintigráfica). Las proteínas 158P1D7 también se emplean, en particular, para la obtención de vacunas contra el cáncer, tal como se describe aquí más adelante.

IV.) Anticuerpos de 15BP1D7

Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a una proteína asociada a 158P1D7 y no se unen (o se unen débilmente) a péptidos o proteínas que no están asociados a 158P1D7. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a 158P1D7 pueden unirse a proteínas asociadas a 158P1D7, por ejemplo a homólogos o análogos de las mismas.

Los anticuerpos de 158P1D7 de la invención son particularmente útiles en ensayos de pronóstico y diagnóstico del cáncer de vejiga y en las metodologías de formación de imágenes.

Además, los anticuerpos expresados intracelularmente (por ejemplo anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres donde esté implicada la expresión de 158P1D7, tales como cánceres avanzados o metastáticos de vejiga.

Varios ensayos inmunológicos son útiles para detectar y cuantificar la 158P1D7 y las proteínas mutantes asociadas a 158P1D7. Estos ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos de 158P1D7 capaces de reconocer y unirse a la proteína asociada a 158P1D7, según convenga. Estos ensayos se desarrollan dentro de varios formatos de ensayos inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluidos, pero no limitados a, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) y similares.

Los ensayos inmunológicos no-anticuerpo de la invención comprenden también ensayos de inmunogenicidad de células T (inhibidores o estimulantes), así como ensayos de unión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Además también se proporciona procedimientos inmunológicos de formación de imágenes capaces de detectar el cáncer de vejiga que expresan la 158P1D7, incluidos, pero no limitados a, procedimientos de formación de imágenes radioescintigráficas utilizando anticuerpos etiquetados de 158P1D7. Estos ensayos son clínicamente útiles en la detección, control y pronóstico de los cánceres que expresan 158P1D7, como el cáncer de vejiga.

Los anticuerpos de 158P1D7 se utilizan también en procedimientos para purificar proteínas asociadas a 158P1D7 y para aislar homólogos de 158P1D7 y moléculas asociadas. Por ejemplo, un procedimiento de purificación de una proteína asociada a 158P1D7 comprende la incubación de un anticuerpo de 158P1D7, que se ha acoplado a una

matriz sólida, con un lisato o con otra solución que contiene una proteína asociada a 158P1D7, en condiciones que permiten al anticuerpo de 158P1D7 unirse a la proteína asociada a 158P1D7; el lavado de la matriz sólida para eliminar las impurezas; y la elución de la proteína asociada a 158P1D7 del anticuerpo acoplado.

Se conocen bien en la técnica diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos por inmunización de un huésped mamífero adecuado utilizando una proteína, un péptido o un fragmento asociado a 158P1D7, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, se pueden utilizar también proteínas de fusión de 158P1D7, tal como una proteína de fusión-GST de 158P1D7. Se produce una proteína de fusión GST que comprende toda o parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3, entonces se utiliza como inmunógeno para generar los anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína asociada a 158P1D7 y se utiliza como inmunógeno.

Además, se utilizan técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin la proteína asociada a 158P1D7 o las células de expresión de 158P1D7) para generar una respuesta inmune al inmunógeno codificado (para su análisis, véase Donnelly y col., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).

Puede analizarse la secuencia de aminoácidos de 158P1D7 tal como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3 con el fin de seleccionar las regiones específicas de la proteína 158P1D7 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se utilizan análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de 158P1D7 para identificar las regiones hidrofílicas en la estructura de 158P1D7 (véase por ejemplo el ejemplo titulado “Patrones de antigenicidad”). Las regiones de la proteína 158P1D7 que muestran la estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente mediante varios otros procedimientos conocidos en la técnica, tales como análisis Chou-Fasman, Hopp and Woods, Kyte-Doolittle, Janin, Bhaskaran and Ponnuswamy, Deleage and Roux, Garnier-Robson, Eisenberg, Karplus-Schultz, o Jameson-Wolf.

Procedimientos para la generación de anticuerpos de 158P1D7 se ilustran además por medio de los ejemplos dados aquí. Los procedimientos para preparar una proteína o un polipéptido para su utilización como inmunógeno son bien conocidos en la técnica. También son bien conocidos en este campo los procedimientos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tal como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, se emplea la conjugación directa que utiliza, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos son eficaces reactivos ligantes como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. A menudo, la administración de un inmunógeno de 158P1D7 se lleva a cabo por inyección durante un período de tiempo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, tal como se entiende en la materia. Durante el programa de inmunización se pueden tomar concentraciones de anticuerpos para determinar la adecuada formación del anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales de 158P1D7 pueden producirse por varios medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se preparan líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado mediante técnicas estándar de hibridoma de Kohler y Milstein o por modificaciones que inmortalizan las células B productoras del anticuerpo, tal como es generalmente conocido. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se exploran por inmunoensayo, donde cual el antígeno es una proteína asociada a 158P1D7. Cuando se identifica el cultivo apropiado de células inmortalizadas, las células pueden extenderse y los anticuerpos producirse bien sea a partir de cultivos in vitro o del fluido ascítico.

Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína 158P1D7 pueden producirse también en el contexto de anticuerpos injertados en una región determinante de complementariedad (CDR) o quimérica de múltiple origen de especie.

Se pueden producir también anticuerpos humanizados o humanos de 158P1D7, y éstos se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Son bien conocidos procedimientos para humanizar los anticuerpos murino y demás anticuerpos no humanos mediante la sustitución de uno o más de los CDRs de anticuerpos no humanos por las Secuencias correspondientes de anticuerpos humanos (véase por ejemplo Jones y col., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann y col., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239: 1534-1536). Véase también, Carter y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims y col., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales totalmente humanos incluyen la exhibición de fagos y procedimientos transgénicos (para su análisis véase Vaughan y col., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Los anticuerpos monoclonales totalmente humanos de 158P1D7 pueden generarse mediante tecnologías de clonación que emplean grandes librerías combinatorias del gen humano Ig (es decir, exhibición de fagos) (Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp 65-82). Los anticuerpos monoclonales totalmente humanos de 158P1D7 pueden producirse también utilizando ratones transgénicos concebidos para contener posiciones del gen de la inmunoglobulina humana, tal como se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 98/24893, Kucherlapati y Jakobovits y col., publicada a 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; las patentes de Estados Unidos

6.162.963, concedida el 19 de diciembre de 2000, 6.150.584, concedida el 12 de noviembre de 2000, y 6.114598, concedida el 5 de septiembre de 2000). Este procedimiento evita la manipulación in vitro necesaria con la tecnología de exhibición de fagos y produce eficazmente anticuerpos humanos auténticos de gran afinidad.

Puede establecerse la reactividad de los anticuerpos de 158P1D7 con una proteína asociada a 158P1D7 mediante diversos medios bien conocidos, incluidos los análisis Western Blot, inmunoprecipitación, ELISA y FACS, que utilizan, como es apropiado, proteínas asociadas a 158P1D7, células de expresión de 158P1D7 o extractos de las mismas. Puede marcarse un anticuerpo de 158P1D7 o un fragmento del mismo con un marcador detectable o conjugarse a una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos bioluminescentes, compuestos quimioluminescentes, quelantes metálicos o enzimas. Además, los anticuerpos biespecíficos, específicos para dos o más epítopes de 158P1D7, se generan utilizando procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Los anticuerpos homodiméricos pueden generarse también por procedimientos de reticulación bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Wolff y col., Cancer Res. 53: 2560-2565).

V.) Respuestas Inmunes Celulares a 15BP1D7

Se ha esbozado el mecanismo por el cual las células T reconocen los antígenos. Las composiciones eficaces de vacunas con epítopes de los péptidos de la invención inducen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para comprender el valor y la eficacia de las composiciones de la invención, que inducen respuestas celulares inmunes, se proporciona un breve análisis de la tecnología asociada a la inmunología.

Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa como ligando reconocido por las células T restringidas por HLA (Buus, S. y col., Cell 47: 1071, 1986; Babbitt, B.P. y col., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R.N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). Durante el estudio de los análogos de antígenos sustituidos por un único aminoácido y la secuenciación de los péptidos naturalmente procesados unidos de forma endógena, se identificaron los residuos críticos que se corresponden con los motivos necesarios para la unión específica a las moléculas del antígeno HLA y que figuran en la Tabla IV (véase también por ejemplo Southwood y col., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee y col., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee y col., SYFPEITHI, ruta de acceso a la Web URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H.M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert y col., Cell 74: 929-937, 1993; Kondo y col., J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney y col., J. Immunol. 157:3480-3490, 1996; Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov.; 50(3-4):201-12, Review).

Además, los análisis cristalográficos por rayos-X de los complejos de péptidos HLA han revelado bolsillos dentro de la hendidura/ranura de unión del péptido de las moléculas HLA que acomodan, en un modo alelo-específico, los residuos portados por los ligandos peptídicos; estos residuos a su vez determinan la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los cuales están presentes (véase por ejemplo, Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith y col., Immunity 4:203, 1996; Fremont y col., Immunity 8.305, 1998; Stern y col., Structure 2:245, 1994; Jones,

E.Y.

Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J.H. y col., Nature 364:33, 1993; Guo, H.C. y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H.C. y col., Nature 360:364, 1992; Silver, M.L. y col., Nature 360:367, 1992; Matsumura,

M.

y col., Science 257:927, 1992; Madden y col., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D.H. y col., Science 257:919, 1992; Saper, M.A., Bjorkman, P.J. and Wiley, D.C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991).

En consecuencia, la definición de los motivos de unión a HLA alelo-específicos de clase I y clase II o a los supermotivos de clase I o clase II permite identificar las regiones dentro de una proteína que tienen correlación con la unión con el(los) antígeno(s) particular(es) HLA.

Por tanto, mediante un proceso de identificación de motivos HLA, se han identificado los candidatos para vacunas basadas en epítopes; estos candidatos pueden evaluarse además mediante ensayos de unión a péptidos de HLA para determinar la afinidad de unión y/o el período de tiempo de asociación del epítope a su molécula HLA correspondiente. Se pueden realizar trabajos de confirmación adicionales para seleccionar, de entre estos candidatos para estas vacunas, los epítopes con características preferidas en términos de amplitud de población y/o inmunogenicidad.

Se pueden utilizar varias estrategias para evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo:

1) La evaluación de cultivos de células T primarias procedentes de individuos sanos (véase por ejemplo Wentworth, P.A. y col., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. y col., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. y col., Human Immunol. 59:1, 1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos de sangre periférica (PBL) procedentes de sujetos sanos con un péptido de prueba, en presencia de células que presentan el antígeno, in vitro, durante un período de varias semanas. Las células T específicas del péptido se activan durante este tiempo y se detectan

mediante, por ejemplo, un ensayo con linfoquina o de liberación de 51Cr que implica células diana sensibilizadas con los péptidos

2) La inmunización de ratones transgénicos HLA (véase por ejemplo Wentworth, P.A. y col., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P.A. y col., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. y col., J. Immunol. 159:4753, 1997). Por ejemplo, en estos procedimientos se administran vía subcutánea los péptidos en un adyuvante incompleto de Freund a ratones transgénicos HLA. Varias semanas después de la inmunización, se retiran los esplenocitos y se cultivan in vitro en presencia del péptido de prueba durante aproximadamente una semana. Se detectan las células T específicas del péptido utilizando, por ejemplo, un ensayo de liberación de 51Cr, que involucra las células diana sensibilizadas con los péptidos y las células diana que expresan de forma endógena el antígeno generado.

3) La evidencia de memoria en las respuestas de las células T por parte de los individuos inmunes que han sido vacunos eficazmente y/o por parte de pacientes enfermos crónicos (véase por ejemplo Rehermann, B. y col., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D.L. y col., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. y col., J. Clin. Invest. 100.503, 1997; Threlkeld, S.C. y col., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H.M. y col., J. Virol. 71:6011, 1997). En consecuencia, las respuestas de memoria son detectadas mediante PBL del cultivo procedente de sujetos que han estado expuestos al antígeno debido a la enfermedad y que, por tanto, han generado “naturalmente” una respuesta inmune, o de pacientes que estaban vacunados contra el antígeno. Los PBL procedentes de los sujetos son cultivados in vitro durante 1-2 semanas en presencia de células que presentan el antígeno (APC) más el péptido de prueba para permitir la activación de las células T de “memoria”, en comparación con las células T “ingenuas”. Al final del período de cultivo, se detecta la actividad de las células T por medio de ensayos que incluyen la liberación de 51Cr, que involucra las células diana sensibilizadas con péptidos, la proliferación de células T o la liberación de linfoquina.

VI.) Animales Transgenicos con 15BP1D7

Pueden emplearse también ácidos nucleicos que codifican una proteína asociada a 158P1D7 para generar animales transgénicos o animales “noqueados” que, a su vez, sirven para el desarrollo y la exploración de reactivos terapéuticamente útiles. De acuerdo con las técnicas establecidas, puede utilizarse el ADNc que codifica la 158P1D7 para clonar ADN genómico que codifique la 158P1D7. Las secuencias genómicas clonadas pueden utilizarse entonces para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica 158P1D7. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales como ratones o ratas, ya son convencionales en la técnica y vienen descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nºs 4.736.866, 12 de abril de 1988, y 4.870.009, 26 de septiembre de 1989. Típicamente, se dirigía a células particulares para la incorporación del transgén de 158P1D7 con los promotores tisulares específicos.

Pueden utilizarse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica la 158P1D7 para examinar el efecto de la expresión aumentada del ADN que codifica la 158P1D7. Estos animales pueden utilizarse como animales control para reactivos, incluso para conferir protección contra, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas a la sobreexpresión. Se trata un animal con un reactivo de forma que una menor incidencia de una condición patológica en comparación con animales no tratados que portan el transgén indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición patológica.

Como alternativa, pueden emplearse homólogos no humanos de 158P1D7 para construir un animal “noqueado” con 158P1D7 que posee un gen defectuoso o alterado que codifica la 158P1D7 a consecuencia de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica la 158P1D7 y el ADN genómico alterado que codifica la 158P1D7 introducida en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, puede utilizarse el ADNc que codifica 158P1D7 para clonar el ADN genómico que codifica la 158P1D7 siguiendo las técnicas establecidas. Se puede suprimir o sustituir por otro gen una parte del ADN genómico que codifica la 158P1D7, por ejemplo sustituirse por un gen que codifica un marcador de selección que puede utilizarse para controlar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en los extremos 5’ como 3’) (véase por ejemplo Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homóloga). Se introduce el vector en una línea celular de origen embriónico (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado homológamente con el ADN endógeno (véase por ejemplo Li y col., Cell, 69:915 (1992)). Entonces se inyectan las células seleccionadas en un blastocito animal (por ejemplo, de ratón o rata) para formar quimeras por agregación (véase por ejemplo Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). Se puede implantar entonces un embrión quimérico en un animal colactáneo hembra seudopreñada adecuada y el embrión se puede llevar a término para crear un animal “noqueado”. Los descendientes que contienen el ADN homológamente recombinado en sus células germinales pueden identificarse por técnicas estándar y ser utilizados para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN homológamente recombinado. Los animales noqueados se caracterizan, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas o por el desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido de 158P1D7.

VII.) Procedimientos para la Detecci6n de 15BP1D7

El patrón de expresión de 158P1D7 hace de ella un marcador de diagnóstico para una enfermedad metastásica. En consecuencia, el estado de los productos del gen de 158P1D7 proporciona información útil para predecir diversos factores que incluyen la predisposición a una enfermedad en etapa avanzada, a la velocidad de la progresión y/o la agresividad del tumor. Tal como se expone aquí en detalle, el estado de los productos génicos de 158P1D7 en muestras de pacientes puede analizarse según diversos protocolos que son bien conocidos en la técnica, incluido el análisis inmunohistoquímico, las varias técnicas Northern Blot, incluida la hibridación in situ, análisis por RT-PCR (por ejemplo en muestras microdisSEQionadas por captura con láser), análisis Western Blot y análisis de diversos tejidos.

Más en particular, se describen aquí ensayos para la detección de los polinucleótidos de 158P1D7 en una muestra biológica tal como orina, suero, hueso, fluido prostático, tejidos, semen, preparaciones celulares y similares. Entre los polinucleótidos detectables de 158P1D7 se incluyen, por ejemplo, un gen de 158P1D7 o un fragmento del mismo, ARNm de 158P1D7, la variante de empalme alternativo de los ARNms de 158P1D7 y las moléculas de ARN

o ADN recombinante que contienen un polinucleótido de 158P1D7.

Un procedimiento para detectar un ARNm de 158P1D7 en una muestra biológica comprende la producción de ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa por medio de al menos un cebador; la amplificación del ADNc así producido por medio de polinucleótidos de 158P1D7 como cebadores sentido y antisentido para amplificar los ADNc de 158P1D7 aquí; y la detección de la presencia del ADNc de 158P1D7 amplificado. Opcionalmente, se puede determinar la secuencia del ADNc de 158P1D7 amplificado.

Un procedimiento para detectar un gen de 158P1D7 en una muestra biológica comprende el aislamiento primero del ADN genómico procedente de la muestra; la amplificación del ADN genómico aislado mediante los polinucleótidos de 158P1D7 como cebadores sentido y antisentido; y la detección de la presencia del gen de 158P1D7 amplificado. Puede concebirse cualquier combinación de sondas sentido y antisentido adecuadas a partir de la secuencia de nucleótidos proporcionada para la 158P1D7 (Figura 2) y utilizada con este propósito.

Los procedimientos para detectar una proteína asociada a 158P1D7 son también bien conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis Western Blot, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, un procedimiento para detectar la presencia de una proteína asociada a 158P1D7 en una muestra biológica comprende primero la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo de 158P1D7, un fragmento del mismo reactivo a 158P1D7, o una proteína recombinante que contiene una región de unión al antígeno de un anticuerpo de 158P1D7; y luego la detección de la unión de la proteína asociada a 158P1D7 en la muestra.

Un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de 158P1D7 comprende la detección de la presencia del ARNm de 158P1D7 en la célula. Los procedimientos para la detección de los ARNm particulares en las células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que utilizan sondas de ADN complementario (tal como la hibridación in situ utilizando ribosondas marcadas de 158P1D7, Northern Blot y técnicas asociadas) y varios ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR, utilizando cebadores complementarios específicos de 158P1D7 y demás procedimientos de detección del tipo amplificación, tales como por ejemplo ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de 158P1D7 comprende la detección de la presencia de la proteína asociada a 158P1D7 en la célula o secretada por la célula. En la técnica se conocen diversos procedimientos para detectar proteínas y éstos se emplean para la detección de proteínas asociadas a 158P1D7 y de células que expresan las proteínas asociadas a 158P1D7.

El análisis de expresión de 158P1D7 sirve también de herramienta para identificar y evaluar los agentes que modulan la expresión del gen de 158P1D7. Por ejemplo, la expresión de 158P1D7 es notablemente sobreregulada en el cáncer de vejiga y se expresa en los cánceres de los tejidos citados en la Tabla I. La identificación de una molécula o de un agente biológico que presente expresión o sobreexpresión de 158P1D7 en células cancerosas tiene valor terapéutico. Por ejemplo, un agente como éste puede identificarse por medio de una pantalla que cuantifica la expresión de 158P1D7 por RT-PCR, hibridación del ácido nucleico o unión del anticuerpo.

VIII.) Procedimientos para Controlar el Estado de los Genes Asociados a 15BP1D7 Y Sus Productos

La oncogénesis es conocida por ser un proceso multietapa en el cual el crecimiento celular se desregula progresivamente y las células progresan desde un estado fisiológico normal hacia estados precancerosos y luego cancerosos (véase por ejemplo Alers y col., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs y col., Cancer Surv. 23: 1932 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para evidenciar un crecimiento celular desregulado (tal como la expresión aberrante de 158P1D7 en los cánceres) tiene en cuenta la detección temprana de esta fisiología aberrante, antes de que un estado patológico como el cáncer haya progresado hasta una etapa en la cual las opciones terapéuticas son más limitadas y/o el pronóstico es peor. En estos exámenes, el estado de la 158P1D7 en una muestra biológica de interés puede compararse, por ejemplo, con el estado de 158P1D7 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra procedente de aquel individuo o alternativamente otro individuo que no esté afectado por una patología). Una alteración en el estado de la 158P1D7 en la muestra

biológica (en comparación con la muestra normal) proporciona una evidencia del crecimiento celular desregulado. Además de utilizar una muestra biológica que no esté afectada por una patología tal como una muestra normal, también se puede utilizar un valor normalizado predeterminado, tal como un nivel normal predeterminado, de la expresión de ARNm (véase por ejemplo Grever y col., J. Comp. Neurol. 1996 Dec. 9; 376(2):306-14 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.837.501) para comparar el estado de la 158P1D7 en una muestra.

El término “estado” en este contexto se utiliza de acuerdo con su significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Típicamente, los expertos utilizan diversos parámetros para evaluarla condición o el estado de un gen y de sus productos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, el emplazamiento de los productos del gen expresado (incluido el emplazamiento de las células que expresan 158P1D7), así como el nivel y la actividad biológica de los productos del gen expresado (tales como el ARNm de 158P1D7, polinucleótidos y polipéptidos). Típicamente, una alteración en el estado de 158P1D7 comprende un cambio en el emplazamiento de 158P1D7 y/o de las células que expresan 158P1D7 y/o un incremento en el ARNm de 158P1D7 y/o de la expresión de la proteína.

El estado de 158P1D7 en una muestra puede analizarse por diversos medios bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ , análisis RT-PCR en muestras microdiSEQcionadas por captura láser, análisis Western Blot y diversos análisis tisulares. Protocolos típicos para evaluar el estado y los productos génicos de 158P1D7 se encuentran, por ejemplo, en Ausubel y col., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Northern Blotting), 15 (Inmunoblotting) and 18 (PCR Analysis). Así, el estado de 158P1D7 en una muestra biológica se evalúa mediante diversos procedimientos utilizados por expertos, incluyendo, pero no limitados a, análisis genómico Southern (para examinar, por ejemplo perturbaciones en el gen 158P1D7), análisis Northern y/o análisis PCR del ARNm de 158P1D7 (para examinar por ejemplo alteraciones en las Secuencias de polinucleótidos o en los niveles de expresión de los ARNm de 158P1D7) y análisis inmunohistoquímico y/o Western (para examinar por ejemplo alteraciones en las Secuencias polipeptídicas, alteraciones en el emplazamiento de los polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de las proteínas 158P1D7 y/o asociaciones de las proteínas 158P1D7 con asociados polipeptídicos de unión). Entre los polinucleótidos detectables de 158P1D7 se incluyen, por ejemplo, un gen de 158P1D7 o un fragmento del mismo, ARNm de 158P1D7, variantes de empalme alternativo, ARNms de 158P1D7 y moléculas de ARN o ADN recombinante que contienen un polinucleótido de 158P1D7.

El perfil de expresión de 158P1D7 hace de él un marcador de diagnóstico para la enfermedad con metástasis y/o local y proporciona información sobre el crecimiento o sobre el potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de 158P1D7 proporciona información útil para predecir la propensión a ciertas etapas particulares de la enfermedad, la progresión y/o la agresividad del tumor. La invención proporciona procedimientos y ensayos para determinar el estado de 158P1D7 y diagnosticar aquellos cánceres que expresan la 158P1D7, tales como los cánceres de los tejidos relacionados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de 158P1D7 se expresa tanto en el cáncer de vejiga y otros cánceres, comparando con tejido sano de vejiga, se pueden utilizar ensayos que evalúan el nivel de transcripción de ARNm de 158P1D7 o de las proteínas en una muestra biológica, para diagnosticar una enfermedad asociada a la desregulación de 158P1D7, y puede proporcionar información de pronóstico útil en la definición de las opciones terapéuticas apropiadas.

El estado de expresión de 158P1D7 proporciona información que incluye la presencia, etapa y localización de células displásticas, precancerosas y cancerosas, previendo la propensión a ciertas etapas de la enfermedad y/o para determinar la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión hace que sirva como reactivo de formación de imágenes para la enfermedad metástasica. Se describe aquí diversos procedimientos de diagnóstico y pronóstico molecular para examinar el estado de la 158P1D7 en muestras biológicas tales como las que provienen de individuos que padecen, o de los que se sospecha padecen, una patología caracterizada por un crecimiento celular desregulado, tal como cáncer.

Tal como se ha descrito anteriormente, el estado de 158P1D7 en una muestra biológica puede examinarse mediante diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de 158P1D7 en una muestra biológica obtenida de un emplazamiento específico en el cuerpo puede examinarse mediante la evaluación de la muestra en búsqueda de la presencia o ausencia de células que expresan 158P1D7 (por ejemplo, aquellas que expresan las proteínas o ARNms de 158P1D7). Este examen puede proporcionar una evidencia del crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando las células que expresan 158P1D7 se encuentran en una muestra biológica que no contiene normalmente estas células (tal como un nódulo linfático), porque estas alteraciones en el estado de 158P1D7 en una muestra biológica se asocian a menudo al crecimiento celular desregulado. De forma específica, un indicador de crecimiento celular desregulado es la metástasis de las células cancerosas desde un órgano de origen (tal como la vejiga) hacia una zona distinta del cuerpo (tal como un nódulo linfático). Por ejemplo, la evidencia de crecimiento celular desregulado es importante porque las metástasis ocultas del nódulo linfático pueden ser detectadas en una proporción notable en pacientes con cáncer de próstata, y estas metástasis están asociadas a los indicadores conocidos de la progresión de la enfermedad (véase por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42(4):315-317 (2000); Su y col., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman y col., J. Urol. 1995 Aug. 154(2 Pt 1):474-8).

Procedimientos para controlar los productos génicos de 158P1D7 pueden comprender la determinación del estado de los productos génicos de 158P1D7 expresados por las células procedentes de un individuo del que se sospecha

tiene una enfermedad asociada al crecimiento celular desregulado (como hiperplasia o cáncer) y luego comparando el estado así determinado con el estado de los productos génicos de 158P1D7 en la muestra correspondiente sana. La presencia de productos génicos aberrantes de 158P1D7 en la muestra de prueba comparada con la muestra sana proporciona una indicación de la presencia de un crecimiento celular desregulado dentro de las células del individuo.

Ensayos que sirven para determinar la presencia de cáncer en un individuo puede comprender la detección de un aumento notable en la expresión de la proteína o del ARNm de 158P1D7 en una célula de prueba o en muestra de tejido con respecto a los niveles de expresión en la célula o el tejido sano correspondiente. La presencia del ARNm de 158P1D7, por ejemplo, puede evaluarse en las muestras de tejido citadas pero no limitadas a las que se relacionan en la Tabla 1. La presencia de una expresión notable de 158P1D7 en cualquiera de estos tejidos sirve para indicar la aparición, presencia y/o gravedad de un cáncer, ya que los tejidos sanos correspondientes no expresan el ARNm de 158P1D7 o lo expresan a niveles más bajos.

El estado de 158P1D7 se determina a nivel de proteína más que a nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, este procedimiento comprende la determinación del nivel de la proteína 158P1D7 expresada por las células en una muestra de tejido de prueba y la comparación del nivel así determinado con el nivel de 158P1D7 expresado en una muestra correspondiente sana. La presencia de la proteína 158P1D7 se evalúa, por ejemplo, por medio de los procedimientos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos de 158P1D7 o asociados enlazantes capaces de detectar la expresión de la proteína 158P1D7 se utilizan en diversos formatos de ensayo bien conocidos la técnica con este propósito.

Se puede evaluar el estado del nucleótido de 158P1D7 y de las secuencias de aminoácidos en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Estas evaluaciones son útiles porque se observan perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en gran cantidad de proteínas asociadas a un fenotipo de crecimiento desregulado (véase por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de 158P1D7 puede ser indicadora de la presencia o promoción de un tumor. Por tanto, estos ensayos tienen un valor predictivo y de diagnóstico cuando una mutación en la 158P1D7 indica una pérdida potencial de la función o un aumento del crecimiento del tumor.

Son bien conocidos en la técnica múltiples ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos de los productos génicos de 158P1D7 se observan según los protocolos Northern, Southern, Western, PCR y de Secuenciación de ADN expuestos aquí. Además, se conocen la técnica otros procedimientos para observar perturbaciones en las Secuencias de aminoácidos y nucleótidos, tales como el análisis de polimorfismos de conformación monocatenarios (véase por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.382.510, concedida el 7 de septiembre de 1999, y 5.952.170, concedida el 17 de enero de 1995).

Además, se puede examinar el estado de metilación del gen 158P1D7 en una muestra biológica. Con frecuencia se produce una desmetilación y/o hipermetilación aberrante de las islas CpG en las regiones reguladoras 5’ del gen en las células inmortalizadas y transformadas, y pueden resultar en una alteración de la expresión de diversos genes. Por ejemplo, se ha detectado una hipermetilación promotora en los genes DBCCR1, PAX6 y APC en los cánceres de vejiga, conduciendo a la expresión aberrante de estos genes (Esteller y col., Cancer Res 2001; 61:3225-3229). Son bien conocidos en la técnica diversos ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar, en los estudios de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden segmentar las Secuencias que contienen los sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de las islas CpG. Además, el MSP (PCR de metilación específica) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de determinado gen. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN con bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilo), seguida de amplificación, utilizando cebadores específicos, del ADN metilado con respecto al no metilado. Tambien se encuentran protocolos que implican una interferencia con la metilación, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel y col., eds., 1995.

La amplificación génica es otro procedimiento para evaluar el estado de 158P1D7. La amplificación del gen se mide directamente en una muestra, por ejemplo, por medio de Southern Blotting o Northern Blotting convencional, para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), dot blotting (análisis de ADN), o hibridación in situ utilizando una sonda adecuadamente marcada basada en las Secuencias proporcionadas aquí. Alternativamente, se emplean anticuerpos que reconocen los dúplex (doble hélices) específicos, incluidos ADN dúplex, ARN dúplex y ADN-ARN dúplex híbridos o dúplex de la proteína ADN. Los anticuerpos a su vez se etiquetan y se lleva a cabo el ensayo en el lugar donde el dúplex está unido a una superficie, para que a la formación del dúplex en la superficie se pueda detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

Se puede someter a ensayo tejido biopsiado o sangre periférica en cuanto a la presencia de células cancerosas mediante, por ejemplo, análisis Northern, dot blot o RT-PCR para detectar la expresión de 158P1D7. La presencia de ARNm de 158P1D7 amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos

RT-PCR son bien conocidos en la técnica. Actualmenter se están evaluando los ensayos de detección RT-PCR de células tumorales en sangre periférica para su utilización en el diagnóstico y gestión de ciertos tumores sólidos en humanos.

Un procedimiento para predecir la propensión al cáncer comprende la detección del ARNm de 158P1D7 o la proteína 158P1D7 en una muestra de tejido, indicando su presencia la predisposición al cáncer, donde el grado de expresión de ARNm de 158P1D7 se correlaciona con el grado de predisposición. En una realización específica, se examina la presencia de 158P1D7 en la vejiga o en otro tejido con la presencia de 158P1D7 en la muestra, lo que proporciona una indicación de la propensión al cáncer de vejiga (o a la aparición o existencia de un tumor de vejiga). De forma similar, se puede evaluar la integridad de las Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 158P1D7 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos 158P1D7 en la muestra es una indicación de predisposición al cáncer (o a la aparición o existencia de un tumor).

Un procedimiento para determinar la agresividad de un tumor puede comprender la determinación del nivel de ARNm de 158P1D7 o de proteína 158P1D7 expresado por las células tumorales, comparando el nivel así determinado con el nivel de ARNm de 158P1D7 o de proteína de 158P1D7 expresado en un tejido sano correspondiente tomado del mismo individuo o en una muestra de referencia de tejido sano, donde el grado de expresión de ARNm de 158P1D7 o de la proteína 158P1D7 en la muestra tumoral, comparado con la muestra sana, indica el grado de agresividad. La agresividad de un tumor se puede evaluar mediante la determinación del punto hasta el cual se expresa 158P1D7 en las células tumorales, niveles de expresión más altos indican tumores más agresivos. La evaluación de la integridad de las secuencias de aminoácido y nucleótidos de 158P1D7 en una muestra biológica, con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos.

Procedimientos para observar la progresión con el tiempo de una malignidad en un individuo comprenden la determinación del nivel de ARNm de 158P1D o de la proteína 158P1D7 expresado por las células en una muestra del tumor, la comparación del nivel así determinado con el nivel de ARNm de 158P1D7 o de la proteína 158P1D7 expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo en un momento distinto, donde el grado de expresión de ARNm de 158P1D7 o de la proteína 158P1D7 en la muestra de tumor con el tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En una realización específica, la progresión de un cáncer se evalúa mediante la determinación de la expresión de 158P1D7 en las células tumorales con el tiempo, donde una mayor expresión con el tiempo indica una progresión del cáncer. De igual manera, se puede evaluar la integridad de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 158P1D7 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, donde la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer.

Los anteriores enfoques de diagnóstico se pueden combinar con cualquiera de diversos protocolos de pronóstico y diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, otra realización de la invención se dirige a procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 158P1D7 y los productos génicos de 158P1D7 (o perturbaciones en el gen de 158P1D7 y los productos del gen de 158P1D7) y un factor que se asocia a la malignidad, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Se puede utilizar una gran variedad de factores asociados a la malignidad, tales como la expresión de genes asociados a la malignidad (por ejemplo, la expresión de PSCA, H-rasand p53, etc.), así como observaciones citológicas generales (véase por ejemplo Bocking y col., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2): 223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. 11(6): 543-51; Baisden y col., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8): 918-24). Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 158P1D7 y los productos del gen de 158P1D7 (o las perturbaciones en el gen de 158P1D7 y los productos del gen 158P1D7) y otro factor que se asocia a la malignidad son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido.

Procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 158P1D7 y los productos del gen de 158P1D7 (o las perturbaciones en el gen de 158P1D7 y los productos del gen 158P1D7) y otro factor asociado a la malignidad implica la detección de la sobreexpresión de la proteína o del ARNm de 158P1D7 en una muestra de tejido, la detección de la sobreexpresión de la proteína o del ARNm BLCA-4 en una muestra de tejido (o la expresión PSCA) y la observación de una coincidencia de la proteína o del ARNm de 158P1D7 y de sobreexpresión de la proteína o del ARNm BLCA-4 (o expresión SCA) (Amara y col., 2001, Cancer Res 61:4660-4665; Konety y col., Clin Cancer Res, 2000, 6(7): 2618-2625). Se puede examinar la expresión del ARNm de 158P1D7 y de BLCA-4 en tejido de vejiga, donde la coincidencia de la sobreexpresión de ARNm de 158P1D7 y BLCA-4 en la muestra indica la existencia de cáncer de vejiga, la predisposición al cáncer de vejiga o la aparición o estado de un tumor en la vejiga.

Procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de la proteína o del ARNm de 158P1D7, y las tecnologías estándar de detección y cuantificación de la proteína y del ácido nucleico son bien conocidas en la técnica. Los procedimientos estándar para la detección y cuantificación del ARNm de 158P1D7 incluyen la hibridación in situ utilizando ribosondas de 158P1D7 marcadas, Northern blot y técnicas asociadas, por medio de sondas de

polinucleótidos de 158P1D7, análisis RT-PCR con cebadores específicos de 158P1D7, y demás procedimientos de detección del tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. Se puede utilizar RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 158P1D7. Se puede utilizar con este propósito cualquier ebador capaz de amplificar 158P1D7, incluyendo, pero no limitados a, los distintos conjuntos de cebadores específicamente descritos aquí. Se pueden utilizar en un ensayo inmunohistoquímico de tejido biopsiado, anticuerpos monoclonales o policlonales específicamente reactivos con la proteína 158P1D7 de tipo salvaje.

IX.) Identificaci6n de las Moleculas que Interactuan con 15BP1D7

Las secuencias de ácido nucleico y de proteína 158P1D7 aquí descritas permiten a un experto identificar las proteínas, pequeñas moléculas y demás agentes que interactúan con 158P1D7, así como las vías de acceso activadas por 158P1D7, a través de cualquiera de diversos protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno de los denominados sistemas "trampa" de interacción (también denominados “ensayos doble híbrido”). En estos sistemas, las moléculas interactúan y reconstituyen un factor de transcripción que dirige la expresión de un gen reportero, donde se somete a ensayo la expresión de dicho gen reportero. Otros sistemas identifican las interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariótico, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.955.280, concedida el 21 de septiembre de 1999, 5.925.523, concedida el 20 de julio de 1999, 5.846.722, concedida el 8 de diciembre de 1998, y 6.004.746, concedida el 21 de diciembre de 1999. Se dispone también en la técnica de algoritmos para predecir la función proteínica basados en el genoma (véase por ejemplo Marcotte y col., Nature 402:4 November 1999, 83-86).

Como alternativa, se pueden examinar las librerías de péptidos para identificar qué moléculas interactúan con las secuencias de proteínas 158P1D7. En estos procedimientos, los péptidos que se unen a 158P1D7 se identifican mediante el examen de las librerías que codifican una colección al azar o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las librerías se expresan como proteínas de fusión de las proteínas de recubrimiento con bacteriófagos, luego las partículas de bacteriófagos se examinan contra la proteína 158P1D7.

En consecuencia, los péptidos que tienen una gran variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos, de pronóstico o diagnóstico, son, por tanto, identificados sin ninguna información previa sobre la estructura de la molécula receptora o del ligando esperado. Se pueden emplear las librerías de péptidos y se describen procedimientos de exploración habituales para identificar las moléculas que interactúan con las secuencias de la proteína 158P1D7 por ejemplo en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.723.286, concedida el 3 de marzo de 1998, y 5.733.731, concedida el 31 de marzo de 1998.

Como alternativa, se utilizan líneas celulares que expresan 158P1D7 para identificar las interacciones proteínaproteína mediadas por 158P1D7. Estas interacciones pueden examinarse por técnicas de inmunoprecipitación (véase por ejemplo Hamilton BJ y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). La proteína 158P1D7 puede ser inmunoprecipitada desde las líneas celulares que expresan 158P1D7 utilizando anticuerpos anti158P1D7. Alternativamente, los anticuerpos contra His-tag pueden utilizarse en una línea celular concebida para expresar las fusiones de 158P1D7 y un His-tag (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede examinarse para buscar la asociación de proteínas por medio de procedimientos como Western blotting, marcado con 35S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteínas, electroforesis bidimensional en gel y tinción de plata.

Las pequeñas moléculas y ligandos que interactúan con 158P1D7 pueden identificarse a través de las realizaciones asociadas a estos ensayos de exploración. Por ejemplo, pueden identificarse pequeñas moléculas que interfieren con la función proteína, incluidas aquellas que interfieren con la capacidad de 158P1D7 para mediar la fosforilación y la desfoforilación, la interacción con las moléculas de ADN o ARN, como indicación de regulación de los ciclos celulares, señalización del segundo mensajero o tumorigénesis. De forma similar, las pequeñas moléculas que modulan el canal iónico asociado a 158P1D7, la bomba proteica o las funciones de comunicación celular 158P1D7 son identificadas y utilizadas para tratar a aquellos pacientes que tienen un cáncer que expresa 158P1D7 (véase por ejemplo Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2nd Ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992). Además, los ligandos que regulan la función de 158P1D7 pueden identificarse basándose en su capacidad para unirse a 158P1D7 y activar un constructo reportero. Se exponen procedimientos típicos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.928.868, concedida el 27 de julio de 1999, e incluyen procedimientos para formar ligandos híbridos en los cuales al menos un ligando es una pequeña molécula. En una realización ilustrativa, se utilizan células concebidas para expresar una proteína de fusión de 158P1D7 y una proteína de unión a ADN para coexpresar una proteína de fusión de un ligando híbrido/pequeña molécula y una proteína activadora transcripcional de la librería de ADNc. Las células contienen además un gen reportero, cuya expresión está condicionada por la proximidad entre sí de las primera y segunda proteínas de fusión, un evento que ocurre solamente si el ligando híbrido se une a los sitios diana de ambas proteínas híbridas. Se seleccionan estas células que expresan el gen reportero y se identifica la pequeña molécula desconocida o el ligando desconocido. Este procedimiento proporciona un medio para identificar los moduladores que activan o inhiben la 158P1D7.

Un procedimiento de exploración para una molécula que interactúa con una secuencia de aminoácidos de 158P1D7 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, que comprende los pasos de poner en contacto una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de 158P1D7, permitir que la población de moléculas y la secuencia de

aminoácidos de 158P1D7 interactúen en condiciones que facilitan una interacción, determinar la presencia de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 158P1D7 y luego separar las moléculas que no interactúan con la secuencia de aminoácidos de 158P1D7 de las moléculas que sí lo hacen. El procedimiento comprende además la purificación, caracterización e identificación de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 158P1D7. La molécula identificada puede utilizarse para modular una función realizada por 158P1D7. La secuencia de aminoácidos de 158P1D7 se pone en contacto con una librería de péptidos.

X.) Procedimientos Y Composiciones Terapeuticos

La identificación de 158P1D7 como proteína que se expresa normalmente en un conjunto restringido de tejidos, pero que se expresa también en el cáncer de vejiga y otros cánceres, abre un número de posibilidades terapéuticas al tratamiento de estos cánceres. Tal como se contempla aquí, la 158P1D7 funciona como un factor de transcripción implicado en la activación de los genes promotores de tumores o de los genes represores que bloquean la tumorigénesis.

En consecuencia, los estudios terapéuticos que inhiben la actividad de la proteína 158P1D7 son útiles para aquellos pacientes que padecen un cáncer que expresa la 158P1D7. Estos desarrollos terapéuticos forman dos clases. Una clase comprende varios procedimientos para inhibir la unión o asociación de la proteína 158P1D7 con su asociado de unión o con otras proteínas. La otra clase comprende diversos procedimientos para inhibir la transcripción del gen de 158P1D7 o la traducción del ARNm de 158P1D7.

X.A.) Vacu nas Anticancer

La invención proporciona vacunas contra el cáncer que comprenden un ácido nucleico asociado a 158P1D7. A la vista de la expresión de 158P1D7, las vacunas contra el cáncer impiden y/o tratan los cánceres que expresan la 158P1D7 con efectos mínimos o nulos sobre los tejidos no afectados. La utilización de un antígeno del tumor en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales y/o mediadas por células, como la terapia contra el cáncer, es bien conocida en la técnica (véase por ejemplo Hodge y col., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong y col., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117).

Estos procedimientos pueden ponerse fácilmente en práctica empleando una proteína asociada a 158P1D o una molécula de ácido nucleico que codifica 158P1D7 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de 158P1D7 (que comprende típicamente un número de anticuerpos o epítopes de células T). Los expertos en este campo conocen variedad de sistemas de vacunas para el suministro de epítopes inmunorreactivos (véase por ejemplo Heryln y col., Ann Med 1999 Feb 31(1): 66-78; Maruyama y col., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3): 123-32). Brevemente, estos procedimientos para generar una respuesta inmune (por ejemplo, humoral y/o mediada por células) en un mamífero, comprenden los pasos de: exponer el sistema inmune del mamífero a un epítope inmunorreactivo (por ejemplo un epítope presente en la proteína 158P1D7 mostrada en la SEQ ID NO.: 657 o un análogo u homólogo de la misma) para que el mamífero genere una respuesta inmune que es específica de este epítope (por ejemplo, genera anticuerpos que reconocen específicamente tal epítope).

La proteína 158P1D7 completa puede ser combinada y suministrada por varios medios. Estas composiciones de vacunas pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo Vitiello, A. y col., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones peptídicas encapsuladas en microesferas de poli(DL-láctido-co-glicólido) (“PLG”) (véase por ejemplo Eldridge y col., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991; Alonso y col., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones y col., Vaccine 13:675-681, 1995), composiciones peptídicas contenidas en complejos inmunoestimuladores (ISCOMS) (véase por ejemplo, Takahashi y col., Nature 344:873-875, 1990; Hu y col., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas de múltiples péptidos de antígeno (MAPs) (véase por ejemplo, Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para su utilización en sistemas balísticos de suministro, péptidos típicamente cristalizados, vectores víricos de suministro (Perkus, M.E. y col., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. y col., Nature 320:535, 1986; Hu, S.L. y col., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.P. y col., AIDS Biol Technology 4:790, 1986; Top, F.H. y col., j. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P.K. y col., Virology 175:535, 1990), partículas de origen vírico o sintético (por ejemplo Kofler, N. y col., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J.H. y col., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L.D., Jr. y col., Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H.S., Vogel, F.R., and Chedid, L.A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R.K. y col., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. y col., J. Immunol. 148.1585, 1992, Rock, K.L., Immunol. Today 17:131, 1996) o ADNc desnudo o de partículas absorbidas (Ulmer, J.B. y col., Science 259.1745, 1993; Robinson, H.L., Hunt, L.A. and Webster, R.G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J.W. y col., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p. 423, 1996; Cease, K.B., and Berzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 and Eldridge, J.H. y col., Sem. Hematol. 30:16, 1993). Se pueden utilizar también las tecnologías de suministro enfocado a toxinas, también conocidas como dianas mediada por receptores, tales como las de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachussetts).

En los pacientes con cáncer asociado a 158P1D7, las composiciones de vacunas de la invención pueden utilizarse también conjuntamente con otros tratamientos empleados contra el cáncer, por ejemplo cirugía, quimioterapia, terapias con medicamentos, terapias con radiaciones, etc., incluyendo su utilización en combinación con adyuvantes inmunes como IL-2, IL-12, GM-CSF, y similares.

Vacunas Celulares:

Los epítopes de CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar los péptidos dentro de la proteína 158P1D7 que se unen a los alelos correspondientes de HLA (véase por ejemplo la Tabla IV; EpimerTM y EpimatrixTM, Brown University (URL www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)) y BIMAS (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en la URL syf-peithi.bmi-heidelberg.com/). El inmunógeno de 158P1D7 puede contener una o más secuencias de aminoácidos identificadas por técnicas bien conocidas en este campo, tales como las secuencias mostradas en las Tablas V-XVIII o los péptidos de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo de HLA de Clase I (por ejemplo la Tabla IV (A), Tabla IV (D) o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo de HLA de clase II (por ejemplo Tablas IV (B) o IV (C)). Tal como se valora en la técnica, la ranura de unión de HLA de Clase I termina esencialmente cerrada para que sólo los péptidos de un rango determinado de tamaño puedan encajar en la ranura y unirse, generalmente los epítopes de HLA de Clase I tienen una longitud de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos. Por contraste, la ranura de unión de HLA de Clase II termina esencialmente abierta; por tanto, un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede ser unido por una molécula de HLA de Clase II. Debido a las diferencias entre las ranuras de unión de HLA de Clase I y de Clase II, los motivos de HLA de Clase I son de longitud específica, es decir que la posición dos de un motivo de Clase I es el segundo aminoácido en la dirección amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de los aminoácidos en un motivo de Clase II son solamente de una con respecto a la otra, no del péptido total, es decir que se pueden fijar aminoácidos adicionales a los terminales amino y/o carboxilo de una Secuencia portadora de motivos. Los epítopes de HLA de clase II son a menudo de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos de largo, o más largos que de 25 aminoácidos.

Vacunas Basadas en Anticuerpos

En la técnica son conocidos diversos procedimientos para generar una respuesta inmune en un mamífero (por ejemplo, como primer paso en la generación de hibridomas). Los procedimientos para generar una respuesta inmune en un mamífero comprenden la exposición del sistema inmune del mamífero a un epítope inmunogénico sobre una proteína (por ejemplo la proteína 158P1D7) para que se genere una respuesta inmune. Una realización típica consiste en un procedimiento para generar una respuesta inmune a la 158P1D7 en un huésped poniendo en contacto el huésped con una cantidad suficiente de al menos una célula de 158P1D7 o de un epítope de célula T citotóxica o análogo de la misma; y al menos un intervalo de tiempo tras el cual se vuelve a poner en contacto el huésped con la célula de 158P1D7 o con el epítope de célula T citotóxica o análogo de la misma. Un procedimiento para generar una respuesta inmune contra una proteína asociada a 158P1D7 o contra un péptido multiepitópico artificial puede comprender la administración del inmunógeno de 158P1D7 (por ejemplo la proteína 158P1D7 o un fragmento peptídico de la misma, una proteína de fusión de 158P1D7 o análogo, etc.) en una preparación de vacuna a un mamífero humano u otro mamífero. Típicamente, estas preparaciones de vacunas contienen además un adyuvante adecuado (véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 6.146.635) o un epítope auxiliar universal, tal como un péptido PADRETM (Epimmune Inc., San Diego, CA; véase por ejemplo Alexander y col., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2):79-92). Un procedimiento alternativo comprende generar una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno de 158P1D7 mediante: la administración in vivo en el músculo o la piel del cuerpo del individuo de una molécula de ADN que comprende una Secuencia de ADN que codifica un inmunógeno de 158P1D7, la secuencia de ADN operativamente unida a las Secuencias reguladoras que controlan la expresión de la secuencia de ADN; donde la molécula de ADN es recogida por las células; la secuencia de ADN se expresa en las células y se genera una respuesta inmune contra el inmunógeno (véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.962.428). Opcionalmente, se administra también un facilitador genético de vacuna tal como lípidos aniónicos, saponinas, lectinas, compuestos estrogénicos, hidroxialquilos inferiores, sulfóxido de dimetilo y urea.

Vacunas de Ácido Nucleico:

Las composiciones de vacunas de la invención incluyen modalidades mediadas por los ácidos nucleicos. Al paciente puede administrarse ADN o ARN que codifica la(s) proteína(s) aquí descritas. Pueden emplearse procedimientos de inmunización genética para generar respuestas inmunes humorales y celulares profilácticas o terapéuticas dirigidas contra las células cancerosas que expresan la 158P1D7. Los constructos que comprenden el ADN que codifica una proteína/inmunógeno asociado a 158P1D7 y las secuencias reguladoras adecuadas pueden inyectarse directamente en el músculo o la piel de un individuo, de modo que las células del músculo o piel recojan el constructo y expresen la proteína/inmunógeno codificado de 158P1D7. Como alternativa, una vacuna comprende una proteína asociada a 158P1D7. La expresión del inmunógeno de la proteína asociada a 158P1D7 resulta en la generación de la inmunidad celular y humoral profiláctica o terapéutica contra las células que llevan la proteína 158P1D7. Se pueden utilizar varias técnicas de inmunización genética profiláctica y terapéutica conocidas (para su revisión, véase la información y referencias publicadas en la dirección de internet www.genweb.com). El suministro basado en ácido nucleico viene descrito, por ejemplo, en Wolff y col., Science 247:1465 (1990), así como en las Patentes de Estados Unidos Nºs 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524, 5.679.647 y en WO 98/04720. Ejemplos de tecnologías de suministro basado en ADN incluyen el “ADN desnudo”, suministro facilitado (bupivicaína, polímeros, mediado por péptidos), complejos de lípidos catiónicos y suministro mediado por partículas (“pistola de genes”) o mediado por presión (véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.922.687).

Con el propósito de una inmunización terapéutica o profiláctica, las proteínas de la invención pueden expresarse a través de vectores virales o bacterianos. Varios sistemas de suministro de genes virales que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, gripe, virus de la polio, adenovirus, lentivirus y virus de sindbis (véase por ejemplo Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang y col., J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)). Se pueden emplear también sistemas de suministro no viral mediante la introducción de ADN desnudo, que codifica una proteína asociada a 158P1D7, en el paciente (por ejemplo, intramuscular o intradérmicamente), para inducir una respuesta antitumoral.

Se utiliza el virus vaccinia, por ejemplo, como vector para expresar las Secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. A su introducción en un huésped, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico de la proteína y provoca así una respuesta inmune del huésped. Vectores de vaccinia y procedimientos útiles en los protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.722.848. Otro vector es el BCG (bacilo de Calmette-Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover y col., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores que sirven para la administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo vectores de virus adeno-asociado y adenovirus, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina de ántrax destoxificada y similares, se evidenciarán a los especialistas en la materia a partir de la presente descripción.

Así, los sistemas de suministro de genes se utilizan para suministrar una molécula de ácido nucleico asociada a 158P1D7. En una realización, se emplea ADNc humano de 158P1D7 de longitud completa. En otra realización, se emplean moléculas de ácido nucleico de 158P1D7 que codifican el linfocito T citotóxico (CTL) específico y/o epítopes de anticuerpos.

Vacunas Ex Vivo

Se pueden emplear también varias estrategias ex vivo para generar una respuesta inmune. Una posibilidad implica la utilización de células que presenten el antígeno (APC), tal como células dendríticas (DC), para presentar el antígeno de 158P1D7 al sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas expresan las moléculas de MHC de clase I y II, el coestimulador de B7 e IL-12 y, por tanto, son células altamente especializadas que presentan el antígeno. En el cáncer de vejiga, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno MAGE-3 en ensayos clínicos de Fase I para estimular los sistemas inmunes de pacientes con cáncer de vejiga (Nishiyama y col., 2001, Clin Cancer Res, 7(1)-23-31). Así, se pueden utilizar las células dendríticas para presentar los péptidos de 158P1D7 a las células T en el contexto de las moléculas de MHC de clase I o II. Las células dendríticas autólogas están pulsadas con los péptidos de 158P1D7 capaces de unirse a las moléculas de MHC de clase I y/o clase II. Las células dendríticas están pulsadas con la proteína 158P1D7 completa. Una alternativa implica la concepción de la sobreexpresión del gen de 158P1D7 en las células dendríticas mediante la utilización de varios vectores de implementación conocidos en la técnica tal como adenovirus (Arthur y col., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson y col., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus adenoasociado, transfección de ADN (Ribas y col., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869), o transfección de ARN derivado del tumor (Ashley y col., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182). También pueden concebirse células que expresan la 158P1D7 para expresar moduladores inmunes, tales como GM-CSF, y utilizarse como agentes inmunizadores.

X.B.) 15BP1D7 como Diana para la Terapia Basada en Anticuerpos

La 158P1D7 es una diana atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Ya se conocen en este campo diversas estrategias anticuerpos que se dirigen a moléculas tanto extracelulares como intracelulares (véase por ejemplo la muerte mediada por ADCC y su complemento, así como la utilización de intracuerpos). Como la 158P1D7 es expresada por las células cancerosas de varios linajes en relación con las células sanas correspondientes, se prepara la administración sistémica de las composiciones inmunorreactivas a 158P1D7 que muestran una sensibilidad excelente sin efectos tóxicos, no específicos y/o no diana provocados por la unión de la composición inmunorreactiva a órganos y tejidos no diana. Los anticuerpos específicamente reactivos con los dominios de 158P1D7 sirven para tratar sistémicamente los cánceres que expresan la 158P1D7, bien sea como conjugados con una toxina o agente terapéutico, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función celular.

Los anticuerpos de 158P1D7 pueden introducirse en un paciente para que el anticuerpo se una a 158P1D7 y modular una función, tal como una interacción con un asociado de unión, y consecuentemente medien en la destrucción de las células tumorales y/o inhiban el crecimiento de las células tumorales. Los mecanismos por los cuales estos anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir la citolísis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, modulación de la función fisiológica de 158P1D7, inhibición de las vías de acceso de transducción de señales o de la unión del ligando, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral y/o apoptosis.

Los especialistas en la materia entenderán que pueden utilizarse los anticuerpos para dirigirse y unir específicamente moléculas inmunogénicas tales como la región inmunogénica de la secuencia de 158P1D7 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Además, los expertos entenderán que es de rutina conjugar los anticuerpos a los agentes citotóxicos (véase por ejemplo Slevers y col., Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio de 1999)). Cuando los

agentes citotóxicos y/o terapéuticos son suministrados directamente a las células, tal como mediante su conjugación con los anticuerpos específicos de una molécula expresada por esta célula (por ejemplo 158P1D7), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (es decir la citotoxicidad) en estas células.

En la técnica se conocen múltiples composiciones y procedimientos para utilizar conjugados de agente citotóxicoanticuerpo para matar células. En el contexto de los cánceres, los procedimientos típicos implican la administración a un animal que tiene un tumor de una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente terapéutico y/o citotóxico determinado ligado a un agente diana (por ejemplo un anticuerpo anti-158P1D7) que se une a un marcador (por ejemplo 158P1D7) expresado, accesible a la unión o localizado en las superficies celulares. Una realización típica consiste en un procedimiento para suministrar un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa 158P1D7, que comprende la conjugación del agente citotóxico a un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un epítope de 158P1D7 y la exposición de la célula al conjugado agente-anticuerpo. Otra realización ilustrativa consiste en un procedimiento para tratar a un individuo que se sospecha padece cáncer con metástasis, que comprende un paso de administrar parenteralmente a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico y/o terapéutico.

La inmunoterapia del cáncer utilizando anticuerpos anti-158P1D7 puede realizarse de acuerdo con varios estudios que han sido empleados con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo, pero no limitados a, cáncer de colon (Arlen y col., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki y col., 1997, Blood 90:31793186, Tsunenari y col., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk y col., 1992, Cancer Res. 52:27712776), linfoma de células B (Funakoshi y col., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong y col., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorrectal (Moun y col., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders y col., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) y cáncer de mama (Shepard y col., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117127). Algunos desarrollos terapéuticos implican la conjugación del anticuerpo desnudo a una toxina, tal como la conjugación de Y91 o I131 a los anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. o BexxarTM, Coulter Pharmaceuticals), mientras otros implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como HerceptinTM (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para tratar el cáncer de vejiga, por ejemplo, se pueden administrar los anticuerpos de 158P1D7 junto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal.

Aunque la terapia con anticuerpos de 158P1D7 es adecuada para todas las etapas del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente adecuada en cánceres avanzados o metastáticos. El tratamiento con las terapias anticuerpos de la invención está indicado para pacientes que han recibido una o más series de quimioterapia. Como alternativa, la terapia con anticuerpos de la invención se combina con un régimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico alguno. Además, la terapia con anticuerpos puede permitir la utilización de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

Se puede evaluar a los pacientes con cáncer en cuanto a la presencia y al nivel de expresión de 158P1D7, preferentemente por valoración inmunohistoquímica de tejido tumoral, formación de imágenes cuantitativas de 158P1D7 u otras técnicas que indican fiablemente la presencia y grado de expresión de 158P1D7. Para este propósito, es preferente el análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o especímenes quirúrgicos. Los procedimientos para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos tumorales son bien conocidos en la técnica.

Entre los anticuerpos monoclonales anti-158P1D7 que tratan el cáncer de vejiga u otros cánceres se incluyen aquellos que inician una potente respuesta inmune contra el tumor o aquellos que directamente son citotóxicos. A este respecto, los anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-158P1D7 pueden provocar la lisis celular tumoral por medio de mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o mediada por el complemento, ambos requieren una parte Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para su interacción con los sitios receptores Fc de las células efectoras en las proteínas del complemento. Además, los mAbs anti-158P1D7 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento del tumor sirven para tratar cánceres que expresan la 158P1D7. Los mecanismos por los cuales los mAbs directamente citotóxicos actúan incluyen: la inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral y la inducción de apoptosis. El(los) mecanismo(s) por los cuales un mAb anti-158P1D7 particular ejerce un efecto antitumoral se evalúa mediante cualquiera de los ensayos in vitro que evalúan la muerte celular, tal como ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por el complemento y otros, tal como es bien conocido en la técnica.

En algunos pacientes, el uso de anticuerpos murino o de otros anticuerpos monoclonales no humanos, o mAbs quiméricos humanos/de ratón puede inducir respuestas inmunes de moderadas a fuertes contra el anticuerpo no humano. Esto puede resultar en la supresión del anticuerpo de la circulación y a una eficacia reducida. En los casos más graves, una respuesta inmune como ésta puede conducir a la formación extensa de complejos inmunes que, potencialmente, pueden provocar un fallo renal.

Las formulaciones del anticuerpo anti-158P1D7 se administran a través de cualquier vía capaz de suministrar los anticuerpos a una célula tumoral. Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, las intravenosas, intraperitoneales, intramusculares, intratumorales, intradérmicas y similares. Generalmente el tratamiento implica la administración repetida de la preparación de anticuerpos anti-158P1D7 a través de una vía aceptable de administración, tal como inyección intravenosa (IV), típicamente a una dosis en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal. En general, dosis en el rango de 10-500 mg de mAb por semana son eficaces y bien toleradas.

En base a una experiencia clínica con Herceptina en el tratamiento del cáncer de mama metastático, una dosis inicial cargada de aproximadamente 4 mg por kg de peso corporal del paciente IV, seguida de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-158P1D7 representa un régimen de dosis aceptable. Preferentemente, la dosis inicial cargada se administra vía infusión de 90 minutos o más. La dosis periódica de mantenimiento se administra como infusión de 30 minutos o más, siempre que la dosis inicial haya sido bien tolerada. Tal como valorarán los especialistas en la materia, en el régimen ideal de dosis en un caso particular pueden influir varios factores.

Opcionalmente, se tendría que evaluar a los pacientes en cuanto a los niveles de 158P1D7 en una muestra determinada (por ejemplo, los niveles de antígenos circulantes de 158P1D7 y/o las células de expresión de 158P1D7) con el fin de facilitar la determinación del régimen de dosificación más eficaz, etc. Estas evaluaciones se utilizan también con propósitos de control durante la terapia y sirven para determinar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo citología de orina y/o niveles inmunoCyt en la terapia del cáncer de vejiga o, por analogía, niveles de PSA en el suero en la terapia del cáncer de próstata).

Los anticuerpos anti-158P1D7 antiidiotípicos pueden utilizarse también en la terapia anticáncer como vacuna para inducir una respuesta inmune en las células que expresan una proteína asociada a 158P1D7. En particular, la generación de anticuerpos antiidiotípicos es bien conocida la técnica; esta metodología puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-158P1D7 antiidiotípicos que imitan un epítope en una proteína asociada a 158P1D7 (véase, por ejemplo, Wagner y col., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon y col., 1995, J. Clin. Invest. 96: 334-342; Herlyn y col., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76). Un anticuerpo antiidiotípico como éste puede utilizarse en estrategias de vacunas contra el cáncer.

X.C.) 15BP1D7 como una Diana para las Respuestas Celulares Inmunes

Un péptido puede estar presente individualmente en una vacuna. Como alternativa, el péptido puede existir como homopolímero que comprende múltiples copias del mismo péptido o como heteropolímero de varios péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de una mayor reacción inmunológica y, cuando se utilizan distintos epítopes peptídicos para elaborar el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTLs que reaccionan con distintos determinantes antigénicos del organismo patogénico o del péptido asociado al tumor dirigido a una respuesta inmune. La composición puede ser una región natural de un antígeno o puede prepararse, por ejemplo, de forma recombinante o mediante síntesis química.

Los vehículos que pueden emplearse con las vacunas de la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como seroalbúmina humana, toxoide de tétanos, poliaminoácidos como poli-L-lisina, ácido poli-L-glutámico, influenza, proteína nuclear del virus de hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir aceptable) tal como agua, o una solución salina, preferentemente una solución salina tamponada con fosfato. Las vacunas incluyen también típicamente un adyuvante. Adyuvantes como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Además, tal como se revela aquí, las respuestas de CTL pueden ser iniciadas por los péptidos de conjugación de la invención a lípidos como tripalmitoil-Sglicerilcisteinliseril-serina (P3CSS). Además, se ha descubierto que adyuvantes como los oligonucleótidos que contienen una citosina-fosforotiolada-guanina (CpG) sintética aumentan las respuestas de CTL de 10 a 100 veces (véase por ejemplo Davila y Celis J. Immunol. 165:539-547 (2000)).

Cuando se inmuniza con una composición peptídica de acuerdo con la invención, vía inyección, aerosol, oral, transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otras vías adecuadas, el sistema inmune del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTLs y/o HTLs específicos del antígeno deseado. En consecuencia, el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune al desarrollo posterior de células que expresen o sobreexpresen el antígeno de 158P1D7, o al menos saca algún provecho terapéutico cuando el antígeno estaba asociado al tumor.

Una vacuna de la invención puede incluir también células que presentan el antígeno (APC), tal como células dendríticas (DC), como un vehículo para presentar los péptidos de la invención. Las composiciones de vacunas pueden ser creadas in vitro, después de la movilización y cosecha de células dendríticas, con lo cual la carga de células dendríticas tiene lugar in vitro. Por ejemplo, las células dendríticas son transfectadas, por ejemplo con un minigén de acuerdo con la invención, o son pulsadas con los péptidos. La célula dendrítica puede administrarse luego a un paciente para provocar respuestas inmunes in vivo. Las composiciones de vacunas basadas en ADN o en péptidos, pueden administrarse también in vivo en combinación con la movilización de células dendríticas, con lo cual la carga de células dendríticas tiene lugar in vivo.

Preferentemente, se utilizan los siguientes principios cuando se selecciona una serie de epítopes para su inclusión en una composición poliepitópica para su utilización en una vacuna, o para seleccionar epítopes discretos a ser incluidos en una vacuna y/o a ser codificados por los ácidos nucleicos, tal como un minigén. Se prefiere que cada uno de los siguientes principios esté equilibrado para poder hacer la selección. Los múltiples epítopes que han de ser incluidos en una composición de vacuna determinada pueden ser, pero no necesariamente, contiguos en secuencia en el antígeno nativo del que proceden los epítopes.

1.) Se seleccionan epítopes que, tras su administración, imitan las respuestas inmunes que se ha observado tienen correlación con la supresión del tumor. Para la Clase I de HLA, esto incluye 3-4 epítopes que proceden al menos de un antígeno asociado al tumor (TAA). Para la Clase II de HLA se emplea un fundamento similar; de nuevo se seleccionan 3-4 epítopes procedentes de al menos un TAA (véase por ejemplo Rosenberg y col., Science 278: 1447-1450). Los epítopes procedentes de un TAA pueden utilizarse en combinación con aquellos procedentes de uno o más TAAs adicionales para producir una vacuna que se dirige a tumores con perfiles de expresión variables de TAAs expresados frecuentemente.

2.) Se seleccionan epítopes que tienen la afinidad de unión requerida establecida para correlacionarse con la inmunogenicidad: para la Clase I de HLA un IC50 de 500 nM o inferior, a menudo 200 nM o menos; y para la Clase II un IC50 de 1.000 nM o inferior.

3.) Se seleccionan suficientes péptidos portadores de supermotivos, o una serie suficiente de péptidos portadores de motivos específicos de alelos, para porporcionar una amplia cobertura de población. Por ejemplo, es preferible tener al menos un 80% de cobertura de población. Se puede emplear un análisis de Monte Carlo, evaluación estadística conocida la técnica, para valorar la amplitud o la redundancia de la cobertura de población.

4.) Cuando se seleccionan epítopes procedentes de antígenos asociados al cáncer, a menudo es útil seleccionar análogos debido a que el paciente puede haber desarrollado tolerancia al epítope nativo.

5.) Son particularmente relevantes los epítopes denominados “epítopes anidados”. Los epítopes anidados se producen cuando al menos dos epítopes se superponen en una secuencia peptídica determinada. Una secuencia de péptidos anidados puede comprender la célula B, epítopes de clase I de HLA y/o de clase II de HLA. Cuando se proporcionan epítopes anidados, un objetivo general consiste en proporcionar el mayor número posible de epítopes por secuencia. Así, un aspecto consiste en evitar proporcionar un péptido que sea algo más largo que el terminal amino del epítope amino terminal y el terminal carboxilo del epítope carboxilo terminal en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multiepitópica, tal como una secuencia que comprende epítopes anidados, normalmente es importante examinar la secuencia con el fin de asegurarse de que no tiene propiedades patológicas u otras propiedades biológicas deletéreas.

6.) Cuando se crea una proteína poliepitópica o cuando se crea un minigén, un objetivo consiste en generar el péptido más pequeño posible que abarque los epítopes de interés. Este principio es similar, si no igual, al empleado cuando se selecciona un péptido que comprende epítopes anidados. Sin embargo, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de minimización del tamaño es comparable a la necesidad de integrar alguna Secuencia espaciadora entre los epítopes en la proteína poliepitópica. Se pueden introducir, por ejemplo, residuos espaciadores de aminoácidos para evitar epítopes de unión (un epítope reconocido por el sistema inmune no presente en el antígeno diana y solamente creado por la yuxtaposición artificial de epítopes), o para facilitar la segmentación entre los epítopes y así mejorar la presentación de los epítopes. En general, deben evitarse los epítopes de unión porque el receptor puede generar una respuesta inmune a aquel epítope no nativo. Es de particular interés un epítope de unión que sea un “epítope dominante”. Un epítope dominante puede conducir a una respuesta tan entusiasta que las respuestas inmunes a otros epítopes disminuyan o sean suprimidas.

7.) Cuando están presentes secuencias de variantes múltiples de la misma proteína diana, se pueden seleccionar también epítopes peptídicos potenciales en base a su conservación. Por ejemplo, un criterio para la conservación puede definir que la totalidad de la secuencia de un péptido de unión de HLA de clase I o la totalidad del núcleo 9-mer de un péptido de unión de clase II sea conservada según un porcentaje designado de las secuencias evaluado para un antígeno de proteína específico.

X.C.1. Vacunas de Minigenes

Existen diversas posibilidades que permiten el suministro simultáneo de múltiples epítopes. Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos son particularmente útiles. Los epítopes a incluir en un minigén se seleccionan preferentemente de acuerdo con los principios establecidos en la sección anterior. Un medio preferido para administrar los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención utiliza constructos de minigenes que codifican un péptido que comprende uno o múltiples epítopes de la invención.

La utilización de minigenes con multiepítopes se describe a continuación y en Ishioka y col., J. Immunol. 162: 39153925, 1999; An, L. y Whitton, J.L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S.A. y col., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton,

J.L. y col., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. y col., Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, se puede concebir un plásmido de ADN multiepítope que codifica la 158P1D7 procedente de epítopes portadores de motivos y/o supermotivos, el epítope de célula T auxiliar universal PADRE® (o múltiples epítopes de HTL procedentes de

158P1D7), y una translocación de la secuencia señal en el retículo-endoplásmico. Una vacuna puede comprender también epítopes que proceden de otros TAAs.

Puede confirmarse la inmunogenicidad de un minigén multiepitópico en ratones transgénicos, para evaluar la magnitud de las respuestas de inducción de CTL contra los epítopes ensayados. Además, la inmunogenicidad de los epítopes codificados por ADN in vivo pueden tener correlación con las respuestas in vitro de las líneas específicas de CTL contra las células diana transfectadas con el plásmido de ADN. Así, estos experimentos pueden mostrar que el minigén sirve para: 1.) generar una respuesta de CTL y 2.) que las células reconocidas por los CTL inducidos expresan los epítopes codificados.

Por ejemplo, para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes seleccionados (minigén) para su expresión en células humanas, pueden traducirse inversamente las secuencias de aminoácidos de los epítopes. Se puede utilizar una tabla de codones humanos para guiar la elección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítope pueden adjuntarse directamente, para que cuando se traduzcan, se cree una secuencia continua de polipéptidos. Para optimizar la expresión y/o la inmunogenicidad se pueden incorporar elementos adicionales en el diseño del minigén. Ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden traducirse inversamente e incluirse en la secuencia del minigén incluyen: epítopes de clase I de HLA, epítopes de clase II de HLA, epítopes de anticuerpos, una secuencia señal de ubiquidad y/o una señal diana al retículo endoplásmico. Además, la presentación HLA de los epítopes de CTL y HTL puede mejorarse mediante la inclusión de secuencias flanqueantes naturales o sintéticas (por ejemplo, polialanina) adyacentes a los epítopes de CTL o HTL.

La secuencia de minigenes puede convertirse en ADN ,mediante la unión de los oligonucleótidos que codifican más

o menos las hebras del minigén. Los oligonucleótidos de superposición (longitud de 30-100 bases) pueden ser sintetizados, fosforilados, purificados y anclados bajo condiciones apropiadas por medio de técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos pueden unirse, por ejemplo, con una T4-ADN ligasa. Este minigén sintético, que codifica el polipéptido del epítope, puede clonarse luego en un vector de expresión deseado.

Preferentemente, en el vector se incluyen secuencias reguladoras estándar bien conocidas por los especialistas en la técnica para asegurar la expresión en las células diana. Varios elementos del vector son deseables: un promotor con un sitio de clonación aguas abajo para la inserción del minigén; una señal de poliadenilación para la terminación eficaz de la transcripción; un origen de replicación de E. co/i; y un marcador seleccionable de E. co/i (por ejemplo resistencia a ampicilina o a la canamicina). Se pueden utilizar numerosos promotores con este propósito, por ejemplo el promotor del citomegalovirus humano (hCMV). Véanse por ejemplo las Patentes de Estados Unidos Nºs

5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras adecuadas.

Se pueden desear modificaciones adicionales del vector para optimizar la expresión e inmunogenicidad del minigén. En algunos casos, se necesitan intrones para una expresión eficaz del gen y uno o más intrones naturales o sintéticos podrían incorporarse en la región transcrita del minigén. Se puede tener en cuenta también la inclusión de secuencias de estabilización de ARNm y de secuencias para la replicación en las células de mamíferos, para incrementar la expresión del minigén.

Una vez seleccionado un vector de expresión, el minigén se clona en la región de poliunión aguas abajo del promotor. Este plásmido se transforma en una cepa apropiada de E. co/i y se prepara el ADN por técnicas estándar. La orientación y la secuencia de ADN del minigén, así como todos los demás elementos incluidos en el vector, se confirman mediante un mapeo de restricción y un análisis de la secuencia de ADN. Las células bacterianas que contienen el plásmido correcto pueden almacenarse como banco de células maestras y banco de células de trabajo.

Además, parece que las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) desempeñan un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ADN. Estas Secuencias pueden incluirse en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigén, si se desea, para mejorar la inmunogenicidad.

En algunas realizaciones, se puede emplear un vector de expresión bicistrónico que permite la producción tanto de los epítopes codificados por el minigén como de una segunda proteína (incluida para mejorar o disminuir la inmonogenicidad). Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían mejorar ventajosamente la respuesta inmune, cuando se coexpresan, incluyen citoquinas (por ejemplo IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas que inducen las citoquinas (por ejemplo LeIF), moléculas coestimuladoras, o para las respuestas de HTL, proteínas de unión pan-DR (PADRETM, Epimmune, San Diego, CA). Los epítopes auxiliares (HTL) pueden unirse a las señales intracelulares diana y expresarse por separado de los epítopes expresados de CTL; esto permite la dirección de los epítopes de HTL hacia un compartimento celular distinto del de los epítopes de CTL. Si es necesario, esto podría facilitar una entrada más eficaz de los epítopes de HTL en la vía de acceso del HLA de clase II, mejorando así la inducción de HTL. Por contraste a la inducción de HTL o CTL, la disminución específica de la respuesta inmune por coexpresión de moléculas inmunosupresivas (por ejemplo TGF-�) puede resultar beneficioso en algunas enfermedades.

Se pueden producir cantidades terapéuticas de ADN de plásmido, por ejemplo, mediante la fermentación en E. co/i, seguida de purificación. Se utilizan partes alícuotas procedentes del banco de células de trabajo para inocular el medio de crecimiento y se cultivan hasta saturación en matraces agitadores o un biorreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. Se puede purificar el ADN de plásmido por medio de tecnologías de bioseparación

estándar, tales como resinas de intercambio aniónico en fase sólida suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California). Si es necesario, se puede aislar ADN súperenrollado de las formas lineales y circulares abiertas por electroforesis en gel u otros procedimientos.

Se puede preparar ADN de plásmido purificado para su inyección en diversas formulaciones. La más sencilla de éstas es la reconstitución de ADN liofilizado en una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Este acercamiento, conocido como “ADN desnudo”, se está empleando actualmente para la administración intramuscular (IM) en pruebas clínicas. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas con ADN de minigén, puede resultar deseable un procedimiento alternativo para formular ADN de plásmido purificado. Se han descrito diversos procedimientos y se empieza a disponer de nuevas técnicas. Los lípidos catiónicos, glicolípidos y liposomas fusogénicos pueden utilizarse también en la formulación de complejos (véase por ejemplo lo descrito en la WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, Bio Techniques 6(7): 682 (1988); Patente de Estados Unidos Nº 5.279.833; WO 91/06309; y Felgner y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)). Además, los péptidos y compuestos denominados colectivamente compuestos protectores, interactivos, de no condensación (PINC), podrían formarse también en ADN de plásmido purificado, para influir en las variables tales como la estabilidad, dispersión intramuscular o el tráfico de órganos específicos o de tipos celulares.

La sensibilización celular diana puede utilizarse como ensayo funcional para la expresión y presentación de la clase I de HLA de los epítopes de CTL codificados por el minigén. Por ejemplo, el ADN de plásmido se introduce en una línea celular de mamífero que es adecuada como diana para los ensayos estándar de liberación de cromo CTL. El procedimiento de transfección utilizado dependerá de la formulación final. Se puede emplear la electroporación para el ADN “desnudo”, mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa in vitro. Un plásmido que exprese la proteína fluorescente verde (GFP) puede ser cotransfectado para permitir el enriquecimiento de las células transfectadas por medio de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Luego estás células se marcan con cromo-51 (51Cr) y se utilizan como células diana para las líneas CTL específicas del epítope; la citolisis, detectada por liberación de la 51Cr, indica tanto la producción como la presentación de HLA de los epítopes de CTL codificados por el minigén. La expresión de los epítopes de HTL puede evaluarse de forma análoga por medio de ensayos para evaluar la actividad de HTL.

Una segunda posibilidad para las pruebas funcionales de las formulaciones de ADN del minigén es la inmonogenicidad in viv o. Se inmunizan ratones transgénicos que expresan las proteínas de HLA humanas apropiadas con el producto de ADN. La dosis y vía de administración dependen de la formulación (por ejemplo IM para ADN en PBS, intraperitoneal (i.p.) para el ADN complejado con lípidos). Veintiún días después de la inmunización, se cosechan los esplenocitos y se reestimulan durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítope a ensayar. A continuación, en las células efectoras de CTL se realizan ensayos en cuanto a la citolisis de las células diana cargadas de péptidos, marcadas con 51Cr, por medio de técnicas estándar. La lisis de las células diana que fueron sensibilizadas por el HLA cargado de epítopes de péptidos, que se corresponden con los epítopes codificados por el minigén, demuestra la función de la vacuna de ADN para la inducción in vivo de los CTLs. La inmunogenicidad de los epítopes de HTL se confirma en los ratones transgénicos de forma análoga.

Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden administrarse mediante suministro balístico, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.204.253. Mediante esta técnica, se administran partículas que compren únicamente ADN. En otra realización alternativa, el ADN puede adherirse a partículas tales como partículas de oro.

X.C.2. Combinaciones de Peptidos de CTL con Peptidos Auxiliares

Las composiciones de vacunas que comprenden los péptidos CTL de la invención pueden ser modificadas, por ejemplo, analogadas, para proporcionar los atributos deseados, tal como una mayor vida media en suero, una mayor cobertura de la población o una mayor inmunogenecidad.

Por ejemplo, la capacidad de un péptido para inducir la actividad de CTL puede mejorarse ligando el péptido a una secuencia que contiene al menos un epítope que es capaz de inducir una respuesta de células-T auxiliar. Aunque un péptido CTL puede ligarse directamente a un péptido auxiliar T, a menudo los conjugados epítope CTL/epítope HTL son ligados por una molécula espaciadora. El espaciador se compone típicamente de moléculas relativamente pequeñas, neutras, tal como aminoácidos o análogos de aminoácidos, que están sustancialmente descargados en condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan típicamente de entre, por ejemplo, Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o de aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no necesita estar compuesto de los mismos residuos y, por tanto, puede ser un hetero- u homo-oligómero. Cuando está presente, el espaciador tendrá normalmente al menos uno o dos residuos, generalmente de tres a seis residuos y a veces 10 o más residuos. El epítope de péptido CTL puede estar ligado al epítope auxiliar T bien sea directamente o a través de un espaciador en el terminal amino o carboxi del péptido CTL. El terminal amino del péptido inmunogénico o del péptido auxiliar T puede estar acilado.

En algunas realizaciones, el péptido auxiliar T es tal que es reconocido por las células auxiliares T presentes en la mayoría de una población genéticamente diversa. Esto puede realizarse mediante la selección de péptidos que se unen a muchas, a la mayoría o a todas las moléculas de HLA de clase II. Ejemplos de estos aminoácidos que se

unen a muchas moléculas de HLA de clase II incluyen las secuencias procedentes de antígenos, como el toxoide de tétanos en las posiciones 830-843 (QYIKANSKFIGITE; SEQ ID NO: 651), la proteína circumsporozoito de P/asmodium fa /ciparum (CS) en las posiciones 378-398 (DIEKYDAYMEKASSVFNVVNS; SEQ ID NO: 652) y la proteína 18kD de Streptococcus en las posiciones 116-131 (GAVDSILGGVATYGAA; SEQ ID NO: 653). Otros ejemplos incluyen péptidos portadores de un supermotivo DR 1-4-7 o de uno de los motivos DR3.

Alternativamente, es posible preparar péptidos sintéticos capaces de estimular los linfocitos auxiliares T de una forma débilmente restringida por HLA utilizando secuencias de aminoácidos no encontrados en la naturaleza (véase por ejemplo la publicación PCT WO 95/07707). Estos compuestos sintéticos, denominados epítopes de unión a Pan-DR (por ejemplo PADRETM, Epimmune, Inc., San Diego, CA), están diseñados para unirse preferentemente a la mayoría de las moléculas HLA-DR (HLA humano de clase II). Por ejemplo, se ha descubierto que un péptido de epítope de unión a pan-DR que tiene la fórmula: aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 654), donde “X” es ciclohexilalanina, fenilalanina o tirosina y “a” es D-alanina o L-alanina, se une a la mayoría de los alelos HLA-DR y estimula la respuesta de los linfocitos auxiliares T procedentes de la mayoría de los individuos sin tener en cuenta su tipo de HLA. Una alternativa de epítope de unión a pan-DR comprende todos los aminoácidos naturales “L” y puede proporcionarse en forma de ácidos nucleicos que codifican el epítope.

Los epítopes de péptido HTL pueden modificarse también para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden modificarse para incluir los aminoácidos D para aumentar su resistencia a las proteasas y extender así su media vida en suero, o pueden conjugarse a otras moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y similares para incrementar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido auxiliar T puede conjugarse a una o más cadenas de ácido palmítico en los terminales amino o carboxilo.

X.C.3. Combinaciones de Peptidos CTL con Agentes Iniciadores de Celulas T

En algunas realizaciones puede resultar deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente cebador de linfocitos B o linfocitos T. Se han identificado los lípidos como agentes capaces de cebar CTL in vivo. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico pueden fijarse a los grupos amino £ y a de un residuo de lisina y luego ligarse, por ejemplo, a través de uno o más residuos de unión, tales como Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede administrarse entonces directamente en una micela o partícula, incorporado en un liposoma o emulsionado en un adyuvante, por ejemplo el adyuvante incompleto de Freund. En una realización preferente, una composición inmunogénica particularmente eficaz comprende ácido palmítico fijado a los grupos amino £ y a de Lys, que está fijado a través de un enlace, por ejemplo, Ser-Ser, al terminal amino del péptido inmunogénico.

Otro ejemplos de cebadores lipídicos de respuestas CTL, las lipoproteínas de E. co/i tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS), pueden utilizarse para iniciar el CTL específico del virus cuando están fijados de forma covalente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres y col., Nature 342:561, 1989). Los péptidos de la invención pueden ser acoplados a P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido puede administrarse a un individuo para iniciar específicamente una respuesta inmune al antígeno diana. Además, como la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede ser iniciada con los epítopes conjugados por P3CSS, pueden combinarse dos de estas composiciones para provocar más eficazmente respuestas tanto humorales como mediadas por células.

X.C.4. Composiciones de Vacunas que Comprenden DC pulsadas con Peptidos CTL Y 1 o HTL

Una composición de vacuna puede comprende la administración ex vivo de un cóctel de péptidos portadores de epítopes a PBMC o DC aisladas del mismo, procedentes de la sangre de un paciente. Se puede utilizar un producto farmacéutico para facilitar la cosecha de DC, tal como ProgenipoietinTM (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las DC con péptidos y antes de la reinfusión a los pacientes, se lavan las DC para eliminar los péptidos no unidos. En esta realización, una vacuna comprende las DC pulsadas por péptidos que presentan los epítopes de los péptidos pulsados complejados con moléculas HLA en sus superficies.

Las DC pueden ser pulsadas ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan las respuestas CTL a 158P1D7. Opcionalmente, puede incluirse un péptido de célula T auxiliar (HTL), tal como un péptido de HLA de clase II débilmente restringido, natural o artificial, para facilitar la respuesta CTL. Así, se utiliza una vacuna de acuerdo con la invención para tratar un cáncer que expresa o sobreexpresa la 158P1D7.

X.D. Inmuno terapia Adoptiva

También se utilizan los péptidos asociados a 158P1D7 antigénicos para provocar una respuesta CTL y/o HTL ex vivo. Las células de CTL o HTL resultantes pueden emplearse para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas de terapia convencionales o que no responderán a un ácido nucleico o péptido de una vacuna terapéutica de acuerdo con la invención. Las respuestas CTL o HTL ex vivo a un antígeno particular se inducen mediante la incubación, en un cultivo de tejido, de las células precursoras de CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de células que presentan el antígeno (APC), tal como células dendríticas, y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación adecuado (típicamente de 728 días aproximadamente) durante el cual las células precursoras son activadas y ampliadas en células efectoras, las células son infundidas de vuelta al paciente, donde destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de su

célula diana específica (por ejemplo, una célula tumoral). Las células dendríticas transfectadas pueden utilizarse también como células que presentan el antígeno.

X.E. Administraci6n de Vacunas con Fines Terapeuticos o Profilacticos

Las vacunas y las composiciones farmacéuticas de la invención se emplean típicamente para tratar y/o impedir un cáncer que expresa o sobreexpresa la 158P1D7. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones peptídicas y/o los ácidos nucleicos se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta eficaz de las células B, CTL y/o HTL ante el antígeno y para curar, o al menos parcialmente detener o reducir síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para llevar esto a cabo se define como “dosis terapéuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición particular administrada, la forma de administración, la etapa y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el peso y el estado de salud general del paciente y la opinión del médico que las prescribe.

Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos, o el ADN que los codifica, se administran generalmente a un individuo que padece ya un tumor que expresa la 158P1D7. Los péptidos o, el ADN que los codifica, pueden administrarse individualmente o como fusiones de una o más secuencias de péptidos. Los pacientes pueden ser tratados con los péptidos inmunogénicos por separado o junto con otros tratamientos, como la cirugía, según convenga.

Para el uso terapéutico, en general la administración debe comenzar al primer diagnóstico de cáncer asociado a 158P1D7. Seguidamente se administran dosis adicionales hasta que al menos los síntomas se reduzcan sustancialmente y durante un período posterior. La realización de la composición de vacuna (es decir, incluyendo, pero no limitada a, realizaciones tales como cócteles de péptidos, polipéptidos poliepitópicos, minigenes o CTLs específicos de TAA o células dendríticas pulsadas) suministrada al paciente puede variar según la etapa de la enfermedad o el estado de salud del paciente. Por ejemplo, en un paciente con un tumor que expresa la 158P1D7, una vacuna que comprende el CTL específico de 158P1D7 puede resultar más eficaz eliminando células tumorales en el paciente con la enfermedad avanzada que las realizaciones alternativas.

En general es importante proporcionar una cantidad suficiente del epítope de péptido, suministrado por una determinada vía de administración, para estimular eficazmente una respuesta de célula T citotóxica; las composiciones que estimulan las respuestas de células T auxiliares pueden darse de acuerdo con esta realización de la invención.

La dosificación inicial en una inmunización terapéutica en general oscila en un rango de dosificación unitaria donde el valor más bajo es de aproximadamente 1, 5, 50, 500 ó 1.000 Ig y el valor más alto es de aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 ó 50.000 Ig. Los valores de dosificación para un humano oscilan típicamente entre aproximadamente 500 Ig y aproximadamente 50.000 Ig para un paciente de 70 kilos. Pueden administrarse dosificaciones adicionales, de entre aproximadamente 1,0 Ig y aproximadamente 50.000 Ig de péptido según un régimen adicional durante semanas a meses, dependiendo de la respuesta y la condición del paciente, tal como se determina por medición de la actividad específica de CTL y HTL, obtenidos de la sangre del paciente. La administración debería continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que la neoplasia ha sido eliminada o reducida y durante un período posterior. Las dosificaciones, vías de administración y programas de dosis se ajustan conforme a las metodologías conocidas en la técnica.

En algunas realizaciones, los péptidos y las composiciones se emplean en estados de la enfermedad severos, es decir, en situaciones que amenazan la vida o que potencialmente amenazan la vida. En estos casos, debido a cantidades mínimas de sustancias extrañas y de la naturaleza no tóxica relativa de los péptidos de las composiciones preferentes de la invención, es posible y puede resultar deseable para el médico administrar un exceso sustancial de estas composiciones peptídicas en comparación con estas cantidades establecidas de dosificación.

Las composiciones de vacunas de la invención pueden emplearse también puras como agentes profilácticos. Generalmente, la dosificación para una inmunización profiláctica inicial oscila generalmente en un rango de dosificación unitaria donde el valor más bajo es de aproximadamente 1, 5, 50, 500 ó 1.000 Ig y el valor más alto es de aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 ó 50.000 Ig. Los valores de dosificación para un humano oscilan típicamente entre aproximadamente 500 Ig y aproximadamente 50.000 Ig para un paciente de 70 kilos. Esto es seguido de dosificaciones adicionales de entre aproximadamente 1,0 Ig y aproximadamente 50.000 Ig de péptido administrado a intervalos definidos desde aproximadamente cuatro semanas hasta seis meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede evaluarse midiendo la actividad específica de CTL y HTL, obtenidos de una muestra de sangre del paciente.

Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico están destinadas a la administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (por ejemplo como crema o ungüento tópico). Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Así, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que

comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso.

Se puede utilizar una gran variedad de vehículos acuosos, por ejemplo agua, agua tamponada, solución salina al 0,8%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas, o pueden ser esterilizadas por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para su uso tal cual o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración.

Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y de tamponación, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humidificantes, conservantes y similares, por ejemplo acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración de péptidos de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente; esto es, desde menos de aproximadamente el 0,1%, normalmente a aproximadamente el 2% o al menos el 2% hasta tanto como del 20% al 50% o más en peso, y se seleccionará en primer lugar según los volúmenes de fluidos, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado.

Una forma de dosis unitaria humana de la composición peptídica está incluida típicamente en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso, y se administra en un volumen de fluido que es conocido por los especialistas en la materia por ser utilizado para la administración de estas composiciones al ser humano (véase por ejemplo Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985).

La(s) proteína(s) de la invención y/o los ácidos nucleicos que codifican la(s) proteína(s), pueden administrarse también a través de liposomas, que pueden servir también para: 1) dirigir la(s) proteína(s) hacia un tejido particular tal como el tejido linfoide; 2) dirigirla(s) selectivamente hacia las células enfermas o 3) incrementar la vida media de la composición peptídica. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones fosfolipídicas, capas lamerales y similares. En estas preparaciones, el péptido que ha de suministrarse se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se une a un receptor prevalente entre las células linfoides, tales como los anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o a otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. Así, los liposomas cargados o decorados con un péptido de la invención deseado pueden ser dirigidos hacia el sitio de las células linfoides, donde los liposomas suministran entonces las composiciones peptídicas. Los liposomas para su utilización de acuerdo con la invención se forman a partir de lípidos que forman una vesícula estándar, que incluyen generalmente fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente debe tener en cuenta, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en el flujo sanguíneo. Se dispone de diversos procedimientos para preparar liposomas, tal como se describe, por ejemplo, en Szoka y col., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980) y en las Patentes de Estados Unidos Nºs 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Para las células diana del sistema inmune, un ligando que ha de incorporarse en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos de los determinantes celulares superficiales de las células deseadas del sistema inmune. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc., en una dosis que varía según, entre otros, la forma de administración, el péptido que se está suministrando y la etapa de la enfermedad que se está tratando.

Para las composiciones sólidas se pueden utilizar vehículos sólidos no tóxicos convencionales, que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como los vehículos anteriormente relacionados, y generalmente un 10-95% de ingrediente activo, es decir, de uno o más péptidos de la invención, y preferentemente a una concentración del 25%-75%.

Para la administración por aerosol, se suministran preferentemente péptidos inmunogénicos en forma finamente dividida junto con un agente tensioactivo y un propelente. Los porcentajes típicos de péptidos son aproximadamente del 0,01%-20% en peso, preferentemente del 1%-10% aproximadamente. El agente tensioactivo debe ser, por supuesto, no tóxico y preferentemente soluble en el propelente. Representantes de estos agentes son ésteres de ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de aproximadamente 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico, con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Se pueden emplear ésteres mixtos, como glicéridos mixtos o naturales. El agente tensioactivo puede constituir aproximadamente del 0,1%-20% en peso de la composición, preferentemente el 0,25-5% aproximadamente. El resto de la composición es normalmente el propelente. Se puede incluir también un vehículo si se desea, por ejemplo lecitina, para la administración intranasal.

XI.) Realizaciones de Diagn6stico Y Pron6stico de 15BP1D7

Tal como se describe aquí, los polinucleótidos, polipéptidos, células T citotóxicas reactivas (CTL), células T auxiliares reactivas (HTL) y anticuerpos anti-polipéptido de 158P1D7 se utilizan en ensayos terapéuticos, de pronóstico, de diagnóstico bien conocidos, que examinan las condiciones asociadas a un crecimiento celular desregulado tal como el cáncer de vejiga.

La 158P1D7 puede utilizarse de forma análoga o complementaria a la combinación de antígenos asociados a la vejiga, mucinas y CEA, representados en un kit de diagnóstico denominado ImmunoCytTM. El ImmunoCyt es un test comercial que sirve para identificar y controlar la presencia de cáncer de vejiga (véase Fradet y col., 1997, Can J Urol. 4(3): 400-405). Se utilizan también diversos otros marcadores de diagnóstico en contextos similares, incluidos p53 y H-ras (véase por ejemplo Tulchinsky y col., Int J Mol med 1999 Jul 4(1): 99-102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000; 24(1): 1-12). Por tanto, este descubrimiento de los polinucleótidos y polipéptidos de 158P1D7 (así como las sondas de polinucleótidos de 158P1D7 y anticuerpos anti-158P1D7 empleados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permiten a los expertos utilizar estas moléculas en procedimientos que son análogos a los empleados, por ejemplo, en diversos ensayos de diagnóstico dirigidos al examen de condiciones asociadas al cáncer de vejiga.

Las realizaciones típicas de los procedimientos de diagnóstico que utilizan los polinucleótidos, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos de 158P1D7 son análogas a aquellos procedimientos procedentes de ensayos de diagnóstico de reconocida solvencia que emplean, por ejemplo, los polinucleótidos, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos. Por ejemplo, al igual que se utilizan los polinucleótidos PSA como sondas (por ejemplo en el análisis Northern, véase por ejemplo Sharief y col. Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3): 567-74 (1994)) y cebadores (por ejemplo en el análisis PCR, véase por ejemplo Okegawa y col., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNms de PSA en los procedimientos de control de la sobreexpresión de PSA o de las metástasis de los cánceres de próstata, los polinucleótidos de 158P1D7 descritos aquí pueden utilizarse para detectar la sobreexpresión de 158P1D7 o metástasis del cáncer de vejiga u otros cánceres que expresan este gen. Alternativamente, al igual que se utilizan los polipéptidos de PSA para generar anticuerpos específicos de PSA que pueden emplearse luego para observar la presencia y/o el nivel de proteínas de PSA en los procedimientos para controlar la sobreexpresión de la proteína PSA (véase por ejemplo Stephan y col., Urology 55(4): 560-3 (2000)) o las metástasis de células prostáticas (véase por ejemplo Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), los polipéptidos de 158P1D7 descritos aquí pueden utilizarse para generar anticuerpos utilizados en la detección de la sobreexpresión de 158P1D7 o metástasis de células de la vejiga y de otros cánceres que expresan este gen.

Específicamente, debido a que las metástasis implican el movimiento de las células cancerosas desde un órgano de origen (vejiga) hacia una zona diferente del cuerpo (tal como un nódulo linfático), se pueden utilizar ensayos que examinan una muestra biológica en cuanto a la presencia de células que expresan los polinucleótidos y/o polipéptidos de 158P1D7 para poner en evidencia las metástasis. Por ejemplo, cuando se descubre que una muestra biológica procedente de un tejido sano que no contiene células que expresan 158P1D7 (nódulo linfático) contiene células que expresan 158P1D7, tal como la expresión de 158P1D7 vista en LAPC4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de las metástasis del nódulo linfático y del hueso respectivamente, este descubrimiento es indicativo de metástasis.

Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos de 158P1D7 pueden utilizarse para poner en evidencia el cáncer de vejiga, por ejemplo, cuando se descubre que las células en una muestra biológica que no expresan normalmente la 158P1D7 o que expresan la 158P1D7 a un nivel diferente expresan la 158P1D7 o tienen una expresión aumentada de la 158P1D7.

En estos ensayos, los expertos pueden desear además tener más evidencias de metástasis sometiendo a prueba la muestra biológica en cuanto a la presencia de un segundo marcador restringido al tejido (además de 158P1D7), tal como ImmnoCytTM, PSCA, etc., (véase por ejemplo Fradet y col., 1997, Can J Urol, 4(3): 400-405; Amara y col., 2001, Cancer Res 61:4660-4665). Al igual que los expertos emplean fragmentos de polinucleótidos de PSA y variantes de polinucleótidos en procedimientos de control de PSA, los fragmentos de polinucleótidos de 158P1D7 y las variantes de polinucleótidos se utilizan de forma análoga. En particular, los polinucleótidos típicos de PSA utilizados en los procedimientos de control de PSA son sondas o cebadores que se componen de fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores utilizados para amplificar por PCR un polinucleótido de PSA deben incluir menos de la secuencia total de PSA para ser adecuadas a la reacción en cadena de la polimerasa. En el contexto de estas reacciones PCR, generalmente los expertos crean distintos fragmentos de polinucleótido que pueden utilizarse como cebadores con el fin de amplificar distintas partes de un polinucleótido de interés o de optimizar las reacciones de amplificación (véase por ejemplo Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson y col., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Se proporciona en el Ejemplo 4 una ilustración adicional del uso de estos fragmentos, donde se utiliza un fragmento de polinucleótido de 158P1D7 como sonda para mostrar la expresión de los ARN de 158P1D7 en células cancerosas. Además, se utilizan típicamente secuencias de polinucleótidos variables como cebadores y sondas para los ARNm correspondientes en los análisis por PCR y Northern (véase por ejemplo Sawai y col., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11(6): 407-13 y Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel y col., eds., 1995)). Los fragmentos y variantes del polinucleótido son útiles en este contexto cuando son capaces de unirse a una secuencia de

polinucleótido diana (por ejemplo el polinucleótido de 158P1D7 mostrado en la SEQ ID NO: 655) en condiciones de alta rigurosidad.

Además, polipéptidos de PSA que contienen un epítope que puede ser reconocido por un anticuerpo o célula T y que se unen específicamente a aquel epítope son utilizados en procedimientos de control de PSA. Los fragmentos del polipéptido de 158P1D7 y análogos o variantes del polipéptido pueden utilizarse también de forma análoga. Esta práctica de utilizar fragmentos de polipéptido o variantes de polipéptido para generar anticuerpos (como los anticuerpos o células T anti-PSA) es típica en la técnica con una gran variedad de sistemas, tales como las proteínas de fusión empleadas por los médicos (véase por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubel y col., eds., 1995). En este contexto, cada epítope(s) proporciona la arquitectura con la que un anticuerpo o célula T es reactiva. Típicamente, los expertos crean una variedad de distintos fragmentos de polipéptido que pueden emplearse con el fin de generar respuestas inmunes específicas a partir de distintas partes de un polipéptido de interés (véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.840.501 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.939.533). Por ejemplo, puede resultar preferible utilizar un polipéptido que comprenda uno de los motivos biológicos de 158P1D7 desarrollados aquí o una subsecuencia portadora de motivos que esté ya identificada por un especialista en base a los motivos disponibles en la técnica. Los fragmentos, variantes o análogos del polipéptido son normalmente útiles en este contexto mientras comprendan un epítope capaz de generar un anticuerpo o célula T específica de una secuencia de polipéptido diana (por ejemplo el polipéptido de 158P1D7 mostrado en la SEQ ID NO: 657).

Tal como se muestra aquí, los polinucleótidos y polipéptidos de 158P1D7 (así como las sondas de polinucleótidos de 158P1D7 y anticuerpos o células T anti-158P1D7 utilizados para identificar la presencia de estas moléculas) muestran propiedades específicas que los hacen útiles en el diagnóstico de cánceres tales como los relacionados en la Tebla I. Los ensayos de diagnóstico que miden la presencia de los productos génicos de 158P1D7 con el fin de evaluar la presencia o el principio de una condición de enfermedad aquí descrita, tal como el cáncer de vejiga, se utilizan para identificar a los pacientes en cuanto a las medidas preventivas o también para su control, tal como se ha hecho con tanto éxito con el PSA para controlar el cáncer de próstata. Los materiales tales como los polinucleótidos y polipéptidos de 158P1D7 (así como las sondas de polinucleótidos de 158P1D7 y anticuerpos anti158P1D7 empleados para identificar la presencia de estas moléculas) satisfacen la necesidad técnica de moléculas que tengan características similares o complementarias al PSA en situaciones de cáncer de vejiga. Finalmente, además de su uso en ensayos de diagnóstico, los polinucleótidos de 158P1D7 aquí descritos tienen diversas otras utilidades, tales como su uso en la identificación de anormalidades cromosómicas asociadas a la oncogenética en la región cromosómica representada por el gen de 158P1D7 (véase el Ejemplo 3 a continuación). Por otra parte, además de su uso en ensayos de diagnóstico, los polinucleótidos y proteínas asociadas a 158P1D7 aquí descritos poseen otras utilidades, tales como su uso en el análisis forense de tejidos de origen desconocido (véase por ejemplo Takahama K. Forensic Sci. Int. 1996 Jun 28; 80(1-2): 63-9).

Además, los polinucleótidos o proteínas asociadas a 158P1D7 de la invención pueden utilizarse para tratar una condición patológica caracterizada por la sobreexpresión de 158P1D7. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de la Figura 2 o la Figura 3, o fragmentos de ambos, pueden utilizarse para generar una respuesta inmune al antígeno de 158P1D7. Los anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con 158P1D7 pueden utilizarse para modular la función de esta molécula y proporcionan así una ventaja terapéutica.

XII.) Inhibici6n de la Funci6n de la Proteina 15BP1D7

Se describen a continuación varios procedimientos y composiciones para inhibir la unión de 158P1D7 a su asociado de unión o su asociación a otra(s) proteína(s), así como procedimientos para inhibir la función de 158P1D7.

XII.A.) Inhibici6n de 15BP1D7 con Anticuerpos Intracelulares

En una primera posibilidad, un vector recombinante que codifica anticuerpos de cadena única que se unen específicamente a 158P1D7 es introducido en las células que expresan 158P1D7 a través de tecnologías de transferencia genética. En consecuencia, el anticuerpo anti-158P1D7 monocatenario codificado se expresa intracelularmente, se une a la proteína 158P1D7, e inhibe así su función. Los procedimientos para concebir estos anticuerpos intracelulares de cadena única son bien conocidos. Estos anticuerpos intracelulares, también conocidos como “intracuerpos”, se dirigen específicamente a un compartimento particular dentro de la célula, proporcionando el control en aquel lugar donde se enfoca la actividad inhibidora del tratamiento. Esta tecnología ha sido aplicada con éxito en la técnica (para su revisión, véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se ha demostrado que los intracuerpos eliminan virtualmente la expresión de los receptores superficiales de las células, de otro modo abundantes (véase por ejemplo, Richardson y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141, Beerli y col., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane y col., 1994, Gene Ther. 1: 332-337).

Los anticuerpos de cadena única comprenden dominios variables de cadenas pesada y ligera unidas por un polipéptido conector flexible y se expresan como polipéptido único. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena única se expresan como un fragmento de la región variable de cadena única unido a la región de cadena ligera conservada. Se manipulan señales de tráfico intracelular bien conocidas en los vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican estos anticuerpos monocatenarios con el fin de dirigir con precisión el intracuerpo hacia

el compartimento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplásmico (ER) se manipulan para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención de ER en el C-terminal, tal como el motivo KDEL de aminoácidos. Los intracuerpos destinados a ejercer una actividad en el núcleo están concebidos para incluir una señal de localización nuclear. Las partes lipídicas se unen a los intracuerpos con el fin de fijar el intracuerpo en el lado citosólico de la membrana plasmática. Se pueden dirigir también los intracuerpos para que ejerzan su función en el citosol. Por ejemplo, se emplean intracuerpos citosólicos para secuestrar los factores dentro del citosol, impidiendo así que sean transportados hacia su destino celular natural.

Los intracuerpos se pueden utilizar para capturar 158P1D7 en el núcleo, impidiendo así su actividad dentro del núcleo. Las señales nucleares diana se manipulan dentro de estos intracuerpos de 158P1D7 con el fin de lograr el direccionamiento deseado. Estos intracuerpos de 158P1D7 están diseñados para unirse específicamente a un dominio particular de 158P1D7. En otra realización, se emplean intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a la proteína 158P1D7 para impedir que la 158P1D7 consiga acceder al núcleo, impidiéndole así que ejerza actividad biológica alguna dentro del núcleo (por ejemplo, impidiendo que 158P1D7 forme complejos de transcripción con otros factores).

Con el fin de dirigir específicamente la expresión de estos intracuerpos hacia células particulares, la transcripción del intracuerpo se localiza por debajo del control regulatorio de un promotor y/o amplificador adecuado específico del tumor. Con el fin de dirigir la expresión del intracuerpo específicamente hacia la vejiga, por ejemplo, se puede utilizar el promotor y/o el promotor/amplificador de PSCA (véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.919.652, 6 de julio de 1999, y Lin y col., PNAS, USA 92(3): 679-683 (1995)).

XII.B.) Inhibici6n de 15BP1D7 con Proteinas Recombinantes

En otro desarrollo, las moléculas recombinantes se unen a 158P1D7 e inhiben así la función de 158P1D7. Por ejemplo, estas moléculas recombinantes impiden o inhiben que 158P1D7 tenga acceso/se una a su(s) asociado(s) de unión o se asocie a otra(s) proteína(s). Estas moléculas recombinantes, por ejemplo, pueden contener la(s) parte(s) reactiva(s) de una molécula anticuerpo específica de 158P1D7. En una realización particular, el dominio de unión de 158P1D7 de un asociado de unión de 158P1D7 se dirige dentro de una proteína de fusión dimérica, comprendiendo la proteína de fusión dos dominios de unión al ligando de 158P1D7 ligados a la porción Fc de un IgG humano, tal como IgG1 humano. Esta porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1. Estas proteínas de fusión dimérica se administran a los pacientes que padecen un cáncer asociado a la expresión de 158P1D7 en su forma soluble, uniéndose específicamente la proteína de fusión dimérica a 158P1D7 y bloqueando la interacción de 158P1D7 con un asociado de unión. Estas proteínas de fusión dimérica se combinan además en proteínas multiméricas mediante la utilización de tecnologías conocidas de enlace de anticuerpos.

XII.C.) Inhibici6n de la Transcripci6n o de la Traducci6n de 15BP1D7

En un desarrollo, un procedimiento para inhibir la transcripción del gen de 158P1D7 comprende poner en contacto el gen 158P1D7 con un polinucleótido antisentido 158P1D7. En otro desarrollo, un procedimiento para inhibir la traducción de ARNm 158P1D7 comprende poner en contacto el ARNm 158P1D7 con un polinucleótido antisentido. En otro desarrollo, se utiliza una ribozima específica para segmentar el mensaje de 158P1D7, inhibiéndose así la traducción. Dichos procedimientos basados en la utilización de polinucleótidos antisentido y ribozimas también pueden dirigirse a las regiones reguladoras del gen 158P1D7, tales como el promotor 158P1D7 y/o elementos estimuladores. También se utilizan proteínas capaces de inhibir el factor de transcripción del gen 158P1D7 para inhibir la transcripción del ARNm 158P1D7. Anteriormente se han descrito los diferentes polinucleótidos y composiciones de utilidad en los procedimientos antes mencionados. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir la transcripción y la traducción es bien conocido en la técnica.

Otros factores que inhiben la transcripción de 158P1D7 al interferir con la activación transcripcional de 158P1D7 son también útiles para tratar cánceres de vejiga que expresan 158P1D7. Asimismo, los factores que interfieren con el procesamiento de 158P1D7 son útiles para tratar cánceres de vejiga que expresan 158P1D7.

XII.D.) Consideraciones Generales para las Estrategias Terapeuticas

Las tecnologías de transferencia de genes y de terapia génica se pueden utilizar para depositar moléculas de polinucleótidos terapéuticas en células tumorales que sintetizan 158P1D7 (esto es: antisentido, ribozimas y polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de 158P1D7). Se conocen varios procedimientos terapéuticos en la técnica. Vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido 158P1D7, ribozimas, factores capaces de interferir en la transcripción de 158P1D7, etcétera, pueden ser depositados en las células tumorales diana utilizando dichos procedimientos terapéuticos.

Los desarrollos terapéuticos anteriores se pueden combinar con cualquiera de una amplia variedad de regímenes terapéuticos quirúrgico, quimioterapia o radioterapia. Los desarrollos terapéuticos de la invención hacen posible el uso de dosis reducidas de quimioterapia (o de otras terapias) y/o administración menos frecuente; lo que supone un avance para todos los pacientes, en particular, para aquellos que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

Se puede evaluar la actividad antitumoral de una determinada composición (por ejemplo: antisentido, ribozima, intracuerpo) o una combinación de dichas composiciones utilizando varios sistemas de ensayo in vitro , in vivo. Ensayos in vitro que pueden evaluar la actividad terapéutica incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de actividad de estimulación tumoral, así como ensayos de unión capaces de determinar el alcance que una composición terapéutica puede tener a la hora de inhibir la unión de 158P1D7 a una pareja de unión, etc.

In vivo, se puede evaluar el efecto de la composición terapéutica 158P1D7 en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, se pueden utilizar modelos de cánceres de vejiga xenogénicos, en los que tejido extirpado de un cáncer de vejiga humano o tejidos del injerto heterólogos son introducidos en animales inmunológicamente comprometidos, tales como ratones desnudas o ratones SCID (Shibayama y col., 1991, J Urol., 146 (4); 1136-7; Beecken y col., 2000, Urology, 56(3):521-526). La eficacia se puede predecir utilizando ensayos que midan la inhibición de la formación tumoral, la regresión tumoral o de metástasis y similares.

Los ensayos in vivo que evalúan la estimulación de la apoptosis son útiles en la evaluación de las composiciones terapéuticas. En una realización, se pueden examinar injertos heterólogos en ratones que padecen tumores tratados con la composición terapéutica para ver si hay focos apoptóticos y compararse con los ratones control no tratadas que han sufrido un injerto heterólogo. La extensión de los focos apoptóticos en los tumores de ratones tratadas proporcionará indicios de la eficacia terapéutica de la composición.

Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los procedimientos anteriores pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el procedimiento de aplicación deseado. Portadores adecuados incluyen cualquier material que, combinado con la composición terapéutica, conserve la función antitumoral de la composición terapéutica y que, en general, sea no reactivo frente al sistema inmunitario del paciente. Ejemplos incluyen, aunque no únicamente, cualquiera de los portadores farmacéuticos convencionales, tales como: soluciones salinas tamponadas de fosfato estériles, agua bacteriostática y similares (en general, véase la 16ª Edición de Remington’s Pharmaceutical Sciences, A. Osal., Ed., 1980).

Las formulaciones terapéuticas pueden ser solubilizadas y administradas a través de cualquier vía que pueda liberar la composición farmacéutica en el lugar del tumor. Vías de administración potencialmente eficaces incluyen, aunque no únicamente, la intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares. Una formulación preferente para inyecciones intravenosas comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua no conservada estéril y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen un 0,9% de cloruro sódico estéril para inyecciones, USP. Los preparados proteínicos terapéuticos pueden ser liofilizados y almacenados como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y luego son reconstituidos en agua bacteriostática (que contiene por ejemplo: antiséptico de alcohol bencílico)

o en agua estéril antes de la inyección.

Los protocolos de administración y dosificación para tratar cánceres de vejiga mediante el uso de los procedimientos anteriores variarán según el procedimiento y el cáncer a tratar y dependerán, por lo general, de una serie de factores que han sido tenidos en cuenta en la técnica.

XIII.) Kits

Los kits pueden comprender un portador, un envase o un recipiente compartimentado para ampollas, tubos y similares; cada uno de los recipientes o el recipiente contiene(n) uno de los distintos elementos usados en el procedimiento. Por ejemplo, el recipiente(s) puede(n) contener una sonda que está o puede estar perceptiblemente marcada. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleótido específico para una proteína relacionada con 158P1D7 o un gen o un mensaje de 158P1D7, respectivamente. Cuando el procedimiento utiliza una hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico diana, el kit puede contener también recipientes que contengan nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que contenga un medio cebador, por ejemplo una proteína unida a la biotina, tal como avidina o estreptavidina unida a una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioisotópico. El kit puede contener toda la secuencia

o parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o de la Figura 3 o análogas a las mismas, o moléculas de ácido nucleico que codifican dicha secuencia de aminoácidos.

Los kits pueden comprender de forma típica el recipiente descrito arriba y uno o más recipientes distintos que contienen materiales convenientes desde el punto de vista comercial y del usuario, entre los que se incluyen: tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con las instrucciones de uso.

En el recipiente puede aparecer una etiqueta que indique que la composición es para una determinada terapia o aplicación no terapéutica y también puede tener las indicaciones para su uso in vivo o in vitro, como las descritas anteriormente. Indicaciones y/u otras informacones también pueden aparecer en la etiqueta o en el prospecto incluido en kit.

Ejemplos

A continuación se describen e ilustran varios aspectos de la invención mediante los siguientes ejemplos, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Aislamiento por SSH de un Fragmento de ADNc del gen 15BP1D7

5 Para aislar los genes que son sobreexpresados en el cáncer de vejiga, utilizamos el procedimiento de Hibridación Substractiva bajo Supresión (SSH) utilizando ADNc de tejidos cancerígenos de la vejiga, incluido el carcinoma de células transicionales invasivas. Se extrajo la secuencia de ADNc SSH 158P1D7 de un grupo de cáncer de vejiga sin substracción de ADNc de vejiga normal. En la unidad también se incluyeron ADNcs extraídos de otros 9 tejidos normales. El ADNc 158P1D7 estaba altamente expresado en el grupo de tejido de cáncer de vejiga y menos

10 expresado en un conjunto reducido de tejidos normales. La secuencia ADN SSH de 231 pb (Figura 1) presenta una alta homología (identidad 230/231) con una hipotética proteína FLJ22774 (registro de Banco de Genes XM_033183) derivada de un clon genómico del cromosoma 13. Se aisló un clon ADNc de 158P1D7 (TurboScript3PX) de 2.555 pb de ADNc cancerígeno de la vejiga, mostrando un ORF de 841 aminoácidos (Figura 2 y Figura 3). 15 La proteína 15SP1D7 tiene una secuencia de señal y un domino transmembránico y se prevé esté localizada en la superficie celular utilizando el programa SPORT-I (URL psort.nibb.ac.jp:8800/form.html). El análisis de la secuencia

de aminoácidos de 158P1D7 muestra un 100% de identidad sobre la región de aminoácidos 798 con la hipotética proteína humana FLJ22774 (Registro de Banco de Genes XP_033182, Figura 4). Materiales y Procedimientos

20 Tejidos Humanos:

Se compraron tejidos de pacientes con cáncer de vejiga de varias fuentes, como NDRI (Filadelfia, PA). El ARNm para tejidos normales se compró en Clontech, Palo Alto, CA. Aislamiento del ARN: Se homogeneizaron los tejidos en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 ml/g del ARN total

25 aislado del tejido. Se purificó el Poli A ARN del ARN total utilizando kits Mini y Midi ARNm de Oligotex, Qiagen. El Los ARN total y ARNm fueron cuantificados por análisis espectrofotométrico (O.D. 260/280 nm) y analizados por electroforesis en gel.

Oligonucleótidos: Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPCL (Cromatografía líquida de alta resolución). 30 DPNCDN (cebador de la síntesis de ADNc): 5’TTTTGATCAAGCTT303’ (SEQ ID NO: 661)

Adaptador 1: 5’CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3’ (SEQ ID NO: 662) 3’GGCCCGTCCTAG5’ (SEQ ID NO: 663)

35 Adaptador 2: 5’GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3’ (SEQ ID NO:664) 3’CGGCTCCTAG5’ (SEQ ID NO: 665)

Cebador PCR 1: 40 5’CTAATACGACTCACTATAGGGC3’ (SEQ ID NO: 666) Cebador encajado (NP) 1: 5’TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3’ (SEQ ID NO: 667) Cebador encajado (NP) 2: 5’AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3’ (SEQ ID NO: 668)

Hibridación Substractiva bajo Supresión:

Se utilizó la Hibridación Substractiva bajo Supresión (SSH) para identificar los ADNcs correspondientes a genes que pueden expresarse diferencialmente en el cáncer de vejiga. La reacción SSH utilizó ADNc del cáncer de vejiga y tejidos normales.

La secuencia 158P1D7 de genes fue extraída de un grupo de cáncer de vejiga sin substracción de ADNc de vejiga normal. Se identificó la secuencia SSH ADN (Figura 1).

Se utilizó el ADNc extraído de un grupo de tejido de vejiga normal como fuente de ADNc “controlador”, mientras se utilizó ADNc de un grupo de tejido de cáncer de vejiga como fuente de ADNc “conductor”. Se sintetizaron los ADNcs bicatenarios correspondientes a ADNcs conductor y controlador a partir de 2 μg de poli(A)+ARN aislado del tejido de injerto heterólogo pertinente, tal como se describe arriba, utilizando un Kit de substracción de ADNc PCR-Select de CLONTECH y 1 ng de DPNCDN oligonucleótido como cebador. Se llevó a cabo la síntesis de la primera y segunda cadenas, tal como se describe en el protocolo del manual del usuario del kit (Nº de Protocolo CLONTECH PT1117, Catálogo Nº K1804-1). El ADN resultante se digirió en Dpn II durante 3 horas a 37ºC. El ADN digerido se extrajo con fenol/cloroformo (proporción 1:1) y se precipitó con etanol.

Se generó ADNc conductor combinando ADNc digerido Dpn II a partir de la fuente de tejido pertinente (véase arriba) con una mezcla de ADNcs digeridos extraídos de nueve tejidos normales: estómago, músculo esquelético, pulmón, cerebro, hígado, riñón, páncreas, intestino delgado y corazón, en una proporción 1:1.

Se generó ADNc controlador diluyendo 1 μl de ADNc digerido en Dpn II de la fuente de tejido pertinente (véase arriba) (400 ng) en 5 Il de agua. Luego se ligó el ADNc diluido (2 μl, 160 ng) en 2 μl de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 μM), en reacciones de ligación diferentes, a un volumen total de 10 μl a 16ºC durante toda la noche, utilizando 400 u de ligasa-T4-ADN (CLONTECH). La ligación finalizó con 1 μl de EDTA 0,2M se calentó a 72ºC durante 5 min.

Se llevó a cabo la primera hibridación añadiendo 1,5 μl (600 ng) de ADNc controlador a cada uno de los dos tubos que contenían 1,5 μl (20 ng) de ADNc conductor ligado al Adaptador 1 y al Adaptador 2. A un volumen final 4 μl, se recubrieron las muestras con aceite mineral desnaturalizado, en un ciclador térmico MJ Research, a 98ºC durante 1,5 minutos y luego se dejaron hibridizar durante 8 horas a 68ºC. Entonces se mezclaron las dos hibridaciones con otro 1 μl de ADNc controlador recién desnaturalizado y se dejaron hibridizar durante toda la noche a 68ºC. A continuación se diluyó la segunda hibridación en 200 μl de Hepes 20 mM, a un pH 8,3; 50 mM NaCl; 0,2 mM EDTA, se calentó a 70ºC durante 7 min y se almacenó a -20ºC.

Amplificación PCR, Clonación y Secuenciación de Fragmentos de Genes Generados por SSH:

Para amplificar los fragmentos génicos resultantes de las reacciones SSH, se efectuaron dos amplificaciones PCR. En la reacción primaria PCR, se añadió 1 μl de la mezcla de hibridación final diluida con 1 μl de iniciador PCR 1 (10 μM); 0,5 μl de la mezcla dNTP (10 μM), 2,5 μl 10 x solución tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 μl 50 x Mezclade Polimerasa de ADNc Óptimo (CLONTECH) a un volumen final de 25 μl. Se efectuó la PCR 1 bajo las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 minutos, 94ºC durante 25 segundos, luego 27 ciclos a 94ºC durante 10 segundos, 66ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos. Se efectuaron cinco reacciones PCR primarias distintas en cada experimento. Se combinaron los productos y se diluyeron con agua a una proporción 1:10. En la reacción secundaria PCR, se añadió 1 μl de la reacción PCR primaria combinada y diluida a la misma mezcla de reacción que la usada en PCR 1, salvo que se utilizaron los cerbadores NP 1 y NP 2 (10 μM) en lugar del cebador PCR 1. Se efectuó la reacción PCR 2 utilizando de 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos. Se analizaron los productos utilizando una electroforesis en gel de agarosa a un 2%.

Se insertaron los productos PCR en PCR2.1 utilizando un kit de clonación vectorial T/A (Invitrogen). Se sometieron las colonias E. Co/i transformadas a una selección azul/blanco y de ampicillina. Se recogieron las colonias blancas, se colocaron en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer en un cultivo líquido durante toda la noche. Para identificar inserciones, se efectuó una amplificación PCR en 1 ml de cultivo bacteriano bajo las condiciones de PCR1 y utilizando NP y NP2 como cebadores. Se analizaron los productos PCR utilizando una electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Se almacenaron los clones bacterianos en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó el ADN plásmido, se secuenció y se sometió a una búsqueda de homología con el ácido nucleico en las bases de datos del Banco de Genes, dBest y NCI-CGAP.

Análisis de la Expresión RT-PCR:

Se pueden generar primeras cadenas de ADNcs a partir de 1 μg de ARNm mediante cebadores oligo (dT)12-18 utilizando el sistema de Superscript Preamplification Gibco-BRL. Se utilizó el protocolo del fabricante, que incluía una incubación de 50 minutos a 42ºC con transcriptasa inversa, seguida de tratamiento con ARNsa-H a 37ºC durante 20 minutos. Una vez finalizada la reacción, se puede aumentar el volumen a 200 μl con agua antes de su normalización. Se pueden obtener las primeras cadenas de ADNcs a partir de 16 tejidos humanos sanos diferentes de Clontech.

Se efectúo la normalización de la primera cadena de ADNc a partir de múltiples tejidos utilizando los cebadores 5’atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3’ (SEQ ID NO: 669) y 5’agccacacgcagctcattgtagaagg 3’ (SEQ ID NO: 670) para amplificar la -actina. Se amplificaron las primeras cadenas de ADNc (5 μl) en un volumen total de 50 μl que contenía 0,4 μM de cebadores; 0,2 μM de cada dNTP, solución tampón 1XPCR (Clontech, 10 nM Tris-HCL, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,3) y ADN-polimerasa 1X Klentaq (Clontech). Cinco μl de la reacción PCR pueden ser eliminados en los ciclos 18, 20 y 22 y utilizados en la electroforesis en gel de aragosa. Se efectuó una reacción PCR utilizando un ciclador térmico MJ Research bajo las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial puede producirse a 94ºC durante 15 segundos, seguida de ciclos de 18, 20 y 22 a 94ºC durante 15 segundos; 65ºC durante 2 minutos; 72ºC durante 5 segundos. Se llevó a cabo una extensión final a 72ºC durante 2 min. Después de la electroforesis en gel de agarosa, se comparó la intensidad de banda de la banda de �-actina de 283 pb de los múltiples tejidos por inspección visual. Se calcularon los factores de dilución de la primea cadena de ADNc, dando la misma intensidad de banda para la �-actina en todos los tejidos después 22 ciclos de PCR. Pueden ser necesarias tres series de normalización para obtener las mismas intensidades de banda en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.

Para determinar los niveles de expresión del gen de 158P1D7, se analizaron 5 μl de la primera cadena de ADNc normalizada por PCR utilizando 26 y 30 ciclos de amplificación. Se puede obtener un análisis de la expresión semicuantitativa comparando los productos PCR en números de ciclo que dan intensidades en la banda de luz. Los cebadores utilizados para la RT-PCR se diseñaron utilizando la secuencia 158P1D7 SSH y se muestran abajo:

158P1D7.1

5’ ATAAGCTTTCAATGTTGCGCTCCT 3’ (SEQ ID NO: 671)

158P1D7.2

5’ TGTCAACTAAGACCACGTCCATTC3’ (SEQ ID NO: 672)

La Fig. 6 muestra un análisis típico de expresión RT-PCR. Se efectuó un análisis de expresión RT-PCR en la primera cadena de ADNcs generada utilizando pools de tejidos de múltiples muestras. Se normalizaron los ADNcs utilizando beta-actina PCR. Se observó la expresión de 158P1D7 en el grupo de cáncer de vejiga.

Ejemplo 2: Clonaci6n de 15BP1D7 Total

Se extrajo la secuencia ADNc SSH 158P1D7 de un grupo de cáncer de vejiga sin substracción de ADNc de vejiga normal. Se denominó a la secuencia ADNc SSH (Figura1) 158P1D7. Se clonó la longitud total del TurboScript3PX del clon 158P1D7 del clon ADNc (Figura 2) a partir del ADNc del grupo de cáncer de vejiga.

El ADNc del clon 158P1D7 se depositó conforme a las condiciones del Tratado de Budapest del 22 de agosto de 2001 en la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) como el plásmido p158P1D7- Turbo/3PX y se le ha dado el Nº de registro XXXXX (expediente XXXXXX ).

Ejemplo 3: Mapa Cromos6mico de 15BP1D7

La localización cromosómica puede implicar genes patógenos. Se dispone de varios procedimientos para trazar el mapa cromosómico, entre los que se incluyen la hibridación in s itu (FISH), paneles de radicación híbridos humanos/hamster (Walter y col., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville A1), paneles de células somáticas híbridas humano-roedor, por ejemplo las disponibles del Coriell Institute (Camden, New Jersey) y visualizadores genómicos que utilizan homologías BLAST en los clones genómicos secuenciados y cartografiados (NCBI, Bethesda, Maryland).

Los mapas 158P1D7 del cromosoma 13 utilizan la secuencia 158P1D7 y la herramienta NCBI BLAST: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/ page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs). Esta es una región de frecuente amplificación en el cáncer de vejiga (Prat y col., Urology 2001 Mayo; 57(5):986-92; Muscheck y col., Carcinogenesis 2000 Sep;21(9):1721-26) y está asociada a la rápida proliferación de células tumorales en el cáncer de vejiga avanzado (Tomovska y col., Int J Oncol 2001 Junio; 18(6): 1239-44).

Ejemplo 4: Analisis de la expresi6n de 15BP1D7 en tejidos sanos Y en muestras de pacientes

La Figura 6 muestra el análisis de 158P1D7 por RT-PCR. Se observa una fuerte expresión de 158P1D7 en el grupo de cáncer de vejiga.

El análisis Northern blot exhaustivo de 158P1D7 en 16 tejidos humanos sanos confirma la misma expresión observada por RT-PCR (Figura 7). Se detectan dos transcripciones de aproximadamente 4,6 y 4,2 kb en la próstata y niveles inferiores en el corazón, placenta, hígado intestino delgado y colon.

El análisis Northern blot en muestras tumorales de pacientes presenta una expresión de 158P1D7 en la mayor parte de los tejidos tumorales de vejiga analizados y en la línea celular del cáncer de vejiga SCaBER (Figura 8A y 8B). La expresión detectada en tejidos adyacentes sanos (aislados de pacientes) pero no en tejidos sanos (aislados de

donantes sanos) podría indicar que estos tejidos no son totalmente normales y que la 158P1D7 puede expresarse en etapas tumorales tempranas.

La expresión limitada de 158P1D7 en tejidos sanos y la expresión detectada en los cáncer de vejiga indica que la 158P1D7 es un posible objetivo terapéutico y un marcador diagnóstico del cáncer en humanos.

Ejemplo 5: Producci6n de 15BP1D7 Recombinante en Sistemas Procari6ticos

A. Constructos de transcripción y traducción in vitro:

pCRII: Para generar sondas de ARN sentido y antisentido de 158P1D7 en estudios de ARN in situ se generan constructos pCRII (Invitrogen, Carlsbad Ca) que codifican todo o fragmentos de ADNc de 158P1D7. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 a cada lado del inserto para estimular la transcripción de ARN 158P1D7, que se usan como sondas en los experimentos de hibridación in situ de ARN. Dichas sondas son utilizadas para analizar la expresión celular y tisular de 158P1D7 a nivel del ARN. El ARN 158P1D7 transcrito que representa la región que codifica el aminoácido ADNc se emplea en sistemas de traducción in vitro, tales como el Sistema Reticulolisato Acoplado TnT™ (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar la proteína 158P1D7.

B. Constructos Bacterianos:

Constructos pGEX: para generar proteínas 158P1D7 recombinantes en bacterias que se funden con la proteína glutatión-S-tranferasa (GST), toda o parte de la secuencia de ADNc que codifica la proteína 158P1D7 se funde al gen GST, clonándose en un vector pGEX-6P-1 o en cualquier otro tipo de vector de fusión GST de la familia pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estos constructos permiten la expresión controlada de las secuencias de proteínas recombinantes 158P1D7 con el GST fundido en el extremo amino y un epítope histidina seis (6X His) en el extremo carboxilo. Las etiquetas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada, así como el reconocimiento de la proteína de fusión con los anticuerpos anti-GST y His. La etiqueta 6X His es generada uniendo 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3’ del marco abierto de lectura (ORF). Se puede emplear un sitio de segmentación proteolítico, por ejemplo el sitio de reconocimiento PreScission™ en pGEX-6P-1, de modo que se produce la segmentación del marcador GST de la proteína relacionada con 158P1D7. El gen de resistencia a la ampillicina y el origen pBR322 permiten la selección y mantenimiento de los plásmidos en E.coli. Por ejemplo, los constructos se generan utilizando pGEX-6P-1 de manera que las siguientes regiones de 158P1D7 se expresadas como fusiones del extremo amino en GST: aminoácidos 1 a 841; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

o más contiguos a 158P1D7 o análogos a los mismos.

Constructos pMAL: Para generar proteínas 158P1D7 recombinantes que se fundan a la proteína de unión a la maltosa (MBP) en células bacterianas, toda o parte de la secuencia que codifica la proteína ADNc 158P1D7 se funde al gen MBP mediante clonación en vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estos constructos permiten la expresión controlada de las secuencias de proteínas recombinantes 158P1D7 con MBP fundido con el extremo amino y un epítope 6X His en el extremo carboxilo. Las etiquetas MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada, así como el reconocimiento de la proteína de fusión con los anticuerpos anti-MBP y anti-His. La 6X His e obtiene añadiendo codones histidina al cebador de clonación 3’. El sitio de reconocimiento factor Xa permite la segmentación del marcador pMAL de 158P1D7. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X son optimizados para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o en el periplasma, respectivamente. La expresión del periplasma mejora el plegado de las proteínas con enlaces bisulfuro. Por ejemplo, los constructos se generan utilizando pMAL-c2X y pMAL-p2X de manera que las siguientes regiones de la proteína 158P1D7 son expresadas como fusiones del extremo amino a MBP: aminoácidos 1 a 841; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 o análogos a los mismos.

Constructos pET: Para expresar 158P1D7 en células bacterianas, toda o parte de la secuencia que codifica la proteína ADNc 158P1D7 son clonadas en la familia de vectores pET (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten la expresión fuertemente controlada de la proteína recombinante 158P1D7 en bacterias que se fusionan o no a las proteínas que mejoran la solubilidad, tales como NusA y tiorredoxina (Trx), y etiquetas de epítopes, tales como 6X His y S-Tag™, que favorecen la purificación y detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, los constructos se obtienen utilizando un sistema de fusión pET NusA 43.1 de manera que las siguientes regiones de la proteína 158P1D7 son expresadas como fusiones del extremo amino a NusA: aminoácidos 1 a 841; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 o análogos a los mismos.

C. Constructos de Levadura:

Constructos pESC: Para expresar 158P1D7 en la especie de levaduras Saccharomyces cerev isiae con el fin de generar proteína recombinante y para estudios funcionales, toda o parte de la secuencia que codifica la proteína ADNc 158P1D7 se clona en la familia de vectores pESC, cada una de las cuales contiene 1 de los 4 marcadores seleccionables: HIS3, TRP1, LEU2, y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresión controlada desde el mismo plásmido de hasta 2 diferentes genes o secuencias clonadas que contienen las etiquetas epítopes Flag™ o Myc en la misma célula de la levadura. Este sistema es útil para conformar interacciones proteína

proteína de 158P1D7. Además, aparece una expresión en las modificaciones post-traduccionales similares a la producción de levadura, tales como glicosilaciones y fosforilaciones, cuando se expresan en células eucarióticas. Por ejemplo, los constructos se hacen utilizando pESC-HIS de manera que las siguientes regiones de la proteína 158P1D7 son expresadas: aminoácidos 1 a 841; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 o análogos a los mismos.

Constructos pESP: Para expresar 158P1D7 en la especie de levaduras Saccharomyces pombe, toda o parte de la secuencia que codifica la proteína ADNc 158P1D7 se clonad en la familia pESC de vectores. Estos vectores permiten un alto nivel controlado de expresión de una secuencia proteínica 158P1D7 que está fundida en el extremo amino o en el extremo carboxilo a GST, lo que favorece la purificación de la proteína recombinante. La etiqueta epitópica Flag™ permite detectar la proteína recombinante con el anticuerpo anti-Flag™. Por ejemplo, los constructos se hacen utilizando el vector pESP-1 de manera que las siguientes regiones de la proteína 158P1D7 son expresadas como fusiones del extremo amino a GST: aminoácidos 1 a 841; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 o análogos a los mismos.

Ejemplo 6: Producci6n de 15BP1D7 Recombinante en Sistemas Eucari6ticos

A. Constructos de Mamiferos

Para expresar 158P1D7 recombinante en células eucarióticas, toda o parte de las secuencias ADNc 158P1D7 pueden ser clonadas en una cualquiera de las variedades de vectores de expresión conocidos en la técnica. Los constructos pueden ser transfectados en una cualquiera de una amplia variedad de células de mamíferos, tales como células 293T. Los lisatos de las células 293T transfectadas pueden ser sondados con el suero policlonal 158P1D7, descrito anteriormente.

Constructos pADNc4/HisMax: Para expresar 158P1D7 en células de mamíferos, el ORF 158P1D7 es clonado en pADNc4/HisMax Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor citomegalovirus (CMV) y el estimulador de traducción SP163. La proteína recombinante tiene XpressTM y seis epítopes de histidina fusionados al extremo-N. El vector pADNc4/HisMax contiene también la hormona de crecimiento bovino (BGH), una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción para mejorar la estabilidad del ARNm, junto con un origen SV40 para la replicación episomal y el rescate vectorial simple en las líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la zeocina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampillicina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E.co/i. En este constructo se expresan las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

Constructos pADNc3.1/MycHis: Para expresar 158P1D7 en células de mamíferos, los ORFs con el sitio de iniciación de traducción del consenso Kozak se clonaron en p6ADN3.1/MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen el epítope myc y seis histidinas fusionada al extremo C. El vector pADNc3.1/MycHis también contiene la hormona de crecimiento bovino (BGH), una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción para mejorar la estabilidad del ARNm, junto con un origen SV40 para la replicación episomal y el rescate vectorial simple en las líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Se puede utilizar el gen de resistencia a la neomicina, ya que permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicillina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E.co/i. En este constructo se expresan las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

Constructo pADNc3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar 158P1D7 en células de mamíferos y permitir la detección de proteínas recombinantes utilizando fluorescencia, los ORFs con el sitio de iniciación de traducción del consenso Kozak son clonados en pADNc3.1CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la Proteína Verde Fluorescente (GPF) fusionada al extremo C, lo que facilita la detección no invasiva in vivo y los estudios de biología celular. El vector pADNc3.1CT-GFP-TOPO contiene también la hormona de crecimiento bovino (BGH), una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción para mejorar la estabilidad del ARNm, junto con un origen SV40 para la replicación episomal y el rescate vectorial simple en las líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la neomicina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicillina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E.co/i. Se obtiene otro constructo con fusión de GPF en el extremo N en pADNc3.1/NT-GFP-TOPO extendiendo toda la longitud de la proteína 158P1D7. En este constructo son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

PAPtag: Los ORFs 158P1D7 son clonados en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Este constructo genera una fusión de fosfatasa-alcalina al extremo C de las proteínas 58P1D7 al tiempo que fusiona la secuencia señal IgG

a al extremo N. Las proteínas recombinantes resultantes 158P1D7 son optimizadas por secreción en el medio de

células transfectadas de mamíferos y se pueden utilizar para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 158P1D7. La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor CMV y las proteínas recombinantes contienen también myc y seis histidinas fusionadas al extremo C de la fosfatasa-alcalina. El gen de resistencia a la zeocina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampillicina permite la selección del plásmido en E.co/i. En este constructo son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

ptag5: Los ORFs 158P1D7 son también clonados en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Este constructo genera una fusión de la inmunoglobulina G1 Fc en el extremo C de la proteína 158P1D7, en tanto que fusiona la secuencia de señal lgGK al extremo N. Las proteínas recombinantes resultantes 158P1D7 son optimizadas por secreción al medio de las células transfectadas de mamíferos y se pueden utilizar para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 158P1D7. La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor CMV y las proteínas recombinantes contienen también myc y seis histidinas fusionadas al extremo C de la fosfatasa-alcalina. El gen de resistencia a la zeocina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E.co/i. En este constructo son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

PsecFc: Los ORFs 158P1D7 son también clonados en psecFc. El vector psecFc se ensambló clonando la inmunoglobulina G1 Fc (articulación, regiones CH2, CH3) en pSEQTag2 (Invitrogen, California). Este constructo genera una fusión de la inmunoglobulina G1 Fc en el extremo C de la proteína 158P1D7, en tanto que fusiona la secuencia de señal lgG-Kappa al extremo N. Las proteínas recombinantes resultantes 158P1D7 son optimizadas por secreción al medio de las células transfectadas de mamíferos y se pueden utilizar para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 158P1D7. La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor CMV y las proteínas recombinantes contienen también myc y seis histidinas fusionadas al extremo C de la fosfatasa-alcalina. El gen de resistencia a la zeocina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampillicina permite la selección del plásmido en E.co/i. En este constructo son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

Constructos pSRa: Para generar líneas celulares de mamíferos que expresen constitutivamente 158P1D7, los ORFs son clonados en pSRa. Se generan retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos por transfección de los constructos pSRa en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o cotransfección de pSRa y un plásmido cooperador (que contiene secuencias de empaquetamiento suprimidas) en células 293, respectivamente. El retrovirus se puede utilizar para infectar varias líneas celulares de mamíferos, lo que da lugar a la integración del gen clonado, 158P1D7, en líneas celulares huésped. La expresión de la proteína es estimulada desde la repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a la neomicina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampillicina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E.co/i. Los vectores retrovirales pueden emplearse a partir de ese momento para infectar y generar varias líneas celulares, utilizando, por ejemplo, células SCaBER, NIH 3T3, TsuPr1, 293 o células rat-1A.

Se obtienen otros constructos pSRa que fusionan una etiqueta epítope, tal como la etiqueta FLAG al extremo C de las secuencias 158P1D7 para permitir su detección utilizando anticuerpos de etiqueta anti-epítope. Por ejemplo, la secuencia FLAG 5’ gat tac aag gat gac gac gat aag 3’ se añade al cebador de clonación en el extremo 3’ del ORF. Se obtienen otros constructos pSRa para producir tanto GFP en el extremo N como GFP en el extremo C y proteínas de fusión myc/6HIS de longitud completa de proteínas 158P1D7. En dichos constructos son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

Vectores Virales Adicionales: Se obtienen otros constructos para la expresión y liberación mediada por virus de 158P1D7. En los sistemas de liberación de virus, tales como vectores adenovirales y vectores tipo amplicón derivados del virus herpes, se logra una alta titulación de virus que lleva a un nivel alto de expresión de 158P1D7. Las secuencias que codifican 158P1D7 o fragmentos de la misma son amplificadas por PCR y subclonadas en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). La recombinación y el empaquetamiento del virus se lleva a cabo conforme a las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. Otra posibilidad se basa en que las secuencias que codifican 158P1D7 o fragmentos de la misma se clonen en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores virales herpes. A partir de ese momento los vectores virales son utilizados para infectar varias líneas celulares, tales como: células SCaBER, NIH 3T3, 293 o células rat-1. En este constructo son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

Sistemas de Expresión Regulados: Para controlar la expresión de 158P1D7 en células de mamíferos, las secuencias codificadoras de 158P1D7 son clonadas en sistemas de expresión regulados de mamíferos tales como: el Sistema T-Rex System (Invitrogen), el Sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el Sistema altamente regulado Ecdysone (Sratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración del recombinante 158P1D7. Se emplean estos vectores a partir de ese momento para controlar la expresión de

158P1D7 en varias líneas celulares, tales como: células SCaBER, NIH 3T3, 293 o células rat-1. En estos constructos son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

B. Sistemas de Expresi6n del Baculovirus

Para generar proteínas recombinantes 158P1D7 en un sistema de expresión baculovirus, los ORFs 158P1D7 son clonados en el vector de transferencia del baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que presenta una etiqueta His en el extremo N. Concretamente, pBlueBac-158P1D7 es cotransfectado con el plásmido cooperador pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insectos F9 (Spodoptera frugi perda) para generar baculovirus recombinante (para más información, véase el manual de instrucciones Invitrogen). Luego el baculovirus es recogido del sobrenadante celular y purificado por ensayos de placa.

A continuación, la proteína recombinante 158P1D7 es generada por infección de células de insectos HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. La proteína recombinante 158P1D7 puede ser detectada utilizando anti158P1D7 o un anticuerpo anti-His-tag. La proteína 158P1D7 puede ser purificada y utilizada en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos específicos monoclonales o policlonales para 158P1D7.

En este constructo son expresadas las siguientes regiones 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más contiguos a 158P1D7 variantes o análogos a los mismos.

Ejemplo 7: Perfiles de Antigenicidad

Las Figuras 11, 12, 13, 14 y 15 ilustran gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de 158P1D7, cada evaluación se puede consultar en la página de Internet ProtScale (URL www.expasy.ch/cgibin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular ExPasy.

Para identificar las regiones antigénicas de la proteína 158P1D7, se utilizaron estos perfiles: Figura 11, Hidrofilicidad, (Hopp T.P., Woods K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); Figura 12, Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Figura 13, Porcentaje de Residuos Accesibles (Janin J., 1979, Nature 277:491-492); Figura 14, Flexibilidad Media, (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); Figura 15, Beta-giro (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la técnica, tales como las de la página de Internet ProtScale. Cada uno de los perfiles de los anteriores aminoácidos de 158P1D7 se generó siguiendo los parámetros de análisis ProtScale: 1) Tamaño de ventana 9; 2) 100% del peso del marco de la ventana en comparación con el centro de la ventana y 3) valores de perfil del aminoácido normalizados entre 0 y 1.

Para determinar el alargamiento de los aminoácidos hidrofílicos se utilizaron los perfiles de Hidrofilicidad (Figura 11), Hidropaticidad (Figura 12) y Porcentaje de Residuos Accesibles (Figura 13) (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de Hidrofilicidad y Porcentaje de Residuos Accesibles, y valores inferiores a 0,5 en el perfil de Hidropaticidad). Es probable que dichas regiones sean expuestas a medios acuosos presentes en la superficie de la proteína y que, por tanto, se pueda efectuar un reconocimiento inmunitario, por ejemplo mediante anticuerpos.

Los perfiles de flexibilidad media (Figura 14) y Beta-giro (Figura 15) determinan el alargamiento de los aminoácidos (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de Beta-giro y en el perfil de Flexibilidad Media) que no son restringidos en las estructuras secundarias, tales como hojas beta y hélices alfa. Es probable también que dichas regiones estén más expuestas en la proteína y que, por tanto, se pueda efectuar un reconocimiento inmunitario, por ejemplo mediante anticuerpos.

Las secuencias antigénicas de la proteína 158P1D7 indicadas, por ejemplo, por los perfiles expuestos en las Figuras 11, 12, 13, 14 o 15, se emplean para preparar inmunógenos, péptidos o ácidos nucleicos que las codifican, para generar anticuerpos anti-158P1D7 terapéuticos y de diagnóstico. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos de la proteína 158P1D7 o los ácidos nucleicos correspondientes que la codifican. En concreto, los péptidos inmunógenos de la invención pueden comprender la región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier número entero creciente hasta 841, incluyendo una posición aminoácido con un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilicidad de la Figura 11; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier número entero creciente hasta 841 incluyendo una posición aminoácido con un valor inferior a 0,5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 12; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier número entero creciente hasta 841 incluyendo una posición aminoácido con un valor superior a 0,5 en el perfil de Residuos Accesibles de la Figura 13; una región péptida de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier número creciente en hasta 841 incluyendo una posición aminoácido con un valor superior a 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media de la Figura 14; y una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 2 en cualquier número entero creciente hasta 841 incluyendo una posición aminoácido con un valor superior a 0,5 en el perfil de Beta-giro de la Figura 15. Los péptidos inmunógenos de la invención también pueden comprender ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores. Todos los inmunógenos de la invención, péptido o ácido nucleico, pueden ser incluidos

en forma de dosis unitaria humana o en una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.

Ejemplo B: Generaci6n de Anticuerpos Policlonales 15BP1D7

Se pueden producir anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o adyuvante será inyectado en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Además de inmunizar toda la longitud de la proteína 158P1D7, se emplean algoritmos automatizados para ofi-inmunógenos de diseño que, basados en el análisis de la secuencia de aminoácidos, contienen características antigénicas y pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario del huésped inmunizado (véase el Ejemplo: "Perfiles de Antigenicidad"). Se podría predecir que dichas regiones serían hidrofílicas, flexibles, en conformaciones beta-giro y que estarían expuestas en la superficie de la proteína (para ver los perfiles de aminoácidos que indican dichas regiones de 158P1D7, véanse por ejemplo las Figuras 12, 13, 14, o 15).

Por ejemplo, las proteínas de fusión recombinantes 158P1D7 o los péptidos que codifican regiones hidrofílicas, flexibles, beta-giro de la secuencia 158P1D7, tales como los aminoácidos 25-45 y 250-385, se utilizan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos Blancos Nueva Zelanda. Es conveniente conjugar el agente inmunizante con una proteína inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre algunos ejemplos de proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque no únicamente, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina, tiroglobulina bovina y el inhibidor de tripsina de soja. En una realización, se conjuga un péptido que codifica los aminoácidos 25-45 de 158P1D7 con KLH y se utiliza para inmunizar ratas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos 158P1D7 puede fusionarse utilizando técnicas de ADN recombinante en cualquiera de las diferentes parejas de proteínas de fusión bien conocidas en la técnica, tales como la proteína glutatión-S-transferasa (GST) y las proteínas de fusión marcadas HIS. Dichas proteínas de fusión son purificadas a partir de bacterias inducidas utilizando la matriz de afinidad apropiada. En una realización, se produce y purifica una proteína de fusión GST que codifica los aminoácidos 250-385 de 158P1D7 y se genera un producto de desdoblamiento en el que las secuencias de GST se eliminan por segmentación proteolítica. Dicha proteína segmentada 158P1D7 se utiliza como inmunógeno. Entre otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que se pueden emplear se encuentran la proteína de unión a la maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA o una región constante de inmunoglobulina (véase la sección “Producción de 158P1D7 en Sistemas Procarióticos” y current Protocols of Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul y col. eds.,1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. y Ledbetter, L.(1991) J.Exp. Med. 174, 561-566).

Además de las proteínas de fusión derivadas de bacterias, también se utilizan antígenos de proteínas expresados en mamíferos. Estos antígenos son expresados a partir de vectores de expresión de mamíferos tales como los vectores de fusión Tag5 y Fc (véase la sección "Producción de 158P1D7 Recombinante en Sistemas Eucarióticos"), y retienen modificaciones post-traducción, tales como glicosilaciones, halladas en la proteína nativa 158P1D7. En una realización, el dominio extracelular previsto de 158P1D7, aminoácidos 1-614, es clonado en el vector de secreción de mamíferos Tag5. La proteína recombinante es purificada mediante cromatografía por quelatos metálicos a partir de los sobrenadantes del cultivo tisular de células 239T que expresan establemente el vector recombinante. El dominio extracelular 158P1D7 del vector purificado Tag5 es entones utilizado como inmunógeno.

Durante el protocolo de inmunización es conveniente mezclar o emulsionar el antígeno en adyuvantes que mejoren la respuesta inmunológica del animal huésped Ejemplos de adyuvantes incluyen, aunque no únicamente: el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético).

En un protocolo de inmunización característico, al principio se inyectan vía subcutánea a los conejos hasta 200 Ig, normalmente entre 100-200 Ig, de proteína de fusión o péptido conjugado a KLH mezclado con un adyuvante completo de Freund (CFA). Luego se inyectan subcutáneamente cada dos semanas a los conejos hasta 200 Ig, normalmente entre 100-200 Ig, de inmunógeno en adyuvante de Freund incompleto (IFA). Se toman muestras de sangre aproximadamente 7-10 después de cada inmunización y se utilizan para controlar la titulación del antisuero por ELISA.

Para analizar la reactividad del suero, por ejemplo del suero de conejo, con las proteínas 158P1D7, puede clonarse toda la longitud del ADN en un vector de expresión tal como el que presenta etiqueta 6X His en el extremo carboxilo (pCADN 3.1 mychis, Invitrogen, véase el ejemplo "Producción de 158P1D7 Recombinante en Sistemas Eucarióticos"). Después de la transfección de los constructos en células 293T, los lisatos celulares son sondados con un suero anti-158P1D7 y con un anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para determinar la reactividad específica frente a la proteína 158P1D7 desnaturalizada utilizando la técnica Western blot. Además, se puede determinar el reconocimiento de la proteína nativa por el antisuero mediante inmunoprecipitación y citometría de flujo de 293T y otras células que expresan 158P1D7 recombinante. Opcionalmente, la especificidad del antisuero es analizada por técnicas Western blot, inmunoprecipitación, microscopio fluorescente y citometría de flujo utilizando células que expresan endógenamente 158P1D7.

Los sueros de conejos inmunizados con proteínas de fusión, tales como las proteínas de fusión GST y MBP, son purificados por depleción de anticuerpos reactivos frente a GST, MBP u otras secuencias de parejas de fusión mediante su paso a través de una columna de afinidad que contiene la pareja de fusión sola o en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Los sueros de conejo inmunizados con proteína His y péptidos, así como los sueros reducidos de pareja de fusión son además purificados por su paso a través de una columna de afinidad compuesta por inmunógeno de proteína original o péptido libre acoplado a una matriz Affigel (BioRad).

Ejemplo 9: Generaci6n de Anticuerpos Monoclonales 15BP1D7 (mAbs)

mAbs terapéuticos para 158P1D7 pueden incluir aquellos que reaccionan con epítopes de la proteína que interrumpirían o modularían la función biológica de 158P1D7, por ejemplo, los que interrumpirían su interacción con los ligandos o proteínas que median o están involucrados en su actividad biológica. mAbs terapéuticos también comprenden aquellos que se unen específicamente a epítopes de 158P1D7 expuestos en la superficie celular y que, por tanto, son útiles a la hora de seleccionar los conjugados mAbs-toxina. Inmunógenos para generar dichos mAbs incluyen aquellos destinados a codificar o contener toda la proteína 158P1D7 o regiones de la proteína 158P1D7 que el análisis por ordenador de la secuencia de aminoácidos prevé serán antigénicas (véanse las Figuras 11, 12, 13, 14, o 15, y el ejemplo "Perfiles de Antigenicidad"). Inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes y proteínas Tag5 expresadas en mamíferos y proteínas de fusión lgG FC humanas y murinas. Además, las células que expresan altos niveles de 158P1D7, tales como células 293T-158P1D7 son utilizadas para inmunizar ratas.

A fin de generar mAbs para 158P1D7, primero se inmunizan los ratones vía intraperitoneal (IP) normalmente con 1050 Ig de inmunógeno de proteína o 107 células que expresan 158P1D7 mezclados en adyuvante de Freund completo. Posteriormente los ratones son inmunizadas vía IP cada 2-4 semanas normalmente con 10-50 Ig de inmunógeno de proteína o 107 células mezcladas en adyuvante de Freund incompleto. Alternativamente se puede utilizar el adyuvante MPL-TDM en las inmunizaciones. Además de las estrategias anteriores de inmunización basadas en proteínas y células, se puede emplear un protocolo de inmunización basado en ADN, en el que se utiliza un vector de expresión de mamíferos que codifica la secuencia 158P1D7 para inmunizar ratones por inyección directa de ADN de plásmido. Por ejemplo, el dominio extracelular de 158P1D7, aminoácidos 1-614, es clonado en el vector de secreción de mamíferos Tag5 y el vector recombinante es utilizado como inmunógeno. En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 250-385 de 158P1D7 (que el análisis de secuencia prevé será antigénico, véase la Figura 11, 12, 13, 14 o 15) es clonada en el vector de secreción de fusión Fc, en el que la secuencia 158P1D7 está fusionada en el extremo amino a una secuencia líder IgK y en el extremo carboxilo a la secuencia codificadora de la región IgG Fc murina o humana. Este vector recombinante luego es utilizado como inmunógeno. Los protocolos de inmunización de plásmido se utilizan en combinación con proteínas purificadas expresadas desde el mismo vector y con células que expresan 158P1D7.

Durante el protocolo de inmunización se toman muestras de sangre de 7 a 10 días después de la inyección para controlar la titulación y especificidad de la respuesta inmunitaria. Una vez se han obtenido la reactividad y especificidad apropiadas, determinadas por ELISA, se efectúan análisis Western blot, de inmunoprecipitación, por microscopio fluorescente y citometría de flujo, así como generación de fusión y de un hibridoma con los procedimientos establecidos bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).

En una realización para generar anticuerpos monoclonales 158P1D7, una proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST) que codifica los aminoácidos 250-385 de la proteína 158P1D7 es expresada y purificada. Luego se emplea un fragmento de segmentación que codifica aminoácidos específicos de 158P1D7 como inmunógeno, donde se elimina la GST por proteólisis de sitio específico. Inicialmente se inmuniza a ratones Balb C vía intraperitoneal con 25 Ig de proteína de segmentación 158P1D7 mezclada en adyuvante completo de Freund. Posteriormente, los ratones son inmunizadas cada dos semanas con 25 Ig de proteína de segmentación 158P1D7 mezclada en adyuvante incompleto de Freund hasta un total de tres inmunizaciones. Se determina la titulación del suero de los ratones inmunizadas por ELISA utilizando la longitud total de la proteína de fusión-GST y el inmunógeno segmentado. La reactividad y especificidad del suero en la longitud total de la proteína 158P1D7 son controladas por análisis Western blot, inmunoprecipitación y citometría de flujo utilizando células 293T transfectadas con un vector de expresión que codifica el ADNc 158P1D7 (véase, el Ejemplo: "Producción de 158P1D7 Recombinante en Sistemas Eucarióticos”). También son utilizadas otras células que expresan 158P1D7 recombinante o que expresan endógenamente 158P1D7. Se deja a los ratones que muestran la reactividad más fuerte en reposo y se les administra una inyección final de proteína de segmentación 158P1D7 en PBS y posteriormente, cuatro días más tarde, son sacrificados. Los bazos de los ratones sacrificados se recogen y fusionan con células de mieloma SPO/2 utilizando los procedimientos habituales (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de los pocillos tras la selección HAT son analizados por ELISA, Western blot, inmunoprecipitación, microscopio fluorescente y citometría de flujo a fin de identificar los clones productores de anticuerpos específicos 158P1D7.

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal 158P1D7 es determinada utilizando tecnologías convencionales. Las mediciones de afinidad cuantifican la fuerza del anticuerpo frente a una unión de epítope y se utilizan para determinar qué anticuerpos monoclonales 158P1D7 son preferentes para su uso diagnóstico o terapéutico, como se aprecia en una de las prácticas de la técnica. El sistema BIAcore (Uppsala, Sweden) es un procedimiento preferido para determinar la afinidad de unión. El sistema BIAcore utiliza resonancia de plasmón superficial (SPR, Welford K.

1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295:268) para controlar las interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis BIAcore genera convenientemente coeficientes de asociación, coeficientes de disociación, coeficientes de disociación de equilibrio y coeficientes de afinidad.

Ejemplo 10: EnsaYos de Uni6n HLA Clase I Y Clase II

Los ensayos de Unión HLA Clase I y Clase II que utilizan moléculas HLA purificadas son efectuados de acuerdo con los protocolos descritos (por ejemplo en las publicaciones PCT WO 94/20127 Y WO 94/03205; Sidney y col., Current Protoco/s in Immuno/ogy18.3.1 (1998); Sidney y col., J. Immuno/. 154:247 (1995); Sette y col., Mo/. Immuno/. 31:813 (1994)). En resumen, las moléculas purificadas MHC (5 a 500 nM) son incubadas con varios inhibidores de péptido sin marcar y péptidos sonda 1-10nM 125I-radiomarcados, tal como se describe. Después de la incubación, los complejos MHC-péptido son separados del péptido libre por filtración en gel y se determina la fracción de combinado peptídico. Normalmente, en experimentos preliminares, cada preparado MHC es titulado en presencia de cantidades fijas de péptido radiomarcado para determinar la concentración de moléculas necesarias para unir de un 10 a un 20% de la radioactividad total. Todos los ensayos posteriores de unión directa y de inhibición son efectuados utilizando dichas concentraciones de HLA.

Bajo estas condiciones [label]<[HLA] y CI50�[HLA], los valores medidos CI50 son aproximaciones razonables a los valores reales KD. Normalmente, los inhibidores del péptido son analizados en concentraciones que oscilan entre 120 Ig/ml y 1,2 ng/ml, y son analizados en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para comparar los datos obtenidos en diferentes experimentos, se calcula una cifra de unión relativa para cada péptido, dividiendo la CI50 de un control positivo de inhibición entre la CI50 de cada péptido analizado (normalmente versiones sin marcar del péptido sonda radiomarcado). Se compilan los valores relativos de unión a fin de poder ser consultados en bases de datos y para poder efectuar comparaciones inter-experimentales. Posteriormente estos valores pueden ser convertidos en valores CI50 nM dividiendo el CI50 mM de los controles de inhibición positivos entre la unión relativa del péptido de interés. Este es un procedimiento de compilación de datos preciso y sistemático para comparar péptidos que han sido analizados en diferentes días o con diferentes cantidades de MHC purificado.

Pueden llevarse a cabo ensayos de unión, tal como se ha explicado anteriormente, para analizar los péptidos portadores de motivos HLA y/o de supermotivos HLA.

Ejemplo 11: Identificaci6n de Epitopes Candidatos CTL portadores de Motivos Y Supermotivos HLA

Las composiciones de vacuna HLA de la invención pueden incluir múltiples epítopes. Los múltiples epítopes pueden comprender múltiples supermotivos o motivos HLA para abarcar una amplia muestra de la población. Este ejemplo ilustra la identificación y confirmación de los epítopes portadores de motivos y supermotivos que se incluyen en dicha composición de vacuna. El cálculo de la población se efectúa utilizando la estrategia descrita abajo.

Búsquedas automatizadas y algoritmos para la identificación de epítopes portadores de supermotivos y/o motivos

Las búsquedas efectuadas para identificar la secuencia de péptido portador de los motivos del ejemplo "Perfiles de Antigenicidad” y Tablas V-XVIII emplean los datos de secuencia proteínica del producto génico de 158P1D7 expuesto en las Figuras 2 y 3.

Las búsquedas automatizadas de epítopes portadores de supermotivos o motivos HLA Clase I o Clase II se efectúan de la siguiente forma. Todas las secuencias de la proteína 158P1D7 traducidas son analizadas utilizando un programa de búsqueda de cadena de texto para identificar las posibles secuencias peptídicas que contienen motivos de unión HLA apropiados; dichos programas son producidos fácilmente de acuerdo con la información de la técnica según las descripciones conocidas motivo/supermotivo. Además dichos cálculos se pueden efectuar mentalmente.

Las secuencias identificadas supermotivo A2-, A3- y DR- son marcadas utilizando algoritmos polinómicos para predecir su capacidad de unión a moléculas específicas HLA Clase I o Clase II. Estos algoritmos polinómicos explican el efecto de diferentes aminoácidos en diferentes posiciones y están esencialmente basados en la premisa de que la afinidad general (o �G) de las interacciones moleculares péptido HLA se puede aproximar como una función polinómica lineal del tipo:

“�G”= a1i x a2i x a3i..... x ani

donde aji es un coeficiente que representa el efecto de la presencia de un aminoácido dado (j) en una posición dada

(i) a lo largo de la secuencia de un péptido de n aminoácidos. La principal hipótesis de este procedimiento es que los efectos en cada posición son esencialmente independientes unos de otros (es decir, unión independiente de cadenas laterales individuales). Cuando el residuo j aparece en una posición en el péptido, se presume que aporta una cantidad constante ji a la energía libre de unión del péptido, independientemente de la secuencia peptídica restante.

El procedimiento de derivación de coeficientes algorítmicos específicos ha sido descrito en Gulukota y col., J. Mo/. Bio/. 267:1258-126, 1997; (véase también Sidney y col., Hu man Immuno/. 45:79-93, 1996; y Southwood y col., J. Immuno/. 160: 3363-3373, 1998). En resumen, para todas las posiciones i de anclaje y no anclaje por igual, la media

geométrica de la unión relativa media (ARB) de todos los péptidos que llevan j se calcula con relación al resto del grupo y se utiliza como estimación para ji. Para los péptidos de Clase II, si son posibles múltiples alineaciones, solamente es utilizada la alineación más marcada, siguiendo un procedimiento iterativo. Para calcular la marcación algorítmica de un péptido dado en un análisis determinado, los valores ARB correspondientes a la secuencia del péptido se multiplican. Si este resultado excede el umbral elegido, se prevé que el péptido se una. Los umbrales apropiados son elegidos en función del grado de rigor de la predicción deseada.

Selección de péptidos de reacción cruzada supertipo HLA-A2

Secuencias proteínicas completas de 158P1D7 son escaneadas utilizando un programa de identificación motivo para identificar Secuencias 8- 9- 10- y 11-mer que contienen la especificidad principal de anclaje HLA-A2. Normalmente estas secuencias son marcadas utilizando el protocolo descrito arriba y los péptidos correspondientes a las secuencias con marca positiva son sintetizados y analizados para observar su capacidad de unir moléculas purificadas HLA-A*0201 in vitro (HLA-A*0201 es considerada una molécula prototipo A2 supertipo).

Estos péptidos luego son analizados para ver su capacidad de unirse a más moléculas A2-supertipo (A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802). Los péptidos que unen al menos tres de los cinco alelos supertipo-A2 analizados normalmente son considerados ligantes de reacción cruzada A2-supertipo. Los péptidos preferidos se unen con una afinidad igual o inferior a 500 nM a tres o más moléculas HLA-A2 supertipo.

Selección de epítopes portadores de supermotivo HLA-A3

La secuencia de la proteína 158P1D7 escaneada anteriormente es también examinada para ver la presencia de péptidos con anclajes primarios supermotivo HLA-A3. Los péptidos correspondientes a las secuencias portadoras del supermotivo HLA A3 luego son sintetizadas y analizadas para ver la unión a las moléculas HLA-A*0301 y HLAA*1101, las moléculas codificadas por los dos alelos A3-supertipo prevalentes. Los péptidos que unen al menos uno de los dos alelos con afinidades de unión �500 nM, frecuentemente �200 nM, luego son analizados para ver la reactividad cruzada de unión a los otros alelos habituales A3-supertipo (por ejemplo, A*3101, A*3301, y A*6801) para identificar a los que pueden unir al menos tres de las cinco moléculas HLA-A3-supertipo analizadas.

Selección de epítopes portadores de supermotivo HLA-B7

La proteína 158P1D7 es también analizada para ver la presencia de péptidos 8-, 9- 10-, o 11-mer con supermotivo HLA-B7. Los péptidos correspondientes son sintetizados y analizados para ver la unión a HLA-B*0702, molécula codificada por el alelo B7 supertipo más habitual (o sea el alelo supertipo B7 prototipo). Los péptidos que unen B*0702 con CI50 de �500nM son identificados utilizando procedimientos convencionales. Luego se analizan estos péptidos para ver la unión a otras moléculas habituales B7-supertipo (por ejemplo B*3501, B*5101, B*5301 y B*5401). Así se identifican los péptidos capaces de unirse a tres o más de los cinco alelos B7-supertipo analizados.

Selección de epítopes portadores de motivo A1 y A24

Para aumentar la población estudiada, los epítopes HLA-A1 y -A24 son también incorporados en las composiciones de la vacuna. También se puede efectuar un análisis de la proteína 158P1D7 para identificar las secuencias que contienen los motivos HLA-A1- y A24.

Los epítopes de unión de alta afinidad y/o de reacción cruzada portadores de otros motivos y/o supermotivos son identificados utilizando una metodología análoga.

Ejemplo 12: Confirmaci6n de la inmunogenicidad

Los péptidos candidatos portadores de supermotivos CTL A2 de reacción cruzada que son identificados como se describe en este documento son seleccionados para confirmar la inmunogenicidad in vitro. La confirmación se lleva a cabo utilizando la metodología siguiente:

Líneas Celulares Diana para Estudio Celular Selectivo:

La línea celular .221A2.1, producida mediante transferencia del gen HLA-A2.1 a la línea celular 721.221 de Blinfoblastoide humano-mutante nulo HLA-A, -B, -C es utilizada como blanco cargado de péptido para medir la actividad de CTL limitada por HLA-A2.1. Esta línea celular se cultiva en un medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales y 10% (v/v) de FCS inactivado por calor. Las células que expresan un antígeno de interés o transfectantes que comprenden el gen que codifica el antígeno de interés pueden ser utilizadas como células diana para confirmar la capacidad de CTLs péptidos específicos para reconocer antígenos endógenos.

Cultivos de inducción CTL primarios:

Generaci6n de Ce/u/as Dendftricas (DC): Se descongelan PBMCs en RPMI con 30 Ig/ml de ADNsa, se lavan dos veces y se vuelven a suspender en un medio completo (RPMI-1640 más el 5% de suero humano AB, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, L-glutamina y penicilina/estreptomicina). Los monocitos son purificados por cultivo en

placas 10 x 106 PBMC/pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de dos horas a 37ºC, las células no adherentes son eliminadas agitando suavemente las placas y se aspiran los sobrenadantes. Los pocillos se lavan 3 veces con 30 ml de RPMI para eliminar la mayoría de las células no adherentes y poco adherentes. Luego se añade a cada pocillo 3 ml de medio completo que contiene 50 ng/ml de GM-CSF y 1.000 U/ml de IL-4.Se añade TNFa a las DCs el sexto día, a 75 ng/ml, y se utilizan las células para cultivos de inducción CTL el séptimo día.

Inducci6n de Cn con DC y Peptid o: Se aislan células CD8+T por selección positiva con perlas Dynal inmunomagnéticas (Dynabeads® M-450) y con reactivo detacha-bead®. Normalmente se procesan alrededor de 200-250x106 PBMC para obtener 24x106 células CD8+T (suficiente para un cultivo de placas de 48 pocillos). En resumen, se descongelan PBMCs en RPMI con 30Ig/ml de ADNsa, se lavan una vez con PBS que contiene 1% de suero humano AB y se vuelven a suspender en PBS/1% de suero AB en una concentración de 20x106 células/ml. Las perlas magnéticas se lavan 3 veces con suero PBS/AB, se añaden a las células (140 Il de perlas/ 20x106 de células) y se incuban durante 1 hora a 4ºC mezclándolas continuamente. Se lavan las perlas y las células cuatro veces con PBS/suero AB para eliminar las células no adherentes y se vuelven a suspender, en una proporción de 100x106 células/ml (en base al número de células original), en suero PBS/AB que contiene 100Il/ml de reactivo detacha-bead® y 30 Ig/ml de ADNsa. La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente mezclándola continuamente. Se lavan las perlas de nuevo con PBS/AB/ADNsa para recoger las células CD8+T. Se recogen las DC y se centrifugan a 1.300 rpm durante 5-7 minutos, se lavan una vez más con PBS que contiene 1% BSA, se cuentan y pulsan con 40 Ig/ml de péptido a una concentración celular de 1-2 x 106/ml en presencia de 3 Ig/ml de �2microglobulina durante 4 horas a 20ºC. Las DC luego son irradiadas (4.200 rads), lavadas una vez con el medio y contadas de nuevo.

Preparaci6n de cu/tivos de inducci6n: 0,25 ml de DC generada por citoquina a (1 x 105 células/ml) son cultivadas con 0,25 ml de células CD8+T (2 x 106 células/ml) en cada pocillo de una placa de 48 pocillos, en presencia de 10 ng/ml de IL-7. Se añade IL-10 humano recombinante al día siguiente a una concentración final de 10 ng/ml y se añade IL-2 rhumano 48 horas después a 10 IU/ml.

Reestimu/aci6n de /os cu/tivos de inducci6n con ce/u/as adherentes pu/sadas con peptido: Siete y catorce días de después de la primera inducción, las células son reestimuladas con células adherentes pulsadas con péptido. Las PBMCs son descongeladas y lavadas dos veces con RPMI y ADNsa. Las células son resuspendidas en una proporción de 5 x 106 células/ml e irradiadas a ~4.200 rads. Las PBMCs se cultivan en placa en una proporción de 2 x 106 en 0,5 ml de medio completo por pocillo y se incuban durante dos horas a 37ºC. Las placas se lavan dos veces con RPMI golpeando ligeramente la placa para eliminar las células no adherentes y las células adherentes son pulsadas con 10 Ig/ml de péptido en presencia de 3 Ig/ml de ß2-microglobulina en 0,25 ml de RPMI/5% de AB por pocillo durante dos horas a 37ºC. La solución de péptido de cada pocillo es aspirada y los pocillos lavados una vez con RPMI. La mayoría del medio es aspirada de los cultivos de inducción (células CD8+) y llevada a 0,5 ml con medio fresco. Luego las células son transferidas a los pocillos que contienen las células adherentes pulsadas con péptido. Veinticuatro horas más tarde, se añade IL-10 humano recombinante a una concentración final de 10 ng/ml y al día siguiente se añade IL2 humano recombinante y de nuevo 2 a 3 días más tarde a una concentración de 50 IU/ml (Tsai y col., Critica / R eviews in I mmuno/ogy 18(1-2):65-75, 1998). Siete días más tarde, los cultivos son analizados para ver la actividad CTL en un ensayo de liberación de 51Cr. En algunos experimentos se analizan los cultivos para reconocer el péptido-específico por IFNyELISA in situ en la segunda reestimulación seguida por análisis de reconocimiento endógeno siete días más tarde. Después de la expansión se mide la actividad en ambos ensayos para efectuar una comparación simultánea.

Medición de la actividad lítica CTL por liberación de 51Cr

Siete días después de la segunda reestimulación se determina la citotoxicidad en un ensayo de liberación de 51Cr convencional (5 horas) analizando los pocillos individuales en un solo E:T. Se preparan blancos pulsados con péptidos incubando los pocillos con 10 Ig/ml de péptido toda la noche a 37ºC.

Las células diana adherentes son eliminadas del frasco de cultivo con tripsina–EDTA; y son marcadas con 200 ICi de cromato sódico 51Cr (Dupont, Wilmington, DE) durante 1 hora a 37ºC. Las células diana marcadas son resuspendidas a 106 por ml y diluidas en una proporción 1:10 con células K562 a una concentración de 3,3 x 106/ml (línea celular eritroblastoma sensible a NK utilizada para reducir la lisis no específica). Las células diana (100 Il) y los efectores (100 Il) son cultivados en placas de base redonda de 96 pocillos e incubadas durante 5 horas a 37ºC. En ese momento, se recogen 100 Il de sobrenadante de cada pocillo y se determina la lisis según la fórmula [(cpm de la muestra de análisis - cpm de la muestra de liberación de 51Cr espontánea)/(cpm de la muestra de liberación de 51Cr máxima - cpm de la muestra de liberación de 51Cr)] x 100.

La liberación máxima y espontánea se determina incubando los blancos marcados con Trition X-100 1% y los medios solos, respectivamente. Se define un cultivo positivo como aquel en el que la lisis específica (muestraprocedencia) es un 10% o más en el caso de pocillos individuales o un 15% o más en el caso de las dos mayores proporciones E:T al análisis de los cultivos.

Medición in situ de la Producción IFNy Humano como Indicador de Reconocimiento Péptido-Específico y Endógeno

Se recubrieron placas Immulon 2 con anticuerpos monoclonales IFNy anti-humano de rata (4 Ig/ml NaHCO3 0,1M, pH 8,2) durante toda la noche a 4ºC. Se lavan las placas con PBS libre de Ca2+, Mg2+/0,05% Tween 20 y se bloquean con PBS/10% FCS durante 2 horas, después de lo cual se añaden CTLs (100 Il/pocillos) y blancos (100 Il/pocillos) a cada pocillo, dejando pocillos vacíos para los modelos y huecos (que recibieron sólo medios). Las células diana, bien sean blancos pulsados con péptidos o endógenos, son utilizadas en una concentración de 1 x 106 células/ml. Las placas son incubadas durante 48 horas a 37ºC con CO2 5%.

Se añade IFN-gamma humano-recombinante a los pocillos estándar comenzando con 400 pg o 1.200 pg/100 microlitro/pocillo y la placa se incuba durante 2 horas a 37ºC. Se lavan las placas y se añaden 100 Il de anticuerpo monoclonal IFN-gamma anti-humano de rata biotinilado (2 microgramos/ml en PBS/3%FCS/0,05% Tween 20) y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de otro lavado, se añaden 100 microlitros de HRPestreptavidina (1:4.000) y se incuban las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavan las placas 6 veces con una solución tampón de lavado, 100 microlitros/pocillo de solución reveladora (TMB 1:1) y se deja que las placas evolucionen durante 5-15 minutos. Se detiene la reacción con 50 microlitros/pocillo de H3PO4 1M y se efectúa una lectura de la OD450. Se considera que un cultivo es positivo si la medición dio al menos 50 pg de IFNgamma/pocillo por encima de la base y dos veces el nivel base de expresión.

Expansión CTL

Aquellos cultivos que mostraban una actividad lítica específica frente a los blancos pulsados con péptidos y/o los blancos tumorales son expandidos durante un período de 2 semanas con anti-CD3. En resumen, se añaden 5 x 104 células CD8+ a 1 matraz T25 que contiene: 1 x 106 PBMC irradiado (4.200 rad) (autólogo o alogénico) por ml, 2 x 105 células transformadas EBV irradiadas (8.000 rad) por ml y OKT3 (anti-CD3) 30 ng por ml en RPMI-1640 que contiene 10% (v/v) de suero AB humano, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, 25IM de 2-mercaptoetanol, Lglutamina y penicilina/estreptomicina. Se añade 1L2 humano recombinante 24 horas más tarde a una concentración final de 200 IU/ml y después de eso, cada tres días, se añade medio fresco 50 IU/ml. Las células son divididas si la concentración celular excede 1 x 106/ml y los cultivos son analizados entre los días 13 y 15 en una proporción E:T 30, 10, 3 y 1:1 en el ensayo de liberación de 51Cr o en 1 x 106/ml en el ensayo de IFNy in situ utilizando los mismos blancos que antes de la expansión.

Los cultivos son expandidos en ausencia de anti-CD3+ de la siguiente forma. Se seleccionan los cultivos que muestran actividad lítica frente a los blancos péptido y endógeno y se añaden 5 x 104 células CD8+ a un matraz T25 que contiene lo siguiente: 1 x 106 PBMC autólogo por ml pulsado con 10 Ig/ml de péptido durante 2 horas a 37ºC e irradiados (4.200 rad); 2 x 105 células transformadas EBV irradiadas (8.000 rad) por ml de RPMI-1640 que contiene un 10% (v/v) de suero AB humano, AA no esenciales, piruvato sódico, 25mM 2-ME, L-glutamina y gentamicina.

Inmumogenicidad de péptidos portadores de supermotivos A2

En un ensayo celular se analizan péptidos de unión de reacción cruzada supermotivo A2 para ver la capacidad de inducir CTLs péptido-específicos en individuos normales. En este análisis normalmente se considera que un péptido es un epítope si induce CTLs péptido-específicos al menos en individuos y preferiblemente si también reconoce el péptido expresado endógenamente.

También se puede confirmar la inmunogenicidad utilizando PBMCs aisladas de pacientes tumorales que expresan 158P1D7. En resumen, las PBMCs se aislan de pacientes, se reestimulan con monocitos pulsados con péptidos y se analizan para ver la capacidad de reconocer células diana pulsadas con péptido así como de células transfectadas que expresan endógenamente el antígeno.

Evaluación de inmunogenicidad A*03/A11

También se puede evaluar la inmunogenicidad de los péptidos de unión de reacción cruzada portadores de supermotivos HLA-A3 utilizando una metodología análoga a la utilizada para evaluar la inmunogenicidad de los péptidos supermotivo HLA-A2.

Evaluación de la inmunogenicidad B7

El estudio selectivo de inmunogenicidad de los péptidos de unión de reacción cruzada B7-supertipo identificados en este documento se confirma de modo análogo a la confirmación de los péptidos portadores de supermotivos A2-y A3.

También se confirma la inmunogenicidad de los péptidos portadores de otros supermotivos/motivos, por ejemplo: HLA-A1, HLA-A24 etc, utilizando una metodología similar.

Ejemplo 13: Implementaci6n del Supermotivo Extendido para Mejorar la Capacidad de Uni6n de los Epitopes Nativos Creando Analogos

Los motivos y supermotivos HLA (que comprenden residuos primarios y/o secundarios) son útiles para identificar y preparar péptidos nativos de alta reacción cruzada, como se demuestra en este documento. Además la definición de motivos y supermotivos HLA permite también diseñar epítopes de alta reacción cruzada identificando residuos dentro de una secuencia de péptidos nativos que pueden ser analogados para dar al péptido determinadas características, por ejemplo mayor reactividad cruzada dentro del grupo de moléculas HLA que comprenden un supertipo y/o mayor afinidad de unión para algunas o todas de estas moléculas HLA. En este ejemplo se describen ejemplos de péptidos por analogía que muestran una afinidad de unión modulada.

Analogía en Residuos de Anclaje Primarios

Se implementan estrategias de diseño de péptidos para incrementar la reactividad cruzada de los epítopes. Por ejemplo, se alteran los principales anclajes de los péptidos portadores de supermotivos A2 para introducir un L, I, V

o M preferido en posición 2 y I o V en el extremo C.

Para analizar la reactividad cruzada de los péptidos análogos, en primer lugar se analiza la unión de cada análogo diseñado al alelo supertipo A2 prototipo A*0201, entonces, si la capacidad de unión de A*0201 se mantiene, se analiza la reactividad cruzada A2- supertipo.

Alternativamente, se confirma que un péptido se une a uno o todos los supertipos y luego se analoga para modular la afinidad de unión a uno (o más) supertipos a fin de aumentar el campo de aplicación en la población.

La selección de análogos en un estudio celular selectivo de inmunogenicidad normalmente está limitada por la capacidad del péptido de tipo salvaje parental (WT) para unir, al menos débilmente, por ejemplo a un IC50 de 5.000 nM o inferior, a tres de más alelos supertipo A2. La razón fundamental de este requisito es que los péptidos WT deben estar presentes endógenamente en una cantidad suficiente para que sean relevantes desde el punto de vista biológico. Se ha demostrado que las células T específicas del epítope parental aumentan la inmunogenicidad y la reactividad cruzada de los péptidos análogos (véase por ejemplo Parkhurst y col, J. Imm uno/. 157:2539, 1996; y Pogue y col., Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 92:8166, 1995).

En el estudio celular selectivo de estos péptidos análogos es importante confirmar que los CTLs análogos específicos también son capaces de reconocer el péptido tipo salvaje y, cuando es posible, las células diana que expresan el epítope endógenamente.

Analogía de Péptidos Portadores de Supermotivos B7 y HLA-A3

Los análogos de los epítopes portadores de supermotivos HLA-A3 se generan utilizando estrategias similares a las empleadas para los péptidos portadores de supermotivos HLA-A2. Por ejemplo, se manipulan los péptidos que se unen a 3/5 de las moléculas A3-supertipo en los residuos de anclaje primario para poseer un residuo preferido (V, S, M o A) en posición 2.

Los péptidos análogos son entonces analizados para ver su capacidad de unir A*03 y A*11 (alelos supertipo A3 prototipo). Los péptidos que muestran una capacidad de unión 500 nM, se confirma luego que tienen una reactividad cruzada A3-supertipo.

Al igual que los péptidos portadores de motivos A2 y A3, los péptidos que unen 3 o más alelos supertipo B7 pueden mejorarse, en lo posible, para obtener un aumento de la unión de reacción cruzada o una afinidad de unión o una vida media de unión mayor. Por ejemplo, se manipulan los péptidos portadores de supermotivos B7 para poseer un residuo preferido (V, I, L, o F) en la posición de anclaje primaria en el extremo C, tal como demostró Sidney y col. (J. Immuno/. 157:3480-3490, 1996).

La analogía en los residuos de anclaje primarios de otros epítopes portadores de motivos y/o supermotivos se lleva a cabo de manera similar.

Después se confirma la inmunogenicidad de los péptidos análogos, normalmente en un ensayo de estudio celular selectivo. De nuevo, en general, es importante demostrar que los CTLs análogos-específicos son también capaces de reconocer el péptido de tipo salvaje y, si es posible, blancos que expresen endógenamente el epítope.

Analogía en los Residuos de Anclaje Secundarios

Además, los supermotivos HLA son de gran valor en el diseño de péptidos de alta reacción cruzada y/o de péptidos que unen moléculas HLA con mayor afinidad identificando residuos particulares en posiciones de anclaje secundarias asociadas a dichas propiedades. Por ejemplo, se analiza la capacidad de unión de un péptido portador del supermotivo B7 con un residuo F en posición 1. Luego el péptido es analogado, por ejemplo, para sustituir L por F en tal posición 1. Se evalúa el aumento de la afinidad de unión, la vida media de unión y/o el aumento de reactividad cruzada del péptido analogado. Dicho procedimiento asocia péptidos analogados con propiedades mejoradas.

También se puede analizar la inmunogenicidad de los análogos diseñados con capacidad de unión suficientemente mejorada o con reactividad cruzada en ratones transgénicas HLA-B7, por ejemplo: inmunizando IFA o con un lipopéptido. Además se puede analizar la capacidad de estimular una respuesta de memoria utilizando PBMCs de pacientes con tumores que expresan 158P1D7.

Otras estrategias de Analogía

Otra forma de analogar péptidos no relacionada con las posiciones de anclaje implica la sustitución de una cisteína por ácido a-aminobutírico. Debido a su naturaleza química, la cisteína es propensa a formar puentes bisulfuro, alterando lo suficiente la estructura del péptido como para reducir su capacidad de unión. La sustitución de ácido aaminobutírico por cisteína no sólo evita este problema, sino que también se ha demostrado que mejora las capacidades de unión y de unión cruzada en algunos ejemplos (véase por ejemplo la reseña de Sette y col., en: Persistent Viral Infections, Eds. R. Ahmed and I. Chen, John Wiley & Sons, England, 1999).

De este modo, mediante el uso de sustituciones únicas de aminoácidos, pueden modularse las propiedades de unión y/o la reactividad cruzada de los ligandos peptídicos de las moléculas HLA supertipo.

Ejemplo 14: Identificaci6n Y Confirmaci6n de Secuencias Derivadas de 15BP1D7 con Motivos de Uni6n HLA

Se identifican y confirman epítopes de péptidos portadores de motivo o supermotivo HLA clase II, tal como se describe abajo, utilizando una metodología similar a la descrita para los péptidos HLA clase I.

Selección de epítopes que portan el supermotivo HLA-DR

Para identificar epítopes derivados de 158P ID7 o epítopes HLA clase II HTL, se analiza la presencia de secuencias portadoras de motivos o supermotivos HLA-DR en el antígeno. Concretamente, se seleccionan secuencias 15-mer que comprenden un supermotivo DR, que comprende un núcleo 9-mer, y regiones flanqueantes de 3 residuos N y C terminales (en total 15 aminoácidos).

Se han elaborado protocolos para predecir la unión de los péptidos a moléculas DR (Southwood y col., J. Immuno/. 160:3363-3373, 1998). Dichos protocolos específicos para moléculas individuales DR permiten marcar y clasificar las regiones del núcleo 9-mer. Cada protocolo no marca únicamente las secuencias de péptidos para ver la presencia de anclajes primarios supermotivo DR (es decir, en posición 1 y posición 6) dentro del núcleo 9-mer, sino que además evalúa las secuencias para ver la presencia de anclajes secundarios. Utilizando las tablas de selección alelo-específicas (véase por ejemplo Southwood y col., ibid.), se ha visto que estos protocolos seleccionan eficazmente las secuencias de péptido con una alta probabilidad de unir una molécula DR particular. Además se ha visto que llevando a cabo estos protocolos conjuntamente, concretamente los protocolos DR1, DR4w4 y DR7, se pueden seleccionar eficazmente péptidos de reacción cruzada DR.

Se analiza la capacidad de unión de los péptidos derivados de 158P1D7 arriba identificados para ver su capacidad de unión a varias moléculas comunes HLA-DR. En primer lugar se analiza la unión de todos los péptidos a las moléculas DR en el panel primario: DR1, DR4w4 y DR7. Se analiza la unión de los péptidos que unen al menos dos de éstas tres moléculas DR a DR2w2 �1, DR2w2 �2, DR6w19 y DR9 en ensayos secundarios. Finalmente, se analiza la unión de los péptidos que unen al menos dos de las cuatro moléculas DR del panel secundario y, por tanto, al menos cuatro de las siete moléculas DR diferentes, a moléculas DR4w15, DR5w11 y DR8w2 en ensayos terciarios. Los péptidos que unen al menos siete de las diez moléculas DR, que comprenden los ensayos celulares selectivos primario, secundario y terciario son considerados ligantes DR de reacción cruzada. Los péptidos derivados de 158P1D7 que se demuestra se unen a los alelos comunes HLA-DR son de particular interés.

Selección de Péptidos Motivo DR3

Al ser HLA-DR3 un alelo que predomina en la población Caucásica, Negra e Hispánica, la capacidad de unión DR3 constituye un criterio relevante para la selección de epítopes HL3. Por tanto, también se pueden analizar la capacidad de unión a DR3 de los péptidos candidatos. Sin embargo, en vista de la especificidad de unión del motivo DR3, los péptidos que se unen únicamente a DR3 también pueden considerarse candidatos a incluirse en una formulación para vacunas.

Para identificar eficazmente los péptidos que unen DR3, se analiza la secuencia de antígenos diana 158P1D7 que porta uno de los dos motivos de unión DR3 específico mencionados por Geluk y col. (J. Immuno/. 152:5742-5748, 1994). Luego se sintetizan los péptidos correspondientes y se confirma que tienen capacidad de unir DR3 con una afinidad de 1IM o mejor, es decir, inferior a 1 IM. Se localizan los péptidos que responden a este criterio de unión y se les califica como ligantes de alta afinidad HLA clase II.

Los epítopes de unión a DR3 así identificados se incluyen en composiciones para vacunas junto con epítopes de péptidos portadores de supermotivos DR.

Al igual que en el caso de los péptidos portadores de motivos HLA clase I, los péptidos portadores de motivos clase II son analogados para mejorar la afinidad o la reactividad cruzada. Por ejemplo, el ácido aspártico en la posición

cuatro de la secuencia central 9-mer es un residuo óptimo para la unión DR3, y la sustitución de ese residuo a menudo mejora la unión de DR3.

Ejemplo 15: Inmunogenicidad de los Epitopes HTL derivados de 15BPID7

Este ejemplo establece los epítopes portadores de motivos DR3 y supermotivos DR inmunogénicos entre los identificados utilizando la metodología descrita en este documento.

La inmunogenicidad de los epítopes HTL se confirma de manera análoga a como se determina la inmunogenicidad de los epítopes CTL, valorando la capacidad de estimular respuestas HTL y/o utilizando modelos de ratones transgénicas apropiadas. La inmunogenicidad se determina mediante un estudio celular selectivo de: 1) la inducción primaria in vitro que emplea PBMCs normales o 2) la respuesta de memoria de pacientes que tienen tumores que expresan 158P1D7.

Ejemplo 16: Calculo de las Frecuencias Fenotipicas de supertipos HLA de varias Procedencias etnicas para Determinar la Amplitud de Poblaci6n Estudiada

Este ejemplo ilustra la valoración sobre la amplitud de población estudiada de una composición de vacuna que consta de múltiples epítopes que comprenden múltiples supermotivos y/o motivos.

Para analizar la población estudiada se determinan las frecuencias génicas de los alelos HLA. Las frecuencias génicas de cada alelo HLA se calculan a partir de las frecuencias antigénicas o de alelo utilizando fórmulas de distribución binomiales gf=1-(SQRT(1-af)) (véase por ejemplo Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93, 1996). Para obtener frecuencias fenotípicas generales se calculan las frecuencias génicas acumulativas y las frecuencias antigénicas acumulativas derivadas del uso de la fórmula inversa [af=1-(1-Cgf)2].

Cuando no se dispone de los datos de frecuencia del nivel de tipificación del ADN, se presupone una correspondencia con las frecuencias antigénicas definidas serológicamente. Para poder abarcar a toda la posible población supertipo, se presupone que no hay desequilibrio de segregación y únicamente se incluyen los alelos que se confirma pertenecen a cada supertipo (estimación mínima). La estimación de la amplitud de población estudiada obtenida por combinaciones inter-locus se realiza añadiendo a la población A estudiada la proporción de población A no estudiada que se supone sería estudiada según los alelos B considerados (por ejemplo, total=A+B*(1-A)). Los supertipos confirmados de tipo A3 son A3, A11, A31, A*3301 y A*6801. Aunque el supertipo de tipo A3 puede también incluir A34, A66 y A*7401, dichos alelos no se incluyeron en los cálculos de frecuencia general. Asimismo, la familia de supertipos de tipo A2 confirmados son A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901. Por último, alelos supertipo de tipo B7 confirmados son B7, B*3501-03, B51, B*5301, B*5401, B*5501-2, B*5601, B*6701 y B*7801 (posiblemente también B*1401, B*3504-06, B*4201 y B*5602).

La población estudiada que se logra combinando los supertipos A2-, A3-y B7 es de aproximadamente el 86% en cinco de los cinco grupos étnicos. La población estudiada se puede extender incluyendo los péptidos portadores de los motivos A1 y A24. De media, A1 está presente en el 12% y A24 en el 29% de la población de los cinco diferentes grupos étnicos más importantes (el Caucasiano, Norteamericano, Negro, Chino, Japonés e Hispánico). Juntos, estos alelos representan una frecuencia media del 39% en esta misma población étnica. La población total estudiada en las principales etnias cuando se combinan A1 y A24 con los alelos estudiados A2-, A3- y A7- supertipo es > 95%. Se puede utilizar un procedimiento análogo para estimar la población estudiada que se logra con combinaciones de epítopes portadores de motivos clase II.

Los estudios de inmunogenicidad en humanos (por ejemplo Bertoni y col., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Doolan y col., Immunity 7:97, 1997; y Threlkeld y col., J. Immunol. 159:1648, 1997) han demostrado que los péptidos de unión de alta reacción cruzada se reconocen casi siempre como epítopes. El uso de péptidos de unión de alta reactividad cruzada constituye un importante criterio de selección para identificar epítopes candidatos a incluir en una vacuna que sea inmunogénica en una población diversa.

Con un número suficiente de epítopes (como se describe en este documento y en la técnica) se prevé que la población media estudiada sea superior al 95% en cada una de las cinco poblaciones étnicas principales estudiadas. El análisis de simulación Monte Carlo de la teoría del juego, conocido en esta técnica (véase por ejemplo Osborne,

M.J. y Rubinstein, A. "A course in game theory" MIT Press, 1994) se puede utilizar para estimar qué porcentaje de individuos de una población compuesta por grupos étnicos caucasianos, negros norteamericanos, japoneses, chinos e hispánicos reconocería los epítopes de vacunas descritos en este documento. Un porcentaje preferente es 90%, en especial 95%.

Ejemplo 17: Reconocimiento CTL de Antigenos Procesados End6genamente despues de la PreinYecci6n

Este ejemplo confirma que las CTLs inducidas por epítopes de péptidos nativos o análogos identificados y seleccionados como se describe en este documento reconocen endógenamente, por ejemplo, los antígenos nativos sintetizados.

Se reestimula in vitro células efectoras aisladas de ratones transgénicas que son inmunizadas con epítopes de péptidos, por ejemplo epítopes portadores de supermotivos HLA-A2, utilizando células estimuladoras recubiertas con péptidos. Seis días después, se analiza la citotoxicidad de las células efectoras y las líneas celulares que presentan actividad citotóxica péptido-específica se reestimulan adicionalmente. Otros seis días más tarde, se analiza la actividad citotóxica en células diana Jurkat-A2.1/Kb marcadas con 51Cr en ausencia o presencia de péptido, y también son analizadas en las células diana marcadas 51Cr portadoras de antígeno sintetizado endógenamente, es decir, células que son establemente transfectadas con vectores de expresión 158P1D7.

Los resultados demuestran que las líneas CTL obtenidas de animales preinyectados con epítopes del péptido reconocen el antígeno 158P1D7 sintetizado endógenamente. La elección del modelo de ratones transgénicas a utilizar en dicho análisis depende del(de los) epítope(s) que se ha(n) de evaluar. Además de ratones transgénicas HLA-A*0201/Kb, se han caracterizado otros modelos de rata transgénica que incluyen ratones con A11 humano (que se pueden utilizar para evaluar epítopes A3) y los alelos B7 y se están desarrollando otros (por ejemplo ratones transgénicas para HLA-A1 y A24). También se han desarrollado modelos de rata HLA-DR1 y HLADR3 que se pueden utilizar para evaluar epítopes HTL.

Ejemplo 1B: Actividad de los Epitopes Conjugados CTL-HTL en Ratones Transgenicas

Este ejemplo ilustra la inducción de CTLs y HTLs en ratones transgénicas, mediante el uso de un CTL derivado de 158P1D7 y de composiciones de vacunas con péptidos HTL. La composición de vacuna que se utiliza en este documento comprende los péptidos que se administran al paciente tumoral que expresa 158P1D7. La composición del péptido puede comprender múltiples epítopes CTL y/o HTL. Los epítopes son identificados utilizando la metodología descrita en este documento. Este ejemplo también ilustra que se puede lograr una mayor inmunogenicidad incluyendo uno o más epítopes HTL en una composición de vacuna CTL; dicha composición de péptido puede comprender un epítope HTL conjugado a un epítope CTL. El epítope CTL puede ser uno que una múltiples miembros de la familia HLA con una afinidad de 500 nM o menor, o análogos de ese epítope. Si se desea, los péptidos pueden ser lipidados.

Procedimientos de i nmunizaci6n: La inmunización de ratones transgénicas se realiza tal como se describe (Alexander y col., J.Immunol. 159:4753-4761, 1997). Por ejemplo, se inyecta subcutáneamente (en la base de la cola) a ratones A2/kb transgénicas para el alelo HLA A2.1 humano y que se utilizan para confirmar la inmunogenicidad de los epítopes portadores del supermotivo HLA-A*0201 o HLA-A2, con 0,1 ml de péptido en adyuvante de Freund Incompleto o, si la composición de péptido es un conjugado CTL/HTL lipidado, en DMSO/salina, o si la composición de péptido es un polipéptido, en PBS o adyuvante de Freund Incompleto. Siete días más tarde de la preinyección, los esplenocitos obtenidos de dichos animales son reestimulados con linfoblastos activados por LPS irradiados singénicos recubiertos con péptidos.

fneas ce/u/ares: Las células diana empleadas en los ensayos de citotoxicidad péptido-específica son células Jurkat transfectadas con un gen quimérico HLAA2.1/Kb (por ejemplo Vitiello y col., J. Exp. Med. 173:1007, 1991).

Activaci6n Cn in vitro: Una semana después de la preinyección, las células del bazo (30 x 106 células/frasco) se cocultivan a 37º C con linfoblastos recuertos con péptidos irradiados (3000 rads) singénicos (10 x 106 células/matraz) en 10 ml de medio de cultivo/matraz T25. Después de seis días se recogen las células efectoras y se analiza su actividad citotóxica

Ensayo de actividad citot6x ica: Se incuban células diana (1,0 a 1,5 x 106) a 37ºC en presencia de 200 Il de 51Cr. Después de 60 minutos, se lavan las células tres veces y se resuspenden en un medio R10. Se añade péptidos cuando sea necesario en una concentración de 1 Ig/ml. Para el ensayo se añaden 104 células diana marcadas con 51Cr a diferentes concentraciones de células (volumen final de 200 Il) en placas de 96 pocillos con base en forma de

U. Después de un período de seis horas de incubación a 37ºC, se eliminan 0,1 ml de la parte alícuota del sobrenadante de cada pocillo y se determina la radioactividad en un contador gamma automático Micromedic. Se determina el porcentaje específico de lisis mediante la fórmula: porcentaje de liberación específica = 100 x (liberación experimental- liberación espontánea) / (liberación máxima- liberación espontánea). Para facilitar la comparación entre los distintos ensayos CTL realizados bajo las mismas condiciones, el porcentaje de liberación de51Cr se expresa en unidades de lisis/106 células. Una unidad de lisis se define arbitrariamente como el número de células efectoras requerido para obtener un 30% de lisis en 10.000 células diana en un ensayo de liberación de 51Cr de seis horas. Para obtener unidades de lisis específicas/106, las unidades de lisis/106 obtenidas en ausencia de péptido son sustraídas de las unidades de lisis/106 obtenidas en presencia de péptido. Por ejemplo, si se obtiene un 30% de liberación de 51Cr en la proporción efector(E):diana(T) de 50:1 (es decir, 5 x 105 células efectoras por 10.000 células diana) en ausencia de péptido y 5:1 (es decir, 5 x 104 células efectoras por 10.000 células diana) en presencia de péptido, la lisis específica sería [(1/50.000)-(1/500.000)] x 106 = 18 LU.

Se analizan los resultados para evaluar la magnitud de las respuestas CTL de animales inyectados con el preparado de vacuna conjugado CTL/HTL inmunogénico y se comparan con la magnitud de las respuestas CTL logradas utilizando, por ejemplo, los epítopes CTL, tal como se describe arriba en el Ejemplo: “Confirmación de la Inmunogenicidad”. Se pueden efectuar análisis similares a este para confirmar la inmunogenicidad de los conjugados de péptidos que contienen múltiples epítopes CTL y/o múltiples epítopes HTL. De acuerdo con estos

procedimientos, se observa que se induce una respuesta CTL y que simultáneamente se induce una respuesta HTL con la administración de dichas composiciones.

Ejemplo 19: Selecci6n de Epitopes CTL Y HTL para Incluir en una Vacuna de 15BP1D7 Especifica

Este ejemplo ilustra un procedimiento para seleccionar epítopes de péptidos para las composiciones de vacuna de la invención. Los péptidos en la composición pueden estar en forma de secuencia de ácido nucleico, bien como una única secuencia o más de una secuencia (esto es un minigén) que codifica el(los) péptido(s) o pueden ser péptidos solos y/o poliepitópicos.

Cuando se seleccionan varios epítopes para incluir en una composición de vacuna se utilizan los siguientes principios. Se equilibra cada uno de estos principios a fin de hacer la selección.

Se seleccionan epítopes que, después de su administración, imitan respuestas inmunes que están correlacionadas con la eliminación de 158P1D7. El número de epítopes utilizados depende de las revisiones a pacientes que eliminen espontáneamente 158P1D7. Por ejemplo, se ha observado que los pacientes que eliminan espontáneamente 158P1D7 generan una respuesta inmune a al menos tres (3) de los antígenos 158P1D7, luego tres de los cuatro (3-4) epítopes deberían estar incluidos en la clase I de HLA. Un razonamiento similar se utiliza para determinar epítopes HLA de clase II.

A menudo se seleccionan epítopes que tienen una afinidad de unión con una CI50 de 500 nM o inferior a una molécula HLA de clase I o clase II, con una CI50 de 1.000 nM o inferior; o péptidos HLA Clase I con altos marcadores de unión según el sitio de internet BIMAS, en la URL bimas.dcrt.nih.gov/.

A fin de conseguir un campo de aplicación mayor de la vacuna en varias poblaciones, se seleccionan suficientes péptidos portadores de supermotivos o un conjunto suficiente de péptidos portadores de motivos alelo-específicos para cubrir una amplia población. En una realización, se seleccionan epítopes para cubrir al menos el 80% de la población. Se puede emplear el análisis Monte Carlo, evaluación estadística conocida en la técnica, para evaluar la amplitud o el exceso de población.

Cuando se crean composiciones poliepitópicas o un minigén que codifica tales composiciones, normalmente es conveniente generar el péptido más pequeño posible que contenga los epítopes de interés. Los principios empleados son similares, sino iguales, a los empleados cuando se selecciona un péptido que comprende epítopes incluidos. Por ejemplo, se selecciona una secuencia de la proteína para la composición de vacuna porque tiene un número máximo de epítopes dentro de la secuencia, esto es, tiene una alta concentración de epítopes. Los epítopes pueden estar incluidos o solapados (esto es, un marco que se desplaza uno con relación a otro). Por ejemplo, en el caso de epítopes que se solapan, dos epítopes 9-mer y 10 epítopes 10-mer pueden estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Cada epítope puede estar expuesto y unido por una molécula HLA cuando se administra dicho péptido. Un péptido multiepitópico se puede generar sintéticamente, por recombinación o vía segmentación de la fuente nativa. Alternativamente, se puede obtener un análogo de dicha secuencia nativa, donde uno o más epítopes que comprenden sustituciones alteran la reactividad cruzada y/o propiedades de afinidad de unión del péptido poliepitópico. Dicha composición de vacuna se administra con fines terapéuticos o profilácticos. Esta realización proporciona la posibilidad de que, aunque se trate de un aspecto del sistema inmunitario todavía no descubierto, el proceso se aplique a la secuencia nativa incluida y con ello se facilite la producción de composiciones de vacuna inductora de una respuesta inmunitaria, terapéutica o profiláctica. Además, dicha realización proporciona la posibilidad de epítopes portadores de motivos para la constitución de un HLA actualmente desconocido. Además, esta realización (que no crea ningún análogo) dirige la respuesta inmunitaria para multiplicar las secuencias de péptido que normalmente están presentes en 158P1D7 y evita así la necesidad de evaluar epítope de entrecruzamiento alguno. Por último, la realización proporciona una economía de escala en la producción de composiciones de vacuna de ácidos nucleicos. En relación con esta realización, se pueden obtener programas automatizados de acuerdo con los principios de la técnica que identifiquen en una secuencia diana el mayor número de epítopes por longitud de secuencia.

Una composición de vacuna compuesta por péptidos selectivos, a su administración, es segura, eficaz y provoca una respuesta inmune similar en magnitud a una respuesta inmune que controla o elimina células que portan o sobreexpresan la 158P1D7.

Ejemplo 20: Construcci6n de Plasmidos de ADN Multi-Epitope "Minigen"

Este ejemplo aborda la construcción de un plásmido de expresión minigén. Naturalmente, los plásmidos minigén pueden contener varias configuraciones de células B, epítopes CTL y/o HTL o epítopes análogos descritas en este documento.

Un plásmido de expresión minigén normalmente incluye múltiples epítopes de péptidos CTL y HTL. En este ejemplo, los epítopes de péptidos portadores de supermotivos HLA-A2, -A3, -B7 y los epítopes de péptido portadores de motivos HLA-A1 y -A24 se utilizan junto con epítopes portadores de supermotivos DR y/o epítopes DR3. Se seleccionan epítopes de péptido portadores de motivos o supermotivos clase I de HLA derivados de 158P1D7, de manera que estén representados múltiples supermotivos/motivos para poder abarcar un amplio número de

población. De igual modo, se seleccionan epítopes Clase II de HLA de 158P1D7 para abarcar un amplio rango de población. Por ejemplo, se seleccionan tanto epítopes portadores de supermotivos HLA DR-1-4-7 como epítopes portadores de motivos HLA DR-3 para incluirse en el constructo minigén. Entonces los epítopes seleccionados CTL y HTL se incorporan en un minigén para que se exprese en un vector de expresión.

Además dicho constructo puede incluir secuencias que dirijan los epítopes HTL al retículo endoplasmático. Por ejemplo, la proteína li se puede fusionar en uno o más epítopes HTL, como se describe en la técnica, eliminándose la secuencia CLIP de la proteína li y reemplazándose por una secuencia de epítopes Clase II de HLA, de manera que el epítope Clase II de HLA sea dirigido al retículo endoplasmático, dónde este epítope se une a moléculas Clase II de HLA.

Este ejemplo ilustra los procedimientos que se pueden utilizar para construir un plásmido de expresión portador de minigén. Se dispone de otros vectores de expresión que se pueden utilizar en composiciones minigén, y estos son conocidos por los expertos.

El plásmido ADN minigén de este ejemplo contiene una secuencia consenso Kozak y una secuencia de señal luminosa de cadena kappa lg consenso murina, seguida de epítopes CTL y/o HTL seleccionados conforme a los principios descritos en este documento. La secuencia codifica un marco de lectura abierto fusionado al marcador epítope del anticuerpo Myc e His codificado por el vector pADNc 3.1 Myc-His.

Los oligonucleótidos que se solapan y que pueden, por ejemplo, generar una media de aproximadamente 70 nucleótidos en toda la longitud con 15 solapamientos de nucleótidos, se sintetizan y purifican por HPLC. Los oligonucleótidos codifican epítopes de péptidos seleccionados, así como nucleótidos conectores apropiados, secuencias Kozak y secuencias señal. El minigén multiepítope final se ensambla extendiendo los oligonucleótidos en tres series de reacciones utilizando PCR. Se utiliza una máquina PCR Perkin/Elmer 9600, realizándose un total de 30 ciclos, bajo las siguientes condiciones: 95ºC durante 15 segundos, temperatura de recocido (5º por debajo de la Tm más baja calculada de cada pareja de iniciador) durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto.

Por ejemplo, un minigén se prepara de la siguiente forma. Para una primera reacción PCR, se anclan y extienden 5 Ig de cada dos oligonucleótidos: en un ejemplo se utilizan ocho, es decir, cuatro parejas de cebadores, oligonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6 y 7+8, que se combinan en 100 Il de reacciones que contienen una solución tamponada de polimerasa Pfu (1x= 10 mM KCL, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM tricloruro, pH 8,75, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 100 Ig/ml BSA), 0,25 mM cada dNTP y 2,5 U de polimerasa Pfu. La longitud de los productos dímeros se purifica en gel y se mezclan dos reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4 y el producto de 5+6 y 7+8, se anclan y se extienden durante 10 ciclos. La mitad de las dos reacciones se mezcla y se llevan a cabo cinco ciclos de anclado y extensión antes de añadir los cebadores flanqueantes para amplificar la longitud final del producto. Se purifica en gel la longitud final del producto y se clona en pCR-blunt (Invitrogen) y se hace un análisis selectivo de los clones individuales mediante secuenciación.

Ejemplo 21: Constructo Plasmido Y Grado en que Induce Inmunogenicidad

Se confirma in vitro el grado al que el plásmido, por ejemplo un plásmido construido conforme al ejemplo anterior, puede inducir inmunogenicidad, determinando la presencia de epítope mediante APC después de la transducción o transfección del APC con un constructo de ácido nucleico que expresa el epítope. Dicho estudio determina la “antigenicidad” y permite el uso de APC humano. El ensayo establece la capacidad del epítope de ser presentado por el APC en un contexto que es reconocido por una célula T, cuantificando la densidad de complejos epítope-HLA de Clase I en la superficie celular. Se puede efectuar la cuantificación directamente midiendo la cantidad de péptido eluido de APC (véase por ejemplo, Sijts y col., J. Immunol. 156:683-692, 1996; Demotz y col., Nature 342:682-684, 1989); o se puede estimar el número de complejos péptido-HLA de Clase I midiendo la cantidad de lisis o de liberación de linfoquina inducida por las células diana enfermas o transfectadas, y luego se determina la concentración de péptidos necesaria para obtener niveles equivalentes de lisis o de liberación de linfoquinas (véase por ejemplo Kageyama y col., J. Immunol. 154:567-576, 1995).

Alternativamente, se confirma la inmunogenicidad a través de inyecciones in vi vo en ratones y después en evaluaciones in vitro de la actividad CTL y HTL, que son analizadas utilizando ensayos de citotoxicidad y proliferación respectivamente, como se describe por ejemplo en Alexander y col., Immunity 1:751-761, 1994.

Por ejemplo, para confirmar la capacidad de un constructo minigén de ADN que contiene al menos un péptido supermotivo HLA-A2 de inducir CTLs in vivo , se inmunizan por ejemplo ratones transgénicas HLA-A2.1/Kb vía intramuscular con 100 Ig de ADNc desnudo. Para comparar el nivel de las CTLs inducido por la inmunización con ADNc, se inmuniza también a un grupo control de animales con una composición del péptido actual, que comprende múltiples epítopes sintetizados como un solo polipéptido, como se codificaría el minigén.

Se estimulan los esplenocitos de los animales inmunizados dos veces con cada una de las respectivas composiciones (epítopes de péptido codificados en el minigén o péptidos poliepitópicos), luego se analiza la citotoxicidad péptido-específica en un ensayo de liberación de 51Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta CTL dirigida frente al epítope restringido-A2, lo que indica de este modo la inmunogenicidad in vivo de la vacuna minigén y de la vacuna poliepitópica.

Así, se ha comprobado que el minigén provoca respuestas inmunes dirigidas hacia los epítopes de péptidosupermotivo HLA-A2, como lo hace la vacuna de péptido poliepitópica. También se lleva a cabo un análisis similar utilizando otros modelos de ratones HLA-A3 y HLA-B7 transgénicas para evaluar la inducción de CTL por epítopes motivo o supermotivo HLA-A3 y HLA-B7, con ello se ha comprobado que el minigén provoca respuestas inmunes apropiadas dirigidas hacia los epítopes provistos.

Para confirmar la capacidad de un minigén que codifica un epítope de Clase II para inducir HTLs in vivo, ratones transgénicas DR, o para epítopes que tienen reacción cruzada con la molécula MHC de la rata apropiada, reducidos I-Ab, por ejemplo, son inmunizados intramuscularmente con 100 Ig de ADN plásmido. Como medio para comparar el nivel de las HTLs inducidas por inmunización con ADN, también se inmuniza a un grupo de animales control con una composición del péptido actual emulsificada en un adyuvante Freund completo. Se purifican células CD4+T, esto es HTLs, de los esplenocitos de los animales inmunizados y estimulados con cada una de las respectivas composiciones (péptidos codificados en el minigén). Se mide la respuesta HTL utilizando un ensayo de proliferación de incorporación de H3-timidina3 (véase por ejemplo Alexander y col. Immunity 1:751-761, 1994). Los resultados indican la magnitud de la respuesta HTL demostrando así la inmunogenicidad in vivo del inmunogen.

También se confirma que los minigenes de ADN construidos como se describe en el ejemplo anterior constituyen una vacuna en combinación con un agente de refuerzo utilizando un protocolo de refuerzo primario. El agente de refuerzo puede constar de una proteína recombinante (por ejemplo Barnett y col., Aids Res. Y Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998) o de una vacuna recombinante, por ejemplo que exprese un minigén o un ADN que codifica toda la proteína de interés (véase por ejemplo Hanke y col., Vaccine 16:439-445, 1998; Sedegah y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53, 1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; y Robinson y col., Nature Med. 5:526-34, 1999).

Por ejemplo, la eficacia del minigén de ADN utilizado en un protocolo de refuerzo primario se evalúa inicialmente en ratones transgénicas. En este ejemplo, ratones transgénicas A2.1/Kb son inmunizadas IM con 100 Ig de un minigén de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos que incluyen al menos 1 péptido portador del supermotivo HLA-A2. Después de un período de incubación (que oscila entre 3 y 9 semanas) se refuerza a los ratones IP con 107 pfu/rata de un virus de vacuna recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigén de ADN. Se inmuniza a ratones control con 100 Ig de ADN o con vacunas recombinantes sin la secuencia del minigén o con un ADN que codifica el minigén pero sin las vacunas de refuerzo. Después de un período de incubación adicional de dos semanas se analiza inmediatamente la actividad péptido específica de los esplenocitos de los ratones en un ensayo ELISPOT. Además, se estimulan los esplenocitos in vitro con epítopes de péptido restringidos A2 codificados en el minigén y en las vacunas recombinantes, luego se analiza la actividad péptido-específica por ELISA IFN alpha, beta y/o gamma.

Se comprueba que el minigén utilizado en un protocolo de refuerzo primario provoca una mayor respuesta inmune hacia los péptidos supermotivos HLA/A2 que con solamente ADN. Dicho análisis se puede llevar a cabo en modelos de ratones transgénicas HLA-A11 o HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por epítopes motivos o supermotivos HLA-A3 o HLA-B7. El uso de protocolos de refuerzo primarios en humanos se describe abajo, en el Ejemplo "Inducción de las respuestas CTL utilizando un Protocolo de Refuerzo Primario”.

Ejemplo 22: Composici6n de Peptidos para Uso Profilactico

Las composiciones de vacuna de la presente invención se pueden utilizar para prevenir la expresión de 158P1D7 en personas con riesgo de sufrir tumores que porten este antígeno. Por ejemplo, se administra una composición epítope péptido poliepitópico (o un ácido nucleico que comprende la misma) que contiene múltiples epítopes CTL y HTL, de igual modo que los seleccionados en los ejemplos de arriba, que también son seleccionados para abarcar un porcentaje mayor al 80% de la población, a individuos con riesgo de sufrir tumores asociados a la 158P1D7.

Por ejemplo, se proporciona una composición basada en péptidos como un solo polipéptido que contiene múltiples epítopes. Normalmente la vacuna se administra en una solución fisiológica que comprende un adyuvante, tal como el Adyuvante de Freund Incompleto. Las dosis de péptido para la administración inicial es de aproximadamente 1 a

50.000 Ig, generalmente 100-5.000 Ig, para un paciente de 70 kg. La primera administración de la vacuna es seguida de dosis de refuerzo en 4 semanas, seguida de una evaluación de la magnitud de la respuesta inmune en el paciente, por técnicas que determinan la presencia de poblaciones CTL epítope-específicas en una muestra PBMC. Si es preciso se administran dosis de refuerzo adicionales. Se comprueba que la composición es tanto segura como eficaz como profilaxis frente a la enfermedad asociada a la 158P1D7.

Alternativamente se suele utilizar una composición que comprende agentes transfectantes para la administración de una vacuna basada en un ácido nucleico conforme a la metodología de la técnica descrita en este documento.

Ejemplo 23: Composiciones de Vacuna Poliepit6picas Derivadas de Secuencias de 15BP1D7 Nativas

Se analiza una secuencia poliproteínica 158P1D7 nativa, preferentemente utilizando algoritmos automatizados definidos para cada supermotivo o motivo de Clase I y/o Clase II, para identificar regiones “relativamente cortas” de la poliproteína que comprende múltiples epítopes. Las regiones “relativamente cortas” son preferiblemente de menor longitud que todo el antígeno nativo. Se selecciona esta secuencia relativamente corta que contiene múltiples

epítopes “incluidos” distintos o solapados, la cual se puede utilizar para generar un constructo minigén. El constructo es diseñado para expresar el péptido que corresponde a la secuencia de la proteína nativa. Por lo general, un péptido “relativamente corto” es inferior en longitud a 250 aminoácidos, a menudo inferior a 100 aminoácidos, preferiblemente inferior a 75 aminoácidos y en particular inferior a 50 aminoácidos. La secuencia proteínica de la composición de la vacuna se selecciona porque tiene un número máximo de epítopes en la secuencia, esto es tiene una alta concentración de epítopes. Tal como se menciona en este documento, los motivos epítope pueden estar incluidos o solados (es decir, un marco que se desplaza uno con relación a otro). Por ejemplo, con epítopes que se solapan, dos epítopes 9-mer y un epítope 10-mer pueden estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Dicha composición de vacuna se administra con fines terapéuticos o profilácticos.

La composición de vacuna incluirá, por ejemplo, múltiples epítopes CTL del antígeno 158P1D7 y al menos un epítope HTL. Esta secuencia nativa poliepitópica es administrada o como un péptido o como una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. Alternativamente, se puede hacer un análogo de esta secuencia nativa, por la que uno o más de los epítopes comprenden sustituciones que alteran la reactividad cruzada y/o las propiedades de afinidad de unión del péptido poliepitópico.

La realización de este ejemplo proporciona la posibilidad de que, aunque en un aspecto del sistema inmunitario todavía no descubierto, el proceso se aplique a la secuencia incluida nativa y con ello se facilite la producción de composiciones de vacunas que inducen respuestas inmunitarias, terapéuticas o profilácticas. Además, dicha realización proporciona la posibilidad de epítopes portadores de motivos para la constitución de HLA, actualmente desconocidos. Además, esta realización (que excluye una realización analogada) dirige la respuesta inmunitaria para multiplicar las secuencias de péptido que normalmente están presentes en 158P1D7, evitando así la necesidad de evaluar epítope de cruce alguno. Por último, la realización proporciona una economía a escala en la producción de composiciones de vacuna de péptidos o de ácidos nucleicos.

En relación con esta realización, existen programas automatizados en la técnica que se pueden utilizar para identificar, en una secuencia diana, el mayor número de epítopes por longitud de secuencia.

Ejemplo 24: Composiciones de Vacuna Poliepit6picas de Multiples Antigenos

Los epítopes de péptido 158P1D7 de la presente invención se utilizan junto con epítopes de otros antígenos diana asociados a tumores para crear una composición de vacuna útil en la prevención o el tratamiento del cáncer de vejiga que expresa 158P1D7 y estos otros antígenos. Por ejemplo, se puede facilitar una composición de vacuna como un solo polipéptido que incorpore múltiples epítopes de 158P1D7, así como antígenos asociados a tumores que a menudo son expresados en un cáncer diana asociado con la expresión de 158P1D7, o puede administrarse como una composición que comprende un cóctel de uno o más epítopes discretos. Alternativamente, la vacuna puede ser administrada como un constructo minigén o células dendítricas que han sido cargadas con epítopes de péptidos in vitro.

Ejemplo 25: Utilizaci6n de Peptidos para Evaluar una Respuesta Inmunitaria

Se pueden utilizar los péptidos de la invención para analizar una respuesta inmunitaria ante la presencia de anticuerpos específicos CTL o HTL dirigida a 158P1D7. Dicho análisis de puede efectuar del modo descrito por Ogg y col., Science 279:2103-2106, 1998. En este ejemplo, los péptidos se utilizan como un reactivo con fines diagnósticos o de prognosis, no como inmunógenos.

En este ejemplo, se emplean complejos tetraméricos antígeno leucocito de alta sensibilidad humanos (tretámeros) para un análisis de sección transversal, por ejemplo de frecuencias CTL específicas HLA-A*0201 de 158P1D7, en individuos HLA A*0201-positivos en diferentes estadíos de la enfermedad o después de una inmunización que comprende un péptido 158P1D7 que contiene motivo A*0201. Los complejos tetraméricos se sintetizan como se describe en Musey y col., N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997. En resumen, la cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y la �2-microglobulina se sintetizan por medio de un sistema de expresión procariótico. La cadena pesada es modificada por deleción de la cola transmembrana-citosólica y la adición en el extremo COOH de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimática BirA. La cadena pesada, �2-microglobulina, y el péptido son replegados por dilución. El producto replegado 45-kD es aislado por cromatografía líquida rápida de proteínas y luego biotinilado con BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri), adenosin-5’-trifosfato y magnesio. Se añade un conjugado estreptavidina-ficoeritrina en una fracción molar 1:4 y el producto tetramérico es concentrado hasta obtener 1 mg/ml. El producto resultante se conoce como tetrámero-ficoeritrina.

Para el análisis de muestras de sangre de pacientes, se centrifuga aproximadamente un millón de PBMCs a 300g durante 5 minutos y se vuelven a suspender en 50 Il de una solución salina estabilizada con fosfato frío. Se efectúa un análisis tricolor con la tetrámero-ficoeritrina, junto con Tricolor anti-CD8 y anti-CD38. Las PBMCs se incuban con tetrámeros y anticuerpos en hielo durante 30 a 60 minutos y luego se lavan dos veces antes de la fijación con formaldehído. Se aplican barreras para contener más del 99,98% de las muestras control. Los controles de los tetrámeros incluyen tanto individuos A*0201-negativos como donantes sanos A*0201-positivos. El porcentaje de células teñidas con tetrámero se determina luego por citometría de flujo. Los resultados indican el número de células en la muestra PBMC que contienen las CTLs epítope-restringidas, lo que en consecuencia indica rápidamente el

alcance de la respuesta inmunitaria al epítope 158P1D7 y de este modo el estado de exposición a 158P1D7 o la exposición a una vacuna que provoca una respuesta protectora o terapéutica.

Ejemplo 26: Uso de Peptidos Epitopes para Evaluar las Respuestas de Memoria

Los péptidos epítopes de la invención son utilizados como reactivos para evaluar las respuestas de células T, tales como respuestas agudas y de memoria, en pacientes. Este análisis se puede llevar a cabo en pacientes que se han recuperado de una enfermedad asociada a 159PID7 o que han sido vacunados con una vacuna 158P1D7.

Por ejemplo, se puede analizar la respuesta CTL restringida de clase I de las personas que han sido vacunadas. La vacuna puede ser cualquier vacuna 158P1D7. Se recogen las PBMC de individuos vacunados y que han sido tipificadas HLA. Los péptidos epítopes apropiados de la invención que óptimamente portan supermotivos que proporcionan una reactividad cruzada con múltiples miembros de la familia supertipo HLA, son luego utilizados para efectuar un análisis de las muestras extraídas de individuos que portan ese tipo de HLA.

Las PBMCs de individuos vacunados son luego separadas según gradientes de densidad Ficoll-Histopaque (Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO), se lavan tres veces en HBSS (GIBCO Laboratories), se resuspenden en RPMI-1640 (GIBCO Laboratories), se suplementan con L-glutamina (2 mM), penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 Ig/ml) y Hepes (10mM) que contiene un 10% de suero AB humano inactivado por calor (RPMI completo) y se cultivan en placas utilizando formatos microcultivo. Se añade el péptido sintético que comprende un epítope de la invención en una cantidad de 10 Ig/ ml a cada pocillo y se añade epítope 128-140 de núcleo de HBV en una cantidad de 1 Ig/ml a cada pocillo como fuente de ayuda a las células T durante la primera semana de estimulación.

En el formato de microcultivo, se estimulan 4 x 105 PBMCs con el péptido en 8 cultivos de repetición en placas de base redonda de 96 pocillos con 100 Il/pocillo de RPMI completo. Los días 3 y 10, se añaden a cada pocillo 100 μl de RPMI completo y 20 U/ml de una concentración final de rIL-2. El día 7 los cultivos son transferidos a placas de base plana de 96 pocillos y son reestimulados con péptido, rIL-2 y 105 de células alimentadoras autólogas irradiadas

(3.000 rad). La actividad citotóxica de los cultivos es analizada el día 14. Para que haya una respuesta CTL positiva es necesario que dos o más de los cultivos de repetición muestren una liberación de 51Cr específica superior al 10%, con respecto a la comparación con sujetos control sanos, tal como se describe anteriormente (Rehermann y col., Nature Med. 2:1104,1108, 1996; Rehermann y col., J. Clin. Invest. 97:1655-1665, 1996; y Rehermann y col. J. Clin. Invest. 98:1432-1440, 1996).

Las líneas celulares diana son autólogas y el B-LCL transformado por EBV alogénico se obtiene de la Sociedad Americana de Histocompatibilidd e Inmunogénetica (ASHI, Boston, MA) o de pools de pacientes tal como se describe en Guilhot y col. J. Virol. 66:2670-2678, 1992.

Los ensayos de citotoxicidad se llevan a cabo de la siguiente forma. Las células diana constan de o bien líneas celulares de linfoblastoides B alogénicos compatibles con HLA o bien de líneas celulares de linfoblastoides B autológas transformadas por EBV, que son incubadas toda la noche con epítope del péptido sintético de la invención a 10 μM y marcadas con 100 ICi de 51Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 1 hora, después de lo cual son lavadas cuatro veces con HBSS.

La actividad citolítica se determina en un ensayo de liberación de 51Cr convencional 4-h en un pocillo dividido, utilizando placas de 96 pocillos con base en forma de U que contienen 3.000 células diana/pocillo. Las PBMCs estimuladas se analizan en una proporción efector/diana (E/T) de 20-50:1 el día 14. El porcentaje de citotoxicidad se determina por la fórmula: 100 x [(liberación experimental–liberación espontánea) / máxima liberación–liberación espontánea)]. La liberación máxima se determina por lisis de las células diana con detergentes (2% Triton X-100; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La liberación espontánea es < 25% de la máxima liberación en todos los experimentos.

Los resultados de estos análisis indican el grado al que han llegado a estar estimuladas las poblaciones CTL restringidas-HLA por exposiciones previas a 158P1D7 o a una vacuna 158P1D7.

Del mismo modo también pueden analizarse respuestas HTL restringidas de Clase II. Las PBMCs purificadas se cultivan en placas de base plana de 96 pocillos con una densidad de 1,5 x 105 células/pocillo y se estimulan con 10 Ig/ml del péptido sintético de la invención, todo el antígeno 158P1D7 o PHA. Las células se cultivan como habitualmente en repliclados de 4-6 pocillos para cada estado. Después de siete días de cultivo, el medio es eliminado y reemplazado por medio fresco conteniendo 10 U/ml de IL-2. Dos días más tarde, se añade 1 ICi de 3Htimidina a cada pocillo y se prosigue la incubación durante otras 18 horas. Entonces se recoge el ADN celular en revestimientos de fibra de vidrio y se analiza la incorporación de 3H-timidina. La proliferación de células T antígenoespecíficas se calcula como la proporción de incorporación de 3H-timidina en presencia de antígeno dividida por la incorporación de 3H-timidina en ausencia de antígeno.

Ejemplo 27: Inducci6n de una Respuesta CTL Especifica en Humanos

Se prepara un ensayo clínico humano con una composición inmunogénica que comprende epítopes CTL y HTL como parte de un estudio de dosis escalonado, IND Fase I y se lleva a cabo como un ensayo aleatorio de doble ciego placebo. Este ensayo se diseña, por ejemplo, de la siguiente forma:

Se toma un total de 27 individuos y se los divide en 3 grupos:

Grupo I: Se inyecta a 3 sujetos placebo y a 6 sujetos 5 Ig de composición peptídica.

Grupo II: Se inyecta a 3 sujetos placebo y a 6 sujetos 50 Ig de composición peptídica.

Grupo III: Se inyecta a 3 sujetos placebo y a 6 sujetos 500 Ig de composición peptídica.

Después de 4 semanas de la primera inyección todos los sujetos reciben una inoculación de refuerzo con las mismas dosis.

Los puntos finales medidos en este estudio están relacionados con la seguridad y la tolerancia a la composición péptida, así como a su inmunogenicidad. Las respuestas inmunitarias celulares con respecto a la composición péptida son un indicador de la actividad intrínseca de esta composición péptida y, por tanto, se pueden ver como una medida de la eficacia biológica. A continuación se resumen los datos clínicos y de laboratorio relacionados con los puntos finales de seguridad y eficacia.

Seguridad: Se controla la incidencia de eventos adversos en el grupo tratado con medicamentos y placebo y se valora desde el punto de vista del grado y reversibilidad.

Evaluación de la eficacia de la vacuna: Para evaluar la eficacia de la vacuna se extrae sangre a los sujetos antes y después de la inyección. Se aislan células mononucleares de sangre periférica de sangre heparinizada fresca por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, se divide en alícuotas en medios refrigerantes y se almacena congelada. Se analiza la actividad CTL y HTL de las muestras.

Se comprueba que la vacuna es segura y eficaz.

Ejemplo 2B: EnsaYos Fase II en Pacientes que Expresan 15BP1D7

Se realizan ensayos Fase II para estudiar el efecto de la administración de composiciones péptidas CTL-HTL a pacientes que padecen cáncer de vejiga que expresa 158P1D7. Los principales objetivos del ensayo son determinar una dosis y el régimen efectivos para inducir CTLs en pacientes con cáncer de vejiga que expresa 158P1D7, para establecer la seguridad de inducir una respuesta CTL y HTL en estos pacientes, y para ver hasta que punto la activación de CTLs mejora el cuadro clínico de estos pacientes, tal como se manifiestaría, por ejemplo, con la reducción y/o disminución de las lesiones. Dicho estudio se diseña por ejemplo de la siguiente forma:

Los estudios se realizan en diversos centros. El diseño del ensayo es un protocolo “open-label”, no controlado, de dosis escalonada, en el que la composición peptídica se administra en una dosis única seguida, 6 semanas más tarde, de una inyección de refuerzo con la misma dosis. Las dosis por inyección son de 50, 500 y 5.000 microgramos. Se registran los efectos adversos asociados al medicamento (gravedad y reversibilidad).

Existen tres grupos de pacientes. Al primer grupo se le inyectan 50 microgramos de la composición peptídica y al segundo y tercer grupos 500 y 5.000 microgramos de la composición peptídica, respectivamente. La edad de los pacientes de cada grupo está comprendida entre 21-65 y representan diversas étnias. Todos tienen un tumor que expresa 158P1D7.

Se controlan las manifestaciones clínicas o las respuestas de las células T antígeno específicas para evaluar los efectos de la administración de las composiciones peptídica. Se comprueba que la composición de la vacuna es segura y eficaz en el tratamiento de la enfermedad asociada a 158P1D7.

Ejemplo 29: Inducci6n de Respuestas CTL Utilizando un Protocolo de InYecci6n de Refuerzo

También se puede utilizar en la administración de la vacuna a humanos, un protocolo de inyección de refuerzo, similar en su principio fundamental al que se utiliza para confirmar la eficacia de vacunas de ADN en ratones transgénicas tal como el descrito arriba en el Ejemplo: Constructo Plásmido y Grado al que induce Inmunogenicidad”. Dicho régimen puede también incluir una administración inicial de, por ejemplo, un ADN desnudo seguida de un refuerzo con un virus recombinante que codifica la vacuna, o de una proteína/polipéptido recombinante o de una mezcla peptídica administrada en un adyuvante.

Por ejemplo, se puede efectuar la inmunización inicial utilizando un vector de expresión, como el construido en el ejemplo “Construcción de Plásmidos de ADN Multi-Epítope “Minigén””, en forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en cantidades que oscilan entre 0,5-5 mg en sitios múltiples. El ácido nucleico (0,1 a

1.000 Ig) se puede administrar utilizando una pistola genética. Después de un período de incubación de 3-4

semanas, se administra una dosis de refuerzo. Esta dosis puede ser de virus aviar recombinante administrado en una dosis de 5-107 a 5 x 109 pfu. También se puede utilizar como refuerzo otro virus recombinante tal como MVA, virus de la viruela del canario, adenovirus o virus asociado a los adenorivus, o la proteína poliepitópica o una mezcla de los péptidos. Para evaluar la eficacia de la vacuna, se extraen muestras de sangre del paciente antes de la inmunización, así como en intervalos después de la administración de la vacuna inicial y de las dosis de refuerzo de la vacuna. Se aislan células mononucleares de sangre periférica heparinizada fresca mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, se dividen en alícuotas en medios refrigerantes y se almacenan congeladas. Se analiza la actividad CTL y HTL de las muestras.

El análisis de los resultados indica que se genera una magnitud de respuesta suficiente para lograr una inmunidad terapéutica o protectora frente a la 158P1D7.

Ejemplo 30: Administraci6n de Composiciones de Vacunas que Utilizan Celulas Denditricas (DC)

Las vacunas que comprenden epítopes del péptido de la invención se pueden administrar utilizando APCs o APCs “profesionales”, tales como DCs. En este ejemplo, se administran DCs pulsadas con péptido a un paciente para estimular la respuesta CTL in vivo. En este procedimiento, las células dendítricas son aisladas, expandidas y pulsadas con una vacuna que comprende epítopes CTL y HTL del péptido. Las células dendítricas son inyectadas en el paciente para provocar respuestas CTL y HTL in vivo . Luego CTL y HTL inducidos destruyen o facilitan la destrucción, respectivamente, de las células diana que portan la proteína 158P1D7, desde la que se extraen los epítopes de la vacuna.

Por ejemplo, se administra ex vivo un cóctel de péptidos que comprende epítopes de PBMC o se aislan DCs del mismo. Para facilitar la recogida de DCs, se puede utilizar un producto farmacéutico, tal como Progenipoietin™ (Monsanto, St. Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las DCs con péptidos y antes de reinyectárselas a los pacientes, éstas son lavadas para eliminar los péptidos no unidos.

Como se aprecia desde el punto de vista clínico y se establece por una de las técnicas basadas en los resultados clínicos, el número de DCs reinyectadas a pacientes puede variar (véase por ejemplo Nature Med. 4:328, 1998; Nature Med. 2:52, 1996 y Prostate 32:272, 1997). Aunque normalmente se administran 2-50 x 106 DC por paciente, también se pueden administrar mayores cantidades de DC, por ejemplo de 107 o 108. Dichas poblaciones celulares normalmente contienen entre el 50-90% de DC.

En algunas realizaciones, se inyecta a pacientes PBMCs cargadas con péptido sin purificar las DCs. Por ejemplo, se inyecta a pacientes PBMCs generadas después de su tratamiento con un agente como Progenipoietin™ sin purificar las DCs. El número total de PBMCs que se administra a menudo oscila entre 108 y 1010. Por lo general, las dosis celulares inyectadas a pacientes se basan en el porcentaje de DC que hay en la sangre de cada paciente, como se determina, por ejemplo, por análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-DC específicos. En consecuencia, por ejemplo, si Progenipoietin™ moviliza un 2% de DC en la sangre periférica de un paciente dado y ese paciente va a recibir 5 x 106 de DC, se inyectará al paciente un total de 2,5 x 108 de PBMC cargada de péptido. El porcentaje de DC movilizada por un agente como el Progenipoietin™ normalmente se estima entre el 2-10%, pero puede variar, como cualquier experto en la técnica puede apreciar.

Activación ex vivo de las Respuestas CTL/HTL

Alternativamente las respuestas CTL o HTL ex vivo frente a los antígenos 158P1D7 pueden ser inducidas incubando, en cultivos tisulares, células precursoras de CTL o HTL del paciente o células precursoras de CTL o HTL genéticamente compatibles, junto con una fuente de APC, por ejemplo DC, y los péptidos inmunogénicos. Después de un período de incubación adecuado (normalmente alrededor de 7-28 días), en el que las células precursoras son activadas y expandidas en células efectoras, se inyectan las células al paciente, que destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de las células diana específicas, es decir, las células tumorales.

Ejemplo 31: Metodo Alternativo de Identificaci6n Y Confirmaci6n de Peptidos Portadores de Motivos

Otro procedimiento para la identificación y confirmación de péptidos portadores de motivo es eluyéndolos a partir de células portadoras de moléculas MHCs definidas. Por ejemplo, las líneas celulares B transformadas por EBV utilizadas en la tipificación del tejido se han caracterizado para determinar qué moléculas de HLA expresan. En determinados casos, estas células expresan solamente un solo tipo de molécula HLA. Estas células pueden ser transfectadas con ácidos nucleicos que expresan el antígeno de interés, por ejemplo 158P1D7. Los péptidos producidos mediante procesamiento de antígenos endógenos de los péptidos producidos por transfección se unirán luego a las moléculas HLA dentro de la célula y se transportarán y mostrarán en la superficie celular. Entonces, los péptidos son eluidos a partir de las moléculas HLA por exposición a condiciones ácidas suaves y se determina su secuencia aminoácida, por ejemplo por espectometría de masas (por ejemplo Kubo y col., J. Immunol. 152:3913, 1994). Debido a que la mayoría de los péptidos que unen una molécula HLA específica son portadores de motivos, ésta es una modalidad alternativa para obtener péptidos portadores de motivos correlacionados con la molécula HLA específica expresada en la célula.

Como alternativa, las líneas celulares que no expresan moléculas HLA endógenas pueden ser transfectadas con un constructo de expresión que codifica un solo alelo HLA. Estas células luego se pueden utilizar de la siguiente manera, por ejemplo, pueden ser transfectadas con ácidos nucleicos que codifican 158P1D7 para aislar los péptidos correspondientes a 158P1D7 que estaban presentes en la superficie de la célula. Los péptidos obtenidos de dicho análisis portarán motivo(s) que corresponden a la unión al único alelo HLA que está expresado en la célula.

Como se aprecia en la técnica, se puede efectuar un análisis similar en una célula portadora de más de un alelo HLA y, por consiguiente, determinar los péptidos específicos para cada alelo HLA expresado. Además, un experto reconocería qué medios, distintos a la transfección, se pueden utilizar para proporcionar una fuente de antígeno a la célula, por ejemplo la carga con un antígeno de proteína.

Ejemplo 32: Polinucle6tidos Complementarios

Las secuencias complementarias a las secuencias que codifican 158P1D7, o partes de la misma, se utilizan para detectar, disminuir o inhibir la expresión de 158P1D7 que aparece de forma natural. Aunque se ha descrito el uso de oligonucleótidos que comprenden aproximadamente entre 15 y 30 pares de bases, fundamentalmente se utiliza el mismo procedimiento con fragmentos de secuencias más cortos o más largos. Los oligonucleótidos apropiados se diseñan utilizando por ejemplo el software OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia de codificación de 158P1D7. Para inhibir la transcripción, se diseña un oligonucleótido complementario de la secuencia 5’ más específica y se utiliza para impedir la unión del promotor a la secuencia de codificación. Para inhibir la traducción, se diseña un oligonucleótido complementario para prevenir la unión ribosomal al transcripto que codifica la 158P1D7.

Ejemplo 33: Purificaci6n de 15BP1 D7 Recombinante o Natural Ut ilizando A nticuerpos Especificos 15BP1D7

Se purifica fundamentalmente 158P1D7 natural o recombinante por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para la 158P1D7. Se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-158P1D7 a una resina cromatográfica activada, tal como SEPHAROSE activada por CNBr (Amersham Pharmacia Biotech). Después del acoplamiento, la resina es bloqueada y lavada según las instrucciones del fabricante.

Los medios que contienen 158P1D7 se pasan por la columna de inmunoafinidad y se lava la columna bajo condiciones que permiten la absorbancia preferente de 158P1D7 (por ejemplo, soluciones tamponadas con una alta intensidad iónica en presencia de detergente). La columna es eluída bajo condiciones que rompen la unión anticuerpo/158P1D7 (por ejemplo, una solución tamponada a pH 2 a pH 3, o una alta concentración de un caótropo tal como urea o ión tiocianato) y se recoge GCR.P.

Ejemplo 34: Identificaci6n de Moleculas que Interactuan con 15BP1D7

Se marca la 158P1D7 o fragmentos biológicamente activos de la misma con reactivo 121 1 Bolton-Hunter (véase por ejemplo Bolton y col. (1973) Biochem. J. 133:529). Las moléculas candidatas, previamente colocadas en los pocillos de una placa de múltiples pocillos, son incubadas con la 158P1D7 marcada, lavadas y se analizan todos los pocillos con complejo 158P1D7 marcado. Se utilizan los datos obtenidos utilizando diferentes concentraciones de 158P1D7 para calcular los valores del número, afinidad y asociación de 158P1D7 con las moléculas candidatas. En toda esta aplicación, se hace referencia a los contenidos en varios sitios de internet, publicaciones, solicitudes y patentes (las URL remiten a las páginas y direcciones de la World Wide Web).

Ejemplo 35: EnsaYo in vivo para la Estimulaci6n del Crecimiento del Tumor 15BP1D7

El efecto de la proteína 158P1D7 en el crecimiento de células tumorales se puede confirmar in vivo por la sobreexpresión de genes en células de cáncer de vejiga. Por ejemplo, se puede inyectar SQ a SCID en cada flanco con 1 x 106 de células de cáncer de vejiga (tales como células SCaBER, UM-UC-3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 y SW780) que contienen un vector vacío tkNeo o 158P1D7.

Se pueden utilizar al menos dos estrategias: (1) La expresión 158P1D7 constitutiva regulada por un promotor, tal como un promotor constitutivo obtenido de genomas de virus tales como virus polioma, virus aviar (UK 2.211.504, 5 de julio 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 21, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus del Simio 40 (SV40), o de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo el promotor de actina o de inmunoglobulina, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped. (2) La expresión regulada bajo control de un sistema vectorial inducible como: ecdisona, tet, etc., se pueden utilizar siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped. Luego se controla la aparición de tumores palpables en el volumen del tumor y se hace un seguimiento para determinar si las células que expresan 158P1D7 crecen a una velocidad más rápida y si los tumores producidos por células que expresan 158P1D7 muestran características de agresividad alterada (por ejemplo: aumento de metástasis, vascularización, menor capacidad de respuesta a los medicamentos quimioterapéuticos). Además, se les puede implantar ortotópicamente a los ratones las mismas células para determinar si la 158P1D7 tiene efecto en el crecimiento local de la vejiga o en la capacidad de las células de metastatizar, especialmente en pulmones o nódulos linfáticos (Fu, X. y col., Int. J. Cancer, 1991. 49: p. 938-939;

Chang, S. y col., Anticancer Res., 1997. 17: p. 3239-3242; Peralta, E.A. y col., J. Urol., 1999. 162: p. 1806-1811). Además, este ensayo es útil para confirmar el efecto inhibidor de la 158P1D7 de las composiciones terapéuticas candidatas tales como, por ejemplo, anticuerpos o intracuerpos de 158P1D7 y moléculas o ribozomas antisentido 158P1D7.

Ejemplo 36: Inhibici6n Mediada por Anticuerpos Monoclonales 15BP1D7 de Tumores de Vejiga in vivo

La expresión significativa de 158P1D7 en tejidos cancerígenos, junto con su expresión restringida en tejidos normales, hace que la 158P1D7 sea una diana excelente en la terapia con anticuerpos. En los casos en los que el anticuerpo monoclonal diana sea una proteína de la superfice celular, se ha demostrado que los anticuerpos son eficaces a la hora de inhibir el crecimiento tumoral (véase por ejemplo Saffran, D. y col., PNAS 10:1073-1078 o www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698). En aquellos casos en los que la diana no esté en la superficie celular, por ejemplo PSA y PAP en el cáncer de próstata, los anticuerpos siguen demostrando que reconocen e inhiben el crecimiento de las células que expresan esas proteínas (Saffran, D.C. y col., Cancer and Metastasis Reviews, 1999. 18: p. 437-449). En cuanto a cualquier proteína celular con un perfil de expresión restringido, la 158P1D7 es una diana para la inmunoterapia basada en células T.

En consecuencia, la eficacia terapéutica de mAbs anti-158P1D7 en modelos de rata con cáncer de vejiga humana es modelada en injertos heterólogos de cáncer de vejiga que expresan 158P1D7 o en líneas celulares de cáncer de vejiga, tales como las descritas en el Ejemplo “Ensayo in vivo para la Estimulación del Crecimiento del Tumor 158P1D7”), que han sido diseñadas para expresar la 158P1D7.

La eficacia de los anticuerpos en el crecimiento del tumor y la formación de metástasis se confirma, por ejemplo, en un modelo de injerto heterólogo de cáncer de vejiga ortotópico de ratas. Los anticuerpos pueden ser no conjugados, tal como se aborda en este ejemplo, o pueden ser conjugados a una modalidad terapéutica, como se aprecia en la técnica. Se confirma que mAbs anti-158P1D7 inhibe la formación de 158P1D7, que expresa tumores de vejiga. mAbs anti-158P1D7 también puede retardar el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y prolongar la supervivencia en ratones portadores de tumores. Estos resultados indican la utilidad de mAbs anti-158P1D7 en el tratamiento de los estadíos locales y avanzados del tumor de vejiga (véase por ejemplo Saffran, D. y col., PNAS 10:1073-1078 o www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).

La administración de mAbs anti-158P1D7 retarda el crecimiento del tumor ortotópico establecido e inhibe la metástasis en zonas alejadas, lo que da lugar a una prolongación significativa de la supervivencia de los ratones portadoras de tumores. Estos estudios indican que la 158P1D7 es una diana atractiva para la inmunoterapia y demuestra el potencial terapéutico de mAbs anti-158P1D7 para el tratamiento del cáncer de vejiga local y metastático.

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales 158P1D7 no conjugados inhiben eficazmente el crecimiento de los tumores de la vejiga humana desarrollados en SCID y, en consecuencia, una combinación de dichos anticuerpos monoclonales es también eficaz.

Inhibici6n de Tumores mediante el Uso de Multiples mAbs 15BP1D7 no Conjugados

Materiales Y Procedimientos

Anticuerpos monoclonales 158P1D7:

Se aumentan los anticuerpos monoclonales en relación con la 158P1D7, como se describe en el Ejemplo "Generación de anticuerpos monoclonales 158P1D7 (mAbs)." Se determina la capacidad de los anticuerpos de unir la 158P1D7 por ELISA, Western blot, FACS e inmunoprecipitación, de acuerdo con las técnicas conocidas. Los datos del mapa de epítopes de los mAbs anti-158P1D7, determinados por ELISA y análisis de Western blot, reconocen epítopes en la proteína 158P1D7. Se efectúa el análisis inmunohistoquímico de tejidos cancerosos de vejiga y de células con estos anticuerpos.

Se purifican anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de cultivos de tejidos de hibridoma o ascitis por cromatografía de sefarosa con proteína G, se dializan frente a PBS, se esterilizan por filtrado y se almacenan a 20ºC. Se efectúa la determinación de proteína por un ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Se prepara un anticuerpo monoclonal terapéutico o un cóctel que comprende una mezcla de anticuerpos monoclonales y se utiliza para tratar ratones inyectadas subcutánea y ortotópicamente con los injertos heterólogos de los tumores de vejiga.

Líneas Celulares del Cáncer de Vejiga

Se generan las líneas celulares de cáncer de vejiga (Scaber, J82, UM-UC-3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 and SW780) que expresan 158P1D7 por transferencia genética retroviral, como describe Hubert, R.S. y col., STEAP: a prostate-specific cellsurface antigen highly expressed in human prostate tumors. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25):14523-8. Se detecta la coloración de anti-158P1D7 utilizando anticuerpos anti-rata de cabra conjugados FITC (Southern Biotechnology Associates), seguida de un análisis en un citómetro de flujo Coulter Epics-XL.

Modelos de Ratón in vivo

Se generan tumores subcutáneos (s.c.) inyectando 1 x 106 células de cáncer de vejiga que expresan 158P1D7 mezcladas en una dilución con Matrigel en una proporción 1:1 (Collaborative Research) en el lado derecho de una rata macho SCID. Para analizar la eficacia de los anticuerpos en la formación de tumores, se comienza, en concreto, con inyecciones de anticuerpo el mismo día en el que se inyectan las células tumorales. En el control, se inyecta a ratones lgG (ICN) de rata purificada o PBS, o un anticuerpo monoclonal purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares no se hallan diferencias entre lgG de rata o PBS en el crecimiento del tumor. Se dermina el tamaño del tumor por mediciones de calibre de nonio, y el volumen del tumor se calcula en largo x ancho x alto. Los ratones con tumores subcutáneos superiores a 1,5 cm de diámetro son sacrificados. Se determinan los niveles circulantes de mAbs anti-158P1D7 usando el kit ELISA (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) (véase por ejemplo (Saffran, D. y col., PNAS 10:1073-1078).

En dos realizaciones alternativas, se ponen, por ejemplo, inyecciones ortotópicas con anestesia o utilizando cetamina/xilazina. En una primera realización, se administra directamente a través de la uretra en la vejiga una inyección intravesicular de células de cáncer de vejiga (Peralta, E.A. y col., J. Urol., 1999. 162:1806-1811). En una segunda realización, se hace una incisión en la pared abdominal, se expone la vejiga y se unen quirúrgicamente los pedazos de tejido tumoral (1-2 mm de tamaño) extraídos de un tumor subcutáneo de la pared exterior de la vejiga, lo que se conoce como “impolantación” (Fu, X. y col., Int. J. Cancer, 1991. 49: 938-939; Chang, S. y col., Anticancer Res., 1997. 17: p. 3239-3242). Se pueden administrar anticuerpos a grupos de ratones en el mismo momento de la inyección o de la “implantación” y después de 1-2 semanas para dejar que se establezca el tumor.

MAbs anti-158P1D7 Inhiben el Crecimiento de Tumores de Cáncer de Vejiga que Expresan 158P1D7

En una realización, se analiza el efecto de mAbs anti-158P1D7 en la formación de tumores utilizando el modelo ortotópico de “implantación” de vejiga. En comparación con el modelo del tumor subcutáneo, el modelo ortotópico, que requiere la adhesión quirúrgica de tejidos tumorales directamente sobre la vejiga, da lugar a un crecimiento local del tumor, desarrollo de metástasis en zonas alejadas y posteriormente la muerte (Fu, X., y col., Int. J. Cancer, 1991.

49: p. 938-939; Chang, S. y col., Anticancer Res., 1997.17: p. 3239-3242). Estas características hacen que el modelo ortotópico sea más representativo de la progresión de la enfermedad y permita hacer un seguimiento del efecto terapéutico de mABs, así como de otras modalidades terapéuticas, en los puntos finales, desde el punto de vista clínico.

En concecuencia, las células tumorales que expresan 158P1D7 son implantadas ortotópicamente y 2 días más tarde los ratones son segregadas en dos grupos y tratadas con: a) 50-2.000 Ig, normalmente 200-500 Ig de Ab anti158P1D7, o b) PBS tres veces a la semana durante dos a cinco semanas. Se controla semanalmente a los ratones para ver si hay indicios de crecimiento del tumor.

Como se ha advertido, una ventaja importante del modelo de cáncer de vejiga ortotópico es la capacidad de poder estudiar el desarrollo de las metástasis. La formación de metástasis en los ratones portadoras de tumores ortotópicos establecidos es estudiada en análisis histológicos de secciones tisulares, incluyendo el pulmón y los nódulos linfáticos (Fu, X. y col., Int. J. Cancer, 1991. 49:938-939; Chang, S. y col., Anticancer Res., 1997. 17:32393242). Además, se puede efectuar un análisis IHC en secciones tisulares utilizando los anticuerpos anti-158P1D7.

Se inyectan 1.000 Ig de mAB anti-158P1D7 o de PBS durante un período de 4 semanas a los ratones portadoras de tumores de vejiga que expresan 158P1D7. Se deja que los ratones de ambos grupos establezcan una alta carga tumoral (crecimiento de 1-2 semanas) para asegurar una alta frecuencia de formación de metástasis en los pulmones y nódulos linfáticos. Luego los ratones son sacrificados y se analizan su tumor de vejiga local y los tejidos del nódulo linfático y del pulmón en busca de células tumorales por histología y análisis IHC.

Estos estudios demuestran que los anticuerpos anti-158P1D7 en el inicio y progresión de cáncer de vejiga en modelos de rata son muy eficaces frente al tumor. Los anticuerpos anti-158P1D7 inhiben la formación del tumor y retardan el crecimiento de tumores ya establecidos y prolongan la supervivencia de los ratones tratadas. Además, mAbs anti-158P1D7 evidencia un efecto inhibidor espectacular en la propagación del tumor de vejiga local a zonas alejadas, incluso en presencia de una gran carga tumoral. Por tanto, los mAbs anti-158P1D7 son eficaces en los puntos finales más importantes desde el punto de vista clínico, incluyendo la disminución del crecimiento del cáncer, de la metástasis y la prolongación de la supervivencia.

Ejemplo 37: Comparaci6n de la Homologia de 15BP1D7 con Secuencias Conocidas

La proteína 158P1D7 de la Figura 3 tiene 841 aminoácidos con un peso molecular calculado de 95,1 kDa, y pI de 6,07. Se prevé que 158P1D7 sea una proteína nuclear (65% por PSORT http://psort.nibb.ac.jp/form2.html) con la posibilidad de ser una proteína de membrana plasmática (0.46PSORT http:// psort.nibb.ac.jp/form.html). 158P1D7 tiene un posible sitio de segmentación entre los aa 626 y 627 y un posible sitio de señal en los aa 3-25.

Utilizando la página web PubMed del N.C.B.I. disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez, se comprobó a nivel de proteína que 158P1D7 muestra mayor homología a la hipotética proteína FLJ22774 (PubMed record: gi 14149932) de función no conocida, con un 97% de identidad y un 97% de homología. La proteína 158P1D7 muestra

cierta homología a una proteína humana similar a IGFALS (proteína de unión a un factor de crecimiento similar a la insulina, subunidad lábil al ácido) (registro PubMed: gi6691962) con un 36% de identidad y un 52% de homología y a una proteína Slit 1 de rata (registro PubMed: gi 5532493) con un 24% de identidad y un 37% de homología (Figuras 5a y 5b).

Se ha demostrado que los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) desempeñan un papel importante en el crecimiento tumoral, entre los que se incluyen de próstata, mama, cerebro y de ovario (O’Brian y col., Urology. 2001, 58:1; Wang J. y col Oncogene. 2001, 20:3857; Helle S. y col, Br J Cancer. 2001, 85:74). Los IGFs producen su efecto oncogénico uniéndose a receptores específicos de la superficie celular y activando la supervivencia, así como las vías mitogénicas (Babajko S. y col., Med Pediatr Oncol. 2001, 36:154; Scalia P. y col., J Cell Biochem. 2001, 82:610). La actividad de los factores de crecimiento similares a la insulina es regulada por las proteínas de unión IGF (IGF-BP) y la subunidad lábil de ácido (ALS) de IGF-BP (Zeslawski W. y col., EMBO J. 2001, 20:3638; Jones JI. y Clemmons DR. Endocr. Rev. 1995, 16: 3). En el plasma, la mayor parte de los IGFs aparecen como un complejo ternario que contiene IGF-BP y ALS (Jones JI. y Clemmons DR. Endocr. Rev. 1995, 16: 3). La asociación con ALS permite la retención del complejo ternario en la vasculatura y prolonga su vida útil (Ueki I y col., Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:6868). Los estudios en ratones demuestran la contribución de ALS en el crecimiento celular al verse que los ratones portadoras de ALS mutante muestran un déficit de crecimiento (Ueki I. y col., Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:6868), lo que indica que ALS desempeña un papel fundamental en el crecimiento de las células tumorales.

En un primer momento se identificaron las proteínas Slit en la Drosophi/a como proteínas segregadas que regulan la guía y orientación de axones (Rajagopalan S. y col., Cell. 2000, 103:1033; Chen J. y col., J Neurosci. 2001, 21:1548). Se clonaron homólogos de mamíferos en ratones y humanos, en los que se muestra que regulan la migración y quimotaxis. (Wu J. y col, Nature. 2001, 410:948; Brose K y Tessier M, Curr Opin Neurobiol. 2001, 10:95). Las proteínas Slit están localizadas en dos sitios subcelulares distintos dentro de las células epiteliales dependiendo de la fase celular, estando localizada la Slit 3 predominantemente en las mitocondrias y estando dirigida hacia la superficie celular en muchas células confluentes (Little, M.H. y col., AmJ Physiol Cell Physiol. 2001, 281:C486). La localización diferencial de Slit indica que Slit puede funcionar de manera diferente cuando es segregada, asociada con la superficie celular o retenida en la mitocondria.

La descripción de la presente invención por la que 158P1D7 está altamente expresada en varios cánceres en tanto que muestra un modelo de expresión restringido en tejidos normales, indica que el gen 158P1D7 desempeña un papel fundamental en varios cánceres, incluidos los cánceres de vejiga. La presente invención prevé que 158P1D7 controle el crecimiento y la progresión del tumor, regulando la proliferación, supervivencia, migración, expresión génica así como la disponibilidad de la superficie celular. En consecuencia, cuando 158P1D7 funciona como un regulador del crecimiento y de las apoptosis celular o de la expresión, 158P1D7 se utiliza con fines terapéuticos, de diagnóstico, de pronóstico o de prevención.

Además, las Figuras 16A y 16B presentan una región transmembrana y la predicción de orientación de 158P1D7. La Figura 16A es una representación esquemática de la probabilidad de la existencia de regiones transmembránicas y de la orientación extracelular e intracelular de 158P1D7, basándose en el algoritmo de Sonnhammer, von Heijne y Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne y Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff y C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). El procedimiento predice que la 158P1D7 contiene una única región transmembrana de aminoácidos 611-633 con alta probabilidad de que el extremo amino se encuentre fuera, de acuerdo con la topología de una proteína transmembrana Tipo 1. También se visualiza un corto alargamiento hidrofóbico de los aminoácidos 3-25, de acuerdo con la existencia de un péptido señal en el extremo amino. La Figura 16B es una representación esquemática de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana y de la orientación de la 158P1D7 basándose en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE – A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993). El procedimiento predice que la 158P1D7 contiene una región transmembrana primaria de aminoácidos 609-633 y una región transmembrana secundaria de aminoácidos 3-25 (aminoácidos contiguos con valores superiores a 0 en el gráfico tienen alta probabilidad de ser regiones transmembrana) con una orientación en la que el extremo amino está dentro y el extremo carboxilo está fuera. También se prevé un modelo alternativo, de acuerdo con la Figura 16A, en el que la 158P1D7 es una proteína transmembrana Tipo 1 en la que el extremo amino está fuera y la proteína contiene un péptido señal de dominio transmembrana secundario de aminoácidos 3-25 y un dominio transmembrana primario de aa 615-633. Se evalúan los algoritmos de predicción transmembrana de la Figura 16A y de la Figura 16B a través del servidor de biología molecular ExPasy (http://www.expasy.ch/tools/).

Ejemplo 3B: Identificaci6n Y Confirmaci6n de las Vias de Transducci6n de Seral

Se tiene constancia de que muchas proteínas de mamíferos interactúan con moléculas señal y participan en la regulación de las vías señal (J Neurochem. 2001; 76:217-223). En concreto, se ha demostrado que IGF y IGF-BP regulan las vías mitogénicas y de supervivencia (Babajko, S. y col., Med Pediatr Oncol. 2001, 36:154; Scalia, P. y col., J Cell Biochem. 2001, 82:610). Utilizando técnicas de inmunoprecipitación y Western blot, se identifican proteínas que se asocian con 158P1D7 y median en eventos de señales. Varias vías que se sabe que juegan un

papel en la biología del cáncer son reguladas por la 158P1D7, incluyendo vías fosfolipídicas tales como PI3K, AKT, etc, vías de adhesión y migración, incluyendo FAK, Rho, Rac-1, etc, así como cascadas mitogénicas/supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11:279; J Biol. Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000, 19:3003,

J. Cell Biol. 1997, 138:913.). Análisis bioinformáticos revelaron que la 158P1D7 se puede fosforilar por serina/treonina, así como por tirosina-quinasas. Por tanto la fosforilación de 158P1D7 conduce a la activación de las vías enumeradas anteriormente

Por ejemplo utilizando técnicas Western blot, se confirma la capacidad de la 158P1D7 de regular estas vías. Las células que expresan o carecen de 158P1D7 se dejan sin tratar o se estimulan con citoquinas, hormonas y anticuerpos anti-integrina. Se analizan los lisatos celulares utilizando anticuerpos anti-fosfo-específicos (Cell Signaling, Santa Cruz Biotechnology) a fin de detectar la fosforilación y regulación de ERK, p38, AKT, PI3K, PLC y de otras moléculas señal. Cuando la 158P1D7 desempeña un papel en la regulación de las vías señal, tanto individual como en conjunto, se utiliza como diana con fines de diagnóstico, pronóstico, prevención o terapéuticos.

Para confirmar que la 158P1D7 activa directa e indirectamente vías de transducción de señal conocidas, se llevan a cabo ensayos transcripcionales reporteros basados en luciferasa en células que expresan genes individuales. Estos reporteros transcripcionales contienen sitios de unión consensuados para los factores de transcripción conocidos que se encuentran debajo de vías de transducción de señal bien caracterizadas. A continuación se enumeran los reporteros y ejemplos de estos factores de transcripción asociados, vías de transducción de señal y estímulos de activación:

1.

NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-quinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés

2.

SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación

3.

AP-1-luc, FOS/JUN; MAPKISAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/stress

4.

ARE-luc, andrógeno receptor; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

5.

p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

6.

CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés

Se analizan los efectos mediados por genes en células que presentan la expresión ARNm. Se introducen los plásmidos reporteros luciferasa por transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). Se mide la actividad luciferasa, indicador de la actividad transcripcional relativa, incubando los extractos de células con el sustrato luciferina y se controla la luminiscencia de la reacción en un luminímetro.

Se hace un mapa de las vías de señal activadas por 158P1D7 y se utiliza para identificar y validar los blancos terapéuticos. Cuando 158P1D7 está implicada en la señalización celular, se utiliza como diana con fines de diagnóstico, pronóstico, prevención y terapéuticos.

Ejemplo 39: Implicaci6n en la Progresi6n Tumoral

El gen 158P1D7 puede contribuir al crecimiento de células cancerígenas. El papel de 158P1D7 en el crecimiento tumoral se confirma en varias líneas celulares primarias y transfectadas, entre las que se incluyen líneas celulares prostáticas, de colon, vejiga y riñón, así como en las células NIH 3T3 diseñadas para expresar 158P1D7 establemente. Se evalúa el crecimiento celular de las células parentales que carecen de 158P1D7 y de las células que expresan 158P1D7 utilizando ensayos de proliferación bien documentados (véase por ejemplo Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000;44:61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288).

Para confirmar el papel de 158P1D7 en el proceso de transformación, se investiga su efecto en ensayos de formación de colonias. Se comparan células NIH3T3 parentales que carecen de 158P1D7 con células NHI-3T3 que expresan 158P1D7, utilizando un ensayos de agar blando, bajo condiciones rigurosas y más permisivas (Song, Z. y col. Cancer Res. 2000, 60:6730).

Para confirmar el papel de 158P1D7 en la invasión y metástasis de células cancerígenas se utiliza un ensayo bien establecido, por ejemplo, un ensayo Transwell Insert System (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999, 59:6010). Se comparan las células control, entre las que se incluyen líneas celulares prostáticas, de colon, vejiga y riñón que carecen de 158P1D7, con células que expresan 158P1D7, respectivamente. Se cargan las células con colorante fluorescente, calceína y se cultivan en placas en el pocillo superior del inserto Transwell recubierto con un análogo de la membrana de basamento. Se determina la invasión por fluorescencia de las células en una cámara inferior con respecto a la fluorescencia de toda la población celular.

La 158P1D7 también puede desempeñar un papel en el ciclo y en la apoptosis celular. Se comparan células parentales y células que expresan 158P1D7 para ver las diferencias en la regulación del ciclo celular utilizando un ensayo BrdU bien establecido (Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136:247). En breve, las células que se cultivan tanto en condiciones óptimas (con mucho suero) como en condiciones menos óptimas (con poco suero) son marcadas con BrdU y coloreadas con anti-BrdU Ab y yoduro de propidio. Se analiza si las células entran en las fases

G1, S y G2M del ciclo celular. Alternativamente, se evalúa el efecto del estrés sobre la apoptosis en células parentales control y en células que expresan 158P1D7, entre las que se incluyen células de vejiga tumorales y sanas. Se tratan las células diseñadas y parentales con varios agentes quimioterapéuticos, tales como paclitaxel, gemcitabina, etc, y con inhibidores de la síntesis proteica, tales como cicloheximida. Se colorean las células con anexina V-FITC y se mide la muerte celular por análisis FACS. La modulación de la muerte celular por 158P1D7 puede desempeñar un papel crítico en la regulación de la progresión tumoral y de la carga tumoral.

Cuando la 158P1D7 desempeña un papel en el crecimiento celular, la transformación, invasión o apoptosis, entonces se utiliza como blanco para fines de diagnóstico, pronóstico, prevención y terapéuticos.

Ejemplo 40: Implicaci6n en la Angiogenesis

Para el crecimiento tumoral es necesaria la angiogénesis o formación de nuevos vasos sanguíneos capilares (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139:441). Se han hecho numerosos ensayos para medir la angiogénesis in vitro e in vivo, como el ensayo de cultivo de tejidos, formación de conductos de células endoteliales y la proliferación celular endotelial. Se confirma el efecto de la 158P1D7 sobre la angiogénesis utilizando estos ensayos, así como la neo-vascularización in vitr o. Por ejemplo, se evalúan células endoteliales diseñadas para expresar la 158P1D7 utilizando ensayos de formación de conductos y proliferación. También se confirma el efecto de la 158P1D7 en modelos animales in vivo. Por ejemplo, se implantan subcutáneamente en ratones inmunocomprometidas tanto células que expresan 158P1D7 como células que carecen de 158P1D7. Se evalúa la migración de células endoteliales y la angiogénesis 5-15 días después utilizando técnicas inmunohistoquímicas. Cuando la 158P1D7 afecta la angiogénesis, entonces se utiliza como diana con fines de diagnóstico, pronóstico, prevención y terapéuticos.

Ejemplo 41: Regulaci6n de la Transcripci6n

La localización antes mencionada de 158P1D7 hacia el núcleo y su similitud con IGF-BP, que se ha comprobado activa las vías de señal y regula las funciones celulares esenciales, apoya el uso de 158P1D7 en la presente invención, basándose en su papel en la regulación transcripcional de genes eucarióticos. La regulación de la expresión genética se confirma, por ejemplo, estudiando la expresión genética en células que expresan o carecen de 158P1D7. Con este fin se efectúan dos experimentos.

En la primera serie de experimentos se extrae e hibridiza ARN de células parentales y que expresan 158P1D7 a fin de obtener líneas genéticas que se puedan comercializar (Clontech) (Smid-Koopman, E. y col. Br J Cancer. 2000. 83:246). Se comparan las células en reposo así como las células tratadas con FBS o andrógenos. Los genes que se expresan diferencialmente se identifican conforme a los procedimientos conocidos en la técnica. Luego se hace un mapa de las vías biológicas de los genes que se expresan diferencialmente (Chen, K. y col., Thyroid. 2001. 11:41.).

En la segunda serie de experimentos se evalúa la activación de las vías transcripcionales específicas utilizando constructos reporteros de luciferasa comerciales (por ejemplo, Stratagene), entre los que se incluyen NFkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc y CRE-luc. Dichos reporteros transcripcionales contienen sitios de unión consensuados en los factores de transcripción conocidos que estaban debajo de las vías de señal bien caracterizadas, y representan un buen instrumento para determinar la activación de las vías y seleccionar los moduladores positivos y negativos de la activación de éstas.

Cuando la 158P1D7 desempeña un papel en la regulación genética, se utiliza como diana con fines de diagnóstico, de prognóstico, prevención y terapéuticos.

Ejemplo 42: Localizaci6n Subcelular de 15BP1D7

Se evalúa la localización celular de 158P1D7 utilizando técnicas de fraccionamiento subcelular, muy empleadas en biología celular (Storrie, B. y col. Methods Enzymol. 1990;182:203-25). Se separan en fracciones nucleares, citosólicas y de membrana varias líneas celulares, entre las que se incluyen líneas celulares de próstata, riñón y vejiga, así como las líneas celulares diseñadas para expresar 158P1D7. Se analizan la expresión y localización genética en núcleos, membranas pesadas (lisosomas, peroxisomas y mitocondria), membranas ligeras (membrana plasmática y retículo endoplasmático) y fracciones de proteínas solubles utilizando técnicas Western blot.

Alternativamente, las células 293T son transfectadas con un vector de expresión que codifica genes individuales, etiquetados HIS (PCADN 3.1 MYC/HIS, Invitrogen) y la localización subcelular de dichos genes es determinada como se describe arriba. En resumen, las células transfectadas son recogidas y sometidas a un protocolo de fraccionamiento subcelular diferencial (Pemberton, P.A. y col., 1997, J of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1697-1706). Se sigue la localización de los genes etiquetados HIS por Western blot.

Utilizando anticuerpos 158P1D7 es posible demostrar la localización celular por inmunofluorescencia e inmunohistoquímica. Por ejemplo, las células que expresan o carecen de 158P1D7 son adheridas a una platina de microscopio y coloreadas con Ab específico anti-158P1D7. Las células son incubadas con un Ab anti-especie secundario acoplado a FITC y analizadas al microscopio fluorescente. Alternativamente, las células y tejidos que carecen o expresan 158P1D7 son analizadas por IHC como se describe en este documento.

Cuando la 158P1D7 se localiza en compartimentos celulares específicos se utiliza como diana con fines de diagnóstico, pronóstico, prevención y terapéuticos.

Ejemplo 43: Implicaci6n de 15BP1D7 en el Trafico de Proteinas

Debido a su similitud con las proteínas Slit, 158P1D7 puede regular el tráfico intracelular y la retención en compartimentos mitocondriales y/o nucleares. Su papel en el tráfico de proteínas se puede confirmar utilizando procedimientos bien establecidos. (Valetti C. y col. Mol Biol Cell. 1999, 10:4107). Por ejemplo, la a2-microglobulina conjugada a FITC es incubada con células que expresan 158P1D7 y con células 158P1D7-negativas. La localización y captación de FITC-a2–macroglobulina son visualizadas en un microscopio fluorescente. En otro procedimiento, la co-localización de 158P1D7 es visualizada por técnicas de coprecipitación y Western blot y con microscopio fluorescente.

Alternativamente, las células que expresan 158P1D7 y que carecen de 158P1D7 son comparadas utilizando seroalbúmina bovina marcada con ceramida Bodipy (Huber, L. y col. Mol. Cell. Biol. 1995, 15:918). En resumen, se deja que las células absorban la BSA marcada y se ponen alternativamente a 4ºC y 18ºC para que tenga lugar el tráfico. Luego se analiza en las células la presencia de BSA marcada, en tiempos diferentes, con un microscopio fluorescente en compartimentos vesiculares específicos entre los que se incluyen la vesícula de Golgi, el retículo endoplásmico, etc.

En otra realización, se examina el efecto de 158P1D7 sobre el transporte de la membrana utilizando complejos biotina-avidina. Las células que expresan o carecen de 158P1D7 se incuban temporalmente con biotina. Se pone transitoriamente a las células a 4ºC o temporalmente se calientan a 37ºC durante varios períodos de tiempo. Luego se fraccionan y se examina la presencia de biotina en compartimentos celulares específicos por precipitación de afinidad con avidina. Utilizando dichos sistemas de ensayo, se identifican proteínas, anticuerpos y moléculas pequeñas que modifican el efecto de la 158P1D7 sobre el transporte vesicular. Cuando 158P1D7 desempeña un papel en el tráfico intracelular, la 158P1D7 es una diana con fines de diagnóstico, pronóstico, prevención y terapéutico.

Ejemplo 44: Asociaci6n Proteina-Proteina

Se ha comprobado que las proteínas IGF y IGF-BP interactúan con otras proteínas, formando así complejos que pueden regular la localización de la proteína, su actividad biológica, transcripción genética y transformación celular (Zeslawski, W. y col., EMBO J. 2001, 20:3638; Yu H, Rohan T, J Natl Cancer Inst. 2000, 92:1472). Utilizando técnicas de inmunoprecipitación así como dos sistemas híbridos de levaduras, se identifican proteínas que se asocian a 158P1D7. Se comparan los inmunoprecipitados de las células que expresan 158P1D7 y de las células que carecen de 158P1D7 para ver las asociaciones específicas proteína-proteína.

Se llevan a cabo estudios para determinar el alcance de la asociación de la 158P1D7 con receptores tales como los receptores EGF y IGF y con proteínas intracelulares tales como IGF-BP, proteínas citoesqueletales, etc. Los estudios que comparan las células positivas 158P1D7 y las células negativas 158P1D7, así como aquellos que comparan las células no estimuladas/en reposo y las células tratadas con activadores celulares epiteliales, tales como citoquinas, factores de crecimiento y Ab anti-integrina, revelan interacciones únicas proteína-proteína.

Además, se confirman las interacciones proteína-proteína utilizando una metodología de dos híbridos en levaduras (Curr Opin Chem Biol. 1999, 3:64). Se introduce un vector con una colección de proteínas fusionadas al dominio de activación de un factor de transcripción en levaduras que expresan una proteína de fusión del dominio de unión al ADN 158P1D7 y un constructo reportero. La interacción proteína-proteína se detecta por ensayo colorimétrico de la actividad del reportero. La asociación específica con los receptores superficiales y moléculas efectoras indica al experto el modo de acción de la 158P1D7 y así identifica los objetivos terapéuticos, de pronóstico, preventivos y/o de diagnóstico del cáncer. Este y ensayos similares se han utilizado también para identificar y seleccionar moléculas pequeñas que interactúan con 158P1D7.

Cuando la 158P1D7 se asocia con proteínas o moléculas pequeñas, se utiliza como diana con fines de diagnóstico, de pronóstico, prevención y terapia.

TABLAS

TABLA I: Tejidos que expresan 15BP1D7 cuando es maligno: Vejiga, Próstata, Colon, Pulmón, Mama, Ovario TABLA II: Abreviaturas de aminoacidos

UNA LETRA

TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO

F

Phe fenilalanina

L

Leu leucina

S

Ser serina

Y

Tyr tirosina

C

Cys cisteína

W

Trp triptófano

P

Pro prolina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

R

Arg arginina

I

Ile isoleucina

M

Met metionina

T

Thr treonina

N

Asn asparagina

K

Lys lisina

V

Val valina

A

Ala alanina

D

Asp ácido aspártico

E

Glu ácido glutámico

G

Gly glicina

TABLA III: MATRIZ DE SUSTITUCION DE AMINOACIDOS

Adaptada de la matriz de sustitución de aminoácidos (matriz de sustitución de bloques) GCG Software 9.0 BLOSUM62. Cuanto mayor sea el valor, más probabilidades hay de encontrar una sustitución en proteínas naturales relacionadas (véase URL www.ikp.unibe.ch/manual/blosum62.html).

TABLA IV A

SUPERMOTIVOS

POSICIÓN POSICIÓN POSICIÓN

2 (Anclaje Primario)

3 (Anclaje Primario) Término C (Anclaje Primario)

A1

TI VMS FWY

A2

LIVMAnQ IVMAn

A3

VSMATLI RK

A24

YFWIV Mn FIYW M

B7

P VILFMWYA

B27

RHK FYLWMIVA

B44

ED FWYLIMVA

B58

ATS FWY IVMA

B62

QLIVMP FWYMIVLA

MOTIVOS

A1

TSM Y

(continuación)

A1

DEAS Y

A2.1

LMVQIAn V IMAn

A3

LMVISATFCGD KYRHFA

A11

VTMLISAGNCDF KRYH

A24

YFWM FLIW

A*3101

MVTA IS RK

A*3301

MVALFISn RK

A*6801

AVTMS I RK

B*0702

P LMFWYAIV

B*3501

P LMFWYIVA

B51

P LIVFWYAM

B*5301

P IMFWYA V

B*5401

P ATIV MFWY

Los residuos indicados en negrita son preferentes, los indicados en cursiva son menos preferentes: Se considera que un péptido es portador de motivo si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primario para un motivo

o supermotivo tal como se especifica en la tabla arriba mostrada

TABLA IV (B) SUPERMOTIVO HLS CLASE II

1

6 9

W,F,Y,V,.I,L

A, V, I, L, P, C, S, T A, V, I, L, C, S, T, M, Y

TABLA IV C

MOTIVOS

1° anclaje 1 2 3 4 5 1° anclaje 6 7 8 9

DR4

preferente nocivo FMY IVW M T W I VSTCPA IM MH R MH WDE

DR1

preferente nocivo MF IVWY C CH PAMQ FD CWD VMATSP IC M GDE D AVM

DR7

preferente nocivo MF IVWY M C W A G IVMSACnP M GRD N IV G

(continuación)

DR3

MOTIVOS 1º Anclaje 2 3 1º Anclaje 5 1º Anclaje 6

Motivo a preferido

1 4

Motivo b

LIVMFY D

Preferido

LIVMFAY DNQEST KRH

Supermotivo DR

MF IVWY VMSTACPLI

Residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o “tolerados”

TABLA IV D POSICION

SUPERMOTIVOS

1 2 3 4 5 6 7 8 Término C

A1

1º Anclaje TI VMS 1º Anclaje FWY

A2

1º Anclaje LIVMAnQ

A3

preferente nocivo DE (3/5) P 1º Anclaje VSMAn 1 YFW (4/5) DE (4/5) YFW (3/5) YFW (4/5) P (4/5) 1º Anclaje RK

(5/5)

A24

1º Anclaje YFWIV Mn 1º Anclaje FIYW M

B7

preferente nocivo FWY (5/5); LIVM (3/5); DE (3/5); P (5/5); G (415); A (3/5); QN (3/5) 1º Anclaje P FWY (4/5) DE (3/5) G (4/5) QN (4/5) FWY (3/5) DE (4/5) 1º Anclaje VILFMWYA

B27

1º Anclaje RHK 1º Anclaje FYLWMIVA

(continuación)

POSICION

SUPERMOTIVOS

1 2 3 4 5 6 7 8 Término C

B44

1º Anclaje 1º Anclaje

ED

FYLWMIVA

B58

1º Anclaje 1º Anclaje

ATS

FWY IVMA

B62

1º Anclaje 1º Anclaje

QLIVMP

FWYMIV A

TABLA IV E

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Término C

A1 – 9inch preferente GFYW 1º AnclajeDEA YFW P DEQN YFW o término C1º anclajenocivo DE STM RHKLIVMP A G A

Y

A1 9-mer preferente GRHK ASTCLIVM1º AnclajeGSTCASTC: LIVM DE 1º Anclajenocivo A RHKDEPYDEAS DE PQN RHK PG GP Y PW

A1 10-mer preferente YWF 1º AnclajeDEAQN A YFWQNPASTCGDE P 1º Anclajenocivo GP STM RHKGLIVM DE RHK QNA RHXYFW RHK A Y

A1 10-mer preferente YWF STCLIVM1º AnclajeA YFW PG G YWF 1º Anclajenocivo RHK RHKDEPYFW DEAS P G PRHKQN Y

A21 9-mer preferente YWF 1º AnclajeYWF STC YFW A P 1º Anclaje nocivo DEP LMIVQAn DERKH RHK DERKH V IMAn

A2.1 10-preferente AYI·W 1º AnclajeLVIM G G FYWL 1º Anclajemer nocivo DEP LMIVQAn DE RKHA P RKH VIM RKH V IMAn

DERKH

3 preferente DEP RHKYTW PRHKYFW A YFW P 1º Anclajenocivo 1º AnclajeKYRHFA LMVISATFCGD DE

11 preferente A 1º AnclajeYFW YFW A YFW YFW P 1º Anclajenocivo DEP VTLMISAG A G KRVH NCDF

24 ner preferente YFWRHK 1º AnclajeSTCYFW YFW 1º Anclajenocivo DEG YFWM DE G QNP DERHK G AQN FLIW

(continuación)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Término C

24 mer preferente 1º AnclajeP YFW P 1º AnclajenocivoYFWM GDE QN RHK DE A QN DEA FLIW

101 preferente RHKMVTA IS 1º AnclajeYFW AP 1º Anclaje

nocivo DEP DE YFW P ADE DE DE DE RK YFW

301 preferente 1º AnclajeYFW AYFW 1º Anclajenocivo GP MVAL FISn DE RK

A6801 preferente YFWSTC1º Anclaje YFWLIVM YFW P 1º Anclajenocivo GP AVTMS I DEG RHKA RK

B0702 preferente RHKFWY 1º AnclajeRHKRHKRHKRHKPA 1º Anclajenocivo DEQNP P DEP DE DE DE QN DE LMFWYAIV

B3501 preferente FWYLIVM1º AnclajeFWY FWY 1º Anclaje

nocivo AGP P G G LMFWYIV A

B51 preferente LIVMFWY 1º AnclajeFWY STC FWYG FWY1º Anclajenocivo AGPDERH P DE G DEQN GDE LIVFWYAM KSTC

B5301 preferente LIVMFWY 1º AnclajeFWY STC FWY LIVMFWY FWY1º Anclaje

nocivo AGPQN P G RHKQN DE IMFWY A V

5

(continuación)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Término C

B5401 preferente FWY1º AnclajeFWYLIVMLIVM nocivo GPQNDE P GDESIC RHKDE DE QNDGE DE

Residuos en cursiva indica menos residuos menos preferidos o “tolerados”. La información de esta tabla es específica para 9-méros a menos que se indique de otra forma.

TABLA V Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A1, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una Molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

150 VIEPSAFSK 900,000 1.

2

436 NLEYLYLEY 225,000 2.

3

812 LVEQTKNEY 45,000 3.

4

828 HAEPDYLEV 45,000 4.

5

711 GSDAKHLQR 37,500 5.

6

546 CTSPGHLDK 25,000 6.

7

265 SICPTPPVY 10,000 7.

8

351 NIESLSDLR 9,000 8.

9

799 LMETLMYSR 9,000 9.

10

173 ESLPPNIFR 7,500 10.

11

650 DNSPVHLQY 6,250 11.

12

601 LTDAVPLSV 6,250 12.

13

174 SLPPNIFRF 5,000 13.

14

100 IADIEIGAF 5,000 14.

15

682 MVSPMVHVY 5,000 15.

16

102 DIEIGAFNG 4,500 16.

17

134 GLENLEFLQ 4,500 17.

38

47 NCEAKGIKM 4,500 18.

19

383 LVEYFTLEM 4,500 19.

20

401 VLEEGSFMN 4,500 20.

21

388 TLEMLHLGN 4,500 21.

22

749 FQDASSLYR 3,750 22.

23

56 VSEISVPPS 2,700 23.

24

561 NSEILCPGL 2,700 24.

25

431 FLGLHNLEY 2,500 25.

26

291 INDSRMSTK 2,500 26.

27

142 QADNNFITV 2,500 27.

28

502 ILDDLDLLT 2,500 28.

29

522 SCDLVGLQQ 2,500 29.

30

223 NCDLLQLKT 2,500 30.

(continuación)

TABLA V Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A1, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una Molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

31

771 ITEYLRKNI 2,250 31.

32

232 WLENMPPQS 1,800 32.

33

171 AIESLPPNI 1,800 33.

34

137 NLEFLQADN 1,800 34.

35

355 LSDLRPPPQ 1,500 35.

36

380 KSDLVEYFT 1,500 36.

37

59 ISVPPSRPF 1,500 37.

38

255 GSILSRLKK 1,500 38.

39

540 VTDDILCTS 1,250 39.

40

308 TKAPGLIPY 1,250 40.

41

817 KNEYFELKA 1,125 41.

42

743 STEFLSFQD 1,125 42.

43

359 RPPPQNPRK 1,000 43.

44

246 VCNSPPFFK 1,000 44.

45

417 YLNGNHLTK 1,000 45.

46

433 GLHNLEYLY 1,000 46.

47

785 DMEAHYPGA 0,900 47.

48

398 RIEVLEEGS 0,900 48.

49

701 EEEEERNEK 0,900 49.

50

833 YLEVLEQQT 0,900 50.

TABLA VI Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7-A1, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de SubSecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

56 VSEISVPPSR 27,000 51.

2

669 TTERPSASLY 11,250 52.

3

210 ILDLQLEDNK 10,000 53.

4

781 QLQPDMEAHY 10,000 54.

5

150 VIEPSAFSKL 9,000 55.

6

171 AIESLPPNIF 9,000 56.

7

828 HAEPDYLEVL 9,000 57.

8

123 SLEILKEDTF 9,000 58.

9

398 RIEVLEEGSF 9,000 59.

10

812 LVEQTKNEYF 9,000 60.

11

173 ESLPPNIFRF 7,500 61.

32

546 CTSPGHLDKK 5,000 62.

13

134 GLENLEFLQA 4,500 63.

14

401 VLEEGSFMNL 4,500 64.

15

380 KSDLVEYFTL 3,750 65.

16

456 NPMPKLKVLY 2,500 66.

17

505 DLDLLTQIDL 2,500 67.

18

502 ILDDLDLLTQ 2,500 68.

19

743 STEFLSFQDA 2,250 69.

20

771 ITEYLRKNIA 2,250 70.

21

682 MVSPMVHVYR 2,000 71.

22

214 QLEDNKWACN 1,800 72.

23

355 LSDLRPPPQN 1,500 73.

24

264 ESICPTPPVY 1,500 74.

25

753 SSLYRNILEK 1,500 75.

26

561 NSEILCPGLV 1,350 76.

27

601 LTDAVPLSVL 1,250 77.

28

276 HEDPSGSLHL 1,250 78.

29

590 TTNTADTILR 1,250 79.

30

149 TVIEPSAFSK 1,000 80.

(continuación)

TABLA VI Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7-A1, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de SubSecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

31

106 GAFNGLGLLK 1,000 81.

32

801 ETLMYSRPRK 1,000 82.

33

545 LCTSPGHLDK 1,000 83.

34

824 KANLHAEPDY 1,000 84.

35

525 LVGLQQWIQK 1,000 85.

36

300 TTSILKLPTK 1,000 86.

37

477 HIFSGVPLTK 1,000 87.

38

100 IADIEIGAFN 1,000 88.

39

768 QLGITEYLRK 1,000 89.

40

245 VVCNSPPFFK 1,000 90.

41

721 LLEQENHSPL 0,900 91.

42

700 LEEEEERNEK 0,900 92.

43

102 DIEIGAFNGL 0,900 93.

44

441 YLEYNAIKEI 0,900 94.

45

436 NLEYLYLEYN 0,900 95.

46

36 NCEEKDGTML 0,900 96.

47

513 DLEDNPWDCS 0,900 97.

48

383 LVEYFTLEML 0,900 98.

49

388 TLEMLHLGNN 0,900 99.

50

137 NLEFLQADNN 0,900 100.

TABLA VII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A2, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de SubSecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

465 YLNNNLLQV 735,860 101.

2

614 LLIMFITIV 423,695 102.

(continuación) (continuación)

TABLA VII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A2, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de SubSecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

3

193 NQLQTLPYV 330,059 103.

4

616 IMFITIVFC 285,492 104.

5

140 FLQADNNFI 263,950 105.

6

415 KLYLNGNHL 239,259 106.

7

439 YLYLEYNAI 230,356 107.

8

611 ILGLLIMFI 224,357 108.

9

2 KLWIHLFYS 158,832 109.

10

429 GMFLGLHNL 131,296 110.

11

581 YLMVTTPAT 126,833 111.

12

463 VLYLNNNLL 116,211 112.

13

574 SMPTQTSYL 84,856 113.

14

71 LLNNGLTML 83,527 114.

15

4 WIHLFYSSL 77,017 115.

16

305 KLPTKAPGL 74,768 116.

17

613 GLLIMFITI 73,343 117.

18

213 LQLEDNKWA 71,445 118.

19

826 NLHAEPDYL 57,572 119.

20

803 LMYSRPRKV 54,652 120.

21

501 NILDDLDLL 50,218 121.

22

798 KLMETLMYS 50,051 122.

23

527 GLQQWIQKL 49,134 123.

24

158 KLNRLKVLI 36,515 124.

25

178 NIFRFVPLT 33,135 125.

26

225 DLLQLKTWL 32,604 126.

27

462 KVLYLNNNL 24,206 127.

28

767 QQLGITEYL 21,597 128.

29

116 QLHINHNSL 21,362 129.

TABLA VII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A2, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de SubSecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

68 QLSLLNNGL 21,362 130.

31

502 ILDDLDLLT 20,776 131.

32

70 SLLNNGLTM 18,382 132.

33

470 LLQVLPPHI 17,736 133.

34

391 MLHLGNNRI 17,736 134.

35

164 VLILNDNAI 17,736 135.

36

337 VLSPSGLLI 17,736 136.

37

774 YLRKNIAQL 17,177 137.

38

450 ILPGTFNPM 16,047 138.

39

323 QLPGPYCPI 15,649 139.

40

367 KLILAGNII 14,971 140.

41

316 YITKPSTQL 13,512 141.

42

141 LQADNNFIT 12,523 142.

43

214 QLEDNKWAC 9,777 143.

44

582 LMVTTPATT 9,149 144.

45

758 NILEKEREL 8,912 145.

46

17 SLHSQTPVL 8,759 146.

47

182 FVPLTHLDL 8,598 147.

48

609 VLILGLLIM 7,964 148.

49

295 RMSTKTTSI 7,535 149.

50

309 KAPGLIPYI 6,415 150.

TABLA VIII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A2, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

613 GLLIMFITIV 922,161 151.

2

431 FLGLHNLEYL 609,108 152.

3

616 IMFITIVFCA 301,064 153.

4

600 SLTDAVPLSV 285,163 154.

5

417 YLNGNHLTKL 226,014 155.

6

473 VLPPHIFSGV 224,653 156.

7

70 SLLNNGLTML 181,794 157.

8

433 GLHNLEYLYL 176,240 158.

9

166 ILNDNAIESL 167,806 159.

10

407 FMNLTRLQKL 163,232 160.

11

174 SLPPNIFRFV 145,364 161.

12

425 KLSKGMFLGL 142,060 162.

13

581 YLMVTTPATT 126,833 163.

14

409 NLTRLQKLYL 117,493 164.

15

610 LILGLLIMFI 114,142 165.

16

746 FLSFQDASSL 98,267 166.

17

213 LQLEDNKWAC 97,424 167.

18

141 LQADNNFITV 93,387 168.

19

465 YLNNNLLQVL 92,666 169.

20

369 ILAGNIIHSL 83,527 170.

21

415 KLYLNGNHLT 83,462 171.

22

140 FLQADNNFIT 81,516 172.

23

158 KLNRLKVLIL 70,507 173.

24

611 ILGLLIMFIT 69,289 174.

25

78 MLHTNDFSGL 69,001 175.

26

615 LIMFITIVFC 54,353 176.

27

802 TLMYSRPRKV 51,468 177.

28

531 WIQKLSKNTV 43,992 178.

29

469 NLLQVLPPHI 38,601 179.

30

67 FQLSLLNNGL 36,864 180.

(continuación)

TABLA VIII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A2, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

31

803 LMYSRPRKVL 34,412 181.

32

115 KQLHINHNSL 28,049 182.

33

462 KVLYLNNNLL 24,206 183.

34

86 GLTNAISIHL 21,362 184.

35

401 VLEEGSFMNL 18,106 185.

36

44 MLINCEAKGI 17,736 186.

37

596 TILRSLTDAV 17,338 187.

38

621 IVFCAAGIVV 15,695 188.

39

501 NILDDLDLLT 15,544 189.

40

4 WIHLFYSSLL 13,512 190.

41

486 KVNLKTNQFT 12,552 191.

42

163 KVLILNDNAI 11,822 192.

43

336 KVLSPSGLLI 11,822 193.

44

60 SVPPSRPFQL 10,841 194.

45

282 SLHLAATSSI 10,433 195.

46

110 GLGLLKQLHI 10,433 196.

47

766 LQQLGITEYL 9,923 197.

48

126 ILKEDTFHGL 9,902 198.

49

15 CISLHSQTPV 9,563 199.

50

582 LMVTTPATTT 9,149 200.

TABLA IX Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A3, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

754 SLYRNILEK 300,000 201.

2

417 YLNGNHLTK 60,000 202.

3

407 FMN nR QK 40,000 203.

4

433 GLHNLEYLY 36,000 204.

5

802 TLMYSRPRK 30,000 205.

6

43 TMLINCEAK 30,000 206.

7

342 GLLIHCQER 18,000 207.

8

799 LMETLMYSR 18,000 208.

9

613 GLLIMFITI 16,200 209.

10

429 GMFLGLHNL 13,500 210.

11

174 SLPPNIFRF 13,500 211.

12

768 QLGITEYLR 12,000 212.

13

627 GIVVLVLHR 10,800 213.

14

150 VIEPSAFSK 9,000 214.

15

415 KLYLNGNHL 9,000 215.

16

527 GLQQWIQKL 8,100 216.

17

436 NLEYLYLEY 8,000 217.

18

431 FLGLHNLEY 8,000 218.

19

378 LMKSDLVEY 6,000 219.

20

529 QQWIQKLSK 6,000 220.

21

546 CTSPGHLDK 3,000 221.

22

463 VLYLNNNLL 3,000 222.

23

439 YLYLEYNAI 3,000 223.

24

2 KLWIHLFYS 2,700 224.

25

367 KLILAGNII 2,700 225.

26

297 STKTTSILK 2,000 226.

27

6 HLFYSSLLA 2,000 227.

28

632 VLHRRRRYK 2,000 228.

29

409 NLTRLQKLY 2,000 229.

(continuación)

TABLA IX Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A3, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

611 ILGLLIMFI 1,800 230.

31

337 VLSPSGLLI 1,800 231.

32

305 KLPTKAPGL 1,800 232.

33

390 EMLHLGNNR 1,800 233.

34

158 KLNRLKVLI 1,800 234.

35

682 MVSPMVHVY 1,800 235.

36

616 IMFITIVFC 1,500 236.

37

659 SMYGHKTTH 1,500 237.

38

628 IVVLVLHRR 1,350 238.

39

614 LLIMFITIV 1,350 239.

40

323 QLPGPYCPI 1,350 240.

41

610 LILGLLIMF 1,350 241.

42

729 PLTGSNMKY 1,200 242.

43

453 GTFNPMPKL 1,012 243.

44

228 QLKTWLENM 0,900 244.

45

450 ILPGTFNPM 0,900 245.

46

615 LIMFITIVF 0,900 246.

47

609 VLILGLLIM 0,900 247.

48

255 GSILSRLKK 0,900 248.

49

482 VPLTKVNLK 0,900 249.

50

774 YLRKNIAQL 0,900 250.

TABLA X Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A3, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

439 YLYLEYNAIK 300,000 251.

2

798 KLMETLMYSR 121,500 252.

3

632 VLHRRRRYKK 60,000 253.

4

768 QLGITEYLRK 40,000 254.

5

477 HIFSGVPLTK 30,000 255.

6

210 ILDLQLEDNK 20,000 256.

7

481 GVPLTKVNLK 18,000 257.

8

681 HMVSPMVHVY 18,000 258.

9

616 IMFITIVFCA 13,500 259.

10

149 TVIEPSAFSK 13,500 260.

11

158 KLNRLKVLIL 10,800 261.

12

425 KLSKGMFLGL 10,800 262.

13

815 QTKNEYFELK 9,000 263.

14

609 VLILGLLIMF 9,000 264.

15

245 VVCNSPPFFK 9,000 265.

16

614 LLIMFITIVF 9,000 266.

17

811 VLVEQTKNEY 9,000 267.

18

377 SLMKSDLVEY 9,000 268.

19

453 GTFNPMPKLK 7,500 269.

20

781 QLQPDMEAHY 6,000 270.

21

655 HLQYSMYGHK 6,000 271.

22

378 LMKSDLVEYF 6,000 272.

23

75 GLTMLHTNDF 6,000 273.

24

106 GAFNGLGLLK 6,000 274.

25

2 KLWIHLFYSS 5,400 275.

26

86 GLTNAISIHL 5,400 276.

27

401 VLEEGSFMNL 5,400 277.

28

42 GTMLINCEAK 4,500 278.

29

613 GLLIMFITIV 4,050 279.

(continuación)

TABLA X Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A3, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

627 GIVVLVLHRR 4,050 280.

31

525 LVGLQQWIQK 4,000 281.

32

134 GLENLEFLQA 3,600 282.

33

433 GLHNLEYLYL 3,600 283.

34

110 GLGLLKQLHI 3,600 284.

35

6 HLFYSSLLAC 3,000 285.

36

470 LLQVLPPHIF 3,000 286.

37

194 QLQTLPYVGF 3,000 287.

38

290 SINDSRMSTK 3,000 288.

39

126 ILKEDTFHGL 2,700 289.

40

357 DLRPPPQNPR 2,700 290.

41

796 ELKLMETLMY 2,400 291.

42

546 CTSPGHLDKK 2,250 292.

43

803 LMYSRPRKVL 2,250 293.

44

729 PLTGSNMKYK 2,250 294.

45

369 ILAGNIIHSL 2,025 295.

46

123 SLEILKEDTF 2,000 296.

47

765 ELQQLGITEY 1,800 297.

48

112 GLLKQLHINH 1,800 298.

49

367 KLILAGNIIH 1,800 299.

50

78 MLHTNDFSGL 1,800 300.

TABLA XI Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A11, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

529 QQWIQKLSK 2,400 301.

2

297 STKTTSILK 2,000 302.

3

546 CTSPGHLDK 2,000 303.

4

754 SLYRNILEK 1,600 304.

5

656 LQYSMYGHK 1,200 305.

6

150 VIEPSAFSK 1,200 306.

7

407 FMNLTRLQK 0,800 307.

8

802 TLMYSRPRK 0,800 308.

9

417 YLNGNHLTK 0,800 309.

10

627 GIVVLVLHR 0,720 310.

11

628 IVVLVLHRR 0,600 311.

12

440 LYLEYNAIK 0,600 312.

13

246 VCNSPPFFK 0,600 313.

14

359 RPPPQNPRK 0,600 314.

15

664 KTTHHTTER 0,600 315.

16

43 TMLINCEAK 0,600 316.

17

730 LTGSNMKYK 0,500 317.

18

478 IFSGVPLTK 0,400 318.

19

107 AFNGLGLLK 0,400 319.

20

372 GNIIHSLMK 0,360 320.

21

342 GLLIHCQER 0,360 321.

22

482 VPLTKVNLK 0,300 322.

23

728 SPLTGSNMK 0,300 323.

24

420 GNHLTKLSK 0,240 324.

25

749 FQDASSLYR 0,240 325.

26

287 ATSSINDSR 0,200 326.

27

790 YPGAHEELK 0,200 327.

28

328 YCPIPCNCK 0,200 328.

29

255 GSILSRLKK 0,180 329.

(continuación)

TABLA XI Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A11, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

799 LMETLMYSR 0,160 330.

31

768 QLGITEYLR 0,160 331.

32

20 SQTPVLSSR 0,120 332.

33

454 TFNPMPKLK 0,100 333.

34

550 GHLDKKELK 0,090 334.

35

809 RKVLVEQTK 0,090 335.

36

336 KVLSPSGLL 0,090 336.

37

462 KVLYLNNNL 0,090 337.

38

163 KVLILNDNA 0,090 338.

39

252 FFKGSILSR 0,080 339.

40

351 NIESLSDLR 0,080 340.

41

769 LGITEYLRK 0,060 341.

42

526 VGLQQWIQK 0,060 342.

43

453 GTFNPMPKL 0,060 343.

44

42 GTMLINCEA 0,060 344.

45

629 VVLVLHRRR 0,060 345.

46

608 SVLILGLLI 0,060 346.

47

183 VPLTHLDLR 0,060 347.

48

486 KVNLKTNQF 0,060 348.

49

481 GVPLTKVNL 0,060 349.

50

707 NEKEGSDAK 0,060 350.

TABLA XII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A11, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

149 TVIEPSAFSK 9,000 351.

2

245 VVCNSPPFFK 6,000 352.

3

42 GTMLINCEAK 6,000 353.

4

481 GVPLTKVNLK 6,000 354.

5

525 LVGLQQWIQK 4,000 355.

6

453 GTFNPMPKLK 3,000 356.

7

106 GAFNGLGLLK 2,400 357.

8

477 HIFSGVPLTK 1,600 358.

9

416 LYLNGNHLTK 1,200 359.

10

528 LQQWIQKLSK 1,200 360.

11

815 QTKNEYFELK 1,000 361.

12

300 TTSILKLPTK 1,000 362.

13

546 CTSPGHLDKK 1,000 363.

14

798 KLMETLMYSR 0,960 364.

15

200 YVGFLEHIGR 0,800 365.

16

406 SFMNLTRLQK 0,800 366.

17

439 YLYLEYNAIK 0,800 367.

18

768 QLGITEYLRK 0,800 368.

19

632 VLHRRRRYKK 0,800 369.

20

801 ETLMYSRPRK 0,450 370.

21

310 APGLIPYITK 0,400 371.

22

789 HYPGAHEELK 0,400 372.

23

655 HLQYSMYGHK 0,400 373.

24

451 LPGTFNPMPK 0,400 374.

25

689 VYRSPSFGPK 0,400 375.

26

545 LCTSPGHLDK 0,400 376.

27

210 ILDLQLEDNK 0,400 377.

28

590 TTNTADTILR 0,400 378.

29

290 SINDSRMSTK 0,400 379.

(continuación)

TABLA XII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A11, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

45 LINCEAKGIK 0,400 380.

31

682 MVSPMVHVYR 0,400 381.

32

182 FVPLTHLDLR 0,400 382.

33

767 QQLGITEYLR 0,360 383.

34

627 GIVVLVLHRR 0,360 384.

35

631 LVLHRRRRYK 0,300 385.

36

221 ACNCDLLQLK 0,200 386.

37

336 KVLSPSGLLI 0,180 387.

38

706 RNEKEGSDAK 0,120 388.

39

254 KGSILSRLKK 0,120 389.

40

462 KVLYLNNNLL 0,090 390.

41

163 KVLILNDNAI 0,090 391.

42

621 IVFCAAGIVV 0,080 392.

43

748 SFQDASSLYR 0,080 393.

44

119 INHNSLEILK 0,080 394.

45

753 SSLYRNILEK 0,060 395.

46

60 SVPPSRPFQL 0,060 396.

47

490 KTNQFTHLPV 0,060 397.

48

700 LEEEEERNEK 0,060 398.

49

628 IVVLVLHRRR 0,060 399.

50

608 SVLILGLLIM 0,060 400.

TABLA XIII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A24, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

443 EYNAIKEIL 420,000

1

2

789 HYPGAHEEL 330,000

2

3

819 EYFELKANL 288,000

3

4

804 MYSRPRKVL 200,000

4

5

8 FYSSLLACI 60,000

5

6

386 YFTLEMLHL 20,000

6

7

139 EFLQADNNF 18,000

7

8

462 KVLYLNNNL 17,280

8

9

350 RNIESLSDL 14,400

9

10

599 RSLTDAVPL 12,000

10

11

336 KVLSPSGLL 12,000

11

12

305 KLPTKAPGL 12,000

12

13

736 KYKTTNQST 12,000

13

14

580 SYLMVTTPA 10,500

14

15

415 KLYLNGNHL 9,600

15

16

272 VYEEHEDPS 9,000

16

17

202 GFLEHIGRI 9,000

17

18

438 EYLYLEYNA 9,000

18

19

466 LNNNLLQVL 8,640

19

20

767 QQLGITEYL 8,400

20

21

203 FLEHIGRIL 8,400

21

22

607 LSVLILGLL 8,400

22

23

87 LTNAISIHL 8,400

23

24

537 KNTVTDDIL 8,000

24

25

219 KWACNCDLL 8,000

25

26

758 NILEKEREL 7,920

26

27

408 MNLTRLQKL 7,920

27

28

527 GLQQWIQKL 7,920

28

29

416 LYLNGNHLT 7,500

29

(continuación)

TABLA XIII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A24, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

199 PYVGFLEHI 7,500

30

31

486 KVNLKTNQF 7,200

31

32

109 NGLGLLKQL 7,200

32

33

196 QTLPYVGFL 7,200

33

34

133 HGLENLEFL 7,200

34

35

225 DLLQLKTWL 7,200

35

36

83 DFSGLTNAI 7,200

36

37

456 NPMPKLKVL 7,200

37

38

561 NSEILCPGL 7,200

38

39

501 NILDDLDLL 7,200

39

40

500 SNILDDLDL 6,000

40

41

221 ACNCDLLQL 6,000

41

42

71 LLNNGLTML 6,000

42

43

604 AVPLSVLIL 6,000

43

44

182 FVPLTHLDL 6,000

44

45

347 CQERNIESL 6,000

45

46

669 TTERPSASL 6,000

46

47

10 SSLLACISL 6,000

47

48

590 TTNTADTIL 6,000

48

49

481 GVPLTKVNL 6,000

49

50

432 LGLHNLEYL 6,000

50

TABLA XIV Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A24, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

773 EYLRKNIAQL 300,000 401.

2

385 EYFTLEMLHL 200,000 402.

3

438 EYLYLEYNAI 90,000 403.

4

181 RFVPLTHLDL 72,000 404.

5

202 GFLEHIGRIL 50,400 405.

6

677 LYEQHMVSPM 37,500 406.

7

315 PYITKPSTQL 30,000 407.

8

252 FFKGSILSRL 28,000 408.

9

622 VFCAAGIVVL 20,000 409.

10

179 IFRFVPLTHL 20,000 410.

11

359 RPPPQNPRKL 15,840 411.

12

462 KVLYLNNNLL 14,400 412.

13

115 KQLHINHNSL 14,400 413.

14

757 RNILEKEREL 13,200 414.

15

832 DYLEVLEQQT 12,960 415.

16

691 RSPSFGPKHL 12,000 416.

17

428 KGMFLGLHNL 12,000 417.

18

158 KLNRLKVLIL 12,000 418.

19

131 TFHGLENLEF 11,000 419.

20

425 KLSKGMFLGL 9,600 420.

21

150 VIEPSAFSKL 9,504 421.

22

139 EFLQADNNFI 9,000 422.

23

102 DIEIGAFNGL 8,640 423.

24

465 YLNNNLLQVL 8,640 424.

25

67 FQLSLLNNGL 8,640 425.

26

401 VLEEGSFMNL 8,640 426.

27

497 LPVSNILDDL 8,400 427.

28

766 LQQLGITEYL 8,400 428.

29

96 GFNNIADIEI 8,250 429.

(continuación)

TABLA XIV Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - A24, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

738 KTTNQSTEFL 8,000 430.

31

380 KSDLVEYFTL 8,000 431.

32

295 RMSTKTTSIL 8,000 432.

33

526 VGLQQWIQKL 7,920 433.

34

407 FMNLTRLQKL 7,920 434.

35

580 SYLMVTTPAT 7,500 435.

36

464 LYLNNNLLQV 7,500 436.

37

828 HAEPDYLEVL 7,200 437.

38

329 CPIPCNCKVL 7,200 438.

39

36 NCEEKDGTML 7,200 439.

40

346 HCQERNIESL 7,200 440.

41

166 ILNDNAIESL 7,200 441.

42

60 SVPPSRPFQL 7,200 442.

43

605 VPLSVLILGL 7,200 443.

44

480 SGVPLTKVNL 7,200 444.

45

603 DAVPLSVLIL 7,200 445.

46

494 FTHLPVSNIL 6,720 446.

47

592 NTADTILRSL 6,720 447.

48

417 YLNGNHLTKL 6,600 448.

49

118 HINHNSLEIL 6,000 449.

50

500 SNILDDLDLL 6,000 450.

TABLA XV Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B7, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

456 NPMPKLKVL 240,000 451.

2

458 MPKLKVLYL 80,000 452.

3

692 SPSFGPKHL 80,000 453.

4

61 VPPSRPFQL 80,000 454.

5

517 NPWDCSCDL 80,000 455.

6

604 AVPLSVLIL 60,000 456.

7

26 SSRGSCDSL 40,000 457.

8

207 IGRILDLQL 40,000 458.

9

410 LTRLQKLYL 40,000 459.

10

159 LNRLKVLIL 40,000 460.

11

774 YLRKNIAQL 40,000 461.

12

625 AAGIWLVL 36,000 462.

13

336 KVLSPSGLL 30,000 463.

14

481 GVPLTKVNL 20,000 464.

15

182 FVPLTHLDL 20,000 465.

16

462 KVLYLNNNL 20,000 466.

17

652 SPVHLQYSM 20,000 467.

18

575 MPTQTSYLM 20,000 468.

19

752 ASSLYRNIL 18,000 469.

20

370 LAGNIIHSL 12,000 470.

21

154 SAFSKLNRL 12,000 471.

22

713 DAKHLQRSL 12,000 472.

23

221 ACNCDLLQL 12,000 473.

24

106 GAFNGLGLL 12,000 474.

25

249 SPPFFKGSI 8,000 475.

26

306 LPTKAPGLI 8,000 476.

27

250 PPFFKGSIL 8,000 477.

28

360 PPPQNPRKL 8,000 478.

29

453 GTFNPMPKL 6,000 479.

(continuación)

TABLA XV Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B7, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

310 APGLIPYIT 6,000 480.

31

316 YITKPSTQL 6,000 481.

32

400 EVLEEGSFM 5,000 482.

33

429 GMFLGLHNL 4,000 483.

34

418 LNGNHLTKL 4,000 484.

35

544 ILCTSPGHL 4,000 485.

36

826 NLHAEPDYL 4,000 486.

37

350 RNIESLSDL 4,000 487.

38

4 WIHLFYSSL 4,000 488.

39

501 NILDDLDLL 4,000 489.

40

109 NGLGLLKQL 4,000 490.

41

607 LSVLILGLL 4,000 491.

42

71 LLNNGLTML 4,000 492.

43

599 RSLTDAVPL 4,000 493.

44

739 TTNQSTEFL 4,000 494.

45

87 LTNAISIHL 4,000 495.

46

130 DTFHGLENL 4,000 496.

47

415 KLYLNGNHL 4,000 497.

48

175 LPPNIFRFV 4,000 498.

49

105 IGAFNGLGL 4,000 499.

50

296 MSTKTTSIL 4,000 500.

TABLA XVI Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B7, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

249 SPPFFKGSIL 80,000 501.

2

548 SPGHLDKKEL 80,000 502.

3

497 LPVSNILDDL 80,000 503.

4

329 CPIPCNCKVL 80,000 504.

5

790 YPGAHEELKL 80,000 505.

6

605 VPLSVLILGL 80,000 506.

7

359 RPPPQNPRKL 80,000 507.

8

189 DLRGNQLQTL 40,000 508.

9

647 QMRDNSPVHL 40,000 509.

10

566 CPGLVNNPSM 20,000 510.

11

807 RPRKVLVEQT 20,000 511.

12

462 KVLYLNNNLL 20,000 512.

13

60 SVPPSRPFQL 20,000 513.

14

713 DAKHLQRSLL 18,000 514.

15

751 DASSLYRNIL 18,000 515.

16

603 DAVPLSVLIL 12,000 516.

17

624 CAAGIWLVL 12,000 517.

18

428 KGMFLGLHNL 12,000 518.

19

825 ANLHAEPDYL 12,000 519.

20

220 WACNCDLLQL 12,000 520.

21

803 LMYSRPRKVL 9,000 521.

22

198 LPYVGFLEHI 8,000 522.

23

361 PPQNPRKLIL 8,000 523.

24

176 PPNIFRFVPL 8,000 524.

25

475 PPHIFSGVPL 8,000 525.

26

62 PPSRPFQLSL 8,000 526.

27

179 IFRFVPLTHL 6,000 527.

28

668 HTTERPSASL 6,000 528.

29

383 LVEYFTLEML 6,000 529.

(continuación)

TABLA XVI Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B7, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

608 SVLILGLLIM 5,000 530.

31

393 HLGNNRIEVL 4,000 531.

32

589 TTTNTADTIL 4,000 532.

33

738 KTTNQSTEFL 4,000 533.

34

78 MLHTNDFSGL 4,000 534.

35

16 ISLHSQTPVL 4,000 535.

36

9 YSSLLACISL 4,000 536.

37

814 EQTKNEYFEL 4,000 537.

38

407 FMNLTRLQKL 4,000 538.

39

575 MPTQTSYLMV 4,000 539.

40

4 WIHLFYSSLL 4,000 540.

41

417 YLNGNHLTKL 4,000 541.

42

63 PSRPFQLSLL 4,000 542.

43

757 RNILEKEREL 4,000 543.

44

108 FNGLGLLKQL 4,000 544.

45

409 NLTRLQKLYL 4,000 545.

46

556 ELKALNSEIL 4,000 546.

47

166 ILNDNAIESL 4,000 547.

48

217 DNKWACNCDL 4,000 548.

49

364 NPRKLILAGN 4,000 549.

50

295 RMSTKTTSIL 4,000 550.

TABLA XVII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B35, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

458 MPKLKVLYL 60,000 551.

2

652 SPVHLQYSM 40,000 552.

3

575 MPTQTSYLM 40,000 553.

4

517 NPWDCSCDL 40,000 554.

5

456 NPMPKLKVL 20,000 555.

6

692 SPSFGPKHL 20,000 556.

7

61 VPPSRPFQL 20,000 557.

8

792 GAHEELKLM 18,000 558.

9

26 SSRGSCDSL 15,000 559.

10

426 LSKGMFLGL 15,000 560.

11

599 RSLTDAVPL 15,000 561.

12

727 HSPLTGSNM 10,000 562.

13

288 TSSINDSRM 10,000 563.

14

713 DAKHLQRSL 9,000 564.

15

378 LMKSDLVEY 9,000 565.

16

306 LPTKAPGLI 8,000 566.

17

249 SPPFFKGSI 8,000 567.

18

747 LSFQDASSL 7,500 568.

19

228 QLKTWLENM 6,000 569.

20

674 SASLYEQHM 6,000 570.

21

400 EVLEEGSFM 6,000 571.

22

258 LSRLKKESI 6,000 572.

23

796 ELKLMETLM 6,000 573.

24

752 ASSLYRNIL 5,000 574.

25

607 LSVLILGLL 5,000 575.

26

10 SSLLACISL 5,000 576.

27

59 ISVPPSRPF 5,000 577.

28

296 MSTKTTSIL 5,000 578.

29

405 GSFMNLTRL 5,000 579.

(continuación)

TABLA XVII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B35, 9-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

815 QTKNEYFEL 4,500 580.

31

350 RNIESLSDL 4,000 581.

32

329 CPIPCNCKV 4,000 582.

33

474 LPPHIFSGV 4,000 583.

34

782 LQPDMEAHY 4,000 584.

35

65 RPFQLSLLN 4,000 585.

36

175 LPPNIFRFV 4,000 586.

37

805 YSRPRKVLV 3,000 587.

38

774 YLRKNIAQL 3,000 588.

39

154 SAFSKLNRL 3,000 589.

40

410 LTRLQKLYL 3,000 590.

41

207 IGRILDLQL 3,000 591.

42

370 LAGNIIHSL 3,000 592.

43

106 GAFNGLGLL 3,000 593.

44

156 FSKLNRLKV 3,000 594.

45

501 NILDDLDLL 3,000 595.

46

423 LTKLSKGMF 3,000 596.

47

625 AAGIVVLVL 3,000 597.

48

159 LNRLKVLIL 3,000 598.

49

89 NAISIHLGF 3,000 599.

50

309 KAPGLIPYI 2,400 600.

TABLA XVIII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B35, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

1

319 KPSTQLPGPY 80,000 601.

2

566 CPGLVNNPSM 40,000 602.

3

728 SPLTGSNMKY 40,000 603.

4

572 NPSMPTQTSY 40,000 604.

5

652 SPVHLQYSMY 40,000 605.

6

359 RPPPQNPRKL 40,000 606.

7

456 NPMPKLKVLY 40,000 607.

8

548 SPGHLDKKEL 30,000 608.

9

790 YPGAHEELKL 30,000 609.

10

329 CPIPCNCKVL 20,000 610.

11

249 SPPFFKGSIL 20,000 611.

12

605 VPLSVLILGL 20,000 612.

13

497 LPVSNILDDL 20,000 613.

14

156 FSKLNRLKVL 15,000 614.

15

824 KANLHAEPDY 12,000 615.

16

807 RPRKVLVEQT 12,000 616.

17

747 LSFQDASSLY 10,000 617.

18

691 RSPSFGPKHL 10,000 618.

19

264 ESICPTPPVY 10,000 619.

20

651 NSPVHLQYSM 10,000 620.

21

69 LSLLNNGLTM 10,000 621.

22

796 ELKLMETLMY 9,000 622.

23

713 DAKHLQRSLL 9,000 623.

24

198 LPYVGFLEHI 8,000 624.

25

517 NPWDCSCDLV 8,000 625.

26

499 VSNILDDLDL 7,500 626.

27

126 ILKEDTFHGL 6,000 627.

28

370 LAGNIIHSLM 6,000 628.

29

458 MPKLKVLYLN 6,000 629.

(continuación)

TABLA XVIII Resultados de Puntuación de Péptidos HLA- 158P1D7 - B35, 10-mers

Rango

Posición Inicial Listado de Residuos de Subsecuencia Puntuación (Estimación del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) Sec.ID#

30

364 NPRKLILAGN 6,000 630.

31

647 QMRDNSPVHL 6,000 631.

32

446 AIKEILPGTF 6,000 632.

33

535 LSKNTVTDDI 6,000 633.

34

25 LSSRGSCDSL 5,000 634.

35

9 YSSLLACISL 5,000 635.

36

173 ESLPPNIFRF 5,000 636.

37

16 ISLHSQTPVL 5,000 637.

38

380 KSDLVEYFTL 4,500 638.

39

220 WACNCDLLQL 4,500 639.

40

435 HNLEYLYLEY 4,000 640.

41

236 MPPQSIIGDV 4,000 641.

42

382 DLVEYFTLEM 4,000 642.

43

35 CNCEEKDGTM 4,000 643.

44

575 MPTQTSYLMV 4,000 644.

45

777 KNIAQLQPDM 4,000 645.

46

191 RGNQLQTLPY 4,000 646.

47

65 RPFQLSLLNN 4,000 647.

48

811 VLVEQTKNEY 4,000 648.

49

46 INCEAKGIKM 4,000 649.

50

556 ELKALNSEIL 3,000 650.

Tabla XIX: Subsecuencias de la Proteina 15BP1D7 Portadoras de Motivos

Motivos Proteinicos de 15BP1D7 Sitio de N-glicosilación Número de correspondencias: 3 1 292-295 NDSR 2 409-412 NLTR 3 741-744 NQST

Sitio de fosforilación de proteína quinasa dependiente de CAMP y cGMP

262-265 KKES

Sitio de fosforilación de proteína quinasa Número de correspondencias: 3 1 26-28 SSR 2 297-299 STK 3 670-672 TER

Sitio de fosforilación de caseína quinasa II Número de correspondencias: 12 1 149-152 TVIE 2 186-189 THLD 3 231-234 TWLE 4 290-293 SIND 5 354-357 SLSD 6 510-513 TQID 7 539-542 TVTD 8 600-603 SLTD 9 676-679 SLYE 10 720-723 SLLE 11 748-751 SFQD 12 816-819 TKNE

Sitio de fosforilación de tirosina quinasa

798-805 KLMETLMY

Sitio de N-miristoilación Número de correspondencias: 8 1 29-34 GSCDSL 2 86-91 GLTNAI 3 106-111 GAFNGL

(continuación) (continuación)

Tabla XIX: SubSecuencias de la Proteina 15BP1D7 Portadoras de Motivo

4 255-260 GSILSR 5 405-410 GSFMNL 6 420-425 GNHLTK 7 429-434 GMFLGL 8 481-486 GVPLTK

Dos Motivos Proteínicos fueron predichos por Pfam

1-Archaeal-ATPase en aa 441-451 2-Repetición rica en leucina C-terminal en aa 218-268 y aa 517-567

Tabla XX: Motivos Frecuentes

Nombre

% id. medio Descripci6n Funci6n Potencial

zf-C2H2

34% Dedo de cinc, tipo C2H2 Proteína de unión a ácido nucleico, funciona como factor de transcripción, probable localización nuclear.

citocromo b N

68% Citocromo b(Nterminal)/b6/petB Oxidasa unida a membrana, genera superóxido.

ig

19% Dominio de inmunoglobulina Los dominios tienen una longitud de cien aminoácidos e incluyen un enlace disulfuro intradominio conservado.

WD40

18% Dominio WD, repetición G-beta Repeticiones tándem de aprox. 40 residuos, cada uno de los cuales contiene un motivo Trp-Asp. Función de transducción de señales de interacción proteínica.

PDZ

23% Dominio PDZ Puede actuar en la dirección de moléculas de señalización hacia sitios submembranosos.

LRR

28% Repetición Rica en Leucina Motivos de secuencia corta implicados en interacciones proteínaproteína.

pquinasa

23% Dominio de proteína quinasa Núcleo catalítico conservado común a las serina/treonina y a las tirosina proteína quinasas que contiene un sitio de unión de ATP y un sitio catalítico.

Tabla XX: Motivos Frecuentes

Nombre

% id. medio Descripci6n Funci6n Potencial

PH

16% Dominio PH Homología a pleckstrina implicada en la señalización intracelular o como constituyentes del citoesqueleto.

EGF

34% Dominio tipo EGF-like 30-40 aminoácidos de longitud que se encuentran en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas segregadas.

rvt

49% Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN)

ank

25% Repetición Ank Proteína citoplásmica, asocia proteínas de membrana integrales al citoesqueleto.

oxidored q1

32% NADH-ubiquinona/ plastoquinona (complejo I), diversas cadenas Asociado a membrana. Implicado en la translocación protónica a través de la membrana.

efhand

24% Mano EF Dominio de unión a calcio, consiste en un bucle de 12 residuos flanqueado por ambos lados por un dominio alfahelicoidal de 12 residuos.

rvp

79% Aspartil protesasa retroviral Aspartil o ácido proteasas, centradas en un residuo de aspartilo.

Colágeno

42% Repetición hélice triple colágeno (20 copias) Proteínas estructurales extracelulares implicadas en la formación de tejido conectivo. La Secuencia consiste en los G-X-Y y las cadenas polipeptídicas forman una hélice triple.

fn3

20% Dominio de fibronectina tipo III Localizado en la región de unión de ligando extracelular de receptores. Tiene una longitud de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos con dos pares de cisteínas implicados en enlaces disulfuro.

7tm 1

19% Receptor de transmembrana 7 (familia de rodopsina) Siete regiones transmembrana hidrófobs, con el término N localizado extracelularmente mientras que el término C es citoplásmico. Señal a través de proteínas G.

Tabla VII: CLASIFICACION TNM DE TUMORES DE VEJIGA

Tumor primario (T) Para indicar múltiples tumores se ha de añadir el sufijo (m) a la categoría T adecuada. El sufijo (is) se puede añadir a cualquier T para indicar la presencia de carcinoma asociado in situ.

5 TX Tumor primario que no puede ser evaluado. TO Ninguna evidencia de tumor primario. Ta Carcinoma papilar no invasor. Tis Carcinoma in situ: “tumor plano”. T1 El tumor invade el tejido conectivo subepitelial.

10 T2 El tumor invade el músculo superficial (mitad interior).

T3 El tumor invade el músculo profundo o la grasa perivesical. T3a El tumor invade el músculo profundo (mitad exterior). T3b El tumor invade la grasa perivesical.

i. Microscópicamente. 15 ii. Macroscópicamente (masa extravesical).

T4 El tumor invade alguna de las siguientes partes: próstata, útero, vagina, pared pélvica o pared abdominal. T4a El tumor invade la próstata, el útero, la vagina. T4b El tumor invade la pared pélvica o la pared abdominal, o ambas.

20 Nódulos linfáticos regionales (N)

Los nódulos linfáticos regionales son los que se encuentran dentro de la propia pelvis, todos los demás son nodulos distantes. NX Los nódulos linfáticos regionales no pueden ser evaluados. N0 Ninguna metástasis de nódulos linfáticos regionales.

25 N1 Metástasis en un solo nódulo linfático, 2 cm o menos en su dimensión más grande. N2 Metástasis en un solo nódulo linfático, más de 2 cm pero no más de 5 cm en su dimensión más grande, o en múltiples nódulos linfáticos, no mayores de 5 cm en su dimensión más grande. N3 Metástasis en un nódulo linfático de no más de 5 cm en su dimensión más grande. Metástasis distante (M)

30 MX La presencia de metástasis distante no puede ser evaluada. M0 Ninguna metástasis distante. M1 Metástasis distante.

Agrupamiento de etapas

Etapa 0a Ta N0 M0 0is Tis N0 M0 I T1 N0 M0 II T2 N0 M0 T3a N0 M0

(continuación)

III

T3b

T4a

IV

T4b

Cualquier T

Cualquier T

N0

M0

N0

M0

N0

M0

N1-3

M0

Cualquier N

M1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AGENSYS, INC. FARIS, MARY

5 HUBERT, RENE RAITANO, ARTHUR AFAR, DANIEL LEVIN, ELANA CHALLITA-EID, PIA JAKOBOVITZ, AYA

<120> ÁCIDO NUCLEICO Y PROTEÍNA CORRESPONDIENTE DENOMINADA 158P1D7 ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO Y LA DETECCIÓN DEL CÁNCER DE VEJIGA Y OTROS CÁNCERES

15 <130> 5115820050.40

<140> EP 071016935

<141> 2001-08-22

<150> EP 071016935

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<150> PCT/US 01/26276

<151> 2001-08-22

<150> 60/227.098

<151> 2000-08-22

<160> 750

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <400>2

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

55 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>112 35 <211> 9

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<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>113

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>116 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>117

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>119

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<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

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<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>122

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>123

<211> 9 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>124

<211> 9

<212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>126

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>128

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>130

<211> 9

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

5 <210>131

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>132 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>133

<211> 9 25 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>134

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>135

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>136

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>137 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>138

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>139

<211> 9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>140 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>143

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>144

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>147

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>148 40 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>149

<211> 9 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>150

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>153

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>154 <211>10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>157 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <210>159

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 25 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>161 <211>10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>162 <211>10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>164

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>165 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>166

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>167 10 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>169

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 169

<210>170 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>171

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>174

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>175

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>177

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>178

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>179

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212>

PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212>

PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>184

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>185

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>186

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>187 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>188

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>190

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>192

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>193

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo de péptido

<211> 10

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>196

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>197

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>198

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>199 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>200

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>201

<211> 9

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>202

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>203

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>204

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>205 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>206

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>207 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>208

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>209

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>211

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>213

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>214 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>215

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>216

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>217 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>218 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>219

<211> 9 40 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>220

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>223

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>224 40 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>225

<211> 9 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>226

<211> 9

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>228

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>229

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>230

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>233

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>234 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>237

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>238

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>239

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>240

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>241 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>242

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <210>244

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>245 25 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>246

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>247

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>248

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>249

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>250 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>251

<211> 10 40 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>252

<211> 10

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <210>253

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>254

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>255 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>256

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>257

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>258

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>259 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>260

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>262

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>263

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>265

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>266

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>268

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>269

<211> 10

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>272

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>273

<211> 10

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>274

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>276

<211> 10 25 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>278

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>280

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>281

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>282

<211> 10 40 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

5 <210>283

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>284 15 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>285

<211> 10 25 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>286

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>287

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>289

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>290

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>291

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>292 10 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>293

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>294

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>295

<211> 10

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>296

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>297

<211> 10

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>298

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>300

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>302

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>304

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>305

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>306

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>309

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>310 5 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>311

<211> 9 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>312

<211> 9

<212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>313

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>314

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>315 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>317

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>318 35 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>319

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>321 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>322

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>323

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>324 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>325

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>326

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido35 <326>

<210>327 40 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 45 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211>

9

<210>328

<211>

9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>331

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>332

<211> 9

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>333

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>334

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>335 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>336

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>337

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>338

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>340

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>342

<211> 9

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>343

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>345

<211> 9

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>348

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>349

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <210>350

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>353

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>354 40 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>355

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>356

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>357

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>358 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>359

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>360

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>361 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>362 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>363

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>366 25 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>367

<211> 10 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>368

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>369

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>370

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>371

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 371

35 <210>372

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>373

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>375

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>376

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>378

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>381

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>382

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>383

<211> 10 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>384

<211> 10

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <210>385

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>386

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>387 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>388

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>389 10 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>390 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>391

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>392

<211> 10

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>393

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>394

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>396

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>397

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<210>398 5 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>399

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>400

<211> 10

<212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <210>401

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>402 40 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>403

<211> 10

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>405

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>406 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>407

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>408 10 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>409

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>410

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>411

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>412

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>413

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>414 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>415

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>416

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

15 <210>418

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>419

<211> 10 25 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>420

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

40 <210>421

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <210>424

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>425 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>426

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

40 <210>431

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

25 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>436

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>437

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>439

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>445

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>448

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>450

<211> 10

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>452

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>454

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>455

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>456

<211> 9

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>457

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>458

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212>

PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>461

<211> 9

<212>

PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>462

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>464

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>465

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>468

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>472

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>474

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>476

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>477

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>478 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>480

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>482

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>485

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>486

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>487

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>489

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>491

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>492

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>495

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>496

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>497

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>499

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>501

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>502

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>505

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>506

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>507

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>509

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>510

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>511

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>512

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>513 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>515

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>516

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>517

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>520

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>521

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>522

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>524

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>525

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>526

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>527

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>531

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>532

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>534

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>535 35 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <400>535

<210>536

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>537

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>540

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>541

<211> 10

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>545

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>546

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>547

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>548 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>551

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>552

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>554

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>555

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>556

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>557

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>558

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>561

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>562

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>566

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>567

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>569

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>570

<211> 9

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>571

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>572

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>574

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>575

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>576

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>577

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>578 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>580

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>581

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>582

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>586

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>590

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>591

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>592

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>594

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>595

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>596

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>597

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35

<210>600

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40

<220>

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>602

<211> 10

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <210>603

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>605

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>606

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>607

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>608

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

30 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 40 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>611

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>612

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>614

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>615

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>616

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>617

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>620

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>621

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>622

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>625

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>626

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>627

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>629

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>630

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>631

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>632

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 20 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>634

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>635

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>636

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>637

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>638 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>641

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

10 <210>642

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>643 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

35 <210>645

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

40 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>646

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>647

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

20 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<210>650

<211> 10

<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido <210>651

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ejemplo antígeno toxoide de tétanos

<400> 651

<211> 21

<212> PRT

<213> P/asmodium fa/ciparum

<210>653

<211> 16

<212> PRT 20 <213> Streptococcus sp.

<210>654 25 <211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido epítope

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)

<223> Cualquier aminoácido

<210> 655

<211> 231

<212>ADN

5 <210> 655

<211> 2555

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10 <220>

<221>

<222> (23) .. (2545)

<400> 656

<210> 657

<211> 841>

<210>PRT

<213> Homo sapiens

<400> 657

<210>661 <211>14

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>662 <211>42

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<400> 662

<210>663 <211>12

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 663

<210>664 <211>40

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<400> 664

<210>665 <211>10

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<210>666 <211>22

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: oligonucleótido sintético

<210>667 <211>22

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>668 <211>20

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>669 <211>25

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>670 <211>26

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>671 <211>24

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>672 <211>24

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: cebador

<210>673 <211>4

<212>PRT

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Descripción de Secuencia artificial: motivo péptido

<400> 673

<210>674

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 674

<210>675

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 675

<210>676

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 676

<210>677

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 677

<210>678

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 678

<210>679

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 679 <210>680

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 680

<210>681

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 681

<210>682

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 682

<210>683

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 683

<210>684

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 684

<210>685

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 685

<210>686

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 686

<210>687

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 687

<210>688

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

45 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 688

<210>689

<211> 8

<212> PRT 55 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 689

<210>690

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 690

<210>691

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 691

<210>692

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 692

<210>693

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 693

<210>694

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 694

<210>695

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 695

<210>696

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 696

<210>697

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 697

<210>698

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 698

<210>699

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 699

<210>700

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 700

<210>701

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 701

<210>702

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 702

<210>703

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 703

<210>704

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 704

<210>705

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 705

<210>706

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 706

<210>707

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 707

<210>708

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 708

<210>709

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 709

<210>710

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 710

<210>711

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 711

<210>712

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 712

<210>713

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 713

<210>714

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 714

<210>715

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 715

<210>716

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 716

<210>717

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 717

<210>718

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 718

<210>719

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 719

<210>720

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 720

<210>721

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 721

<210>722

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 722

<210>723

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 723

<210>724

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 724

<210>725

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 725

<210>726

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 726

<210>727

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 727

<210>728

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 728

<210>729

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 729 <210>730

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 730

<210>731

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 731

<210>732

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 732

<210>733

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 733

<210>734

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 734

<210>735

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 735

<210>736

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 736

<210>737

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 737

<210>738

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 738

<210>739

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 739 <210>740

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 740

<210>741

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 741

<210>742

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 742

<210>743

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 743

<210>744

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 744 <210>745

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 745

<210>746

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 746

<210>747

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 747

<210>748 <211>6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 6- His tag

<400> 748

<210>749

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Motivo péptido

<400> 749 <210>750

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 750

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína para uso en el tratamiento de cáncer de vejiga, en la que la proteína provoca una respuesta inmune contra una célula de cáncer de vejiga que expresa una proteína, en la que la proteína comprende una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 657, en la que el medicamento se proporciona al sistema

   5 inmune del mamífero y por medio de lo cual se provoca con el que tiene lugar la respuesta inmune contra dicha célula de cáncer de vejiga que expresa la proteína.

2. 2.

   La proteína para su uso en el tratamiento de cáncer de vejiga de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el medicamento expone el sistema inmune del mamífero a la proteína.

3. 3.

   La proteína para su uso en el tratamiento de cáncer de vejiga de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la

   10 respuesta inmune comprende la célula que presenta el antígeno que presenta un antígeno derivado de la secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de SEC ID Nº: 657 para generar una respuesta inmune humoral.
4. 4. La proteína para su uso en el tratamiento de cáncer de vejiga de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la respuesta inmune comprende la célula que presenta antígeno que presenta un antígeno derivado de la secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de SEC ID Nº: 657 para generar una respuesta inmune mediada por la

   15 célula.
5. 5. Una composición inmunogénica para su uso en el tratamiento de cáncer de vejiga provocando respuesta inmune contra una célula de cáncer de vejiga que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína o ácido nucleico que codifica la proteína, en la que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 657 y se expresa por dicha célula de cáncer de vejiga, en la que la respuesta inmune es efectiva para inhibir el

   20 crecimiento de células cancerígenas.

   Figura 1. Secuencia 15BP1D7 SSH (SEQ ID NO:655)

   Figura 2. Clon de cDNA 15BP1D7 TurboScript3PX Y marco de lectura abierto (ORF)

   Figura 3. Secuencia de aminoacidos 15BP1D7

   Figura 4. Homologia BLAST de aminoacidos de 15BP1D7 con la proteina hipotetica FLJ22774

   Identidades = 798/798 (100%)

   Figura 5a: Alineaci6n de 15BP1D7 con FLJ22774 humana, CLON KAIA1575. [Homo sapiens]

   Identidades = 405/415 (97%), Positivas = 405/415 (97%)

   Figura 5b: Alineaci6n de la proteina 15BP1D7 con una proteina humana similar a IGFALS

   Identidades = 316/864 (36%), Positivas = 459/864 (52%)

   Figura 7. Expresi6n de 15BP1D7 en Tejidos Sanos

   Corazón1. 1. Bazo

   Cerebro2. 2. Timo

   Placenta3. 3. Próstata

   Pulmón4. 4. Testículo

   Hígado5. 5. Ovario

   Músculo Esquelético 6. 6. Intestino Delgado

   Riñón7. 7. Colon

   Páncreas8. 8. Leucocitos

   Figura BA. Expresi6n de 15BP1D7 en Especimenes de Pacientes de Cancer de Vejiga

   Figura BB. Expresi6n de 15BP1D7 en Especimenes de Pacientes de Cancer de Vejiga

   Figura 11. Perfil de hidrofilia de 15BP1D7 (Hopp T.P., Woods K.R., 19B1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7B:3B24-3B2B)

   Figura 12. Perfil de hidropatia de 15BP1D7 (KYte J., Doolittle R. F., 19B2, J. Mol. Biol. 157:105-132)

   Figura 14. Perfil de Flexibilidad Media de 15BP1D7 (Bhaskaran R., PonnuswamY P. K., 19BB. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255)