DE60126495T2

DE60126495T2 - Nukleinsäure und protein, genannt 158p1d7, für die behandlung und erkennung von blasenkrebs und anderen krebsarten

Info

Publication number: DE60126495T2
Application number: DE60126495T
Authority: DE
Inventors: Mary Los Angeles FARIS; S. Rene Los Angeles HUBERT; B. Arthur Los Angeles RAITANO; E. Daniel Pacific Palisades AFAR; Elana Los Angeles LEVIN; M. Pia Encino CHALLITA-EID; Aya Beverly Hills JAKOBOVITS
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 2000-08-22
Filing date: 2001-08-22
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2021-08-23
Also published as: EP1311675B1; CA2420543C; EP1311675A2; US20030166526A1; ATE353366T1; HK1110876A1; US6863892B2; US20050227253A1; US20060018917A1; DK1854809T3; AU2001286699A1; WO2002016598A2; DE60126495D1; EP1854809B1; US20030017466A1; EP1854809A1; ES2281437T3; WO2002016598A3; ES2395524T3; WO2002016593A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der hierin beschriebenen Erfindung ist eine neue Nukleinsäuresequenz und ihr kodiertes Protein, das als 158P1D7 bezeichnet wird, und diagnostische und therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen, die bei dem Management von verschiedenen Krebsen, die 158P1D7 exprimieren, nützlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs ist die zweite führende, menschliche Todesursache neben der koronaren Erkrankung. Weltweit sterben jedes Jahr Millionen von Menschen an Krebs. In den Vereinigten Staaten verursacht Krebs allein, wie von der American Cancer Society berichtet wurde, den Tod von gut über einer halben Million Menschen jährlich, wobei über 1,2 Millionen neue Fälle pro Jahr diagnostiziert werden. Während die Todesfälle an Herzerkrankungen bedeutend gesunken sind, steigen solche, die auf Krebs zurückgeführt werden, allgemein an. Es wird vorausgesagt, dass Krebs im frühen Abschnitt des nächsten Jahrhunderts zur führenden Todesursache wird.
Von allen neuen Krebsfällen in den Vereinigten Staaten repräsentiert Blasenkrebs ungefähr 5 Prozent bei Männern (fünfthäufigstes Neoplasma) und 3 Prozent bei Frauen (achthäufigstes Neoplasma). Die Häufigkeit steigt langsam an, gleichzeitig mit einer ansteigenden älteren Bevölkerung. 1998 gab es 54 500 geschätzte Fälle, einschließlich 39 500 bei Männern und 15 000 bei Frauen. Die altersangeglichene Häufigkeit in den Vereinigten Staaten ist 32 pro 100 000 für Männer und 8 pro 100 000 für Frauen. Das historische Verhältnis von männlich/weiblich von 3:1 könnte sinken, was mit dem Verhaltensmuster des Rauchens von Frauen zusammenhängt. Es gab 1998 11 000 geschätzte Todesfälle von Blasenkrebs (7 800 bei Männern und 3 900 bei Frauen). Die Häufigkeit und Mortalität von Blasenkrebs steigt stark mit dem Alter an und wird ein zunehmendes Problem werden, da die Bevölkerung älter wird.
Blasenkrebse umfassen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen. Die bestimmenden Hauptfaktoren zur Kontrolle und zum Überleben der Erkrankung sind Histologie und das Ausmaß der Erkrankung. Die wichtigsten Kennzeichen für diese Faktoren schließen die Klassifikation der Pathologie, die International Classification of Diseases-Oncology (ICDO – Internationale Klassifikation für die Onkologie), und die Klassifikation zur Einstufung des Ausmaßes der Erkrankung, die TNM-Klassifikation (Tabelle XXI) ein. Für eine allgemeine Diskussion von Blasen- und anderen urogenitalen Krebsen, siehe z.B. Volgelzang et al., Hrsg. Comprehensive Textbook of Genitourinary Oncology, (Williams & Wilkins, Baltimore 1996), insbesondere die Seiten 295-556.
Es wurde über drei primäre Typen von Tumoren in der Blase berichtet. Der häufigste Typ von Blasenkrebs ist Transitionalzellkarzinom (TCC); dies macht etwa 90% aller Blasenkrebse aus. Die zweite Form von Blasenkrebs ist Plattenepithelkarzinom, das etwa 8% aller Blasenkrebse, wo Schistosomiasis nicht endemisch ist, ausmacht und ungefähr 75% von Blasenkarzinomen, wo Schistosomiasis endemisch ist. Plattenepithelkarzinome tendieren dazu, in tiefere Schichten der Blase einzudringen. Der dritte Typ von Blasenkrebs ist Adenokarzinom, das 1%-2% von Blasenkrebsen ausmacht; diese sind hauptsächlich invasive Formen von Krebs.
Blasenkrebs wird gewöhnlich unter Verwendung von Zytoskopie und Urinzytologie nachgewiesen und diagnostiziert. Jedoch zeigen diese Verfahren eine schlechte Empfindlichkeit. Relativ zuverlässigere Nachweisverfahren, die derzeit in der Klinik verwendet werden, schließen den Blasentumor-Antigen(BTA)-Stat-Test, NMP22-Proteinassay, die Telomeraseexpression und den Hyaluronsäure- und Hyaluronidase(HA-HAase)-Urintest ein. Der Vorteil der Verwendung derartiger Marker bei der Diagnose von Blasenkrebs ist ihre relativ hohe Empfindlichkeit in frühen Tumorstadien, im Vergleich zu normaler Zytologie.
Beispielsweise weist der BTA-Stat-Test 60-80% Empfindlichkeit und 50-70% Spezifität für Blasenkrebs auf, während der HA-HAase-Urintest 90-92% Empfindlichkeit und 80-84% Spezifität für Blasenkrebs zeigt (J. Urol. 2001 165:1067). Allgemein betrug die Empfindlichkeit für Stadium-Ta-Tumoren 81% für Nuclear Matrix Protein (NMP22), 70% für Telomerase, 32% für Blasentumor-Antigen (BTA) und 26% für Zytologie (J. Urol. 2001 166:470; J. Urol. 1999, 161:810). Obwohl der Telomeric-Repeat-Assay, der die Telomerase-Aktivität misst, relativ empfindlich ist, führt die Instabilität der Telomerase im Urin derzeit dazu, dass dieses Nachweisverfahren unzuverlässig wird.
Die meisten Blasenkrebse kehren in der Blase wieder. Im Allgemeinen wird Blasenkrebs mit einer Kombination von transurethraler Resektion der Blase (TUR) und intravesikaler Chemotherapie oder Immuntherapie gehandhabt. Die multifokale und wiederkehrende Natur von Blasenkrebs weist auf die Grenzen von TUR hin. Die meisten muskelinvasiven Krebse werden nicht durch TUR allein geheilt. Radikale Zystektomie und Harnumleitung sind die effektivsten Mittel zur Eliminierung des Krebses, doch haben eine unbestreitbare Auswirkung auf die urinäre und sexuelle Funktion.
Intravesikales Bacilli Calmette-Guerin (BCG) ist ein häufiges und wirksames Immuntherapeutikum, das bei der Behandlung von Blasenkrebs verwendet wird. BCG wird auch als ein Prophylaktikum verwendet, um die Rekurrenz von Blasenkrebs zu verhindern. Jedoch sprechen 30% der Patienten nicht auf die BCG-Therapie an und entwickeln weiter eine invasive und metastatische Erkrankung (Catalona et al. J. Urol. 1987, 137:220-224). BCG-bedingte Nebenwirkungen wurden häufig beobachtet, wie zum Beispiel Arzneimittel-induzierte Cystitis, Risiko von bakterieller Infektion und Hämaturie, unter anderem. Andere alternative Immuntherapien wurden für die Behandlung von Blasenkrebs angewendet, wie zum Beispiel KLH (Flamm et al. Urologe 1994; 33:138-143), Interferone (Bazarbashi et al. J. Surg. Oncol. 2000; 74:181-4) und mit MAGE-3-Peptid beladene dendritische Zellen (Nishiyama et al. Clin. Cancer Res. 2001; 7:23-31). All diese Ansätze sind noch experimentell (Zlotta et al. Eur. Urol. 2000; 37 Suppl. 3:10-15). Es besteht weiter ein wesentlicher Bedarf für diagnostische und Behandlungsmodalitäten, die für Patienten mit Blasenkrebs dienlich sind. Weiterhin zeichnen sich, von einem weltweiten Standpunkt gesehen, mehrere Krebse als die führenden Todesursachen aus. Insbesondere sind Karzinome der Lunge, Prostata, Brust, des Kolons, Pankreas und Eierstocks primäre Ursachen von Krebstod. Diese und nahezu alle anderen Karzinome teilen ein gemeinsames letales Merkmal. Mit sehr wenigen Ausnahmen ist eine metastatische Erkrankung von einem Karzinom tödlich. Außerdem ist, selbst für solche Krebspatienten, die ihre primären Krebse zunächst überleben, ihr Leben dramatisch verändert. Viele Krebspatienten erfahren starke Angstgefühle, die durch die Bewusstheit des Potenzials für Rekurrenz oder Versagen der Behandlung angetrieben werden. Viele Krebspatienten erfahren physische Schwächungen nach der Behandlung. Außerdem erfahren viele Krebspatienten eine Rekurrenz.
Prostatakrebs ist weltweit der vierthäufigste Krebs bei Männern. In Nordamerika und Nordeuropa ist er bei weitem der häufigste Krebs bei Männern und die zweite führende Ursache für Krebstod bei Männern. In den Vereinigten Staaten sterben allein gut über 30 000 Männer jährlich an dieser Erkrankung, nach Lungenkrebs nur die zweite. Trotz der Größenordnung dieser Zahlen gibt es noch keine effektive Behandlung für metastatischen Prostatakrebs. Chirurgische Prostatektomie, Strahlentherapie, Hormonablationstherapie, chirurgische Kastration und Chemotherapie sind weiter die hauptsächlichen Behandlungsmodalitäten. Leider sind diese Behandlungen für viele unwirksam und werden häufig mit unerwünschten Folgen in Verbindung gebracht.
Aus diagnostischer Sicht bleibt der Mangel eines Prostatatumor-Markers, der lokalisierte Tumoren im Frühstadium genau nachweisen kann, eine wesentliche Einschränkung bei der Diagnose und beim Management dieser Erkrankung. Obwohl der Prostata-spezifische-Antigen(PSA)-Assay im Serum zu einem sehr nützlichen Werkzeug geworden ist, wird jedoch seine Spezifität und allgemeine Verwendbarkeit in mehrerer wichtiger Hinsicht weitgehend als mangelhaft angesehen. Während zuvor identifizierte Marker, wie zum Beispiel PSA, PSM, PCTA und PSCA die Bemühungen zur Diagnose und Behandlung von Prostatakrebs unterstützt haben, besteht ein Bedarf zur Identifizierung von zusätzlichen Markern und therapeutischen Zielen für Prostata und ähnliche Krebse, um die Diagnose und Therapie weiter zu verbessern.
Nierenzellkarzinom (RCC) macht ungefähr 3 Prozent der Malignitäten bei Erwachsenen aus. Sobald Adenome einen Durchmesser von 2 bis 3 cm erreichen, besteht ein malignes Potenzial. Beim Erwachsenen sind die zwei hauptsächlichen malignen Nierentumoren das Nierenzelladenokarzinom und das Transitionalzellkarzinom des Nierenbeckens oder Ureters. Die Häufigkeit von Nierenzelladenokarzinom wird in den Vereinigten Staaten auf mehr als 29 000 Fälle geschätzt und mehr als 11 600 Patienten starben 1998 an dieser Erkrankung. Transitionalzellkarzinom ist mit einer Häufigkeit von ungefähr 500 Fällen pro Jahr in den Vereinigten Staaten weniger häufig.
Operation war seit vielen Dekaden die primäre Therapie für Nierenzelladenokarzinom. Bis kürzlich war die metastatische Erkrankung für jedwede systemische Therapie unempfindlich. Mit neueren Entwicklungen bei systemischen Therapien, insbesondere Immuntherapien, könnte metastatisches Nierenzellkarzinom bei geeigneten Patienten mit einer Möglichkeit von anhaltenden Reaktionen aggressiv angegangen werden. Dennoch besteht ein verbleibender Bedarf an effektiven Therapien für diese Patienten.
In den Vereinigten Staaten traten 2000 geschätzte 130 200 Fälle von kolorektalem Krebs auf, einschließlich 93 800 Fällen von Kolonkrebs und 36 400 von Rektalkrebs. Kolorektale Krebse sind die dritthäufigsten Krebse bei Männern und Frauen. Häufigkeitsraten nahmen während 1992-1996 bedeutend ab (–2,1% pro Jahr). Die Forschung nimmt an, dass diese Abnahmen auf zunehmendem Screening und zunehmender Polypentfernung beruhen, was die Progression von Polypen zu invasiven Krebsen verhindert. Es gab 2000 geschätzte 56 300 Todesfälle (47 700 von Kolonkrebs, 8 600 von Rektalkrebs), was etwa 11% aller Krebstodesfälle in den U.S. ausmacht.
Derzeit ist Operation die häufigste Form der Therapie für kolorektalen Krebs und für Krebse, die sich nicht ausgebreitet haben, ist sie häufig kurativ. Chemotherapie oder Chemotherapie zuzüglich Bestrahlung wird an die meisten Patienten, deren Krebs die Darmwand tief perforiert hat oder sich auf die Lymphknoten ausgebreitet hat, vor oder nach Operation verabreicht. Eine permanente Kolostomie (Erzeugung einer abdominalen Öffnung zur Ausscheidung von Körperabfallprodukten) ist gelegentlich bei Kolonkrebs notwendig und ist selten bei Rektalkrebs erforderlich. Es besteht weiter ein Bedarf an effektiven diagnostischen und Behandlungsmodalitäten für kolorektalen Krebs.
Es gab 2000 geschätzte 164 100 neue Fälle von Lungen- und Bronchialkrebs, was 14% aller Krebsdiagnosen in den U.S. ausmacht. Die Häufigkeitsrate von Lungen- und Bronchialkrebs nimmt bei Männer bedeutend ab, von einer Höhe von 86,5 pro 100 000 im Jahr 1984 auf 70,0 im Jahr 1996. In den 90er Jahren begann sich die Anstiegsrate unter Frauen zu verlangsamen. 1996 betrug die Häufigkeitsrate bei Frauen 42,3 pro 100 000.
Lungen- und Bronchialkrebs verursachte 2000 geschätzte 156 900 Todesfälle, was 28% aller Krebstodesfälle ausmacht. Während 1992-1996 nahm die Mortalität von Lungenkrebs unter Männern bedeutend ab (–1,7% pro Jahr), während die Raten für Frauen noch bedeutend anstiegen (0,9% pro Jahr). Seit 1987 sind jedes Jahr mehr Frauen an Lungenkrebs als an Brustkrebs gestorben, der seit mehr als 40 Jahren die Hauptursache für Krebstodesfälle bei Frauen war. Die Abnahmen der Lungenkrebshäufigkeit und Mortalitätsraten ergeben sich sehr wahrscheinlich aus den abgenommenen Raten des Rauchens während der vergangenen 30 Jahre; jedoch bleiben abnehmende Muster des Rauchens unter Frauen hinter denen von Männern zurück. Es ist bedenklich, dass, obwohl sich die Abnahmen beim Tabakgebrauch bei Erwachsenen verlangsamt haben, der Tabakgebrauch bei der Jugend wieder ansteigt.
Die Behandlungsoptionen für Lungen- und Bronchialkrebs werden durch die Art und das Stadium des Krebses bestimmt und schließen Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie ein. Für viele lokalisierte Krebse ist Operation gewöhnlich die Behandlung der Wahl. Da sich die Erkrankung bis zum Zeitpunkt, bei dem sie erkannt wird, gewöhnlich ausgebreitet hat, sind Strahlentherapie und Chemotherapie häufig zusammen mit der Operation nötig. Chemotherapie allein oder zusammen mit Bestrahlung ist die Behandlung der Wahl für kleinzelligen Lungenkrebs; bei diesem Regime erfährt ein großer Prozentsatz von Patienten Remission, die in einigen Fällen langanhaltend ist. Es besteht jedoch ein anhaltender Bedarf an effektiver Behandlung und diagnostischen Ansätzen für Lungen- und Bronchialkrebse.
Es wurde das Auftreten von geschätzten 182 800 neuen invasiven Fällen von Brustkrebs unter Frauen während 2000 in den Vereinigten Staaten erwartet. Zusätzlich wurden 2000 etwa 1 400 neue Fälle von Brustkrebs, die bei Männern diagnostiziert wurden, erwartet. Nach einem Anstieg von etwa 4% pro Jahr in den 80er Jahren haben sich die Häufigkeitsraten von Brustkrebs bei Frauen in den 90er Jahren auf etwa 110,6 Fälle pro 100 000 eingepegelt.
In den U.S. allein gab es 2000 geschätzte 41 200 Todesfälle (40 800 Frauen, 400 Männer) aufgrund von Brustkrebs. Brustkrebs nimmt den zweiten Rang unter den Krebstodesfällen bei Frauen ein. Entsprechend den neuesten Daten nahmen die Mortalitätsraten während 1992-1996, mit der größten Abnahme bei jüngeren Frauen, sowohl weißen als auch schwarzen, bedeutend ab. Diese Abnahmen waren wahrscheinlich das Ergebnis von früherem Nachweis und verbesserter Behandlung.
Unter Berücksichtigung der medizinischen Sachlagen und der Präferenzen des Patienten kann die Behandlung von Brustkrebs Folgendes einschließen: Lumpektomie (lokale Entfernung des Tumors) und Entfernung der Lymphknoten unter dem Arm; Mastektomie (chirurgische Entfernung der Brust) und Entfernung der Lymphknoten unter dem Arm; Strahlentherapie; Chemotherapie; oder Hormontherapie. Häufig werden zwei oder mehrere Verfahren zusammen verwendet. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass für Erkrankungen im Frühstadium langfristige Überlebensraten nach Lumpektomie zuzüglich Radiotherapie ähnlich den Überlebensraten nach modizifierter radikaler Mastektomie sind. Wesentliche Fortschritte bei Rekonstruktionstechniken stellen mehrere Optionen zur Brustrekonstruktion nach Mastektomie bereit. Kürzlich wurde eine derartige Rekonstruktion zur gleichen Zeit wie die Mastektomie ausgeführt.
Lokale Exzision von duktalem Karzinom in situ (DCIS) mit angemessenen Mengen von umgebendem normalem Brustgewebe kann die lokale Rekurrenz des DCIS verhindern. Bestrahlung der Brust und/oder Tamoxifen kann die Chance, dass DCIS im verbleibenden Brustgewebe auftritt, verringern. Dies ist wichtig, da sich DCIS, falls es unbehandelt bleibt, in einen invasiven Brustkrebs entwickeln kann. Dennoch treten durch diese Behandlungen schwere Nebenwirkungen oder Folgeerscheinungen auf. Daher besteht ein Bedarf an wirksamen Behandlungen für Brustkrebs.
Es traten 2000 in den Vereinigten Staaten geschätzte 23 100 neue Fälle von Eierstockkrebs auf. Dieser macht 4% aller Krebse unter Frauen aus und hat den zweiten Rang unter den gynäkologischen Krebsen. Während 1992-1996 nahmen die Häufigkeitsraten von Eierstockkrebs bedeutend ab. Als eine Folge von Eierstockkrebs gab es 2000 geschätzte 14 000 Todesfälle. Eierstockkrebs verursacht mehr Todesfälle als irgendein anderer Krebs des weiblichen Reproduktionssytems.
Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie sind Behandlungsoptionen für Eierstockkrebs. Operation schließt gewöhnlich die Entfernung von einem oder beiden Eierstöcken, den Eileitern (Salpingo-oophorektomie) und der Gebärmutter (Hysterektomie) ein. Bei einigen sehr frühen Tumoren wird nur der beteiligte Eierstock entfernt werden, insbesondere bei jungen Frauen, die Kinder haben möchten. Bei fortgeschrittener Erkrankung wird versucht, die gesamte intraabdominale Erkrankung zu beseitigen, um die Wirkung von Chemotherapie zu erhöhen. Es besteht weiter ein bedeutender Bedarf an wirksamen Behandlungsoptionen für Eierstockkrebs.
Es traten 2000 in den Vereinigten Staaten geschätzte 28 300 neue Fälle von Pankreaskrebs auf. Während der vergangenen 20 Jahre haben die Raten von Pankreaskrebs bei Männern abgenommen. Raten unter Frauen sind ungefähr konstant geblieben, doch könnten beginnen, abzunehmen. Pankreaskrebs verursachte 2000 in den Vereinigten Staaten geschätzte 28 200 Todesfälle. Während der vergangenen 20 Jahre trat eine leichte, doch bedeutende Abnahme bei den Mortalitätsraten unter Männern (etwa –0,9% pro Jahr) auf, während die Raten unter Frauen leicht anstiegen.
Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie sind Behandlungsoptionen für Pankreaskrebs. Diese Behandlungsoptionen können bei vielen Patienten das Überleben verlängern und/oder Symptome lindern, doch werden wahrscheinlich für die meisten zu keiner Heilung führen. Es besteht ein bedeutender Bedarf an zusätzlichen therapeutischen und diagnostischen Optionen für Pankreaskrebs.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Nukleinsäuresequenz und ihr kodiertes Polypetid, das als 158P1D7 bezeichnet wird. Wie hierin verwendet, kann „158P1D7" neue Polynukleotide oder Polypeptide oder beide der offenbarten Erfindung bezeichnen.
Nukleinsäuren, die 158P1D7 kodieren, werden im Krebs/in Krebsen, die in Tabelle I aufgelistet sind, überexprimiert. Die Northern-Blot-Expressionsanalyse der 158P1D7-Expression in normalen Geweben zeigt ein restringiertes Expressionsmuster in adulten Geweben. Die Nukleotid-(2) und Aminosäuresequenzen (2 und 3) von 158P1D7 sind erstellt. Das gewebebezogene Profil von 158P1D7 in normalen adulten Geweben, zusammen mit der Überexpression, die in Blasentumoren beobachtet wird, zeigt, dass 158P1D7 zumindest in einigen Krebsen aberrierend überexprimiert wird. Somit dienen 158P1D7-Nukleinsäuren und -Polypeptide als ein nützliches Diagnostikum (oder Indikator) und/oder therapeutisches Ziel für Krebse der Gewebe, wie zum Beispiel solcher, die in Tabelle I aufgelistet sind.
Die Erfindung stellt Verfahren zur Kontrolle und zum Nachweis von Polynukleotiden bereit, die mit allen oder einem Teil von Folgenden übereinstimmen oder zu diesen komplementär sind: der 158P1D7-Nukleinsäuren, -mRNAs und/oder -kodierenden Sequenzen, bevorzugt in isolierter Form, einschließlich Polynukleotiden, die Folgende kodieren: 158P1D7-ähnliche Proteine und Fragmente von 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 oder mehr als 25 zusammenhängenden Aminosäuren; mindestens etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 oder mehr als 100 zusammenhängenden Aminosäuren eines 158P1D7-ähnlichen Proteins sowie die Peptide/Proteine selbst; DNA, RNA, DNA/RNA-Hybriden und ähnlichen Molekülen (wie zum Beispiel PNAs), Polynukleotiden oder Oligonukleotiden, die komplementär sind oder mindestens eine Homologie von 90% zu 158P1D7-Nukleinsäuresequenzen oder mRNA-Sequenzen oder Teilen davon aufweisen, und Polynukleotiden oder Oligonukleotiden, die zu den 158P1D7-Genen, -mRNAs oder zu 158P1D7-kodierenden Polynukleotiden hybridisieren. Es werden auch Mittel zur Isolierung von cDNAs und des Gens/der Gene, das/die 158P1D7 kodiert/kodieren, bereitgestellt. Rekombinante DNA-Moleküle, die 158P1D7-Polynukleotide enthalten, Zellen, die mit derartigen Molekülen transformiert oder transduziert werden, und Wirt-Vektor- Systeme für die Expression von 158P1D7-Genprodukten werden auch bereitgestellt. Die Erfindung stellt weiter Antikörper bereit, die zu 158P1D7-Proteinen und Polypeptidfragmenten davon binden, einschließlich polyklonaler und monoklonaler Antikörper, muriner und anderer Säugerantikörper, chimärer Antikörper, humanisierter und vollständig menschlicher Antikörper und Antikörper, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sind. Die Erfindung umfasst auch T-Zellklone, die ein Epitop von 158P1D7 zusammen mit einem bestimmten HLA-Molekül erkennen.
Die Erfindung stellt weiter Verfahren zum Nachweis der Gegenwart, Menge und des Status von 158P1D7-Polynukleotiden und -Proteinen in verschiedenen biologischen Proben sowie Verfahren zur Identifizierung von Zellen, die 158P1D7-Polynukleotide und -Polypeptide exprimieren, bereit. Eine typische Ausführungsform dieser Erfindung stellt Verfahren zur Kontrolle von 158P1D7-Polynukleotiden und -Polypeptiden in einer Gewebe- oder Hämatologie-Probe, die etwa die Form von Wachstumsdysregulation, wie zum Beispiel Krebs, hat oder verdächtig ist, diese zu haben, bereit.
Die Erfindung stellt weiter verschiedene immunogene oder therapeutische Zusammensetzungen und Strategien zur Behandlung von Krebsen, die 158P1D7 exprimieren, wie zum Beispiel Blasenkrebsen, bereit, einschließlich Therapien, die darauf abzielen, die Transkription, Translation, Verarbeitung oder Funktion von 158P1D7 zu inhibieren, sowie Krebsimpfstoffen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1. 158P1D7-SSH-Nukleinsäuresequenz. Die 158P1D7-SSH-Sequenz enthält 231 bp (SEQ-ID.-NR.: 655)
2. Die cDNA-(SEQ-ID.-NR.: 656) und Aminosäure-(SEQ-ID.-NR.: 657) Sequenzen von 158P1D7. Das beginnende Methionin ist unterstrichen. Das offene Leseraster erstreckt sich von Nukleinsäure 23 bis 2548, einschließlich des Stoppkodons.
3. Aminosäuresequenz von 158P1D7 (SEQ-ID.-NR.: 657).
4. Sequenz-Alignment von 158P1D7 mit menschlichem hypothetischem Protein FLJ22774, Klon KAIA1575 (SEQ-ID.-NR.: 658).
5a. Aminosäuresequenz-Alignment von 158P1D7 mit menschlichem Protein (FLJ227744, SEQ-ID.-NR.: 659).
5b. Aminosäuresequenz-Alignment von 158P1D7 mit menschlichem Protein, das IGFALS ähnlich ist (SEQ-ID.-NR.: 660).
6. Expression von 158P1D7 durch RT-PCR. First-Strand-cDNA wurde aus dem Lebendpool 1(VP1: Leber, Lunge und Niere), Lebendpool 2 (VP2, Pankreas, Kolon und Magen), Prostata-Xenograft-Pool(LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD, LAPC-9AI), Prostatakrebs-Pool, Blasenkrebs-Pool, Kolonkrebs-Pool, Lungenkrebs-Pool, Eierstockkrebs-Pool, Brustkrebs-Pool und Metastase-Pool hergestellt. Die Normalisierung wurde durch PCR unter Verwendung von Primern für Actin und GAPDH durchgeführt. Halbquantitative PCR unter Verwendung von Primern für 158P1D7 wurde mit 30 Zyklen der Amplifikation durchgeführt. Starke Expression von 158P1D7 wird im Blasenkrebs-Pool und Brustkrebs-Pool beobachtet. Niedrigere Expressionsniveaus werden im VP1, VP2, Xenograft-Pool, Prostatakrebs-Pool, Kolonkrebs-Pool, Lungenkrebs-Pool, Eierstockkrebs-Pool und Metastase-Pool beobachtet.
7. Expression von 158P1D7 in normalen menschlichen Geweben. Zwei Northern-Blots mit mehreren Geweben, mit 2 μg mRNA/Spur, wurden mit dem 158P1D7-Fragment untersucht. Größenstandards in Kilobasen (kb) sind an der Seite gezeigt. Die Ergebnisse zeigen Expression von 158P1D7 in Prostata, Leber, Plazenta, Herz und, auf niedrigerem Niveau, im Dünndarm und Kolon.
8A und 8B. Expression von 158P1D7 in Proben von Patienten mit Blasenkrebs. RNA wurde aus den Blasenkrebszelllinien (CL), der normalen Blase (N), Blasentumoren (T) und passendem normalen angrenzenden Gewebe (N_AT), das aus Patienten mit Blasenkrebs isoliert wurde, extrahiert. Northern-Blots mit 10 μg gesamter RNA/Spur wurden mit dem 158P1D7-Fragment untersucht. Größenstandards in Kilobasen (kb) sind an der Seite gezeigt. Die Ergebnisse zeigen Expression von 158P1D7 in 1 von 3 Blasenkrebszelllinien. In Patientenproben wird 158P1D7-Expression in 4 von 6 getesteten Tumoren nachgewiesen (8A). In einer weiteren Studie wird 158P1D7-Expression in allen getesteten Patiententumoren nachgewiesen (8B). Die Expression, die in normalen angrenzenden Geweben (von erkrankten Geweben isoliert), doch nicht in normalem Gewebe, das aus gesunden Spendern isoliert wurde, beobachtet wird, könnte anzeigen, dass diese Gewebe nicht völlig normal sind und dass 158P1D7 in Tumoren im Frühstadium exprimiert werden kann.
9. Expression von 158P1D7 in Proben von Patienten mit Lungenkrebs. RNA wurde aus Lungenkrebszelllinien (CL), Lungentumoren (T) und ihren normalen angrenzenden Geweben (N_AT), die aus Patienten mit Lungenkrebs isoliert wurden, extrahiert. Northern-Blot mit 10 μg gesamter RNA/Spur wurde mit dem 158P1D7-Fragment untersucht. Größenstandards in Kilobasen (kb) sind an der Seite gezeigt. Die Ergebnisse zeigen Expression von 158P1D7 in 1 von 3 Lungenkrebszelllinien und in allen 3 getesteten Lungentumoren, doch nicht in normalen Lungengeweben.
10. Expression von 158P1D7 in Proben von Patienten mit Brustkrebs. RNA wurde aus Brustkrebszelllinien (CL), normaler Brust (N) und Brusttumoren (T), die aus Patienten mit Brustkrebs isoliert wurden, extrahiert. Northern-Blot mit 10 μg gesamter RNA/Spur wurde mit dem 158P1D7-Fragment untersucht. Größenstandards in Kilobasen (kb) sind an der Seite gezeigt. Die Ergebnisse zeigen Expression von 158P1D7 in 2 von 3 Brustkrebszelllinien und in 2 Brusttumoren, doch nicht in normalem Brustgewebe.
11. Hydrophilitätsprofil der Aminosäuren von 158P1D7, das durch Computer-Algorithmus-Sequenzanalyse unter Verwendung des Verfahrens von Hopp und Woods (Hopp T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828) bestimmt wurde, abgerufen von der Protscale-Webseite (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) durch den ExPasy Molekularbiologie Server.
12. Hydropathieprofil der Aminosäuren von 158P1D7, das durch Computer-Algorithmus-Sequenzanalyse unter Verwendung des Verfahrens von Kyte und Doolittle (Kyte J., Doolittle R. F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132) bestimmt wurde, abgerufen von der Protscale-Webseite (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) durch den ExPasy Molekularbiologie Server.
13. Prozentanteil-Profil der zugänglichen Aminosäurereste von 158P1D7, das durch Computer-Algorithmus-Sequenzanalyse unter Verwendung des Verfahrens von Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) bestimmt wurde, abgerufen von der Protscale-Webseite (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) durch den ExPasy Molekularbiologie Server.
14. Aminosäureprofil der durchschnittlichen Flexibilität von 158P1D7, das durch Computer-Algorithmus-Sequenzanalyse unter Verwendung des Verfahrens von Bhaskaran und Ponnuswamy (Bhaskaran R. und Ponnuswamy P. K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) bestimmt wurde, abgerufen von der ProtScale-Webseite (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) durch den ExPasy Molekularbiologie Server.
15. Beta-Haarnadelschleifen-Aminosäureprofil von 158P1D7, das durch Computer-Algorithmus-Sequenzanalyse unter Verwendung des Verfahrens van Deleage und Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294) bestimmt wurde, abgerufen von der ProtScale-Webseite (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) durch den ExPasy Molekularbiologie Server.
16A und 16B. Transmembranregion- und Orientierungsvorhersage für 158P1D7.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gliederung der Abschnitte

I.) Definitionen
II.) 158P1D7-Polynukleotide
II.A.) Verwendungen von 158P1D7-Polynukleotiden
II.A.1.) Kontrolle von genetischen Abnormalitäten
II.A.2.) Antisense-Ausführungsformen
II.A.3.) Primer und Primer-Paare
II.A.4.) Isolierung von 158P1D7-kodierenden Nukleinsäuremolekülen
II.A.5.) Rekombinante Nukleinsäuremoleküle und Wirt-Vektor-Systeme
III.) 158P1D7-Ähnliche Proteine
III.A.) Motiv-tragende Protein-Ausführungsformen
III.B.) Expression von 158P1D7-ähnlichen Proteinen
III.C.) Modifikationen von 158P1D7-ähnlichen Proteinen
III.D.) Verwendungen von 158P1D7-ähnlichen Proteinen
IV.) 158P1D7-Antikörper
V.) 158P1D7-Zelluläre Immunantworten
VI.) 158P1D7-Transgene Tiere
VII.) Verfahren zum Nachweis von 158P1D7
VIII.) Verfahren zur Kontrolle des Status von 158P1D7-ähnlichen Genen und ihren Produkten
IX.) Identifizierung von Molekülen, die mit 158P1D7 wechselwirken
X.) Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen
X.A.) Anti-Krebsimpfstoffe
X.B.) 158P1D7 als Ziel für Antikörper-basierte Therapie
X.C.) 158P1D7 als Ziel für zelluläre Immunantworten
X.C.1. Minigen-Impfstoffe
X.C.2. Kombinationen von CTL-Peptiden mit Helferpeptiden
X.C.3. Kombinationen von CTL-Peptiden mit T-Zell-Priming-Agenzien
X.C.4. Impfstoffzusammensetzungen, die DC umfassen, die mit CTL- und/oder HTL-Peptiden gepulst sind
X.D.) Adoptive Immuntherapie
X.E.) Verabreichung von Impfstoffen für therapeutische oder prophylaktische Zwecke
XI.) Diagnostische und prognostische Ausführungsformen von 158P1D7.
XII.) Inhibierung von 158P1D7-Proteinfunktion
XII.A.) Inhibierung von 158P1D7 mit intrazellulären Antikörpern
XII.B.) Inhibierung von 158P1D7 mit rekombinanten Proteinen
XII.C.) Inhibierung von 158P1D7-Transkription oder -Translation
XII.D.) Allgemeine Betrachtungen für therapeutische Strategien
XIII.) KITS

I.) Definitionen:
Sofern nicht anderweitig definiert, sollen alle hierin verwendeten Begriffe der Technik, Bezeichnungen und andere wissenschaftliche Begriffe oder Terminologie die Bedeutungen haben, die allgemein vom Fachmann der Technik, die diese Erfindung betrifft, verstanden werden. In einigen Fällen sind Begriffe mit allgemein verstandenen Bedeutungen hierin zur Klarheit und/oder bereiten Bezugnahme definiert und die Einschließung derartiger Definitionen hierin soll nicht notwendigerweise ausgelegt werden, dass ein wesentlicher Unterschied zu dem repräsentiert wird, was allgemein in der Technik verstanden wird. Viele der hierin beschriebenen oder hingewiesenen Techniken und Methoden sind gut verstanden und werden allgemein unter Verwendung von konventioneller Methodik durch den Fachmann eingesetzt, wie zum Beispiel die weit verbreiteten Methodiken zum molekularen Klonieren, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., beschrieben sind. Sofern angemessen, werden Methoden, die die Verwendung von gewerblich erhältlichen Kits und Reagenzien einschließen, allgemein gemäß den durch den Hersteller erläuterten Protokollen und/oder Parametern ausgeführt, sofern nicht anderweitig angemerkt ist.
Die Begriffe „invasiver Blasenkrebs" bedeuten Blasenkrebse, die sich auf die Blasenmuskelwand ausgebreitet haben, und sollen Stadium T2 – T4 und Erkrankung nach dem TNM (tumor = Tumor, node = Lymphknoten, metastasis = Metastase)-System einschließen. Im Allgemeinen haben diese Patienten wesentlich weniger günstige Resultate, im Vergleich zu Patienten mit nicht-invasivem Krebs. Nach Zystektomie werden 50% oder mehr der Patienten mit invasivem Krebs Metastase bilden (Whittmore. Semin. Urol. 1983; 1:4-10).
„Das native Glykosylierungsmuster verändern" ist für Zwecke mit der Bedeutung hierin beabsichtigt, eine oder mehrere Kohlenhydrat-Einheiten, die in der nativen Sequenz 158P1D7 gefunden werden, zu deletieren (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletieren der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel) und/oder eine oder mehrere Glykosylierungsstellen, die nicht in der nativen Sequenz 158P1D7 vorliegen, zu addieren. Außerdem schließt der Ausdruck qualitative Veränderungen bei der Glykosylierung der nativen Proteine ein, was eine Veränderung der Art und Anteile verschiedener vorliegender Kohlenhydrat-Einheiten einschließt.
Der Begriff „Analogon" bezeichnet ein Molekül, das strukturell ähnlich ist oder mit einem anderen Molekül ähnliche oder übereinstimmende Merkmale teilt (z.B. ein 158P1D7-ähnliches Protein). Beispielsweise kann ein Analogon des 158P1D7-Proteins spezifisch durch einen Antikörper oder eine T-Zelle, die spezifisch zum 158P1D7-Protein bindet, gebunden werden.
Der Begriff „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet. Folglich kann ein „Antikörper" natürlich vorkommen oder künstlich hergestellt sein, wie zum Beispiel monoklonale Antikörper, die durch konventionelle Hybridomatechnik hergestellt werden. Anti-158P1D7-Antikörper binden 158P1D7-Proteine oder ein Fragment davon und umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente, die die Antigen-bindende Domäne und/oder eine oder mehrere Komplementaritätbestimmende Regionen dieser Antikörper enthalten.
Ein „Antikörperfragment" ist als mindestens ein Teil der variablen Region des Immunoglobulinmoleküls, das zu seinem Ziel bindet, d.h. die Antigen-bindende Region, definiert. In einer Ausführungsform erfasst es speziell einzelne Anti-158P1D7-Antikörper und Klone davon (einschließlich Agonist, Anatgonist und neutralisierende Antikörper) und Anti-158P1D7-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitoper Spezifität.
Der Begriff „Kodon-optimierte Sequenzen" bezeichnet Nukleotidsequenzen, die für eine bestimmte Wirtsspezies durch Austausch von irgendeinem oder mehr als einem Kodon, das eine Einsatzhäufigkeit von weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 30% oder 40% hat, optimiert wurden. Eine Sequenz kann „vollständig optimiert" sein, um kein Kodon zu enthalten, das eine Einsatzhäufigkeit von weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 30% oder 40% hat. Nukleotidsequenzen, die für die Expression in einer gegebenen Wirtsspezies durch Eliminierung von störenden Polyadenylierungssequenzen, Eliminierung von Exon/Intron-Splicing-Signalen, Eliminierung von Transposon-artigen Wiederholungen und/oder Optimierung von GC-Gehalt zusätzlich zur Kodon-Optimierung optimiert wurden, werden hierin als „Expressions-verbesserte Sequenzen" bezeichnet.
Der Begriff „cytotoxisches Agens" bezeichnet eine Substanz, die eine oder mehr als eine Funktion von Zellen inhibiert oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht. Der Begriff soll radioaktive Isotope-Chemotherapeutika und Toxine, wie zum Beispiel kleine Molekültoxine oder enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, fungalen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, einschließlich Fragmenten und/oder Varianten davon, einschließen. Beispiele von cytotoxischen Agenzien schließen Folgende ein, sind aber nicht auf diese beschränkt:
Maytansinoide, Yttrium, Bismut, Ricin, Ricin-A-Kette, Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Dihydroxyanthracindion, Actinomycin, Diphtherie-Toxin, Pseudomonas Exotoxin (PE) A, PE40, Abrin, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin, Curicin, Crotin, Calicheamicin, Sapaonaria officinalis-Inhibitor und Glucocorticoid und andere Chemotherapeutika sowie Radioisotope, wie zum Beispiel At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² und radioaktive Isotope von Lu. Antikörper können auch zu einem Antikrebs-Prodrug-aktivierenden Enzym konjugiert sein, das fähig ist, das Prodrug in seine aktive Form umzuwandeln.
Der Begriff „Homologon" bezeichnet ein Molekül, das Homologie zu einem anderen Molekül zeigt, beispielsweise dadurch, dass es an übereinstimmenden Positionen Sequenzen von chemischen Resten hat, die gleich oder ähnlich sind. „Menschliches Leukozytenantigen" oder „HLA" ist ein menschliches Klasse-Ioder -Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC – Major Histocompatibility Complex)-Protein (siehe z.B. Stites et al., IMMUNOLOGY, 8. Ausg., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).
Die Begriffe „hybridisieren", „hybridisierend", „hybridisiert" und desgleichen, die im Zusammenhang mit Polynukleotiden verwendet werden, sollen sich auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen beziehen, bevorzugt wie zum Beispiel Hybridisierung in 50% Formamid/6 × SSC/0,1% SDS/100 μg/ml ssDNA, worin die Temperaturen für die Hybridisierung über 37 Grad C liegen und Temperaturen zum Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS über 55 Grad C liegen.
Die Ausdrücke „isoliert" oder „biologisch rein" bezeichnen Stoff, der im Wesentlichen oder hauptsächlich frei von Komponenten ist, die den Stoff, wie er in seinem nativen Zustand gefunden wird, normalerweise begleiten. Somit enthalten isolierte erfindungsgemäße Peptide bevorzugt keine Stoffe, die normalerweise mit den Peptiden in ihrer in-situ-Umgebung zusammenhängen oder vorliegen. Beispielsweise gilt ein Polynukleotid als „isoliert", wenn es im Wesentlichen von den kontaminierenden Polynukleotiden abgetrennt wurde, die mit den Nukleinsäuren, die keine von 158P1D7 sind, übereinstimmen oder zu diesen komplementär sind oder die Polypeptide kodieren, die nicht das 158P1D7-Genprodukt oder Fragmente davon sind. Ein Fachmann kann leicht Methoden zur Nukleinsäureisolierung einsetzen, um ein isoliertes 158P1D7-Polynukleotid zu erhalten. Ein Protein gilt beispielsweise als „isoliert", wenn physikalische, mechanische und/oder chemische Verfahren eingesetzt werden, um das 158P1D7-Protein von zellulären Bestandteilen zu entfernen, die normalerweise mit dem Protein zusammenhängen und vorliegen. Ein Fachmann kann leicht Standardverfahren zur Reinigung einsetzten, um ein isoliertes 158P1D7-Protein zu erhalten. Alternativ kann ein isoliertes Protein durch synthetische oder chemische Mittel bereitgestellt werden.
Der Begriff „Säuger" bezeichnet jedweden Organismus, der als ein Säuger klassifiziert ist, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hunden, Katzen, Kühen, Pferden und Menschen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger eine Maus. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger ein Mensch.
Die Begriffe „metastatischer Blasenkrebs" und „metastatische Erkrankung" bedeuten Blasenkrebse, die sich auf regionale Lymphknoten oder auf entfernte Stellen ausgebreitet haben, und sollen TxNxM+ nach dem TNM-System darstellen. Die häufigste Stelle für Blasenkrebsmetastase ist der Lymphknoten. Andere häufige Stellen für Metastase schließen Lunge, Knochen und Leber ein.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper" bezeichnet einen Antikörper, der von einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d.h. die Antikörper, die die Population umfassen, sind identisch, mit Ausnahme von möglichen, natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorliegen.
Ein „Motiv", wie im biologischen Motiv eines 158P1D7-ähnlichen Proteins, bezeichnet ein jedwedes Muster von Aminosäuren, die einen Teil der Primärsequenz eines Proteins bilden, das mit einer bestimmten Funktion (z.B. Protein-Protein-Wechselwirkung, Protein-DNA-Wechselwirkung, usw.) oder Modifikation (z.B. das heißt phosphoryliert, glycosyliert oder amidiert) oder Lokalisation (z.B. Sekretionssequenz, nukleäre Lokalisationssequenz, usw.) oder einer Sequenz, die mit Immunogenität, entweder humoraler oder zellulärer, zusammenhängt, in Verbindung gebracht wird. Ein Motiv kann entweder an bestimmte Positionen, die allgemein mit einer bestimmten Funktion oder Eigenschaft zusammenhängen, angrenzen oder fähig sein, an diese angepasst zu werden. Im Zusammenhang mit HLA-Motiven bezeichnet „Motiv" das Muster von Resten in einem Peptid definierter Länge, gewöhnlich ein Peptid von etwa 8 bis etwa 13 Aminosäuren für ein Klasse-I-HLA-Motiv und von etwa 6 bis etwa 25 Aminosäuren für ein Klasse-II-HLA-Motiv, das durch ein bestimmtes HLA-Molekül erkannt wird. Peptidmotive zur HLA-Bindung sind normalerweise für jedes Protein, das durch jedes menschliche HLA-Allel kodiert wird, verschieden und unterscheiden sich im Muster der primären und sekundären Ankerreste.
Ein „pharmazeutischer Arzneiträger" umfasst einen Stoff, wie zum Beispiel ein Adjuvans, einen Träger, pH-einstellende und puffernde Mittel, Tonizität-einstellende Mittel, Benetzungsmittel, Konservierungsmittel und desgleichen.
„Pharmazeutisch verträglich" bezeichnet eine nicht-toxische, inerte und/oder [Lakune] Zusammensetzung, die für Säuger, wie zum Beispiel Menschen, physiologisch verträglich ist.
Der Begriff „Polynukleotid" bedeutet eine polymere Form von Nukleotiden von mindestens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Basen oder Basenpaaren in der Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide oder eine modifizierte Form von beiden Typen von Nukleotiden, und soll einzel- und doppelsträngige Formen von DNA und/oder RNA einschließen. In der Technik wird dieser Begriff häufig synonym zu „Oligonukleotid" verwendet, obwohl „Oligonukleotid" verwendet werden kann, um auf eine Teilmenge von Polynukleotiden zu verweisen, die weniger als etwa 50 Nukleotide in der Länge aufweist. Ein Polynukleotid kann eine Nukleotidsequenz umfassen, die hierin offenbart ist, worin Thymidin (T) (wie beispielsweise in SEQ-ID.-NR.: 656 gezeigt) auch Uracil (U) sein kann; diese Definition betrifft Unterschiede zwischen den chemischen Strukturen von DNA und RNA, insbesondere die Beobachtung, dass eine von vier Hauptbasen in RNA Uracil (U) anstelle von Thymidin (T) ist.
Der Begriff „Polypeptid" bedeutet ein Polymer von mindestens etwa 4, 5, 6, 7 oder 8 Aminosäuren. In der gesamten Patentschrift werden die Standardbezeichnungen von drei Buchstaben oder einem Buchstaben für Aminosäuren verwendet. In der Technik wird dieser Begriff häufig synonym zu „Peptid" oder „Protein" verwendet, somit kann „Peptid" verwendet werden, um auf eine Teilmenge von Polypeptiden zu verweisen, die weniger als etwa 50 Aminosäuren in der Länge aufweist.
Ein HLA-„primärer Ankerrest" ist eine Aminosäure an einer spezifischen Position entlang einer Peptidsequenz, von der angenommen wird, dass sie einen Kontaktpunkt zwischen dem immunogenen Peptid und dem HLA-Molekül bereitstellt. Ein bis drei, gewöhnlich zwei, primäre Ankerreste innerhalb eines Peptids definierter Länge definieren allgemein ein „Motiv" für ein immunogenes Peptid. Von diesen Resten wird angenommen, dass sie in nahem Kontakt in die Peptidbindungsfurche eines HLA-Moleküls passen, wobei ihre Seitenketten in spezifischen Taschen der Bindungsfurche eingegraben sind. In beispielsweise einer Ausführungsform sind die primären Ankerreste für ein HLA-Klasse-I-Molekül an Position 2 (von der Amino-terminalen Position) und an der Carboxyl-terminalen Position eines erfindungsgemäßen Peptidepitops von 8, 9, 10, 11 oder 12 Resten lokalisiert. In beispielsweise einer weiteren Ausführungsform sind die primären Ankerreste eines Peptids, das ein HLA-Klasse-II-Molekül binden wird, relativ zueinander, anstelle an den Termini eines Peptids, verteilt, wo das Peptid allgemein aus mindestens 9 Aminosäuren in der Länge besteht. Die primären Ankerpositionen für jedes Motiv und Supermotiv sind in Tabelle IV dargelegt. Beispielsweise können analoge Peptide durch Veränderung der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten Resten in den primären und/oder sekundären Ankerpositionen, in Tabelle IV gezeigt, erzeugt werden. Derartige Analoga werden verwendet, um die Bindungsaffinität und/oder Bevölkerungsabdeckung eines Peptids, das ein bestimmtes HLA-Motiv oder -Supermotiv umfasst, zu modulieren.
Ein „rekombinantes" DNA- oder RNA-Molekül ist ein DNA- oder RNA-Molekül, das molekularer Manipulation in vitro unterworfen wurde. „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen ist leicht durch einen Durchschnittsfachmann bestimmbar und ist allgemein eine empirische Kalkulation, die von der Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen zum richtigen Annealing (Anlagern), während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Hybridisierung hängt allgemein von der Fähigkeit von denaturierten Nukleinsäuresequenzen ab, erneut anzulagern, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unterhalb ihrer Schmelztemperatur vorliegen. Um so höher der Grad der gewünschten Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Ergebnis folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu tendieren würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen dies dagegen weniger tun. Für zusätzliche Details und Erklärungen von Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
„Stringente Bedingungen" oder „hohe Stringenzbedingungen", wie hierin definiert, werden durch Folgendes gekennzeichnet, doch sind nicht auf solche beschränkt, die: (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur zum Waschen einsetzen, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie zum Beispiel Formamid, einsetzen, beispielsweise 50% (v/v) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphat-Puffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3) Folgendes einsetzen: 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, DNA aus sonifiziertem Lachssperma (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42 °C, mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55 °C, gefolgt von einer hoch stringenten Waschung, die aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, besteht, bei 55 °C. „Mittlere stringente Bedingungen" werden, doch sind nicht beschränkt auf diese, durch solche in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, beschrieben und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und %-SDS) ein, die weniger stringent sind als die vorstehend Beschriebenen. Ein Beispiel von mittleren stringenten Bedingungen ist die Inkubation über Nacht bei 37 °C in einer Lösung, die Folgendes umfasst: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte, gescherte DNA aus Lachssperma, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Der Fachmann wird erkennen, wie die Temperatur, Ionenstärke usw., wie notwendig, angepasst werden können, um Faktoren, wie zum Beispiel Sondenlänge und desgleichen, in Einklang zu bringen.
Ein HLA-„Supermotiv" ist eine Peptidbindungsspezifität, die von HLA-Molekülen, die durch zwei oder mehr HLA-Allele kodiert werden, geteilt wird.
Ein „transgenes Tier" (z.B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier, das Zellen besitzt, die ein Transgen enthalten, dessen Transgen in das Tier oder einen Vorfahren des Tiers in einer pränatalen, z.B. einer embryonalen, Phase eingebracht wurde. Ein „Transgen" ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt, eingebaut ist.
Wie hierin verwendet, ist ein HLA oder „Impfstoff" mit zellulärer Immunantwort eine Zusammensetzung, die ein odere mehrere Peptide der Erfindung enthält oder kodiert. Es gibt zahlreiche Ausführungsformen derartiger Impfstoffe, wie zum Beispiel einen Cocktail von einem oder mehreren einzelnen Peptiden; ein oder mehrere Peptide der Erfindung, die von einem polyepitopen Peptid umfasst werden; oder Nukleinsäuren, die derartige einzelne Peptide oder Polypeptide kodieren, z.B. ein Minigen, das ein polyepitopes Peptid kodiert. Die „ein oder mehreren Peptide" können jedwede ganze Einheit einer Ganzzahl von 1-150 oder mehr einschließen, z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, oder 150 oder mehr Peptide der Erfindung. Die Peptide oder Polypeptide können gegebenenfalls modifiziert sein, wie zum Beispiel durch Lipidierung, Addition von Ziel- oder anderen Sequenzen. HLA-Klasse-I-Peptide der Erfindung können mit HLA-Klasse-II-Peptiden vermischt oder verknüpft sein, um die Aktivierung von sowohl den cytotoxischen T-Lymphozyten als auch den Helfer-T-Lymphozyten zu erleichtern. HLA-Impfstoffe können auch Peptid-gepulste, Antigenpräsentierende Zellen umfassen, z.B. dendritische Zellen.
Der Begriff „Variante" bezeichnet ein Molekül, das eine Variation von einer beschriebenen Art oder Norm aufzeigt, wie zum Beispiel ein Protein, das einen oder mehrere verschiedene Aminosäurereste in der/den entsprechenden Position(en) eines speziell beschriebenen Proteins (z.B. des 158P1D7-Proteins, das in 2 oder 3 gezeigt ist) hat. Ein Analogon ist ein Beispiel eines Variantenproteins.
Die 158P1D7-ähnlichen Proteine der Erfindung schließen solche ein, die hierin spezifisch identifiziert wurden, sowie allelische Varianten, konservative Substitutionsvarianten, Analoga und Homologa, die ohne übermäßiges Experimentieren entsprechend den Verfahren, die hierin erläutert oder in der Technik leicht zugänglich sind, isoliert/erzeugt und charakterisiert werden können. Fusionsproteine, die Teile von verschiedenen 158P1D7-Proteinen oder Fragmenten davon vereinigen, sowie Fusionsproteine eines 158P1D7-Proteins und eines heterologen Polypeptids sind auch eingeschlossen. Derartige 158P1D7-Proteine werden gemeinsam als die 158P1D7-ähnlichen Proteine, die Proteine der Erfindung oder 158P1D7 bezeichnet. Der Begriff„158P1D7-ähnliches Protein" bezeichnet ein Polypeptidfragment oder eine 158P1D7-Proteinsequenz von 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 oder mehr als 25 Aminosäuren; oder mindestens etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 oder mehr als 100 Aminosäuren.
II.) 158P1D7-Polynukleotide
Ein Aspekt der Erfindung stellt die Kontrolle und den Nachweis von Polynukleotiden bereit, die mit allen oder einem Teil von einem 158P1D7-Gen, einer -mRNA und/oder -kodierenden Sequenz, bevorzugt in isolierter Form, übereinstimmen oder zu diesen komplementär sind, einschließlich Polynukleotiden, die ein 158P1D7-ähnliches Protein und Fragmente davon kodieren, DNA, RNA, DNA/RNA-Hybrid und ähnlichen Molekülen, Polynukleotiden oder Oligonukleotiden, die zu einem 158P1D7-Gen oder einer -mRNA-Sequenz oder einem Teil davon komplementär sind, und Polynukleotiden oder Oligonukleotiden, die zu einem 158P1D7-Gen, einer -mRNA oder zu einem 158P1D7-kodierenden Polynukleotid (insgesamt „158P1D7-Polynukleotide") hybridisieren. In allen Fällen, wenn auf sie in diesem Abschnitt verweisen wird, kann in 2 T auch U sein.
Ausführungsformen eines 158P1D7-Polynukleotids schließen Folgende ein: ein 158P1D7-Polynukleotid mit der in 2 dargestellten Sequenz, der Nukleotidsequenz von 158P1D7, wie in 2 dargestellt ist, worin T U ist; mindestens 10 zusammenhängende Nukleotide eines Polynukleotids mit der in 2 dargestellten Sequenz; oder mindestens 10 benachbarte Nukleotide eines Polynukleotids mit der in 2 dargestellten Sequenz, worin T U ist. Beispielsweise umfassen Ausführungsformen von 158P1D7-Nukleotiden, ohne Einschränkung, Folgende:

(a) ein Polynukleotid, das die in 2 dargestellte Sequenz umfasst oder aus ihr besteht, worin T auch U sein kann;
(b) ein Polynukleotid, das die in 2 dargestellte Sequenz, von Nukleotidrest-Nummer 23 bis Nukleotidrest-Nummer 2548, umfasst oder aus ihr besteht, worin T auch U sein kann;
(c) ein Polynukleotid, das ein 158P1D7-ähnliches Protein kodiert, dessen Sequenz durch die cDNAs, die im Plasmid, das mit p158P1D7-Turbo/3PX bezeichnet und bei American Type Culture Collection mit der Accession No. (Zugangsnummer) PTA-__am 22. August 2001 hinterlegt wurde (über Federal Express am 20. August 2001 gesendet), enthalten sind, kodiert wird;
(d) ein Polynukleotid, das ein 158P1D7-ähnliches Protein kodiert, das mindestens 90% zu der in 2 dargestellten, gesamten Aminosäuresequenz homolog ist;
(e) ein Polynukleotid, das ein 158P1D7-ähnliches Protein kodiert, das mindestens 90% mit der in 2 dargestellten, gesamten Aminosäuresequenz identisch ist;
(f) ein Polynukleotid, das mindestens ein in den Tabellen V-XVIII dargelegtes Peptid kodiert;
(g) ein Polynukleotid, das eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 3 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841 kodiert, die eine Aminosäureposition mit einem Wert von größer als 0,5 im Hydrophilitätsprofil von 11 einschließt;
(h) ein Polynukleotid, das eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 3 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841 kodiert, die eine Aminosäureposition mit einem Wert von kleiner als 0,5 im Hydropathieprofil von 12 einschließt;
(i) ein Polynukleotid, das eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 3 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841 kodiert, die eine Aminosäureposition mit einem Wert von größer als 0,5 im Prozentanteil-Profil der zugänglichen Reste von 13 einschließt;
(j) ein Polynukleotid, das eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 3 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841 kodiert, die eine Aminosäureposition mit einem Wert von größer als 0,5 im Profil der durchschnittlichen Flexibilität von 14 einschließt;
(k) ein Polynukleotid, das eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 3 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841 kodiert, die eine Aminosäureposition mit einem Wert von größer als 0,5 im Beta-Haarnadelschleife-Profil von 15 einschließt;
(l) ein Polynukleotid, das zu einem Polynukleotid von einem von (a)-(k) vollständig komplementär ist;
(m) ein Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen selektiv zu einem Polynukleotid von (a)-(1) hybridisiert;
(n) ein Peptid, das durch eins von (a)-(k) kodiert ist; und
(o) ein Polynukleotid von einem von (a)-(m) oder Peptid von (n) zusammen mit einem pharmazeutischen Arzneiträger und/oder in einer menschlichen Einheitsdosisform.

Wie hierin verwendet, wird eingesehen, dass eine Auswahl speziell alle ganzen Einheitspositionen davon offenbart.
Typische Ausführungsformen der Erfindung, die hierin offenbart sind, schließen 158P1D7-Polynukleotide ein, die spezifische Teile der 158P1D7-mRNA-Sequenz (und solche, die zu derartigen Sequenzen komplementär sind) kodieren, wie zum Beispiel solche, die das Protein oder Fragmente davon kodieren, beispielsweise von 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 oder 841 zusammenhängenden Aminosäuren.
Beispielsweise schließen hierin offenbarte, repräsentative Ausführungsformen der Erfindung Folgende ein: Polynukleotide und ihre kodierten Peptide, die selbst etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 10 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 10 bis etwa Aminosäure 20 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 20 bis etwa Aminosäure 30 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 30 bis etwa Aminosäure 40 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 40 bis etwa Aminosäure 50 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 50 bis etwa Aminosäure 60 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 60 bis etwa Aminosäure 70 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 70 bis etwa Aminosäure 80 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 90 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, Polynukleotide, die etwa Aminosäure 90 bis etwa Aminosäure 100 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, in Inkrementen von etwa 10 Aminosäuren, die an der Carbonyl-terminalen Aminosäure, die in 2 oder 3 dargelegt ist, enden. Entsprechend sind Polynukleotide, die Teile der Aminosäuresequenz (von etwa 10 Aminosäuren) von Aminosäure 100 bis zur Carboxyl-terminalen Aminosäure des 158P1D7-Proteins kodieren, Ausführungsformen der Erfindung. Es wird eingesehen, dass darin jede bestimmte Aminosäureposition diese Position plus oder minus fünf Aminosäurereste offenbart.
Polynukleotide, die relativ lange Teile des 158P1D7-Proteins kodieren, sind auch im Rahmen der Erfindung. Beispielsweise können Polynukleotide, die von etwa Aminosäure 1 (oder 20 oder 30 oder 40 usw.) bis etwa Aminosäure 20 (oder 30 oder 40 oder 50 usw.) des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins kodieren, durch eine Vielfalt von in der Technik gut bekannten Techniken erzeugt werden. Diese Polynukleotidfragmente können jedweden Teil der 158P1D7-Sequenz, wie in 2 oder 3 gezeigt, einschließen.
Zusätzliche erläuternde Ausführungsformen der Erfindung, die hierin offenbart sind, schließen 158P1D7-Polynukleotidfragmente ein, die ein oder mehrere biologische Motive kodieren, die innerhalb der 158P1D7-Proteinsequenz enthalten sind, einschließlich einer oder mehrerer der in den Tabellen V-XVIII dargelegten Motiv-tragenden Subsequenzen des 158P1D7-Proteins. In einer weiteren Ausführungsform kodieren typische Polynukleotidfragmente der Erfindung eine oder mehrere der Regionen von 158P1D7, die zu einem bekannten Molekül Homologie zeigen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können typische Polynukleotidfragmente eine oder mehrere der 158P1D7-N-Glycosylierungsstellen, cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinase-Phosphorylierungsstellen, Casein-Kinase-II-Phosphorylierungsstellen oder eine N-Myristoylierungsstelle und Amidierungsstellen kodieren.
II.A.) Verwendungen von 158P1D7-Polynukleotiden
II.A.1.) Kontrolle von genetischen Abnormalitäten
Die Polynukleotide der vorangehenden Abschnitte haben etliche verschiedene spezifische Verwendungen. Das menschliche 158P1D7-Gen entstammt der in Beispiel 3 dargelegten chromosomalen Lage. Da das 158P1D7-Gen diesem Chromosom entstammt, werden beispielsweise Polynukleotide, die verschiedene Regionen des 158P1D7-Proteins kodieren, dazu verwendet, zytogenetische Abnormalitäten dieses chromosomalen Orts zu kennzeichnen, wie zum Beispiel Abnormalitäten, die mit verschiedenen Krebsen in Verbindung gebracht werden. In bestimmten Genen wurde eine Vielfalt von chromosomalen Abnormalitäten, einschließlich Rearrangements, als häufige zytogenetische Abnormalitäten in etlichen verschiedenen Krebsen identifiziert (siehe z.B. Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) und Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Somit liefern Polynukleotide, die spezifische Regionen des 158P1D7-Proteins kodieren, neue Werkzeuge, die mit größerer Genauigkeit, als es zuvor möglich war, zur Beschreibung von zytogenetischen Abnormalitäten in der chromosomalen Region, die 158P1D7 kodiert, die zum malignen Phänotyp beitragen könnten, verwendet werden können. In diesem Zusammenhang erfüllen diese Polynukleotide einen Bedarf in der Technik zur Erweiterung der Empfindlichkeit von chromosomalem Screening, um feinere und weniger häufige chromosomale Abnormalitäten zu identifizieren (siehe z.B. Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 171(4): 1055-1057 (1994)).
Da gezeigt wurde, dass 158P1D7 in Blasen- und anderen Krebsen sehr hoch exprimiert wird, werden 158P1D7-Polynukleotide weiterhin in Verfahren, die den Status von 158P1D7-Genprodukten in normalen im Vergleich zu kanzerösen Geweben beurteilen, verwendet. Typischerweise werden Polynukleotide, die spezifische Regionen des 158P1D7-Proteins kodieren, zur Beurteilung der Gegenwart von Störungen (wie zum Beispiel Deletionen, Insertionen, Punktmutationen oder Veränderungen, die zu einem Verlust eines Antigens führen usw.) in spezifischen Regionen des 158P1D7-Gens, wie zum Beispiel derartige Regionen, die ein oder mehrere Motive enthalten, verwendet. Exemplarische Assays schließen sowohl RT-PCR-Assays als auch die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP = single-strand conformation polymorphism)-Analyse ein (siehe z.B. Marrogi et at., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)), die beide Polynukleotide, die spezifische Regionen eines Proteins kodieren, zur Untersuchung dieser Regionen innerhalb des Proteins verwenden.
II.A.2.) Antisense-Ausführungsformen
Andere speziell erwogene Nukleinsäure-ähnliche Ausführungsformen, die durch die hierin offenbarte Erfindung kontrolliert oder nachgewiesen werden, sind genomische DNA, cDNAs, Ribozyme und Antisense-Moleküle sowie Nukleinsäuremoleküle, die auf einer alternativen Hauptkette basieren oder alternative Basen einschließen, ob von natürlichen Quellen abstammend oder synthetisiert, und schließen Moleküle ein, die fähig sind, die RNA oder Proteinexpression von 158P1D7 zu inhibieren. Beispielsweise können Antisense-Moleküle RNAs oder andere Moleküle sein, einschließlich Peptidnukleinsäuren (PNAs) oder Nicht-Nukleinsäuremoleküle, wie zum Beispiel Phosphorthioat-Derivate, die spezifisch DNA oder RNA auf eine Basenpaar-abhängige Weise binden. Ein Fachmann kann diese Klassen von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung der hierin offenbarten 158P1D7-Polynukleotide und -Polynukleotidsequenzen leicht erhalten.
Antisense-Technologie bringt die Verabreichung von exogenen Oligonukleotiden mit sich, die zu einem Ziel-Polynukleotid, das innerhalb der Zelle lokalisiert ist, binden. Der Begriff „Antisense-" verweist auf die Tatsache, dass derartige Oligonukleotide zu ihren intrazellulären Zielen, z.B. 158P1D7, komplementär sind. Siehe beispielsweise Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; und Synthesis 1: 1-5 (1988). Die 158P1D7-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung schließen Derivate ein, wie zum Beispiel S-Oligonukleotide (Phosphorthioat-Derivate oder S-Oligos, siehe Jack Cohere, oben), die eine erhöhte Inhibierungswirkung für Krebszellwachstum zeigen. S-Oligos (Nukleosid-Phosphorthioate) sind isoelektronische Analoga eines Oligonukleotids (O-Oligo), in denen ein nicht-überbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe durch ein Schwefelatom ersetzt ist. Die S-Oligos der vorliegenden Erfindung können durch Behandlung der entsprechenden O-Oligos mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid, das ein Schwefel-Übertragungsreagenz ist, hergestellt werden. Siehe Iyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); und Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990). Zusätzliche 158P1D7-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung schließen in der Technik bekannte Morpholino-Antisense-Oligonukleotide ein (siehe z.B. Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
Die 158P1D7-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können typischerweise RNA oder DNA sein, die zu den ersten 100 5'-Kodons oder letzten 100 3'-Kodons der 158P1D7-genomischen Sequenz oder der entsprechenden mRNA komplementär ist oder stabil mit diesen hybridisiert. Es ist keine absolute Komplementarität erforderlich, obgleich hohe Grade an Komplementarität bevorzugt sind. Die Verwendung eines Oligonukleotids, das zu dieser Region komplementär ist, ermöglicht die selektive Hybridisierung zu 158P1D7-mRNA und nicht zu mRNA, die andere regulatorische Untereinheiten von Proteinkinase bestimmt. In einer Ausführungsform sind 158P1D7-Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung 15- bis 30-mer-Fragmente des Antisense-DNA-Moleküls, die eine Sequenz haben, die zu 158P1D7-mRNA hybridisiert. Gegebenenfalls ist das 158P1D7-Antisense-Oligonukleotid ein 30-mer-Oligonukleotid, das zu einer Region in den ersten 10 5'-Kodons oder letzten 10 3'-Kodons von 158P1D7 komplementär ist. Alternativ sind die Antisense-Moleküle modifiziert, um Ribozyme bei der Inhibierung von 158P1D7-Expression einzusetzen, siehe z.B. L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet. 12: 510-515 (1996).
II.A.3.) Primer und Primer-Paare
Weitere spezifische Ausführungsformen dieser Nukleotide schließen Primer und Primer-Paare ein, die die spezifische Amplifikation von Polynukleotiden der Erfindung oder von jedweden spezifischen Teilen davon ermöglichen, und Sonden, die selektiv oder spezifisch zu Nukleinsäuremolekülen der Erfindung oder zu jedwedem Teil davon hybridisieren. Primer können auch als Sonden verwendet werden und können mit einem nachweisbaren Marker, wie zum Beispiel einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem Metallchelat oder Enzym, markiert werden. Derartige Sonden und Primer werden zum Nachweis der Gegenwart eines 158P1D7-Polynukleotids in einer Probe und als ein Mittel zum Nachweis einer Zelle, die ein 158P1D7-Protein exprimiert, verwendet.
Beispiele von derartigen Sonden schließen Polypeptide, die alles oder Teil der in 2 dargestellten, menschlichen 158P1D7-cDNA-Sequenz umfassen, ein. Beispiele von Primer-Paaren, die zur spezifischen Amplifikation von 158P1D7-mRNAs fähig sind, sind auch in den Beispielen beschrieben. Wie von einem Fachmann eingesehen werden wird, können sehr viele verschiedene Primer und Sonden hergestellt werden, die auf den hierin bereitgestellten Sequenzen basieren und effektiv zur Amplifikation und/oder zum Nachweis einer 158P1D7-mRNA verwendet werden. Bevorzugte Sonden der Erfindung sind Polynukleotide von mehr als etwa 9, etwa 12, etwa 15, etwa 18, etwa 20, etwa 23, etwa 25, etwa 30, etwa 35, etwa 40, etwa 45 und etwa 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die in den hierin offenbarten 158P1D7-Nukleinsäuren gefunden werden.
Die 158P1D7-Polynukleotide der Erfindung sind für etliche Zwecke nützlich, einschließlich, doch nicht darauf beschränkt, ihrer Verwendung als Sonden und Primer für die Amplifikation und/oder den Nachweis des/der 158P1D7-Gens/Gene, -mRNA(s) oder Fragmente davon; als Reagenzien für die Diagnose und/oder Prognose von Blasenkrebs und anderen Krebsen; als kodierende Sequenzen, die fähig sind, die Expression von 158P1D7-Polypeptiden zu steuern; als Werkzeuge zur Modulation oder Inhibierung der Expression des/der 158P1D7-Gens/Gene und/oder Translation des/der 158P1D7-Transkripts/Transkripte; und als Therapeutikum.
II.A.4.) Isolierung von 158P1D7-kodierenden Nukleinsäuremolekülen
Die hierin beschriebenen 158P1D7-cDNA-Sequenzen ermöglichen die Isolierung von anderen Polynukleotiden, die das/die 158P1D7-Genprodukte) kodieren, sowie die Isolierung von Polynukleotiden, die 158P1D'1-Genprodukthomologa, alternativ gespleißte Isoformen, allelische Varianten und Mutantformen des 158P1D7-Genprodukts kodieren, sowie Polynukleotiden, die Analoga von 158P1D7-ähnlichen Proteinen kodieren. Verschiedene Verfahren zum molekularen Klonieren, die zur Isolierung von cDNAs in vollständiger Länge, die ein 158P1D7-Gen kodieren, eingesetzt werden können, sind gut bekannt (siehe beispielsweise Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Hrsg., Wiley and Sons, 1995). Beispielsweise können Lambda-Phagen-Klonierungsmethoden in geeigneter Weise unter Verwendung von gewerblich erhältlichen Klonierungssystemen (z.B. Lambda ZAP Express, Stratagene) eingesetzt werden. Phagenklone, die 158P1D7-Gen-cDNAs enthalten, können durch Testen mit einer markierten 158P1D7-cDNA oder einem Fragment davon identifiziert werden. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform die 158P1D7-cDNA (2) oder ein Teil davon synthetisiert und als Sonde zum Auffinden von überlappenden und cDNAs in vollständiger Länge, die mit einem 158P1D7-Gen übereinstimmen, verwendet werden. Das 158P1D7-Gen selbst kann durch Screening der genomischen DNA-Bibliotheken, Bibliotheken von künstlichen bakteriellen Chromosomen (BAC – bacterial artificial chromosome), Bibliotheken von künstlichen Hefechromosomen (YAC – yeast artificial chromosome) und desgleichen mit 158P1D7-DNA-Sonden oder -Primern isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung von jedweder Sonde, wie hierin beschrieben, zur Identifizierung und Isolierung einer 158P1D7- oder 158P1D7-ähnlichen Nukleinsäuresequenz aus einer natürlich vorkommenden Quelle, wie zum Beispiel Menschen oder anderen Säugern, sowie die isolierte Nukleinsäuresequenz an sich, die alle oder die meisten der Sequenzen, die in der verwendeten Sonde gefunden werden, umfassen würde, ein.
II.A.5.) Rekombinante Nukleinsäuremoleküle und Wirt-Vektor-Systeme
Die Erfindung stellt auch rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein 158P1D7-Polynukleotide, ein Fragment, Analogon oder Homologon davon enthalten, bereit, einschließlich Folgender, doch nicht auf diese beschränkt: Phagen, Plasmide, Phagemide, Cosmide, YACs, BACs sowie verschiedene virale und nicht-virale Vektoren, die in der Technik gut bekannt sind, und Zellen, die mit derartigen rekombinanten DNA- oder RNA-Molekülen transformiert oder transfiziert sind. Verfahren zur Erzeugung derartiger Moleküle sind gut bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, oben). Die Erfindung stellt weiter ein Wirt-Vektor-System bereit, das ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein 158P1D7-Polynukleotid, Fragment, Analogon oder Homologon davon enthält, innerhalb einer geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle umfasst. Beispiele von geeigneten eukaryotischen Wirtszellen schließen eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle, wie zum Beispiel eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle (z.B. eine Baculovirus-infizierbare Zelle, wie zum Beispiel eine Sf9- oder HighFive-Zelle) ein. Beispiele von geeigneten Säugerzellen schließen verschiedene Blasenkrebszelllinien, wie zum Beispiel SCaBER, UM-UC3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 und SW780, andere transfizierbare oder transduzierbare Blasenkrebszelllinien sowie etliche Säugerzellen, die routinemäßig zur Expression von rekombinanten Proteinen verwendet werden (z.B. COS-, CHO-, 293-, 293T-Zellen), ein. Noch genauer kann ein Polynukleotid, das die kodierende Sequenz von 158P1D7 oder eines Fragments, Analogons oder Homologons davon umfasst, zur Erzeugung von 158P1D7-Proteinen oder Fragmenten davon unter Verwendung irgendeiner Zahl von Wirt-Vektor-Systemen, die routinemäßig verwendet werden und in der Technik gut bekannt sind, verwendet werden.
Es ist eine große Auswahl an Wirt-Vektor-Systemen, die zur Expression von 158P1D7-Proteinen oder Fragmenten davon geeignet sind, erhältlich (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, oben; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, oben). Bevorzugte Vektoren zur Säugerexpression schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: pcDNA 3.1 Myc-His-Tag (Invitrogen) und den retroviralen Vektor pSRatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Unter Verwendung dieser Expressionsvektoren kann 158P1D7 in mehreren Blasenkrebs- und Nicht-Blasenzelllinien, einschließlich beispielsweise SCaBER, UM-UC3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 und SW780, exprimiert werden. Die Wirt-Vektor-Systeme der Erfindung sind zur Herstellung eines 158P1D7-Proteins oder Fragments davon nützlich. Derartige Wirt-Vektor-Systeme können zur Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von 158P1D7 und 158P1D7-Mutationen oder Analoga eingesetzt werden.
Rekombinantes menschliches 158P1D7-Protein oder ein Analogon oder Homologon oder Fragment davon kann von Säugerzellen, die mit einem Konstrukt, das ein 158P1D7-ähnliches Nukleotid kodiert, transfiziert sind, erzeugt werden. Beispielsweise können 293T-Zellen mit einem Expressionsplasmid, das 158P1D7 oder Fragment, Analogon oder Homologon davon kodiert, transfiziert werden, das 158P1D7- oder ähnliche Protein wird in den 293T-Zellen exprimiert und das rekombinante 158P1D7-Protein wird unter Verwendung von Standardverfahren zur Reinigung (z.B. Affinitätsreinigung unter Verwendung von Anti-158P1D7-Antikörpern) isoliert. In einer weiteren Ausführungsform wird eine 158P1D7-kodierende Sequenz in den retroviralen Vektor pSRαMSVtkneo subkloniert und zur Infizierung verschiedener Säugerzelllinien, wie zum Beispiel NIH 3T3, TsuPr1, 293 und rat-1, verwendet, um 158P1D7-exprimierende Zelllinien zu produzieren. Verschiedene andere Expressionssysteme, die in der Technik gut bekannt sind, können auch eingesetzt werden. Expressionskonstrukte, die ein Leitpeptid kodieren, das im Rahmen mit der 158P1D7-kodierenden Sequenz verbunden ist, können zur Erzeugung einer sekretierten Form von rekombinantem 158P1D7-Protein verwendet werden.
Wie hierin diskutiert, erlaubt die Redundanz im genetischen Code die Variation in 158P1D7-Gensequenzen. Insbesondere ist in der Technik bekannt, dass spezifische Wirtsspezies häufig spezifische Kodon-Präferenzen haben und somit kann man die offenbarte Sequenz, wie es für einen gewünschten Wirt bevorzugt ist, anpassen. Beispielsweise werden in bevorzugten analogen Kodon-Sequenzen typischerweise seltene Kodons (d.h. Kodons mit einer Einsatzhäufigkeit von weniger als etwa 20% in bekannten Sequenzen des gewünschten Wirts) durch häufigere Kodons ersetzt. Kodon-Präferenzen werden für eine spezifische Spezies beispielsweise durch Anwenden der Tabellen zur Kodon-Einsatzhäufigkeit, die im INTERNET, wie zum Beispiel bei URL www.dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html, erhältlich sind, berechnet.
Es ist bekannt, dass zusätzliche Sequenzmodifikationen die Proteinexpression in einem zellulären Wirt erhöhen. Diese schließen Eliminierung von Sequenzen, die störende Polyadenylierungssignale, Exon/Intron-Spleißstellensignale, Transposon-artige Wiederholungen kodieren, und/oder anderer derartiger gut charakterisierter Sequenzen, die für die Genexpression schädlich sind, ein. Der GC-Gehalt der Sequenz wird auf für einen gegebenen zellulären Wirt durchschnittliche Niveaus angeglichen, wie durch Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet wird. Wo es möglich ist, wird die Sequenz modifiziert, um vorhergesagte sekundäre Haarnadel-mRNA-Strukturen zu vermeiden. Andere nützliche Modifikationen schließen die Addition einer translationalen-Initiation-Konsensussequenz am Anfang des offenen Leserasters ein, wie in Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989) beschrieben ist. Der Fachmann sieht ein, dass die allgemeine Regel, dass eukaryotische Ribosomen Translation ausschließlich am nahgelegenen 5'-AUG-Kodon initiieren, nur unter seltenen Bedingungen aufgehoben ist (siehe z.B. Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) und Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).
III.) 158P1D7-Ähnliche Proteine
Spezifische Ausführungsformen von 158P1D7-Proteinen umfassen ein Polypeptid mit der gesamten oder einem Teil der Aminosäuresequenz von menschlichem 158P1D7, wie in 2 oder 3 gezeigt. Alternativ umfassen Ausführungsformen von 158P1D7-Proteinen Varianten-, Homologon- oder Analogon-Polypeptide, die Veränderungen in der in 2 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenz von 158P1D7 aufweisen.
Im Allgemeinen teilen natürlich vorkommende allelische Varianten von menschlichem 158P1D7 einen hohen Grad an struktureller Identität und Homologie (z.B. 90% oder mehr Homologie). Typischerweise enthalten allelische Varianten des 158P1D7-Proteins konservative Aminosäuresubstitutionen innerhalb der hierin beschriebenen 158P1D7-Sequenzen oder enthalten eine Substitution einer Aminosäure von einer entsprechenden Position in einem Homologon von 158P1D7. Eine Klasse von allelischen 158P1D7-Varianten sind Proteine, die einen hohen Grad an Homologie mit mindestens einer kleinen Region einer bestimmten 158P1D7-Aminosäuresequenz teilen, doch weiter eine radikale Abweichung von der Sequenz enthalten, wie zum Beispiel eine nicht-konservative Substitution, Verkürzung, Insertion oder Leserasterverschiebung. Beim Vergleich von Proteinsequenzen haben die Begriffe Ähnlichkeit, Identität und Homologie jeder eine eigene Bedeutung, wie auf dem Gebiet der Genetik eingesehen wird. Außerdem können Orthologie und Paralogie wichtige Konzepte zur Beschreibung der Beziehung von Mitgliedern einer gegebenen Proteinfamilie in einem Organismus zu den Mitgliedern der gleichen Familie in anderen Organismen sein.
Aminosäureabkürzungen sind in Tabelle II bereitgestellt. Konservative Aminosäuresubstitutionen können häufig in einem Protein vorgenommen werden, ohne weder die Konformation noch die Funktion des Proteins zu verändern. Proteine der Erfindung können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr konservative Substitutionen umfassen. Derartige Veränderungen schließen das Substituieren von jedwedem der Folgenden ein: Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) für irgendeine andere dieser hydrophoben Aminosäuren; Asparaginsäure (D) für Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) für Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) für Threonin (T) und umgekehrt. Andere Substitutionen können auch als konservativ betrachtet werden, was von der Umgebung der bestimmten Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins abhängt. Beispielsweise können Glycin (G) und Alanin (A) häufig austauschbar sein, so können auch Alanin (A) und Valin (V) austauschbar sein. Methionin (M), das realtiv hydrophob ist, kann häufig gegen Leucin und Isoleucin, und manchmal gegen Valin, ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig in Positionen austauschbar, in denen das bedeutende Merkmal des Aminosäurerests seine Ladung ist und die unterschiedlichen pKs dieser zwei Aminosäurereste nicht bedeutend sind. Noch andere Veränderungen können als „konservativ" in bestimmten Umgebungen betrachtet werden (siehe z.B. Tabelle III hierin; Seite 13-15 „Biochemistry" 2. Ausgabe, Lubert Stryer, Hrsg. (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992, Vol. (Bd.) 89, 10915-10919; Lei et al., J. Biol. Chem. 1995 May 19 (19. Mai); 270(20):11882-6).
Hierin offenbarte Ausführungsformen der Erfindung schließen eine große Vielfalt von, in der Technik anerkannten Varianten oder Analoga von 158P1D7-Proteinen ein, wie zum Beispiel Polypeptide mit Aminosäureinsertionen, -deletionen und -substitutionen. 158P1D7-Varianten können unter Verwendung der in der Technik bekannten Verfahren, wie zum Beispiel ortsspezifische Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese, erzeugt werden. Ortsspezifische Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), Kassettenmutagenese (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), Restriktion-Selektion-Mutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R.Soc. London SerA, 317:415 (1986)) oder andere bekannte Techniken können an der klonierten DNA zur Herstellung der 158P1D7-Varianten-DNA ausgeführt werden.
Aminosäure-Scanning-Analyse kann auch zur Identifizierung von einer oder mehreren Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz, die an einer spezifischen biologischen Aktivität, wie zum Beispiel einer Protein-Protein-Wechselwirkung, beteiligt ist, eingesetzt werden. Unter den zum Scanning bevorzugten Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Derartige Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine zum Scanning bevorzugte Aminosäure in dieser Gruppe, da es nach dem Beta-Kohlenstoff keine Seitenkette aufweist und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation des Varianten verändern wird. Alanin ist typischerweise auch bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiterhin wird sie häufig in sowohl verborgenen als auch freigelegten Positionen gefunden (Creighton, The Proteins. (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Falls Alanin-Substitution nicht zu angemessenen Mengen von Variant führt, kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
Wie hierin definiert, haben 158P1D7-Varianten, -Analoga oder -Homologa die charakteristische Eigenschaft, dass sie mindestens ein Epitop aufweisen, das mit einem 158P1D7-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID.-NR.: 657 „kreuzreaktiv" ist. Wie in diesem Satz verwendet, bedeutet „kreuzreaktiv", dass ein Antikörper oder eine T-Zelle, der/die spezifisch zu einem 158P1D7-Varianten bindet, auch spezifisch zum 158P1D7-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID.-NR.: 657 bindet. Ein Polypeptid ist kein Variant des in SEQ-ID.-NR.: 657 dargestellten Proteins mehr, wenn es kein Epitop mehr enthält, das von einem Antikörper oder einer T-Zelle, der/die spezifisch zum 158P1D7-Protein bindet, erkannt werden kann. Der Fachmann sieht ein, dass Antikörper, die Proteine erkennen, zu Epitopen von variierender Größe binden und eine Gruppierung der Folge von etwa vier oder fünf Aminosäuren, zusammenhängend oder nicht, als eine typische Zahl von Aminosäuren in einem kleinsten Epitop angesehen wird. Siehe z.B. Nair et al., J. Immunol. 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol. Immunol. (1989) 26(9):865-73; Schwartz et al., J. Immunol. (1985) 135(4):2598-608.
Eine weitere Klasse von 158P1D7-ähnlichen Proteinvarianten teilen 70%, 75%, 80%, 85% oder 90% oder mehr Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID.-NR.: 657 oder einem Fragment davon. Eine weitere spezifische Klasse von 158P1D7-Proteinvarianten oder -analoga umfasst ein oder mehrere der biologischen 158P1D7-Motive, die hierin beschrieben sind oder derzeit in der Technik bekannt sind. Somit werden durch die vorliegende Erfindung Analoga von 158P1D7-Fragmenten (Nuklein- oder Aminosäure-) umfasst, die relativ zum Ausgangsfragment veränderte funktionelle (z.B. immunogene) Eigenschaften haben. Es sollte eingesehen werden, dass Motive, die jetzt Teil der Technik sind oder dies werden, auf die Nuklein- oder Aminosäuresequenzen von 2 oder 3 angewendet werden sollten.
Wie hierin diskutiert, schließen Ausführungsformen der beanspruchten Erfindung Polypeptide ein, die weniger als die vollständige Aminosäuresequenz des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins enthalten. Beispielsweise umfassen repräsentative Ausführungsformen der Erfindung Peptide/Proteine mit 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins.
Außerdem schließen repräsentative Ausführungsformen der Erfindung, hierin offenbart, Folgende ein: Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 10 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 10 bis etwa Aminosäure 20 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 20 bis etwa Aminosäure 30 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 30 bis etwa Aminosäure 40 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 40 bis etwa Aminosäure 50 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 50 bis etwa Aminosäure 60 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 60 bis etwa Aminosäure 70 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 70 bis etwa Aminosäure 80 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 90 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 90 bis etwa Aminosäure 100 des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, usw., durchgehend durch die Gesamtheit der 158P1D7-Aminosäuresequenz. Außerdem sind Polypeptide, die aus etwa Aminosäure 1 (oder 20 oder 30 oder 40 usw.) bis etwa Aminosäure 20 (oder 130 oder 140 oder 150 usw.) des in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Proteins bestehen, Ausführungsformen der Erfindung. Es sollte eingesehen werden, dass die Start- und Endpositionen in diesem Absatz auf die angegebene Position sowie diese Position plus oder minus 5 Reste verweisen.
158P1D7-ähnliche Proteine werden unter Verwendung von normaler Peptidsynthesetechnologie oder unter Verwendung von chemischen Spaltungsverfahren, die gut in der Technik bekannt sind, erzeugt. Alternativ können rekombinante Verfahren zur Erzeugung von Nukleinsäuremolekülen, die ein 158P1D7-ähnliches Protein kodieren, verwendet werden. In einer Ausführungsform stellen Nukleinsäuremoleküle ein Mittel zur Erzeugung von definierten Fragmenten des 158P1D7-Proteins (oder Varianten, Homologa oder Analoga davon) bereit.
III.A.) Motiv-tragende Protein-Ausführungsformen
Zusätzliche erläuternde, nachweisbare oder kontrollierbare Ausführungsformen der Erfindung, hierin offenbart, schließen 158P1D7-Polypeptide ein, die die Aminosäurereste von einem oder mehreren der biologischen Motive, die innerhalb der in 2 oder 3 dargelegten 158P1D7-Polypeptidsequenz enthalten sind, umfassen. Verschiedene Motive sind in der Technik bekannt und ein Protein kann zur Gegenwart derartiger Motive durch etliche, öffentlich zugängliche Internetseiten beurteilt werden (siehe z.B. URL-Adressen: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/tools/scnpsitl.html; Epimatrix^TM und Epimer^TM, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; und BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).
Motiv-tragende Subsequenzen des 158P1D7-Proteins sind in Tabelle XIX dargelegt und identifiziert.
Tabelle XX legt mehrere häufig vorkommende Motive dar, was auf Pfam-Suche beruht (siehe URL-Adresse pfam.wustl.edu/). Die Spalten von Tabelle XX führen (1) die Abkürzung des Motivnamens, (2) die prozentuale Identität, die unter den verschiedenen Mitgliedern der Motivfamilie gefunden wird, (3) den Motivnamen oder die Motivbeschreibung und (4) die häufigste Funktion auf; Informationen zur Lage sind eingeschlossen, falls das Motiv für die Lage relevant ist.
Polypeptide, die ein oder mehrere der vorstehend diskutierten 158P1D7-Motive umfassen, sind bei der Aufklärung der spezifischen Eigenschaften eines malignen Phänotyps im Hinblick auf die Beobachtung nützlich, dass die vorstehend diskutierten 158P1D7-Motive mit Wachstumsdysregulation in Verbindung gebracht werden, und da 158P1D7 in bestimmten Krebsen überexprimiert wird (Siehe z.B. Tabelle I). Beispielsweise sind Casein-Kinase II, cAMP- und camp-abhängige Proteinkinase und Proteinkinase C Enzyme, die dafür bekannt sind, dass sie mit der Entwicklung des malignen Phänotyps zusammenhängen (siehe z.B. Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) und O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Außerdem sind sowohl Glycosylierung als auch Myristoylierung Proteinmodifikationen, die auch mit Krebs und Progression von Krebs in Verbindung gebracht werden (siehe z.B. Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raja et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). Amidierung ist eine weitere Proteinmodifikation, die auch mit Krebs und Progression von Krebs in Verbindung gebracht wird (siehe z.B. Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)).
In einer weiteren Ausführungsform umfassen Proteine der Erfindung ein oder mehrere der immunreaktiven Epitope, die gemäß in der Technik anerkannten Verfahren identifiziert sind, wie zum Beispiel die in den Tabellen V-XVIII dargelegten Peptide. CTL-Epitope können unter Verwendung spezifischer Algorithmen zur Identifizierung von Peptiden innerhalb eines 158P1D7-Proteins, die zur optimalen Bindung zu spezifischen HLA-Allelen fähig sind, bestimmt werden (z.B. Tabelle IV; Epimatrix^TM und Epimer^TM, Brown University, URL www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; und BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.). Außerdem sind Prozesse zur Identifizierung von Peptiden, die ausreichende Bindungsaffinität für HLA-Moleküle aufweisen und die damit korreliert werden, dass sie immunogene Epitope sind, in der Technik gut bekannt und werden ohne übermäßiges Experimentieren ausgeführt. Außerdem sind Prozesse zur Identifizierung von Peptiden, die immunogene Epitope sind, in der Technik gut bekannt und werden ohne übermäßiges Experimentieren entweder in vitro oder in vivo ausgeführt.
Es sind auch Prinzipien zur Erzeugung von Analoga derartiger Epitope, um die Immunogenität zu modulieren, in der Technik bekannt. Beispielsweise beginnt man mit einem Epitop, dass ein CTL- oder HTL-Motiv trägt (siehe z.B. die HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Motive/Supermotive von Tabelle IV). Aus dem Epitop wird durch Substitution einer Aminosäure an einer der spezifischen Positionen und Ersetzen dieser gegen eine andere Aminosäure, die für diese Position bestimmt ist, ein Analog gebildet. Beispielsweise kann man einen schädlichen Rest zu Gunsten eines jedweden anderen Rests, wie zum Beispiel eines bevorzugten, in Tabelle IV definierten Rests, substituieren; einen weniger bevorzugten Rest gegen einen bevorzugten, in Tabelle IV definierten Rest substituieren; oder einen ursprünglich vorkommenden bevorzugten Rest gegen einen anderen bevorzugten, in Tabelle IV definierten Rest substituieren. Substitutionen können an primären Ankerpositionen oder an anderen Positionen in einem Peptid vorkommen; siehe z.B. Tabelle IV.
Eine Vielfalt von Literaturhinweisen reflektieren die Technik in Bezug auf die Identifizierung und Erzeugung von Epitopen in einem interessierenden Protein sowie Analoga davon. Siehe beispielsweise WO 9733602 an Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; und Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 und Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.
Ähnliche Ausführungsformen der Erfindungen schließen Polypeptide ein, die Kombinationen der unterschiedlichen, in Tabelle XIX dargelegten Motive und/oder ein oder mehrere der vorhergesagten CTL-Epitope von Tabelle V bis Tabelle XVIII und/oder ein oder mehrere der in der Technik bekannten T-Zell-Bindungsmotive umfassen. Bevorzugte Ausführungsformen enthalten keine Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, weder innerhalb der Motive noch der dazwischenliegenden Sequenzen der Polypeptide. Außerdem können Ausführungsformen, die eine Vielzahl von entweder N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäureresten an einer von beiden Seiten dieser Motive einschließen, wünschenswert sein (um beispielsweise einen größeren Teil der Polypeptid-Architektur, in der das Motiv lokalisiert ist, einzuschließen). Typischerweise beträgt die Anzahl von N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäureresten an einer von beiden Seiten eines Motivs zwischen etwa 1 bis etwa 100 Aminosäurereste, bevorzugt 5 bis etwa 50 Aminosäurereste.
158P1D7-Ähnliche Proteine sind in vielen Formen verkörpert, bevorzugt in isolierter Form. Ein aufgereinigtes 158P1D7-Proteinmolekül wird im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Molekülen sein, die die Bindung von 158P1D7 zum Antikörper, zur T-Zelle oder zu einem anderen Liganden beeinträchtigen. Die Art und der Grad der Isolierung und Reinigung wird von der beabsichtigten Verwendung abhängen. Ausführungsformen von 158P1D7-ähnlichen Proteinen schließen aufgereinigte 158P1D7-ähnliche Proteine und funktionelle, lösliche 158P1D7-ähnliche Proteine ein. In einer Ausführungsform bewahrt ein funktionelles, lösliches 158P1D7-Protein oder Fragment davon die Fähigkeit, durch einen Antikörper, eine T-Zelle oder einen anderen Liganden gebunden zu werden.
Die Erfindung stellt auch 158P1D7-Proteine bereit, die biologisch aktive Fragmente der in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Aminosäuresequenz umfassen. Derartige Proteine weisen Eigenschaften des 158P1D7-Proteins auf, wie zum Beispiel die Fähigkeit, die Bildung von Antikörpern, die spezifisch ein Epitop binden, das mit dem 158P1D7-Protein in Verbindung gebracht wird, hervorzurufen; durch derartige Antikörper gebunden zu werden; die Aktivierung von HTL oder CTL hervorzurufen; und/oder durch HTL oder CTL erkannt zu werden.
158P1D7-Ähnliche Polypeptide, die besonders interessante Strukturen enthalten, können unter Verwendung verschiedener, in der Technik gut bekannter, analytischer Techniken, einschließlich beispielsweise der Verfahren nach Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder der Jameson-Wolf-Analyse, oder basierend auf Immunogenität, vorausgesagt und/oder identifiziert werden. Fragmente, die derartige Strukturen enthalten, sind bei der Erzeugung von Untereinheit-spezifischen Anti-158P1D7-Antikörpern oder T-Zellen oder bei der Identifizierung zellulärer Faktoren, die zu 158P1D7 binden, besonders nützlich.
CTL-Epitope können unter Verwendung spezifischer Algorithmen bestimmt werden, um Peptide innerhalb eines 158P1D7-Proteins zu identifizieren, die zu einer optimalen Bindung zu spezifischen HLA-Allelen fähig sind, (z.B. unter Verwendung der SYFPEITHI-Seite im World Wide Web URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; der Auflistungen in Tabelle IV (A)-(E); Epimatrix^TM und Epimer^TM, Brown University, URL (www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); und BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/. Zur Erläuterung: es wurden Peptidepitope von 158P1D7, die im Zusammenhang mit menschlichen MHC-Klasse-I-Molekülen HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 und B35 präsentiert werden, vorausgesagt (Tabellen V-XVIII). Insbesondere wurde die vollständige Aminosäuresequenz des 158P1D7-Proteins in den HLA Peptide Motif Search algorithm (HLA-Peptidmotiv-Suchalgorithmus) eingegeben, der auf der vorstehend aufgelisteten Bioinformatics-and-Molecular-Analysis-Section(BIMAS = Bioinformatik- und Molekularanalyse-Bereich)-Webseite gefunden wird. Der HLA-Peptidmotiv-Suchalgorithmus wurde von Dr. Ken Parker entwickelt und basiert auf der Bindung von spezifischen Peptidsequenzen in der Furche von HLA-Klasse-I-Molekülen, insbesondere HLA-A2 (siehe z.B. Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Dieser Algorithmus ermöglicht die Lokalisierung und Einschätzung von 8-mer-, 9-mer- und 10-mer-Peptiden von einer vollständigen Proteinsequenz für die vorausgesagte Bindung zu HLA-A2 sowie zahlreichen anderen HLA-Klasse-I-Molekülen. Viele HLA-Klasse-I-Bindungspeptide sind 8-, 9-, 10- oder 11-mere. Beispielsweise enthalten die Epitope für Klasse-I-HLA-A2 bevorzugt ein Leucin (L) oder Methionin (M) an Position 2 und ein Valin (V) oder Leucin (L) am C-Terminus (siehe z.B. Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Ausgewählte Ergebnisse von vorausgesagten 158P1D7-Bindungspeptiden sind hierin in den Tabellen V-XVIII dargestellt. In den Tabellen V-XVIII sind die obersten 50 rangierenden Kandidaten, 9-mere und 10-mere, für jedes Familienmitglied zusammen mit ihrer Lokalisierung, der Aminosäuresequenz von jedem spezifischen Peptid und einem geschätzten Bindungs-Score dargestellt. Der Bindungs-Score entspricht der geschätzten Halbwertszeit von Dissoziation von Komplexen, die das Peptid enthalten, bei 37 °C und pH 6,5. Es wird vorausgesagt, dass Peptide mit dem höchsten Bindungs-Score die am festesten Gebundenen zu HLA Klasse I auf der Zelloberfläche für die längste Zeitdauer sind und somit die besten immunogenen Ziele für T-Zell-Erkennung darstellen.
Die eigentliche Bindung von Peptiden zu einem HLA-Allel kann durch Stabilisierung von HLA-Expression auf der Antigen-entwickelnden defekten Zelllinie T2 bewertet werden (siehe z.B. Xue et al., Prostate 30:73-8 (1997) und Peshwa et al., Prostate 36:129-38 (1998)). Immunogenität von spezifischen Peptiden kann in vitro durch Stimulation von cytotoxischen CD8+-T-Lymphozyten (CTL = cytotoxische T-Lymphozyten) in Gegenwart von Antigen-präsentierenden Zellen, wie zum Beispiel dendritischen Zellen, bewertet werden.
Es sollte eingesehen werden, dass jedes Epitop, das durch die BIMAS-Seite, Epimer^TM- und Epimatrix^TM-Seiten vorausgesagt oder durch die HLA-Klasse-I- oder -Klasse-II-Motive, die in der Technik verfügbar sind oder Teil der Technik werden, wie zum Beispiel in Tabelle IV dargelegt (oder unter Verwendung der World Wide Webseite URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/), bestimmt wird, auf das 158P1D7-Protein „angewendet" werden soll. Wie in diesem Zusammenhang verwendet, bedeutet „angewendet", dass das 158P1D7-Protein bewertet wird, z.B. visuell oder durch computerbasierte Verfahren zum Auffinden von Mustern, wie vom Fachmann der entsprechenden Technik eingesehen wird. Jede Subsequenz des 158P1D7 von 8, 9, 10 oder 11 Aminosäureresten, die ein HLA-Klasse-I-Motiv trägt, oder eine Subsequenz von 9 oder mehr Aminosäureresten, die ein HLA-Klasse-II-Motiv trägt, sind im Rahmen der Erfindung.
III.B.) Expression von 158P1D7-ähnlichen Proteinen
In einer in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Ausführungsform kann 158P1D7 zweckdienlicherweise in Zellen (wie zum Beispiel 293T-Zellen) exprimiert werden, die mit einem gewerblich erhältlichen Expressionsvektor transfiziert sind, wie zum Beispiel einem CMV-gesteuerten Expressionsvektor, der 158P1D7 mit einem C-terminalen 6xHis- und MYC-Tag (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen oder Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN) kodiert. Der Tag5-Vektor stellt ein IgGK-Sekretionssignal bereit, das zur Unterstützung der Bildung eines sekretierten 158P1D7-Proteins in transfizierten Zellen verwendet werden kann. Das sekretierte 158P1D7 mit HIS-Tags im Kulturmedium kann aufgereinigt werden, z.B. unter Verwendung einer Nickel-Säule unter Verwendung von Standardtechniken.
III.C.) Modifikationen von 158P1D7-ähnlichen Proteinen
Modifikationen von 158P1D7-ähnlichen Proteinen, wie zum Beispiel kovalente Modifikationen, sind im Rahmen dieser Erfindung eingeschlossen. Eine Art von kovalenter Modifikation schließt das Reagieren von gezielten Aminosäureresten eines 158P1D7-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zur Reaktion mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des 158P1D7 fähig ist, ein. Eine weitere Art von kovalenter Modifikation des 158P1D7-Polypeptids, die im Rahmen dieser Erfindung eingeschlossen ist, umfasst die Veränderung des nativen Glycosylierungsmusters eines Proteins der Erfindung. Eine weitere Art von kovalenter Modifikation von 158P1D7 umfasst die Verknüpfung des 158P1D7-Polypeptids zu einem von einer Vielfalt von nicht-proteinartigen Polymeren, z.B. Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylenen, auf die in den U.S.-Patenten Nr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 oder 4 179 337 dargelegte Weise.
Die 158P1D7-ähnlichen Proteine der vorliegenden Erfindung können auch modifiziert sein, um ein chimäres Molekül zu bilden, das 158P1D7 umfasst, das mit einem einer weiteren heterologen Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert ist. Ein derartiges chimäres Molekül kann chemisch oder auf rekombinante Weise synthetisiert werden. Ein chimäres Molekül kann ein Protein der Erfindung enthalten, das mit einem weiteren Tumor-assoziierten Antigen oder Fragment davon fusioniert ist. Alternativ kann ein erfindungsgemäßes Protein eine Fusion von Fragmenten der 158P1D7-Sequenz (Amino- oder Nukleinsäure-) derart umfassen, dass ein Molekül gebildet wird, das durch seine Länge nicht direkt homolog zu den in 2 oder 3 dargestellten Amino- oder Nukleinsäuresequenzen ist. Ein derartiges chimäres Molekül kann Mehrfache der gleichen Subsequenz von 158P1D7 umfassen. Ein chimäres Molekül kann eine Fusion eines 158P1D7-ähnlichen Proteins mit einem Polyhistidin-Epitop-Tag, das ein Epitop bereitstellt, an das immobilisiertes Nickel selektiv binden kann, mit Cytokinen oder mit Wachstumsfaktoren umfassen. Der Epitop-Tag ist allgemein am Amino- oder Carboxyl-Terminus des 158P1D7 angebracht. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion eines 158P1D7-ähnlichen Proteins mit einem Immunoglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunoglobulins umfassen. Bei einer bivalenten Form des chimären Moleküls (auch als ein „Immunadhäsin" bezeichnet) könnte eine derartige Fusion zu der Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen. Die Ig-Fusionen schließen bevorzugt die Substitution einer löslichen (Transmembrandomäne deletiert oder inaktiviert) Form eines 158P1D7-Polypeptids an der Stelle von mindestens einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls ein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Immunoglobulin-Fusion die Drehachse CH2 und CH3 oder die Drehachsenregionen CHI, CH2 und CH3 eines IgGI-Moleküls ein. Zur Herstellung von Immunoglobulin-Fusionen siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5 428 130, ausgestellt am 27. Juni 1995.
III.D.) Verwendungen von 158P1D7-ähnlichen Proteinen
Die Proteine der Erfindung haben etliche verschiedene Verwendungen. Da 158P1D7 in Blasen- und anderen Krebsen stark exprimiert wird, werden 158P1D7-ähnliche Proteine in Verfahren verwendet, die den Status von 158P1D7-Genprodukten in normalen im Vergleich zu kanzerösen Geweben bewerten, wodurch der maligne Phänotyp aufgeklärt wird. Normalerweise werden Polypeptide aus spezifischen Regionen des 158P1D7-Proteins zur Bewertung der Gegenwart von Störungen (wie zum Beispiel Deletionen, Insertionen, Punktmutationen usw.) in solchen Regionen (wie zum Beispiel Regionen, die ein oder mehrere Motive enthalten) verwendet. Exemplarische Assays nutzen Antikörper oder T-Zellen, die auf 158P1D7-ähnliche Proteine ausgerichtet sind, die die Aminosäurereste von einem oder mehreren der biologischen Motive, die innerhalb der 158P1D7-Polypeptidsequenz enthalten sind, umfassen, um die Merkmale dieser Region in normalen im Vergleich zu kanzerösen Geweben zu bewerten oder eine Immunantwort auf das Epitop aufzuklären. Alternativ werden 158P1D7-ähnliche Proteine, die die Aminosäurereste von einem oder mehreren der biologischen Motive in dem 158P1D7-Protein enthalten, zum Screening auf Faktoren, die mit dieser Region von 158P1D7 wechselwirken, verwendet.
158P1D7-Proteinfragmente/-Subsequenzen sind besonders bei der Erzeugung und Charakterisierung von domänenspezifischen Antikörpern (z.B. Antikörpern, die ein extrazelluläres oder intrazelluläres Epitop eines 158P1D7-Proteins erkennen) zur Identifizierung von Agenzien oder zellulären Faktoren, die zu 158P1D7 oder einer bestimmten strukturellen Domäne davon binden, und in verschiedenen therapeutischen und diagnostischen Zusammenhängen, einschließlich, doch nicht auf diagnostische Assays, Krebsimpfstoffe und Verfahren zur Herstellung derartiger Impfstoffe beschränkt, nützlich.
Proteine, die durch die 158P1D7-Gene oder durch Analoga, Homologa oder Fragmente davon kodiert werden, haben viele Verwendungen, einschließlich, doch nicht auf die Erzeugung von Antikörpern beschränkt, und in Verfahren zur Identifizierung von Liganden und anderen Agenzien und zellulären Bestandteilen, die zu einem 158P1D7-Genprodukt binden. Antikörper, die gegen ein 158P1D7-Protein oder Fragment davon produziert sind, sind in diagnostischen und prognostischen Assays und in bildgebenden Methoden beim Management von menschlichen Krebsen, die durch Expression von 158P1D7-Protein gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel solchen in Tabelle I Aufgelisteten, nützlich. Derartige Antikörper können intrazellulär exprimiert und in Verfahren zur Behandlung von Patienten mit derartigen Krebsen verwendet werden. 158P1D7-Ähnliche Nukleinsäuren oder Proteine werden auch zur Erzeugung von HTL- oder CTL-Reaktionen verwendet.
Es werden verschiedene immunologische, zum Nachweis von 158P1D7-Proteinen nützliche Assays verwendet, einschließlich, doch nicht auf verschiedene Arten von Radioimmunassays, enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISA), enzymgebundenen Immunfluoreszenz-Assays (ELIFA), immunocytochemische Verfahren und desgleichen beschränkt. Antikörper können markiert sein und als immunologische bildgebende Reagenzien, die zum Nachweis von 158P1D7-exprimierenden Zellen fähig sind (z.B. in radioszintigraphischen bildgebenden Verfahren), verwendet werden. 158P1D7-Proteine sind auch besonders bei der Erzeugung von Krebsimpfstoffen nützlich, wie hierin weiter beschrieben wird.
IV.) 158P1D7-Antikörper
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt Antikörper bereit, die zu 158P1D7-ähnlichen Proteinen binden. Bevorzugte Antikörper binden spezifisch zu einem 158P1D7-ähnlichen Protein und binden nicht (oder binden schwach) zu Peptiden oder Proteinen, die nicht 158P1D7-ähnliche Proteine sind. Beispielsweise können Antikörper, die 158P1D7 binden, 158P1D7-ähnliche Proteine, wie zum Beispiel die Homologa oder Analoga davon, binden.
158P1D7-Antikörper der Erfindung sind besonders in diagnostischen und prognostischen Assays für Blasenkrebs und bildgebenden Methoden nützlich. Ähnlich sind derartige Antikörper bei der Behandlung, Diagnose und/oder Prognose von anderen Krebsen nützlich, soweit 158P1D7 in diesen anderen Krebsen auch exprimiert oder überexprimiert wird. Außerdem sind intrazellulär exprimierte Antikörper (z.B. Einzelketten-Antikörper) therapeutisch bei der Behandlung von Krebsen nützlich, in denen die Expression von 158P1D7 eingeschlossen ist, wie zum Beispiel in fortgeschrittenen oder metastatischen Blasenkrebsen.
Die Erfindung stellt auch verschiedene immunologische Assays bereit, die zum Nachweis und zur Quantifizierung von 158P1D7 und 158P1D7-ähnlichen Mutationsproteinen nützlich sind. Derartige Assays können einen oder mehrere 158P1D7-Antikörper umfassen, die zur Erkennung und Bindung eines 158P1D7-ähnlichen Proteins, wie jeweils anwendbar, fähig sind. Diese Assays werden in verschiedenen immunologischen, in der Technik gut bekannten Assayformaten ausgeführt, einschließlich, doch nicht auf verschiedene Arten von Radioimmunassays, enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISA), enzymgebundenen Immunfluoreszenz-Assays (ELIFA) und desgleichen beschränkt.
Immunologische Nicht-Antikörper-Assays der Erfindung umfassen auch T-Zell-Immunogenitätsassays (inhibitorische oder stimulierende) sowie Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Bindungsassays.
Außerdem werden durch die Erfindung auch immunologische bildgebende Verfahren, die zum Nachweis von Blasenkrebs und anderen Krebsen, die 158P1D7 exprimieren, geeignet sind, einschließlich, doch nicht auf radioszintigraphische bildgebende Verfahren beschränkt, unter Verwendung von markierten 158P1D7-Antikörpern bereitgestellt. Derartige Assays sind beim Nachweis, bei der Kontrolle und Prognose von 158P1D7-exprimierenden Krebsen, wie zum Beispiel Blasenkrebs, klinisch nützlich.
158P1D7-Antikörper werden auch in Verfahren zur Aufreinigung eines 158P1D7-ähnlichen Proteins und zur Isolierung von 158P1D7-Homologa und ähnlichen Molekülen verwendet. Beispielsweise umfasst ein Verfahren zur Aufreinigung eines 158P1D7-ähnlichen Proteins das Inkubieren eines 158P1D7-Antikörpers, der zu einer festen Matrix gekoppelt wurde, mit einem Lysat oder einer anderen Lösung, die ein 158P1D7-ähnliches Protein enthält, unter Bedingungen, die dem 158P1D7-Antikörper ermöglichen, zu dem 158P1D7-ähnlichen Protein zu binden; Waschen der festen Matrix, um Verunreinigungen zu entfernen; und Eluieren des 158P1D7-ähnlichen Proteins vom gekoppelten Antikörper. Andere Verwendungen der 158P1D7-Antikörper der Erfindung schließen die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern, die das 158P1D7-Protein nachahmen, ein.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind in der Technik gut bekannt. Beispielsweise können Antikörper durch Immunisieren eines geeigneten Säugerwirts unter Verwendung eines 158P1D7-ähnlichen Proteins, -Peptids oder -Fragments in isolierter oder immunkonjugierter Form hergestellt werden (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Hrsg., Harlow und Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Außerdem können auch Fusionsproteine von 158P1D7 verwendet werden, wie zum Beispiel ein 158P1D7-GST-Fusionsprotein. In einer bestimmten Ausführungsform wird ein GST-Fusionsprotein, das die gesamte oder das meiste der Aminosäuresequenz von 2 oder 3 umfasst, hergestellt, dann als ein Immunogen zur Erzeugung entsprechender Antikörper verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird ein 158P1D7-ähnliches Protein synthetisiert und als ein Immunogen verwendet.
Außerdem werden in der Technik bekannte Immunisierungstechniken mit nackter DNA verwendet (mit oder ohne aufgereinigtem 158P1D7-ähnlichen Protein oder 158P1D7-exprimierenden Zellen), um eine Immunantwort auf das kodierte Immunogen zu erzeugen (zur Übersicht siehe Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
Die Aminosäuresequenz von 158P1D7, wie in 2 oder 3 dargestellt, kann analysiert werden, um spezifische Regionen des 158P1D7-Proteins zur Erzeugung von Antikörpern zu selektieren. Beispielsweise werden Hydrophobitäts- und Hydrophilitätsanalysen der 158P1D7-Aminosäuresequenz zur Identifizierung von hydrophilen Regionen in der 158P1D7-Struktur verwendet (siehe z.B. das Beispiel mit dem Titel „Antigenitätsprofile"). Regionen des 158P1D7- Proteins, die immunogene Struktur zeigen, sowie andere Regionen und Domänen können leicht unter Verwendung von verschiedenen anderen, in der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, wie zum Beispiel nach Chou-Fasman, Hopp und Woods, Kyte-Doolittle, Janin, Bhaskaran und Ponnuswamy, Deleage und Roux, Garnier-Robson, Eisenberg, Karplus-Schultz oder der Jameson-Wolf-Analyse. Somit ist jede Region, die durch eines dieser Programme oder Verfahren identifiziert wird, im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Verfahren zur Erzeugung von 158P1D7-Antikörpern werden weiter durch hierin bereitgestellte Beispiele erläutert. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids zur Verwendung als ein Immunogen sind in der Technik gut bekannt. In der Technik sind auch Verfahren zur Herstellung von immunogenen Konjugaten eines Proteins mit einem Träger, wie zum Beispiel BSA, KLH oder anderen Trägerproteinen, gut bekannt. Unter einigen Umständen wird direkte Konjugation unter Verwendung von beispielsweise Carbodimid-Reagenzien eingesetzt; in anderen Fällen sind verknüpfende Reagenzien, wie zum Beispiel solche, die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, geliefert werden, effektiv. Die Verabreichung eines 158P1D7-Immunogens wird häufig durch Injektion über eine geeignete Zeitdauer und unter Verwendung eines geeigneten Adjuvans, wie in der Technik verstanden wird, durchgeführt. Während des Immunisierungsablaufes können Titer von Antikörpern zur Bestimmung der Angemessenheit der Antikörperbildung genommen werden.
Monoklonale 158P1D7-Antikörper können auf verschiedenen, in der Technik gut bekannten Wegen hergestellt werden. Beispielsweise werden immortalisierte Zelllinien, die einen gewünschten monoklonalen Antikörper sekretieren, unter Verwendung der normalen Hybridomatechnik von Kohler und Milstein oder Modifikationen, die Antikörper-produzierende B-Zellen immortalisieren, wie allgemein bekannt ist, hergestellt. Immortalisierte Zelllinien, die die gewünschten Antikörper sekretieren, werden durch einen Immunoassay, in dem das Antigen ein 158P1D7-ähnliches Protein ist, getestet. Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur identifiziert ist, können die Zellen expandiert werden und die Antikörper entweder von in-vitro-Kulturen oder von Aszitesflüssigkeit hergestellt werden.
Die Antikörper oder Fragmente der Erfindung können auch durch rekombinante Mittel produziert werden. Regionen, die spezifisch zu den gewünschten Regionen des 158P1D7-Proteins binden, können auch im Zusammenhang mit chimären oder Antikörpern, in die die Komplemantarität-bestimmende Region (CDR) eingeführt wurde, verschiedenen Ursprungs von Spezies hergestellt werden. Humanisierte oder menschliche 158P1D7-Antikörper können auch produziert werden und sind für die Verwendung in therapeutischen Zusammenhängen bevorzugt. Verfahren zum Humanisieren muriner und anderer nicht-menschlicher Antikörper durch Austauschen von einer oder mehrerer der nicht-menschlichen Antikörper-CDRs gegen entsprechende menschliche Antikörpersequenzen sind gut bekannt (siehe beispielsweise Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Siehe auch Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 und Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.
Verfahren zur Herstellung vollständig menschlicher, monoklonaler Antikörper schließen Phagen-Display und transgene Verfahren ein (zur Übersicht siehe Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Vollständig menschliche, monoklonale 158P1D7-Antikörper können unter Verwendung von Klonierungstechnologien, die große kombinatorische Bibliotheken von menschlichen Ig-Genen einsetzen (d.h. Phagen-Display), erzeugt werden (Griffiths und Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Hrsg.), Nottingham Academic, S. 45-64 (1993); Burton und Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. id., S. 65-82). Vollständig menschliche, monoklonale 158P1D7-Antikörper können auch unter Verwendung von transgenen Mäusen hergestellt werden, die entwickelt wurden, damit sie menschliche Immunoglobulin-Genloci enthalten, wie in der PCT Patentanmeldung WO98/24893, Kucherlapati und Jakobovits et al., veröffentlicht am 3. Dezember 1997, beschrieben ist (siehe auch Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; U.S.-Patente 6 162 963, ausgestellt am 19. Dezember 2000; 6 150 584, ausgestellt am 12. November 2000; und 6 114 598, ausgestellt am 5. September 2000). Dieses Verfahren vermeidet die in-vitro-Manipulation, die bei der Phagen-Display-Technik erforderlich ist, und produziert effizient authentische menschliche Antikörper mit hoher Affinität.
Die Reaktivität von 158P1D7-Antikörpern mit einem 158P1D7-ähnlichen Protein kann durch etliche gut bekannte Mittel, einschließlich Western-Blot-, Immunpräzipitations-, ELISA- und FACS-Analysen, unter Verwendung von 158P1D7-ähnlichen Proteinen, 158P1D7-exprimierenden Zellen oder Extrakten davon, wie jeweils anwendbar, ermittelt werden. Ein 158P1D7-Antikörper oder Fragment davon kann mit einem nachweisbaren Marker markiert oder zu einem zweiten Molekül konjugiert sein. Geeignete nachweisbare Marker schließen Folgende ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, chemilumineszierende Verbindung, ein Metallchelat oder ein Enzym. Ferner werden bispezifische Antikörper, die für zwei oder mehr 158P1D7-Epitope spezifisch sind, unter Verwendung von allgemein in der Technik bekannten Verfahren erzeugt. Homodimere Antikörper können auch durch in der Technik bekannte Vernetzungstechniken erzeugt werden (z.B. Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
V.) 158P1D7-Zelluläre Immunantworten
Der Mechanismus, durch den T-Zellen Antigene erkennen, wurde beschrieben. Wirksame Peptidepitop-Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung induzieren therapeutische oder prophylaktische Immunantworten in sehr breiten Segmenten der weltweiten Bevölkerung. Zum Verständnis des Werts und der Wirksamkeit von Zusammensetzungen der Erfindung, die zelluläre Immunantworten induzieren, wird eine kurze Übersicht von Immunologie-bezogener Technologie geliefert.
Ein Komplex eines HLA-Moleküls und eines Peptidantigens wirkt wie der Ligand, der von HLA-restringierten T-Zellen erkannt wird (Buus, S. et al., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. und Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). Durch das Studium von Antigenanaloga mit einzelnen substituierten Aminosäuren und das Sequenzieren von endogen gebundenen, natürlich entwickelten Peptiden wurden entscheidende Reste identifiziert, die den Motiven, die zur spezifischen Bindung zu HLA-Antigenmolekülen erforderlich sind, entsprechen, und sind in Tabelle IV dargelegt (siehe auch z.B. Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, Zugang über World Wide Web bei URL syfpeithi.bmi-heidelber.com/; Sette, A. und Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. und Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. und Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo et al., J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157:3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. und Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov.; 50(3-4):201-12, Übersicht).
Weiterhin haben Röntgenkristallanalysen von HLA-Peptid-Komplexen Taschen innerhalb der Peptidbindungsspalte/-furche von HLA-Molekülen gezeigt, die auf Allel-spezifische Weise Reste aufnehmen, die von Peptidliganden getragen werden; diese Reste bestimmen wiederum die HLA-Bindungskapazität der Peptide, in denen sie vorliegen. (Siehe z.B. Madden, D. R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al.; Structure 2:245, 1994; Jones, E. Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. und Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991.)
Entsprechend ermöglicht die Definition von Klasse-I- und Klasse-II-Allelspezifischen HLA-Bindungsmotiven oder Klasse-I- oder Klasse-II-Supermotiven die Identifizierung von Regionen innerhalb eines Proteins, die mit der Bindung zu (einem) bestimmten HLA-Antigen(en) korrelieren.
Somit wurden durch einen Prozess der HLA-Motiv-Identifizierung Kandidaten für Epitop-basierte Impfstoffe identifiziert; derartige Kandidaten können weiter durch HLA-Peptid-Bindungsassays zur Bestimmung der Bindungsaffinität und/oder der Zeitdauer der Verbindung des Epitops und seines entsprechenden HLA-Moleküls bewertet werden. Zusätzliche bestätigende Arbeit kann zur Auswahl von Epitopen mit bevorzugten Merkmalen, hinsichtlich Bevölkerungserfassung und/oder Immunogenität, unter diesen Impfstoffkandidaten ausgeführt werden.
Es können verschiedene Strategien zur Bewertung von zellulärer Immunogenität genutzt werden, einschließlich:

1) Bewertung von primären T-Zellkulturen von normalen Individuen (siehe z.B. Wentworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. etal., Humanlmmunol. 59:1, 1998). Diese Methode schließt die Stimulation von peripheren Blutlymphozyten (PBL) von normalen Subjekten mit einem Testpeptid in Gegenwart von Antigen-präsentierenden Zellen in vitro über eine Dauer von mehreren Wochen ein. T-Zellen, die für das Peptid spezifisch sind, werden während dieser Zeit aktiviert und werden unter Verwendung von z.B. eines Lymphokin- oder ⁵¹Cr-Freisetzungsassays, der Peptid-sensibilisierte Zielzellen einschließt, nachgewiesen.
2) Immunisierung von HLA-transgenen Mäusen (siehe z.B. Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997). Es werden beispielsweise in derartigen Verfahren Peptide in inkomplettem Freund-Adjuvans subkutan an HLA-transgene Mäuse verabreicht. Mehrere Wochen nach der Immunisierung werden Splenozyten entfernt und in vitro in Gegenwart vom Testpeptid für ungefähr eine Woche kultiviert. Peptid-spezifische T-Zellen werden unter Verwendung von z.B. eines ⁵¹Cr-Freisetzungsassays, der Peptid-sensibilisierte Zielzellen und Zielzellen, die endogen erzeugtes Antigen exprimieren, einschließt, nachgewiesen.
3) Darstellung von T-Zell-Recall-Antworten von immunen Individuen, die entweder effektiv geimpft wurden und/oder chronisch kranke Patienten waren (siehe z.B. Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. Virol. 71:6011, 1997). Entsprechend werden Recall-Antworten durch Kultivierung von PBL von Subjekten, die dem Antigen aufgrund einer Erkrankung ausgesetzt wurden und somit eine Immunantwort „natürlich" erzeugt haben, oder von Patienten, die gegen das Antigen geimpft wurden, nachgewiesen. PBL von Subjekten werden in vitro für 1-2 Wochen in Gegenwart vom Testpeptid zuzüglich der Antigen-präsentierenden Zellen (APC) kultiviert, um die Aktivierung von „Memory"-T-Zellen im Vergleich zu „naiven" T-Zellen zu ermöglichen. Am Ende der Kultivierungsperiode wird die T-Zell-Aktivität unter Verwendung von Assays, einschließlich der ⁵¹Cr-Freisetzung, die Peptidsensibilisierte Ziele einschließt, T-Zell-Proliferation oder Lymphokin-Freisetzung, nachgewiesen.

VL) 158P1D7-Transgene Tiere
Nukleinsäuren, die ein 158P1D7-ähnliches Protein kodieren, können auch zur Erzeugung von entweder transgenen Tieren oder „Knock-out"-Tieren verwendet werden, die wiederum bei der Entwicklung und beim Screening von therapeutisch nützlichen Reagenzien nützlich sind. Gemäß bekannten Techniken kann cDNA, die 158P1D7 kodiert, zur Klonierung von genomischer DNA, die 158P1D7 kodiert, verwendet werden. Die klonierten genomischen Sequenzen können dann zur Erzeugung von transgenen Tieren, die Zellen enthalten, die DNA, die 158P1D7 kodiert, exprimieren, verwendet werden. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren, insbesondere Tieren wie zum Beispiel Mäusen oder Ratten, sind in der Technik üblich geworden und sind beispielsweise in den U.S.-Patenten Nr. 4 736 866, ausgestellt am 12. April 1988, und 4 870 009, ausgestellt am 26. September 1989, beschrieben. Normalerweise würde auf bestimmte Zellen zur 158P1D7-Transgen-Einführung mit gewebespezifischen Enhancern abgezielt werden.
Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens, das 158P1D7 kodiert, einschließen, können zur Untersuchung der Wirkung von erhöhter Expression von DNA, die 158P1D7 kodiert, verwendet werden. Derartige Tiere können als Versuchstiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor beispielsweise pathologischen Zuständen, die mit seiner Überexpression verbunden sind, gewähren. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit einem Reagenz behandelt und eine verringerte Häufigkeit eines pathologischen Zustands, im Vergleich zu unbehandelten Tieren, die das Transgen tragen, würde ein potentielles therapeutisches Eingreifen für den pathologischen Zustand anzeigen.
Alternativ können nicht-menschliche Homologa von 158P1D7 zur Konstruktion eines 158P1D7-„Knock-out"-Tiers verwendet werden, das ein defektes oder verändertes, 158P1D7-kodierendes Gen als Folge von homologer Rekombination zwischen dem endogenen, 158P1D7-kodierenden Gen und veränderter genomischer, 158P1D7-kodierender DNA, die in eine Embryozelle des Tiers eingeführt wurde, aufweist. Beispielsweise kann 158P1D7-kodierende cDNA zur Klonierung genomischer, 158P1D7-kodierender DNA gemäß bekannten Techniken verwendet werden. Ein Teil der genomischen, 158P1D7-kodierenden DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt sein, wie zum Beispiel ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert, der zur Kontrolle des Einbaus verwendet werden kann. Normalerweise sind mehrere Kilobasen von unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch den 3'-Enden) im Vektor eingeschlossen (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell, 51:503 (1987) für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie eingeführt (z.B. durch Elektroporation) und Zellen, in die die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert wurde, werden selektiert (siehe z.B. Li et al., Cell, 69:915 (1992)). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyte eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimäre zu bilden (siehe z.B. Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg. (IRL, Oxford, 1987), S. 113-152). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes scheinträchtiges weibliches Ammentier implantiert und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out"-Tier hervorzubringen. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen enthalten, können durch Standardtechniken identifiziert werden und zur Züchtung von Tieren, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten, verwendet werden. Knock-out-Tiere sind beispielsweise durch ihre Fähigkeit zum Schutz vor bestimmten pathologischen Zuständen oder durch ihre Entwicklung von pathologischen Zuständen aufgrund der Abwesenheit des 158P1D7-Polypeptids gekennzeichnet.
VII.) Verfahren zum Nachweis von 158P1D7
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis von 158P1D7-Polynukleotiden und -Polypeptiden und 158P1D7-ähnlichen Proteinen sowie Verfahren zur Identifizierung einer Zelle, die 158P1D7 exprimiert. Das Expressionsprofil von 158P1D7 macht es zu einem diagnostischen Marker für metastasierte Erkrankung. Entsprechend liefert der Status von 158P1D7-Genprodukten Informationen, die zur Vorhersage verschiedener Faktoren, einschließlich der Anfälligkeit für eine Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium, der Progressionsrate und/oder Aggregssivität des Tumors, nützlich sind. Wie hierin im Detail diskutiert, kann der Status von 158P1D7-Genprodukten in Patientenproben durch verschiedene, in der Technik gut bekannte Protokolle, einschließlich immunhistochemischer Analyse, verschiedener Northern-Blotting-Techniken, einschließlich in-situ-Hybridisierung, RT-PCR-Analyse (beispielsweise an Proben aus Laser Capture Microdissection), Western-Blot-Analyse und Tissue-Array-Analyse, analysiert werden.
Vorzugsweiser stellt die Erfindung Assays zum Nachweis von 158P1D7-Polynukleotiden in einer biologischen Probe, wie zum Beispiel Urin, Serum, Knochen, Prostataflüssigkeit, Geweben, Samenflüssigkeit, Zellpräparaten und desgleichen, bereit. Nachweisbare 158P1D7-Polynukleotide schließen beispielsweise ein 158P1D7-Gen oder Fragment davon, 158P1D7-mRNA, alternative Spleißvariant-158P1D7-mRNAs und rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein 158P1D7-Polynukleotid enthalten, ein. Etliche Verfahren zur Amplifikation und/oder zum Nachweis der Gegenwart von 158P1D7-Polynukleotiden sind in der Technik gut bekannt und können bei der praktischen Ausführung dieses Aspekts der Erfindung eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Nachweis einer 158P1D7-mRNA in einer biologischen Probe das Herstellen von cDNA aus der Probe durch reverse Transkription unter Verwendung von mindestens einem Primer; Amplifizieren der cDNA, die unter Verwendung von 158P1D7-Polynukleotiden als Sense- und Antisense-Primer zur Amplifikation von 158P1D7-cDNAs darin hergestellt wird; und Nachweisen der Gegenwart der amplifizierten 158P1D7-cDNA. Gegebenenfalls kann die Sequenz der amplifizierten 158P1D7-cDNA bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Nachweis eines 158P1D7-Gens in einer biologischen Probe zuerst das Isolieren genomischer DNA aus der Probe; Amplifizieren der isolierten genomischen DNA unter Verwendung von 158P1D7-Polynukleotiden als Sense- und Antisense-Primer; und Nachweisen der Gegenwart des amplifizierten 158P1D7-Gens. Eine jedwede Anzahl von geeigneten Kombinationen von Sense- und Antisense-Sonden kann aus der Nukleotidsequenz, die für das 158P1D7 (2) bereitgestellt ist, entwickelt werden und für diesen Zweck verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch Assays zum Nachweis der Gegenwart eines 158P1D7-Proteins in einem Gewebe oder einer anderen biologischen Probe, wie zum Beispiel Urin, Serum, Samenflüssigkeit, Knochen, Prostata, Zellpräparate und desgleichen, bereit. Verfahren zum Nachweis eines 158P1D7-ähnlichen Proteins sind auch gut bekannt und schließen beispielsweise Immunpräzipitation, immunhistochemische Analyse, Western-Blot-Analyse, molekulare Bindungsassays, ELISA, ELIFA und desgleichen ein. Beispielsweise umfasst ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines 158P1D7-ähnlichen Proteins in einer biologischen Probe zuerst das Inkontaktbringen der Probe mit einem 158P1D7-Antikörper, einem 158P1D7-reaktiven Fragment davon oder einem rekombinanten Protein, das eine Antigenbindende Region eines 158P1D7-Antikörpers enthält, und dann das Nachweisen der Bindung von 158P1D7-ähnlichem Protein in der Probe.
Verfahren zur Identifizierung einer Zelle, die 158P1D7 exprimiert, sind auch im Rahmen der Erfindung. In einer Ausführungsform umfasst ein Assay zur Identifizierung einer Zelle, die ein 158P1D7-Gen exprimiert, das Nachweisen der Gegenwart von 158P1D7-mRNA in der Zelle. Verfahren zum Nachweis von bestimmten mRNAs in Zellen sind gut bekannt und schließen beispielsweise Hybridisierungsassays unter Verwendung von komplementären DNA-Sonden (wie zum Beispiel in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von markierten 158P1D7-Ribosonden, Northern-Blot und ähnliche Techniken) und verschiedene Nukleinsäure-Amplifikationsassays (wie zum Beispiel RT-PCR unter Verwendung von komplementären Primern, die für 158P1D7 spezifisch sind, und andere Nachweisverfahren mit Amplifikation, wie zum Beispiel verzweigte DNA, SISBA, TMA und desgleichen) ein. Alternativ umfasst ein Assay zur Identifizierung einer Zelle, die ein 158P1D7-Gen exprimiert, das Nachweisen der Gegenwart von 158P1D7-ähnlichem Protein in der Zelle oder das durch die Zelle sekretiert wird. Verschiedene Verfahren zum Nachweis von Proteinen sind in der Technik gut bekannt und werden zum Nachweis von 158P1D7-ähnlichen Proteinen und Zellen, die 158P1D7-ähnliche Proteine exprimieren, eingesetzt.
158P1D7-Expressionsanalyse ist auch als ein Werkzeug zur Identifizierung und Bewertung von Agenzien, die die 158P1D7-Genexpression modulieren, nützlich. Beispielsweise ist die 158P1D7-Expression im Blasenkrebs bedeutend up-reguliert und wird in Krebsen der Gewebe, die in Tabelle I aufgelistet sind, exprimiert. Die Identifizierung eines Moleküls oder biologischen Agens, das die 158P1D7-Expression oder -Überexpression in Krebszellen inhibiert, ist von therapeutischem Wert. Beispielsweise kann ein derartiges Agens unter Verwendung von Screening, bei dem die 158P1D7-Expression durch RT-PCR, Nukleinsäurehybridisierung oder Antikörperbindung quantifiziert wird, identifiziert werden.
VIII.) Verfahren zur Kontrolle des Status von 158P1D7-ähnlichen Genen und ihren Produkten
Es ist bekannt, dass Onkogenese ein mehrstufiger Prozess ist, worin zelluläres Wachstum zunehmend dysreguliert wird und Zellen von einem normalen physiologischen Zustand zu präkanzerösen und dann kanzerösen Zuständen fortschreiten (siehe z.B. Alers et al., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) und Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). In diesem Zusammenhang ermöglicht die Untersuchung einer biologischen Probe zum Beweis von dysreguliertem Zellwachstum (wie zum Beispiel aberrierende 158P1D7-Expression in Krebsen) den frühen Nachweis einer derartigen aberrierenden Physiologie, bevor ein pathologischer Zustand, wie zum Beispiel Krebs, zu einem Stadium fortgeschritten ist, wo therapeutische Optionen begrenzter sind und/oder die Prognose schlechter ist. In derartigen Untersuchungen kann der Status von 158P1D7 in einer interessierenden biologischen Probe beispielsweise mit dem Status von 158P1D7 in einer entsprechenden normalen Probe (z.B. einer Probe von diesem Individuum oder alternativ einem anderen Individuum, das nicht durch eine Pathologie betroffen ist) verglichen werden. Eine Veränderung beim Status von 158P1D7 in der biologischen Probe (im Vergleich zur normalen Probe) liefert den Beweis für dysreguliertes zelluläres Wachstum. Zusätzlich zur Verwendung einer biologischen Probe, die nicht durch eine Pathologie betroffen ist, wie eine normale Probe, kann man auch einen vorgegebenen normativen Wert, wie zum Beispiel ein vorgegebenes normales Niveau von mRNA-Expression, verwenden (siehe z.B. Grever et al., J. Comp. Neurol. 9. Dez. 1996;376(2):306-14 und U.S.-Patent Nr. 5 837 501), um den 158P1D7-Status in einer Probe zu vergleichen.
Der Begriff „Status" wird in diesem Zusammenhang gemäß seiner in der Technik anerkannten Bedeutung verwendet und bezeichnet den Zustand oder die Beschaffenheit eines Gens und seiner Produkte. Normalerweise verwendet der Fachmann etliche Parameter, um den Zustand oder die Beschaffenheit eines Gens und seiner Produkte zu bewerten. Diese schließen Folgende ein, sind aber nicht auf diese beschränkt: die Lokalisierung von exprimierten Genprodukten (einschließlich der Lokalisierung von 158P1D7-exprimierenden Zellen) sowie die Höhe und biologische Aktivität von exprimierten Genprodukten (wie zum Beispiel 158P1D7-mRNA, -Polynukleotiden und -Polypeptiden). Normalerweise umfasst eine Veränderung des Status von 158P1D7 eine Änderung bei der Lokalisation von 158P1D7 und/oder 158P1D7-exprimierenden Zellen und/oder eine Erhöhung bei der 158P1D7-mRNA- und/oder -Proteinexpression.
Der 158P1D7-Status in einer Probe kann auf etlichen, in der Technik gut bekannten Wegen analysiert werden, einschließlich, ohne Beschränkung, immunhistochemischer Analyse, in-situ-Hybridisierung, RT-PCR-Analyse an Proben aus Laser Capture Microdissection, Western-Blot-Analyse und Tissue-Array-Analyse. Typische Protokolle zur Bewertung des Status des 158P1D7-Gens und der -Genprodukte werden beispielsweise in Ausubel et al. Hrsg., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Abschnitte 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) und 18 (PCR Analysis), gefunden. Somit wird der Status von 158P1D7 in einer biologischen Probe durch verschiedene Verfahren, die vom Fachmann genutzt werden, bewertet, einschließlich Folgender, doch nicht auf diese beschränkt: genomische Southern-Analyse (um beispielsweise Störungen in dem 158P1D7-Gen zu untersuchen), Northern-Analyse und/oder PCR-Analyse von 158P1D7-mRNA (um beispielsweise Veränderungen in den Polynukleotidsequenzen oder bei den Expressionsniveaus von 158P1D7-mRNAs zu untersuchen) und Western- und/oder immunhistochemische Analyse (um beispielsweise Veränderungen in Polypeptidsequenzen, Veränderungen bei der Polypeptidlokalisation innerhalb einer Probe, Veränderungen bei den Expressionsniveaus von 158P1D7-Proteinen und/oder Verbindungen von 158P1D7-Proteinen mit Polypeptid-bindenden Partnern zu untersuchen). Nachweisbare 158P1D7-Polynukleotide schließen beispielsweise ein 158P1D7-Gen oder Fragment davon, 158P1D7-mRNA, alternative Spleißvarianten, 158P1D7-mRNAs und rekombinante DNA- oder RNA-Moleküle, die ein 158P1D7-Polynukleotid enthalten, ein.
Das Expressionsprofil von 158P1D7 macht es zu einem diagnostischen Marker für lokale und/oder metastasierte Erkrankung und liefert Informationen zum Wachstum oder onkogenen Potenzial einer biologischen Probe. Insbesondere liefert der Status von 158P1D7 Informationen, die für die Vorhersage zur Anfälligkeit für bestimmte Erkrankungsstadien, Progression und/oder Aggressivität des Tumors nützlich sind. Die Erfindung stellt Verfahren und Assays zur Bestimmung des 158P1D7-Status und zur Diagnose von Krebsen, die 158P1D7 exprimieren, wie zum Beispiel Krebsen der Gewebe, die in Tabelle I aufgelistet sind, bereit. Da 158P1D7-mRNA in Blasen- und anderen Krebsen, relativ zu normalem Blasengewebe, so stark exprimiert wird, können beispielsweise Assays, die die Höhen von 158P1D7-mRNA-Transkripten oder -Proteinen in einer biologischen Probe bewerten, zur Diagnose einer Erkrankung, die mit 158P1D7-Dysregulation verbunden ist, verwendet werden und können prognostische Informationen liefern, die für die Bestimmung geeigneter therapeutischer Optionen nützlich sind.
Der Expressionsstatus von 158P1D7 liefert Informationen, die die Gegenwart, das Stadium und die Lokalisierung von dysplastischen, präkanzerösen und kanzerösen Zellen einschließen, die zur Vorhersage der Anfälligkeit für verschiedene Erkrankungsstadien und/oder zur Einschätzung der Aggressivität des Tumors führen. Außerdem macht das Expressionsprofil es als ein bildgebendes Reagenz für metastasierte Erkrankung verwendbar. Folglich richtet sich ein Aspekt der Erfindung auf verschiedene molekulare prognostische und diagnostische Verfahren zur Untersuchung des Status von 158P1D7 in biologischen Proben, wie zum Beispiel solchen von Individuen, die an, oder wo vermutet wird, dass sie an einer Pathologie leiden, die durch dysreguliertes Zellwachstum, wie zum Beispiel Krebs, gekennzeichnet ist.
Wie vorstehend beschrieben, kann der Status von 158P1D7 in einer biologischen Probe durch etliche gut bekannte Methoden in der Technik untersucht werden. Beispielsweise kann der Status von 158P1D7 in einer biologischen Probe, die von einem spezifischen Ort im Körper entnommen wurde, durch Beurteilung der Probe zur Gegenwart oder Abwesenheit von 158P1D7-exprimierenden Zellen (z.B. solchen, die 158P1D7-mRNAs oder -Proteine exprimieren) untersucht werden. Diese Untersuchung kann beispielsweise Beweise für dysreguliertes Zellwachstum liefern, wenn 158P1D7-exprimierende Zellen in einer biologischen Probe gefunden werden, die normalerweise nicht solche Zellen enthält (zum Beispiel ein Lymphknoten), da derartige Veränderungen im Status von 158P1D7 in einer biologischen Probe häufig mit dysreguliertem zellulärem Wachstum verbunden sind. Speziell sind Metastasen von Krebszellen von einem ursprünglichen Organ (wie zum Beispiel der Blase) in einem anderen Bereich des Körpers (wie zum Beispiel eines Lymphknotens) ein Indikator von dysreguliertem zellulärem Wachstum. Beispielsweise ist der Beweis für dysreguliertes zelluläres Wachstum wichtig, da verborgene Lymphknotenmetastasen bei einem wesentlichen Anteil von Patienten mit Prostatakrebs nachgewiesen werden können und derartige Metastasen mit bekannten Prädiktoren von Erkrankungsprogression in Verbindung gebracht werden (siehe z.B. Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) und Freeman et al., J. Urol. 1995 Aug. 154(2 Pt 1):474-8).
In einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Kontrolle von 158P1D7-Genprodukten durch Bestimmung des Status von 158P1D7-Genprodukten, die von Zellen aus einem Individuum exprimiert werden, von dem vermutet wird, das es eine Erkrankung hat, die mit dysreguliertem Zellwachstum verbunden ist (wie zum Beispiel Hyperplasie oder Krebs), und dann Vergleich des so bestimmten Status mit dem Status von 158P1D7-Genprodukten in einer entsprechenden normalen Probe bereit. Die Gegenwart von aberrierenden 158P1D7-Genprodukten in der Testprobe, relativ zur normalen Probe, liefert einen Hinweis auf die Gegenwart von dysreguliertem Zellwachstum innerhalb der Zellen des Individuums.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Assays bereit, die bei der Bestimmung der Gegenwart von Krebs in einem Individuum nützlich sind, die den Nachweis eines bedeutenden Anstiegs der 158P1D7-mRNA- oder -Proteinexpression in einer Testzelle oder einem Testgewebe, relativ zu den Expressionsniveaus in der entsprechenden normalen Zelle oder dem entsprechenden normalen Gewebe, umfassen. Die Gegenwart von 158P1D7-mRNA kann beispielsweise in Gewebeproben bewertet werden, einschließlich der, doch nicht beschränkt auf die in Tabelle I Aufgelisteten. Die Gegenwart von erheblicher 158P1D7-Expression in einem dieser Gewebe ist zur Anzeige des Auftretens, der Gegenwart und/oder Schwere eines Krebses nützlich, da die entsprechenden normalen Gewebe 158P1D7-mRNA nicht exprimieren oder es auf niedrigen Niveaus exprimieren.
In einer ähnlichen Ausführungsform wird der 158P1D7-Status vielmehr auf der Ebene des Proteins als auf der Ebene der Nukleinsäuren bestimmt. Beispielsweise umfasst ein derartiges Verfahren die Bestimmung der Höhe von 158P1D7-Protein, das von Zellen in einer zu untersuchenden Gewebeprobe exprimiert wird, und den Vergleich der so bestimmten Höhe mit der Höhe von 158P1D7, das in einer entsprechenden normalen Probe exprimiert wird. In einer Ausführungsform wird die Gegenwart von 158P1D7-Protein beispielsweise unter Verwendung von immunhistochemischen Verfahren beurteilt. 158P1D7-Antikörper oder Bindungspartner, die zum Nachweis von 158P1D7-Proteinexpression fähig sind, werden in verschiedenen Assayformaten, die in der Technik für diesen Zweck gut bekannt sind, verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Status von 158P1D7-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe bewertet werden, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle zu identifizieren. Diese Störungen können Insertionen, Deletionen, Substitutionen und desgleichen einschließen. Derartige Bewertungen sind nützlich, da Störungen in den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in einer großen Zahl von Proteinen beobachtet werden, die mit einem dysregulierten Wachstumsphänotyp in Verbindung gebracht werden (siehe z.B. Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Beispielsweise kann eine Mutation in der Sequenz von 158P1D7 für die Gegenwart oder Promotion eines Tumors Indikativ sein. Derartige Assays haben daher diagnostischen und prädikativen Wert, wo eine Mutation in 158P1D7 einen potenziellen Verlust von Funktion oder einen Anstieg im Tumorwachstum anzeigt.
Eine große Vielfalt von Assays zur Beobachtung von Störungen in Nukleotid- und Aminosäuresequenzen ist in der Technik gut bekannt. Beispielsweise werden die Größe und Struktur von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen von 158P1D7-Genprodukten durch die hierin diskutierten Northern-, Southern-, Western-,PCR- und DNA-Sequenzierungsprotokolle beobachtet. Außerdem sind andere Verfahren zur Beobachtung von Störungen in Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, wie zum Beispiel Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse, in der Technik gut bekannt (siehe z.B. U.S.-Patente Nr. 5 382 510, ausgestellt am 7. September 1999, und 5 952 170, ausgestellt am 17. Januar 1995).
Zusätzlich kann man den Methylierungsstatus des 158P1D7-Gens in einer biologischen Probe untersuchen. Aberrierende Demethylierung und/oder Hypermethylierung von CpG-Inseln in Gen-5'-regulatorischen Regionen tritt häufig in immortalisierten und transformierten Zellen auf und kann zur veränderten Expression von verschiedenen Genen führen. Beispielsweise wurde Promotor-Hypermethylierung der DBCCR1-, PAX6- und APC-Gene in Blasenkrebsen nachgewiesen, die zu aberrierender Expression der Gene führt (Esteller et al., Cancer Res. 2001; 61:3225-3229). Eine Vielfalt von Assays zur Untersuchung des Methylierungsstatus eines Gens ist in der Technik gut bekannt. Beispielsweise kann man in Southern-Hybridisierungs-Ansätzen methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme nutzen, die nicht die Sequenzen spalten können, die methylierte CpG-Stellen enthalten, um den Methylierungsstatus von CpG-Inseln einzuschätzen. Außerdem kann MSP (methylierungsspezifische PCR) rasch ein Profil des Methylierungsstatus von all den in einer CpG-Insel eines gegebenen Gens vorliegenden CpG-Stellen liefern. Diese Methode schließt anfängliche Modifikation von DNA durch Natriumbisulfit (das alle unnmethylierten Cytosine zu Uracil umwandeln wird) ein, worauf die Amplifikation unter Verwendung von Primern folgt, die für methylierte, im Vergleich zu unmethylierter, DNA spezifisch sind. Es können Protokolle, die die Beeinflussung der Methylierung einschließen, auch beispielsweise in Current Protocols In Molecular Biology, Abschnitt 12, Frederick M. Ausubel et al., Hrsg., 1995, gefunden werden.
Genamplifikation ist ein zusätzliches Verfahren zur Bewertung des Status von 158P1D7. Genamplifikation wird direkt in einer Probe gemessen, beispielsweise durch übliches Southern-Blotting oder Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer entsprechend markierten Sonde, die auf den hierin bereitgestellten Sequenzen basiert. Alternativ werden Antikörper eingesetzt, die spezifische Duplexe erkennen, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper werden wiederum markiert und der Assay wird da ausgeführt, wo der Duplex zu einer Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von zu dem Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
Biopsiertes Gewebe oder peripheres Blut kann in geeigneter Weise auf die Gegenwart von Krebszellen unter Verwendung von beispielsweise Northern-, Dot-Blot- oder RT-PCR-Analyse zum Nachweis von 158P1D7-Expression getestet werden. Die Gegenwart von RT-PCR-amplifizierbarer 158P1D7-mRNA liefert einen Hinweis auf die Gegenwart von Krebs. RT-PCR-Assays sind in der Technik gut bekannt. RT-PCR-Nachweisassays für Tumorzellen in peripherem Blut werden derzeit zur Verwendung bei der Diagnose und beim Management von etlichen menschlichen soliden Tumoren beurteilt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Bewertung der Anfälligkeit eines Individuums zur Entwicklung von Krebs. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Vorhersage der Anfälligkeit für Krebs den Nachweis von 158P1D7-mRNA oder 158P1D7-Protein in einer Gewebeprobe, wobei die Gegenwart Anfälligkeit für Krebs anzeigt, worin der Grad von 158P1D7-mRNA-Expression mit dem Grad der Anfälligkeit korreliert. In einer speziellen Ausführungsform wird die Gegenwart von 158P1D7 in Blasen- oder anderem Gewebe untersucht, wobei die Gegenwart von 158P1D7 in der Probe einen Hinweis auf die Anfälligkeit für Blasenkrebs (oder das Auftreten oder Vorliegen eines Blasentumors) liefert. Ähnlich kann man die Intaktheit von 158P1D7-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe beurteilen, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle zu identifizieren, wie zum Beispiel Insertionen, Deletionen, Substitutionen und desgleichen. Die Gegenwart von einer oder mehreren Störungen in 158P1D7- Genprodukten in der Probe ist ein Hinweis auf die Anfälligkeit für Krebs (oder das Auftreten oder Vorliegen eines Tumors).
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Beurteilung der Aggressivität eines Tumors. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Beurteilung der Aggressivität eines Tumors die Bestimmung der Höhe von 158P1D7-mRNA oder 158P1D7-Protein, die von Tumorzellen exprimiert werden, den Vergleich der so bestimmten Höhe mit der Höhe von 158P1D7-mRNA oder 158P1D7-Protein, die in einem entsprechenden normalen Gewebe, das von demselben Individuum entnommen wurde, oder einer normalen Gewebevergleichsprobe exprimiert werden, worin der Grad von 158P1D7-mRNA- oder 158P1D7-Proteinexpression in der Tumorprobe, relativ zur normalen Probe, den Grad der Aggressivität anzeigt. In einer speziellen Ausführungsform wird die Agressivität eines Tumors durch Bestimmung des Ausmaßes, zu dem 158P1D7 in den Tumorzellen exprimiert wird, beurteilt, wobei höhere Expressionsniveaus auf aggressivere Tumoren hinweisen. Eine weitere Ausführungsform ist die Beurteilung der Intaktheit von 158P1D7-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle zu identifizieren, wie zum Beispiel Insertionen, Deletionen, Substitutionen und desgleichen. Die Gegenwart von einer oder mehreren Störungen weist auf aggressivere Tumoren hin.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf Verfahren zur Beobachtung der Progression eines Malignoms in einem Individuum im Zeitverlauf. In einer Ausführungsform umfassen Verfahren zur Beobachtung der Progression eines Malignoms in einem Individuum im Zeitverlauf die Bestimmung der Höhe von 158P1D7-mRNA oder 158P1D7-Protein, die von Zellen in einer Probe des Tumors exprimiert werden, den Vergleich der so bestimmten Höhe mit der Höhe von 158P1D7-mRNA oder 158P1D7-Protein, die in einer äquivalenten Gewebeprobe, die von demselben Individuum zu einer anderen Zeit entnommen wurde, exprimiert werden, worin der Grad von 158P1D7-mRNA- oder 158P1D7-Proteinexpression in der Tumorprobe im Zeitverlauf Informationen zur Progression des Krebses liefert. In einer speziellen Ausführungsform wird die Progression eines Krebses durch Bestimmung der 158P1D7-Expression in den Tumorzellen im Zeitverlauf beurteilt, wobei erhöhte Expression im Zeitverlauf eine Progression des Krebses anzeigt. Man kann auch die Intaktheit von 158P1D7-Nukleotid- und -Aminosäuresequenzen in einer biologischen Probe beurteilen, um Störungen in der Struktur dieser Moleküle zu identifizieren, wie zum Beispiel Insertionen, Deletionen, Substitutionen und desgleichen, wobei die Gegenwart von einer oder mehreren Störungen auf eine Progression des Krebses hinweist.
Die vorstehenden diagnostischen Ansätze können mit einer der großen Vielfalt von in der Technik bekannten prognostischen und diagnostischen Protokollen kombiniert werden. Beispielsweise richtet sich eine weitere Ausführungsform der Erfindung auf Verfahren zur Beobachtung eines Zusammenfallens der Expression vom 158P1D7-Gen und von 158P1D7-Genprodukten (oder Störungen im 158P1D7-Gen und in 158P1D7-Genprodukten) mit einem Faktor, der mit Malignität verbunden ist, als ein Mittel zur Diagnose und Prognose des Status einer Gewebeprobe. Es kann eine große Vielfalt von Faktoren, die mit Malignität verbunden sind, genutzt werden, wie zum Beispiel die Expression von Genen, die mit Malignität verbunden sind (z.B. PSCA-, H-ras- und p53-Expression usw.), sowie grobe zytologische Beobachtungen (siehe z.B. Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Verfahren zur Beobachtung eines Zusammenfallens der Expression vom 158P1D7-Gen und von 158P1D7-Genprodukten (oder Störungen im 158P1D7-Gen und in 158P1D7-Genprodukten) mit einem weiteren Faktor, der mit Malignität verbunden ist, sind beispielsweise nützlich, da die Gegenwart einer Reihe spezifischer Faktoren, die mit der Erkrankung zusammenfallen, Informationen liefert, die für die Diagnose und Prognose des Status einer Gewebeprobe entscheidend sind.
In einer Ausführungsform bringen Verfahren zur Beobachtung eines Zusammenfallens der Expression vom 158P1D7-Gen und von 158P1D7-Genprodukten (oder Störungen im 158P1D7-Gen und in 158P1D7-Genprodukten) mit einem weiteren Faktor, der mit Malignität verbunden ist, den Nachweis der Überexpression von 158P1D7-mRNA oder -Protein in einer Gewebeprobe, den Nachweis der Überexpression von BLCA-4A-mRNA oder -Protein in einer Gewebeprobe (oder PSCA-Expression) und die Beobachtung eines Zusammenfallens von 158P1D7-mRNA- oder -Protein- und BLCA-4A-mRNA- oder -Proteinüberexpression (oder PSCA-Expression) mit sich (Amara et al., 2001, Cancer Res. 61:4660-4665; Konety et al., Clin. Cancer Res., 2000, 6(7):2618-2625). In einer speziellen Ausführungsform wird die Expression von 158P1D7- und BLCA-4-mRNA in Blasengewebe untersucht, wo das Zusammenfallen von 158P1D7- und BLCA-4- mRNA-Überexpression in der Probe das Vorliegen von Blasenkrebs, die Anfälligkeit für Blasenkrebs oder das Auftreten oder den Status eines Blasentumors anzeigt.
Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung der Expression von 158P1D7-mRNA oder -Protein sind hierin beschrieben und Standardtechnolgien zum Nachweis und zur Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen sind in der Technik gut bekannt. Standardverfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von 158P1D7-mRNA schließen in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von markierten 158P1D7-Ribosonden, Northern-Blot und ähnliche Techniken unter Verwendung von 158P1D7-Polynukleotidsonden, RT-PCR-Analyse unter Verwendung von 158P1D7-spezifischen Primern und andere Amplifikationstyp-Nachweisverfahren, wie zum Beispiel verzweigte DNA, SISBA, TMA und desgleichen, ein. In einer speziellen Ausführungsform wird halbquantitative RT-PCR zum Nachweis und zur Quantifizierung von 158P1D7-mRNA-Expression verwendet. Es kann jedwede Anzahl von Primern, die zur Amplifikation von 158P1D7 fähig sind, für diesen Zweck verwendet werden, einschließlich, doch nicht auf verschiedene, speziell hierin beschriebene Primer-Sets beschränkt. In einer speziellen Ausführungsform können polyklonale oder monoklonale Antikörper, die mit dem Wildtyp-158P1D7-Protein spezifisch reaktiv sind, in einem immunhistochemischen Assay von biopsiertem Gewebe verwendet werden.
IX.) Identifizierung von Molekülen, die mit 158P1D7 wechselwirken
Die hierin offenbarten 158P1D7-Protein- und Nukleinsäuresequenzen ermöglichen einem Fachmann die Identifizierung von Proteinen, kleinen Molekülen und anderen Agenzien, die mit 158P1D7 wechselwirken, sowie Wegen, die durch 158P1D7 aktiviert werden, über eins einer Vielzahl von in der Technik üblichen Protokollen. Beispielsweise kann man eins der sogenannten Interaction-Trap (Interaktionsfalle)-Systeme (auch als der „Zwei-Hybrid-Assay" bezeichnet) nutzen. In derartigen Systemen wechselwirken Moleküle und bilden wieder einen Transkriptionsfaktor, der die Expression eines Reportergens richtet, worauf die Expression des Reportergens gemessen wird. Andere Systeme identifizieren Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo über die Wiedereinsetzung eines eukaryotischen transkriptionalen Aktivators, siehe z.B. U.S.-Patente Nr. 5 955 280, ausgestellt am 21. September 1999, 5 925 523, ausgestellt am 20. Juli 1999, 5 846 722, ausgestellt am 8. Dezember 1998, und 6 004 746, ausgestellt am 21. Dezember 1999. Es sind in der Technik auch Algorithmen für Genom-basierte Vorhersagen zur Proteinfunktion verfügbar (siehe z.B. Marcotte et al., Nature 402: 4 November 1999, 83-86).
Alternativ kann man zur Identifizierung von Molekülen, die mit 158P1D7-Proteinsequenzen wechselwirken, Peptidbibliotheken screenen. In derartigen Verfahren werden Peptide, die zu 158P1D7 binden, durch Screening von Bibliotheken, die eine zufällige oder kontrollierte Sammlung von Aminosäuren kodieren, identifiziert. Die von Bibliotheken kodierten Peptide werden als Fusionsproteine von Bakteriophagen-Hüllproteinen exprimiert, die Bakteriophagenpartikel werden dann gegen das 158P1D7-Protein gescreent.
Entsprechend werden somit Peptide, die eine große Vielfalt von Verwendungen haben, wie zum Beispiel als therapeutische, prognostische oder diagnostische Reagenzien, ohne vorausgehende Information zur Struktur des erwarteten Liganden oder Rezeptormoleküls identifiziert. Typische Peptidbibliotheken und Screening-Verfahren, die zur Identifizierung von Molekülen, die mit 158P1D7-Proteinsequenzen wechselwirken, verwendet werden können, sind beispielsweise in den U.S.-Patenten Nr. 5 723 286, ausgestellt am 3. März 1998, und 5 733 731, ausgestellt am 31. März 1998, offenbart.
Alternativ werden Zelllinien, die 158P1D7 exprimieren, zur Identifizierung von 158P1D7-vermittelten Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet. Derartige Wechselwirkungen können unter Verwendung von Immunpräzipitationstechniken untersucht werden (siehe z.B. Hamilton B. J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). 158P1D7-Protein kann aus 158P1D7-exprimierenden Zelllinien unter Verwendung von Anti-158P1D7-Antikörpern immunpräzipitiert werden. Alternativ können Antikörper gegen His-Tag in einer Zelllinie, die zur Expression von Fusionen von 158P1D7 und einem His-Tag konstruiert wurde (Vektoren wurden vorstehend erwähnt), verwendet werden. Der immunpräzipitierte Komplex kann auf Proteinverbindung durch Methoden, wie zum Beispiel Wetsern-Blotting, ³⁵S-Methionin-Markierung von Proteinen, Protein-Mikrosequenzierung, Silberfärbung und zweidimensionale Gelelektrophorese, untersucht werden.
Kleine Moleküle und Liganden, die mit 158P1D7 wechselwirken, können durch ähnliche Ausführungsformen von derartigen Screening-Assays identifiziert werden. Beispielsweise können kleine Moleküle identifiziert werden, die die Proteinfunktion beeinträchtigen, einschließlich der Moleküle, die die Fähigkeit von 158P1D7 beeinträchtigen, Phosphorylierung und Dephosphorylierung, Wechselwirkung mit DNA- oder RNA-Molekülen als ein Anzeichen für die Regulierung von Zellzyklen, Signalwirkung des sekundären Botenstoffs oder Tumorgenese zu vermitteln. Ähnlich werden kleine Moleküle, die 158P1D7-bezogene(n) Ionenkanal, Proteinpumpe oder Zellkommunikationsfunktionen von 158P1D7 modulieren, identifiziert und zur Behandlung von Patienten verwendet, die einen Krebs haben, der 158P1D7 exprimiert (siehe z.B. Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Ausg., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992). Darüber hinaus können Liganden, die 158P1D7-Funktion regulieren, auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Bindung von 158P1D7 und Aktivierung eines Reporterkonstrukts identifiziert werden. Typische Verfahren sind beispielsweise im U.S.-Patent Nr. 5 928 868, ausgestellt am 27. Juli 1999, diskutiert und schließen Verfahren zur Bildung von Hybridliganden, in denen mindestens ein Ligand ein kleines Molekül ist, ein. In einer erläuternden Ausführungsform werden Zellen, die zur Expression eines Fusionsproteins von 158P1D7 und einem DNA-bindenden Protein konstruiert wurden, zur Coexpression eines Fusionsproteins eines Hybridliganden/kleinen Moleküls und eines transkriptionalen cDNA-Bibliothek-Aktivatorproteins verwendet. Die Zellen enthalten weiter ein Reportergen, dessen Expression durch die Nähe der ersten und zweiten Fusionsproteine zueinander bedingt ist, ein Vorgang der nur dann auftritt, wenn der Hybridligand zu den Zielstellen an beiden Hybridproteinen bindet. Solche Zellen, die das Reportergen exprimieren, werden selektiert und das unbekannte kleine Molekül oder der unbekannte Ligand werden identifiziert. Dieses Verfahren stellt ein Mittel zur Identifizierung von Modulatoren bereit, die 158P1D7 aktivieren oder inhibieren.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung umfasst ein Verfahren zum Screening für ein Molekül, das mit einer in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Aminosäuresequenz wechselwirkt, das die folgenden Schritte umfasst: Inkontaktbringen einer Gesamtheit von Molekülen mit der 158P1D7-Aminosäuresequenz; der Gesamtheit von Molekülen und der 158P1D7-Aminosäuresequenz ermöglichen, unter Bedingungen zur Erleichterung einer Wechselwirkung zu wechselwirken; Bestimmen der Gegenwart eines Moleküls, das mit der 158P1D7-Aminosäuresequenz wechselwirkt; und dann Abtrennen von Molekülen, die nicht mit der 158P1D7-Aminosäuresequenz wechselwirken, von wechselwirkenden Molekülen. In einer speziellen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter das Aufreinigen, Charakterisieren und Identifizieren eines Moleküls, das mit der 158P1D7-Aminosäuresequenz wechselwirkt. Das identifizierte Molekül kann zur Modulation einer von 158P1D7 ausgeführten Funktion verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die 158P1D7-Aminosäuresequenz mit einer Bibliothek von Peptiden in Kontakt gebracht.
X.) Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen
Die Identifizierung von 158P1D7 als ein Protein, das normalerweise in einer begrenzten Gruppe von Geweben exprimiert wird, doch das auch in Blasen- und anderen Krebsen exprimiert wird, eröffnet etliche therapeutische Ansätze zur Behandlung von derartigen Krebsen. Wie hierin erwogen, wirkt 158P1D7 als ein Transkriptionsfaktor, der an der Aktivierung von tumorauslösenden Genen oder -unterdrückenden Genen, die die Tumorgenese blockieren, beteiligt ist.
Entsprechend sind therapeutische Ansätze, die die Aktivität des 158P1D7-Proteins inhibieren, für Patienten, die an einem Krebs, der 158P1D7 exprimiert, leiden, wertvoll. Diese therapeutischen Ansätze fallen allgemein in zwei Klassen. Eine Klasse umfasst verschiedene Verfahren zur Inhibierung der Bindung oder Verbindung des 158P1D7-Proteins mit seinem Bindungspartner oder mit anderen Proteinen. Eine weitere Klasse umfasst eine Vielfalt von Verfahren zur Inhibierung der Transkription des 158P1D7-Gens oder Translation von 158P1D7-mRNA.
X.A.) Anti-Krebsimpfstoffe
Die Erfindung stellt Krebsimpfstoffe bereit, die ein 158P1D7-ähnliches Protein oder eine 158P1D7-ähnliche Nukleinsäure umfassen. Im Hinblick auf die Expression von 158P1D7 verhindern und/oder behandeln Krebsimpfstoffe 158P1D7-exprimierende Krebse mit minimalen oder keinen Wirkungen für die Nicht-Zielgewebe. Die Verwendung eines Tumorantigens in einem Impfstoff, der humorale und/oder zellvermittelte Immunantworten erzeugt, als Anti-Krebs-Therapie ist in der Technik gut bekannt (siehe z.B. Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117).
Derartige Verfahren können durch Einsatz eines 158P1D7-ähnlichen Proteins oder eines 158P1D7-kodierenden Nukleinsäuremoleküls und rekombinanter Vektoren, die zur Expression und Präsentation des 158P1D7-Immunogens (das normalerweise etliche Antikörper oder T-Zell-Epitope umfasst) fähig sind, leicht ausgeführt werden. Der Fachmann versteht, dass eine große Vielfalt von Impfstoffsystemen zur Zuführung von immunreaktiven Epitopen in der Technik bekannt sind (siehe z.B. Heryln et al., Ann. Med. 1999, Feb. 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol. Immunother. 2000, Jun. 49(3):123-32). Kurz gesagt, umfassen derartige Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort (z.B. humoral und/oder zellvermittelt) in einem Säuger die Schritte: Aussetzen des Immunsystems des Säugers einem immunreaktiven Epitop (z.B. einem Epitop, das in dem 158P1D7-Protein, in SEQ-ID.-NR.: 657 dargestellt, oder einem Analogon oder Homologon davon vorliegt), sodass der Säuger eine Immunantwort erzeugt, die für das Epitop spezifisch ist (z.B. Antikörper erzeugt, die dieses Epitop spezifisch erkennen). In einem bevorzugten Verfahren enthält das 158P1D7-Immunogen ein biologisches Motiv, siehe z.B. Tabellen V-XVIII, oder ein Peptid eines Größenbereichs aus 158P1D7, in 9, 10, 11, 12 und 13 angezeigt.
Das gesamte 158P1D7-Protein, immunogene Regionen oder Epitope davon können durch verschiedene Mittel kombiniert und zugeführt werden. Derartige Impfstoffzusammensetzungen können beispielsweise Folgende einschließen: Lipopeptide (z.B. Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), Peptidzusammensetzungen, die in Poly(DL-Lactid-Co-Glycolid) ("PLG")-Mikrosphären eingekapselt sind (siehe z.B., Eldridge et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991; Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995), Peptidzusammensetzungen, die in immunstimulierenden Komplexen (ISCOMS) enthalten sind (siehe z.B. Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin. Exp. Immunol. 113:235-243, 1998), Multiple-Antigen-Peptid-Systeme (MAPs) (siehe z.B., Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J. P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996), Peptide, die als multivalente Peptide formuliert sind; Peptide zur Verwendung in ballistischen Zuführungssystemen, typisch kristallisierte Peptide, virale Zuführungsvektoren (Perkus, M. E. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., Hrsg., S. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L, et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175:535, 1990), Partikel viralen oder synthetischen Ursprungs (z.B. Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995), Adjuvanzien (Warren, H. S., Vogel, F. R. und Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993), Liposomen (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996) oder nackte oder Partikel-absorbierte cDNA (Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A. und Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., Hrsg., S. 423, 1996; Cease, K. B. und Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 und Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993). Toxin-gezielte Zuführungstechnologien, auch als rezeptorvermitteltes Targeting bekannt, wie zum Beispiel solche von Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts), können auch verwendet werden.
In Patienten mit 158P1D7-assoziiertem Krebs können die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung auch in Verbindung mit anderen, für Krebs eingesetzten Behandlungen, z.B. Operation, Chemotherapie, Arzneimitteltherapien, Bestrahlungstherapien, usw., verwendet werden, einschließlich der Verwendung zusammen mit Immunadjuvanzien, wie zum Beispiel IL-2, IL-12, GM-CSF und desgleichen.
Zelluläre Impfstoffe:
CTL-Epitope können unter Verwendung von spezifischen Algorithmen zur Identifizierung von Peptiden innerhalb des 158P1D7-Proteins, die entsprechende HLA-Allele binden, bestimmt werden (siehe z.B. Tabelle IV; Epimer^TM und Epimatrix^TM, Brown University (URL www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); und BIMAS (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI bei URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)). In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das 158P1D7-Immunogen eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, die unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Techniken identifiziert wurden, wie zum Beispiel die in den Tabellen V-XVIII dargestellten Sequenzen oder ein Peptid von 8, 9, 10 oder 11 Aminosäuren, die durch ein HLA-Klasse-I-Motiv/Supermotiv beschrieben werden (z.B. Tabelle IV (A), Tabelle IV (D) oder Tabelle IV (E)) und/oder ein Peptid von mindestens 9 Aminosäuren, das ein HLA-Klasse-II-Motiv/Supermotiv umfasst (z.B. Tabelle IV (B) oder Tabelle IV (C)). Wie in der Technik eingesehen wird, ist die HLA-Klasse-I-Bindungsfurche im Wesentlichen geschlossen, sodass nur Peptide eines bestimmten Größenbereichs in die Furche passen und gebunden werden können, allgemein sind HLA-Klasse-I-Epitope 8, 9, 10 oder 11 Aminosäuren lang. Im Gegensatz dazu ist die HLA-Klasse-II-Bindungsfurche im Wesentlichen offen; daher kann ein Peptid von etwa 9 oder mehr Aminosäuren durch ein HLA-Klasse-II-Molekül gebunden werden.
Aufgrund der Unterschiede bei der Bindungsfurche zwischen HLA Klasse I und II sind HLA-Klasse-I-Motive längenspezifisch, d.h. Position zwei eines Klasse-I-Motivs ist die zweite Aminosäure in einer Amino-Carboxyl-Richtung des Peptids. Die Aminosäurepositionen in einem Klasse-II-Motiv sind nur zueinander relativ, nicht zum gesamten Peptid, d.h. es können zusätzliche Aminosäuren an die Amino- und/oder Carboxyl-Termini einer Motiv-tragenden Sequenz angebracht werden. HLA-Klasse-II-Epitope sind häufig 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Aminosäuren lang oder länger als 25 Aminosäuren.
Antikörper-basierte Impfstoffe
In der Technik ist eine große Vielfalt von Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Säuger bekannt (beispielsweise als der erste Schritt bei der Erzeugung von Hybridomen). Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Säuger umfassen das Aussetzen des Immunsystems des Säugers einem immunogenen Epitop auf einem Protein (z.B. dem 158P1D7-Protein), sodass eine Immunantwort erzeugt wird. Eine typische Ausführungsform besteht aus einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort auf 158P1D7 in einem Wirt durch Inkontaktbringen des Wirts mit einer ausreichenden Menge von mindestens einem 158P1D7-B-Zellen- oder cytotoxischen T-Zellenepitop oder Analogon davon; und mindestens einem periodischen Zeitabstand, wonach der Wirt mit dem 158P1D7-B-Zellen- oder cytotoxischen T-Zellenepitop oder Analogon davon wieder in Kontakt gebracht wird. Eine spezielle Ausführungsform besteht aus einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort gegen ein 158P1D7-ähnliches Protein oder ein künstliches multiepitopes Peptid, das Folgendes umfasst: Verabreichen von einem 158P1D7-Immunogen (z.B. dem 158P1D7-Protein oder einem Peptidfragment davon, einem 158P1D7-Fusionsprotein oder Analogon usw.) in einer Impfstoffzubereitung an ein menschlicher oder anderer Säuger. Normalerweise enthalten derartige Impfstoffzubereitungen weiter ein geeignetes Adjuvans (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 6 146 635) oder ein universelles Helferepitop, wie zum Beispiel ein PADRE^TM-Peptid (Epimmune Inc., San Diego, CA; siehe z.B. Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 und Alexander et al., Immunol. Res. 1998, 18(2): 79-92). Ein alternatives Verfahren umfasst die Erzeugung einer Immunantwort in einem Individuum gegen ein 158P1D7-Immunogen durch: Verabreichen von einem DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein 158P1D7-Immunogen kodiert, in vivo an Muskel oder Haut des Körpers des Individuums, wobei die DNA-Sequenz wirksam mit regulatorischen Sequenzen, die die Expression der DNA-Sequenz kontrollieren, verbunden ist; worin das DNA-Molekül von Zellen aufgenommen wird, die DNA-Sequenz in den Zellen exprimiert wird und eine Immunantwort gegen das Immunogen erzeugt wird (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5 962 428). Gegebenenfalls wird auch ein genetischer Impfstoff-Vermittler verabreicht, wie zum Beispiel anionische Lipide, Saponine, Lektine, östrogene Verbindungen, hydroxylierte niedrigere Alkyle, Dimethylsulfoxid und Harnstoff.
Nukleinsäure-Impfstoffe:
Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung schließen Nukleinsäure-vermittelte Modalitäten ein. DNA oder RNA, die Protein(e) der Erfindung kodieren, können an den Patienten verabreicht werden. Genetische Immunisierungsverfahren können zur Erzeugung von prophylaktischen oder therapeutischen humoralen und zellulären Immunantworten, die sich gegen 158P1D7-exprimierende Krebszellen richten, eingesetzt werden. Konstrukte, die DNA, die ein 158P1D7-ähnliches Protein/Immunogen kodiert, und entsprechende regulatorische Sequenzen umfassen, können direkt in Muskel oder Haut eines Individuums injiziert werden, sodass die Zellen des Muskels oder der Haut das Konstrukt aufnehmen und das kodierte 158P1D7-Protein/Immunogen exprimieren. Alternativ umfasst ein Impfstoff ein 158P1D7-ähnliches Protein. Die Expression des 158P1D7-ähnlichen Protein-Immunogens führt zur Erzeugung von prophylaktischer oder therapeutischer humoraler und zellulärer Immunität gegen Zellen, die das 158P1D7-Protein tragen. Es können verschiedene prophylaktische und therapeutische genetische Immunisierungstechniken, die in der Technik bekannt sind, verwendet werden (zur Übersicht siehe Informationen und Quellenangaben, die unter der Internet-Adresse www.genweb.com veröffentlicht sind). Nukleinsäure-basierte Zuführung ist beispielsweise in Wolff et al., Science 247:1465 (1990) sowie den U.S.-Patenten Nr. 5 580 859, 5 589 466, 5 804 566, 5 739 118, 5 736 524, 5 679 647, WO 98/04720 beschrieben. Beispiele von DNA-basierten Zuführungstechnologien schließen „nackte DNA", erleichterte (Bupivicain-, Polymeren-, Peptid-vermittelte) Zuführung, kationische Lipidkomplexe und Partikel-vermittelte („Gene-Gun") oder druckvermittelte Zuführung (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5 922 687) ein.
Für therapeutische oder prophylaktische Immunisierungszwecke können Proteine der Erfindung über virale oder bakterielle Vektoren exprimiert werden.
Verschiedene virale Genzuführungssysteme, die in der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden können, schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: Vaccinia, Hühnerpocken, Kanarienpocken, Adenovirus, Influenza, Poliovirus, Adeno-assoziierten Virus, Lentivirus und Sindbis-Virus (siehe z.B. Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang et al. J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)). Nicht-virale Zuführungssysteme können durch Einführung von nackter DNA, die ein 158P1D7-ähnliches Protein kodiert, in den Patienten (z.B. intramuskulär oder intradermal) auch eingesetzt werden, um eine Anti-Tumor-Antwort zu induzieren.
Der Vaccinia-Virus wird beispielsweise als ein Vektor zur Expression von Nukleotidsequenzen, die die Peptide der Erfindung kodieren, verwendet. Bei Einführung in einen Wirt exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das immunogene Protein-Peptid und löst dadurch eine Immunantwort des Wirts aus. Vaccinia-Vektoren und Verfahren, die in Immunisierunsgprotokollen nützlich sind, sind in z.B. U.S.-Patent Nr. 4 722 848 beschrieben. Ein weiterer Vektor ist BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG-Vektoren sind in Stover et al., Nature 351:456-460 (1991) beschrieben. Eine große Vielfalt von anderen Vektoren, die zur therapeutischen Verabreichung oder Immunisierung der Peptide der Erfindung nützlich sind, z.B. Adeno- und Adeno-assoziierte Virusvektoren, retrovirale Vektoren, Salmonella typhi-Vektoren, detoxifizierte Anthrax-Toxin-Vektoren und desgleichen, wird dem Fachmann aus der Beschreibung hierin offensichtlich werden.
Somit werden Genzuführungssysteme zur Zuführung eines 158P1D7-ähnlichen Nukleinsäuremoleküls verwendet. In einer Ausführungsform wird die menschliche 158P1D7-cDNA in vollständiger Länge eingesetzt. In einer weiteren Ausführungsform werden 158P1D7-Nukleinsäuremoleküle, die spezifische cytotoxische T-Lymphozyten (CTL)- und/oder Antikörper-Epitope kodieren, eingesetzt.
Ex-vivo-Impfstoffe
Es können auch verschiedene ex-vivo-Strategien zur Erzeugung einer Immunantwort eingesetzt werden. Ein Ansatz schließt die Verwendung von Antigenpräsentierenden Zellen (APCs), wie zum Beispiel dendritischen Zellen (DC), zur Präsentation von 158P1D7-Antigen für das Immunsystem eines Patienten ein. Dendritische Zellen exprimieren MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle, B7-Costimulator und IL-12 und sind somit sehr spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen. Bei Blasenkrebs werden autologe dendritische Zellen, die mit Peptiden des MAGE-3-Antigens gepulst sind, in Phase I einer klinischen Prüfung zur Stimulierung des Immunsystems von Patienten mit Blasenkrebs verwendet (Nishiyama et al., 2001, Clin. Cancer Res., 7(1):23-31). Somit können dendritische Zellen zur Präsentation von 158P1D7-Peptiden für T-Zellen in Verbindung mit MHC-Klasse-I- oder -II-Molekülen verwendet werden. In einer Ausführungsform werden autologe dendritische Zellen mit 158P1D7-Peptiden, die zur Bindung zu MHC-Klasse-I- und/oder -II-Molekülen fähig sind, gepulst. In einer weiteren Ausführungsform werden dendritische Zellen mit dem vollständigen 158P1D7-Protein gepulst. Eine noch weitere Ausführungsform schließt das Konstruieren der Überexpression des 158P1D7-Gens in dendritischen Zellen unter Verwendung verschiedener ausführender, in der Technik bekannter Vektoren, wie zum Beispiel Adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), Retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770), Lentivirus, Adeno-assoziierter Virus, DNA-Transfektion (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869) oder Tumor-abgeleitete RNA-Transfektion (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182) ein. Zellen, die 158P1D7 exprimieren, können auch zur Expression von Immunmodulatoren, wie zum Beispiel GM-CSF, konstruiert und als immunisierende Agenzien verwendet werden.
X.B.) 158P1D7 als Ziel für Antikörner-basierte Therapie
158P1D7 ist ein attraktives Ziel für Antikörper-basierte, therapeutische Strategien. Es sind etliche Antikörper-Strategien zum Angriff von sowohl extrazellulären als auch intrazellulären Molekülen in der Technik bekannt (siehe z.B. Komplement- und ADCC-vermitteltes Abtöten sowie die Verwendung von Intrabodies (intrazellulären Antikörpern)). Da 158P1D7 von Krebszellen verschiedener Stämme im Verhältnis zu den entsprechenden normalen Zellen exprimiert wird, wird die systemische Verabreichung von 158P1D7-immunreaktiven Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine ausgezeichnete Empfindlichkeit ohne toxische, nicht-spezifische und/oder Nicht-Ziel-Wirkungen, die durch die Bindung der immunreaktiven Zusammensetzung zu Nicht-Zielorganen und -geweben verursacht werden, zeigen. Antikörper, die mit Domänen von 158P1D7 spezifisch reaktiv sind, sind zur systemischen Behandlung von 158P1D7-exprimierenden Krebsen nützlich, entweder als Konjugate mit einem Toxin oder therapeutischen Agens oder als nackte Antikörper, die zur Inhibierung von Zellproliferation oder -funktion fähig sind.
158P1D7-Antikörper können in einen Patienten derart eingeführt werden, dass der Antikörper zu 158P1D7 bindet und eine Funktion moduliert, wie zum Beispiel eine Wechselwirkung mit einem Bindungspartner, und folglich die Destruktion der Tumorzellen vermittelt und/oder das Wachstum der Tumorzellen inhibiert.
Mechanismen, durch die derartige Antikörper eine therapeutische Wirkung ausüben, können Komplement-vermittelte Zytolyse, Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität, Modulation der physiologischen Funktion von 158P1D7, Inhibierung von Ligandbindungs- oder Signalübertragungswegen, Modulation von Tumorzelldifferenzierung, Veränderung von Tumorangiogenesefaktor-Profilen und/oder Apoptose einschließen.
Der Fachmann sieht ein, dass Antikörper zum spezifischen Angriff und zur spezifischen Bindung immunogener Moleküle, wie zum Beispiel einer immunogenen Region der in 2 oder 3 dargestellten 158P1D7-Sequenz, verwendet werden können. Außerdem sieht der Fachmann ein, dass die Konjugation von Antikörpern zu cytotoxischen Agenzien Routine ist (siehe z.B. Slevers et al. Blood 93:11, 3678-3684 (1. Juni 1999)). Wenn cytotoxische und/oder therapeutische Agenzien den Zellen direkt zugeführt werden, wie zum Beispiel durch Konjugation dieser zu Antikörpern, die für ein Molekül, das von dieser Zelle exprimiert wird, (z.B. 158P1D7) spezifisch sind, wird das cytotoxische Agens seine bekannte biologische Wirkung (d.h. Cytotoxizität) auf diese Zellen ausüben.
In der Technik ist eine große Vielfalt von Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung von Konjugaten aus Antikörper und cytotoxischem Agens zur Abtötung von Zellen bekannt. Im Zusammenhang mit Krebsen bringen typische Verfahren Folgendes mit sich: Verabreichen einer biologisch wirksamen Menge eines Konjugats, das ein ausgewähltes cytotoxisches und/oder therapeutisches Agens umfasst, das mit einem angreifenden Agens (z.B. einem Anti-158P1D7-Antikörper), das zu einem exprimierten Marker (z.B. 158P1D7) bindet, der für Bindung zugänglich oder auf den Zelloberflächen lokalisiert ist, verbunden ist, an ein Tier mit einem Tumor. Eine typische Ausführungsform ist ein Verfahren zur Zuführung eines cytotoxischen und/oder therapeutischen Agens zu einer 158P1D7-exprimierenden Zelle, das Folgendes umfasst: Konjugieren des cytotoxischen Agens zu einem Antikörper, der immunspezifisch zu einem 158P1D7-Epitop bindet, und Aussetzen der Zelle zu dem Antikörper-Agens-Konjugat. Eine weitere erläuternde Ausführungsform ist ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums, bei dem vermutet wird, dass es an metastasiertem Krebs leidet, das einen Schritt der parenteralen Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers, der zu einem cytotoxischen und/oder therapeutischen Agens konjugiert ist, umfasst, an genanntes Individuum umfasst.
Krebsimmuntherapie unter Verwendung von Anti-158P1D7-Antikörpern kann gemäß verschiedenen Ansätzen erfolgen, die erfolgreich bei der Behandlung von anderen Krebsarten eingesetzt wurden, einschließlich, doch nicht auf diese beschränkt: Kolonkrebs (Arien et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), multiples Myelom (Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), Magenkrebs (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), B-Zell-Lymphom (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), Leukämie (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), kolorektaler Krebs (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) und Brustkrebs (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Einige therapeutische Ansätze umfassen die Konjugation von nacktem Antikörper zu einem Toxin, wie zum Beispiel die Konjugation von Y⁹¹ oder I¹³¹ zu Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Zevalin^TM, IDEC Pharmaceuticals Corp. oder Bexxar^TM, Coulter Pharmaceuticals), während andere die Mitverabreichung von Antikörpern und anderen therapeutischen Agenzien, wie zum Beispiel Herceptin^TM (Trastuzumab) mit Paclitaxel (Genentech, Inc.), umfassen. Zur Behandlung von beispielsweise Blasenkrebs können 158P1D7-Antikörper zusammen mit Bestrahlung, Chemotherapie oder Hormonablation verabreicht werden.
Obgleich die 158P1D7-Antikörpertherapie für alle Krebsstadien nützlich ist, kann Antikörpertherapie bei fortgeschrittenen oder metastasierten Krebsen besonders geeignet sein. Die Behandlung mit der Antikörpertherapie der Erfindung ist für Patienten angezeigt, die eine oder mehrere Runden Chemotherapie erhalten haben. Alternativ wird die Antikörpertherapie der Erfindung mit einem chemotherapeutischen oder Bestrahlungsregime für Patienten kombiniert, die keine chemotherapeutische Behandlung erhalten haben. Zusätzlich kann die Antikörpertherapie die Verwendung von reduzierten Dosierungen von begleitender Chemotherapie ermöglichen, insbesondere bei Patienten, die die Toxizität des Chemotherapeutikums nicht sehr gut vertragen.
Krebspatienten können hinsichtlich der Gegenwart und Höhe von 158P1D7-Expression bewertet werden, bevorzugt unter Verwendung immunhistochemischer Beurteilungen von Tumorgewebe, quantitativer 158P1D7-Abbildung oder anderer Techniken, die die Gegenwart und den Grad von 158P1D7-Expression zuverlässig anzeigen. Immunhistochemische Analyse von Tumorbiopsien oder operativen Proben ist für diesen Zweck bevorzugt. Verfahren zur immunhistochemischen Analyse von Tumorgeweben sind in der Technik gut bekannt.
Monoklonale Anti-158P1D7-Antikörper, die Blasen- und andere Krebse behandeln, schließen solche ein, die eine wirksame Immunantwort gegen den Tumor auslösen, oder solche, die direkt cytotoxisch sind. In diesem Zusammenhang können monoklonale Anti-158P1D7-Antikörper (mAbs = monoklonale Antikörper) Tumorzelllyse durch entweder Komplement-vermittelte oder Antikörper-abhängige Zellcytotoxizität(ADCC)-Mechanismen auslösen, von denen beide einen intakten Fc-Teil des Immunoglobulinmoleküls zur Wechselwirkung mit Effektorzell-Fc-Rezeptorstellen auf Komplementproteinen erfordern. Außerdem sind Anti-158P1D7-mAbs, die eine direkte biologische Wirkung auf das Tumorwachstum ausüben, zur Behandlung von Krebsen, die 158P1D7 exprimieren, geeignet. Mechanismen, durch die direkt cytotoxische mAbs wirken, schließen Folgendes ein: Inhibierung von Zellwachstum, Modulation von zellulärer Differenzierung, Modulation von Tumorangionesefaktor-Profilen und die Induktion von Apoptose. Der Mechanismus/Die Mechanismen, durch den/die ein bestimmter Anti-158P1D7-mAb eine Antitumorwirkung ausübt, wird/werden unter Verwendung von irgendeiner Anzahl von in-vitro-Assays, die Zelltod bewerten, wie zum Beispiel ADCC, ADMMC, Komplement-vermittelte Zelllyse und so weiter, bewertet, wie in der Technik allgemein bekannt ist.
Bei einigen Patienten kann die Verwendung von murinen oder anderen nicht-menschlichen monoklonalen Antikörpern oder chimären Mensch/Maus-mAbs mittlere bis starke Immunantworten gegen den nicht-menschlichen Antikörper erzeugen. Dies kann zur Clearance des Antikörpers aus dem Kreislauf und zu reduzierter Wirksamkeit führen. In den meisten schweren Fällen kann solch eine Immunantwort zur beträchtlichen Bildung von Immunkomplexen führen, die möglicherweise Nierenversagen verursachen können. Entsprechend sind bevorzugte monoklonale Antikörper, die in den therapeutischen Verfahren der Erfindung verwendet werden, solche, die entweder vollständig menschlich oder humanisiert sind und die spezifisch mit hoher Affinität zum 158P1D7-Zielantigen binden, doch geringe oder keine Antigenität im Patienten zeigen.
Therapeutische Verfahren der Erfindung erwägen die Verabreichung von einzelnen Anti-158P1D7-mAbs sowie Kombinationen oder Cocktails von verschiedenen mAbs. Derartige mAb-Cocktails können insofern bestimmte Vorteile haben, als dass sie mAbs enthalten, die auf verschiedene Epitope ausgerichtet sind, verschiedene Effektormechanismen nutzen oder cytotoxische mAbs, mit mAbs, die auf Immuneffektor-Funktionalität beruhen, direkt kombinieren. Derartige kombinierte mAbs können synergistische therapeutische Wirkungen zeigen. Außerdem können Anti-158P1D7-mAbs gleichzeitig mit anderen therapeutischen Modalitäten verabreicht werden, einschließlich Folgender, doch nicht auf diese beschränkt: verschiedene Chemotherapeutika, Androgen-Blocker, Immunmodulatoren (z.B. IL-2, GM-CSF), Operation oder Bestrahlung. Die Anti-158P1D7-mAbs werden in ihrer „nackten" oder nichtkonjugierten Form verabreicht oder können zu einem therapeutischen Agens/Agenzien konjugiert sein.
Anti-158P1D7-Antikörperformulierungen werden über irgendeinen Weg verabreicht, bei dem es möglich ist, die Antikörper einer Tumorzelle zuzuführen. Verabreichungswege schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, intratumoral, intradermal und desgleichen. Die Behandlung umfasst allgemein die wiederholte Verabreichung der Anti-158P1D7-Antikörperzubereitung über einen verträglichen Verabreichungsweg, wie zum Beispiel intravenöse Injektion (IV), normalerweise bei einer Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht. Im Allgemeinen sind Dosen im Bereich von 10-500 mg mAb pro Woche wirksam und werden gut vertragen.
Basierend auf klinischer Erfahrung mit dem Herceptin-mAb bei der Behandlung von metastasiertem Brustkrebs, stellt eine anfängliche Beladungsdosis von ungefähr 4 mg/kg Körpergewicht des Patienten IV, gefolgt von wöchentlichen Dosen von etwa 2 mg/kg IV der Anti-158P1D7-mAb-Zubereitung, ein verträgliches Dosierungsregime dar. Bevorzugt wird die anfängliche Beladungsdosis als eine 90-Minuten- oder längere Infusion verabreicht. Die periodische Erhaltungsdosis wird als eine 30-Minuten- oder längere Infusion verabreicht, sofern die anfängliche Dosis gut vertragen wurde. Wie vom Fachmann eingesehen wird, können verschiedene Faktoren das ideale Dosisregime in einem bestimmten Fall beeinflussen. Derartige Faktoren schließen beispielsweise die Bindungsaffinität und Halbwertzeit des verwendeten Ab oder der verwendeten mAbs, den Grad der 158P1D7-Expression im Patienten, das Ausmaß von zirkulierendem 158P1D7-Shed-Antigen, das gewünschte Konzentrationsniveau des Antikörpers im Dauerzustand, die Häufigkeit der Behandlung und den Einfluss von chemotherapeutischen oder anderen Agenzien, die zusammen mit dem Behandlungsverfahren der Erfindung verwendet werden, sowie den Gesundheitszustand eines bestimmten Patienten ein.
Gegebenenfalls sollten Patienten hinsichtlich der Höhen von 158P1D7 in einer gegebenen Probe (z.B. der Höhen von zirkulierendem 158P1D7-Antigen und/oder 158P1D7-exprimierenden Zellen) beurteilt werden, um die Bestimmung des wirksamsten Dosierungsregimes usw. zu erleichtern. Derartige Beurteilungen werden auch für Kontrollzwecke während der Therapie verwendet und sind zur Abschätzung des therapeutischen Erfolgs zusammen mit der Beurteilung anderer Parameter (beispielsweise Urinzytologie und/oder ImmunoCyt-Niveaus bei Blasenkrebstherapie oder analog Serum-PSA-Niveaus bei Prostatakrebstherapie) nützlich.
Anti-idiotypische Anti-158P1D7-Antikörper können auch bei der Antikrebstherapie als ein Impfstoff zur Induktion einer Immunantwort auf Zellen, die ein 158P1D7-ähnliches Protein exprimieren, verwendet werden. Insbesondere ist die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern in der Technik gut bekannt; diese Methode kann zur Erzeugung von anti-idiotypischen Anti-158P1D7-Antikörpern, die ein Epitop auf einem 158P1D7-ähnlichen Protein nachahmen, leicht angepasst werden (siehe beispielsweise Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76). Ein derartiger anti-idiotypischer Antikörper kann in Krebsimpfstoff-Strategien verwendet werden.
X.C.) 158P1D7 als Ziel für zelluläre Immunantworten
Impfstoffe und Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen, die eine immunogen wirksame Menge eines oder mehrerer HLA-bindender Peptide enthalten, wie hierin beschrieben, sind weitere Ausführungsformen der Erfindung. Außerdem umfassen erfindungsgemäße Impfstoffe Zusammensetzungen von einem oder mehreren der beanspruchten Peptide. Ein Peptid kann einzeln in einem Impfstoff vorliegen. Alternativ kann das Peptid als ein Homopolymer, das mehrfache Kopien desselben Peptids umfasst, oder als ein Heteropolymer verschiedener Peptide vorliegen. Polymere haben den Vorteil einer erhöhten immunologischen Reaktion und, wo verschiedene Peptidepitope verwendet werden, um das Polymer zu bilden, der zusätzlichen Fähigkeit, Antikörper und/oder CTLs zu erzeugen, die mit verschiedenen antigenen Determinanten des pathogenen Organismus oder Tumor-bezogenem Peptid, das für eine Immunantwort angegriffen wird, reagieren. Die Zusammensetzung kann eine natürlich vorkommende Region eines Antigens sein oder kann hergestellt werden, z.B. rekombinant oder durch chemische Synthese.
Träger, die mit Impfstoffen der Erfindung verwendet werden können, sind in der Technik gut bekannt und schließen z.B. Folgende ein: Thyroglobulin, Albumine, wie zum Beispiel menschliches Serumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren, wie zum Beispiel Poly-t-lysin, Poly-t-glutaminsäure, Influenza, Hepatitis-B-Virus-Kernprotein und desgleichen. Die Impfstoffe können ein physiologisch tolerierbares (d.h. verträgliches) Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Wasser oder Kochsalzlösung, bevorzugt phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthalten. Die Impfstoffe schließen normalerweise auch ein Adjuvans ein. Adjuvanzien, wie zum Beispiel inkomplettes Freund-Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Alaun, sind Beispiele von Stoffen, die in der Technik gut bekannt sind. Zusätzlich, wie hierin offenbart, können CTL-Antworten durch Konjugation von Peptiden der Erfindung zu Lipiden, wie zum Beispiel Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyserylserin (P₃CSS), geprimt werden. Darüber hinaus wurde gefunden, dass ein Adjuvans, wie zum Beispiel ein synthetisches Cytosinphosphorthioliertes-Guanin-enthaltendes (CpG-)Oligonukleotid, CTL-Antworten 10-bis 100-fach erhöht. (siehe z.B. Davila und Celis J. Immunol. 165:539-547 (2000)).
Bei Immunisierung mit einer erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzung über Injektion, Aerosol, orale, transdermale, transmukosale, intrapleurale, intrathekale oder andere geeignete Wege reagiert das Immunsystem des Wirts auf den Impfstoff durch Bildung großer Mengen von CTLs und/oder HTLs, die für das gewünschte Antigen spezifisch sind. Infolgedessen wird der Wirt zumindest teilweise immun gegen die spätere Entwicklung von Zellen, die 158P1D7-Antigen exprimieren oder überexprimieren, oder erlangt mindestens etwas therapeutischen Nutzen, wenn das Antigen Tumor-assoziiert war.
In einigen Ausführungsformen könnte es wünschenswert sein, die Klasse-I-Peptid-Komponenten mit Komponenten zu kombinieren, die neutralisierende Antikörper- und oder Helfer-T-Zell-Antworten, die auf das Zielantigen gerichtet sind, induzieren oder unterstützen. Eine bevorzugte Ausführungsform einer derartigen Zusammensetzung umfasst erfindungsgemäße Klasse-I- und Klasse-II-Epitope. Eine alternative Ausführungsform einer derartigen Zusammensetzung umfasst ein erfindungsgemäßes Klasse-I- und/oder Klasse-II-Epitop zusammen mit einem kreuzreaktiven HTL-Epitop, wie zum Beispiel PADRE^TM (Epimmune, San Diego, CA)-Molekül (z.B. im U.S.-Patent Nr. 5 736 142 beschrieben).
Ein Impfstoff der Erfindung kann auch Antigen-präsentierende Zellen (APC), wie zum Beispiel dendritische Zellen (DC), als ein Vehikel zur Präsentation von Peptiden der Erfindung einschließen. Impfstoffzusammensetzungen können in vitro gebildet werden, nach Mobilisierung und Ernte der dendritischen Zellen, wodurch die Beladung von dendritischen Zellen in vitro erfolgt. Beispielsweise werden dendritische Zellen z.B. mit einem erfindungsgemäßen Minigen transfiziert oder werden mit Peptiden gepulst. Die dendritische Zelle kann dann an einen Patienten zur Auslösung von Immunantworten in vivo verabreicht werden. Impfstoffzusammensetzungen, entweder DNA- oder Peptid-basierte, können auch in vivo in Kombination mit Mobilisierung der dendritischen Zellen verabreicht werden, wodurch die Beladung von dendritischen Zellen in vivo erfolgt.
Bevorzugt werden die folgenden Prinzipien zur Auswahl einer Reihe von Epitopen zum Einschluss in einer polyepitopen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Impfstoff oder zur Auswahl von einzelnen Epitopen, die in einem Impfstoff eingeschlossen und/oder durch Nukleinsäuren, wie zum Beispiel ein Minigen, kodiert werden sollen, angewendet. Es ist bevorzugt, dass jedes der folgenden Prinzipien abgewogen wird, um die Auswahl zu treffen. Die multiplen Epitope, die in eine gegebene Impfstoffzusammensetzung eingeschlossen werden, können, doch müssen nicht, in der Sequenz im nativen Antigen, von dem die Epitope stammen, zusammenhängend sein.

1.) Es werden die Epitope ausgewählt, die bei Verabreichung Immunantworten nachahmen, von denen beobachtet wurde, dass sie mit der Tumorbeseitigung korrelieren. Für HLA Klasse I schließt dies 3-4 Epitope ein, die von mindestens einem Tumor-assoziierten Antigen (TAA) stammen. Für HLA Klasse II wird ein ähnliches Grundprinzip angewendet; wieder werden 3-4 Epitope von mindestens einem TAA ausgewählt (siehe z.B. Rosenberg et al., Science 278:1447-1450). Epitope von einem TAA können zusammen mit Epitopen von einem oder mehreren zusätzlichen TAAs verwendet werden, um einen Impfstoff herzustellen, der auf Tumoren mit variierenden Expressionsmustern von häufig exprimierten TAAs ausgerichtet ist.
2.) Es werden die Epitope ausgewählt, die die notwendige Bindungsaffinität haben, von der bekannt ist, dass sie mit Immunogenität korreliert: für HLA Klasse I eine IC₅₀ von 500 nM oder weniger, häufig 200 nM oder weniger; und für Klasse II eine IC₅₀ von 1000 nM oder weniger.
3.) Ausreichende Supermotiv-tragende Peptide oder eine ausreichende Reihe von Allel-spezifischen Motiv-tragenden Peptiden werden ausgewählt, um eine breite Bevölkerungsabdeckung zu gewährleisten. Beispielsweise sind mindestens 80% Bevölkerungsabdeckung bevorzugt. Eine Monte-Carlo-Analyse, eine in der Technik bekannte, statistische Bewertung, kann zur Einschätzung des Umfangs oder der Redundanz der Bevölkerungsabdeckung eingesetzt werden.
4.) Bei der Auswahl von Epitopen aus Krebs-bezogenen Antigenen ist es häufig nützlich, Analoga auszuwählen, da der Patient eine Toleranz für das native Epitop entwickelt haben könnte.
5.) Von besonderer Bedeutung sind Epitope, die als „nested epitopes" (geschachtelte Epitope) bezeichnet werden. Geschachtelte Epitope treten dort auf, wo mindestens zwei Epitope in einer gegebenen Peptidsequenz überlappen. Eine geschachtelte Peptidsequenz kann B-Zell-, HLA-Klasse-I- und/oder HLA-Klasse-II-Epitope umfassen. Bei der Bereitstellung von geschachtelten Epitopen ist ein allgemeines Ziel, die größte Anzahl von Epitopen pro Sequenz bereitzustellen. Somit ist ein Aspekt, die Bereitstellung eines Peptids zu vermeiden, das länger als der Amino-Terminus des Amino-terminalen Epitops und der Carboxyl-Terminus des Carboxyl-terminalen Epitops in dem Peptid ist. Bei der Bereitstellung einer multiepitopen Sequenz, wie zum Beispiel eine Sequenz, die geschachtelte Epitope umfasst, ist es allgemein wichtig, die Sequenz zu screenen, um zu gewährleisten, dass sie keine pathologischen oder anderen schädlichen biologischen Eigenschaften enthält.
6.) Wenn ein polyepitopes Protein hergestellt wird oder bei der Herstellung eines Minigens, ist es ein Ziel, das kleinste Peptid, das die interessierenden Epitope umfasst, zu erzeugen. Dieses Prinzip ist ähnlich, wenn nicht gleich dem, das bei der Auswahl eines Peptids, das geschachtelte Epitope umfasst, angewendet wurde. Jedoch ist das Ziel der Größenminimierung bei einem künstlichen polyepitopen Peptid gegen die Notwendigkeit des Einbaus von Spacersequenzen zwischen Epitopen in dem polyepitopen Protein abgewogen. Spacer-Aminosäurereste können beispielsweise eingeführt werden, um funktionale Epitope (ein Epitop, das von dem Immunsystem erkannt wird, nicht im Zielantigen vorliegt und nur durch künstliches Nebeneinanderreihen von Epitopen konstruiert wird) zu vermeiden oder die Spaltung zwischen Epitopen zu unterstützen und dadurch die Epitop-Präsentation zu erhöhen. Junktionale Epitope sollten allgemein vermieden werden, da der Empfänger eine Immunantwort auf dieses nicht-native Epitop erzeugen könnte. Von besonderem Anliegen ist ein funktionales Epitop, das ein „dominantes Epitop" ist. Ein dominantes Epitop kann zu einer solchen eifrigen Antwort führen, dass Immunantworten auf andere Epitope abgeschwächt oder unterdrückt werden.
7.) Wo die Sequenzen von multiplen Varianten des gleichen Zielproteins vorliegen, können mögliche Peptidepitope auch auf der Grundlage ihrer Konserviertheit ausgewählt werden. Beispielsweise kann ein Merkmal für Konserviertheit bestimmen, dass die gesamte Sequenz eines HLA-Klasse-I-bindenden Peptids oder der gesamte 9-mer-Kern eines Klasse-II-bindenden Peptids in einem ausgewiesenen Prozentanteil der Sequenz, der für ein spezifisches Proteinantigen abgeschätzt wurde, konserviert ist.

X.C.1.) Minigen-Impfstoffe
Es sind etliche verschiedene Ansätze verfügbar, die die gleichzeitige Zuführung von multiplen Epitopen ermöglichen. Nukleinsäuren, die die Peptide der Erfindung kodieren, sind eine besonders nützliche Ausführungsform der Erfindung. Epitope zum Einschluss in einem Minigen werden bevorzugt gemäß den im vorangehenden Abschnitt dargelegten Leitlinien selektiert. Ein bevorzugtes Mittel zur Verabreichung von Nukleinsäuren, die die Peptide der Erfindung kodieren, verwendet Minigenkonstrukte, die ein Peptid kodieren, das ein oder multiple Epitope der Erfindung umfasst.
Die Verwendung von multi-epitopen Minigenen ist nachstehend und in Folgenden beschrieben: Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L. und Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998. Beispielsweise kann ein Multi-Epitop-DNA-Plasmid, das Supermotiv- und/oder Motiv-tragende Epitope, die von 158P1D7 stammen, das universelle PADRE^®-T-Helferzell-Epitop (oder multiple HTL-Epitope von 158P1D7) und eine endoplasmatisches-Reticulum-translokalisierende Signalsequenz kodiert, konstruiert werden. Ein Impfstoff kann auch Epitope umfassen, die von anderen TAAs stammen.
Die Immunogenität eines multi-epitopen Minigens kann in transgenen Mäusen zur Beurteilung des Ausmaßes von CTL-Induktionsantworten gegen die getesteten Epitope bestätigt werden. Weiter kann die Immunogenität von DNA-kodierten Epitopen in vivo mit den in-vitro-Antworten von spezifischen CTL-Linien gegen Zielzellen, die mit dem DNA-Plasmid transfiziert sind, korreliert werden. Somit können diese Experimente zeigen, dass das Minigen beidem dient: 1.) der Erzeugung einer CTL-Antwort und 2.) dass die induzierten CTLs Zellen erkannten, die die kodierten Epitope exprimieren.
Um beispielsweise eine DNA-Sequenz, die die selektierten Epitope (Minigen) kodiert, zur Expression in menschlichen Zellen zu erzeugen, können die Aminosäuresequenzen der Epitope revers translatiert werden. Es kann eine menschliche Codon Usage Table verwendet werden, um die Kodonwahl für jede Aminosäure zu lenken. Diese Epitop-kodierenden DNA-Sequenzen können direkt nebeneinander liegen, sodass bei der Translation eine fortlaufende Polypeptidsequenz entsteht. Zur Optimierung von Expression und/oder Immunogenität könnnen zusätzliche Elemente in das Minigendesign eingebaut werden. Beispiele von Aminosäuresequenzen, die revers translatiert und in der Minigensequenz eingeschlossen werden können, schließen Folgende ein: HLA-Klasse-I-Epitope, HLA-Klasse-II-Epitope, Antikörper-Epitope, eine Ubiquitinierungssignalsequenz und/oder ein auf das endoplasmatische Reticulum ausgerichtete Signal. Außerdem kann HLA-Präsentation von CTL- und HTL-Epitopen durch Einschluss von synthetischen (z.B. Poly-Alanin) oder natürlich vorkommenden flankierenden Sequenzen, benachbart zu den CTL- oder HTL-Epitopen, verbessert werden; diese größeren Peptide, die das/die Epitop(e) umfassen, sind im Rahmen der Erfindung.
Die Minigensequenz kann durch Zusammensetzen von Oligonukleotiden, die die Plus- und Minus-Stränge des Minigens kodieren, zu DNA umgewandelt werden. Überlappende Oligonukleotide (30-100 Basen lang) können unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung von gut bekannten Techniken synthetisiert, phosphoryliert, aufgereinigt und annealt werden. Die Enden der Oligonukleotide können beispielsweise unter Verwendung von T4-DNA-Ligase zusammengefügt werden. Dieses synthetische Minigen, das das Epitop-Polypeptid kodiert, kann dann in einen gewünschten Expressionsvektor kloniert werden.
Regulatorische Standardsequenzen, die dem Fachmann gut bekannt sind, werden bevorzugt in dem Vektor eingeschlossen, um die Expression in den Zielzellen zu gewährleisten. Mehrere Vektorelemente sind wünschenswert: ein Promotor mit einer Downstream-Klonierungsstelle zur Minigen-Insertion; ein Polyadenylierungssignal zur effizienten Terminierung der Transkription; eine E. coli-Replikationsquelle; und ein E. coli-selektierbarer Marker (z.B. Ampicillin- oder Kanamycin-Resistenz). Zahlreiche Promotoren können für diesen Zweck verwendet werden, z.B. der menschliche Cytomegalovirus (hCMV)-Promotor. Siehe z.B. U.S.-Patente Nr. 5 580 859 und 5 589 466 für andere geeignete Promotorsequenzen.
Es könnten zusätzliche Vektormodifikationen zur Optimierung der Minigen-Expression und Immunogenität erwünscht sein. In einigen Fällen sind Introns zur effizienten Genexpression erforderlich und ein oder mehrere synthetische oder natürlich vorkommende Introns könnten in die transkribierte Region des Minigens eingebaut werden. Der Einschluss von mRNA-Stabilisierungssequenzen und Sequenzen zur Replikation in Säugerzellen kann auch zur Erhöhung der Minigen-Expression erwogen werden.
Sobald ein Expressionsvektor selektiert ist, wird das Minigen in die Polylinker-Region, downstream des Promotors, kloniert. Dieses Plasmid wird in einen geeigneten E. coli-Stamm transformiert und die DNA wird unter Verwendung von Standardtechniken zubereitet. Die Orientierung und DNA-Sequenz des Minigens sowie alle anderen, im Vektor eingeschlossenen Elemente werden unter Verwendung von Restriktions-Mapping und DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Bakterielle Zellen, die das korrekte Plasmid besitzen, können als eine Master-Cell-Bank und eine Working-Cell-Bank aufbewahrt werden.
Außerdem scheinen immunstimulierende Sequenzen (ISSs oder CpGs) eine Rolle bei der Immunogenität von DNA-Impfstoffen zu spielen. Diese Sequenzen können in dem Vektor, außerhalb der Minigen-kodierenden Sequenz, eingeschlossen sein, falls es wünschenswert ist, die Immunogenität zu steigern.
In einigen Ausführungsformen kann ein bicistronischer Expressionsvektor verwendet werden, der die Herstellung von sowohl dem Minigen-kodierten Epitop als auch einem zweiten Protein (das eingeschlossen ist, um die Immunogenität zu steigern oder zu verringern) ermöglicht. Beispiele von Proteinen oder Polypeptiden, die bei Coexpression die Immunantwort vorteilhaft steigern könnten, schließen Folgende ein: Cytokine (z.B. IL-2, IL-12, GM-CSF), Cytokin-induzierende Moleküle (z.B. LeIF), costimulierende Moleküle oder für HTL-Antworten pan-DR-bindende Proteine (PADRE^TM, Epimmune, San Diego, CA). Helfer (HTL)-Epitope können mit intrazellulären zielgerichteten Signalen verbunden und separat von den exprimierten CTL-Epitopen exprimiert werden; dies ermöglicht die Ausrichtung der HTL-Epitope auf ein Zellkompartiment, das sich von dem der CTL-Epitope unterscheidet. Falls erforderlich, könnte dies den Eintritt von HTL-Epitopen in den HLA-Klasse-II-Weg effizienter unterstützen, wodurch die HTL-Induktion verbessert wird. Im Gegensatz zur HTL- oder CTL-Induktion kann spezifisches Verringern der Immunantwort durch Coexpression von immunsuppressiven Molekülen (z.B. TGF-β) bei bestimmten Erkrankungen vorteilhaft sein.
Therapeutische Mengen von Plasmid-DNA können beispielsweise durch Fermentation in E. coli und anschließender Aufreinigung hergestellt werden. Aliquoten von der Working-Cell-Bank werden zum Animpfen des Wachstumsmediums verwendet und bis zur Sättigung in Schüttelgefäßen oder einem Bioreaktor entsprechend gut bekannten Techniken wachsen gelassen. Plasmid-DNA kann unter Verwendung von normalen biologischen Trennungstechnologien, wie zum Beispiel Festphasen-Anionenaustauschharze, von QIAGEN, Inc. (Valencia, Kalifornien) geliefert, aufgereinigt werden. Falls erforderlich, kann überspiralisierte DNA von den offenen zirkulären und linearen Formen unter Verwendung von Gelelektrophorese oder anderen Verfahren isoliert werden.
Aufgereinigte Plasmid-DNA kann zur Injektion unter Verwendung einer Vielfalt von Formulierungen vorbereitet werden. Die einfachste Weise ist die Wiederherstellung von lyophilisierter DNA in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dieser Ansatz, bekannt als „nackte DNA", wird derzeit zur intramuskulären (IM) Verabreichung in klinischen Prüfungen verwendet. Zur Maximierung der immuntherapeutischen Wirkungen von Minigen-DNA-Impfstoffen könnte ein alternatives Verfahren zur Formulierung von aufgereinigter Plasmid-DNA wünschenswert sein. Es wurde eine Vielfalt von Verfahren beschrieben und neue Techniken könnten verfügbar werden. Kationische Lipide, Glycolipide und fusogene Liposomen können auch in der Formulierung verwendet werden (siehe z.B. wie von Folgenden beschrieben: WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); U.S.-Pat. Nr. 5 279 833; WO 91/06309; und Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)). Außerdem könnten Peptide und Verbindungen, die insgesamt als schützende, interaktive, nicht-kondensierende Verbindungen (PINC = protective, interactive, non-condensing compounds) bezeichnet werden, auch zu aufgereinigter Plasmid-DNA komplexiert werden, um Variablen, wie zum Beispiel Stabilität, intramuskuläre Dispersion oder Trafficking zu spezifischen Organen oder Zellarten, zu beeinflussen.
Die Sensibilisierung von Zielzellen kann als ein funktioneller Assay zur Expression und HLA-Klasse-I-Präsentation von Minigen-kodierten CTL-Epitopen verwendet werden. Beispielsweise wird die Plasmid-DNA in eine Säugerzelllinie eingeführt, die als ein Ziel für normale CTL-Chrom-Freisetzungs-Assays geeignet ist. Das verwendete Transfektionsverfahren wird von der endgültigen Formulierung abhängen. Elektroporation kann für „nackte" DNA verwendet werden, während kationische Lipide direkte in-vitro-Transfektion ermöglichen. Ein Plasmid, das Grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, kann cotransfiziert werden, um die Anreicherung von transfizierten Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) zu ermöglichen. Diese Zellen werden dann Chrom-51(⁵¹Cr)-markiert und als Zielzellen für Epitop-spezifische CTL-Linien verwendet; Zytolyse, die durch ⁵¹Cr-Freisetzung nachgewiesen wird, zeigt sowohl die Erzeugung als auch die HLA-Präsentation von Minigen-kodierten CTL-Epitopen an. Die Expression von HTL-Epitopen kann auf analoge Weise unter Verwendung von Assays zur Einschätzung der HTL-Aktivität beurteilt werden.
In-vivo-Immunogenität ist ein zweiter Ansatz zur funktionellen Untersuchung von Minigen-DNA-Formulierungen. Transgene Mäuse, die die entsprechenden menschlichen HLA-Proteine exprimieren, werden mit dem DNA-Produkt immunisiert. Die Dosis und der Verabreichungsweg hängen von der Formulierung ab (z.B. IM für DNA in PBS, intraperitoneal (i.p.) für Lipid-komplexierte DNA). Einundzwanzig Tage nach der Immunisierung werden Splenozyten geerntet und erneut für eine Woche in Gegenwart von Peptiden, die jedes zu testende Epitop kodieren, stimuliert. Danach werden für CTL-Effektorzellen Assays für die Zytolyse von Peptid-beladenen, ⁵¹Cr-markierten Zielzellen unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt. Die Lyse von Zielzellen, die durch HLA, mit Peptidepitopen beladen, entsprechend den Minigen-kodierten Epitopen, sensibilisiert wurden, zeigt DNA-Impfstofffunktion für in-vivo-Induktion von CTLs. Die Immunogenität von HTL-Epitopen wird auf analoge Weise in transgenen Mäusen bestätigt.
Alternativ können die Nukleinsäuren unter Verwendung von ballistischer Zuführung verabreicht werden, wie zum Beispiel im U.S.-Patent Nr. 5 204 253 beschrieben ist. Unter Verwendung dieser Technik werden Partikel, die einzig DNA enthalten, verabreicht. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann DNA an Partikeln, wie zum Beispiel Goldpartikeln, haften.
Minigene können auch unter Verwendung anderer, in der Technik gut bekannter, bakterieller oder viraler Zuführungssysteme zugeführt werden, z.B. kann ein Expressionskonstrukt, das Epitope der Erfindung kodiert, in einen viralen Vektor, wie zum Beispiel Vaccinia, eingebaut werden.
X.C.2. Kombinationen von CTL-Peptiden mit Helferpeptiden
Impfstoffzusammensetzungen, die CTL-Peptide der Erfindung umfassen, können modifiziert, z.B. analogisiert (Bildung von Analoga), werden, um gewünschte Eigenschaften bereitzustellen, wie zum Beispiel verbesserte Serum-Halbwertzeit, breitere Bevölkerungsabdeckung oder erhöhte Immunogenität.
Zum Beispiel kann die Fähigkeit eines Peptids zur Induktion von CTL-Aktivität durch Verknüpfen des Peptids mit einer Sequenz, die mindestens ein Epitop enthält, das zur Induktion einer T-Helferzell-Antwort fähig ist, verbessert werden. Obwohl ein CTL-Peptid direkt mit einem T-Helferpeptid verknüpft werden kann, werden CTL-Epitop/HTL-Epitop-Kojugate häufig durch ein Spacermolekül verknüpft. Der Spacer besteht normalerweise aus relativ kleinen, neutralen Molekülen, wie zum Beispiel Aminosäuren oder Aminosäuremimetika, die unter physiologischen Bedingungen im Wesentlichen ungeladen sind. Die Spacer werden normalerweise aus z.B. Ala, Gly oder anderen neutralen Spacern von unpolaren Aminosäuren oder neutralen polaren Aminosäuren ausgewählt. Es wird eingesehen werden, dass der wahlweise vorliegende Spacer nicht aus den gleichen Resten zu bestehen muss und somit ein Hetero- oder Homooligomer sein kann. Wenn ein Spacer vorliegt, wird er gewöhnlich aus mindestens einem oder zwei Resten, gewöhnlicher aus drei bis sechs Resten und manchmal 10 oder mehr Resten bestehen. Das CTL-Peptid-Epitop kann mit dem T-Helferpeptid-Epitop entweder direkt oder über einen Spacer, entweder am Amino- oder am Carboxy-Terminus des CTL-Peptids, verknüpft sein. Der Amino-Terminus von entweder dem immunogenen Peptid oder dem T-Helferpeptid kann acyliert sein.
In bestimmten Ausführungsformen ist das T-Helferpeptid eins, das von T-Helferzellen, die in der Mehrheit einer genetisch diversen Population vorliegen, erkannt wird. Dies kann durch Selektion von Peptiden, die zu vielen, den meisten oder allen der HLA-Klasse-II-Moleküle binden, erreicht werden. Beispiele derartiger Aminosäuren, die viele HLA-Klasse-II-Moleküle binden, schließen Sequenzen von Antigenen ein, wie zum Beispiel Tetanustoxoid an den Positionen 830-843 (QYIKANSKFIGITE; SEQ-ID.-NR.: 651), Plasmodium falciparum Circumsporozoite (CS)-Protein an den Positionen 378-398 (DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS; SEQ-ID.-NR.: 652) und Streptococcus-18 kD-Protein an den Positionen 116-131 (GAVDSILGGVATYGAA; SEQ-ID.-NR.: 653). Andere Beispiele schließen Peptide ein, die ein DR-1-4-7-Supermotiv oder eins der DR3-Motive tragen.
Alternativ ist es möglich, synthetische Peptide herzustellen, die zur Stimulierung von T-Helferlymphozyten in einer locker HLA-restringierten Weise unter Verwendung von Aminosäuresequenzen, die nicht in der Natur gefunden werden, fähig sind (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung WO 95/07707). Diese synthetischen Verbindungen, genannt Pan-DR-bindende Epitope (z.B. PADRE^TM, Epimmune, Inc., San Diego, CA), sind entwickelt worden, um am bevorzugtesten die meisten HLA-DR (menschliche HLA-Klasse-II)-Moleküle zu binden. Zum Beispiel wurde gefunden, dass ein Pan-DR-bindendes Epitop-Peptid mit der Formel aKXVAAWTLKAAa (SEQ-ID.-NR.: 654), worin „X" entweder Cyclohexylalanin, Phenylalanin oder Tyrosin ist und a entweder D-Alanin oder L-Alanin ist, zu den meisten HLA-DR-Allelen bindet und die Antwort von T-Helferlymphozyten von den meisten Individuen, ungeachtet ihres HLA-Typs, stimuliert. Eine Alternative eines Pan-DR-bindenden Epitops umfasst alle natürlichen „L"-Aminosäuren und kann in Form von Nukleinsäuren, die das Epitop kodieren, bereitgestellt werden.
HTL-Peptid-Epitope können auch modifiziert werden, um ihre biologischen Eigenschaften zu verändern. Beispielsweise können sie modifiziert werden, um D-Aminosäuren zur Erhöhung ihrer Resistenz gegenüber Proteasen einzuschließen und somit ihre Serum-Halbwertszeit zu verlängern, oder sie können zu anderen Molekülen, wie zum Beispiel Lipiden, Proteinen, Kohlehydraten und desgleichen, zur Erhöhung ihrer biologischen Aktivität konjugiert werden. Beispielsweise kann ein T-Helferpeptid zu einer oder mehreren Palmitinsäureketten an entweder den Amino- oder Carboxyl-Termini konjugiert werden.
X.C.3. Kombinationen von CTL-Peptiden mit T-Zell-Priming-Agenzien
In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, mindestens eine Komponente, die B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten primt, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einzuschließen. Lipide wurden als Agenzien identifiziert, die zum Primen von CTL in vivo fähig sind. Beispielsweise können Palmitinsäurereste an die ε- und α-Aminogruppen eines Lysinrests angebracht und dann z.B. über einen oder mehrere verknüpfende Reste, wie zum Beispiel Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser oder desgleichen, mit einem immunogenen Peptid verknüpft werden. Das lipidierte Peptid kann dann entweder direkt in einer Mizelle oder einem Partikel, eingebaut in einem Liposom, oder emulgiert in einem Adjuvans, z.B. inkomplettem Freund-Adjuvans, verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine besonders wirksame immunogene Zusammensetzung Palmitinsäure, die an ε- und α-Aminogruppen von Lys angebracht ist, die über eine Verknüpfung, z.B. Ser-Ser, mit dem Amino-Terminus des immunogenen Peptids verbunden ist.
Als ein weiteres Beispiel des Lipid-Primens von CTL-Antworten können E. coli-Lipoproteine, wie zum Beispiel Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyserylserin (P₃CSS), zum Primen von virusspezifischen CTL verwendet werden, wenn es kovalent mit einem geeigneten Peptid verbunden ist (siehe z.B. Deres et al., Nature 342:561, 1989). Peptide der Erfindung können beispielsweise zu P₃CSS gekuppelt und das Lipopeptid an ein Individuum zum spezifischen Primen einer Immunantwort auf das Zielantigen verabreicht werden. Da die Induktion von neutralisierenden Antikörpern auch mit P₃CSS-konjugierten Epitopen geprimt werden kann, können außerdem zwei solcher Zusammensetzungen kombiniert werden, um sowohl humorale als auch zellvermittelte Antworten wirksamer auszulösen.
X.C.4. Impfstoffzusammensetzungen, die DC umfassen, die mit CTL- und/oder HTL-Peptiden gepulst sind
Eine Ausführung einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung umfasst die ex-vivo-Verabreichung eines Cocktails von Epitop-tragenden Peptiden an PBMC, oder isolierte DC davon, aus dem Blut des Patienten. Zur Unterstützung der Ernte von DC kann ein Pharmazeutikum verwendet werden, wie zum Beispiel Progenipoietin^TM (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) oder GM-CSF/IL-4. Nachdem die DC mit Peptiden gepulst sind und vor der Reinfusion in Patienten werden die DC gewaschen, um ungebundene Peptide zu entfernen. In dieser Ausführungsform umfasst ein Impfstoff Peptid-gepulste DCs, die die gepulsten Peptid-Epitope, die mit HLA-Molekülen komplexiert sind, auf ihren Oberflächen präsentieren.
Die DCs können ex vivo mit einem Cocktail von Peptiden gepulst werden, von denen einige CTL-Antworten auf 158P1D7 stimulieren. Gegebenenfalls kann ein Helfer-T-Zellen (HTL)-Peptid, wie zum Beispiel ein natürliches oder künstliches locker restringiertes HLA-Klasse-II-Peptid, eingeschlossen werden, um die CTL- Antwort zu unterstützen. Somit wird ein erfindungsgemäßer Impfstoff zur Behandlung eines Krebses verwendet, der 158P1D7 exprimiert oder überexprimiert.
X.D. Adoptive Immuntherapie
Antigene 158P1D7-ähnliche Peptide werden auch zum Auslösen einer CTL- und/oder HTL-Antwort ex vivo verwendet. Die resultierenden CTL- oder HTL-Zellen können zur Behandlung von Tumoren in Patienten verwendet werden, die nicht auf andere konventionelle Formen der Therapie ansprechen oder nicht auf ein erfindungsgemäßes therapeutisches Impfstoff-Peptid oder eine erfindungsgemäße therapeutische Impfstoff-Nukleinsäure ansprechen werden. Ex-vivo-CTL- oder -HTL-Antworten auf ein bestimmtes Antigen werden durch Inkubieren der Patienten- oder genetisch kompatiblen CTL- oder HTL-Vorläuferzellen zusammen mit einer Quelle von Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel dendritischen Zellen, und dem entsprechenden immunogenen Peptid in Gewebekultur induziert. Nach einer angemessenen Inkubationszeit (normalerweise etwa 7-28 Tage), in der die Vorläuferzellen aktiviert und in Effektorzellen expandiert werden, werden die Zellen zurück in den Patienten infundiert, wo sie ihre spezifische Zielzelle (z.B. eine Tumorzelle) zerstören (CTL) oder die Zerstörung ihrer spezifischen Zielzellen unterstützen (HTL) werden. Transfizierte dendritische Zellen können auch als Antigen-präsentierende Zellen verwendet werden.
X.E. Verabreichung von Impfstoffen für therapeutische oder prophylaktische Zwecke
Pharmazeutische und Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung werden normalerweise zur Behandlung und/oder Prävention eines Krebses, der 158P1D7 exprimiert oder überexprimiert, verwendet. In therapeutischen Anwendungen werden Peptid- und/oder Nukleinsäurezusammensetzungen in einer Menge, die zum Auslösen einer wirksamen B-Zell-, CTL- und/oder HTL-Antwort auf das Antigen und zur Heilung oder zumindest zum teilweisem Einhalt oder zur teilweisen Verlangsamung der Symptome und/oder Komplikationen ausreichend ist, an einen Patienten verabreicht. Eine Menge, die zum Erreichen davon angemessen ist, ist als „therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, werden von z.B. der jeweiligen verabreichten Zusammensetzung, der Weise der Verabreichung, dem Stadium und der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem Gewicht und allgmeinen Gesundheitszustand des Patienten und der Beurteilung des verschreibenden Arztes abhängen.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen werden die immunogenen Peptide der Erfindung oder die DNA, die diese kodiert, allgemein an ein Individuum verabreicht, das bereits einen Tumor aufweist, der 158P1D7 exprimiert. Die Peptide oder die DNA, die diese kodiert, können einzeln oder als Fusionen von einer oder mehreren Peptidsequenzen verabreicht werden. Patienten können mit den immunogenen Peptiden separat oder in Verbindung mit anderen Behandlungen, wie zum Beispiel Operation, soweit erforderlich, behandelt werden.
Zur therapeutischen Verwendung sollte die Verabreichung allgemein bei der ersten Diagnose von 158P1D7-assoziiertem Krebs beginnen. Dieser folgen Boost-Dosen bis zumindest die Symptome wesentlich zurückgegangen sind, und für eine Dauer danach. Die Ausführungsform der Impfstoffzusammensetzung (d. h. einschließlich, doch nicht beschränkt auf Ausführungsformen, wie zum Beispiel Peptid-Cocktails, polyepitope Polypeptide, Minigene oder TAA-spezifische CTLs oder gepulste dendritische Zellen), die dem Patienten zugeführt wird, kann entsprechend dem Stadium der Erkrankung oder dem Gesundheitszustand des Patienten variieren. Beispielsweise kann ein Impfstoff, der 158P1D7-spezifische CTL umfasst, in einem Patienten mit einem Tumor, der 158P1D7 exprimiert, zum Abtöten von Tumorzellen im Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung wirksamer sein als alternative Ausführungsformen.
Es ist allgemein wichtig, eine Menge des Peptid-Epitops bereitzustellen, das auf eine Verabreichungsweise, die zur wirksamen Stimulation einer cytotoxischen 7-Zell-Antwort ausreichend ist, zugeführt wird; Zusammensetzungen, die Helfer-T-Zell-Antworten stimulieren, können auch gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung gegeben werden.
Die Dosierung für eine anfängliche therapeutische Immunisierung liegt allgemein in einem Einheitsdosierungsbereich, wo der niedrigere Wert etwa 1, 5, 50, 500 oder 1 000 μg beträgt und der höhere Wert etwa 10 000, 20 000, 30 000 oder 50 000 μg beträgt. Dosierungswerte für einen Menschen reichen normalerweise von etwa 500 μg bis etwa 50 000 μg pro 70 Kilogramm Patient. Boost-Dosierungen von zwischen etwa 1,0 μg bis etwa 50 000 μg Peptid, entsprechend einem Boost-Regime über Wochen bis Monate, können in Abhängigkeit von der Reaktion des Patienten und seines Zustands, wie durch Messen der spezifischen Aktivität von CTL und HTL, die aus dem Blut des Patienten erhalten werden, bestimmt wird, verabreicht werden. Die Verabreichung sollte andauern bis zumindest die klinischen Symptome oder Labortest anzeigen, dass die Neoplasie eliminiert oder reduziert wurde, und für eine Dauer danach andauern. Die Dosierungen, Verabreichungswege und Dosis-Pläne werden gemäß den in der Technik bekannten Methoden abgestimmt.
In bestimmten Ausführungsformen werden die Peptide und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei ernsten Erkrankungszuständen eingesetzt, das heißt in lebensbedrohenden oder möglicherweise lebensbedrohenden Situationen. In derartigen Fällen ist es, infolge der minimalen Mengen von irrelevanten Substanzen und der relativen, nicht-toxischen Natur der Peptide in bevorzugten Zusammensetzungen der Erfindung, möglich und kann von dem behandelnden Arzt als wünschenswert angesehen werden, erhebliche Überschüsse dieser Peptidzusammensetzungen, relativ zu diesen festgelegten Dosierungsmengen, zu verabreichen.
Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung können auch rein als prophylaktische Agenzien verwendet werden. Allgemein liegt die Dosierung für eine anfängliche prophylaktische Immunisierung allgemein in einem Einheitsdosierungsbereich, wo der niedrigere Wert etwa 1, 5, 50, 500 oder 1 000 μg beträgt und der höhere Wert etwa 10 000, 20 000, 30 000 oder 50 000 μg beträgt. Dosierungswerte für einen Menschen reichen normalerweise von etwa 500 μg bis etwa 50 000 μg pro 70 Kilogramm Patient. Dieser folgen Boost-Dosierungen von zwischen etwa 1,0 μg bis etwa 50 000 μg Peptid, das zu definierten Zeitabständen von etwa vier Wochen bis sechs Monaten nach der anfänglichen Verabreichung von Impfstoff verabreicht wird. Die Immunogenität des Impfstoffs kann durch Messen der spezifischen Aktivität von CTL und HTL, die aus einer Probe des Bluts des Patienten erhalten werden, bewertet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur therapeutischen Behandlung sind zur parenteralen, topischen, oralen, nasalen, intrathekalen oder lokalen (z.B. als eine Creme oder topische Salbe) Verabreichung gedacht. Bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, z.B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär, verabreicht. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bereit, die eine Lösung der immunogenen Peptide, die in einem verträglichen Träger, bevorzugt einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert sind, umfassen.
Eine Vielfalt von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,8% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und desgleichen. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle, bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder können steril gefiltert werden. Die entstehenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung im Istzustand verpackt oder lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird.
Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten, wie für annähernd physiologische Bedingungen erforderlich ist, wie zum Beispiel pH-einstellende und -puffernde Agenzien, Tonizität-einstellende Agenzien, Benetzungsmittel, Konservierungsmittel und desgleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
Die Konzentration von Peptiden der Erfindung in den pharmazeutischen Formulierungen kann weitgehend variieren, d. h. von geringer als etwa 0,1%, gewöhnlich bei oder mindestens etwa 2 Gewichts-% bis so hoch wie 20 Gewichts-% bis 50 Gewichts-% oder mehr, und wird hauptsächlich durch Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten usw. gemäß der jeweiligen ausgewählten Verabreichungsweise ausgewählt werden.
Eine menschliche Einheitsdosisform der Peptidzusammensetzung ist normalerweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine menschliche Einheitsdosis eines verträglichen Trägers, bevorzugt eines wässrigen Trägers umfasst, eingeschlossen und wird in einem Flüssigkeitsvolumen, das dem Fachmann zur Verwendung zur Verabreichung derartiger Zusammensetzungen an Menschen bekannt ist, verabreicht (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, A. Gennaro, Herausgeber, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985).
Protein(e) der Erfindung und/oder Nukleinsäuren, die das/die Protein(e) kodieren, können auch über Liposomen verabreicht werden, die auch Folgendem dienen können: 1) Abzielen des/der Protein(e) auf ein bestimmtes Gewebe, wie zum Beispiel Lymphgewebe; 2) selektives Abzielen auf erkrankte Zellen; oder 3) Erhöhen der Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung. Liposomen schließen Folgende ein: Emulsionen, Schäume, Mizellen, unlösliche Monoschichten, Flüssigkristalle, Phospholipid-Dispersionen, lamellare Schichten und desgleichen. In diesen Zubereitungen wird das zuzuführende Peptid als Teil eines Liposoms, allein oder in Verbindung mit einem Molekül, das zu einem Rezeptor, der unter Lymphzellen vorherrschend ist, bindet, wie zum Beispiel monoklonale Antikörper, die zum CD45-Antigen binden, oder mit anderen therapeutischen oder immunogenen Zusammensetzungen aufgenommen. Somit können Liposomen, entweder gefüllt oder ausgestaltet mit einem gewünschten Peptid der Erfindung, auf die Stelle von Lymphzellen ausgerichtet sein, wo die Liposomen dann die Peptidzusammensetzungen zuführen. Liposomen zur erfindungsgemäßen Verwendung werden aus normalen Bläschen-bildenden Lipiden gebildet, die allgemein neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterol, wie zum Beispiel Cholesterol, einschließen. Die Auswahl von Lipiden wird allgemein durch folgende Berücksichtigungen geführt: z.B. Liposomgröße, Säurelabilität und Stabilität der Liposomen im Blutstrom. Es ist eine Vielfalt von Verfahren zur Herstellung von Liposomen verfügbar, wie z.B. in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980) und den U.S.-Patenten Nr. 4 235 871, 4 501 728, 4 837 028 und 5 019 369 beschrieben.
Zum Angriff von Zellen des Immunsystems kann ein in das Liposom einzubauender Ligand z. B. Antikörper oder Fragmente davon, die für Zelloberflächendeterminanten der gewünschten Zellen des Immunsystems spezifisch sind, einschließen. Eine Liposomsuspension, die ein Peptid enthält, kann intravenös, lokal, topisch usw. in einer Dosis verabreicht werden, die entsprechend, unter anderem, der Verabreichungsweise, dem zugeführten Peptid und dem Stadium der behandelten Erkrankung variiert.
Für feste Zusammensetzungen können konventionelle nichttoxische, feste Träger verwendet werden, die beispielsweise Folgende in pharmazeutischer Qualität einschließen: Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und desgleichen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch verträgliche, nichttoxische Zusammensetzung durch Einbau eines der normalerweise eingesetzten Hilfstoffe, wie zum Beispiel solche Träger, die zuvor aufgelistet wurden, und allgemein 10-95% Wirkstoff, das heißt ein oder mehrere Peptide der Erfindung, und bevorzugter bei einer Konzentration von 25%-75%, gebildet.
Zur Aerosolverabreichung werden immunogene Peptide bevorzugt in fein verteilter Form zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel und Treibmittel bereitgestellt. Typische Prozentanteile von Peptiden betragen etwa 0,01 Gewichts-%-20 Gewichts-%, bevorzugt etwa 1%-10%. Das oberflächenaktive Mittel muss natürlich nichttoxisch und bevorzugt in dem Treibmittel löslich sein. Vertreter derartiger Agenzien sind die Ester oder teilweisen Ester von Fettsäuren, die von etwa 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie zum Beispiel Capron-, Octan-, Laurin, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Ölester- und Oleinsäuren, mit einem aliphatischen mehrwertigen Alkohol oder seinem cyclischen Anhydrid. Es können gemischte Ester, wie zum Beispiel gemischte oder natürliche Glyceride eingesetzt werden. Das oberflächenaktive Mittel kann etwa 0,1 Gewichts-%-20 Gewichts-% der Zusammensetzung, bevorzugt etwa 0,25-5% ausmachen. Die Differenz der Zusammensetzung ist gewöhnlich Treibmittel. Ein Träger kann, wie gewünscht, auch eingeschlossen sein, wie mit z.B. Lecithin zur intranasalen Zuführung.
XI.) Diagnostische und prognostische Ausführungsformen von 158P1D7.
Wie hierin offenbart, werden 158P1D7-Polynukleotide, -Polypeptide, reaktive cytotoxische T-Zellen (CTL), reaktive Helfer-T-Zellen (HTL) und Anti-Polypeptid-Antikörper in gut bekannten diagnostischen, prognostischen und therapeutischen Assays verwendet, die Zustände untersuchen, die mit dysreguliertem Zellwachstum in Verbindung gebracht werden, wie zum Beispiel Krebs, insbesondere den in Tabelle I aufgelisteten Krebsen (siehe z.B. sowohl die spezifischen Muster von Gewebeexpression als auch die Überexpression in bestimmten Krebsen, wie beispielsweise in Beispiel 4 beschrieben ist).
158P1D7 kann in einer Weise, analog oder ergänzend zur Blasen-assoziierten Antigenkombination, Muzine und CEA, die in einem diagnostischen Kit mit dem Namen ImmunoCyt^TM vertreten sind, verwendet werden. ImmunoCyt a ist ein gewerblich erhältlicher Assay zur Identifizierung und Kontrolle der Gegenwart von Blasenkrebs (siehe Fradet et al., 1997, Can. J. Urol., 4(3):400-405). Es werden auch eine Vielfalt anderer diagnostischer Marker in ähnlichen Zusammenhängen, einschließlich p53 und H-ras verwendet (siehe z.B. Tulchinsky et al., Int. J. Mol. Med. 1999, Jul. 4(1):99-102 und Minimoto et al., Cancer Detect. Prev. 2000, 24(1):1-12). Daher ermöglicht diese Offenbarung der 158P1D7-Polynukleotide und -Polypeptide (sowie der 158P1D7-Polynukleotidsonden und Anti-158P1D7-Antikörper, die zur Identifizierung der Gegenwart dieser Moleküle verwendet werden) und ihrer Eigenschaften dem Fachmann, diese Moleküle in Verfahren zu nutzen, die den in beispielsweise einer Vielfalt von diagnostischen Assays, die auf die Untersuchung der mit Krebs assoziierten Zustände ausgerichtet sind, Verwendeten analog sind.
Typische Ausführungsformen von diagnostischen Verfahren, die die 158P1D7-Polynukleotide, -Polypeptide, -reaktiven T-Zellen und -Antikörper nutzen, sind analog zu den Verfahren von bekannten diagnostischen Assays, die z.B. PSA-Polynukleotide, -Polypeptide, -reaktive T-Zellen und -Antikörper einsetzen. Ebenso wie die PSA-Polynukleotide als Sonden (beispielsweise in der Northern-Analyse, siehe z.B. Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567-74(1994)) und Primer (beispielsweise in der PCR-Analyse, siehe z.B. Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) verwendet werden, um die Gegenwart und/oder die Höhe von PSA-mRNAs in Verfahren zur Kontrolle von PSA-Überexpression oder der Metastase von Prostatakrebsen zu überwachen, können die hierin beschriebenen 158P1D7-Polynukleotide beispielsweise genutzt werden, um 158P1D7-Überexpression oder die Metastase von Blasen- und anderen Krebsen, die dieses Gen exprimieren, nachzuweisen. Ebenso wie die PSA-Polypeptide zur Erzeugung von PSA-spezifischen Antikörpern verwendet werden, die dann zur Überwachung der Gegenwart und/oder der Höhe von PSA-Proteinen in Verfahren zur Kontrolle von PSA-Proteinüberexpression (siehe z.B. Stephan et al., Urology 55(4):560-3 (2000)) oder der Metastase von Prostatazellen (siehe z.B. Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)) verwendet werden, können die hierin beschriebenen 158P1D7-Polypeptide alternativ zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung beim Nachweis von 158P1D7-Überexpression oder der Metastase von Blasenzellen und Zellen anderer Krebse, die dieses Gen exprimieren, genutzt werden.
Da Metastasen die Bewegung von Krebszellen von einem ursprünglichen Organ (wie zum Beispiel Lunge oder Blase usw.) zu einem anderen Gebiet des Körpers (wie zum Beispiel einem Lymphknoten) einschließen, könnnen Assays, die eine biologische Probe auf die Gegenwart von Zellen untersuchen, die 158P1D7-Polynukleotide und/oder -Polypeptide exprimieren, speziell zur Bereitstellung des Nachweises von Metastase verwendet werden. Wenn beispielsweise gefunden wird, dass eine biologische Probe von Gewebe, das normalerweise keine 158P1D7-exprimierenden Zellen enthält (Lymphknoten), 158P1D7-exprimierende Zellen enthält, wie zum Beispiel die in LAPC4- und LAPC9-Xenograften, die aus Lymphknoten bzw. Knochenmetastase isoliert wurden, beobachtete 158P1D7-Expression, zeigt dieses Ergebnis Metastase an.
Alternativ können 158P1D7-Polynukleotide und/oder-Polypeptide zur Bereitstellung des Nachweises von beispielsweise Krebs verwendet werden, wenn gefunden wird, dass Zellen in einer biologischen Probe, die normalerweise 158P1D7 nicht exprimieren oder 158P1D7 in einer anderen Höhe exprimieren, 158P1D7 exprimieren oder eine erhöhte Expression von 158P1D7 zeigen (siehe z.B. die 158P1D7-Expression in den in Tabelle I aufgelisteten Krebsen und in Patientenproben usw., die in den begleitenden Abbildungen gezeigt sind). In derartigen Assays kann der Fachmann weiter die Erzeugung von zusätzlichem Nachweis von Metastase durch Untersuchen der biologischen Probe auf die Gegenwart eines zweiten gewebespezifischen Markers (zusätzlich zu 158P1D7) wünschen, wie zum Beispiel ImmunoCyt^TM, PSCA usw. (siehe z.B. Fradet et al., 1997, Can. J. Urol., 4(3):400-405; Amara et al., 2001, Cancer Res. 61:4660-4665). Ebenso wie PSA-Polynukleotidfragmente und -Polynukleotidvarianten vom Fachmann zur Verwendung in Verfahren zur Kontrolle von PSA eingesetzt werden, werden 158P1D7-Polynukleotidfragmente und -Polynukleotidvarianten auf analoge Weise verwendet. Insbesondere sind typische PSA-Polynukleotide, die in Verfahren zur Kontrolle von PSA verwendet werden, Sonden oder Primer, die aus Fragmenten der PSA-cDNA-Sequenz bestehen. Um dies zu erläutern, müssen zur PCR-Amplifikation eines PSA-Polynukleotids verwendete Primer weniger als die gesamte PSA-Sequenz einschließen, um in der Polymerasekettenreaktion zu funktionieren. Im Zusammenhang mit derartigen PCR-Reaktionen erzeugt der Fachmann allgemein eine Vielfalt von verschiedenen Polynukleotidfragmenten, die als Primer verwendet werden können, um verschiedene Teile eines interessierenden Polynukleotids zu amplifizieren oder Amplifikationsreaktionen zu optimieren (siehe z.B. Caetano-Anolles, G., Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Eine zusätzliche Erläuterung der Verwendung derartiger Fragmente ist in Beispiel 4 bereitgestellt, wo ein 158P1D7-Polynukleotidfragment als eine Sonde verwendet wird, um die Expression von 158P1D7-RNAs in Krebszellen zu zeigen. Außerdem werden Variant-Polynukleotidsequenzen normalerweise als Primer und Sonden für die entsprechenden mRNAs in PCR- und Northern-Analysen verwendet (siehe z.B. Sawai et al., Fetal Diagn. Ther., 1996, Nov.-Dez. 11(6):407-13 und Current Protocols In Molecular Biology, Volume (Band) 2, Unit (Abschnitt) 2, Frederick M. Ausubel et al. Hrsg., 1995)). Polynukleotidfragmente und -varianten sind in diesem Zusammenhang, wo sie zur Bindung zu einer Zielpolynukleotidsequenz (z.B. das in SEQ-ID.-NR.: 655 dargestellte 158P1D7-Polynukleotid) unter Bedingungen von hoher Stringenz fähig sind, nützlich.
Darüber hinaus werden PSA-Polypeptide, die ein Epitop enthalten, das von einem Antikörper oder einer T-Zelle, der/die spezifisch zu diesem Epitop bindet, erkannt werden kann, in Verfahren zur Kontrolle von PSA verwendet. 158P1D7-Polypeptidfragmente und -Polypeptidanaloga oder -varianten können auf analoge Weise auch verwendet werden. Diese Praktik der Verwendung von Polypeptidfragmenten oder Polypeptidvarianten zur Erzeugung von Antikörpern (wie zum Beispiel Anti-PSA-Antikörpern oder T-Zellen) ist in der Technik mit einer breiten Vielfalt von Systemen, wie zum Beispiel Fusionsproteinen, die vom Fachmann verwendet werden, typisch (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Volume (Band) 2, Unit (Abschnitt) 16, Frederick M. Ausubel et al. Hrsg., 1995). In diesem Zusammenhang wirkt/wirken jedes Epitop/Epitope, um die Architektur, mit der ein Antikörper oder eine T-Zelle reaktiv ist, bereitzustellen. Normalerweise erzeugt der Fachmann eine Vielfalt von verschiedenen Polypeptidfragmenten, die verwendet werden können, um Immunantworten, die für verschiedene Teile eines interessierenden Polypeptids spezifisch sind, zu erzeugen (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5 840 501 und U.S.-Patent Nr. 5 939 533). Es kann beispielsweise bevorzugt sein, ein Polypeptid zu nutzen, das eins der hierin diskutierten, biologischen 158P1D7-Motive oder eine Motiv-tragende Subsequenz umfasst, die von dem Fachmann, basierend auf in der Technik verfügbaren Motiven, leicht identifiziert wird. Polypeptidfragmente, -varianten oder -analoga sind normalerweise in diesem Zusammenhang nützlich, solange sie ein Epitop umfassen, das zur Erzeugung eines Antikörpers oder einer T-Zelle, der/die für eine Zielpolypeptidsequenz (z.B. des in SEQ-ID.-NR.: 657 dargestellten 158P1D7-Polypeptids) spezifisch ist, fähig ist.
Wie hierin dargestellt, zeigen die 158P1D7-Polynukleotide und -Polypeptide (sowie die 158P1D7-Polynukleotidsonden und Anti-158P1D7-Antikörper oder T-Zellen, die zur Identifizierung der Gegenwart dieser Moleküle verwendet werden) spezifische Eigenschaften, die diese bei der Diagnose von Krebsen, wie zum Beispiel den in Tabelle I Aufgelisteten, nützlich machen. Diagnostische Assays, die die Gegenwart von 158P1D7-Genprodukten messen, um die Gegenwart oder den Ausbruch eines hierin beschriebenen Erkrankungszustands, wie zum Beispiel Blasenkrebs, zu beurteilen, werden zur Identifizierung von Patienten für präventive Maßnahmen oder für die weitere Kontrolle verwendet, wie es so erfolgreich mit PSA zur Kontrolle von Prostatakrebs erfolgte. Stoffe, wie zum Beispiel 158P1D7-Polynukleotide und -Polypeptide (sowie die 158P1D7-Polynukleotidsonden und Anti-158P1D7-Antikörper, die zur Identifizierung der Gegenwart dieser Moleküle verwendet werden) befriedigen einen Bedarf in der Technik für Moleküle mit ähnlichen oder komplementären Charakteristika zu PSA in Situationen von Blasenkrebs. Schließlich haben die hierin offenbarten 158P1D7-Polynukleotide, außer ihrer Verwendung in diagnostischen Assays, etliche andere Nutzwerte, wie zum Beispiel ihre Verwendung bei der Identifizierung von onkogenetischen assoziierten, chromosomalen Abnormalitäten in der chromosomalen Region, zu der das 158P1D7-Gen kartiert ist (siehe Beispiel 3 nachstehend). Außerdem haben die hierin offenbarten 158P1D7-ähnlichen Proteine und -Polynukleotide, außer ihrer Verwendung in diagnostischen Assays, andere Nutzwerte, wie zum Beispiel ihre Verwendung bei der forensischen Analyse von Geweben unbekannten Ursprungs (siehe z.B. Takahama K., Forensic Sci. Int. 1996, Jun. 28;80(1-2): 63-9).
Zusätzlich können 158P1D7-ähnliche Proteine oder -Polynukleotide der Erfindung zur Behandlung eines pathologischen Zustands, der durch die Überexpression von 158P1D7 gekennzeichnet ist, verwendet werden. Beispielsweise können die Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz von 2 oder 3 oder Fragmente von beiden zur Erzeugung einer Immunantwort auf das 158P1D7-Antigen verwendet werden. Antikörper oder andere Moleküle, die mit 158P1D7 reagieren, können zur Modulation der Funktion dieses Moleküls verwendet werden und dadurch einen therapeutischen Nutzen bereitstellen.
XII.) Inhibierung von 158P1D7-Proteinfunktion
Die Erfindung schließt verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung der Bindung von 158P1D7 zu seinen Bindungspartnern oder seiner Verbindung mit einem anderen Proteinen) sowie Verfahren zur Inhibierung der 158P1D7-Funktion ein.
XII.A.) Inhibierung von 158P1D7 mit intrazellulären Antikörpern
In einem Ansatz wird ein rekombinanter Vektor, der Einzelketten-Antikörper, die spezifisch zu 158P1D7 binden, kodiert, in 158P1D7-exprimierende Zellen durch Gentransfer-Technologien eingeführt. Entsprechend wird der kodierte Einzelketten- Anti-158P1D7-Antikörper intrazellulär exprimiert, bindet zum 158P1D7-Protein und inhibiert dadurch seine Funktion. Verfahren zur Konstruktion derartiger intrazellulärer Einzelketten-Antikörper sind gut bekannt. Derartige intrazelluläre Antikörper, die auch als „Intrabodies" bekannt sind, sind spezifisch auf ein bestimmtes Kompartiment innerhalb der Zelle ausgerichtet, wobei Kontrolle darüber bereitgestellt wird, worauf die inhibitorische Aktivität der Behandlung gerichtet ist. Diese Technologie wurde in der Technik erfolgreich angewendet (siehe zur Übersicht Richardson und Marasco, 1995, TIBTECH vol. (Bd.) 13). Es wurde gezeigt, dass Intrabodies die Expression von ansonsten reichlichen Rezeptoren der Zelloberfläche geradezu ausschalten (siehe z.B. Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337).
Einzelketten-Antikörper umfassen die variablen Domänen der schweren und leichten Kette, die durch ein flexibles verknüpfendes Polypeptid verbunden sind, und werden als ein einzelnes Polypeptid exprimiert. Gegebenenfalls werden Einzelketten-Antikörper als ein Einzelketten-Fragment der variablen Region, das mit der konstanten Region der leichten Kette verbunden ist, exprimiert. Es werden bekannte intrazelluläre Trafficking-Signale in rekombinante Polynukleotidvektoren, die derartige Einzelketten-Antikörper kodieren, konstruiert, damit der Intrabody genau auf das gewünschte intrazelluläre Kompartiment ausgerichtet ist. Beispielsweise werden Intrabodies, die auf das endoplasmatische Reticulum (ER) ausgerichtet sind, zum Einbau eines Leitpeptids und gegebenenfalls eines C-terminalen ER-Retentionssignals, wie zum Beispiel des KDEL-Aminosäuremotivs, konstruiert. Intrabodies, die im Kern Aktivität ausüben sollen, werden zum Einschluss eines nukleären Lokalisationssignals konstruiert. Lipideinheiten werden mit Intrabodies verbunden, um den Intrabody an die zytosolische Seite der Plasmamembran anzubinden. Intrabodies können auch ausgerichtet werden, um Funktion im Zytosol auszuüben. Beispielsweise werden zytosolische Intrabodies zur Sekretion von Faktoren innerhalb des Zytosols verwendet, wodurch verhindert wird, dass diese zu ihrem natürlichen zellulären Bestimmungsort transportiert werden.
In einer Ausführungsform werden Intrabodies zum Abfangen von 158P1D7 im Kern verwendet, wodurch seine Aktivität im Kern verhindert wird. Nukleäre ausgerichtete Signale werden in derartige 158P1D7-Intrabodies eingebaut, um den gewünschten Angriff zu erzielen. Derartige 158P1D7-Intrabodies werden zur spezifischen Bindung zu einer bestimmten 158P1D7-Domäne entwickelt. In einer weiteren Ausführungsform werden zytosolische Intrabodies, die spezifisch zum 158P1D7-Protein binden, verwendet, um zu verhindern, dass 158P1D7 Zugang zum Kern erhält, wodurch verhindert wird, dass es irgendeine biologische Aktivität innerhalb des Kerns ausübt (z.B. wird verhindert, dass 158P1D7 Transkriptionskomplexe mit anderen Faktoren bildet).
Um die Expression derartiger Intrabodies spezifisch auf bestimmte Zellen zu lenken, wird die Transkription des Intrabodys unter die regulatorische Kontrolle eines geeigneten tumorspezifischen Promotors und/oder Enhancers gestellt. Um die Expression von Intrabody spezifisch auf beispielsweise die Blase auszurichten, kann der PSCA-Promotor und/oder -Promotor/Enhancer genutzt werden (siehe beispielsweise U.S.-Patent Nr. 5 919 652, ausgestellt am 6. Juli 1999, und Lin et al. PNAS, USA 92(3):679-683 (1995)).
XII.B.) Inhibierung von 158P1D7 mit rekombinanten Proteinen
In einem weiteren Ansatz binden rekombinante Moleküle zu 158P1D7 und inhibieren dadurch die 158P1D7-Funktion. Beispielsweise hindern oder inhibieren diese rekombinanten Moleküle 158P1D7, sodass es keinen Zugang/keine Bindung zu seinem/n Bindungspartner(n) oder keine Verbindung mit einem anderen Proteinen) hat. Derartige rekombinante Moleküle können beispielsweise den/die reaktiven Teil(e) eines 158P1D7-spezifischen Antikörpermoleküls enthalten. In einer bestimmten Ausführungsform wird die 158P1D7-bindende Domäne eines 158P1D7-Bindungspartners in ein dimeres Fusionsprotein eingebaut, wodurch das Fusionsprotein zwei 158P1D7-Ligand-bindende Domänen umfasst, die mit dem Fc-Teil eines menschlichen IgG, wie zum Beispiel eines menschlichen IgG1, verknüpft sind. Derartige IgG-Teile können beispielsweise die C_H2- und C_H3-Domänen und die Gelenkregion enthalten, doch nicht die C_H1-Domäne. Derartige dimere Fusionsproteine werden in löslicher Form an Patienten, die an einem Krebs leiden, der mit der Expression von 158P1D7 in Verbindung gebracht wird, verabreicht, wodurch das dimere Fusionsprotein spezifisch zu 158P1D7 bindet und 158P1D7-Wechselwirkung mit einem Bindungspartner blockiert. Derartige dimere Fusionsproteine werden weiter zu multimeren Proteinen, unter Verwendung von bekannten Technologien zur Verknüpfung von Antikörpern, zusammengefasst.
XII.C.) Inhibierung von 158P1D7-Transkription oder -Translation
Die vorliegende Erfindung umfasst auch verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung der Transkription des 158P1D7-Gens. Ähnlich stellt die Erfindung auch Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung der Translation von 158P1D7-mRNA zum Protein bereit.
In einem Ansatz umfasst ein Verfahren zur Inhibierung der Transkription des 158P1D7-Gens das Inkontaktbringen des 158P1D7-Gens mit einem 158P1D7-Antisense-Polynukleotid. In einem weiteren Ansatz umfasst ein Verfahren zur Inhibierung der 158P1D7-mRNA-Translation das Inkontaktbringen der 158P1D7-mRNA mit einem Antisense-Polynukleotid. In einem weiteren Ansatz wird ein 158P1D7-spezifisches Ribozym zur Spaltung der 158P1D7-Information verwendet, wodurch die Translation inhibiert wird. Derartige Antisense- und Ribozym-basierte Verfahren können auch auf die regulatorischen Regionen des 158P1D7-Gens ausgerichtet sein, wie zum Beispiel die 158P1D7-Promotor- und/oder -Enhancer-Elemente. Ähnlich werden Proteine, die zur Inhibierung eines 158P1D7-Gentranskriptionsfaktors fähig sind, zur Inhibierung der 158P1D7-mRNA-Transkription verwendet. Die verschiedenen Polynukleotide und Zusammensetzungen, die in den vorstehend erwähnten Verfahren nützlich sind, wurden vorstehend beschrieben. Die Verwendung von Antisense- und Ribozymmolekülen zur Inhibierung von Transkription und Translation ist in der Technik gut bekannt.
Andere Faktoren, die die Transkription von 158P1D7 durch Stören der 158P1D7-transkriptionalen Aktivierung inhibieren, sind auch zur Behandlung von 158P1D7-exprimierenden Krebsen nützlich. Ähnlich sind Faktoren, die die Abwicklung von 158P1D7 stören, bei der Behandlung von 158P1D7-exprimierenden Krebsen nützlich. Verfahren zur Krebsbehandlung, die derartige Faktoren nutzen, sind auch im Rahmen der Erfindung.
XII.D.) Allgemeine Betrachtungen für therapeutische Strategien
Gentransfer- und Gentherapie-Technologien können zur Zuführung von therapeutischen Polynukleotidmolekülen zu Tumorzellen, die 158P1D7 synthetisieren, verwendet werden (d.h. Antisense-, Ribozym-, Intrabodies-kodierende Polynukleotide und andere 158P1D7-inhibitorische Moleküle). Es sind etliche Gentherapieansätze in der Technik bekannt. Rekombinante Vektoren, die 158P1D7-Antisense-Polynukleotide, Ribozyme, Faktoren, die zur Störung der 158P1D7- Transkription fähig sind, und so weiter kodieren, können den Zieltumorzellen unter Verwendung derartiger Gentherapieansätze zugeführt werden.
Die vorstehenden therapeutischen Ansätze können mit einem aus der großen Vielfalt von operativen, Chemotherapie- oder Bestrahlungstherapie-Regimen kombiniert werden. Die therapeutischen Ansätze der Erfindung können die Verwendung von verringerten Dosierungen von Chemotherapie (oder anderen Therapien) und/oder weniger häufiger Verabreichung ermöglichen, ein Vorteil für alle Patienten und besonders für solche, die die Toxizität des Chemotherapeutikums nicht gut vertragen.
Die Antitumoraktivität einer bestimmten Zusammensetzung (z.B. Antisense-, Ribozym-, Intrabody-) oder einer Kombination von derartigen Zusammensetzungen kann unter Verwendung von verschiedenen in-vitro- und in-vivo-Assaysystemen beurteilt werten. In-vitro-Assays, die die therapeutische Aktivität beurteilen, schließen Folgende ein: Zellwachstums-Assays, Soft-Agar-Assays und andere Assays, die Tumorpromotionsaktivität anzeigen, Bindungs-Assays, die zur Bestimmung des Ausmaßes, zu dem eine therapeutische Zusammensetzung die Bindung von 158P1D7 zu einem Bindungspartner inhibieren wird, fähig sind, usw.
In vivo kann die Wirkung einer 158P1D7-therapeutischen Zusammensetzung in einem geeigneten Tiermodell beurteilt werden. Beispielsweise können xenogene Blasenkrebsmodelle verwendet werden, worin menschliche Blasenkrebsexplantate oder passagierte Xenograftgewebe in immunsupprimierte Tiere, wie zum Beispiel Nackt- oder SCID-Mäuse, eingeführt werden (Shibayama et al., 1991, J. Urol., 146(4):1136-7; Beecken et al., 2000, Urology, 56(3):521-526). Die Wirksamkeit kann unter Verwendung von Assays, die die Inhibierung von Tumorbildung, Tumorregression oder Metastase und desgleichen messen, vorausgesagt werden.
In-vivo-Assays, die die Promotion von Apoptose beurteilen, sind bei der Beurteilung von therapeutischen Zusammensetzungen nützlich. In einer Ausführungsform können Xenografte von Tumor-tragenden Mäusen, die mit der therapeutischen Zusammensetzung behandelt wurden, auf die Gegenwart von apoptotischen Foci untersucht und mit unbehandelten Xenograft-tragenden Kontrollmäusen verglichen werden. Das Ausmaß, zu dem apaptotische Foci in den Tumoren der behandelten Mäuse gefunden werden, liefert einen Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit der Zusammensetzung.
Die in der praktischen Ausführung der vorhergehenden Verfahren verwendeten therapeutischen Zusammensetzungen können in pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Träger umfassen, der für das gewünschte Zuführungsverfahren geeignet ist, formuliert werden. Geeignete Träger schließen jedweden Stoff ein, der in Kombination mit der therapeutischen Zusammensetzung die Antitumorfunktion der therapeutischen Zusammensetzung bewahrt und mit dem Immunsystem des Patienten allgemein unreaktiv ist. Beispiele schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: irgendeine Anzahl an normalen pharmazeutischen Trägern, wie zum Beispiel sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, bakteriostatisches Wasser und desgleichen (siehe allgemein Remington's Pharmaceutical Sciences 16. Ausgabe, A. Osal., Hrsg., 1980).
Therapeutische Formulierungen können gelöst und über irgendeinen Weg, der zur Zuführung der therapeutischen Zusammensetzung zur Tumorstelle fähig ist, verabreicht werden. Potenziell wirksame Verabreichungswege schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: intravenös, parenteral, intraperitoneal, intramuskulär, intratumoral, intradermal, intraorganisch, orthotopisch und desgleichen. Eine bevorzugte Formulierung zur intravenösen Injektion umfasst die therapeutische Zusammensetzung in einer Lösung von konserviertem bakteriostatischem Wasser, sterilem nichtkonserviertem Wasser und/oder verdünnt in Polyvinylchlorid- oder Polyethylen-Beuteln, die 0,9% steriles Natriumchlorid zur Injektion, USP, enthalten. Therapeutische Proteinzubereitungen können lyophilisert und als sterile Pulver, bevorzugt unter Vakuum, aufbewahrt und dann vor der Injektion in bakteriostatischem Wasser (das beispielsweise Benzylalkohol-Konservierungsmittel enthält) oder in sterilem Wasser wieder eingesetzt werden.
Dosierungen und Verabreichungsprotokolle für die Behandlung von Krebsen unter Verwendung der vorhergehenden Verfahren werden mit dem Verfahren und dem Zielkrebs variieren und werden allgemein von etlichen anderen, in der Technik anerkannten Faktoren abhängen.
XIII.) KITS
Zur Verwendung bei hierin beschriebenen, diagnostischen und therapeutischen Anwendungen sind Kits auch im Rahmen der Erfindung. Derartige Kits können einen Träger, Verpackung oder Behälter umfassen, der aufgeteilt ist, um einen oder mehrere Behälter, wie zum Beispiel Gefäße, Röhrchen und desgleichen, aufzunehmen, wobei jeder (der) Behälter eins der einzelnen, im Verfahren zu verwendenden Elemente umfasst. Beispielsweise kann/können der/die Behälter eine Sonde umfassen, die nachweisbar markiert ist oder werden kann. Eine derartige Sonde kann ein Antikörper oder Polynukleotid sein, der/das für ein 158P1D7-ähnliches Protein bzw. ein 158P1D7-Gen oder -Information spezifisch ist. Wo das Verfahren Nukleinsäure-Hybridisierung zum Nachweis der Zielnukleinsäure nutzt, kann der Kit auch Behälter, die Nukleotid(e) zur Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz enthalten, und/oder einen Behälter, der ein Reporter-Mittel umfasst, wie zum Beispiel ein Biotinbindendes Protein, wie zum Beispiel Avidin oder Streptavidin, das zu einem Reporter-Molekül gebunden ist, wie zum Beispiel einer enzymatischen, fluoreszierenden oder radioisotopen Markierung, aufweisen. Der Kit kann alles oder Teil der Aminosäuresequenz von 2 oder 3 oder Analoga davon oder ein Nukleinsäuremolekül, das derartige Aminosäuresequenzen kodiert, einschließen.
Der Kit der Erfindung wird normalerweise den vorstehend beschriebenen Behälter und einen anderen oder mehrere andere Behälter umfassen, der/die Stoffe umfasst/umfassen, die aus gewerblicher und Sicht des Anwenders wünschenswert sind, einschließlich Puffern, Verdünnungsmitteln, Filtern, Kanülen, Spritzen und Verpackungseinsätzen mit Gebrauchsanweisung.
Am Behälter kann eine Aufschrift angebracht sein, um anzuzeigen, dass die Zusammensetzung für eine spezifische Therapie oder eine nicht-therapeutische Anwendung verwendet wird, und diese kann auch Anleitungen für entweder in-vivo- oder in-vitro-Verwendung, wie solche vorstehend beschriebenen, angeben. Anleitungen oder andere Informationen können auch auf einer Aufschrift oder auf einem Einsatz, der mit dem Kit eingeschlossen ist, eingeschlossen sein.
BEISPIELE
Es werden verschiedene Aspekte der Erfindung durch mehrere folgende Beispiele, von denen keins den Rahmen der Erfindung beschränken soll, weiter beschrieben und erläutert.
Beispiel 1: SSH-Durchgeführte Isolierung eines cDNA-Fragments des 158P1D7-Gens
Zur Isolierung von Genen, die im Blasenkrebs überexprimiert werden, verwendeten wir die Methode der subtraktiven Suppressions-Hybridisierung (SSH – Suppression Subtractive Hybridization) unter Verwendung von cDNA, die aus Blasenkrebsgewebe stammte, einschließlich invasiven transitionalen Zellkarzinoms. Die 158P1D7-SSH-cDNA-Sequenz wurde aus einem Blasenkrebs-Pool minus des Abzugs von normaler Blasen-cDNA hergeleitet. Im Treiber waren auch cDNAs eingeschlossen, die von 9 anderen normalen Geweben stammten. Es wurde bestimmt, dass die 158P1D7-cDNA in dem Blasenkrebsgewebe-Pool hoch exprimiert ist, wobei in einer begrenzten Reihe von normalen Geweben eine niedrigere Expression beobachtet wurde.
Die SSH-DNA-Sequenz von 231 bp (1) weist eine hohe Homologie (230/231 Identität) zu einem hypothetischen Protein FLJ22774 (GenBank-Zugang XM_033183), das von einem Chromosom-13-genomischen Klon abgeleitet wurde, auf. Ein 158P1D7-cDNA-Klon (TurboScript3PX) von 2 555 bp wurde aus Blasenkrebs-cDNA isoliert, was einen ORF von 841 Aminosäuren erkennen ließ (2 und 3).
Das 158P1D7-Protein hat eine Signalsequenz und eine Transmembrandomäne und es wird unter Verwendung des PSORT-I-Programms (URL psort.nibb.ac.jp:8800/form.html) vorausgesagt, dass es an der Zelloberfläche lokalisiert ist. Die Aminosäuresequenzanalyse von 158P1D7 zeigt 100% Identität über die Region von 798 Aminosäuren zu einem menschlichen hypothetischen Protein FLJ22774 (GenBank-Zugang XP_033182, 4).
Materialien und Methoden
Menschliche Gewebe:
Die Blasenkrebsgewebe von Patienten wurden von mehreren Quellen erworben, wie zum Beispiel vom NDRI (Philadelphia, PA). Die mRNA für einige normale Gewebe wurde von Clontech, Palo Alto, CA, erworben.
RNA-Isolierung:
Die Gewebe wurden in Trizol-Reagenz (Life Technologies, Gibco BRL) unter Verwendung von 10 ml/g Gesamt-RNA des Gewebeisolats homogenisiert. Poly-A- RNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von Qiagen's Oligotex mRNA Mini- und -Midi-Kits aufgereinigt. Gesamt- und mRNA wurden durch spektrophotometrische Analyse (O.D. 260/280 nm) quantifiziert und durch Gelelektrophorese analysiert.
Oligonukleotide:
Es wurden die folgenden HPLC-gereinigten Oligonukleotide verwendet.
DPNCDN (cDNA-Syntheseprimer):

5'TTTTGATCAAGCTT₃₀3' (SEQ-ID.-NR.: 661)

Adapter 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEQ-ID.-NR.: 662)
3'GGCCCGTCCTAG5' (SEQ-ID.-NR.: 663)

Adapter 2:

5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3'(SEQ-ID.-NR.: 664)
3'CGGCTCCTAG5' (SEQ-ID.-NR.: 665)

PCR-Primer 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEQ-ID.-NR.: 666)

Geschachtelter Primer (NP) 1:

5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEQ-ID.-NR.: 667)

Geschachtelter Primer (NP)2:

5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (SEQ-ID.-NR.: 668)

Subtraktive Suppressions-Hybridisierung:
Subtraktive Suppressions-Hybridisierung (SSH) wurde zur Identifizierung von cDNAs verwendet, die den Genen entsprechen, die in Blasenkrebs unterschiedlich exprimiert werden könnten. Die SSH-Reaktion nutzte cDNA aus Blasenkrebs- und normalen Geweben.
Die 158P1D7-Gensequenz wurde aus einem Blasenkrebs-Pool minus des Abzugs von normaler Blasen-cDNA hergeleitet. Die SSH-DNA-Sequenz (1) wurde identifiziert.
Die cDNA, die aus dem Pool von normalen Blasengeweben stammte, wurde als die Quelle der „Driver"-cDNA verwendet, während die cDNA aus einem Pool von Blasenkrebsgeweben als die Quelle der „Tester"-cDNA verwendet wurde. Doppelsträngige cDNAs, die den Tester- und Driver-cDNAs entsprechen, wurden aus 2 μg Poly(A)⁺-RNA, die aus dem relevanten Xenograftgewebe isoliert wurde, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung des CLONTECH's PCR-Select cDNA Substraction Kits und 1 ng Oligonukleotid DPNCDN als Primer synthetisiert. First- und Second-Strand-Synthese wurde, wie im Protokoll des Anwenderhandbuchs des Kits beschrieben, ausgeführt (CLONTECH Protokoll Nr. PT1117-1, Katalog-Nr. K1804-1). Die entstehende cDNA wurde mit Dpn II für 3 Std. bei 37 °C verdaut. Verdaute cDNA wurde mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.
Driver-cDNA wurde durch Vereinigen in einem 1:1-Verhältnis von Dpn II-verdauter cDNA aus der relevanten Gewebequelle (siehe vorstehend) mit einem Gemisch von verdauten cDNAs, die aus den neun normalen Geweben stammen: Magen, Skelettmuskulatur, Lunge, Gehirn, Leber, Niere, Pankreas, Dünndarm und Herz, erzeugt.
Tester-cDNA wurde durch Verdünnen von 1 μl von Dpn II-verdauter cDNA aus der relevanten Gewebequelle (siehe vorstehend) (400 ng) in 5 μl Wasser erzeugt. Die verdünnte cDNA (2 μl, 160 ng) wurde dann mit 2 μl von Adapter 1 und Adapter 2 (10 μM) in getrennten Ligationsreaktionen in einem gesamten Volumen von 10 μl bei 16 °C über Nacht unter Verwendung von 400 u von T4-DNA-Ligase (CLONTECH) ligiert. Die Ligation wurde mit 1 μl von 0,2 M EDTA und Erhitzen bei 72 °C für 5 min beendet.
Die erste Hybridisierung wurde durch Zugabe von 1,5 μl (600 ng) von Driver-cDNA zu jedem von zwei Röhrchen, die 1,5 μl (20 ng) Adapter-1- und Adapter-2-ligierte Tester-cDNA enthielten, durchgeführt. In einem Endvolumen von 4 μl wurden die Proben mit Mineralöl überschichtet, in einem MJ Research Thermal Cycler bei 98 °C für 1,5 Minuten denaturiert und dann für 8 Std. bei 68 °C hybridiseren gelassen. Die zwei Hybridisierungen wurden dann mit einem zusätzlichen 1 μl von frisch denaturierter Driver-cDNA zusammengemischt und über Nacht bei 68 °C hybridisieren gelassen. Die zweite Hybridisierung wurde dann in 200 μl von 20 mM Hepes, pH 8,3, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA verdünnt, bei 70 °C für 7 min erhitzt und bei –20 °C aufbewahrt.
PCR-Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von durch SSH erzeugten Genfragmenten:
Zum Amplifizieren von Genfragmenten, die aus SSH-Reaktionen resultieren, wurden zwei PCR-Amplifikationen durchgeführt. In der primären PCR-Reaktion wurde 1 μl des verdünnten endgültigen Hybridisierungsgemischs zu 1 μl PCR-Primer 1 (10 μM), 0,5 μl dNTP-Gemisch (10 μM), 2,5 μl 10 × Reaktionspuffer (CLONTECH) und 0,5 μl 50 × Advantage cDNA Polymerase Mix (CLONTECH) in einem Endvolumen von 25 μl gegeben. PCR 1 wurde unter Verwendung der folgenden Bedingungen ausgeführt: 75 °C für 5 Min., 94 °C für 25 Sek., dann 27 Zyklen von 94 °C für 10 Sek., 66 °C für 30 Sek., 72 °C für 1,5 Min. Es wurden fünf separate primäre PCR-Reaktionen für jedes Experiment durchgeführt. Die Produkte wurden vereinigt und 1:10 mit Wasser verdünnt. Für die sekundäre PCR-Reaktion wurde 1 μl aus der vereinigten und verdünnten primären PCR-Reaktion zu dem gleichen Reaktionsgemisch gegeben, das für PCR 1 verwendet wurde, außer dass Primer NP1 und NP2 (10 μM) anstelle von PCR-Primer 1 verwendet wurden. PCR 2 wurde unter Verwendung von 10-12 Zyklen von 94 °C für 10 Sek., 68 °C für 30 Sek. und 72 °C für 1,5 Minuten ausgeführt. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von 2%-Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Die PCR-Produkte wurden in pCR2.1 unter Verwendung des T/A Vector Cloning Kits (Invitrogen) insertiert. Transformierte E. coli wurden der Blau/Weiß- und Ampicillin-Selektion unterzogen. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und in 96-Well-Platten angeordnet und in flüssiger Kultur über Nacht wachsen gelassen. Zur Identifizierung der Inserts wurde PCR-Amplifikation an 1 ml bakterieller Kultur unter Verwendung der Bedingungen von PCR1 und NP1 und NP2 als Primer ausgeführt. PCR-Produkte wurden unter Verwendung von 2%-Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Bakterielle Klone wurden in 20% Glycerol in einem 96-Well-Format aufbewahrt. Plasmid-DNA wurde zubereitet, sequenziert und der Suche nach Nukleinsäurehomologie der GenBank-, dBest- und NCI-CGAP-Datenbanken unterzogen.
RT-PCR-Expressionsanalyse:
First-Strand-cDNAs können aus 1 μg mRNA mit oligo-(dT)12-18-Primieren unter Verwendung des Gibco-BRL Superscript Preamplification Systems erzeugt werden. Es wurde das Protokoll des Herstellers verwendet, das eine Inkubation für 50 min bei 42 °C mit reverser Transkriptase, gefolgt von RNAse-H-Behandlung bei 37 °C für 20 min einschloss. Nach vollständiger Reaktion kann das Volumen auf 200 μl mit Wasser vor der Normalisierung erhöht werden. First-Strand-cDNAs aus 16 unterschiedlichen normalen, menschlichen Geweben können von Clontech erhalten werden.
Die Normalisierung der First-Strand-cDNAs aus mehrfachen Geweben wurde unter Verwendung der Primer 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (SEQ-ID.-NR.: 669) und 5'agccacacgcagctcattgtagaagg3' (SEQ-ID.-NR.: 670) zur Amplifkation von β-Aktin ausgeführt. First-Strand-cDNA (5 μl) wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das 0,4 μM Primer, 0,2 μM von jedem dNTP, 1 × PCR-Puffer (Clontech, 10 mM Tris-HCL, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, pH 8,3) und 1 × Klentaq DNA-Polymerase (Clontech) enthielt, amplifiziert. Fünf μl der PCR-Reaktion können bei 18, 20 und 22 Zyklen entnommen und zur Agarose-Gelelektrophorese verwendet werden. PCR wurde unter Verwendung eines MJ Research Thermal Cycler unter den folgenden Bedingungen ausgeführt: Anfängliche Denaturierung kann bei 94 °C für 15 Sek. erfolgen, gefolgt von 18, 20 und 22 Zyklen von 94 °C für 15, 65 °C für 2 min, 72 °C für 5 Sek. Eine letzte Extension bei 72 °C wurde für 2 min durchgeführt. Nach Agarose-Gelelektrophorese wurden die Bandenintensitäten der β-Aktiv-Banden bei 283 bp aus mehrfachen Geweben durch visuelle Prüfung verglichen.
Verdünnungsfaktoren für die First-Strand-cDNAs wurden berechnet, um zu gleichen Bandenintensitäten von β-Aktiv in allen Geweben nach 22 Zyklen von PCR zu gelangen. Drei Runden von Normalisierung können erforderlich sein, um gleiche Bandenintensitäten in allen Geweben nach 22 Zyklen von PCR zu erhalten.
Zur Bestimmung der Expressionsniveaus des 158P1D7-Gens wurden 5 μl normalisierte First-Strand-cDNA durch PCR unter Verwendung von 26 und 30 Zyklen von Amplifikation analysiert. Eine halbquantitative Expressionsanalyse kann durch Vergleich der PCR-Produkte bei Zyklenzahlen, die Intensitäten von hellen Banden ergeben, erreicht werden. Die zur RT-PCR verwendeten Primer wurden unter Verwendung der 158P1D7-SSH-Sequenz entwickelt und sind nachstehend aufgelistet:
158P1D7.1
5' ATAAGCTTTCAATGTTGCGCTCCT 3' (SEQ-ID.-NR.: 671)
158P1D7.2
5' TGTCAACTAAGACCACGTCCATTC 3' (SEQ-ID.-NR.: 672)
Eine typische RT-PCR-Expressionsanalyse ist in 6 dargestellt. RT-PCR-Expressionsanalyse wurde an First-Strand-cDNAs, die unter Verwendung von Gewebe-Pools aus mehrfachen Proben erzeugt wurden, ausgeführt. Es wurde gezeigt, dass die cDNAs unter Verwendung von Beta-Aktin-PCR normalisiert wurden. Es wurde Expression von 158P1D7 im Blasenkrebs-Pool beobachtet.
Beispiel 2: Klonierung der vollständigen Länge von 158P1D7
Die 158P1D7-SSH-cDNA-Sequenz wurde aus einem Blasenkrebs-Pool minus des Abzugs von normaler Blasen-cDNA abgeleitet. Die SSH-cDNA-Sequenz (1) wurde als 158P1D7 bezeichnet. Der cDNA-Klon vollständiger Länge 158P1D7-Klon TurboScript3PX (2) wurde aus Blasenkrebs-Pool-cDNA kloniert.
158P1D7-Klon-cDNA wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 22. August 2001 bei der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) als Plasmid p158P1D7-Turbo/3PX hinterlegt und es wurde die Accession No. (Zugangsnr.) (Docket #) zugeteilt.
Beispiel 3: Chromosomales Mapping von 158P1D7
Chromosomale Lokalisation kann Gene in der Erkrankungspathogenese einschließen. Es sind mehrere Ansätze zum Chromosomen-Mapping verfügbar, einschließlich fluoreszierende in-situ-Hybridisierung (FISH), Mensch/Hamster-Radiation-Hybrid (RH)-Panels (Walter et al., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville Al), somatische Cell-Hybrid-Panels (Hybridzelllinienkonstrukte) von Mensch-Nager, wie sie vom Coriell Institute (Camden, New Jersey) erhältlich sind, und Genomic Viewers unter Nutzung von BLAST-Homologien zu sequenzierten und kartierten genomischen Klonen (NCBI, Bethesda, Maryland).
158P1D7 ist auf Chromosom 13, unter Verwendung der 158P1D7-Sequenz und des NCBI-BLAST-Werkzeugs (http://www ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs), kartiert. Dies ist eine Region von häufiger Amplifikation im Blasenkrebs (Prat et al., Urology 2001 Mai; 57(5):986-92; Muscheck et al., Carcinogenesis 2000, Sep. 21(9):1721-26) und wird mit schneller Proliferation der Tumorzellen bei fortgeschrittenem Blasenkrebs in Verbindung gebracht (Tomovska et al., Int. J. Oncol. 2001, Jun. 18(6):1239-44).
Beispiel 4: Expressionsanalyse von 158P1D7 in normalen Geweben und Patientenproben
Die Analyse von 158P1D7 durch RT-PCR ist in 6 dargestellt. Starke Expression von 158P1D7 wird im Blasenkrebs-Pool und Brustkrebs-Pool beobachtet. Niedrigere Expressionsniveaus werden in VP1, VP2, Xenograft-Pool, Prostatakrebs-Pool, Kolonkrebs-Pool, Lungenkrebs-Pool, Eierstockkrebs-Pool und Metastase-Pool beobachtet.
Umfangreiche Northern-Blot-Analyse von 158P1D7 in 16 menschlichen normalen Geweben bestätigt die durch RT-PCR beobachtete Expression (7). Es werden zwei Transkripte von ungefähr 4,6 und 4,2 kb in der Prostata und, zu niedrigeren Niveaus, im Herzen, in der Plazenta, Leber, im Dünndarm und Kolon nachgewiesen.
Northern-Blot-Analyse von Patiententumorproben zeigt Expression von 158P1D7 in den meisten getesteten Blasentumorgeweben und in der Blasenkrebszelllinie SCaBER (8A und 8B). Die in normalen angrenzenden Geweben (aus Patienten isoliert), doch nicht in normalen Geweben (aus einem gesunden Donor isoliert), nachgewiesene Expression könnte anzeigen, dass diese Gewebe nicht völlig normal sind und dass 158P1D7 in Tumoren im Frühstadium exprimiert werden könnte. Expression von 158P1D7 wird auch in 2 von 4 Lungenkrebszelllinien und in allen 3 getesteten Lungenkrebsgeweben nachgewiesen (9). In Brustkrebsproben wird 158P1D7-Expression in den MCF7- und CAMA-1-Brustkrebszelllinien, in Brusttumorgeweben, die aus Brustkrebspatienten isoliert wurden, beobachtet, doch nicht in normalen Brustgeweben (10).
Die begrenzte Expression von 158P1D7 in normalen Geweben und die in Prostatakrebs, Blasenkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs und Brustkrebs nachgewiesene Expression deutet an, dass 158P1D7 ein potenzielles therapeutisches Ziel und ein diagnostischer Marker für menschliche Krebse ist.
Beispiel 5: Herstellung von rekombinantem 158P1D7 in prokaryotischen Systemen
A. In-vitro-Transkriptions- und -Translationskonstrukte:
pCRII: Zur Erzeugung von 158P1D7-Sense- und -Antisense-RNA-Sonden für RNA-Untersuchungen in situ werden pCRII-Konstrukte (Invitrogen, Carlsbad CA) erzeugt, die entweder die gesamte oder Fragmente der 158P1D7-cDNA kodieren. Der pCRII-Vektor hat Sp6- und T7-Promotoren, die das Insert flankieren, um die Transkription von 158P1D7-RNA zur Verwendung als Sonden in RNA-Hybridisierungsexperimenten in situ zu führen. Diese Sonden werden zur Analyse der Zell- und Gewebeexpression von 158P1D7 auf der RNA-Ebene verwendet. Transkribierte 158P1D7-RNA, die die cDNA-Aminosäure-kodierende Region des 158P1D7-Gens repräsentiert, wird in in-vitro-Translationssystemen, wie zum Beispiel dem TnT^TM Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., Madison, WI) zur Synthese von 158P1D7-Protein verwendet.
B. Bakterielle Konstrukte:
pGEX-Konstrukte: Zur Erzeugung von rekombinanten 158P1D7-Proteinen in Bakterien, die mit dem Glutathion-S-Transferase (GST)-Protein fusioniert sind, wird die gesamte oder werden Teile der 158P1D7-cDNA-Protein-kodierenden Sequenz mit dem GST-Gen durch Klonierung in pGEX-6P-1 oder irgendeinen anderen GST-Fusionsvektor der pGEX-Familie (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) fusioniert. Diese Konstrukte ermöglichen kontrollierte Expression von rekombinanten 158P1D7-Proteinsequenzen, die mit GST an dem Amino-Terminus fusioniert sind und ein Sechs-Histidin-Epitop (6 × His) am Carboxyl-Terminus aufweisen. Die GST- und 6 × His-Tags erlauben die Aufreinigung des rekombinanten Fusionsproteins aus induzierten Bakterien mit der geeigneten Affinitätsmatrix und ermöglichen die Erkennung des Fusionsproteins mit Anti-GST- und -His-Antikörpern. Der 6 × His-Tag wird durch Hinzufügen von 6 Histidin-Kodons an den Klonierungsprimer am 3'-Ende des offenen Leserasters (ORF) erzeugt. Eine proteolytische Spaltungsstelle, wie zum Beispiel die PreScission^TM-Erkennungsstelle in pGEX-6P-1, kann eingesetzt werden, sodass sie die Spaltung des GST-Tags vom 158P1D7-ähnlichen Protein erlaubt. Das Ampicillin-Resistenzgen und pBR322 Origin ermöglichen die Selektion und Aufrechterhaltung der pGEX-Plasmide in E. coli. Beispielsweise werden Konstrukte unter Nutzung von pGEX-6P-1 hergestellt, sodass die folgenden Regionen von 158P1D7 als Amino-terminale Fusionen mit GST exprimiert werden: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7 oder Analoga davon.
pMAL-Konstrukte: Zur Erzeugung von rekombinanten 158P1D7-Proteinen, die mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) in bakteriellen Zellen fusioniert sind, wird die gesamte oder werden Teile der 158P1D7-cDNA-Protein-kodierenden Sequenz mit dem MBP-Gen durch Klonierung in die pMAL-c2X- und pMAL-p2X-Vektoren (New England Biolabs, Beverly, MA) fusioniert. Diese Konstrukte ermöglichen kontrollierte Expression von rekombinanten 158P1D7-Proteinsequenzen, die mit MBP an dem Amino-Terminus fusioniert sind und ein 6 × His-Epitop am Carboxyl-Terminus aufweisen. Die MBP- und 6 × His-Tags erlauben die Aufreinigung des rekombinanten Proteins aus induzierten Bakterien mit der geeigneten Affinitätsmatrix und ermöglichen die Erkennung des Fusionsproteins mit Anti-MBP- und Anti-His-Antikörpern. Die 6 × His werden durch Hinzufügen der Histidin-Kodons an den 3'-Klonierungsprimer erzeugt. Eine Faktor Xa-Erkennungsstelle erlaubt die Spaltung des pMAL-Tags vom 158P1D7. Die pMAL-c2X- und pMAL-p2X-Vektoren werden zur Expression des rekombinanten Proteins im Cytoplasma bzw. Periplasma optimiert. Die Expression im Periplasma verbessert die Faltung von Proteinen mit Disulfidbindungen. Beispielsweise werden Konstrukte unter Nutzung von pMAL-c2X und pMAL-p2X hergestellt, sodass die folgenden Regionen des 158P1D7-Proteins als eine Aminoterminale Fusionen mit MBP exprimiert werden: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7 oder Analoga davon.
pET-Konstrukte: Zur Expression von 158P1D7 in bakteriellen Zellen, wird die gesamte oder werden Teile der 158P1D7-cDNA-Protein-kodierenden Sequenz in die pET-Familie von Vektoren (Novagen, Madison, WI) kloniert. Diese Vektoren ermöglichen die streng kontrollierte Expression von rekombinantem 158P1D7-Protein in Bakterien mit und ohne Fusion mit Proteinen, die die Löslichkeit erhöhen, wie zum Beispiel NusA und Thioredoxin (Trx), und Epitop-Tags, wie zum Beispiel 6 × His- und S-Tag^®, die die Aufreinigung und den Nachweis des rekombinanten Proteins begünstigen. Beispielsweise werden Konstrukte unter Nutzung des pET-NusA-Fusionssystems 43.1 hergestellt, sodass die folgenden Regionen des 158P1D7-Proteins als Amino-terminale Fusionen mit NusA exprimiert werden: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7 oder Analoga davon.
B. Hefe-Konstrukte:
pESC-Konstrukte: Zur Expression von 158P1D7 in der Hefespezies Saccharomyces cerevisiae zur Erzeugung von rekombinantem Protein und für funktionelle Studien, wird die gesamte oder werden Teile der 158P1D7-cDNA-Protein-kodierenden Sequenz in die pESC-Familie von Vektoren kloniert, von denen jeder 1 von 4 selektierbaren Markern, HIS3, TRP1, LEU2 und URA3 (Stratagene, La Jolla, CA), enthält. Diese Vektoren ermöglichen die kontrollierte Expression aus dem gleichen Plasmid von bis zu 2 verschiedenen Genen oder klonierten Sequenzen, die entweder Flag^TM- oder Myc-Epitop-Tags enthalten, in derselben Hefezelle. Dieses System ist zur Anpassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen von 158P1D7 nützlich. Außerdem führt die Expression in Hefe zu ähnlichen posttranslationalen Modifikationen, wie zum Beispiel Glycosylierungen und Phosphorylierungen, die beobachtet werden, wenn in eukaryotischen Zellen exprimiert wird. Beispielsweise werden Konstrukte unter Nutzung von pESC-HIS hergestellt, sodass die folgenden Regionen des 158P1D7-Proteins exprimiert werden: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7 oder Analoga davon.
pESP-Konstrukte: Zur Expression von 158P1D7 in der Hefespezies Saccharomyces pombe, wird die gesamte oder werden Teile der 158P1D7-cDNA-Protein-kodierenden Sequenz in die pESP-Familie von Vektoren kloniert. Diese Vektoren ermöglichen ein kontrolliertes, hohes Expressionsniveau einer 158P1D7-Proteinsequenz, die entweder am Amino-Terminus oder am Carboxyl-Terminus mit GST, das die Aufreinigung des rekombinanten Proteins begünstigt, fusioniert ist. Ein Flag^TM-Epitop-Tag ermöglicht den Nachweis des rekombinanten Proteins mit dem Anti-F1ag^TM-Antikörper. Beispielsweise werden Konstrukte unter Nutzung des pESP-1-Vektors hergestellt, sodass die folgenden Regionen des 158P1D7-Proteins als Amino-terminale Fusionen mit GST exprimiert werden: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7 oder Analoga davon.
Beispiel 6: Herstellung von rekombinantem 158P1D7 in eukaryotischen Systemen
A. Säuger-Konstrukte:
Zur Expression von rekombinantem 158P1D7 in eukaryotischen Zellen können die 158P1D7-cDNA-Sequenzen in vollständiger oder Teillänge in einen der in der Technik bekannten Vielfalt von Expressionsvektoren kloniert werden. Die Konstrukte können in eine der großen Vielfalt von Säugerzellen, wie zum Beispiel 293T-Zellen, transfiziert werden. Transfizierte 293T-Zelllysate können mit dem polyklonalen Anti-158P1D7-Serum, vorstehend beschrieben, getestet werden.
pcDNA4/HisMax-Konstrukte: Zur Expression von 158P1D7 in Säugerzellen wird das 158P1D7-ORF in pcDNA4/HisMax Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Cytomegalovirus (CMV)-Promotor und dem SP163-translationalen Enhancer geführt. Das rekombinante Protein hat XpressTM und sechs Histidin-Epitope, die am N-Terminus fusioniert sind. Der pcDNA4/HisMax-Vektor enthält auch das Polyadenylierungssignal von bovinem Wachstumshormon (BGH) und die Transkriptionsterminationssequenz zur Erhöhung der mRNA-Stabilität, zusammen mit dem SV40 Origin zur episomalen Replikation und zum einfachen Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Das Zeocinresistenzgen ermöglicht die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillinresistenzgen und ColE1 Origin erlauben die Selektion und Aufrechterhaltung des Plasmids in E. coli. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
pcDNA3.1/MycHis-Konstrukte: Zur Expression von 158P1D7 in Säugerzellen wurden die ORFs mit der Kozak-Consensus-Translationsinitiationsstelle in pcDNA3.1/MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Cytomegalovirus(CMV)-Promotor geführt. Die rekombinanten Proteine haben das Myc-Epitop und sechs Histidine, die am C-Terminus fusioniert sind. Der pcDNA3.1/MycHis-Vektor enthält auch das Polyadenylierungssignal von bovinem Wachstumshormon (BGH) und die Transkriptionsterminationssequenz zur Erhöhung der mRNA-Stabilität, zusammen mit dem SV40 Origin zur episomalen Replikation und zum einfachen Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Das Neomycinresistenzgen kann verwendet werden, das es die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, ermöglicht und das Ampicillinresistenzgen und ColE1 Origin erlauben die Selektion und Aufrechterhaltung des Plasmids in E. coli. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Konstrukt: Zur Expression von 158P1D7 in Säugerzellen und zur Ermöglichung des Nachweises der rekombinanten Proteine unter Verwendung von Fluoreszenz werden die ORFs mit der Kozak-Consensus-Translationsinitiationsstelle in pcDNA3.1 CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA) kloniert. Die Proteinexpression wird vom Cytomegalovirus (CMV)-Promotor geführt. Die rekombinanten Proteine haben das Grün fluoreszierende Protein (GFP), das am C-Terminus fusioniert ist, was nicht-invasiven, in-vivo-Nachweis und Zellbiologie-Studien erleichtert. Der pcDNA3.ICT-GFP-TOPO-Vektor enthält auch das Polyadenylierungssignal von bovinem Wachstumshormon (BGH) und die Transkriptionsterminationssequenz zur Erhöhung der mRNA-Stabilität, zusammen mit dem SV40 Origin zur episomalen Replikation und zum einfachen Vektor-Rescue in Zelllinien, die das Large-T-Antigen exprimieren. Das Neomycinresistenzgen ermöglicht die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillinresistenzgen und ColE1 Origin erlauben die Selektion und Aufrechterhaltung des Plasmids in E. coli. Ein zusätzliches Konstrukt mit einer N-terminalen GFP-Fusion wird im pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO, das die gesamte Länge des 158P1D7-Proteins umfasst, hergestellt. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
PAPtag: Die 158P1D7-ORFs werden in pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN) kloniert. Dieses Konstrukt erzeugt eine Fusion mit der alkalischen Phosphatase am C-Terminus der 158P1D7-Proteine, während die IgGx-Signalsequenz am N-Terminus fusioniert wird. Die entstehenden rekombinanten 158P1D7-Proteine werden zur Sekretion in das Medium von transfizierten Säugerzellen optimiert und können zur Identifizierung von Proteinen, wie zum Beispiel Liganden oder Rezeptoren, die mit den 158P1D7-Proteinen wechselwirken, verwendet werden. Die Proteinexpression wird vom CMV-Promotor geführt und die rekombinanten Proteine enthalten auch Myc und sechs Histidine, die am C-Terminus der alkalischen Phosphatase fusioniert sind. Das Zeocinresistenzgen ermöglicht die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillinresistenzgen erlaubt die Selektion des Plasmids in E. coli. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
ptag5: Die 158P1D7-ORFs werden auch in pTag-5 kloniert. Dieser Vektor ist pAPtag ähnlich, doch ohne Fusion mit alkalischer Phosphatase. Dieses Konstrukt erzeugt eine Fusion eines Immunoglobulins G1 Fc am C-Terminus des 158P1D7-Proteins, während die IgGK-Signalsequenz am N-Terminus fusioniert wird. Die entstehenden rekombinanten 158P1D7-Proteine werden zur Sekretion in das Medium von transfizierten Säugerzellen optimiert und können zur Identifizierung von Proteinen, wie zum Beispiel Liganden oder Rezeptoren, die mit den 158P1D7-Proteinen wechselwirken, verwendet werden. Die Proteinexpression wird vom CMV-Promotor geführt und das rekombinante Protein enthält auch Myc und sechs Histidine, die am C-Terminus der alkalischen Phosphatase fusioniert sind. Das Zeocinresistenzgen ermöglicht die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillinresistenzgen erlaubt die Selektion des Plasmids in E. coli. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
PsecFc: Die 158P1D7-ORFs werden auch in psecFc kloniert. Der psecFc-Vektor wurde durch Klonierung von Immunoglobulin G1 Fc (Gelenk-, CH2-, CH3-Regionen) in pSecTag2 (Invitrogen, Kalifornien) erhalten. Dieses Konstrukt erzeugt eine Fusion eines Immunoglobulins G1 Fc am C-Terminus der 158P1D7-Proteine, während die IgG-Kappa-Signalsequenz am N-Terminus fusioniert wird. Das entstehende rekombinante 158P1D7-Protein wird zur Sekretion in das Medium von transfizierten Säugerzellen optimiert und kann zur Identifizierung von Proteinen, wie zum Beispiel Liganden oder Rezeptoren, die mit dem 158P1D7-Protein wechselwirken, verwendet werden. Die Proteinexpression wird vom CMV-Promotor geführt und das rekombinante Protein enthält auch Myc und sechs Histidine, die am C-Terminus der alkalischen Phosphatase fusioniert sind. Das Zeocinresistenzgen ermöglicht die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillinresistenzgen erlaubt die Selektion des Plasmids in E. coli. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
pSRα-Konstrukte: Zur Erzeugung von Säugerzelllinien, die 158P1D7 konstitutiv exprimieren werden die ORFs in pSRa-Konstrukte kloniert. Amphotrope und ecotrope Retroviren werden durch Transfektion von pSRa-Konstrukten in die 293T-10A1-Verpackungslinie bzw. Cotransfektion von pSRa und eines Helferplasmids (enthält deletierte Verpackungssequenzen) in die 293-Zellen erzeugt. Der Retrovirus kann zur Infektion einer Vielfalt von Säugerzelllinien verwendet werden, was zum Einbau des klonierten Gens, 158P1D7, in die Wirtszelllinien führt. Die Proteinexpression wird von einer langen terminalen Wiederholung (LTR = long terminal repeat) geführt. Das Neomycinresistenzgen ermöglicht die Selektion von Säugerzellen, die das Protein exprimieren, und das Ampicillinresistenzgen und ColE1 Origin erlauben die Selektion und Aufrechterhaltung des Plasmids in E. coli. Die retroviralen Vektoren können danach zur Infektion und Erzeugung von verschiedenen Zelllinien unter Verwendung von beispielsweise SCaBER-, NIH 3T3-, TsuPr1-, 293- oder Rat-1-Zellen verwendet werden.
Zusätzliche pSRa-Konstrukte werden hergestellt, die ein Epitop-Tag, wie zum Beispiel den FLAG-Tag mit dem C-Terminus von 158P1D7-Sequenzen fusionieren, um den Nachweis unter Verwendung von Anti-Epitop-Tag-Antikörpern zu ermöglichen. Beispielsweise wird die FLAG-Sequenz 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' dem Klonierungsprimer am 3'-Ende des ORF hinzugefügt. Zusätzliche pSRa-Konstrukte werden hergestellt, um sowohl N-terminale als auch C-terminale GFP- und Myc/6 HIS-Fusionsproteine der 158P1D7-Proteine vollständiger Länge zu erzeugen. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in derartigen Konstrukten exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
Zusätzliche virale Vektoren: Zusätzliche Konstrukte werden für die viral vermittelte Zuführung und Expression von 158P1D7 hergestellt. Ein hoher Virustiter, der zu einem hohen Expressionsniveau von 158P1D7 führt, wird in viralen Zuführungssystemen, wie zum Beispiel adenoviralen Vektoren und Herpes-Amplicon-Vektoren, erreicht. Die 158P1D7-kodierenden Sequenzen oder Fragmente davon werden durch PCR amplifiziert und in den AdEasy Shuttle-Vektor (Stratagene) subkloniert. Rekombination und Virusverpackung werden entsprechend den Vorschriften des Herstellers zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren ausgeführt. Alternativ werden 158P1D7-kodierende Sequenzen oder Fragmente davon in den HSV-1-Vektor (Imgenex) zur Erzeugung von herpesviralen Vektoren kloniert. Die viralen Vektoren werden danach zur Infektion von verschiedenen Zelllinien, wie zum Beispiel SCaBER-, NIH 3T3-, 293- oder Rat-1-Zellen, verwendet. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
Regulierte Expressionssysteme: Zur Kontrolle der Expression von 158P1D7 in Säugerzellen werden kodierende Sequenzen von 158P1D7 in regulierte Säuger-Expressionssysteme, wie zum Beispiel das T-Rex System (Invitrogen), das GeneSwitch System (Invitrogen) und das streng regulierte Ecdysone System (Stratagene), kloniert. Diese Systeme ermöglichen die Untersuchung der temporalen und konzentrationsabhängigen Wirkungen von rekombinantem 158P1D7. Diese Vektoren werden danach zur Kontrolle der Expression von 158P1D7 in verschiedenen Zelllinien, wie zum Beispiel SCaBER-, NIH 3T3-, 293- oder Rat-1-Zellen, verwendet. Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesen Konstrukten exprimiert; Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
B. Baculovirus-Expressionssysteme
Zur Erzeugung von rekombinanten 158P1D7-Proteinen in einem Baculovirus-Expressionssystem werden 158P1D7-ORFs in den Baculovirus-Transfervektor pBlueBac 4.5 (Invitrogen) kloniert, der ein His-Tag am N-Terminus bereitstellt.
Speziell wird pBlueBac-158P1D7 mit dem Helferplasmid pBac-N-Blue (Invitrogen) in SF9 (Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen zur Erzeugung von rekombinantem Baculovirus cotransfiziert (siehe Vorschriftenanleitung von Invitrogen für Details). Baculovirus wird dann aus dem Zellüberstand gesammelt und durch einen Plague-Assay aufgereinigt.
Rekombinantes 158P1D7-Protein wird dann durch Infektion von HighFive-Insektenzellen (Invitrogen) mit aufgereinigtem Baculovirus erzeugt. Rekombinantes 158P1D7-Protein kann unter Verwendung des Anti-158P1D7- oder Anti-His-Tag-Antikörpers nachgewiesen werden. Das 158P1D7-Protein kann aufgereinigt werden und in verschiedenen zellbasierten Assays oder als Immunogen zur Erzeugung von polyklonalen und monoklonalen 158P1D7-spezifischen Antikörpern verwendet werden.
Die folgenden Regionen von 158P1D7 werden in diesem Konstrukt exprimiert: Aminosäuren 1 bis 841; oder jedwede 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus 158P1D7, Varianten oder Analoga davon.
Beispiel 7 Antigenitätsprofile
11, 12, 13, 14 und 15 beschreiben graphisch fünf Aminosäureprofile der 158P1D7-Aminosäuresequenz, wobei jede Bewertung durch Zugang der ProtScale-Webseite (URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) auf dem ExPasy Molekularbiologie Server verfügbar ist.
Diese Profile: 11, Hydrophilität, (Hopp T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828); 12, Hydropathie, (Kyte J., Doolittle R. F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); 13, Prozentanteil der zugänglichen Reste (Janin J., 1979 Nature 277:491-492); 14, Durchschnittliche Flexibilität (Bhaskaran R. und Ponnuswamy P. K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); 15, Beta-Haarnadelschleife (Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294); und gegebenenfalls andere, in der Technik Verfügbare, wie zum Beispiel auf der ProtScale-Webseite, wurden zur Identifizierung von antigenen Regionen des 158P1D7-Proteins verwendet. Jedes der vorstehenden Aminosäureprofile von 158P1D7 wurde unter Verwendung der folgenden ProtScale-Parameter zur Analyse erzeugt: 1) eine Fenstergröße von 9; 2) 100% Gewicht der Fensterränder im Vergleich zur Fenstermitte; und 3) Aminosäureprofil-Werte sind normalisiert, um zwischen 0 und 1 zu liegen.
Die Profile von Hydrophilität (11), Hydropathie (12) und des Prozentanteils der zugänglichen Reste (13) wurden zur Bestimmung von Strecken von hydrophilen Aminosäuren verwendet (d.h. Werten größer als 0,5 im Hydrophilitätsprofil und Prozentanteil-Profils der zugänglichen Reste und Werten kleiner als 0,5 im Hydropathieprofil). Es ist wahrscheinlich, dass derartige Regionen der wässrigen Umgebung ausgesetzt sind, auf der Oberfläche des Proteins vorliegen und somit zur Immunerkennung, wie zum Beispiel durch Antikörper, verfügbar sind.
Durchschnittliche Flexibilitäts- (14) und Beta-Haarnadelschleifen(15) Profile bestimmen Strecken von Aminosäuren (d.h. Werten größer als 0,5 im Beta-Haarnadelschleifen-Profil und Profil der durchschnittlichen Flexibilität), die in Sekundärstrukturen, wie Beta-Faltblättern und Alpha-Helices, nicht eingeschränkt sind. Es ist auch wahrscheinlicher, dass derartige Regionen auf dem Protein ausgesetzt sind und somit zur Immunerkennung, wie zum Beispiel durch Antikörper, verfügbar sind.
Antigene Sequenzen des 158P1D7-Proteins, die z.B. durch die in 11, 12, 13, 14 oder 15 dargelegten Profile angezeigt werden, werden zur Herstellung von Immunogenen, entweder Peptiden oder Nukleinsäuren, die sie kodieren, zur Erzeugung von therapeutischen und diagnostischen Anti-158P1D7-Antikörpern verwendet. Das Immunogen kann jedwede 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder mehr als 50 zusammenhängenden Aminosäuren oder die entsprechenden Nukleinsäuren, die sie kodieren, aus dem 158P1D7-Protein darstellen. Insbesondere können Peptid-Immunogene der Erfindung Folgende umfassen: eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 2 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841, die eine Aminosäureposition mit einem Wert einschließt, der größer als 0,5 im Hydrophilitätsprofil von 11 ist; eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 2 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841, die eine Aminosäureposition mit einem Wert einschließt, der kleiner als 0,5 im Hydropathieprofil von 12 ist; eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 2 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841, die eine Aminosäureposition mit einem Wert einschließt, der größer als 0,5 im Prozentanteil-Profil der zugänglichen Reste von 13 ist; eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 2 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841, die eine Aminosäureposition mit einem Wert einschließt, der größer als 0,5 im Profil der durchschnittlichen Flexibilität von 14 ist; und eine Peptidregion von mindestens 5 Aminosäuren von 2 in irgendeinem Ganzzahlinkrement bis zu 841, die eine Aminosäureposition mit einem Wert einschließt, der größer als 0,5 im Beta-Haarnadelschleifen-Profil von 15 ist. Peptid-Immunogene der Erfindung können auch Nukleinsäuren umfassen, die irgendetwas vom Vorhergehenden kodieren. Alle Immunogene der Erfindung, Peptide oder Nukleinsäuren, können in menschlicher Einheitsdosisform vorliegen oder von einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutischen Arzneiträger einschließt, der mit menschlicher Physiologie verträglich ist, umfasst werden.
Beispiel 8: Erzeugung von polyklonalen 158P1D7-Antikörpern
Polyklonale Antikörper können beispielsweise in einem Säuger durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Agens und, falls gewünscht, eines Adjuvans produziert werden. Normalerweise werden das immunisierende Agens und/oder Adjuvans durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen in den Säuger injiziert werden. Zusätzlich zum Immunisieren mit dem 158P1D7-Protein vollständiger Länge werden Computeralgorithmen bei der Entwicklung von Immunogenen eingesetzt, die, basierend auf Aminosäuresequenzanalyse, Charakteristiken enthalten, dass sie antigen und zur Erkennung durch das Immunsystem des immunisierten Wirts verfügbar sind (siehe das Beispiel mit dem Titel „Antigenitätsprofile"). Von derartigen Regionen würde vorausgesagt werden, dass sie hydrophil, flexibel sind, in Beta-Haarnadelschleifen-Konformationen auftreten und dass sie auf der Oberfläche des Proteins ausgesetzt werden (siehe z.B. 11, 12, 13, 14 oder 15 für Aminosäureprofile, die derartige Regionen von 158P1D7 anzeigen).
Beispielsweise werden rekombinante bakterielle 158P1D7-Fusionsproteine oder Peptide, die hydrophile, flexible, Beta-Haarnadelschleifen-Regionen der 158P1D7-Sequenz kodieren, wie zum Beispiel Aminosäuren 25-45 und 250-385, als Antigene zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern in weißen Neuseeland-Kaninchen verwendet. Es ist dienlich, das immunisierende Agens zu einem Protein, das in dem zu immunisierenden Säuger als immunogen bekannt ist, zu konjugieren. Beispiele von derartigen immunogenen Proteinen schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Serumalbumin, bovines Thyroglobulin und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor. In einer Ausführungsform wird ein Peptid, das Aminosäuren 25-45 von 158P1D7 kodiert, zu KLH konjugiert und zur Immunisierung des Kaninchens verwendet. Alternativ kann das immunisierende Agens das gesamte oder Teile vom 158P1D7-Protein, Analoga oder Fusionsproteinen davon einschließen. Beispielsweise kann die 158P1D7-Aminosäuresequenz unter Verwendung von Techniken mit rekombinanter DNA mit einem einer Vielfalt von in der Technik gut bekannten Fusionsproteinpartnern, wie zum Beispiel Glutathion-S-Transferase (GST) und Fusionsproteinen mit HIS-Tags, fusioniert werden. Derartige Fusionsproteine werden aus induzierten Bakterien unter Verwendung der geeigneten Affinitätsmatrix aufgereinigt. In einer Ausführungsform wird ein GST-Fusionsprotein, das die Aminosäuren 250-385 von 158P1D7 kodiert, produziert und aufgereinigt und ein Spaltungsprodukt wird erzeugt, in dem GST-Sequenzen durch proteolytische Spaltung entfernt werden. Dieses abgespaltene 158P1D7-Protein wird als Immunogen verwendet. Andere rekombinante bakterielle Fusionsproteine, die eingesetzt werden können, schließen Maltose-bindendes Protein, LacZ, Thioredoxin, NusA oder eine konstante Region eines Immunoglobulins ein (siehe den Abschnitt mit dem Titel „Herstellung von 158P1D7 in prokaryotischen. Systemen" und Current Protocols In Molecular Biology, Volume (Band) 2, Unit (Abschnitt) 16, Frederick M. Ausubul et al. Hrsg., 1995; Linsley, P. S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. und Ledbetter, L., (1991), J. Exp. Med. 174, 561-566).
Zusätzlich zu bakteriellen abstammenden Fusionsproteinen werden auch Protein-Antigene, die in Säugern exprimiert werden, verwendet. Diese Antigene werden mit Säugerexpressionsvektoren, wie zum Beispiel den Tag5- und Fc-Fusionsvektoren, exprimiert (siehe den Abschnitt mit dem Titel „Herstellung von rekombinantem 158P1D7 in eukaryotischen Systemen") und bewahren posttranslationale Modifikationen, wie zum Beispiel Glycosylierungen, die im nativen 158P1D7-Protein gefunden werden. In einer Ausführungsform wird die vorausgesagte extrazelluläre Domäne von 158P1D7, Aminosäuren 1-614, in den Tag5-Säugersekretionsvektor kloniert. Das rekombinante Protein wird durch Metallchelatchromatographie aus den Gewebekulturüberständen von 293T-Zellen, die den rekombinanten Vektor stabil exprimieren, aufgereinigt. Die aufgereinigte extrazelluläre Tag5-158P1D7-Domäne wird dann als Immunogen verwendet.
Im Laufe des Protokolls zur Immunisierung ist es nützlich, das Antigen in Adjuvanzien, die die Immunantwort des Wirtstieres verstärken, zu mischen oder zu emulgieren. Beispiele von Adjuvanzien schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: komplettes Freund-Adjuvans (CFA) und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid-A, synthetsiches Trehalosedicorynomycolat).
In einem typischen Protokoll zur Immunisierung werden den Kaninchen anfänglich subkutan bis zu 200 μg, normalerweise 100-200 μg, in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) gemischtes Fusionsprotein oder Peptid, das mit KLH konjugiert ist, injiziert. Den Kaninchen werden dann alle zwei Wochen subkutan bis zu 200 μg, normalerweise 100-200 μg, des Immunogens in inkomplettem Freund-Adjuvans (IFA) injiziert. Testblutungen werden ungefähr 7-10 Tage nach jeder Immunisierung vorgenommen und zur Kontrolle des Titers des Antiserums durch ELISA verwendet.
Zum Testen von Serum, wie zum Beispiel Kaninchenserum, auf Reaktivität mit 158P1D7-Proteinen kann die cDNA von 158P1D7 vollständiger Länge in einen Expressionsvektor kloniert werden, wie zum Beispiel einen, der ein 6 × His-Tag am Carboxyl-Terminus bereitstellt (pCDNA 3.1 myc-his, Invitrogen, siehe das Beispiel mit dem Titel „Herstellung von rekombinantem 158P1D7 in eukaryotischen Systemen"). Nach Transfektion der Konstrukte in 293T-Zellen werden die Zelllysate mit dem Anti-158P1D7-Serum und mit Anti-His-Antikörper (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) getestet, um die spezifische Reaktivität mit denaturiertem 158P1D7-Protein unter Verwendung der Western-Blot-Technik zu bestimmen. Außerdem kann die Erkennung von nativem Protein durch das Antiserum durch Immunpräzipitation und flow-cytometrische Analysen von 293T- und anderen rekombinanten 158P1D7-exprimierenden Zellen bestimmt werden. Alternativ wird die Spezifität des Antiserums durch Western-Blot, Immunpräzipitation, Fluoreszenzmikroskopie und flow-cytometrische Techniken unter Verwendung von Zellen, die 158P1D7 endogen exprimieren, getestet.
Seren aus Kaninchen, die mit Fusionsproteinen, wie zum Beispiel GST- und MBP-Fusionsproteinen, immunisiert wurden, werden durch Depletion von Antikörpern, die mit GST-, MBP- oder anderen Funsionspartnersequenzen reaktiv sind, durch Durchlaufen über eine Affinitätssäule, die den Fusionspartner entweder allein oder in Verbindung mit einem irrelevanten Fusionsprotein enthält, aufgereinigt. Seren aus Kaninchen, die mit Protein und Peptid mit His-Tags immunisiert wurden, sowie Fusionspartner-depletierte Seren werden weiter durch Durchlaufen über eine Affinitätssäule, die aus dem ursprünglichen Protein-Immunogen oder freiem Peptid, das zur Affigel-Matrix (BioRad) gekuppelt ist, besteht, aufgereinigt.
Beispiel 9: Erzeugung von monoklonalen 158P1D7-Antikörpern (mAbs = monoklonale Antikörper)
In einer Ausführungsform umfassen therapeutische mAbs gegen 158P1D7 solche, die mit Epitopen des Proteins reagieren, die stören oder die biologische Funktion von 158P1D7 modulieren würden, beispielsweise solche, die seine Wechselwirkung mit Liganden oder Proteinen, die seine biologische Aktivität vermitteln oder daran beteiligt sind, stören würden. Therapeutische mAbs umfassen auch solche, die spezifisch Epitope von 158P1D7 binden, die auf der Zelloberfläche ausgesetzt sind und somit beim Abzielen auf mAb-Toxin-Konjugate nützlich sind. Immunogene zur Erzeugung von derartigen mAbs schließen solche ein, die entwickelt wurden, um das gesamte 158P1D7-Protein oder Regionen des 158P1D7-Proteins, von denen in der Computeranalyse der Aminosäuresequenz (siehe z.B. 11, 12, 13, 14 oder 15 und das Beispiel mit dem Titel „Antigenitätsprofile") vorausgesagt wurde, dass sie antigen ist, zu kodieren oder zu enthalten. Immunogene schließen Peptide, rekombinante bakterielle Proteine und im Säuger exprimierte Tag 5-Proteine und menschliche und marine IgG-Fc-Fusionsproteine ein. Außerdem werden Zellen, die hohe Mengen von 158P1D7 exprimieren, wie zum Beispie1293T-158P1D7-Zellen zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
Zur Erzeugung von mAbs gegen 158P1D7 werden Mäuse zuerst intraperitoneal (IP) mit normalerweise 10-50 μg Protein-Immunogen oder 10⁷ 158P1D7-exprimierenden Zellen, die in komplettem Freund-Adjuvans gemischt sind, immunisiert. Dann werden die Mäuse anschließend alle 2-4 Wochen mit normalerweise 10-50 μg Protein-Immunogen oder 10⁷ Zellen, die in inkomplettem Freund-Adjuvans gemischt sind, IP immunisiert. Alternativ wird MPL-TDM-Adjuvans in den Immunisierungen verwendet. Zusätzlich zu den vorstehenden Protein- und zellbasierten Immunisierungsstrategien wird ein DNA-basiertes Immunisierungsprotokoll angewendet, in dem ein Säugerexpressionsvektor, der die 158P1D7-Sequenz kodiert, zur Immunisierung von Mäusen durch direkte Injektion der Plasmid-DNA verwendet wird. Beispielsweise wird die extrazelluläre Domäne von 158P1D7, Aminosäuren 1-614, in den Tag5-Säugersekretionsvektor kloniert und der rekombinante Vektor wird als Immunogen verwendet. In einem weiteren Beispiel wird die Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäuren 250-385 von 158P1D7 kodiert, (aus der Sequenzanalyse wurde vorausgesagt, dass diese antigen ist, siehe z.B. 11, 12, 13, 14 oder 15) in einen Fc-Fusionssekretionsvektor kloniert, in dem die 158P1D7-Sequenz am Amino-Terminus zu einer IgK-Leitsequenz und am Carboxyl-Terminus zu der kodierenden Sequenz der murinen oder menschlichen IgG-Fc-Region fusioniert ist. Dieser rekombinante Vektor wird dann als Immunogen verwendet. Die Plasmid-Immunisierungsprotokolle werden in Kombination mit aufgereinigten Proteinen, die vom gleichen Vektor exprimiert werden, und mit 158P1D7-exprimierenden Zellen verwendet.
Im Laufe des Immunisierungsprotokolls werden 7-10 Tage nach einer Injektion Testblutungen vorgenommen, um den Titer und die Spezifität der Immunantwort zu kontrollieren. Sobald geeignete Reaktivität und Spezifität, wie durch ELISA, Western-Blotting, Immunpräzipitation, Fluoreszenzmikroskopie und flowcytometrische Analysen bestimmt wurde, erhalten wird, wird dann mit bewährten, in der Technik gut bekannten Methoden die Erzeugung von Fusion und Hybridom vorgenommen (siehe z.B. Harlow und Lane, 1988).
In einer Ausführungsform zur Erzeugung von monoklonalen 158P1D7-Antikörpern wird ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein, das die Aminosäuren 250-385 vom 158P1D7-Protein kodiert, exprimiert und aufgereinigt. Ein Abspaltungsfragment, das 158P1D7-spezifische Aminosäuren kodiert, wird dann als Immunogen verwendet, in dem GST durch ortsspezifische Proteolyse entfernt ist. Balb-C-Mäuse werden anfänglich mit 25 μg des 158P1D7-Abspaltungsproteins, das in komplettem Freund-Adjuvans gemischt ist, intraperitoneal immunisiert. Die Mäuse werden anschließend alle zwei Wochen mit 25 μg 158P1D7-Abspaltungsprotein, das in inkomplettem Freund-Adjuvans gemischt ist, für insgesamt drei Immunisierungen immunisiert. Der Titer des Serums aus immunisierten Mäusen wird durch ELISA unter Verwendung des GST-Fusionsproteins vollständiger Länge und des abgespaltenen Immunogens bestimmt. Die Reaktivität und Spezifität des Serums gegen das 158P1D7-Protein vollständiger Länge werden durch Western-Blotting, Immunpräzipitation und Flow-Cytometrie unter Verwendung von 293T-Zellen, die mit einem Expressionsvektor, der die 158P1D7-cDNA kodiert, transfiziert sind, kontrolliert (siehe z.B. das Beispiel mit dem Titel „Herstellung von rekombinantem 158P1D7 in eukaryotischen Systemen"). Andere rekombinante 158P1D7-exprimierende Zellen oder Zellen, die 158P1D7 endogen exprimieren, werden auch verwendet. Mäuse, die die größte Reaktivität zeigen, werden geschont und es wird ihnen eine letzte Injektion von 158P1D7-Abspaltungsprotein in PBS gegeben und vier Tage später werden sie dann geopfert. Die Milzen der geopferten Mäuse werden geernet und mit SPO/2-Myelomzellen unter Verwendung von Standardmethoden fusioniert (Harlow und Lane, 1988). Die Überstände aus den Wells mit Wachstum, nach der HAT-Selektion, werden durch ELISA, Western-Blot, Immunpräzipitation, Fluoreszenzmikroskopie und Flow-Cytometrie zur Identifizierung von Klonen, die 158P1D7-spezifische Antikörper produzieren, gescreent.
Die Bindungsaffinität eines monoklonalen 158P1D7-Antikörpers wird unter Verwendung von Standardtechnologien bestimmt. Affinitätsmessungen quantifizieren die Stärke der Bindung von Antikörper und Epitop und werden zur Unterstützung der Bestimmung, welche monoklonalen 158P1D7-Antikörper zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung bevorzugt sind, wie vom Fachmann eingesehen wird, verwendet. Das BIAcore-System (Uppsala, Schweden) ist ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von Bindungsaffinität. Das BIAcore-System verwendet Oberflächenplasmonresonanz (SPR = surface plasmon resonance, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton und Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268), um biomolekulare Wechselwirkungen in Echtzeit zu kontrollieren. Die BIAcore-Analyse erzeugt zweckdienlicherweise Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten, Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten, Gleichgewichtsdissoziationskonstanten und Affinitätskonstanten.
Beispiel 10: HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Bindungtsassays
HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Bindungsassays unter Verwendung von aufgereinigten HLA-Molekülen werden gemäß den offenbarten Protokollen ausgeführt (z.B. PCT-Veröffentlichungen WO 94/20127 und WO 94/03205; Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney et al., J. Immunol. 154:247 (1995); Sette et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994)). Kurz gesagt, werden aufgereinigte MHC-Moleküle (5 bis 500 nM) mit verschiedenen nicht-markierten Peptidinhibitoren und 1-10 nM ¹²⁵I-radiomarkierten Sonden-Peptiden, wie beschrieben, inkubiert. Nach der Inkubation werden MHC-Peptid-Komplexe von freiem Peptid durch Gelfiltration abgetrennt und die Fraktion von gebundenem Peptid wird bestimmt. Normalerweise wird in vorläufigen Experimenten jede MHC-Zubereitung in Gegenwart von festgelegten Mengen von radiomarkierten Peptiden titriert, um die Konzentration von HLA-Molekülen, die zur Bindung von 10-20% der gesamten Radioaktivität notwendig sind, zu bestimmen. Alle nachfolgenden Inhibitions- und direkten Bindungsassays werden unter Verwendung dieser HLA-Konzentrationen ausgeführt.
Da unter diesen Bedingungen [Markierung] < [HLA] und IC₅₀ ≥ [HLA], sind die gemessenen IC₅₀-Werte angemessene Näherungen der wahren K_D-Werte. Peptidinhibitoren werden normalerweise bei Konzentrationen im Bereich von 120 μg/ml bis 1,2 ng/ml getestet und werden in zwei bis vier völlig unabhängigen Experimenten getestet. Damit ein Vergleich der in verschiedenen Experimenten erhaltenen Daten ermöglicht wird, wird eine relative Bindungszahl für jedes Peptid durch Dividieren der IC₅₀ einer positiven Kontrolle zur Inhibierung durch die IC₅₀ für jedes getestete Peptid (normalerweise nicht-markierte Versionen des radiomarkierten Sonden-Peptids) berechnet. Für Datenbankzwecke und Vergleiche zwischen den Experimenten werden relative Bindungswerte erstellt. Diese Werte können anschließend in IC₅₀-nM-Werte durch Dividieren der IC₅₀-nM der positiven Kontrolle zur Inhibition durch die relative Bindung des interessierenden Peptids zurückverwandelt werden. Dieses Verfahren der Datenerfassung ist für vergleichende Peptide, die auf unterschiedliche Weise oder mit verschiedenen Mengen von aufgereinigtem MHC getestet wurden, genau und beständig.
Bindungsassays, wie vorstehend dargestellt, können zur Analyse von HLA-Supermotiv- und/oder HLA-Motiv-tragenden Peptiden verwendet werden.
Beispiel 11: Identifizierung von HLA-Supermotiv- und -Motiv-tragenden Kandidaten von CTL-Epitopen
HLA-Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung können multiple Epitope einschließen. Die multiplen Epitope können multiple HLA-Supermotive oder -Motive umfassen, um eine breite Bevölkerungsabdeckung zu erreichen. Dieses Beispiel erläutert die Identifizierung und Bestätigung von Supermotiv- und Motiv-tragenden Epitopen für den Einschluss in einer derartigen Impfstoffzusammensetzung. Die Berechnung der Bevölkerungsabdeckung wird unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Strategie ausgeführt.
Computersuche und -algorithmen zur Identifizierung von Supermotiv- und/oder Motiv-tragenden Epitopen
Die Suche, die zur Identifizierung der Motiv-tragenden Peptidsequenzen in dem Beispiel mit dem Titel „Antigenitätsprofile" und den Tabellen V-XVIII ausgeführt wurde, setzt die Proteinsequenzdaten von dem Genprodukt von 158P1D7, in 2 und 3 dargelegt, ein.
Die Computersuche für Epitope, die HLA-Klasse-I- oder -Klasse-II-Supermotive oder -Motive tragen, wird folgendermaßen ausgeführt. Alle translatierten 158P1D7-Proteinsequenzen werden unter Verwendung eines Softwareprogramms zur Textelementsuche analysiert, um potentielle Peptidsequenzen, die geeignete HLA-Bindungsmotive enthalten, zu identifizieren; derartige Programme werden leicht entsprechend der in der Technik bekannten Information, hinsichtlich bekannter Motiv/Supermotiv-Aufdeckungen, erstellt. Außerdem können derartige Berechnungen verstandesmäßig ausgeführt werden.
Identifizierte A2-, A3- und DR-Supermotivsequenzen werden unter Verwendung von polynominalen Algorithmen getroffen, um ihre Kapazität zur Bindung zu spezifischen HLA-Klasse-I- oder -Klasse-II-Molekülen vorherzusagen. Diese polynominalen Algorithmen erklären den Einfluss von unterschiedlichen Aminosäuren an unterschiedlichen Positionen und basieren im Wesentlichen auf der Voraussetzung, dass die gesamte Affinität (oder ΔG) von Peptid-HLA-Molekül-Wechselwirkungen annähernd als eine lineare polynominale Funktion folgender Art dargestellt werden kann: „ΔG" = a1i x a2i x a3i...x ani worin a_ji ein Koeffizient ist, der die Wirkung der Gegenwart einer gegebenen Aminosäure (j) an einer gegebenen Position (i) entlang der Sequenz eines Peptids von n Aminosäuren repräsentiert. Die entscheidende Annahme dieses Verfahrens ist, dass die Wirkungen an jeder Position im Wesentlichen unabhängig voneinander sind (d.h. unabhängiges Binden von einzelnen Seitenketten). Wenn Rest j an Position i im Peptid auftritt, wird angenommen, dass er eine konstante Menge j_i zur freien Bindungsenergie des Peptids beisteuert, ungeachtet der Sequenz des Rests des Peptids.
Das Verfahren der Herleitung von spezifischen Algorithmuskoeffizienten wurde in Gulukota et al., J. Mol. Biol. 267:1258-126, 1997, beschrieben (siehe auch Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996, und Southwood et al., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998). Kurz gesagt, wird für alle i-Positionen, Anker und Nicht-Anker ebenso, der geometrische Durchschnittswert der durchschnittlichen relativen Bindung (ARB = average relative bindung) aller j-tragenden Peptide relativ zum Rest der Gruppe berechnet und als Schätzwert von j_i verwendet. Für Klasse-II-Peptide wird, falls mehrere Alignments möglich sind, nur das Alignment mit den meisten Treffern (Score) genutzt, wobei einer schrittweisen Methode gefolgt wird. Um den Score eines Algorithmus eines gegebenen Peptids in einer Testreihe zu berechnen, werden die ARB-Werte, die der Sequenz des Peptids entsprechen, multipliziert. Falls dieses Produkt einen gewählten Schwellwert übersteigt, wird vorausgesagt, dass das Peptid bindet. Geeignete Schwellwerte werden als eine Funktion des Grads der Stringent der gewünschten Voraussage ausgewählt.
Selektion von HLA-A2-Supertyp-kreuzreaktiven Peptiden
Vollständige Proteinsequenzen aus 158P1D7 werden unter Nutzung von Software zur Motividentifizierung gescannt, um 8-, 9-, 10- und 11-mer-Sequenzen zu identifizieren, die die Spezifität des HLA-A2-Supermotiv-Hauptankers enthalten. Normalerweise werden diese Sequenzen dann unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Protokolls auf Treffer untersucht und die Peptide, die den Sequenzen mit positiven Treffern entsprechen, werden synthetisiert und auf ihre Kapazität zur invitro-Bindung von aufgereinigten HLA-A*0201-Molekülen getestet (HLA-A*0201 wird als ein Prototyp-A2-Supertyp-Molekül angesehen).
Diese Peptide werden dann auf die Kapazität zur Bindung zu zusätzlichen A2-Supertyp-Molekülen (A*0202, A*0203, A*0206 und A*6802) getestet. Peptide, die zu mindestens drei der fünf getesteten A2-Supertyp-Allele binden, gelten normalerweise als A2-Supertyp-kreuzreaktive Binder. Bevorzugte Peptide binden mit einer Affinität von gleich oder kleiner als 500 nM zu drei oder mehr HLA-A2-Supertyp-Molekülen.
Selektion von HLA-A3-Supermotiv-tragenden Epitopen
Die vorstehend gescannte 158P1D7-Proteinsequenz wird auch auf die Gegenwart von Peptiden mit den HLA-A3-Supermotiv-primären Ankern untersucht. Peptide, die den HLA-A3-Supermotiv-tragenden Sequenzen entsprechen, werden dann synthetisiert und auf die Bindung zu HLA-A*0301- und HLA-A*1101-Molekülen getestet, die Moleküle, die durch die zwei vorherrschendsten A3-Supertyp-Allele kodiert werden. Die Peptide, die mindestens eins von den zwei Allelen mit Bindungsaffinitäten von ≤ 500 nM, häufig ≤ 200 nM, binden, werden dann auf Kreuzreaktivität der Bindung zu den anderen häufigen A3-Supertyp-Allelen (z.B. A*3101, A*3301 und A*6801) getestet, um solche zu identifizieren, die mindestens drei der fünf getesteten HLA-A3-Supertyp-Moleküle binden.
Selektion von HLA-B7-Supermotiv-tragenden Epitopen
Das 158P1D7-Protein wird auch auf die Gegenwart von 8-, 9-, 10- oder 11-mer-Peptiden mit dem HLA-B7-Supermotiv analysiert. Entsprechende Peptide werden synthetisiert und auf die Bindung zu HLA-B*0702 getestet, das Molekül, das durch das häufigste B7-Supertyp-Allel (d. h. das Prototyp-B7-Supertyp-Allel) kodiert wird,. Peptide, die B*0702 mit einer IC₅₀ von ≤ 500 nM binden, werden unter Verwendung von Standardverfahren identifiziert. Diese Peptide werden dann auf die Bindung zu anderen häufigen B7-Supertyp-Molekülen (z.B. B*3501, B*5101, B*5301 und B*5401) getestet. Peptide, die zur Bindung zu drei oder mehr der fünf getesteten B7-Supertyp-Allele fähig sind, werden dabei identifiziert.
Selektion von A1- und A24-Motiv-tragenden Epitopen
Um die Bevölkerungsabdeckung weiter zu erhöhen, können HLA-A1- und -A24-Epitope auch in Impfstoffzusammensetzungen eingeschlossen werden. Eine Analyse des 158P1D7-Proteins kann auch ausgeführt werden, um HLA-A1- und -A24-Motiv-enthaltende Sequenzen zu identifizieren.
Bindungsepitope mit hoher Affinität und/oder Kreuzreaktivität, die ein anderes Motiv und/oder andere Supermotive tragen, werden unter Verwendung von analoger Methodik identifiziert.
Beispiel 12: Bestätigung von Immunogenität
Kreuzreaktive Kandidat-CTL-A2-Supermotiv-tragende Peptide, die, wie hierin beschrieben, identifiziert werden, werden zur Bestätigung der in-vitro-Immunogenität ausgewählt. Die Bestätigung wird unter Verwendung der folgenden Methodik ausgeführt:
Zielzelllinien für zelluläres Screening:
Die .221A2.1-Zelllinie, die durch Transfer des HLA-A2.1-Gens in die menschliche HLA-A-, -B-, -C-Nullmutanten-B-Lymphoblastoidzelllinie 721.221 erzeugt wird, wird als das Peptid-beladene Ziel zur Messung der Aktivität von HLA-A2.1-restringierten CTL verwendet. Diese Zelllinie wird in RPMI-1640-Medium, das mit Antibiotika, Natriumpyruvat, nicht-essentiellen Aminosäuren und 10% (v/v) Hitze-inaktiviertem FCS ergänzt war, wachsen gelassen. Zellen, die ein interessierendes Antigen exprimieren oder Transfektanten, die das Gen, das das interessierende Antigen kodiert, umfassen, können als Zielzellen zur Bestätigung der Fähigkeit von Peptid-spezifischen CTLs zur Erkennung von endogenem Antigen verwendet werden.
Primäre CTL-Induktionskulturen:
Erzeugung von dendritischen Zellen (DC): PBMCs werden in RPMI mit 30 μg/ml DNAse aufgetaut, zweimal gewaschen und in komplettem Medium (RPMI-1640 zuzüglich 5% menschliches AB-Serum, nicht-essentielle Aminosäuren, Natriumpyruvat, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin) resuspendiert. Die Monozyten werden durch Ausstreichen von 10 × 10⁶ PBMC/Well in einer 6-Well-Platte aufgereinigt. Nach 2 Stunden bei 37 °C werden nicht-adhärente Zellen durch behutsames Schütteln der Platten und Absaugen der Überstände entfernt. Die Wells werden insgesamt dreimal mit 3 ml RPMI gewaschen, um die meisten der nichtadhärenten und lose adhärenten Zellen zu entfernen. Dann werden drei ml von komplettem Medium, das 50 ng/ml GM-GSF und 1 000 U/ml IL-4 enthält, zu jedem Well gegeben. Am Tag 6 wird TNFa bei 75 ng/ml zu den DCs gegeben und die Zellen werden für die CTL-Induktionskulturen am Tag 7 verwendet.
Induktion von CTL mit DC und Peptid: CD8+-T-Zellen werden durch positive Selektion mit immunomagnetischen Dynal-Beads (Dynabeads^® M-450) und dem Detacha-Bead^®-Reagenz isoliert. Normalerweise werden etwa 200-250 × 10⁶ PBMC bearbeitet, um 24 × 10⁶ CD8⁺-T-Zellen (genug für eine 48-Well-Plattenkultur) zu erhalten. Kurz gesagt, werden die PBMCs in RPMI mit 30 μg/ml DNAse aufgetaut, einmal mit PBS, das 1% menschliches AB-Serum enthält, gewaschen und in PBS/1% AB-Serum bei einer Konzentration von 20 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die magnetischen Beads werden 3-mal mit PBS/AB-Serum gewaschen, zu den Zellen gegeben (140 μl Beads/20 × 10⁶ Zellen) und für 1 Stunde bei 4 °C unter kontinuierlichem Mischen inkubiert. Die Beads und Zellen werden 4 × mit PBS/AB-Serum gewaschen, um die nicht-adhärenten Zellen zu entfernen, und zu 100 × 10⁶ Zellen/ml (basiert auf der ursprünglichen Zellanzahl) in PBS/AB-Serum, das 100μl/ml Detacha-Bead^®-Reagenz und 30 μg/ml DNAse enthält, resuspendiert. Die Mischung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Mischen inkubiert. Die Beads werden erneut mit PBS/AB/DNAse gewaschen, um die CD8+-T-Zellen zu sammeln. Die DC werden gesammelt und bei 1300 rpm für 5-7 Minuten zentrifugiert, einmal mit PBS mit 1% BSA gewaschen, gezählt und mit 40 μg/ml Peptid bei der Zellkonzentration von 1-2 × 10⁶/ml in Gegenwart von 3μg/ml β₂-Mikroglobulin für 4 Stunden bei 20 °C gepulst. Die DC werden dann bestrahlt (4 200 rad), 1-mal mit Medium gewaschen und erneut gezählt.
Aufbau von Induktionskulturen: 0,25 ml Cytokin-erzeugte DC (bei 1 × 10⁵ Zellen/ml) werden mit 0,25 ml CD8+-T-Zellen (bei 2 × 10⁶ Zellen/ml) in jedem Well einer 48-Well-Platte in Gegenwart von 10 ng/ml IL-7 cokultiviert. Rekombinantes menschliches IL-10 wird am nächsten Tag bei einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben und rekombinantes menschliches IL-2 wird 48 Stunden später bei 10 IU/ml zugegeben.
Restimulation der Induktionskulturen mit Peptid-gepulsten adhärenten Zellen: Sieben und vierzehn Tage nach der primären Induktion werden die Zellen mit Peptidgepulsten adhärenten Zellen restimuliert. Die PBMCs werden aufgetaut und zweimal mit RPMI und DNAse gewaschen. Die Zellen werden bei 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und bei ~ 4200 rad bestrahlt. Die PBMCs werden bei 2 × 10⁶ in 0,5 ml komplettem Medium pro Well ausgestrichen und für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Platten werden zweimal mit RPMI durch behutsames Klopfen der Platte gewaschen, um die nicht-adhärenten Zellen zu entfernen, und die adhärenten Zellen werden mit 10 μg/ml Peptid in Gegenwart von 3 μg/ml β₂-Mikroglobulin in 0,25 ml RPMI/5% AB pro Well für 2 Stunden bei 37 °C gepulst. Die Peptidlösung wird von jedem Well abgesaugt und die Wells werden einmal mit RPMI gewaschen. Das meiste des Mediums wird von den Induktionskulturen (CD8+-Zellen) abgesaugt und mit frischem Medium auf 0,5 ml gebracht. Die Zellen werden dann in die Wells, die die Peptid-gepulsten adhärenten Zellen enthalten, überführt. Vierundzwanzig Stunden später wird rekombinantes menschliches IL-10 bei einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben und rekombinantes menschliches IL2 wird am nächsten Tag zugegeben und erneut 2-3 Tage später bei 50 IU/ml (Tsai et al., Critical Reviews in Immunology 18(1-2):65-75, 1998). Sieben Tage später werden die Kulturen auf CTL-Aktivität in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay untersucht. In einigen Experimenten werden die Kulturen auf peptidspezifische Erkennung im in-situ-IFNy-ELISA zum Zeitpunkt der zweiten Restimulation untersucht, gefolgt von einem Assay zur endogenen Erkennung 7 Tage später. Nach Expansion wird die Aktivität in beiden Assays für einen Vergleich nebeneinander gemessen.
Messung von CTL-lytischer Aktivität durch ⁵¹Cr-Freisetzung
Sieben Tage nach der zweiten Restimulation wird die Cytoxizität in einem normalen (5 Std.) ⁵¹Cr-Freisetzungsassay durch Untersuchen der einzelnen Wells bei einem einzigen E:T bestimmt. Peptid-gepulste Ziele werden durch Inkubation der Zellen mit 10 μg/ml Peptid über Nacht bei 37 °C zubereitet.
Adhärente Zielzellen werden aus den Kulturgefäßen mit Trypsin-EDTA entnommen. Die Zielzellen werden mit 200 μCi ⁵¹Cr-Natriumchromat (Dupont, Wilmington, DE) für 1 Stunde bei 37 °C markiert. Markierte Zielzellen werden bei 10⁶ pro ml resuspendiert und 1:10 mit K562-Zellen bei einer Konzentration von 3,3 × 10⁶/ml (eine NK-sensitive Erythroblastom-Zelllinie, die zur Reduzierung von nicht-spezifischer Lyse verwendet wird) verdünnt. Zielzellen (100 μl) und Effektoren (100 μl) werden in 96-Well-Platten mit runden Böden ausgestrichen und für 5 Stunden bei 37 °C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt werden 100 μl des Überstands aus jedem Well gesammelt und der Prozentsatz der Lyse wird entsprechend der folgenden Formel bestimmt: [(cpm der Testprobe – cpm der Probe mit spontaner 51Cr-Freisetzung)/(cpm der Probe mit maximaler 51Cr-Freisetzung – cpm der Probe mit spontaner 51Cr-Freisetzung)] × 100.
Maximale und spontane Freisetzung werden durch Inkubation der markierten Ziele mit 1% Trition X-100 bzw. Media allein bestimmt. Eine positive Kultur wird als eine definiert, in der die spezifische Lyse (Probe-Hintergrund) 10% oder höher im Fall von einzelnen Wells ist und 15% oder mehr bei den zwei höchsten E:T-Verhältnissen ist, wenn expandierte Kulturen getestet werden.
In-situ-Messung von menschlicher IFNγ-Produktion als ein Indikator für peptidspezifische und endogene Erkennung
Immulon-2-Platten werden mit monoklonalem Maus-Anti-Mensch-IFNγ-Antikörper (4 μg/ml 0,1 M NaHCO₃, pH8,2) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Die Platten werden mit Ca²⁺-, Mg²⁺-freiem PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit PBS/10% FCS für zwei Stunden blockiert, worauf die CTLs (100 μl/Well) und Ziele (100 μl/Well) zu jedem Well gegeben werden, wobei Wells für die Standards und Kontrollen (die nur Medium erhalten) frei gelassen werden. Die Zielzellen, entweder Peptid-gepulste oder endogene Ziele, werden bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml verwendet. Die Platten werden für 48 Stunden bei 37 °C mit 5% CO₂ inkubiert.
Rekombinantes menschliches IFN-gamma wird zu den Standard-Wells, beginnend mit 400 pg oder 1200 pg/100 Mikroliter/Well, gegeben und die Platte wird für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Platten werden gewaschen und 100 μl von biotinyliertem monoklonalem Maus-Anti-Mensch-IFN-gamma-Antikörper (2 Mikrogramm/ml in PBS/3% FCS/0,05% Tween 20) werden zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen werden 100 Mikroliter HRP-Streptavidin (1:4000) zugegeben und die Platten werden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden dann 6 × mit Wasch-Puffer gewaschen, 100 Mikroliter/Well Entwicklungslösung (TMB 1:1) werden zugegeben und die Platten werden für 5-15 Minuten entwickelt. Die Reaktion wird mit 50 Mikroliter/Well 1 M H₃PO₄ abgebrochen und bei OD450 abgelesen. Eine Kultur wird als positiv betrachtet, wenn mindestens 50 pg IFN-gamma/Well über dem Hintergrund gemessen werden und wenn es zweimal die Hintergrundhöhe der Expression beträgt.
CTL-Expansion.
Solche Kulturen, die spezifische lytische Aktivität gegen Peptid-gepulste Ziele und/oder Tumorziele zeigen, werden über eine Dauer von zwei Wochen mit Anti-CD3 expandiert. Kurz gesagt, werden 5 × 10⁴ CD8+-Zellen zu einem T25-Gefäß, das Folgendes enthält, gegeben: 1 × 10⁶ bestrahlte (4 200 rad) PBMC (autologe oder allogene) pro ml, 2 × 10⁵ bestrahlte (8 000 rad) EBV-transformierte Zellen pro ml und OKT3 (Anti-CD3) bei 30 ng pro ml in RPMI-1640, das 10% (v/v) menschliches AB-Serum, nicht-essentielle Aminosäuren, Natriumpyruvat, 25 μM 2-Mercaptoethanol, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin enthält. Rekombinantes menschliches IL2 wird 24 Stunden später bei einer Endkonzentration von 200 IU/ml und alle drei Tage danach mit frischem Medium bei 50 IU/ml zugegeben. Die Zellen werden geteilt, wenn die Zellkonzentration 1 × 10⁶/ml übersteigt, und die Kulturen werden zwischen den Tagen 13 und 15 bei E:T-Verhältnissen von 30, 10, 3 und 1:1 im ⁵¹Cr-Freisetzungsassay oder bei 1 × 10⁶/ml im in-situ-IFNγ-Assay unter Verwendung der gleichen Ziele wie vor der Expansion untersucht.
Kulturen werden bei Abwesenheit von Anti-CD3⁺ folgendermaßen expandiert. Solche Kulturen, die spezifische lytische Aktivität gegen Peptid- und endogene Ziele zeigen, werden selektiert und 5 × 10⁴ CD8⁺-Zellen werden zu einem T25-Gefäß, das Folgendes enthält, gegeben: 1 × 10⁶ autologe PBMC pro ml, die mit 10 μg/ml Peptid für zwei Stunden bei 37 °C Peptid-gepulst und bestrahlt (4 200 rad) wurden; 2 × 10⁵ bestrahlte (8 000 rad) EBV-transformierte Zellen pro ml RPMI-1640, das 10% (v/v) menschliches AB-Serum, nicht-essentielle AA, Natriumpyruvat, 25 mM 2-ME, L-Glutamin und Gentamicin enthält.
Immunogenität von A2-Supermotiv-tragenden Peptiden
Kreuzreaktive A2-Supermotiv-Bindungspeptide werden im zellulären Assay auf die Fähigkeit zur Induktion von peptidspezifischen CTL in normalen Individuen getestet. In dieser Analyse wird ein Peptid normalerweise als ein Epitop betrachtet, wenn es zumindest in Individuen peptidspezifische CTLs induziert und bevorzugt auch das endogen exprimierte Peptid erkennt.
Immunogenität kann auch unter Verwendung von PBMCs, die aus Patienten isoliert wurden, die einen 158P1D7-exprimierenden Tumor tragen, bestätigt werden. Kurz gesagt, werden PBMCs aus Patienten isoliert, mit Peptid-gepulsten Monozyten restimuliert und auf die Fähigkeit zur Erkennung von Peptid-gepulsten Zielzellen sowie transfizierten Zellen, die das Antigen endogen exprimieren, untersucht.
Bewertung von A*03/A11-Immunogenität
HLA-A3-Supermotiv-tragende kreuzreaktive Bindungspeptide werden auch zur Immunogenität unter Verwendung einer Methodik bewertet, die der analog ist, die zur Bewertung der Immunogenität der HLA-A2-Supermotiv-Peptide verwendet wird.
Bewertung von B7-Immunogenität
Immunogenität-Screening der kreuzreaktiven B7-Supertyp-Bindungspeptide, die, wie hierin dargelegt, identifiziert wurden, wird auf eine Weise bestätigt, die der Bestätigung von A2- und A3-Supermotiv-tragenden Peptiden analog ist.
Peptide, die andere Supermotive/Motive, z.B. HLA-A1, HLA-A24 usw., tragen, werden auch unter Verwendung einer ähnlichen Methodik bestätigt.
Beispiel 13: Anwendung des erweiterten Supermotivs zur Verbesserung der Bindungskapazität von nativen Epitopen durch Erzeugung von Analoga
HLA-Motive und -Supermotive (die primäre und/oder sekundäre Reste umfassen) sind bei der Identifizierung und Erzeugung von sehr kreuzreaktiven nativen Peptiden, wie hierin gezeigt, nützlich. Darüber hinaus ermöglicht die Definition von HLA-Motiven und -Supermotiven auch die Konstruktion von sehr kreuzreaktiven Epitopen durch Identifizierung von Resten innerhalb einer nativen Peptidsequenz, die analogisiert werden können, um dem Peptid bestimmte Charakteristiken zu verleihen, z.B. größere Kreuzreaktivität innerhalb der Gruppe von HLA-Molekülen, die einen Supertyp umfassen, und/oder größere Bindungsaffinität für einige oder alle dieser HLA-Moleküle. Beispiele zum Analogisieren von Peptiden, um modulierte Bindungsaffinität zu zeigen, sind in diesem Beispiel dargelegt.
Analogisieren an primären Ankerresten
Es werden Strategien zur Konstruktion von Peptiden angewendet, um die Kreuzreaktivität der Epitope weiter zu erhöhen. Beispielsweise werden die Hauptanker von A2-Supermotiv-tragenden Peptiden verändert, um beispielsweise ein bevorzugtes L, I, V oder M an Position 2 und I oder V am C-Terminus einzuführen.
Zur Analyse der Kreuzreaktivität der analogen Peptide wird jedes konstruierte Analogon anfänglich auf die Bindung zum Prototyp A2-Supertyp-Allel A*0201, dann, wenn A*0201-Bindungskapazität aufrechterhalten wird, auf A2-Supertyp-Kreuzreaktivität getestet.
Alternativ wird ein Peptid als bindend zu einem oder allen Supertyp-Mitgliedern bestätigt und dann analogisiert, um die Bindungsaffinität zu einem (oder mehreren) der Supertyp-Mitglieder zu modulieren, um die Bevölkerungsabdeckung zu erweitern.
Die Auswahl von Analoga zur Immunogenität in einer zellulären Screening-Analyse wird normalerweise weiter durch die Kapazität des Eltern-Wildtyp (WT)-Peptids beschränkt, um zumindest schwach, d. h. bei einem IC₅₀ von 5000 nM oder weniger, zu drei oder mehr A2-Supertyp-Allelen zu binden. Der Grund für dieses Erfordernis ist, dass die WT-Peptide endogen in ausreichender Menge vorliegen müssen, um biologisch relevant zu sein. Es wurde gezeigt, dass analogisierte Peptide eine erhöhte Immunogenität und Kreuzreaktivität durch T-Zellen, die für die Eltern-Epitope spezifisch sind, aufweisen (siehe z.B. Parkhurst et al, J. Immunol. 157:2539, 1996; und Pogue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8166, 1995).
Beim zellulären Screening dieser Peptidanaloga ist es wichtig, zu bestätigen, dass Analogon-spezifische CTLs auch zur Erkennung des Wildtyp-Peptids und, wenn möglich, der Zielzellen, die das Epitop endogen exprimieren, fähig sind.
Analogisieren von HLA-A3- und B7-Supermotiv-tragenden Peptiden Analoga von HLA-A3-Supermotiv-tragenden Epitopen werden unter Verwendung der Strategien erzeugt, die denen beim Analogisieren von HLA-A2-Supermotiv-tragenden Peptiden Eingesetzten ähnlich sind. Beispielsweise werden Peptide, die zu 3/5 der A3-Supertyp-Moleküle binden, an primären Ankerresten bearbeitet, um einen bevorzugten Rest (V, S, M oder A) an Position 2 zu besitzen.
Die analogen Peptide werden dann auf die Fähigkeit zur Bindung von A*03 und A*11 (Prototyp A3-Supertyp-Allele) getestet. Von solchen Peptiden, die ≤ 500 nM Bindungskapazität zeigen, wird dann bestätigt, das sie eine A3-Supertyp-Kreuzreaktivität aufweisen.
Ähnlich zu den A2- und A3-Motiv-tragenden Peptiden können Peptide, die 3 oder mehr B7-Supertyp-Allele binden, wo möglich, verbessert werden, um erhöhtes kreuzreaktives Binden oder eine größere Bindungsaffinität oder Bindungshalbwertzeit zu erhalten. B7-Supermotiv-tragende Peptide werden beispielsweise konstruiert, um einen bevorzugten Rest (V, I, L oder F) an der C-terminalen primären Ankerposition aufzuweisen, wie von Sidney et al. (J. Immunol. 157:3480-3490, 1996) gezeigt wurde.
Analogisieren an primären Ankerresten von anderen Motiv- und/oder Supermotiv-tragenden Epitopen wird auf eine ähnliche Weise ausgeführt.
Die analogen Peptide werden dann für Immunogenität bestätigt, normalerweise in einem zellulären Screening-Assay. Wieder ist es allgemein wichtig, zu zeigen, dass Analogon-spezifische CTLs auch fähig sind, das Wildtyp-Peptid und, wenn möglich, Ziele, die das Epitop endogen exprimieren, zu erkennen.
Analogisieren an sekundären Ankerresten
Darüber hinaus sind HLA-Supermotive bei der Konstruktion von sehr kreuzreaktiven Peptiden und/oder Peptiden, die HLA-Moleküle mit erhöhter Affinität binden, durch Identifizieren von bestimmten Resten an sekundären Ankerpositionen, die mit derartigen Eigenschaften in Verbindung gebracht werden, wertvoll.
Beispielsweise wird die Bindungskapazität eines B7-Supermotiv-tragenden Peptids mit einem F-Rest an Position 1 analysiert. Das Peptid wird dann analogisiert, um beispielsweise L für F an Position 1 zu substituieren. Das analogisierte Peptid wird für erhöhte Bindungsaffinität, Bindungshalbwertzeit und/oder erhöhte Kreuzreaktivität bewertet. Eine derartige Methode identifiziert analogisierte Peptide mit erweiterten Eigenschaften.
Konstruierte Analoga mit ausreichend verbesserter Bindungskapazität oder Kreuzreaktivität können auch auf Immunogenität in HLA-B7-transgenen Mäusen, beispielsweise der IFA-Immunisierung oder Lipopeptid-Immunisierung folgend, getestet werden. Analogisierte Peptide werden zusätzlich auf die Fähigkeit zur Stimulation einer Recall-Antwort unter Verwendung von PBMC aus Patienten mit 158P1D7-exprimierenden Tumoren getestet.
Andere Analogisierungsstrategien
Eine weitere Form der Analogisierung von Peptiden, nicht mit Ankerpositionen verbunden, schließt die Substitution eines Cysteins gegen α-Aminobuttersäure ein. Cystein hat aufgrund seiner chemischen Natur die Neigung, Disulfidbrücken zu bilden und das Peptid ausreichend strukturell derart zu verändern, dass die Bindungskapazität reduziert wird. Die Substitution von α-Aminobuttersäure für Cystein verringert nicht nur dieses Problem, sondern es wurde auch gezeigt, dass die Bindungs- und Kreuzbindungsfähigkeiten in einigen Fällen verbessert werden (siehe z.B. die Übersicht von Sette et al., In: Persistent Viral Infections, Hrsg. R. Ahmed und I. Chen, John Wiley & Sons, England, 1999).
Somit können die Bindungseigenschaften und/oder die Kreuzreaktivität von Peptidliganden für HLA-Supertyp-Moleküle durch die Anwendung von Substitutionen einzelner Aminosäuren moduliert werden.
Beispiel 14. Identifizierung und Bestätigung von 158P1D7-abstammenden Sequenzen mit HLA-DR-Bindungsmotiven
Peptid-Epitope, die ein HLA-Klasse-II-Supermotiv oder -Motiv tragen, werden, wie nachstehend dargestellt, unter Verwendung einer Methodik, die der für HLA-Klasse-I-Peptide Beschriebenen ähnlich ist, identifiziert und bestätigt.
Selektion von HLA-DR-Supermotiv-tragenden Epitopen.
Zur Identifizierung von 158P1D7-abstammenden HLA-Klasse-II-HTL-Epitopen wird das 158P1D7-Antigen auf die Gegenwart von Sequenzen, die ein HLA-DR-Motiv oder -Supermotiv tragen, analysiert. Es werden insbesondere 15- mer-Sequenzen selektiert, die ein DR-Supermotiv, das einen 9-mer-Kern umfasst, und N- und C-terminale flankierende drei-Reste-Regionen (insgesamt 15 Aminosäuren) umfassen.
Es wurden Protokolle zur Vorhersage von Peptidbindung zu DR-Molekülen entwickelt (Southwood et al., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998). Diese Protokolle ermöglichen, besonders für einzelne DR-Moleküle, das Untersuchen auf Treffer und Einordnen von 9-mer-Kernregionen. Jedes Protokoll untersucht Peptidsequenzen nicht nur auf die Gegenwart von primären DR-Supermotiv-Ankern (d.h. an Position 1 und Position 6) innerhalb eines 9-mer Kerns, sondern bewertet Sequenzen zusätzlich nach der Gegenwart von sekundären Ankern. Unter Verwendung von allelspezifischen Selektionstabellen (siehe z.B. Southwood et al., ibid.) wurde gefunden, dass diese Protokolle Peptidsequenzen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Bindung eines bestimmten DR-Moleküls effizient selektieren. Außerdem wurde gefunden, dass durch die Ausführung dieser Protokolle nacheinander, insbesondere solcher für DR1, DR4w4 und DR7, effizient DR-kreuzreaktive Peptide selektiert werden können.
Die vorstehend identifizierten 158P1D7-abstammenden Peptide werden auf ihre Bindungskapazität für verschiedene häufige HLA-DR-Moleküle getestet. Alle Peptide werden anfänglich auf Bindung zu den DR-Molekülen in der primären Gruppe: DR1, DR4w4 und DR7 getestet. Peptide, die mindestens zwei dieser drei DR-Moleküle binden, werden dann auf die Bindung zu DR2w2 β1-, DR2w2 β2-, DR6w19- und DR9-Molekülen in sekundären Assays getestet. Schließlich werden Peptide, die mindestens zwei der vier DR-Moleküle der sekundären Gruppe und somit kumulativ mindestens vier von sieben verschiedenen DR-Molekülen binden, für die Bindung zu DR4w15-, DRSw11- und DR8w2-Molekülen in tertiären Assays gescreent. Peptide, die mindestens sieben der zehn DR-Moleküle binden, was die primären, sekundären und tertiären Screening-Assays umfasst, werden als kreuzreaktive DR-Binder betrachtet. 158P1D7-Abstammende Peptide, von denen gefunden wurde, dass sie häufige HLA-DR-Allele binden, sind von besonderem Interesse.
Selektion von DR3-Motiv-Peptiden
Da HLA-DR3 ein Allel ist, das in kaukasischen, schwarzen und hispanischen Populationen verbreitet ist, ist DR3-Bindungskapazität ein relevantes Kriterium bei der Selektion von HTL-Epitopen. Somit könnten Peptide, von denen gezeigt wurde, dass sie Kandidaten sind, auch auf ihre DR3-Bindungskapazität getestet werden. Jedoch hinsichtlich der Bindungsspezifität des DR3-Motivs können auch Peptide, die nur zu DR3 binden, als Kandidaten für den Einschluss in einer Impfstoffformulierung betrachtet werden.
Zur effizienten Identifizierung von Peptiden, die DR3 binden, werden 158P1D7-Zielantigene auf Sequenzen analysiert, die eins von den zwei DR3-spezifischen Bindungsmotiven tragen, über die von Geluk et al. (J. Immunol. 152:5742-5748, 1994) berichtet wurde. Die entsprechenden Peptide werden dann synthetisiert und von ihnen wird bestätigt, dass sie die Fähigkeit besitzen, DR3 mit einer Affinität von 1 μM oder besser, d.h. weniger als 1 μM, zu binden. Es werden Peptide gefunden, die dieses Bindungskriterium erfüllen und sich als HLA-Klasse-II-Hochaffinitätsbinder eignen.
DR3-bindende Epitope, die auf diese Weise identifiziert werden, sind in Impfstoffzusammensetzungen mit DR-Supermotiv-tragenden Peptid-Epitopen eingeschlossen.
Ähnlich zum Fall von HLA-Klasse-I-Motiv-tragenden Peptiden werden die Klasse-II-Motiv-tragenden Peptide analogisiert, um die Affinität oder Kreuzreaktivität zu verbessern. Beispielsweise ist Asparaginsäure an Position 4 der 9-mer-Kernsequenz ein optimaler Rest zur DR3-Bindung und Substitution für diesen Rest verbessert häufig die DR3-Bindung.
Beispiel 15: Immunogenität von 158P1D7-abstammenden HTL-Epitopen
Dieses Beispiel bestimmt immunogene DR-Supermotiv- und DR3-Motivtragende Epitope unter denen, die unter Verwendung der hierin dargelegten Methodik identifiziert wurden.
Immunogenität von HTL-Epitopen wird auf eine Weise, die der Bestimmung von Immunogenität von CTL-Epitopen analog ist, durch Bewertung der Fähigkeit zur Stimulation von HTL-Antworten und/oder durch Verwendung geeigneter transgener Maus-Modelle bestätigt. Immunogenität wird durch Screening für Folgendes bestimmt: 1.) primäre in-vitro-Induktion unter Verwendung von normalen PBMC oder 2.) Recall-Antworten von Patienten, die 158P1D7-exprimierende Tumoren haben.
Beispiel 16: Berechnung von phänotypischen Häufigkeiten von HLA- Supertypen in verschiedenen ethnischen Hintergründen zur Bestimmung des Umfangs der Bevölkerungsabdeckung
Dieses Beispiel erläutert die Bewertung des Umfangs der Bevölkerungsabdeckung einer Impfstoffzusammensetzung, die aus multiplen Epitopen, die multiple Supermotive und/oder Motive umfassen, besteht.
Um die Bevölkerungsabdeckung zu analysieren werden Genhäufigkeiten von HLA-Allelen bestimmt. Die Genhäufigkeiten für jedes HLA-Allel werden aus Antigen- oder Allelhäufigkeiten unter Nutzung der Binomialverteilungsformel gf = 1 – (SQRT(1 – af)) berechnet (siehe z.B. Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996). Um gesamte phänotypische Häufigkeiten zu erhalten, werden kumulative Genhäufigkeiten berechnet und die kumulativen Antigenhäufigkeiten durch die Verwendung der Umkehrformel [af = 1 – (1 – Cgf)²] abgeleitet.
Wo keine Häufigkeitsdaten auf der Ebene der DNA-Eingabe verfügbar sind, wird Übereinstimmung zu den serologisch definierten Antigenhäufigkeiten angenommen. Um eine gesamte potentielle Supertyp-Bevölkerungsabdeckung zu erhalten, wird keine Verknüpfungsunausgewogenheit angenommen und es werden nur Allele eingeschlossen, von denen bestätigt wurde, dass sie zu jedem der Supertypen gehören (minimale Schätzungen). Schätzungen zur gesamten potentiellen Erfassung, die durch Kombinationen zwischen den Loci erhalten werden, werden durch Addieren des Anteils der Nicht-A-erfassten Population, von der erwartet werden könnte, dass sie durch die betrachteten B-Allele erfasst wird, zur A-Erfassung erstellt (z.B. Gesamt = A + B*(1 – A)). Bestätigte Mitglieder des A3-artigen Supertyps sind A3, A11, A31, A*3301 und A*6801. Obwohl der A3-artige Supertyp auch A34, A66 und A*7401 einschließen könnte, waren diese Allele nicht in den Berechnungen zur Gesamthäufigkeit eingeschlossen. Ebenso sind A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 und A*6901 bestätigte Mitglieder der A2-artigen Supertyp-Familie. Schließlich sind bestätigte Allele des B7-artigen Supertyps: B7, B*3501-03, B51, B*5301, B*5401, B*5501-2, B*5601, B*6701 und B*7801 (möglicherweise auch B*1401, B*3504-06, B*4201 und B*5602).
Die Bevölkerungsabdeckung, die durch Kombination der A2-, A3- und B7-Supertypen erhalten wurde, beträgt in fünf ethnischen Hauptgruppen ungefähr 86%. Die Erfassung kann durch Einschluss von Peptiden, die die A1- und A24-Motive tragen erweitert werden. Im Durchschnitt liegt A1 in 12% und A24 in 29% der Population über fünf verschiedene ethnische Hauptgruppen (kaukasisch, nordamerikanisch-schwarz, chinesisch, japanisch und hispanisch) hinweg vor. Zusammen werden diese Allele mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von 39% in diesen gleichen ethnischen Populationen repräsentiert. Die gesamte Erfassung über die größten Ethnizitäten hinweg ist, wenn A1 und A24 mit der Erfassung der A2-, A3-und B7-Supertyp-Allele kombiniert werden, > 95%. Es kann ein analoger Ansatz zur Schätzung der Bevölkerungsabdeckung, die durch Kombinationen von Klasse-II-Motiv-tragenden Epitopen erhalten wird, verwendet werden.
Immunogenitätsstudien in Menschen (z.B. Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Doolan et al., Immunity 7:97, 1997; und Threlkeld et al., J. Immunol. 159:1648, 1997) haben gezeigt, dass sehr kreuzreaktive Bindungspeptide fast immer als Epitope erkannt werden. Die Verwendung von sehr kreuzreaktiven Bindungspeptiden ist ein wichtiges Auswahlkriterium bei der Identifizierung von Kandidat-Epitopen für den Einschluss in einem Impfstoff, der in einer verschiedenartigen Population immunogen ist.
Mit einer ausreichenden Anzahl von Epitopen (wie hierin offenbart und aus der Technik) wird eine durchschnittliche Bevölkerungsabdeckung von größer als 95% in jeder der fünf ethnischen Hauptpopulationen vorausgesagt. Die Spieltheorie Monte-Carlo-Simulationsanalyse, die in der Technik bekannt ist (siehe z.B. Osborne, M. J. und Rubinstein, A. „A course in game theory" MIT Press, 1994), kann zur Schätzung, welcher Prozentanteil der Individuen in einer Population, die aus kaukasischen, nordamerikanisch-schwarzen, japanischen, chinesischen und hispanischen ethnischen Gruppen besteht, die hierin beschriebenen Impfstoff-Epitope erkennen würde, verwendet werden. Ein bevorzugter Prozentanteil ist 90%. Ein bevorzugterer Prozentanteil ist 95%.
Beispiel 17: CTL-Erkennung von endogen entwickelten Antigenen nach dem Primen
Dieses Beispiel bestätigt, dass CTL, die durch native oder analogisierte Peptid-Epitope, die, wie hierin beschrieben, identifiziert und selektiert wurden, induziert werden, endogen synthetisierte, d. h. native Antigene, erkennen.
Effektorzellen, die aus transgenen Mäusen, die mit Peptid-Epitopen, beispielsweise HLA-A2-Supermotiv-tragenden Epitopen, immunisiert werden, isoliert werden, werden in vitro unter Verwendung von Peptid-beschichteten Stimulatorzellen restimuliert. Sechs Tage später werden die Effektorzellen auf Cytotoxizität untersucht und die Zelllinien, die peptidspezifische cytotoxische Aktivität aufweisen, werden weiter restimuliert. Weitere sechs Tage später werden diese Zelllinien auf cytotoxische Aktivität gegenüber ⁵¹Cr-markierten Jurkat-A2.1/K^b-Zielzellen bei Abwesenheit oder in Gegenwart von Peptid getestet und auch gegenüber ⁵¹Cr-markierten Zielzellen, die das endogen synthetisierte Antigen tragen, d.h. Zellen, die mit 158P1D7-Expressionsvektoren stabil transfiziert sind, getestet.
Die Ergebnisse zeigen, dass CTL-Linien, die von Tieren erhalten werden, die mit Peptid-Epitop geprimt werden, endogen synthetisiertes 158P1D7-Antigen erkennen. Die Wahl des für eine derartige Analyse zu verwendenden Modells der transgenen Maus hängt vom/von den Epitop(en), die bewertet werden, ab. Zusätzlich zu HLA-A*0201/K^b-transgenen Mäusen wurden mehrere andere Modelle der transgenen Maus, einschließlich Mäusen mit menschlichem A11, die auch zur Bewertung von A3-Epitopen verwendet werden können, und B7-Allelen, charakterisiert und andere (z.B. transgene Mäuse für HLA-A1 und A24) werden entwickelt. HLA-DR1- und HLA DR3-Maus-Modelle wurden auch entwickelt, die zur Bewertung von HTL-Epitopen verwendet werden können.
Beispiel 18: Aktivität von CTL-HTL-konjugierten Epitopen in transgenen Mäusen
Dieses Beispiel erläutert die Induktion von CTLs und HTLs in transgenen Mäusen durch Verwendung von 158P1D7-abstammenden CTL- und HTL-Peptid-Impfstoffzusammensetzungen. Die hierin verwendete Impfstoffzusammensetzung umfasst Peptide, die an einen Patienten mit einem 158P1D7-exprimierenden Tumor verabreicht werden sollen. Die Peptidzusammensetzung kann multiple CTL- und/oder HTL-Epitope umfassen. Die Epitope werden unter Verwendung einer Methodik, wie hierin beschrieben, identifiziert. Dieses Beispiel veranschaulicht auch, dass erhöhte Immunogenität durch Einschluss von einem oder mehreren HTL-Epitopen in einer CTL-Impfstoffzusammensetzung erreicht werden kann; eine derartige Peptidzusammensetzung kann ein HTL-Epitop, das zu einem CTL-Epitop konjugiert ist, umfassen. Das CTL-Epitop kann eins sein, das zu multiplen HLA-Familienmitgliedern bei einer Affinität von 500 nM oder weniger oder Analoga dieses Epitops bindet. Die Peptide können lipidiert sein, falls erwünscht.
Immunisierungsmethoden: Die Immunisierung von transgenen Mäusen wird, wie beschrieben, durchgeführt (Alexander et al., J. Immunol. 159:4753-4761, 1997).
Beispielsweise werden A2/K^b-Mäuse, die für das menschliche HLA A2.1-Allel transgen sind, zur Bestätigung der Immunogenität von HLA-A*0201-Motiv- oder HLA-A2-Supermotiv-tragenden Epitopen verwendet und subkutan (Basis des Schwanzes) mit 0,1 ml Peptid in inkomplettem Freund-Adjuvans oder, wenn die Peptidzusammensetzung ein lipidiertes CTL/HTL-Konjugat ist, in DMSO/Kochsalzlösung oder, wenn die Peptidzusammensetzung ein Polypeptid ist, in PBS oder inkomplettem Freund-Adjuvans geprimt. Sieben Tage nach dem Primen werden Splenozyten, die von diesen Tieren erhalten wurden, mit syngenen bestrahlten LPS-aktivierten Lymphoblasten, die mit Peptid beschichtet sind, restimuliert.
Zelllinien: Zielzellen für peptidspezifische Cytotoxizitätsassays sind Jurkat-Zellen, die mit dem HLA-A2.1/K^b-chimären Gen transfiziert sind (z.B. Vitiello et al., J. Exp. Med. 173:1007, 1991).
In-vitro-CTL-Aktivierung: Eine Woche nach dem Primen werden Milzzellen (30 × 10⁶ Zellen/Gefäß) bei 37 °C mit syngenen, bestrahlten (3000 rad), Peptidbeschichteten Lymphoblasten (10 × 10⁶ Zellen/Gefäß) in 10 ml Kulturmedium/T25-Gefäß cokultiviert. Nach sechs Tagen werden Effektorzellen geerntet und auf cytotoxische Aktivität getestet.
Assay für cytotoxische Aktivität: Zielzellen (1,0 bis 1,5 × 10⁶) werden bei 37 °C in Gegenwart von 200 μl von ⁵¹Cr inkubiert. Nach 60 Minuten werden die Zellen dreimal gewaschen und in R10-Medium resupendiert. Falls erforderlich, wird Peptid bei einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben. Für den Assay werden 10⁴ ⁵¹Crmarkierte Zielzellen zu verschiedenen Konzentrationen von Effektorzellen (Endvolumen von 200 μl) in 96-Well-Platten mit U-Böden gegeben. Nach einer Inkubationsdauer von sechs Stunden bei 37 °C wird ein Aliquot von 0,1 ml vom Überstand aus jedem Well entfernt und die Radioaktivität wird in einem automatischen Micromedic Gamma-Zähler bestimmt. Der Prozentanteil der spezifischen Lyse wird durch folgende Formel bestimmt: Prozentanteil der spezifischen Freisetzung = 100 × (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung). Um den Vergleich zwischen separaten CTL-Assays, die unter den gleichen Bedingungen gelaufen sind, zu erleichtern, werden % ⁵¹Cr-Freisetzungsdaten als lytische Einheiten/10⁶ Zellen ausgedrückt. Eine lytische Einheit wird willkürlich als die Anzahl von Effektorzellen, die zum Erreichen von 30% Lyse von 10 000 Zielzellen in einem sechsstündigen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay erforderlich sind, definiert. Um die spezifischen lytischen Einheiten/10⁶ zu erhalten, werden die lytischen Einheiten/10⁶, die bei Abwesenheit von Peptid erhalten wurden, von den lytischen Einheiten/10⁶, die in Gegenwart von Peptid erhalten wurden, subtrahiert. Wenn beispielsweise 30% ⁵¹Cr-Freisetzung bei dem Effektor (E): Ziel (T)-Verhältnis von 50:1 (d.h. 5 × 10⁵ Effektorzellen für 10 000 Ziele) bei Abwesenheit von Peptid und 5:1 (d.h. 5 × 10⁴ Effektorzellen für 10 000 Ziele) in Gegenwart von Peptid erhalten werden, wären die spezifischen lytischen Einheiten: [(1/50 000) – (1/500 000)] × 10⁶ = 18 LU.
Die Ergebnisse werden analysiert, um die Größenordnung der CTL-Antworten von Tieren, denen immunogene CTL/HTL-Konjugat-Impfstoffzubereitung injiziert wurde, zu bewerten, und werden mit der Größenordnung der CTL-Antwort, die unter Verwendung von beispielsweise CTL-Epitopen erzielt wurde, wie vorstehend im Beispiel mit dem Titel „Bestätigung von Immunogenität" dargestellt ist, verglichen. Analysen, die hierzu ähnlich sind, können zur Bestätigung der Immunogenität von Peptidkonjugaten, die multiple CTL-Epitope und/oder multiple HTL-Epitope enthalten, ausgeführt werden. Entsprechend dieser Methoden wird gefunden, dass eine CTL-Antwort induziert wird, und gleichzeitig, dass eine HTL-Antwort bei Verabreichung derartiger Zusammensetzungen induziert wird.
Beispiel 19: Selektion von CTL- und HTL-Epitopen zum Einschluss in einem 158P1D7-spezifischen Impfstoff
Dieses Beispiel erläutert eine Methode zum Selektieren von Peptid-Epitopen für Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung. Die Peptide in der Zusammensetzung können in Form einer Nukleinsäuresequenz, entweder einer einzelnen oder einer oder mehrerer Sequenzen (d. h. Minigen), die Peptid(e) kodiert, vorliegen oder können einzelepitope und/oder polyepitope Peptide sein.
Die folgenden Prinzipien werden bei der Selektion einer Vielzahl von Epitopen zum Einschluss in einer Impfstoffzusammensetzung genutzt. Jedes der folgenden Prinzipien wird abgewogen, um eine Selektion durchzuführen.
Es werden Epitope ausgewählt, die bei Verabreichung Immunantworten nachahmen, die mit 158P1D7-Clearance korrelieren. Die Anzahl der verwendeten Epitope hängt von Beobachtungen von Patienten ab, die 158P1D7 spontan beseitigen. Wenn es beispielsweise beobachtet wurde, dass Patienten, die 158P1D7 spontan beseitigen, eine Immunantwort auf mindestens drei (3) vom 158P1D7-Antigen erzeugen, dann sollten drei oder vier (3-4) Epitope für HLA Klasse I eingeschlossen sein. Ein ähnliches Grundprinzip wird zur Bestimmung von HLA-Klasse-II-Epitopen verwendet.
Es werden häufig Epitope selektiert, die eine Bindungsaffinität von einer IC₅₀ von 500 nM oder kleiner für ein HLA-Klasse-I-Molekül oder für Klasse II eine IC₅₀ von 1000 nM oder kleiner haben, oder HLA-Klasse-I-Peptide mit hohen Bindungstreffern von der BIMAS-Webseite unter URL bimas.dcrt.nih.gov/.
Um eine breite Erfassung des Impfstoffs in einer gesamten verschiedenartigen Population zu erzielen, werden ausreichende Supermotiv-tragende Peptide oder eine ausreichende Reihe von allelspezifischen Motiv-tragenden Peptiden ausgewählt, um eine breite Bevölkerungsabdeckung zu ermöglichen. In einer Ausführungsform werden Epitope ausgewählt, um mindestens 80% Bevölkerungsabdeckung bereitzustellen. Eine Monte-Carlo-Analyse, eine in der Technik bekannte, statistische Bewertung, kann zur Beurteilung des Umfangs oder der Redundanz der Bevölkerungsabdeckung eingesetzt werden.
Bei der Erzeugung von polyepitopen Zusammensetzungen oder eines Minigens, das dieselben kodiert, ist es normalerweise wünschenswert, das kleinstmögliche Peptid, das das interessierende Epitop umfasst, zu erzeugen. Die eingesetzten Prinzipien sind ähnlich, wenn nicht die gleichen, wie die, die bei der Selektion eines Peptids, das geschachtelte Epitope umfasst, eingesetzt werden. Beispielsweise wird eine Proteinsequenz für die Impfstoffzusammensetzung ausgewählt, weil sie die maximale Anzahl von Epitopen, die innerhalb der Sequenz enthalten sind, aufweist, d.h. sie weist eine hohe Konzentration von Epitopen auf. Epitope können geschachtelt sein oder überlappen (d.h. Raster ist relativ zu einander verschoben). Beispielsweise können bei überlappenden Epitopen zwei 9-mer-Epitope und ein 10-mer-Epitop in einem Peptid aus 10 Aminosäuren vorliegen. Jedes Epitop kann von einem HLA-Molekül bei Verabreichung eines derartigen Peptids ausgesetzt und gebunden werden. Ein multiepitopes Peptid kann synthetisch, rekombinant oder über die Abspaltung von der nativen Quelle erzeugt werden. Alternativ kann ein Analogon von dieser nativen Sequenz hergestellt werden, wobei ein oder mehrere der Epitope Substitutionen umfassen, die die Kreuzreaktivitäts- und/oder Bindungsaffinitätseigenschaften des polyepitopen Peptids verändern. Eine derartige Impfstoffzusammensetzung wird für therapeutische oder prophylaktische Zwecke verabreicht. Diese Ausführungsform berücksichtigt die Möglichkeit, dass ein bisher unentdeckter Aspekt der Bearbeitung durch das Immunsystem auf die native geschachtelte Sequenz angewendet und dadurch die Herstellung von therapeutischen oder prophylaktischen Immunantwortinduzierenden Impfstoffzusammensetzungen ermöglicht werden wird. Außerdem berücksichtigt eine derartige Ausführungsform die Möglichkeit von Motiv-tragenden Epitopen für einen HLA-Aufbau, der derzeit unbekannt ist. Darüber hinaus lenkt diese Ausführungsform (ohne Erzeugung von irgendwelchen Analoga) die Immunantwort auf multiple Peptidsequenzen, die tatsächlich in 158P1D7 vorliegen, wodurch die Notwendigkeit zur Bewertung jeglicher funktionaler Epitope vermieden wird. Schließlich stellt die Ausführungsform Wirtschaftlichkeit durch große Serie bei der Herstellung von Nukleinsäure-Impfstoffzusammensetzungen bereit. In Bezug auf diese Ausführungsform können Computerprogramme entsprechend den Prinzipien in der Technik abgeleitet werden, die in einer Zielsequenz die größte Anzahl von Epitopen pro Sequenzlänge identifizieren.
Eine Impfstoffzusammensetzung, die aus selektierten Peptiden besteht, ist bei Verabreichung ungefährlich, wirksam und löst eine Immunantwort aus, die der Größenordnung einer Immunantwort ähnlich ist, die Zellen, die 158P1D7 tragen oder überexprimieren, kontrolliert oder beseitigt.
Beispiel 20: Konstruktion von "Minigen"-Multieuiton-DNA-Plasmiden
Dieses Beispiel diskutiert die Konstruktion eines Minigen-Expressionsplasmids. Minigen-Plasmide können natürlich verschiedene Konfigurationen von B-Zell-, CTL- und/oder HTL-Epitopen oder Epitopanaloga, wie hierin beschrieben, enthalten.
Ein Minigen-Expressionsplasmid schließt normalerweise multiple CTL- und HTL-Peptid-Epitope ein. Im vorliegenden Beispiel werden HLA-A2-, -A3-, -B7-Supermotiv-tragende Peptid-Epitope und HLA-A1- und -A24-Motiv-tragende Peptid-Epitope in Verbindung mit DR-Supermotiv-tragenden Epitopen und/oder DR3-Epitopen verwendet. HLA-Klasse-I-Supermotiv- oder -Motiv-tragende Peptid-Epitope, die von 158P1D7 abstammen, werden derart selektiert, dass multiple Supermotive/Motive repräsentiert werden, um eine breite Bevölkerungsabdeckung zu gewährleisten. Ähnlich werden HLA-Klasse-II-Epitope aus 158P1D7 selektiert, um eine breite Bevölkerungsabdeckung bereitzustellen, d.h. sowohl HLA-DR-1-4-7-Supermotiv-tragende Epitope als auch HLA-DR-3-Motiv-tragende Epitope werden zum Einschluss im Minigen-Konstrukt selektiert. Die selektierten CTL- und HTL-Epitope werden dann zur Expression in einem Expressionsvektor in ein Minigen eingebaut.
Ein derartiges Konstrukt kann zusätzlich Sequenzen einschließen, die die HTL-Epitope auf das endoplasmatische Reticulum lenken. Beispielsweise kann das Ii-Protein mit einem oder mehreren HTL-Epitopen, wie in der Technik beschrieben, fusioniert sein, worin die CLIP-Sequenz des Ii-Proteins entfernt ist und durch eine HLA-Klasse-II-Epitopsequenz ersetzt ist, sodass das HLA-Klasse-II-Epitop auf das endoplasmatische Reticulum gelenkt ist, wo das Epitop zu einem HLA-Klasse-II-Molekül bindet.
Dieses Beispiel erläutert die zu verwendenden Verfahren zur Konstruktion eines Minigen-tragenden Expressionsplasmids. Andere Expressionsvektoren, die für Minigenzusammensetzungen verwendet werden können, sind verfügbar und dem Fachmann bekannt.
Das Minigen-DNA-Plasmid dieses Beispiels enthält eine Konsensus-Kozak-Sequenz und eine murine Konsensus-Kappa-Ig-Leichtkette-Signalsequenz, gefolgt von CTL- und/oder HTL-Epitopen, die entsprechend den hierin offenbarten Prinzipien selektiert sind. Die Sequenz kodiert ein offenes Leseraster, das mit dem Myc- und His-Antikörperepitop-Tag fusioniert ist, der durch den pcDNA 3.1 Myc-His-Vektor kodiert wird.
Überlappende Oligonukleotide, die beispielsweise im Durchschnitt etwa 70 Nukleotide in der Länge mit 15 Nukleotidüberlappungen betragen können, werden synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Die Oligonukleotide kodieren die selektierten Peptid-Epitope sowie geeignete verknüpfende Nukleotide, Kozak-Sequenz und Signalsequenz. Das letzte multiepitope Minigen wird durch Erweitern der überlappenden Oligonukleotide in drei Reaktionsreihen unter Verwendung von PCR aufgebaut. Es wird ein Perkin/Elmer 9600 PCR-Gerät verwendet und es werden insgesamt 30 Zyklen unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C für 15 Sek., Annealing-Temperatur (5 ° unterhalb der niedrigsten berechneten Tm. für jedes Primer-Paar) für 30 Sek. und 72 °C für 1 min.
Beispielsweise wird ein Minigen folgendermaßen hergestellt. Für eine erste PCR-Reaktion werden 5 μg von jedem der zwei Oligonukleotide annealt und verlängert: In einem Beispiel werden unter Verwendung von acht Oligonukleotiden, d.h. vier Paaren von Primern, Oligonukleotide 1 + 2, 3 + 4, 5 + 6 und 7 + 8 in 100 μl Reaktionen, die Pfu-Polymerase-Puffer (1 x = 10 mM KCl, 10 mM (NH4)₂SO₄, 20 mM Tris-Chlorid, pH 8,75, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 100 μg/ml BSA), 0,25 mM von jedem dNTP und 2,5 U Pfu-Polymerase enthalten, vereinigt. Die Dimer-Produkte vollständiger Länge werden über ein Gel gereinigt und zwei Reaktionen, die das Produkt von 1 + 2 und 3 + 4 und das Produkt von 5 + 6 und 7 + 8 enthalten, werden gemischt, dem Annealing unterworfen und in 10 Zyklen verlängert. Die Hälften der zwei Reaktionen werden dann gemischt und es werden 5 Zyklen von Annealing und Verlängerung ausgeführt, bevor die flankierenden Primer zugegeben werden, um das Produkt in vollständiger Länge zu amplifizieren. Das Produkt vollständiger Länge wird über ein Gel gereinigt und in pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert und es werden einzelne Klone durch Sequenzieren gescreent.
Beispiel 21: Das Plasmidkonstrukt und der Grad, zu dem es die Immunogenität induziert.
Der Grad, zu dem ein Plasmidkonstrukt, beispielsweise ein Plasmid, das gemäß dem vorhergehenden Beispiel konstruiert wurde, fähig ist, Immunogenität zu induzieren, wird in vitro durch Bestimmen der Epitop-Präsentation durch APC, nach Transduktion oder Transfektion der APC mit einem Epitop-exprimierenden Nukleinsäurekonstrukt, bestätigt. Eine derartige Untersuchung bestimmt „Antigenität" und ermöglicht die Verwendung von menschlichen APC. Der Assay bestimmt die Fähigkeit des Epitops, durch die APC in einem Zusammenhang, der von einer T-Zelle erkannt wird, präsentiert zu werden, durch Quantifizieren der Dichte von Epitop-HLA-Klasse-I-Komplexen auf der Zelloberfläche. Die Quantifizierung kann durch direktes Messen der Menge von Peptid, das von den APC eluiert wird, erfolgen (siehe z.B. Sijts et al., J. Immunol. 156:683-692, 1996; Demotz et al., Nature 342:682-684, 1989); oder es kann die Anzahl der Peptid-HLA-Klasse-I-Komplexe durch Messen der Menge von Lyse oder Freisetzung von Lymphokin, was durch die erkrankten oder transfizierten Zielzellen induziert wird, und dann Bestimmen der Konzentration von Peptid, die zum Erhalt von äquivalenten Höhen von Lyse oder Freisetzung von Lymphokin notwendig ist, abgeschätzt werden (siehe z.B. Kageyama et al., J. Immunol. 154:567-576, 1995).
Alternativ wird Immunogenität durch in-vivo-Injektionen in Mäuse und anschließende in-vitro-Bewertung von CTL- und HTL-Aktivität, die unter Verwendung von Cytotoxizitäts- bzw. Proliferationsassays analysiert werden, bestätigt, wie z.B. in Alexander et al., Immunity 1:751-761, 1994, genau beschrieben ist.
Um beispielsweise die Kapazität eines DNA-Minigen-Konstrukts, das mindestens ein HLA-A2-Supermotiv-Peptid enthält, zur Induktion von CTLs in vivo zu bestätigen, werden beispielsweise HLA-A2.1/K^b-transgene Mäuse intramuskulär mit 100 μg nackter cDNA immunisiert. Um die Höhe von CTLs, die durch cDNA-Immunisierung induziert werden, vergleichen zu können, wird auch eine Kontrollgruppe von Tieren mit einer tatsächlichen Peptidzusammensetzung immunisiert, die multiple Epitope, die als ein einzelnes Polypeptid synthetisiert werden, wie sie durch das Minigen kodiert werden würden, umfasst.
Splenozyten von immunisierten Tieren werden zweimal mit jeder der jeweiligen Zusammensetzungen (Peptid-Epitope, die in dem Minigen oder dem polyepitopen Peptid kodiert sind) stimuliert, dann auf peptidspezifische cytotoxische Aktivität in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay getestet. Die Ergebnisse zeigen die Größenordnung der CTL-Antwort, die gegen das A2-restringierte Epitop gerichtet ist, an, wodurch die invivo-Immunogenität des Minigen-Impfstoffs und polyepitopen Impfstoffs angezeigt wird.
Es wird daher gefunden, dass das Minigen Immunantworten auslöst, die gegen die HLA-A2-Supermotiv-Peptid-Epitope gerichtet sind, wie auch der polyepitope Peptid-Impfstoff. Eine ähnliche Analyse wird auch unter Verwendung anderer HLA-A3- und HLA-B7-transgener Mausmodelle zur Bewertung von CTL-Induktion durch HLA-A3- und HLA-B7-Motiv- oder -Supermotiv-Epitope durchgeführt, wodurch auch gefunden wird, dass das Minigen entsprechende Immunantworten, die gegen die bereitgestellten Epitope gerichtet sind, auslöst.
Um die Kapazität eines Klasse-II-Epitop-kodierenden Minigens zur Induktion von HTLs in vivo zu bestätigen, werden beispielsweise DR-transgene Mäuse, oder für solche Epitope, die mit dem entsprechenden Maus-MHC-Molekül eine Kreuzreaktivität zeigen, beispielsweise 1-A^b-restringierte Mäuse intramuskulär mit 100 μg Plasmid-DNA immunisiert. Um die Höhe von HTLs, die durch DNA-Immunisierung induziert werden, vergleichen zu können, wird auch eine Kontrollgruppe von Tieren mit einer tatsächlichen Peptidzusammensetzung immunisiert, die in komplettem Freund-Adjuvans emulgiert ist. CD4+-T-Zellen, d.h. HTLs, werden aus den Splenozyten von immunisierten Tieren gereinigt und mit jedem der jeweiligen Zusammensetzungen (Peptide, die im Minigen kodiert sind) stimuliert. Die HTL-Antwort wird unter Verwendung eines ³H-Thymidin-Einbau-Proliferationsassays gemessen (siehe z.B. Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994). Die Ergebnisse zeigen die Größenordnung der HTL-Antwort, wodurch die invivo-Immunogenität des Minigens dargestellt wird.
DNA-Minigene, die, wie im vorangehenden Beispiel beschrieben, konstruiert sind, können auch als ein Impfstoff zusammen mit einem Boost-Mittel unter Verwendung eines Prime-Boost-Protokolls bestätigt werden. Das Boost-Mittel kann beispielsweise aus rekombinantem Protein (z.B. Barnett et al., Aids Res. and Human Retroviruses 14, Supplement (Anhang) 3:5299-5309, 1998) oder rekombinantem Vaccinia, das ein Minigen oder DNA exprimiert, das/die das interessierende vollständige Protein kodiert, bestehen (siehe z.B. Hanke et al., Vaccine 16:439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7648-53, 1998; Hanke und McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; und Robinson et al., Nature Med. 5:526-34, 1999).
Beispielsweise wird die Wirksamkeit des DNA-Minigens, das in dem Prime-Boost-Protokoll verwendet wird, anfänglich in transgenen Mäusen bewertet. In diesem Beispiel werden A2.1/K^b-transgene Mäuse IM mit 100 μg eines DNA-Minigens, das die immunogenen Peptide kodiert, einschließlich mindestens eines HLA-A2-Supermotiv-tragenden Peptids, immunisiert. Nach einer Inkubationsdauer (reicht von 3-9 Wochen) werden die Mäuse IP mit 10⁷ PFU/Maus eines rekombinanten Vaccinia-Virus, der die gleiche Sequenz, die durch das DNA-Minigen kodiert ist, exprimiert, geboostet. Kontrollmäuse werden mit 100 μg DNA oder rekombinantem Vaccinia ohne die Minigensequenz oder mit DNA, die das Minigen kodiert, doch ohne den Vaccinia-Boost immunisiert. Nach einer zusätzlichen Inkubationsdauer von zwei Wochen werden die Splenozyten aus den Mäusen sofort auf peptidsepzifische Aktivität in einem ELISPOT-Assay getestet. Außerdem werden Splenozyten in vitro mit den A2-restringierten Peptid-Epitopen, die in dem Minigen und rekombinantem Vaccinia kodiert sind, stimuliert, dann auf peptidspezifische Aktivität in einem Alpha-, Beta- und/oder Gamma-IFN-ELISA getestet.
Es wird gefunden, dass das in einem Prime-Boost-Protokoll genutzte Minigen größere Immunantworten auf die HLA-A2-Supermotiv-Peptide auslöst als mit DNA allein. Eine derartige Analyse kann auch unter Verwendung von HLA-A11- oder HLA-B7-transgenen Mausmodellen zur Bewertung von CTL-Induktion durch HLA-A3- oder HLA-B7-Motiv- oder -Supermotiv-Epitope ausgeführt werden. Die Verwendung von Prime-Boost-Protokollen in Menschen ist nachstehend im Beispiel mit dem Titel „Induktion von CTL-Antworten unter Verwendung eines Prime-Boost-Protokolls" beschrieben.
Beispiel 22: Peptidzusammensetzung für prophylaktische Verwendungen
Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Prävention von 158P1D7-Expression bei Personen verwendet werden, die für Tumoren, die dieses Antigen tragen, gefährdet sind. Beispielsweise wird eine polyepitope Peptid-Epitop-Zusammensetzung (oder eine Nukleinsäure, die dieselbe umfasst), die multiple CTL- und HTL-Epitope, wie zum Beispiel solche, die in den vorstehenden Beispielen selektiert wurden, enthält, die auch selektiert werden, um auf mehr als 80% der Population abzuzielen, an Individuen, die für einen 158P1D7-assoziierten Tumor gefährdet sind, verabreicht.
Beispielsweise wird eine Peptid-basierte Zusammensetzung als ein einzelnes Polypeptid, das multiple Epitope umfasst, bereitgestellt. Der Impfstoff wird normalerweise in einer physiologischen Lösung, die ein Adjuvans, wie zum Beispiel inkomplettes Freund-Adjuvans, umfasst, verabreicht. Die Dosis von Peptid zur anfänglichen Immunisierung beträgt von etwa 1 bis etwa 50 000 μg, allgemein 100-5 000 μg, für einen Patienten von 70 kg. Der anfänglichen Verabreichung von Impfstoff folgen Boost-Dosierungen bei 4 Wochen, gefolgt von der Bewertung der Größenordnung der Immunantwort im Patienten durch Techniken, die die Gegenwart von epitopspezifischen CTL-Populationen in einer PBMC-Probe bestimmen. Zusätzliche Boost-Dosen werden nach Bedarf verabreicht. Es wird gefunden, dass die Zusammensetzung als Prophylaxe gegen 158P1D7-assoziierte Erkrankung sowohl ungefährlich als auch wirksam ist.
Alternativ wird eine Zusammensetzung, die normalerweise transfizierende Mittel umfasst, zur Verabreichung eines Nukleinsäure-basierten Impfstoffs gemäß den in der Technik bekannten und hierin offenbarten Methodologien verwendet.
Beispiel 23: Polyepitope Impfstoffzusammensetzungen, die von nativen 158P1D7-Sequenzen abstammen
Eine native 158P1D7-Polyproteinsequenz wird analysiert, bevorzugt unter Verwendung von Computer-Algorithmen, die für jedes Klasse-I- und/oder Klasse-II-Supermotiv oder -Motiv definiert sind, um „relativ kurze" Regionen des Polyproteins zu identifizieren, die multiple Epitope umfassen. Die „relativ kurzen" Regionen sind bevorzugt kürzer in der Länge als ein gesamtes natives Antigen. Diese relativ kurze Sequenz, die multiple verschiedene oder überlappende, "geschachtelte" Epitope enthält, wird selektiert; sie kann zur Erzeugung eines Minigen-Konstrukts verwendet werden. Das Konstrukt wird konstruiert, um das Peptid, das der nativen Proteinsequenz entspricht, zu exprimieren. Das „relativ kurze" Peptid ist allgemein kürzer als 250 Aminosäuren in der Länge, häufig kürzer als 100 Aminosäuren in der Länge, bevorzugt kürzer als 75 Aminosäuren in der Länge und bevorzugter kürzer als 50 Aminosäuren in der Länge. Die Proteinsequenz der Impfstoffzusammensetzung wird selektiert, weil sie eine maximale Anzahl von Epitopen innerhalb der Sequenz enthält, d. h. sie weist eine hohe Konzentration von Epitopen auf. Wie hierin vermerkt, können Epitopmotive geschachtelt oder überlappend sein (d. h. Raster ist relativ zu einander verschoben). Beispielsweise können bei überlappenden Epitopen zwei 9-mer-Epitope und ein 10-mer-Epitop in einem Peptid von 10 Aminosäuren vorliegen. Eine derartige Impfstoffzusammensetzung wird für therapeutische oder prophylaktische Zwecke verabreicht.
Die Impfstoffzusammensetzung wird beispielsweise multiple CTL-Epitope aus dem 158P1D7-Antigen und mindestens ein HTL-Epitop einschließen. Diese polyepitope native Sequenz wird entweder als eine Peptid oder als eine Nukleinsäuresequenz, die das Peptid kodiert, verabreicht. Alternativ kann ein Analogon von dieser nativen Sequenz hergestellt werden, wodurch eins oder mehrere der Epitope Substitutionen umfassen, die die Kreuzreaktivitäts- und/oder Bindungsaffinitätseigenschaften des polyepitopen Peptids verändern.
Die Ausführungsform dieses Beispiels bietet die Möglichkeit, dass ein bisher unentdeckter Aspekt der Bearbeitung durch das Immunsystem auf die native geschachtelte Sequenz angewendet und dadurch die Produktion von therapeutischen oder prophylaktischen Immunantwort-induzierenden Impfstoffzusammensetzungen ermöglicht werden wird. Außerdem liefert eine derartige Ausführungsform die Möglichkeit von Motiv-tragenden Epitopen für einen HLA-Aufbau, der derzeit unbekannt ist. Darüber hinaus lenkt diese Ausführungsform (ausschließlich einer analogisierten Ausführungsform) die Immunantwort auf multiple Peptidsequenzen, die tatsächlich in nativem 158P1D7 vorliegen, wodurch die Notwendigkeit zur Bewertung jedweder funktionaler Epitope vermieden wird. Schließlich stellt die Ausführungsform eine Wirtschaftlichkeit durch große Serie bereit, wenn Peptid- oder Nukleinsäure-Impfstoffzusammensetzungen produziert werden.
Zugehörig zu dieser Ausführungsform sind Computerprogramme in der Technik verfügbar, die zur Identifizierung der größten Anzahl von Epitopen pro Sequenzlänge in einer Zielsequenz verwendet werden können.
Beispiel 24: Polyepitope Impfstoffzusammensetzungen aus multiplen Antigenen
Die 158P1D7-Peptid-Epitope der vorliegenden Erfindung werden zusammen mit Epitopen aus anderen Zieltumor-assoziierten Antigenen verwendet, um eine Impfstoffzusammensetzung zu erzeugen, die zur Prävention oder Behandlung von Krebs, der 158P1D7 und derartige andere Antigene exprimiert, nützlich ist. Beispielsweise kann eine Impfstoffzusammensetzung als ein einzelnes Polypeptid bereitgestellt werden, das multiple Epitope aus 158P1D7 sowie Tumor-assoziierten Antigenen einbaut, die häufig bei einem Zielkrebs, der mit 158P1D7-Expression in Verbindung gebracht wird, exprimiert werden, oder kann als eine Zusammensetzung verabreicht werden, die einen Cocktail von einem oder mehreren separaten Epitopen umfasst. Alternativ kann der Impfstoff als ein Minigen-Konstrukt oder als dendritische Zellen, die mit Peptid-Epitopen in vitro beladen wurden, verabreicht werden.
Beispiel 25: Verwendung von Peptiden zur Bewertung einer Immunantwort
Peptide der Erfindung können zur Analyse einer Immunantwort für die Gegenwart von spezifischen Antikörpern, CTL oder HTL, die auf 158P1D7 gerichtet sind, verwendet werden. Eine derartige Analyse kann auf eine Weise, die von Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1998, beschrieben wurde, durchgeführt werden. In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Peptide als ein Reagenz für diagnostische oder prognostische Zwecke, nicht als ein Immunogen, verwendet.
In diesem Beispiel werden sehr empfindliche tetramere Komplexe aus menschlichen Leukozyten und Antigenen („Tetramere") für eine Querschnittsanalyse von beispielsweise 158P1D7-HLA-A*0201-spezifischen CTL-Häufigkeiten von HLA-A*0201-positiven Individuen in unterschiedlichen Erkrankungsstadien oder nach Immunisierung, die ein 158P1D7-Peptid, das ein A*0201-Motiv enthält, umfasst, verwendet. Tetramere Komplexe werden, wie beschrieben, synthetisiert (Musey et al., N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997). Kurz gesagt, werden die aufgereinigte HLA-Schwerkette (A*0201 in diesem Beispiel) und β2-Mikroglobulin mittels eines prokaryotischen Expressionssystems synthetisiert. Die schwere Kette wird durch Deletion des cytosolischen Transmembran-Schwanzes und COOH-terminaler Addition einer Sequenz, die eine BirA-enzymatische Biotinylierungsstelle enthält, modifiziert. Die schwere Kette, (32-Mikroglobulin und Peptid werden durch Verdünnung erneut gefaltet. Das erneut gefaltete Produkt von 45 kD wird durch Fast Protein Liquid Chromatography (beschleunigte Protein-Flüssigchromatographie) isoliert und dann durch BirA in Gegenwart von Biotin (Sigma, St. Louis, Missouri), Adenosin-5'-triphosphat und Magnesium biotinyliert. Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat wird in einem molaren 1:4-Verhältnis zugegeben und das tetramere Produkt wird auf 1 mg/ml konzentriert. Das resultierende Produkt wird als Tetramerq-Phycoerythrin bezeichnet.
Für die Analyse von Blutproben von Patienten werden ungefähr eine Million PBMCs bei 300 g für 5 Minuten zentrifugiert und in 50 μl kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert. Es wird eine dreifarbige Analyse mit dem Tetramer-Phycoerythrin, zusammen mit Anti-CD8-Tricolor und Anti-CD38 durchgeführt. Die PBMCs werden mit Tetramer und Antikörpern für 30 bis 60 min auf Eis inkubiert und dann zweimal vor der Formaldehyd-Fixierung gewaschen. Es werden „Gates" angewendet, um > 99,98% Kontrollproben zu enthalten. Die Kontrollen für die Tetramere schließen sowohl A*0201-negative Individuen als auch A*0201-positive nicht-erkrankte Spender ein. Der Prozentanteil von Zellen, die mit dem Tetramer gefärbt sind, wird dann durch Flow-Cytometrie bestimmt. Die Ergebnisse zeigen die Anzahl von Zellen in der PBMC-Probe an, die Epitop-restringierte CTLs enthalten, wodurch leicht das Ausmaß von Immunantwort auf das 158P1D7-Epitop und damit der Status der Aussetzung zu 158P1D7 oder Aussetzung zu einem Impfstoff, der eine protektive oder therapeutische Antwort auslöst, angezeigt wird.
Beispiel 26: Verwendung von Peptid-Epitopen zur Bewertung von Recall-Antworten
Die Peptid-Epitope der Erfindung werden als Reagenzien zur Bewertung von T-Zell-Antworten, wie zum Beispiel akuten oder Recall-Antworten, in Patienten verwendet. Eine derartige Analyse kann an Patienten ausgeführt werden, die von 158P1D7-assoziierter Erkrankung genesen haben oder die mit einem 158P1D7-Impfstoff geimpft wurden.
Beispielsweise kann die Klasse-I-restringierte CTL-Antwort von Personen, die geimpft wurden, analysiert werden. Der Impfstoff kann jedweder 158P1D7-Impfstoff sein. PBMC werden aus den geimpften Individuen gewonnen und HLA-typisiert. Geeignete Peptid-Epitope der Erfindung, die, optimalerweise Supermotive tragen, um Kreuzreaktivität mit mehreren HLA-Supertyp-Familienmitgliedern bereitzustellen, werden dann zur Analyse von Proben verwendet, die aus Individuen stammen, die den HLA-Typ tragen.
PBMC aus geimpften Individuen werden mit Ficoll-Histopaque Dichtegradienten (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) abgetrennt, dreimal in HBSS (GIBCO Laboratories) gewaschen, in RPMI 1640 (GIBCO Laboratories), was mit L-Glutamin (2 mM), Penicillin (50 U/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und Hepes (10 mM), was 10% Hitze-inaktiviertes menschliches AB-Serum (komplettes RPMI) enthält, ergänzt wird, resupendiert und unter Verwendung von Mikrokultur-Formaten auf Platten ausgestrichen. Ein synthetisches Peptid, das ein Epitop der Erfindung umfasst, wird bei 10 μg/ml zu jedem Well gegeben und HBV-Core-128-140-Epitop wird bei 1 μg/ml zu jedem Well als eine Quelle von T-Zell-Hilfe während der ersten Woche der Stimulation zugegeben.
Im Mikrokultur-Format werden 4 × 10⁵ PBMC mit Peptid in 8 Replikatkulturen in einer 96-Well-Platte mit runden Böden in 100 μl/Well komplettem RPMI stimuliert. An den Tagen 3 und 10 werden 100 μl komplettes RPMI und 20 U/ml Endkonzentration von rIL-2 zu jedem Well gegeben. Am Tag 7 werden die Kulturen in eine 96-Well-Platte mit flachen Böden überführt und mit Peptid, rIL-2 und 10⁵ bestrahlten (3 000 rad) autologen Nährzellen restimuliert. Die Kulturen werden auf cytotoxische Aktivität am Tag 14 getestet. Eine positive CTL-Antwort erfordert zwei oder mehr der acht Replikatkulturen, um mehr als 10% spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung anzuzeigen, was auf dem Vergleich mit nicht-erkrankten Kontrollsubjekten beruht, wie zuvor beschrieben wurde (Rehermann, et al., Nature Med. 2:1104,1108, 1996; Rehermann et al., J. Clin. Invest. 97:1655-1665, 1996; und Rehermann et al., J. Clin. Invest. 98:1432-1440, 1996).
Zielzelllinien sind autologe und allogene EBV-transformierte B-LCL, die entweder von der American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI, Boston, MA) erworben werden oder aus dem Pool von Patienten, wie beschrieben (Guilhot et al., J. Virol. 66:2670-2678, 1992), erstellt werden.
Cytotoxizitätsassays werden auf folgende Weise durchgeführt. Zielzellen bestehen entweder aus allogener HLA-gematchter oder autologer EBV-transformierter B-lymphoblastoider Zelllinie, die über Nacht mit dem synthetischen Peptid-Epitop der Erfindung bei 10 μM inkubiert und mit 100 μCi von ⁵¹Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) für 1 Stunde markiert werden, wonach sie viermal mit HBSS gewaschen werden.
Zytolytische Aktivität wird in einem normalen Split-Well-⁵¹Cr-Freisetzungsassay für 4 h unter Verwendung von 96-Well-Platten mit U-Böden, die 3 000 Ziele/Well enthalten, bestimmt. Stimulierte PBMC werden bei Effektor/Ziel (E/T)-Verhältnissen von 20-50:1 am Tag 14 getestet. Die prozentuale Cytotoxizität wird aus folgender Formel bestimmt: 100 × [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)]. Die maximale Freisetzung wird durch Lyse von Zielen durch Detergens (2% Triton X-100; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bestimmt. Spontane Freisetzung beträgt < 25% der maximalen Freisetzung für alle Experimente.
Die Ergebnisse einer derartigen Analyse zeigen das Ausmaß, zu dem HLArestringierte CTL-Populationen durch vorherige Aussetzung zu 158P1D7 oder einem 158P1D7-Impfstoff stimuliert wurden.
Ähnlich können auch Klasse-II-restringierte HTL-Antworten analysiert werden. Aufgereinigte PBMC werden in einer 96-Well-Platte mit flachen Böden bei einer Dichte von 1,5 × 10⁵ Zellen/Well kultiviert und werden mit 10 μg/ml synthetischem Peptid der Erfindung, gesamtem 158P1D7-Antigen oder PHA stimuliert. Die Zellen werden routinemäßig in Replikaten von 4-6 Wells für jede Bedingung ausgestrichen. Nach sieben Tagen der Kultur wird das Medium entfernt und durch frisches Medium, das 10 U/ml IL-2 enthält, ersetzt. Zwei Tage später wird 1 μCi ³H-Thymidin zu jedem Well gegeben und die Inkubation wird für zusätzliche 18 Stunden fortgesetzt. Dann wird zelluläre DNA auf Glasfasermatten geerntet und auf ³H-Thymidin-Einbau analysiert. Antigenspezifische T-Zell-Proliferation wird als das Verhältnis von ³H-Thymidin-Einbau in Gegenwart von Antigen, dividiert durch den ³H-Thymidin-Einbau bei Abwesenheit von Antigen berechnet.
Beispiel 27: Induktion von spezifischer CTL-Antwort in Menschen
Eine klinische Prüfung für Menschen für eine immunogene Zusammensetzung, die CTL- und HTL-Epitope der Erfindung umfasst, ist als eine IND-Phase-1- Dosiseskalationsstudie aufgebaut und wird als randomisierte, doppelblinde, Plazebokontrollierte Prüfung durchgeführt. Eine derartige Prüfung wird beispielsweise wie folgendermaßen entwickelt:
Es werden insgesamt etwa 27 Individuen eingeschlossen und in 3 Gruppen eingeteilt:
Gruppe I: 3 Subjekten wird Plazebo injiziert und 6 Subjekten werden 5 μg Peptidzusammensetzung injiziert;
Gruppe II: 3 Subjekten wird Plazebo injiziert und 6 Subjekten werden 50 μg Peptidzusammensetzung injiziert;
Gruppe III: 3 Subjekten wird Plazebo injiziert und 6 Subjekten werden 500 μg Peptidzusammensetzung injiziert.
Nach 4 Wochen nach der ersten Injektion erhalten alle Subjekte eine Boost-Inokulation bei der gleichen Dosierung.
Die gemessenen Endpunkte in dieser Studie hängen mit der Sicherheit und Verträglichkeit der Peptidzusammensetzung sowie ihrer Immunogenität zusammen. Zelluläre Immunantworten auf die Peptidzusammensetzung sind ein Index der intrinsischen Aktivität dieser Peptidzusammensetzung und können daher als ein Maß von biologischer Wirksamkeit angesehen werden. Folgendes fasst die klinischen und Labordaten, die mit Sicherheits- und Wirksamkeitsendpunkten zusammenhängen, zusammen.
Sicherheit: Die Häufigkeit von negativen Fällen wird in der Plazebo- und Arzneimittelbehandlungs-Gruppe überwacht und hinsichtlich des Grads und der Reversibilität bewertet.
Bewertung von Impfstoffwirksamkeit: Zur Bewertung von Impfstoffwirksamkeit werden die Subjekte vor und nach der Injektion geblutet. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus dem frisch heparinisierten Blut durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientzentrifugation isoliert, in Aliquoten in gefrierendem Medium aufgeteilt und gefroren gelagert. Die Proben werden auf CTL- und HTL-Aktivität getestet.
Es wurde gefunden, dass der Impfstoff sowohl ungefährlich als auch wirksam ist.
Beispiel 28: Phase-II-Prüfungen in Patienten, die 158P1D7 exprimieren
Phase-II-Prüfungen werden zur Untersuchung der Wirkung der Verabreichung der CTL-HTL-Peptidzusammensetzungen an Patienten mit Krebs, der 158P1D7 exprimiert, durchgeführt. Die Hauptziele der Prüfung sind die Bestimmung einer wirksamen Dosis und eines Regimes zum Induzieren von CTLs in Krebspatienten, die 158P1D7 exprimieren, die Feststellung der Sicherheit des Induzierens einer CTL- und HTL-Antwort in diesen Patienten und die Ermittlung, zu welchem Ausmaß die Aktivierung von CTLs das klinische Bild dieser Patienten verbessert, wie z.B. durch die Reduzierung und/oder Schrumpfung von Läsionen manifestiert ist. Eine derartige Studie wird beispielsweise folgendermaßen entwickelt:
Die Untersuchungen werden multizentrisch ausgeführt. Das Prüfungsdesign ist ein offenes, nicht kontrolliertes Dosiseskalationsprotokoll, worin die Peptidzusammensetzung als eine einzelne Dosis verabreicht wird, gefolgt von einer einzelnen Boost-Einspritzung der gleichen Dosis sechs Wochen später. Die Dosierungen sind 50, 500 und 5 000 Mikrogramm pro Injektion. Arzneimittelassoziierte Nebenwirkungen (Schwere und Reversibilität) werden aufgenommen.
Es gibt drei Patientengruppierungen. Der ersten Gruppe werden 50 Mikrogramm der Peptidzusammensetzung und der zweiten und dritten Gruppe werden 500 bzw. 5 000 Mikrogramm der Peptidzusammensetzung injiziert. Die Patienten innerhalb jeder Gruppe reichen altersmäßig von 21-65 und repräsentieren verschiedene ethnische Hintergründe. Alle von ihnen haben einen Tumor, der 158P1D7 exprimiert.
Klinische Manifestationen oder antigenspezifische T-Zell-Antworten werden überwacht, um die Wirkungen der Verabreichung der Peptidzusammensetzungen zu bewerten. Es wurde gefunden, dass die Impfstoffzusammensetzung bei der Behandlung von 158P1D7-assoziierter Erkrankung sowohl ungefährlich als auch wirksam ist.
Beispiel 29: Induktion von CTL-Antworten unter Verwendung eines Prime-Boost-Protokolls
Ein Prime-Boost-Protokoll, das in seinem grundlegenden Prinzip dem ähnlich ist, das zur Bestätigung der Wirksamkeit eines DNA-Impfstoffs in transgenen Mäusen verwendet wurde, wie vorstehend im Beispiel mit dem Titel „Das Plasmidkonstrukt und der Grad, zu dem es die Immunogenität induziert" beschrieben wurde, kann auch zur Verabreichung des Impfstoffs an Menschen verwendet werden. Ein derartiges Impfstoff-Regime kann eine anfängliche Verabreichung von beispielsweise nackter DNA einschließen, gefolgt von einem Boost unter Verwendung von rekombinantem Virus, der den Impfstoff kodiert, oder rekombinantem Protein/Polypeptid oder einer Peptidmischung, die in einem Adjuvans verabreicht werden.
Die anfängliche Immunisierung kann beispielsweise unter Verwendung eines Expressionsvektors, wie zum Beispiel dessen, der im Beispiel mit dem Titel „Konstruktion von ,Minigen'-Multi-Epitop-DNA-Plasmiden" konstruiert wurde, in Form von nackter Nukleinsäure, die IM (oder SC oder ID) in den Mengen von 0,5-5 mg an mehreren Stellen verabreicht wird, ausgeführt werden. Die Nukleinsäure (0,1 bis 1000 μg) kann auch unter Verwendung einer Genpistole (gene gun) verabreicht werden. Nach einer Inkubationsdauer von 3-4 Wochen wird dann eine Boost-Dosis verabreicht. Der Booster kann rekombinanter Hühnerpocken-Virus sein, der bei einer Dosis von 5-10⁷ bis 5 × 10⁹ PFU verabreicht wird. Ein alternativer rekombinanter Virus, wie zum Beispiel ein MVA, Kanarienpocken-, Adenovirus oder Adenoassoziierter Virus, kann auch für den Booster verwendet werden oder es kann das polyepitope Protein oder eine Mischung der Peptide verabreicht werden. Zur Bewertung der Impfstoffwirksamkeit werden Blutproben von Patienten vor Immunisierung sowie in Zeitabständen nach Verabreichung der anfänglichen Impfstoffdosen und Boost-Dosen des Impfstoffs erhalten. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus dem frisch heparinisierten Blut durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientzentrifugation isoliert, in Aliquoten in gefrierendem Medium aufgeteilt und gefroren gelagert. Die Proben werden auf CTL- und HTL-Aktivität getestet.
Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass eine Größenordnung der Antwort erzeugt wird, die ausreichend ist, um eine therapeutische oder protektive Immunität gegen 158P1D7 zu erzielen.
Beispiel 30: Verabreichung von Impfstoffzusammensetzungen unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC)
Impfstoffe, die Peptid-Epitope der Erfindung umfassen, können unter Verwendung von APCs oder „professionellen" APCs, wie zum Beispiel DC, verabreicht werden. In diesem Beispiel werden Peptid-gepulste DC an einen Patienten verabreicht, um eine CTL-Antwort in vivo zu stimulieren. In diesem Verfahren werden dendritische Zellen isoliert, expandiert und mit einem Impfstoff, der Peptid-CTL- und -HTL-Epitope der Erfindung umfasst, gepulst. Die dendritischen Zellen werden dem Partienten zurückinfundiert, um in vivo CTL- und HTL-Antworten auszulösen. Die induzierten CTL und HTL zerstören bzw. ermöglichen dann die Zerstörung der Zielzellen, die das 158P1D7-Protein tragen, von dem die Epitope im Impfstoff abstammen.
Beispielsweise wird ein Cocktail von Epitop-umfassenden Peptiden ex vivo an PBMC oder isolierte DC davon verabreicht. Es kann ein Arzneimittel verwendet werden, um die Ernte der DC zu erleichtern, wie zum Beispiel Progenipoietin^TM (Monsanto, St. Louis, MO) oder GM-CSF/IL-4. Nach dem Pulsen der DC mit Peptiden und vor der Reinfusion in Patienten werden die DC gewaschen, um ungebundene Peptide zu entfernen.
Wie klinisch eingesehen und vom Fachmann aufgrund der klinischen Ergebnisse leicht bestimmt wird, kann die Anzahl von DC, die in den Patienten reinfundiert werden, variieren (siehe z.B., Nature Med. 4:328, 1998; Nature Med. 2:52, 1996, and Prostate 32:272, 1997). Obwohl normalerweise 2-50 × 10⁶ DC pro Patient verabreicht werden, kann auch eine größere Anzahl von DC, wie zum Beispiel 10⁷ oder 10⁸, bereitgestellt werden. Derartige Zellpopulationen enthalten normalerweise zwischen 50-90% DC.
In einigen Ausführungsformen werden den Patienten Peptid-beladene PBMC ohne Aufreinigung der DC injiziert. Beispielsweise werden den Patienten PBMC, die nach Behandlung mit einem Mittel, wie zum Beispiel Progenipoietin^TM, erzeugt werden, ohne Reinigung der DC injiziert. Die Gesamtzahl von PBMC, die verabreicht werden, reicht häufig von 10⁸ bis 10¹⁰. Allgemein basieren die Zelldosen, die den Patienten injiziert werden, auf dem Prozentanteil von DC im Blut eines jeden Patienten, wie beispielsweise durch Immunfluoreszenz-Analyse mit spezifischen Anti-DC-Antikörpern bestimmt wird. Wenn somit beispielsweise Progenipoietin^TM 2% DC im perpheren Blut eines gegebenen Patienten mobilisiert und dieser Patient 5 × 10⁶ DC erhalten soll, dann werden dem Patienten insgesamt 2.5 × 10⁸ Peptidbeladene PBMC injiziert werden. Der Prozentanteil von DC, die durch ein Mittel, wie zum Beispiel Progenipoietin^TM, mobilisiert werden, wird normalerweise auf zwischen 2-10% geschätzt, kann aber variieren, wie vom Fachmann eingesehen wird.
Ex-vivo-Aktivierung von CTL/HTL-Antworten
Alternativ können ex-vivo-CTL- oder -HTL-Antworten auf 158P1D7-Antigene durch Inkubieren von CTL- oder HTL-Vorläuferzellen des Patienten oder genetisch verträglicher, zusammen mit einer Quelle von APC, wie zum Beispiel DC, und immunogenen Peptiden in Gewebekultur, induziert werden. Nach einer entsprechenden Inkubationszeit (normalerweise etwa 7-28 Tage), in der die Vorläuferzellen aktiviert und in Effektorzellen expandiert werden, werden die Zellen dem Patienten infundiert, wo sie ihre spezifischen Zielzellen, d. h. Tumorzellen, zerstören werden (CTL) oder die Zerstörung dieser ermöglichen (HTL).
Beispiel 31: Ein alternatives Verfahren zur Identifizierung und Bestätigung von Motiv-tragenden Peptiden
Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung und Bestätigung von Motivtragenden Peptiden ist die Eluierung dieser von Zellen, die definierte MHC-Moleküle tragen. Beispielsweise wurden EBV-transformierte B-Zelllinien, die zur Typisierung von Gewebe verwendet werden, ausführlich charakterisiert, um zu bestimmen, welche HLA-Moleküle sie exprimieren. In bestimmten Fällen exprimieren diese Zellen nur einen einzigen Typ von HLA-Molekülen. Diese Zellen können mit Nukleinsäuren, die das interessierende Antigen, z.B. 158P1D7, exprimieren, transfiziert werden. Peptide, die durch endogene Antigen-Verarbeitung von Peptiden, die infolge von Transfektion produziert werden, produziert werden, werden dann zu HLA-Molekülen innerhalb der Zelle binden und transportiert und auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Peptide werden dann durch Aussetzung zu mild sauren Bedingungen von den HLA-Molekülen eluiert und ihre Aminosäuresequenz wird bestimmt, z.B. durch Massenspektralanalyse (z.B. Kubo et al., J. Immunol. 152:3913, 1994). Da die Mehrheit der Peptide, die ein bestimmtes HLA-Molekül binden, Motiv-tragend ist, ist dies eine alternative Modalität zum Erhalten der Motiv-tragenden Peptide, die mit dem bestimmten HLA-Molekül, das auf der Zelle exprimiert wird, korrelieren.
Alternativ können Zelllinien, die keine endogenen HLA-Moleküle exprimieren, mit einem Expressionskonstrukt, das ein einziges HLA-Allel kodiert, transfiziert werden. Diese Zellen können dann, wie beschrieben, verwendet werden, d. h. sie können dann mit Nukleinsäuren, die 158P1D7 kodieren, transfiziert werden, um Peptide zu isolieren, die 158P1D7 entsprechen, die auf der Zelloberfläche präsentiert wurden. Peptide, die aus einer derartigen Analyse erhalten werden, werden Motiv(e) tragen, die dem Binden zu dem einzigen HLA-Allel, das in der Zelle exprimiert wird, entsprechen.
Wie vom Fachmann eingesehen wird, kann man eine ähnliche Analyse auf einer Zelle, die mehr als ein HLA-Allel trägt, ausführen und anschließend Peptide, die für jedes exprimierte HLA-Allel spezifisch sind, bestimmen. Außerdem würde ein Fachmann auch erkennen, dass andere Mittel als die Transfektion, wie zum Beispiel Beladen mit einem Protein-Antigen, zur Bereitstellung einer Quelle von Antigen für die Zelle verwendet werden können.
Beispiel 32: Komplementäre Polynukleotide
Sequenzen, die den 158P1D7-kodierenden Sequenzen komplementär sind, oder jedwede Teile davon, werden zum Nachweis, zur Reduzierung oder Inhibierung der Expression von natürlich vorkommendem 158P1D7 verwendet. Obwohl die Verwendung von Oligonukleotiden, die von etwa 15 bis 30 Basenpaare umfassen, beschrieben ist, wird im Wesentlichen die gleiche Methode mit kleineren oder mit größeren Sequenzfragmenten verwendet. Es werden geeignete Oligonukleotide unter Verwendung von z.B. OLIGO 4.06 Software (National Biosciences) und der kodierenden Sequenz von 158P1D7 entwickelt. Zur Inhibierung der Transkription wird ein komplementäres Oligonukleotid aus der einzigartigsten 5'-Sequenz entwickelt und zur Verhinderung der Promotor-Bindung zur kodierenden Sequenz verwendet. Zur Inhibierung der Translation wird ein komplementäres Oligonukleotid entwickelt, um ribosomale Bindung zum 158P1D7-kodierenden Transkript zu verhindern.
Beispiel 33: Aufreinigung von natürlich vorkommendem oder rekombinantem 158P1D7 unter Verwendung von 158P1D7-spezifischen Antikörpern
Natürlich vorkommendes oder rekombinantes 158P1D7 wird im Wesentlichen durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für 158P1D7 spezifisch sind, aufgereinigt. Eine Immunaffinitätssäule wird durch kovalentes Kuppeln von Anti-158P1D7-Antikörper an ein aktiviertes chromatographische Harz, wie zum Beispiel CNBr-aktivierte SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech) aufgebaut. Nach dem Kuppeln wird das Harz gemäß den Vorschriften des Herstellers blockiert und gewaschen.
Medien, die 158P1D7 enthalten, werden über die Immunaffinitätssäule gegeben und die Säule wird unter den Bedingungen gewaschen, die die begünstigte Absorption von 158P1D7 ermöglichen (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Die Säule wird unter Bedingungen eluiert, die die Antikörper/158P1D7- Bindung unterbrechen (z.B. ein Puffer von pH 2 bis pH 3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops, wie zum Beispiel Harnstoff oder Thiocyanation) und GCR.P wird gesammelt.
Beispiel 34: Identifizierung von Molekülen, die mit 158P1D7 wechselwirken
158P1D7 oder biologisch aktive Fragmente davon werden mit 121 1 Bolton-Hunter-Reagenz markiert.
(Siehe z.B. Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133:529.) Kandidatenmoleküle, die zuvor in den Wells einer Multi-Well-Platte angeordnet wurden, werden mit dem markierten 158P1D7 inkubiert, gewaschen und jegliche Wells mit markiertem 158P1D7-Komplex werden getestet. Die Daten, die unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von 158P1D7 erhalten werden, werden zur Berechnung von Werten für die Anzahl, Affinität und Verbindung von 158P1D7 mit den Kandidatenmolekülen verwendet. In dieser gesamten Anmeldung wird auf den datengehalt verschiedener Webseiten, verschiedene Veröffentlichungen, Anmeldungen und Patente verwiesen. (Auf Webseiten wird durch ihre Internetadressen (Uniform Resource Locator) oder URL-Adressen im World Wide Web verwiesen.)
Beispiel 35: In-vivo-Assay für 158P1D7-Tumorwachstumspromotion
Die Wirkung des 158P1D7-Proteins auf Tumorzellwachstum kann in vivo durch Genüberexpression in Blasenkrebszellen bestätigt werden. Beispielsweise können SCID-Mäusen SQ an jeder Flanke 1 × 10⁶ Blasenkrebszellen (wie zum Beispiel SCaBER-, UM-UC-3-, HT1376-, RT4-, T24-, TCC-SUP-, J82- und SW780-Zellen), die tkNeo-leeren Vektor oder 158P1D7 enthalten, injiziert werden.
Mindestens zwei Strategien können verwendet werden: (1) Konstitutive 158P1D7-Expression unter Regulation eines Promotors, wie zum Beispiel eines konstitutiven Promotors, der aus den Genomen von Viren, wie zum Beispiel Polyoma-Virus, Hühnerpockenvirus ( UK 2 211 504 , veröffentlicht am 5 Juli 1989), Adenovirus (wie zum Beispiel Adenovirus 2), Rinder-Papillomvirus, Avian Sarcoma-Virus, Cytomegalovirus, eines Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian Virus 40 (SV40), oder von heterologen Säuger-Promotoren, z.B. dem Aktin-Promotor oder einem Immunoglobulin-Promotor, vorausgesetzt, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen verträglich sind, erhalten wird. (2) Regulierte Expression unter Kontrolle eines induzierbaren Vektorsystems, wie zum Beispiel Ecdyson, Tet, usw., kann verwendet werden, vorausgesetzt, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen verträglich sind. Dann wird das Tumorvolumen beim Auftreten von palpablen Tumoren überwacht und über eine Zeit verfolgt, um zu bestimmen, ob 158P1D7-exprimierende Zellen bei einer schnelleren Rate wachsen und ob Tumoren, die durch 158P1D7-exprimierende Zellen produziert werden, Kennzeichen von veränderter Aggressivität (z.B. erhöhte Metastase, Vaskularisation, reduzierte Empfindlichkeit gegen chemotherapeutische Arzneimittel) zeigen. Außerdem können die gleichen Zellen in Mäuse orthotopisch implantiert werden, um zu bestimmen, ob 158P1D7 eine Wirkung auf lokales Wachstum in der Blase oder auf die Fähigkeit der Zellen zur Metastasierung hat, insbesondere zur Lunge oder zu den Lymphknoten (Fu, X. et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: S. 938-939; Chang, S. et al., Anticancer Res., 1997. 17: S. 3239-3242; Peralta, E. A. et al., J. Urol., 1999. 162: S. 1806-1811). Darüber hinaus ist dieser Assay zur Bestätigung der 158P1D7-inhibierenden Wirkung von therapeutischen Kandidatenzusammensetzungen, wie zum Beispiel 158P1D7-Antikörpern oder -Intrabodies und 158P1D7-Antisense-Molekülen oder -Ribozymen, nützlich.
Beispiel 36: Durch monoklonale 158P1D7-Antikörper vermittelte Inhibierung von Blasentumoren in vivo
Die erhebliche Expression von 158P1D7 in Krebsgeweben, nebst seiner beschränkten Expression in normalen Geweben, macht 158P1D7 zu einem ausgezeichneten Ziel für Antikörpertherapie. In Fällen, wo das Ziel des monoklonalen Antikörpers ein Protein auf der Zelloberfläche ist, wurde gezeigt, dass Antikörper zur Inhibierung von Tumorwachstum wirksam sind (siehe z.B. Saffan, D. et al., PNAS 10:1073-1078 oder www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698). In Fällen, wo sich das Ziel nicht auf der Zelloberfläche befindet, wie zum Beispiel PSA und PAP in Prostatakrebs, wurde dennoch gezeigt, dass Antikörper Zellen, die solche Proteine exprimieren, erkennen und deren Wachstum inhibieren (Saffran, D. C. et al., Cancer and Metastasis Reviews, 1999. 18: S. 437-449). Wie bei jedem zellulären Protein mit einem beschränkten Expressionsprofil, ist 158P1D7 ein Ziel für 7-Zell-basierte Immuntherapie.
Entsprechend wird die therapeutische Wirksamkeit von Anti-158P1D7-mAbs in Mausmodellen mit menschlichem Blasenkrebs bei 158P1D7-exprimierenden Blasenkrebs-Xenograften oder Blasenkrebszelllinien, wie zum Beispiel solchen, die im Beispiel (das Beispiel mit dem Titel „In-vivo-Assay für 158P1D7-Tumorwachstumspromotion") beschrieben sind, die zur Expression von 158P1D7 entwickelt wurden, modelliert.
Antikörperwirksamkeit auf Tumorwachstum und Metastasebildung wird z.B. in einem Mausmodell für orthotopische Blasenkrebs-Xenografte bestätigt. Die Antikörper können unkonjugiert sein, wie in diesem Beispiel diskutiert wird, oder können zu einer therapeutischen Modalität konjugiert sein, wie in der Technik eingesehen wird. Es ist bestätigt, dass Anti-158P1D7-mAbs die Bildung von 158P1D7-exprimierenden Blasentumoren inhibieren. Anti-158P1D7-mAbs verzögern auch das Wachstum von etablierten orthotopischen Tumoren und verlängern das Überleben von Tumor-tragenden Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen den Nutzen von Anti-158P1D7-mAbs bei der Behandlung von lokalem und fortgeschrittenen Stadien von Blasenkrebs. (Siehe z.B. Saffran, D. et al., PNAS 10:1073-1078 oder www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698)
Die Verabreichung von Anti-158P1D7-mAbs verzögert das Wachstum von etablierten orthotopischen Tumoren und inhibiert Metastase zu entfernten Stellen, was zu einer erheblichen Verlängerung beim Überleben von Tumor-tragenden Mäusen führt. Diese Untersuchungen zeigen, dass 158P1D7 ein attraktives Ziel für die Immuntherapie ist und stellen das therapeutische Potenzial von Anti-158P1D7-mAbs für die Behandlung von lokalem und metastasierendem Blasenkrebs dar.
Dieses Beispiel zeigt, dass unkonjugierte, monoklonale 158P1D7-Antikörper effektiv das Wachstum von menschlichen Blasentumoren, die in SCID-Mäusen gewachsen sind, inhibieren; entsprechend ist eine Kombination von derartigen wirksamen monoklonalen Antikörpern auch effektiv.
Tumoinhibierung unter Verwendung von mehreren unkonjugierten 158P1D7-mAbs
Material und Methoden
Monoklonale 158P1D7-Antikörper:
Monoklonale Antikörper werden gegen 158P1D7, wie im Beispiel mit dem Titel „Erzeugung von monoklonalen 158P1D7-Antikörpern (mAbs = monoklonale Antikörper)" beschrieben ist, produziert. Die Antikörper werden durch ELISA, Western-Blot, FACS und Immunpräzipitation, gemäß den in der Technik bekannten Techniken, auf ihre Kapazität zur Bindung von 158P1D7 untersucht. Daten des Epitop-Mappings für die Anti-158P1D7-mAbs, wie durch ELISA und Western-Analyse bestimmt wurde, erkennen Epitope auf dem 158P1D7-Protein. Es wird eine immunhistochemische Analyse von Blasenkrebsgeweben und -zellen mit diesen Antikörpern durchgeführt.
Die monoklonalen Antikörper werden aus Aszites oder Hybridomgewebekulturüberständen durch Protein-G-Sepharose-Chromatographie aufgereinigt, gegen PBS dialysiert, filtersterilisiert und bei –20 °C aufbewahrt. Proteinbestimmungen werden durch einen Bradford-Assay (Bio-Rad, Hercules, CA) durchgeführt. Es wird ein therapeutischer monoklonaler Antikörper oder ein Cocktail, der eine Mischung von einzelnen monoklonalen Antikörpern umfasst, zubereitet und für die Behandlung von Mäusen, die subkutane oder orthotopische Injektionen von Blasentumor-Xenograften erhielten, verwendet.
Blasenkrebszelllinien
Blasenkrebszelllinien (Scaber, J82, UM-UC-3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 und SW780), die 158P1D7 exprimieren, werden durch retroviralen Gentransfer erzeugt, wie in Hubert, R. S. et al., STEAP: a prostate-specific cell-surface antigen highly expressed in human prostate tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999.
96(25):14523-8, beschrieben ist. Anti-158P1D7-Färbung wird unter Verwendung eines FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Antikörpers (Southern Biotechnology Associates), gefolgt von der Analyse an einem Coulter Epics-XL Flow Cytometer, nachgewiesen.
In-Vivo-Mausmodelle.
Subkutane (s.c.) Tumoren werden durch Injektion von 1 × 10⁶ 158P1D7-exprimierenden Blasenkrebszellen, die bei einer 1:1-Verdünnung mit Matrigel (Collaborative Research) gemischt sind, in die rechte Flanke von männlichen SCID-Mäusen erzeugt. Um die Wirksamkeit des Antikörpers auf die Tumorbildung zu testen, werden am gleichen Tag, an dem die Injektionen von Tumorzellen erfolgen, i.p.-Injektionen von Antikörpern begonnen. Als Kontrolle wird den Mäusen entweder aufgereinigtes Maus-IgG (ICN) oder PBS, oder ein aufgereinigter monoklonaler Antikörper, der ein irrelevantes Antigen, das nicht in menschlichen Zellen exprimiert wird, erkennt, injiziert. In vorausgehenden Untersuchungen wird kein Unterschied zwischen Maus-IgG oder PBS bei dem Tumorwachstum festgestellt. Tumorgrößen werden durch Messschieber-Messungen bestimmt und das Tumorvolumen wird als Länge × Breite × Höhe berechnet. Mäuse mit s.c.-Tumoren, die im Durchmesser größer als 1,5 cm sind, werden geopfert. Zirkulierende Höhen von Anti-158P1D7-mAbs werden durch einen Capture ELISA Kit (Bethyl Labaratories, Montgomery, TX) bestimmt. (Siehe z.B. Saffran, D. et al., PNAS 10:1073-1078).
Orthotopische Injektionen werden beispielsweise in zwei alternativen Ausführungsformen unter Anästhesie durch beispielsweise die Verwendung von Ketamin/Xylazin durchgeführt. In einer ersten Ausführungsform wird eine intravesikuläre Injektion von Blasenkrebszellen direkt durch die Urethra und in die Blase verabreicht (Peralta, E. A. et al., J. Urol., 1999. 162:1806-1811). In einer zweiten Ausführungsfrom wird ein Schnitt durch die Bauchdecke vorgenommen, die Blase wird freigelegt und Blasentumorgewebeteile (1-2 mm Größe), die von einem s.c.-Tumor stammen, werden operativ an die äußere Wand der Blase geklebt, was als „Onplantation" („Anpflanzung") bezeichnet wird (Fu, X. et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: 938-939; Chang, S. et al., Anticancer Res., 1997. 17: S. 3239-3242). Antikörper können an Gruppen von Mäusen zur Zeit der Tumorinjektion oder Onplantation oder nach 1-2 Wochen, um die Festsetzung des Tumors zu ermöglichen, verabreicht werden.
Anti-158P1D7-mAbs inhibieren das Wachstum von 158P1D7-exprimierenden Blasenkrebstumoren
In einer Ausführungsform wird die Wirkung von Anti-158P1D7-mAbs auf die Tumorbildung durch Verwendung des orthotopischen Blasen-Onplantationsmodells untersucht. Im Vergleich zum s.c.-Tumormodell, führt das orthotopische Modell, das die operative Anbringung von Tumorgewebe direkt an die Blase erfordert, zu einem lokalen Tumorwachstum, zur Entwicklung von Metastase an entfernten Stellen und zum anschließenden Tod (Fu, X. et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: S. 938-939; Chang, S. et al., Anticancer Res., 1997. 17: S. 3239-3242). Diese Merkmale machen das orthotopische Modell repräsentativer für menschliche Erkrankungsprogression und es ermöglicht die Verfolgung der therapeutischen Wirkung von mAbs sowie anderen therapeutischen Modalitäten auf klinisch relevante Endpunkte.
Entsprechend werden 158P1D7-exprimierende Tumorzellen orthotopisch angepflanzt und 2 Tage später werden die Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt und mit entweder a) 50-2000 μg, gewöhnlich 200-500 μg, Anti-158D1D7-Ab oder b) PBS dreimal pro Woche für zwei bis fünf Wochen behandelt. Die Mäuse werden wöchentlich zu Hinweisen auf Tumorwachstum überwacht.
Wie angemerkt wurde, ist ein Hauptvorteil des orthotopischen Blasenkrebsmodells die Fähigkeit, die Entwicklung von Metastasen zu untersuchen. Die Bildung von Metastase in Mäusen, die etablierte orthotopische Tumoren tragen, wird durch histologische Analyse von Gewebeabschnitten, einschließlich Lunge und Lymphknoten, untersucht (Fu, X. et al., Int. J. Cancer, 1991. 49:938.939; Chang, S. et al., Anticancer Res., 1997. 17:3239-3242). Außerdem kann an den Gewebeabschnitten IHC-Analyse unter Verwendung von Anti-158P1D7-Antikörpern durchgeführt werden.
Mäusen, die etablierte orthotopische 158P1D7-exprimierende Blasentumoren tragen, werden 1000 μg-Injektionen von entweder Anti-158P1D7-mAb oder PBS über eine Dauer von 4 Wochen verabreicht. Den Mäusen in beiden Gruppen wird ermöglicht, dass sie eine hohe Tumorlast etablieren (1-2 Wochen Wachstum), um eine große Häufigkeit von Metastasebildung in Mauslungen und -lymphknoten zu gewährleisten. Die Mäuse werden dann geopfert und ihr lokaler Blasentumor und Lungen- und Lymphknotengewebe werden auf die Gegenwart von Tumorzellen durch Histologie- und IHC-Analyse analysiert.
Diese Untersuchungen zeigen eine breite Antitumorwirksamkeit von Anti-158P1D7-Antikörpern auf die Initiation und Progression von Blasenkrebs in Mausmodellen. Anti-158P1D7-Antikörper inhibieren Tumorbildung und verzögern das Wachstum von bereits etablierten Tumoren und verlängern das Überleben von behandelten Mäusen. Außerdem zeigen Anti-158P1D7-mAbs eine dramatische Inhibierungswirkung auf die Ausbreitung von lokalem Blasentumor zu entfernten Stellen, selbst in Gegenwart einer großen Tumorlast. Somit sind Anti-158P1D7-mAbs an wichtigen klinisch relevanten Endpunkten wirksam, einschließlich verminderten Tumorwachstums, verminderter Metastase und Verlängerung des Überlebens.
Beipiel 37: Homologievergleich von 1581P1D7 zu bekannten Sequenzen
Das 158P1D7-Protein von 3 hat 841 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 95,1 kDa und pI von 6,07. Es wird vorausgesagt, dass 158P1D7 ein nukleäres Protein ist (65% durch PSORT http://psort.nibb.ac jp/form2.html), wobei die Möglichkeit besteht, dass es ein Plasmamembranprotein ist (0,46, PSORT http://psort.nibb.ac jp/form.html). 158P1D7 hat eine potenzielle Spaltungsstelle zwischen AA 626 und 627 und eine potenzielle Signalstelle bei AA 3-25.
Durch Verwendung der PubMed-Webseite von N.C.B.I., unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez zugänglich, wurde auf der Proteinebene gefunden, dass 158P1D7 die beste Homologie mit dem hypothetischen Protein FLJ22774 (PubMed Record: gi 14149932) unbekannter Funktion mit 97% Identität und 97% Homologie zeigt. Das 158P1D7-Protein zeigt etwas Homologie mit einem menschlichen Protein, ähnlich zu IGFALS (insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit), (PubMed Record: gi 6691962) mit 36% Identität und 52% Homologie und mit Maus-Slit-1-Protein (PubMed Record: gi 5532493) mit 24% Identität und 37% Homologie (5a und 5b).
Von insulin-like growth factors (IGF) wurde gezeigt, dass sie eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum, einschließlich Prostata-, Brust-, Hirn- und Eierstockkrebs, spielen (O'Brian et al., Urology. 2001, 58:1; Wang J. et al. Oncogene. 2001, 20:3857; Helle S. et al., Br. J. Cancer. 2001, 85:74). IGFs erzeugen ihre onkogene Wirkung durch Bindung zu spezifischen Rezeptoren der Zelloberfläche und Aktivierung von Überlebens- sowie mitogenen Wegen (Babajko S. et al., Med. Pediatr. Oncol. 2001, 36:154; Scalia P. et al., J. Cell Biochem. 2001, 82:610). Die Aktivität von insulin-like growth factors wird durch IGF-bindende Proteine (IGF-BP) und die säurelabile Untereinheit (ALS = acid labile subunit) von IGF-BP reguliert (Zeslawski W. et al., EMBO J. 2001, 20:3638; Jones J. I. und Clemmons D. R. Endocr. Rev. 1995, 16: 3). Im Plasma existieren die meisten IGFs als ein ternärer Komplex, der IGF-BP und ALS enthält (Jones J. I. und Clemmons D. R. Endocr. Rev. 1995, 16:3). Die Verbindung mit ALS ermöglicht die Retention des ternären Komplexes im Gefäßsystem und verlängert seine Lebensdauer (Ueki I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6868). Untersuchungen in Mäusen zeigen den Beitrag von ALS zum Zellwachstum durch Darstellen, dass Mäuse, die eine Mutant-ALS tragen, ein Wachstumsdefizit zeigen (Ueki I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6868), was darlegt, dass ALS beim Wachstum von Tumorzellen eine entscheidende Rolle spielt.
Slit-Proteine wurden zuerst in Drosophila als sekretierte Proteine identifiziert, die Axon-Führung und -Orientierung regulieren (Rajagopalan S. et al., Cell. 2000, 103:1033; Chen J. et al., J. Neurosci. 2001, 21:1548). Säuger-Homologa wurden in Mäusen und Menschen geklont, wo gezeigt wurde, dass sie die Migration und Chemotaxis regulieren (Wu J. et al., Nature. 2001, 410:948; Brose K. und Tessier M., Curr. Opin. Neurobiol. 2001, 10:95). Slit-Proteine sind an zwei verschiedenen subzellulären Stellen innerhalb Epithelzellen, in Abhängigkeit vom Zellstadium, lokalisiert, wobei Slit-3 überwiegend in den Mitochondrien lokalisiert ist und auf die Zelloberfläche in konfluenteren Zellen ausgerichtet ist (Little M. H. et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2001, 281:C486). Die unterschiedliche Slit-Lokalisation deutet an, dass Slit unterschiedlich fungieren kann, ob es sekretiert wird, mit der Zelloberfläche verbunden ist oder in den Mitochondrien zurückgehalten wird.
Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung, dass 158P1D7 in mehreren Krebsen hoch exprimiert wird, während es ein eingeschränktes Expressionsmuster in normalen Geweben zeigt, zeigt an, dass das 158P1D7-Gen eine wichtige Rolle in verschiedenen Krebsen, einschließlich Krebsen der Blase, spielt. Durch die vorliegende Erfindung wird bereitgestellt, dass 158P1D7 Tumorwachstum und -progression durch Regulation von Proliferation, Überleben, Migration, Genexpression sowie Zelloberflächenverfügbarkeit kontrolliert. Entsprechend wird 158P1D7, wenn 158P1D7 als ein Regulator von Zellwachstum und Apoptose oder Expression fungiert, für therapeutische, diagnostische, prognostische oder präventive Zwecke verwendet.
Außerdem legen 16A und 16B eine Vorhersage zur Transmembranregion und Orientierung für 158P1D7 dar. 16A ist eine schematische Darstellung der Wahrscheinlichkeit der Existenz von Transmembranregionen und der extrazellulären und intrazellulären Orientierung von 158P1D7, die auf dem Algorithmus von Sonnhammer, von Heijne und Krogh beruht (Erik L. L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne und Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology (Im Tagungsband der Sechsten Internationalen Konferenz über Intelligente Systeme für die Molekularbiologie), S. 175-182, Hrsg. J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Majar, R. Lathrop, D. Sankoff und C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). Das Verfahren sagt voraus, dass 158P1D7 eine einzelne Transmembranregion von den Aminosäuren 611-633 mit hoher Wahrscheinlichkeit enthält, dass sich der Amino-Terminus außerhalb befindet, was mit der Topologie eines Typ-1-Transmembranproteins übereinstimmt. Es wird auch eine kurze hydrophobe Ausdehnung von Aminosäuren 3-25 erwartet, was mit der Existenz eines Aminoterminalen Signalpeptids übereinstimmt. 16B ist eine schematische Darstellung der Wahrscheinlichkeit der Existenz von Transmembranregionen und Orientierung von 158P1D7, die auf dem TMpred-Algorithmus von Hofmann und Stoffel basiert, der TMBASE nutzt (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE – A database of membrane spanning protein segments, Biol. Chem., Hoppe-Seyler 374:166, 1993). Das Verfahren sagt voraus, dass 158P1D7 eine primäre Transmembranregion von Aminosäuren 609-633 und eine sekundäre Transmembranregion von Aminosäuren 3-25 (zusammenhängende Aminosäuren mit Werten von größer als 0 auf dem Diagramm sind mit einer hohen Wahrscheinlichkeit Transmembranregionen) mit einer Orientierung, in der sich der Amino-Terminus innerhalb und der Carboxyl-Terminus außerhalb befindet, enthält. Es wird auch ein alternatives Modell vorausgesagt, das mit 16A übereinstimmt, dass 158P1D7 ein Typ-1-Transmembranprotein ist, in dem sich der Amino-Terminus außerhalb befindet, und das Protein ein sekundäres Transmembrandomänen-Signalpeptid von Aminosäuren 3-25 und eine primäre Transmembrandomäne von AA 615-633 enthält. Die Algorithmen zur Transmembranvorhersage für 16A und 16B werden durch den ExPasy Molekularbiologie Server (http://www.expasy.ch/tools/) zugänglich.
Beispiel 38: Identifizierung und Bestätigung von Signalübertragungswegen
Von vielen Säugerproteinen wurde berichtet, dass sie mit Signalmolekülen Wechselwirken und an der Regulation von Signalwegen beteiligt sind. (J. Neurochem. 2001; 76:217-223). Insbesondere wurde von IGF und IGF-BP gezeigt, dass sie mitogene und Überlebenswege regulieren (Babajko S. et al., Med. Pediatr. Oncol. 2001, 36:154; Scalia P. et al., J. Cell Biochem. 2001, 82:610). Unter Verwendung von Immunpräzipitations- und Western-Blotting-Techniken werden Proteine, die mit 158P1D7 in Verbindung stehen und Signalvorgänge vermitteln, identifiziert. Mehrere Wege, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Krebsbiologie spielen, werden durch 158P1D7 reguliert, einschließlich Phospholipid-Wege, wie zum Beispiel PI3K, AKT, usw., Adhäsions- und Migrationswege, einschließlich FAK, Rho, Rac-I, usw., sowie mitogene/Überlebenskaskaden, wie zum Beispiel ERK, p38, usw. (Cell Growth Differ. 2000, 11:279; J. Biol. Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913.). Die Bioinformatik-Analyse zeigte, dass 158P1D7 durch Serin/Threonin- sowie Tyrosinkinasen phosphoryliert werden kann. Somit wird die Phosphorylierung von 158P1D7 durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, um zur Aktivierung der vorstehend aufgelisteten Wege zu führen.
Unter Verwendung von z.B. Western-Blotting-Techniken wird die Fähigkeit von 158P1D7 zur Regulation dieser Wege bestätigt. Zellen, die 158P1D7 exprimieren oder entbehren, verbleiben entweder unbehandelt oder werden mit Cytokinen, Hormonen und Anti-Integrin-Antikörpern stimuliert. Zelllysate werden unter Verwendung von Anti-Phospho-spezifischen Antikörpern (Cell Signaling, Santa Cruz Biotechnology) analysiert, um die Phosphorylierung und Regulation von ERK, p38, AKT, PI3K, PLC und anderen Signalmolekülen nachzuweisen. Wenn 158P1D7 bei der Regulation von Signalwegen eine Rolle spielt, ob einzeln oder in Gemeinschaft, wird es als ein Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Zur Bestätigung, dass 158P1D7 direkt oder indirekt bekannte Signalübertragungswege in Zellen aktiviert, werden Luciferase (Luc)-basierte transkriptionale Reporterassays in Zellen, die einzelne Gene exprimieren, durchgeführt. Diese transkriptionalen Reporter enthalten Konsensus-bindende Stellen für bekannte Transkriptionsfaktoren, die downstream von gut charakterisierten Signalübertragungswegen liegen. Die Reporter und Beispiele von diesen zugehörigen Transkriptionsfaktoren, Signalübertragungswegen und Aktivierungsstimuli sind nachstehend aufgelistet:

1. NFkB-Luc, NFkB/Rel; Ik-Kinase/SAPK; Wachstum/Apoptose/Stress
2. SRE-Luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; Wachstum/Differenzierung
3. AP-1-Luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; Wachstum/Apoptose/Stress
4. ARE-Luc, Androgenrezeptor; Steroide/MAPK; Wachstum/Differenzierung/Apoptose
5. p53-Luc, p53; SAPK; Wachstum/Differenzierung/Apoptose
6. CRE-Luc, CREB/ATF2; PKA/p38; Wachstum/Apoptose/Stress

Genvermittelte Wirkungen werden in Zellen, die mRNA-Expression zeigen, getestet. Luciferase-Reporterplasmide werden durch lipidvermittelte Transfektion (TFX-50, Promega) eingeführt. Luciferase-Aktivität, ein Indikator von relativer transkriptionaler Aktivität, wird durch Inkubation von Zellextrakten mit Luciferin-Substrat gemessen und die Lumineszenz der Reaktion wird in einem Luminometer überwacht.
Signalwege, die durch 158P1D7 aktiviert werden, werden kartiert und zur Identifizierung und Bewertung von therapeutischen Zielen verwendet. Wenn 158P1D7 an der Zellsignalwirkung beteiligt ist, wird es als Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 39: Beteiligung an der Tumorprogression
Das 158P1D7-Gen kann zum Wachstum von Krebszellen beitragen. Die Rolle von 158P1D7 beim Tumorwachstum wird in einer Vielfalt von primären und transfizierten Zelllinien, einschließlich Prostata-, Kolon-, Blasen- und Nierenzelllinien, sowie NIH 3T3-Zellen, die entwickelt wurden, um 158P1D7 stabil zu exprimieren, bestätigt. Elternzellen, die 158P1D7 entbehren, und Zellen, die 158P1D7 exprimieren, werden zum Zellwachstum unter Verwendung eines gut dokumentierten Proliferationsassays beurteilt (siehe z.B. Fraser S. P., Grimes J. A., Djamgoz M. B., Prostate. 2000; 44:61; Johnson D. E., Ochieng J., Evans S. L., Anticancer Drugs. 1996, 7:288).
Zur Bestätigung der Rolle von 158P1D7 im Transformationsprozess wird seine Wirkung in koloniebildenden Assays untersucht. NIH 3T3-Elternzellen, die 158P1D7 entbehren, werden mit NHI 3T3-Zellen, die 158P1D7 exprimieren, unter Verwendung eines Soft-Agar-Assays unter stringenten und permissiveren Bedingungen verglichen (Song Z. et al., Cancer Res. 2000, 60:6730).
Zur Bestätigung der Rolle von 158P1D7 bei der Invasion und Metastase von Krebszellen wird ein gängiger Assay verwendet, z.B. ein Transwell-Einsatzsystem-Assay (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999, 59:6010). Kontrollzellen, einschließlich Prostata-, Kolon-, Blasen- und Nierenzelllinien, die 158P1D7 entbehren, werden mit Zellen, die 158P1D7 exprimieren, jeweils verglichen. Zellen werden mit dem fluoreszierenden Farbstoff Calcein beladen und in das obere Well des Transwell-Einsatzes, der mit einem Grundmembran-Analogon beschichtet ist, ausgestrichen. Die Invasion wird durch Fluoreszenz von Zellen in der unteren Kammer relativ zur Fluoreszenz der gesamten Zellpopulation bestimmt.
158P1D7 kann auch eine Rolle im Zellzyklus und in der Apoptose spielen. Elternzellen und Zellen, die 158P1D7 exprimieren, werden bezüglich der Unterschiede bei der Regulation des Zellzyklus unter Verwendung eines gängigen BrdU-Assays verglichen (Abdel-Malek Z. A., J. Cell Physiol. 1988, 136:247). Kurzum, Zellen werden unter sowohl optimalen (vollständiges Serum) als auch einschränkenden (niedriges Serum) Bedingungen wachsen gelassen, mit BrdU markiert und mit Anti-BrdU-Ab und Propidiumiodid eingefärbt. Die Zellen werden auf den Eintritt in die G1-, S- und G2M-Phasen des Zellzyklus analysiert. Alternativ wird die Wirkung von Stress auf Apoptose in Kontroll-Elternzellen und Zellen, die 158P1D7 exprimieren, einschließlich normaler und Tumorblasenzellen, bewertet. Konstruierte und Elternzellen werden mit verschiedenen Chemotherapeutika, wie zum Beispiel Paclitaxel, Gemcitabin, usw., und Proteinsyntheseinhibitoren, wie zum Beispiel Cycloheximid, behandelt. Die Zellen werden mit Annexin-V-FITC eingefärbt und der Zelltod wird durch FACS-Analyse gemessen. Die Modulation des Zelltods durch 158P1D7 kann eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Tumorprogression und Tumorlast spielen.
Wenn 158P1D7 beim Zellwachstum, der Transformation, Invasion oder Apoptose eine Rolle spielt, wird es als ein Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 40: Beteiligung an der Angiogenese
Angiogenese oder die Bildung neuer Kapillarblutgefäße ist für das Tumorwachstum notwendig (Hanahan D., Folkman J., Cell. 1996, 86:353; Folkman J., Endocrinology. 1998, 139:441). Es wurden mehrere Assays zur Messung der Angiogenese in vitro und in vivo, wie zum Beispiel die Gewebekultur-Assays, Endothelzellrohrbildung und Endothelzellproliferation, entwickelt. Unter Verwendung dieser Assays sowie der in-vitro-Neovaskularisation wird die Wirkung von 158P1D7 auf die Angiogenese bestätigt. Beispielsweise werden Endothelzellen, die zur Expression von 158P1D7 konstruiert wurden, unter Verwendung von Rohrbildungs- und Proliferationsassays bewertet. Die Wirkung von 158P1D7 wird auch in Tiermodellen in vivo bestätigt. Beispielsweise werden Zellen, die 158P1D7 entweder exprimieren oder entbehren, subkutan in immunsupprimierte Mäuse implantiert. Die Migration von Endothelzellen und die Angiogenese werden 5-15 Tage später unter Verwendung von Immunhistochemie-Techniken bewertet. Wenn 158P1D7 Angiogenese beeinflusst, wird es als ein Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 41: Regulation der Transkription
Die vorstehend angezeigte Lokalisation von 158P1D7 zum Kern und seine Ähnlichkeit zu IGF-BP, von dem beobachtet wurde, dass es Signalwege aktiviert und wesentliche zelluläre Funktionen reguliert, unterstützen die Verwendung von 158P1D7 der vorliegenden Erfindung, die auf seiner Rolle bei der transkriptionalen Regulation von eukaryotischen Genen beruht. Die Regulation von Genexpression wird z.B. durch Untersuchung der Genexpression in Zellen, die 158P1D7 exprimieren oder entbehren, bestätigt. Zu diesem Zweck werden zwei Arten von Experimenten ausgeführt.
In der ersten Reihe von Experimenten wird RNA aus Eltern- und 158P1D7-exprimierenden Zellen extrahiert und zu gewerblich erhältlichen Gen-Arrays (Clontech) hybridisiert (Smid-Koopman E. et al., Br. J. Cancer. 2000. 83:246). Ruhende Zellen sowie Zellen, die mit FBS oder Androgen behandelt wurden, werden verglichen. Unterschiedlich exprimierte Gene werden gemäß den in der Technik bekannten Methoden identifiziert. Die unterschiedlich exprimierten Gene werden dann zu biologischen Wegen kartiert (Chen K. et al., Thyroid. 2001. 11:41.).
In der zweiten Reihe von Experimenten wird die spezifische Aktivierung des transkriptionalen Wegs unter Verwendung von gewerblich erhältlichen (z.B. Stratagene) Luciferase-Reporterkonstrukten, einschließlich Folgender: NFkB-Luc, SRE-Luc, ELKI-Luc, ARE-Luc, p53-Luc und CRE-Luc, bewertet. Diese transkriptionalen Reporter enthalten Konsensus-bindende Stellen für bekannte Transkriptionsfaktoren, die auf den gut charakterisierten Signalübertragungswegen downstream liegen, und repräsentieren ein gutes Werkzeug zur Ermittlung der Wegaktivierung und Screening für positive und negative Modulatoren der Wegaktivierung.
Wenn 158P1D7 eine Rolle bei der Genregulierung spielt, wird es als ein Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 42: Subzelluläre Lokalisation von 158P1D7
Die zelluläre Lokalisierung von 158P1D7 wird unter Verwendung von subzellulären Fraktionierungstechniken, die in der Zellbiologie weit verbreitet sind, beurteilt (Storrie B. et al. Methods Enzymol. 1990; 182:203-25). Es wird eine Vielfalt von Zelllinien, einschließlich Prostata-, Nieren- und Blasenzelllinien sowie Zelllinien, die zur Expression von 158P1D7 konstruiert wurden, in nukleäre, cytosolische und Membranfraktionen aufgetrennt. Genexpression und Lokalisierung in Kernen, schweren Membranen (Lysosomen, Peroxisomen und Mitochondrien), leichten Membranen (Plasmamembran und endoplasmatisches Reticulum) und löslichen Proteinfraktionen werden unter Verwendung von Western-Blotting-Techniken getestet.
Alternativ werden 293T-Zellen mit einem Expressionsvektor, der die einzelnen Gene kodiert, mit einem HIS-Tag versehen ist (PCDNA 3.1 MYC/HIS, Invitrogen), transfiziert und die subzelluläre Lokalisation dieser Gene wird, wie vorstehend beschrieben ist, bestimmt. Kurzum, die transfizierten Zellen werden geerntet und einem unterscheidenden subzellulären Fraktionierungsprotokoll unterworfen (Pemberton, P. A. et al., 1997, J. of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1697-1706). Der Ort der Gene mit HIS-Tag wird durch Western-Blotting verfolgt.
Unter Verwendung von 158P1D7-Antikörpern ist es möglich, die zelluläre Lokalisation durch Immunfluoreszenz und Immunhistochemie zu zeigen. Beispielsweise werden Zellen, die 158P1D7 exprimieren oder entbehren, auf einen Objektträger angehaftet und mit Anti-158P1D7-spezifischem Ab eingefärbt. Die Zellen werden mit einem sekundären FITC-gekuppelten Anti-Spezies-Ab inkubiert und durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Alternativ werden die Zellen und Gewebe, die 158P1D7 entbehren oder exprimieren, durch IHC, wie hierin beschrieben ist, analysiert.
Wenn 158P1D7 an spezifischen Zellkompartimenten lokalisiert wird, wird es als ein Ziel für diagnostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiel 43: Beteiligung von 158P1D7 am Protein-Trafficking
Aufgrund seiner Ähnlichkeit zu Slit-Proteinen kann 158P1D7 intrazelluläres Trafficking und Retention in mitochondrialen und/oder nukleären Kompartimenten regulieren. Seine Rolle beim Trafficking von Proteinen kann unter Verwendung von gängigen Verfahren bestätigt werden (Valetti C. et al., Mol. Biol. Cell. 1999, 10:4107). Beispielsweise wird FITC-konjugiertes α2-Makroglobulin mit 158P1D7-exprimierenden und 158P1D7-negativen Zellen inkubiert. Der Ort und die Aufnahme von FITC-α2-Makroglobulin werden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht. In einem weiteren Ansatz wird die Colokalisation von 158P1D7 mit vesikulären Proteinen durch Copräzipitations- und Western-Blotting-Techniken und Fluoreszenzmikroskopie bestätigt.
Alternativ werden 158P1D7-exprimierende und 158P1D7-entbehrende Zellen unter Verwendung von Bodipy-Ceramid-markiertem Rinderserumalbumin verglichen (Huber L. et al., Mol. Cell. Biol. 1995, 15:918). Kurz gesagt, wird Zellen ermöglicht, dass sie das markierte BSA aufnehmen und sie werden intermittierend bei 4 °C und 18 °C gehalten, um zu ermöglichen, dass Trafficking stattfindet. Die Zellen werden unter Fluoreszenzmikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten auf die Gegenwart von markiertem BSA in spezifischen vesikulären Kompartimenten, einschließlich Golgi, endoplasmatischen Reticulums, usw., untersucht.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Wirkung von 158P1D7 auf den Membrantransport unter Verwendung von Biotin-Avidin-Komplexen untersucht. Zellen, die 158P1D7 entweder exprimieren oder entbehren, werden vorübergehend mit Biotin inkubiert. Die Zellen werden bei 4 °C gehalten oder vorübergehend auf 37 °C für verschiedene Zeitabschnitte erwärmt. Die Zellen werden durch Avidin-Affinitätspräzipitation fraktioniert und auf die Gegenwart von Biotin in spezifischen zellulären Kompartimenten untersucht. Unter Verwendung derartiger Assaysysteme werden Proteine, Antikörper und kleine Moleküle identifiziert, die die Wirkung von 158P1D7 auf den vesikulären Transport modifizieren. Wenn 158P1D7 eine Rolle beim intrazellulären Trafficking spielt, ist 158P1D7 ein Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke.
Beispiel 44: Protein-Protein-Verbindung
Es wurde von IGF- und IGF-BP-Proteinen gezeigt, dass sie mit anderen Proteinen wechselwirken, dadurch Proteinkomplexe bilden, die die Proteinlokalisation, biologische Aktivität, Gentranskription und Zelltransformation regulieren können (Zeslawski W. et al., EMBO J. 2001, 20:3638; Yu H., Rohan T., J. Natl. Cancer Inst. 2000, 92:1472). Unter Verwendung von Immunpräzipitationstechniken sowie zwei Hefe-Hybridsystemen werden Proteine, die mit 158P1D7 in Verbindung treten, identifiziert. Immunpräzipitate aus Zellen, die 158P1D7 exprimieren, und Zellen, die 158P1D7 entbehren, werden hinsichtlich spezifischer Protein-Protein-Verbindungen verglichen.
Es werden Untersuchungen zur Bestimmung des Ausmaßes der Verbindung von 158P1D7 mit Rezeptoren, wie zum Beispiel den EGF- und IGF-Rezeptoren, und mit intrazellulären Proteinen, wie zum Beispiel IGF-BP, cytoskeletalen Proteinen usw., durchgeführt. Untersuchungen, die 158P1D7-positive und 158P1D7-negative Zellen vergleichen, sowie Untersuchungen, die nicht-stimulierte/ruhende Zellen und Zellen, die mit Epithelzellaktivatoren, wie zum Beispiel Cytokinen, Wachstumsfaktoren und Anti-Integrin-Ab behandelt wurden, vergleichen, zeigen einzigartige Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Außerdem werden Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung der Zwei-Hefe-Hybrid-Methode bestätigt (Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3:64). Ein Vektor, der eine Bibliothek von Proteinen trägt, die mit der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert sind, wird in Hefe eingeführt, die ein 158P1D7-DNA-Bindungsdomänen-Fusionsprotein und ein Reporterkonstrukt exprimiert. Protein-Protein-Wechselwirkung wird durch kolorimetrische Reporteraktivität nachgewiesen. Spezifische Verbindung mit Oberflächenrezeptoren und Effektormolekülen führt den Fachmann zur Wirkungsweise von 158P1D7 und identifiziert somit therapeutische, prognostische, präventive und/oder diagnostische Ziele für Krebs. Dieser und ähnliche Assays werden auch zur Identifizierung und zum Sceening für kleine Moleküle, die mit 158P1D7 wechselwirken, verwendet.
Wenn 158P1D7 mit Proteinen oder kleinen Molekülen in Verbindung tritt, wird es als ein Ziel für diagnostische, prognostische, präventive und therapeutische Zwecke verwendet.
Die vorliegende Erfindung soll nicht im Rahmen durch die hierin offenbarten Ausführungsformen, die als einzelne Erläuterungen von individuellen Aspekten der Erfindung gedacht sind, beschränkt werden und Jegliches, das funktionell äquivalent ist, ist im Rahmen der Erfindung. Verschiedene Modifikationen der Modelle und Verfahren der Erfindung, zusätzlich zu den hierin Beschriebenen, werden dem Fachmann aus der vorangehenden Beschreibung und den Ausführungen offensichtlich werden und sollen ähnlich in den Rahmen der Erfindung fallen.
TABELLEN TABELLE I: Gewebe, die 158P1D7 exprimieren, wenn sie malign sind Blase, Prostata, Kolon, Lunge, Brust, Eierstock TABELLE II: ABKÜRZUNGEN VON AMINOSÄUREN
TABELLE III: SUBSTITUTIONSMATRIX VON AMINOSÄUREN
Basierend auf der GCG Software 9.0 BLOSUM62 Substitutionsmatrix von Aminosäuren (Block Substitution Matrix). Um so höher der Wert ist, desto wahrscheinlicher ist es, dass eine Substitution in ähnlichen, natürlichen Proteinen beobachtet wird.
(Siehe URL www.ikp.unibe.ch/manual/blosum62.htm1)
TABELLE IV A
Fett gedruckte Reste sind bevorzugt, Reste in Kursivschrift sind weniger bevorzugt: Ein Peptid wird als Motivtragend betrachtet, wenn es primäre Anker an jeder primären Ankerposition für ein Motiv oder Supermotiv, wie in der vorstehenden Tabelle angegeben ist, hat. TABELLE IV(B): HLA-KLASSE-II-SUPERMOTIV

Tabelle VII: TNM-KLASSIFIZIERUNG VON BLASENTUMOREN
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

In-vitro-Verfahren zur Kontrolle von 158P1D7-Genprodukten in einer Untersuchungsprobe und einer normalen Probe, das Verfahren umfasst: Bestimmen eines Expressionsniveaus eines 158P1D7-Genprodukts, das von Zellen in einer Untersuchungsprobe und der normalen Probe exprimiert wird, worin die Proben aus einem Blasen- oder Brustgewebe von einem Patienten entnommen werden; Vergleichen der Expressionsniveaus der Untersuchungsprobe und der normalen Probe; und Identifizieren der Gegenwart eines erhöhten Expressionsniveaus des 158P1D7-Genprodukts in der Untersuchungsprobe verglichen mit der normalen Probe, worin das 158P1D7-Genprodukt eine 158P1D7-mRNA umfasst, die eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz von 2 zu mindestens 90% identisch ist, oder ein Protein, das mit der Aminosäuresequenz von 2 zu mindestens 90% identisch ist, kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wodurch die Gegenwart von erhöhter 158P1D7-mRNA- oder Proteinexpression in der Untersuchungsprobe verglichen mit der normalen Gewebeprobe einen Hinweis auf die Gegenwart oder den Status eines Krebses bereitstellt.
Verwendung eines Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon, das spezifisch an ein Protein bindet, das mit der Aminosäuresequenz von 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Bereitstellung des Antikörpers oder Antigenbindenden Fragments davon zu einer Blasenkrebszelle oder einer Brustkrebszelle, die das Protein exprimiert, zu mindestens 90% identisch ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an ein cytotoxisches Agens konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, worin der Antikörper oder das Antigenbindende Fragment davon ein Fab-, F(ab')2-, Fv- oder sFv-Fragment ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, worin der Antikörper oder das Antigenbindende Fragment davon ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, worin der Antikörper oder das Antigenbindende Fragment davon ein menschlicher Antikörper ist.
Assay zum Nachweis der Gegenwart eines 158P1D7-Genprodukts in einer Untersuchungsprobe und einer normalen Probe, der Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Untersuchungsprobe und der normalen Probe mit einem bindenden Agens, das spezifisch an das 158P1D7-Genprodukt bindet; und Bestimmen der Gegenwart eines Komplexes aus bindendem Agens und 158P1D7-Genprodukt in der Probe, worin das 158P1D7-Genprodukt eine 158P1D7-mRNA ist, die ein Protein, das mit der Aminosäuresequenz von 2 zu mindestens 90% identisch ist, oder ein 158P1D7-Protein, das mit der Aminosäuresequenz von 2 zu mindestens 90% identisch ist, kodiert, worin das bindende Agens ein Antikörper ist, der spezifisch an genanntes Protein oder eine Probe bindet, die spezifisch an die 158P1D7-mRNA bindet und worin der Nachweis des Komplexes aus bindendem Agens und 158P1D7-Genprodukt ein Hinweis auf eine Blasen- oder Brustkrebszelle in der Untersuchungsprobe ist.
Assay nach Anspruch 8, der weiter Folgendes umfasst: (a) Herstellen von cDNA aus der Untersuchungs- und normalen Probe durch reverse Transkription unter Verwendung von mindestens einem Primer; (b) Amplifizieren einer 158P1D7-cDNA aus einer 158P1D7-mRNA, die unter Verwendung von 158P1D7-Polynukleotiden als Sense- und Antisense-Primer hergestellt wird, worin die als Sense- und Antisense-Primer verwendeten 158P1D7-Polynukleotide fähig sind, die 158P1D7-cDNA, die innerhalb des Plasmids p158P1D7-Turbo/3PX enthalten ist, zu amplifizieren; und (c) Nachweisen der Gegenwart der amplifizierten 158P1D7-cDNA, worin die 158P1D7-cDNA die Aminosäuresequenz von 2 kodiert.