ES2393709B1 - Huella genómica para la predicción de la respuesta clínica a terapia antitumoral en cáncer colorrectal. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método in vitro para predecir la respuesta clínica de un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal a una terapia antitumoral o para identificar a un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal con baja probabilidad de responder a un tratamiento con una terapia antitumoral, preferiblemente una terapia antitumoral neoadyuvante, que comprende la detección de los niveles de expresión de una huella genómica formada por seis genes. Asimismo, la invención también se relaciona con kits para poner en práctica dicho método.

Description

IIU ELLA GENÓMICA PARA LA PREDICCIÓN DE LA RESP UESTA CLÍNICA A TERAPlA ANTlTUMORAL EN CÁNCER COLORRECTAL

5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

10

La presente invención se relaciona con un método in vi/ro para predecir la respuesta cl ínica de un paciente diagnosti cado de cáncer colorrectal a una terapi a antitumo ral o para identificar a un paciente di agnosti cado de cáncer colorrectal con baja probabilidad de responder a un tratami ento con una terapia antitumoral, preferi blemente una terapia ant itumoral neoadyuvante.

ANTECEDENTES

1 S 20 25

El cá ncer de intestino grueso es el tercer tumor malig no más frecuente en el mundo occidental, después del cáncer de pulmón y mama, representando el 10% de todos los cánceres y ocasionando el 10% de la mortalidad secundari a a cáncer. Aproximadamente un tercio de los cánceres de intestino grueso se forman en el recto, y la mayoría de estos se di agnostican como cánceres de recto localmente avanzados (CRLAs). En el CRLA el desarrollo de la Excisión Total del Mesorrecto (ETM) y de estrategias preoperatorias con quimioterapia y radioterapia ha mejorado notablemente la supervivencia global, el control local y probabl emente la tasa de procedimi entos que preservan el esfínter anal. Además, de esta form a, se ha miti gado la toxicidad de la quimiorradi oterapi a (QRT).

30

De acuerdo a los datos de ensayos clínicos aleatorizados ant iguos y recientes, el tratamiento combinado preoperatorio con QRT ha extendido la supervivencia global a los 5 años desde un 4 5% con ci rugía convencional (Douglass, H.O. , el al. 1986, N.EngU Med., 3 15: 1294-1 295 ; Tveit, K.M ., el al. 1997 Norwegian Adjuvant Rectal Cancer Project Group, S r.J Surg., 84: 1130-1135), a un 66-76% con QRT preoperatoria, y las recidi vas locales han di sminuido desde un 30-50% a un 6-8%. Sin embargo, un tercio de los pacientes desarrollará metástasis a distancia, que son responsables de la

elevada mortalidad (Sauer, R., el al. 2004 N.EngU .Med., 35 1: 173 1-1 740; Bosset,

J.F., el al. 2006 N.EngU Med., 355: 11 14-11 23 ).

Además, un número importante de enfermos sufre considerabl es efectos adversos

S

asociarl os a la QRT sin benefi cio al guno. De form a opuesta, otros pacientes pueden ser

¡nfra-tratados. As í, resulta de enorme int eré s id entificar la s potenciales dianas

involucradas en la resistencia a la QRT e identificar a los pacientes que recaerán y que

pueden ser sub sidi ari os de tratami entos más intensivos.

10

La selección del tratami ento QRT para cada caso individual de adenocarcinoma de

recto depend e de vari abl es clíni cas y pato lógicas que resultan incapaces de predecir la

efi cacia terap éuti ca . Es trategias diri gid as, indi viduales, qu e correlacionan

bi omarcadores basales concretos con la respuesta al tratamiento QRT preoperatori o

han mostrado marcadores de interés, incluyendo las mutaciones en p53 (Kandioler, D.

15

e l al. , 2002. Ann.Surg., 235:493-498; Rebi schung, c., el al. 2002, In1. J Cancer,

100: 13 1-1 35), expresión de timidil ato sintetasa (J ohn ston, P.G., el al. 1994, J e Jin

Oncol, 12: 2640-2647; Edl er, D. el al., 2000, Clin Cancer Res. 6: 1378-1384), p2 1

(Reennk, O., el al. 2004, Anti cancer Res., 2 4 : 12 17-1 22 1; Qiu, H., el al. 2000, Di s.

Colon Rectum , 4 3: 451-459; Fu, c.G. , el al. 1998, Di s. Colon Rectum, 41 : 68 -74;

20

Rau, 8., el al. 2003, J Clin Oncol, 21: 339 1-340 1), EGFR (Mil as, L. , el al. 2004, Int. J

Radi at.Onco1.Bio1.Phys. , 58: 966-97 1), COX 2 (Smith, F.M., el al. 2006, Int. J

Radi at.Onco1.Bio1.Phys. , 64: 466-4 72; Min, 8. S. , el al. 2008, Arch Surg, 143: 109 1

1097), índi ce de apoptosis espontánea (Rodel,C., el a l. 2002, lnl . J Radi at.Oncol

Bi o1.Phys., 52: 294-303 ; Abe,T., el al. 200 1, Anti can cer Res. , 2 1: 2 11 5-2 120) o el

25

CEA (Park, Y A , el al. 2006, J Surg. Oncol, 93 : 145-1 50). Sin embargo, ninguna de

ellas ha demostrado claramente su utilidad predicti va en clínica.

Por otra parte, existen pocos trab aj os que estudi en la expresión de colecciones de

genes en series significati vas de pacientes antes del tratami ento QRT preoperatori o.

30

Ghadimi , 8.M. el al. , 2005 (J Clin Oncol, Vo1. 23(9): 1826-38) describ e la

evaluación con microarrays de una muestra de 23 tumores de recto procedentes del

ensayo alemán CAO/ ARO/ AJO-94, en el que los pacientes recibieron fluorouracilo y

radioterapia antes de la cirugía. En este estudio se generó un algoritmo predictivo de respuesta a la QRT preoperatoria de 54 genes, que fueron posteriormente validados en otra muestra de siete paóentes.

5

Watanabe, T., el al. , 2006 (Caneer Res, vol. 66(7): 3370-3374) describe un perfil de expresión genético de 33 genes útil para predecir la sensibilidad de células de cáncer de recto en respuesta a la radioterapia preoperatoria.

10

Kim, U ., el al. , 2007 (Dis Colon Reetum, Vol. 50(9): 1342-53) describe un perfil de expresión génica compuesto por 95 genes analizados mediante microarrays, que permiten predecir si la respuesta a la QRT preoperatoria en pacientes con cáncer rectal avanzado será parcial o completa.

15

La solicitud de patente internacional W02009/071720, a nombre de Universidad Autónoma de Madrid, describe un perfil de 13 genes que permite predecir la respuesta a una terapia, monitorizar el efecto de dicha terapia o pronosticar la evolución del paciente tras la administración de la terapia en suj etos diagnosticados de adenocarcinoma colorrectal.

20 2S

Por tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar una huella genómica alternativa a las ya existentes, que permita pronosticar con fiabilidad la respuesta de un sujeto diagnosticado con cáncer colorrectal a la terapia neoadyuvante admini strada en el tratamiento de dicho cáncer, previamente a la admini stración de dicha terapia. Del mismo modo, dicha huella genóm ica podria ser también útil para pronosticar la respuesta de un sujeto diagnosticado con cáncer colorrectal a la terapia adyuvante administrada en el tratamiento de dicho cáncer.

COMPENDIO DE LA INVENCiÓN

30

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vi/ro para predecir la respuesta clínica a una terapia antitumoral en un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal o para la identificación de un paciente diagnosticado de cáncer

colorrectal que presenta baja probabilidad de responder a un tratamiento COIl una

terapia antitllmoral que comprende

(i) determinar Jos niveles de expresión de los genes ALOX15, CTNNBl, MAPK14, NOS2A, PTGES2 y PTGS2 en una muestra de dicho paciente antes de la administración de la terapia,

(ji) calcular un factor predictivo en base a los niveles de expresión de dichos

genes y

(iii)comparar el valor del factor predictivo obtenido en la etapa (ii) con un

valor de referencia en donde llna alteración del valor del factor predictiyo con respecto al valor de referencia es indicativa de una peor respuesta clínica a la terapia 3ntitumoral o de que el paciente tiene una baja probabilidad de responder a la terapia antitumoral.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit para predecir la respuesta de un paciente que sufre cáncer colorrectal a una terapia antitumoral que comprende reactivos adecuados para la detección de los niveles de expresión de los genes ALOX15, CTNNB1, MAPK14,NOS2A, PTGES2 y PTGS2.

Por último, en otro aspecto, la invención también se relaciona con el uso de dicho kit para predecir la respuesta de un paciente que sufre cáncer colorrectal a una terapia antitUlnoral.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la supervivencia global en función de la expresión de los 6 genes (ALOXI5, CTNNB1, MAPKI4, NOS2A, PTGES2 )' PTGS2) en pacientes con adenocarcinoma rectal tras el tratamiento con quimiorradioterapia. Como punto de corte se ha utilizado el valor de la mediana: 0.8. Aquellos pacientes con tumores que presentan un resultado >0.8 de expresión global de los 6 genes, calculada mediante el análisis factorial, presentan una probabilidad de supervivencia global a los 50 meses del 50% comparado con aquellos pacientes con resultado <=0.8 cuya probabilidad de supervivencia a los 50 meses es del 85%.

La figura 2 muestra la clasificación de los pacientes estudiados en función del grado de

5 respuesta tumoral obtenida a partir del análisis del perfil de los 6 genes ALOXJ 5, CTNNBJ, MAPKJ4, NOS2A, PTGES2 y PTGS2. Se observa en el diagrama de cajas como con la expresión de los 6 genes se obtiene ulla puntuación que se correlaciona de forma significativa con el grado de respuesta tumoral (no respuesta vs. buena vs. respuesta completa), de forma que a mayor puntuación mayor es la probabilidad de

10 obtener una mejor respuesta. Los asteriscos (*) y círculos (") de la figura corresponden a valores atípicos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

S

La selección del tratamiento quimioterapéutico para cada caso individual de cáncer colorrectal depende de variables clínicas y patológicas que resultan incapaces de predecir la eficacia terapéutica de un tratamiento o de pronosticar la evolución de un paciente que sufre dicho tipo de cáncer.

10 l S

Los autores de la presente invención han identificado un conjunto de 6 genes cuya cuantificación de la expresión respecto a un va l or de referencia permite, sorprendentemente, predecir la mejor o peor respuesta de un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal a la administración de una terapia e identificar a un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal que presenta baja probabilidad de responder a un tratamiento con una terapia antitumoral. De este modo, se puede seleccionar a aquellos pacientes que no se beneficiarán de una terapia neoadyuvante y que son candidatos a la resección directa del tumor; o a aquellos pacientes que no van a responder a una terapia adyuvante para evitar toxicidades innecesarias

MÉTODO PREDICTIVO DE LA INVENCIÓN

20 2S 30

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la predicción de la respuesta clínica a una terapia antitumoral en un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal o para la identificación de un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal que presenta baja probabilidad de responder a un tratamiento con una terapia antitumoral que comprende (i) determinar los niveles de expresión de los genes ALOX/5, CTNNB/ , MAPK/4, N()S2A , PTGES2 y PTGS2 en una muestra de dicho paciente antes de la administración de la terapia, (ii) calcular un factor predictivo en base a los ni veles de expresión de dichos genes y (iii) comparar el valor del factor predictivo obtenido en la etapa (ii) con un valor de referencia

en donde una alteración del valor del factor predictivo con respecto al valo r de

referencia es indicativa de una peor respuesta clínica a la terapia antitumoral o de que el

paciente tiene una baja probabilidad de responder a la terapia antitumoral.

S

El término "predicción", tal como aquí se utiliza, se refiere a la determinación de la

probabilidad de que el paciente que sufre de cáncer colorrectal responda favorable o

desfavorablemente a una terapia antitumoral. Especialmente, el término

"' predicción", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la valoración

individual de la supervi vencia global esperada de un paciente que sufre de cáncer

10

colorrectal si se trata con una terapia antitum oral.

En la presente invención se entiende por " respuesta clínica" la respuesta de un

paciente que sufre de cáncer colorrectal a una terapia antitumoraL Para evaluar la

respuesta a la terapia antitumoral puede utilizarse el sistema propuesto por Dworak

15

(Dworak, O. el al. , 1997 Int J Colorectal Dis., 12: 19-23) que clasifica la respuesta

basándose en el grado de respuesta tumoral (GRT) en tres grupos: no respuesta

tumoral (GRT O Y 1), buena respuesta tumoral (GR T 2 Y 3) Y respuesta tumoral

completa (GRT 4). El término "respuesta", tal como se usa en el presente

documento, puede ser una respuesta tumoral completa, en la que no hay célul as

20

tumorales viables; o bien una buena respuesta tumoral, en la que se produce una

regresión mayor del 25% de la masa tumoral con al menos algunas células tumorales

viables. La "no-respuesta" se define como la no-regresión o la regresión de menos

del 25% de la masa tumoral. Los pacientes que consiguen una buena respuesta o una

respuesta completa se consideran como respondedores, y el resto de pacientes como

2S

no-respondedores.

Para determinar la respuesta al tratamiento antes de la administración de la terapia

puede utili zarse cualqui er otro parámetro ampli amente aceptado para comparar la

eficacia de tratamientos alternativos. Dichos parámetros incluyen, sin limitación:

30

-riesgo de recaída que, tal como se usa en el presente documento, se entiende como

la probabilidad de un paciente de volver a desarrollar cáncer colorrectal tras un

período libre de enfermedad.

-

supervivencia global que, tal como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de pacientes que sobreviven, desde el momento del diagnóstico o tratamiento, al cabo de un período de tiempo definido.

5 -muerte por enfermedad que, tal como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de pacientes que fallecen como consecuencia de la enfermedad, desde el momento del diagnóstico o tratamiento, al cabo de un periodo de tiempo definido.

lOEn una realización de la invención el parámetro que se utiliza para determinar la respuesta clínica se selecciona de riesgo de recaída, supervivencia global y muerte por enfennedad.

En una realización particular de la invención el parámetro que se utili za para 1 S detenninar la respuesta clínica es la supervivencia global.

En la presente invención se entiende por "paciente" cualquier animal clasificado como mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas,

20 caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el paciente es un ser humano de sexo femenino o masculino y de cualquier raza o edad. En el contexto de la presente invención, el paciente es un paciente que sufre de cáncer colorrectal o que ha sido previamente diagnosticado de cáncer colorrectal.

2S El término "cáncer colorrectal", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier tipo de cáncer colorrectal, es decir, a cualquier neoplasia del colon, recto o apéndice. En una realización particular, el cáncer colorrectal es adenocarcinoma colorrectal, más preferiblemente adenocarcinoma de recto.

30 Una vez diagnosticado el cáncer colorrectal, se llevan a cabo pruebas para determinar su estadificación, es decir, para evaluar la extensión del cáncer y si éste se ha propagado a otras partes del organismo. La estadificación del cáncer requiere una combinación de exámenes fisicos, colonoscopia, ultrasonidos, radiografias, etc. Los

hallazgos obtenidos mediante estos procedimientos permiten asignar un estadio

específico al tumor. Existen diferentes sistemas de estadiaje del cáncer colorrectal,

entre los que se incluyen la estadificación de Dukes, la de Astler-Coller, y la más

habitual , la clasificación TNM. El método de la invención puede apli carse a

S

cualquier estadio de cáncer colorrectal. No obstante, en una realización particular, el

cáncer colorrectal es un cáncer en estadios 11 o I1I, más preferiblemente en estadios

T2NloT3NO.

En la terapia del cáncer colorrectal se pueden utilizar una variedad de tratamientos

10

para intentar eliminar o contener el cáncer. Dependiendo de la salud del paciente, así

como del tamaño, sitio y etapa del cáncer, se puede utili zar (i) ci rugía, que consiste

en eliminar la parte del colon O del recto que contiene cáncer, junto con una porción

del tejido sano que está a su alrededor, (ii) tratamientos citotóxicos/citostáticos, tales

como quimioterapia, que utiliza medicamentos contra el cáncer para destruir las

1 S

células cancerosas al hacer circular los medicamentos por el cuerpo a través de las

vías sanguíneas; radioterapia, en donde se emplean radiaciones de alta energía para

matar las célul as cancerosas, y agentes antitumorales; y/o (iii) inmunoterapia, en

donde el compuesto administrado estimula, realza o repara la función natural del

sistema inmunológico contra el cáncer para reconocer y elimin ar las células

20

cancerosas del cuerpo.

Como se ha explicado previamente, el método de la invención permite al experto en

la materia predecir la respuesta clínica de un paciente que sufre de cáncer colorrectal

a una terapia antitumoraL El término "terapia antitumoral" incluye tanto la terapia

2S

antitumoral neoadyuvante como la terapia antitumoral adyuvante.

En la presente invención, se entiende por "terapia antitumoral neoadyuvante" a una

terapia antitumoral administrada como primer paso para reducir el tamaño del tumor

antes del tratamiento principal , que generalmente consiste en cirugía. La terapia

30

antitumoral neoadyuvante puede incluir quimioterapia, radioterapia, agentes

antitumorales, inmunoterapia o combinaciones de las mismas.

Por tanto, en una realización particular, la terapia antitumoral es una terapia

antitumoral neoadyuvante, preferiblemente es un tratamiento citotóxico y/o

citostático que, en otra realización todavía más particular, se selecciona del grupo de

quimioterapia, radioterapia y quimiorradioterapia.

5

En la presente invención se entiende por "terapia antitumoral adyuvante" a una

terapia antitumoral adicional administrada después del tratamiento principal para

disminuir el riesgo de recurrencia. En general engloba a toda la terapia que se usa en

conjunción con la cirugía con el objetivo de reducir la sobrevivencia de

10

micrometástasi s tras dicha cirugía. La terapia antitum oral adyuvante puede incluir

quimioterapia, radioterapia. agentes antitumorales. inmunoterapia o combinaciones

de las mismas.

El término "terapia antitum oral" incluye tanto terapia local como sistémica. La

15

·"terapia antitumorallocal" afecta únicamente a las células de un tumor y al área

cercana al mismo, como es el caso de la radioterapia; mientras que la "terapia

antitumoral sistémica" utiliza sustancias que viajan por la corriente sanguínea y que

alcanzan y afectan a las células de todo el cuerpo, como la quimioterapia, los agentes

antitumorales y la inmunoterapia.

20

En una realización preferida de la mvención la terapia antiturnoral es terapia

antitumoral sistémica.

Los agentes quimioterápicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes

alquil antes tales como, por ejemplo, ciclofosfamida, carmustina, daunorubicina,

2S

mecloretamina, clorambucilo, nimustina, melfalán y similares; antraciclinas, tales

como, por ejemplo, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina,

mitoxantrona, valrubicina y similares; compuestos de taxano, tales como, por

ejemplo, paclitaxel, docetaxel y similares; inhibidores de la topoisomerasa tales

como, por ejemplo, etopóxido, tenipóxido, tulipóxido, irinotecán y similares;

30

análogos de nucleótidos tales como, por ejemplo, azacitidina, azatioprina,

capecitabina, citarabina, doxifluridina, S-fluorouracilo, gemcitabina, mercaptopurina,

metotrexato, tioguanina, ftorafur (tegafur/uracilo) y similares; agentes de base de

platino tales como, por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino y similares;

agentes antineoplásicos tales como, por ejemplo, vin cri stina, leucovorina (o ácido

folínico), lomustina, procarbazina y similares; moduladores hormonales tales como,

por ejempl o, tamoxifeno, fi nasterida, inhibidores de la S-a-reductasa y simil ares;

alcal oides de la vinca tales como, por ej emplo, vinbl astina, vincri stina, vindesina,

S

vin orelbina y similares. Los agentes quimioterápicos adecuados se describen con

más detall e en la bibli ografía , tal como en The Me rck lndex en C D-ROM, 1 r

edi ción.

Estos agentes quimioterápicos pueden administrarse aisladamente o formando

10

combinacion es en esquem as conocidos en la práctica clínica como FOLFOX

(oxaliplatino-Ieucovorina-tl uorouracilo), FOLFIRI (Ieucovorina-5-fluorouracilo

irinotecán), XELOX (capecitabina-oxaliplatino) o XELIRI (capecitabina-irinotecán).

A estos esquemas se les pueden añadir agentes inmunoterápicos como bevacizum ab

O cetuximab.

15

En una realización particul ar del método de la invención, la terapia antitumoral se

selecciona de 5-fluorouracilo, irinotecán, oxalipl atin o, UFT-LV (tegafur/uracilo

leucovorina), radi oterapia y combinaciones de los mi smos, más preferibl emente

di cha terapi a antitumoral es una terapi a antitumoral neoadyuvante.

20

En la presente invención se enti end e po r " agentes antitum o ral es" aquell os

compu es tos o agent es quími cos, fí sicos O bi o l óg icos con pro pi e d ad es

antiproliferativas, anti oncogéni cas y/o carcinostáti cas que pueden empl earse para

inhibir el crecimi ento, la proliferación y/o el desarroll o de tumores. Ejempl os de

25

agentes antitumorales que pueden emplearse en la presente invención son (i)

antimetabolitos, tales como antifolatos y análogos de pUTina; (ii) productos naturales,

tales como antibióticos antitumorales e inhibidores mitóticos; (iii) hormonas y

antagoni stas de las mismas, tales como andrógenos y corti costeroides; y (iv) agentes

bi ológicos, como vectores virales. Una relación d e compu estos que puede n

30

empl earse como agentes antitum orales se describe en la soli ci tud de patente

W02005/l1 2973.

En la presente invención se entiende po r "inmunoterapia" todas aquellas terapias

dirigidas a estimular la respuesta inmune, que incluyen (i) la inmunoterapia activa,

tal como la utili zación de fármacos que aumentan de forma ¡nespecífica la respuesta

inmunitaria del organi smo, por ejemplo , la interl euquina 2, el factor de necrosis

S

tum oral o el interferón; y (ji) la inmunoterapi a pasiva, que incluye anticuerpos

dirigidos contra antí genos tumorales como bevacizumab, cetuximab, trastuzumab,

panitumumab o erl otinib.

En la presente invención se enti ende por "baja probabilidad de respond er a un

10

tratamiento" co mo la probabilidad de que el paciente muestre una respuesta

desfavorable a la terapia antitumoraL Esta respuesta desfavorable puede incluir, pero

no se limita a, persistencia o incremento de los síntomas, aumento de la duración de

la enferm edad, estado patol ógico no estabili zado (específi camente deteri orado),

progresión de la enferm edad, empeoramiento del estado patológico y recurrencia

1 S

(tanto local como distante), tanto detectable como no detectable. También puede

incluir la di sminución de la supervivencia, comparado con la supervivencia esperada

si no se apli ca el tratami ento.

La primera etapa del método de la in vención comprend e la determinación de los

20

ni veles de ex presión de los genes ALOX15, CTNNB1, MAPK14, NOS2A , PTGES2 y

PTGS2 en una muestra del paci ente en estudi o antes de la admin istraci ón de la

terapi a.

El término " muestra", tal como se usa en el presente documento, se refi ere a

2S

cualquier muestra biológica que pu ed e obtener se d e un pacie nte. Ejemplos

ilustrativos, no limitativos, de dichas mu estras incluyen muestras de biopsia, tejido,

célula o fluido (sangre, suero, plasma, sali va, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo,

líquido peritoneal, heces, orina, lágrimas, moco, sud or, leche, extractos cerebrales y

simil ares). En una reali zación parti cul ar, di cha muestra es una muestra de tejido,

30

preferiblemente una muestra de tejido tumoral, más preferibl emente una muestra de

tejido tum oral colorrectal de un paciente que sufre cáncer colorrectaI. Dicha muestra

puede obtenerse por mét o dos conve ncio nales, tales como bi opsia, usand o

procedimi entos conocidos en el estado de la técni ca por el experto en la ciencia

médica. Métodos para obtener la muestra de la bi opsia incluyen la resecció n

quirúrgica de una masa de tejido o la mi crodi sección u otros métodos de separación

celular conocidos. Las célul as tum orales pueden obtenerse adici onalmente por

citología de aspiración medi ante la pun ción con una aguj a fina conectada a una

S

jeringa. Para simplificar la conservación y la manipulación de las muestras, éstas

pueden fijarse en formalina y embeberse en parafina, o congelarse primero y después

embeberse en un medi o cri osolidificable, tal como OCT-Compound, a través de la

inmersión en un medi o altamente criogéni co que permita la congelación rápida.

10

La cuantificación de los niveles de ex presión de los genes ALOX/5, CJNNBI,

MAPK/4, NOS2A , PTGES2 y P1GS2 puede reali zarse a partir del ARN mensaj ero

resultante de la transcripción de di chos genes (AR Nm) o de un fragmento de di cho

AR Nm. Alternati vamente, la cuantificación del ni vel de expresión de di chos genes

t ambi én puede reali za rse a partir de sU ADN compl ementari o (ADNc) o de un

l S

fragmento de dichos ADNc. En una reali zación parti cul ar de la presente invención, la

determin ació n de los ni veles de ex presión de los genes ALOX/5, CTNNB /,

MAPK/4, NOS2A , PTCiES2 y PTCiS2 se ll eva a cabo medi ante la medida de los

niveles del ARN mensaj ero (ARNm) de dichos genes.

20

Para medir los niveles de ARN m de los genes de la invención, la muestra biológica

puede tratarse fí sicament e o mecáni camente para di srupci onar el tejido o la s

estructuras celulares y liberar los componentes intracelulares a una solución acuosa u

orgáni ca para preparar los ácidos nucleicos para un posteri or análi sis. Los ácidos

nucleicos se extraen de la muestra por procedimi entos conocidos por el experto en la

2S

materi a y comercialmente di sponibl es. El ARN se extrae posteriorm ente de las

muestras congeladas o frescas por cualquiera de los métodos habituales, por ejemplo,

los descritos en Sambrook, J , el al. , 200 1. Molecul ar cl oning: A Laborato))' Manu al,

3rd ed., Cold Spring Harb or Laborato))' Press, N.Y. , Vol. 1-3. Preferiblemente, debe

evitarse la degradación del ARN durante el proceso de ex tracción.

30

El nivel de expresión puede determinarse usa ndo ARN m obtenido de una muestra de

tejido fij ada en formalina y embebida en parafina. El ARN m puede aislarse de una

muestra patológica almacenada o de una muestra de biopsia que primero se desparafina.

Un método para desparafinar la muestra es lavar la muestra parafinada con un

disolvente orgánico, tal como xi leno. Las muestras desparafinadas pueden rehidratarse

con una solución acuosa de un alcohol inferior. Alcoholes inferiores adecuados

incluyen, por ejemplo, metanoJ, etanol, propanoles y butanoles. Las muestras

S

desparafinadas pueden rehidratarse, por ejemplo, mediante sucesivos lavados con

soluciones alcohólicas de alcoholes inferiores de concentración decreciente.

Alternativamente, la muestra puede desparafinarse y rehidratarse simultáneamente.

Después la muestra se li sa y se extrae el ARN. También puede obtenerse ARN de

muestras de tejido tumoral fresco.

10

Técnicas adecuadas que pueden utilizarse en la presente invención para estudiar el perfil

de expresión génica son, por ejemplo, RT-PCR, SAGE, Taqman o microarrays. Los

ni veles de expresión del ARNm pueden determinarse mediante transcripción inversa

(RT) del ARNm seguida de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa

1 S

(PCR) y cuantificación del producto de la amplificación del ADNc. En una realiz.ación

particular de la invención, la cuantificación de los ni veles del ARNm de los genes de

interés se reali za mediante una PCR cuantitativa múltiple. La detección puede realizarse

en muestras individuales o en microarrays de tejidos.

20

El experto en la materia apreciará que el método de la invención puede ponerse en

práctica usando tanto niveles absolutos de expresión de los genes como niveles

relativos. Así, en la presente invención, la expresión "ni veles de expresión" se usa para

referirse tanto a niveles absolutos como a niveles relativos de expresión de un ARNm.

2S

La expresión "niveles absolutos de expresión" se refiere a la cantidad de ARN m de

interés total que aparece en una muestra. Dicho valor puede venir dado por la

concentración de ARNm, expresada en unidades de masa de ARNm por unidad de

volumen (p. ej . en ng/ml de muestra), en número de moléculas de ARN por unidad de

volumen (p.ej ., en pmol ARN Iml de muestra), en unidades de masa de ARNm por

30

unidad de masa de ARN total (pg ARNm específico I mg de ARN total) o en número

de moléculas de ARN por unidad de masa de ARNm total (p.ej., en pmol ARN / mg de

ARN total).

La expresión "niveles relativos de expresión" se refiere a la relación entre los niveles de

expresión del ARNm objeto de estudio y de un ARNm de referencia, es decir, se define

la concentración de ARNm de forma normalizada con respecto a dicho ARNm de

referencia.

5

Para normalizar los valores de expresión de ARNm entre las diferentes muestras es

posible comparar los niveles de expresión del ARN m de interés en las muestras a

analizar con la expresión de un ARN control. Como "ARN control" en la presente

invención se entiende ARN cuyos ni veles de expresión no cambian o cambian sólo en

10

cantidades limitadas en las células tumorales con respecto a células no-tumorales.

Preferiblemente, el ARN control es ARNm derivado de genes que se expresan de

manera consti tuti va, que son aquellos que siempre están activos o que se transcriben de

manera constante, y que codifi can para proteínas que están constitutivamente

expresadas y que ll evan a cabo funciones celulares esenciales. Genes constitutivos

15

preferidos que pueden utili zarse en la presente invención incluyen p-2-microglobulina

(B2M), ubiquitina, proteína ribosomal IS-S, ciclofilina, GAPDH, PSMB4 y actina. En

una reali zación preferida, el ARN control es ARNm de los genes GAPDH, B2M y/o

PSMB4.

20

En una realización de la invención, la cuantificación de la expresión génica relativa se

calcula según el método et comparativo usando GAPDH, B2M Y PSMB4 como control

endógeno y controles de ARN comercial como calibradores. Los resultados finales se

determinan según la fórmula 2-(6Ct de la muestra -óCt del calibrador), donde los

valores óCT del calibrador y de la muestra se calculan restando el valor CT del gen en

2S

estudio del vaJor del gen control. El resultado final obtenido para cada gen en esta etapa

es un valor absoluto de expresión.

El perfil génico cuya expresión se analiza en el método de la presente invención está

formado por 6 genes: ALOXI5, CINNBI, MAPKI4, NOS2A , PTGES2 y PIGS2.

30

El gen ALOX/5 (UniGene Hs.73809) codifica para la enZima lipooxigenasa 15

(Seiler, A., el al. 2008, Cen Mel.b, 8: 237-48); el gen CTNNB I (UniGene

H s.4760 18) codifica para la proteína beta-catenina (Fodde, R., el al. 200 1, Nat Rev

Cancer, l: 55-67); el gen MAPKI 4 (UniGene Hs.48S233) codifi ca para la enzima

proteína quinasa 14 acti vada por mitógeno, tambi én conocida como MAP quinasa

p38 (Fang, J.Y., Ri chardson, B.C. 2005, Lancet Oncol, 6: 322-7); el gen NOS2A o

NOS2 (UniGene Hs.70919 1) codifi ca para la proteín a óx ido nítri co sintasa 2

5

inducible (Cook, T. , el al. 2004, Cancer Res, 64 : 80 15-2 1); el gen PIGES2

(UniGene Hs.49521 9) codifi ca para la proteína prostaglandina E sintasa 2 (Hull,

M.A. el al. 2004, Mol Cancer Ther, 3: 103 1-9); Y el gen PTGS2, también conocido

como COX-2 (UniGene Hs. 196384), codi fica para el enzima prostaglandina

endoperóx id o sintasa 2 (o cicl oox igenasa 2) (Greenhough, A., el al. 2009,

10

Carcinogenesis, 30: 377-86).

El experto en la materia entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleóti dos

de di chos genes no afectan a la detección de la ex presión de los mi smos y, por lo

tanto, las variantes de estos genes generadas por mutaciones de su secuencia de

1 S

nucleótidos caen dentro del ámbito de la presente invención.

Una vez que se ha determinado un valor de expresión de los genes ALOX 15,

CTNNB 1, MAPK 14, NOS2A, PTGES2 y PTGS2 en una muestra, la etapa (ii ) de la

invención consiste en calcular un factor predi cti vo en base a los ni ve les de expresión

20

de di chos genes.

En la presente invención se entiende por "factor predictivo" o "factor pronósti co" a

un factor que se obtiene del conjunto de los valores de expresión de los seis genes.

Este factor predicti vo o pronósti co puede calcularse mediante la suma de los val ores

25

de ex presión obtenidos para cada gen en la etapa (i). Opcionalmente, los valores de

expresión obtenid os para cada gen en la etapa (i) pueden corregirse medi ante un

coefi ciente de corrección y cal cul ar, posteri orm ente, una puntuación resultante del

conjunto de los seis genes. Los métodos estadí sti cos para calcular dichos coefi cientes

de corrección son conocidos por el ex perto en la materia. En un o de los métodos

30

estadísti cos que puede utili zarse en la invención se usa el análi sis factorial, mediante

el que se generan 3 componentes para cada gen, asignándose a cada componente un

coefi ciente de corrección. El valor absoluto de expresión obtenido para cada gen en

la etapa (i) puede multipli carse por cada un o de los tres coefi cientes de corrección.

La suma de los valores corregidos obtenidos para cada uno de los genes en el

componente 1 genera el factor 1. Para obtener el factor 2 se suman los valores

corregidos paTa cada uno de los genes en el componente 2. Y, finalmente, la suma de

los valores corregidos de cada uno de los genes en el componente 3 genera el factor

S

3. Di chos factores pueden combinarse medi ante la siguiente fórmula para obtener el

factor predictivo o pronósti co (puntuación) del conjunto de los 6 genes.

Factor predi ctivo o pronósti co (puntuación) = raíz cuadrada (factor 12 + factor 22 +

factor 32)

10

En un a reali zación preferida de la invención el facto r predi cti vo o pronósti co se

calcul a medi ante la suma de los ni veles de expresión de los genes, opcionalmente

corregidos usando un coefi ciente para cada gen.

15

Finalmente, la etapa (iii) d e la invención consiste en comparar el valor del factor

predictivo obtenido en la etapa (ii ) con un val or de referencia. La colección de

muestras de las que deri va el val or de referencia está constituida preferibl emente por

pacientes que sufren el mi smo tipo de cáncer, es decir, cáncer colorrectal, O una

mezcla de tej idos colorrectales de indi viduos norm ales no afectados de cáncer

20

colorrectaL

El valor de referencia puede determinarse medi ante técnicas bien conocidas en el

estado de la técni ca, por ejemplo, determinando la medi a de los ni ve les de expresión

de los genes ALOX/5, CTNNB /, MAPK/4, NOS2A, PTGES2 y PTGS2 medidos en

2S

tejido tumoral procedente de muestras de biopsias de pacientes que sufren de cáncer

colorrectal que responden o no a la terapia antitumoral , o en tejido colorrectal

normal. Alternati vamente, el valor de referencia podría corresponder al valor de la

medi a de los ni veles de expresión de los genes ALOX/5, CTNNB J, MAPKJ4,

NOS2A, PT0ES2 y PT0S2 medidos en un a muestra de ARN obtenida mezclando

30

cantidades iguales de ARN de cada una de las muestras tum orales obtenidas de

biopsias de los pacientes que sufren cáncer colorrectal y que responden o no a una

terapia antitumoraL El valor de referencia tambi én puede obtenerse de genes que se

ex presan de forma constitutiva procedentes del mi smo paciente.

,.

En una reali zación preferida de la invención el valor de referencia se calcula a partir

de los valores de expresión de los genes ALOX/5, CTNNB/ , MAPK/4, NOS2A,

PTGES2 y PTGS2 en una población de muestras de pacientes que no responden a la

S

terapia antitumoral , más preferiblemente el valor de referencia es la media de estos

valores.

Una vez establecido el valor de referencia, el valor del factor predictivo obtenido en

la etapa (ii) puede compararse con este valor de referencia y, por 10 tanto, permite

10

detectar alteraciones en el valor del factor predictivo con respecto al valor de

referencia.

En el contexto de la presente invención, se entiende por "alteración del valor del

factor predictivo con respecto al valor de referencia" cualquier vari ación del factor

15

predictivo por encima o por debajo del valor de referencia. Una variación del factor

predictivo por encima del valor de referencia puede ser de al menos 1, l veces, 1,5

veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces,

80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más comparado con el valor de referencia.

Por otra parte, una variación del factor predictivo por debajo del valor de referencia

20

puede ser de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, O, l veces, 0,05 veces, 0,025

veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos comparado con el valor

de referencia.

Una vez que se ha realizado dicha comparación, el método de la invención permite

2S

hacer una predicción de si el paciente mostrará una mejor o peor respuesta a la

terapia antitumoraI. Más concretamente, en el método de la invención una alteración

del valor del factor predictivo con respecto al valor del factor de referencia es

indicati va de una peor respuesta a la terapia antitumoral o de que el paciente tiene

una baja probabilidad de responder a la terapia antitumoral.

30

En una realización particular, cuando el valor del factor predicti vo es superior al

valor de referencia, es indicati vo de una mejor respuesta clínica a la terapia

antitumoral. En otra realización de la invención, cuando el valor del factor predictivo

es superior al valor de referencia, es indicativo de una peor respuesta clínica a la terapia antitumoral.

S

En otra realización de la invención, cuando el valor del factor predictivo es inferior a la media de los pacientes no-respondedores, es indicativo de una peor respuesta clínica a la terapia antitumoraL

10

Los términos "mejor" o "peor" respuesta, tal como se usan en el presente documento, referidos a la respuesta clínica, se refieren a un paciente que muestra una respuesta favorable o desfavorable a la terapia antitumoral.

15 20 25

La expresión "baja probabilidad de responder a un tratamiento" ya se ha definido anteriormente. Como es bien sabido por el experto en la materia, la evaluación de la probabilidad, aunque sería lo preferible, habitualmente no es correcta para el 100% de los pacientes que se analizan. El término, sin embargo, requiere que una proporción estadísticamente significativa de paci entes puedan identificarse como poseedores de una predi sposición a no responder a una terapia antitumoral. Para determinar si una proporción es estadísticamente significativa pueden utilizarse varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, la determinación de intervalos de confianza, la determinación del valor p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Para más detalles, consultar Dowdy & Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Son s, New York 1983. Intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%. Los valores p son, preferiblemente, 0,2, 0,1 , 0,05.

30

El método de la invención, al identificar a aquellos pacientes que tienen una baja probabilidad de responder a la terapia antitumoral neoadyuvante, permite descartar a los pacientes no-respondedores y someterlos directamente a cirugía sin más demora y evitando, al mi smo tiempo, los efectos secundarios asociados a la administración de dicha terapia.

Por otra parte, dicho método también es útil para identificar a aquellos pacientes que

tienen una baja probabilidad de responder a la terapia antitumoral adyuvante, lo que

permite evaluar la relación beneficio-riesgo y descartar a aquell os pacientes que no

van a responder para evitar efectos secundarios innecesarios.

5

Los pacientes que más se pueden beneficiar de esta predicción son aquell os en los

que no exista una indicación clara de neoadyuvancia o adyuvancia, como los

pacientes de riesgo intermedio y con estadifi cación T2N 1, T3NO, Y también los

10

pacientes ancianos en los que existe una dudosa relación beneficiolriesgo. Por lo

tanto, en una realización de la presente invención, el método se aplica a pacientes

que se seleccionan del grupo de (i) un paciente que tiene un cáncer colorrectal en

estadio T2NI o T3NO y; (ii) un paciente anciano.

1 S

En el contexto de la presente invención se consideran "pacientes ancianos" a

aquellos pacientes de edad avanzada que sufren cáncer colorrectal . .La edad a partir

de la cual un paciente puede considerarse anciano varía en función de la especie. En

general, un paciente anciano muestra algún signo de envejecimiento tal como,

aumento en la incidencia de enfermedades, di sminución de la masa mu scular,

20

pérdida de movilidad, disminución de la capacidad de los sentidos (vista, olfato,

oído), deterioro cognitivo, disminución de la capacidad de regeneración de los

tejidos, alteraciones del comportamiento, etc. En el contexto de la presente

invención, cuando los pacientes son seres humanos, se consideran pacientes ancianos

aquellos con edad igualo superior a 6S años que sufren cáncer colorrectal.

25

KITS DE LA INVENCiÓN Y SUS USOS

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit para predecir la respuesta de un

paciente que sufre cáncer colorrectal a una terapia antitum oral que comprende

reactivos adecuados para la detección de los niveles de expresión de los genes

30

ALOX/5, C7NNB /, MAPK/4, NOS2A , PTGES2 y PlGS2. En una realización

particular la terapia antitumoral es una terapia antitumoral neoadyuvante.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit como el definido

anteriormente para predecir la respuesta de un paciente que sufre cáncer colorrectal a

la terapia antitumoral, preferiblemente a la terapia antitumoral neoadyuvante.

S

El término "kit", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una

combinación de un conjunto de reactivos adecuados para la detección de los niveles

de expresión de los genes ALOX/5, CTNNB /, MAPK/4, NOS2A, PTGES2 y PTGS2

junto con uno o más tipos de elementos o componentes (por ejemplo, otros tipos de

reactivos bioquímicos, contenedores, envases adecuados para su venta comercial,

10

sustratos a los que los reactivos están unidos, componentes de hardware electrónicos,

etc.)

En la presente invención, se entiende como "reacti vo adecuado para la detección de

los niveles de expresión de los genes", a cualquier compuesto o composición que

1 S

puede usarse para detectar los genes ALOXI5, C1NNBI , MAPKI4, NUS2A, PlrJES2

y PTGS2 y, opcionalmente, reacti vos para detectar uno O más genes constituti vos.

Este conjunto de reactivos puede incluir, sin limitarse a, ácidos nucleicos capaces de

hibridarse específicamente con cada uno de los genes, sondas, etc.

20

Ácidos nucleicos capaces de hibridarse específicamente con cada uno de los genes

ALOX/5, CINNB/, MAPK/4, NOS2A, PTeES2 y PleS2 son, por ejemplo, uno O

más pares de cebadores u oligonucleótidos para la amplifi cación específica de los

fragmentos del ARNm (o de su correspondiente ADNc) de dichos genes y/o una o

más sondas para la identificación de dichos genes.

25

Como entenderá el experto en la materia, los oligonuc1eótidos y sondas del kit de la

invención pueden usarse en todas las técnicas de determinación de perfiles de

expresión génica (RT -PCR, SAGE, TaqMan, PCR a tiempo real , PCR cuantitativa

múltiple, etc.).

30

En una realización preferida de la invención, los reacti vos adecuados para la

detección de los ni veles de expresión de los genes ALOX/5, CTNNB /, MAPKI4,

NOS2A , PleL;;2 y PleS2 son oligonuc1eótidos y sondas.

22

S

Dichos reacti vos, específicamente las sondas, pueden fijarse a un soporte sólido, tal como una membrana, un pl ásti co O un vidrio, tratado opcionalmente para facilitar la fij ación de di chas sondas al soporte. Dicho soporte sólido comprende, al menos, un conjunto de sond as que se hibrid an específi camente con los genes ALOXJ5, CINNB/ , MAPK/4, NOS2A, PTGES2 y PlGS2, y que pueden usarse para la detección de los ni veles de expresión medi ante tecnología de arrays.

10 1 S 20

Los kits de la invención comprenden adicionalmente reactivos para detectar un ARNm codificado por un gen constituti vo. La di sponibilidad de di chos reacti vos adi cionales permite la normalización de las medidas realizadas en dife rentes muestras (por ejemplo, la muestra a anali zar y la muestra control) para ex cluir que las diferencias en la expresión de los biomarcadores sean debidas a diferente cantidad de ARNm total en la muestra, más que a di ferencias reales en los ni veles relati vos de expresión. Los genes constituti vos, en la presente in vención, son genes que siempre están acti vos o que se transcriben de manera constante y que codifican para proteínas que están constituti vamente ex presadas y que ll evan a cabo fun ciones celul ares esenciales. Genes constitutivos preferidos que pueden utili zarse en la presente in vención incluyen p-2-mi croglobulina (B2M), ubiquitina, proteína ribosomal l S-S, cic1ofilina, GAPDH, P SMB4 y actina. En una realización preferida, el ARN control es ARN m de los genes GAPDH, B2M y/o PSMB4.

25

Todas las reali zaciones parti cul ares del método de la presente in vención son aplicables a los kits de la invención y a sus usos. El sigui ente ejempl o es m eramente ilustrati vo y n o se debe considerar como limitati vo de la invención.

30

Pacientes EJE MPLO 1. MATERIAl. Y MÉTODOS

23

Se seleccionaron 53 pacientes, mayoritariamente con estadios 11 y III de adenocarcinoma de recto por debajo de 10 cm de margen anal, que recibieron dos o más ciclos de quimioterapia y 50.4 Gy de radioterapia antes de la cirugía. Los pacientes fueron reclutados retrospectivamente y las variables clínico-patológicas registradas (Tabla 1).

Tabla t: Pacientes y características tumorales

Número total de pacientes N=53 N (% )

Edad med ia (rango)

64 (37 -80)

Sexo

Mujeres

25 (47,2)

Varones

28 (52,8)

Escala ECOG (ElIstern Coopertt!ive Oncologic Group)

O

19(42,2)

1

25 (55,6)

2

1 (2,2)

indeterminado

8

Clasificación pre-QRT cl íni ca d e l tumor (T)

uT2

3 (7,1)

un

36 (85,8)

uT4

3 (7, 1)

indeterminado

11

Clasificación pre-Q RT clínica nodal (N)

Negati va

2 1 (43,7)

Positiva

27 (56,2)

indeterminado

5 (1 0,4)

Estad io clínico

1

1 (2,4)

[]

14 (33,3)

1Il

27 (64,3)

indeterminado

11

Clasificación post-Q RT patológica del lum or (pT)

T I

3 (7, 1)

T2

10 (23 ,8)

T3

28(66,7)

T4

I (2,4)

indeterminado

11

Número de ganglios aislados (pN ) promedio (rango)

O (0-8)

Estadio patológico

O

10(18,9)

I

12 (22,6)

2a

17 (32,1)

2b

2 (3 ,8)

3a

I (1 ,8)

3b

5 (9,4)

3c

6( 11 ,4)

Número de ganglios a islados (pN) total promedio (rango)

8 (0-27)

Núme ro de ganglios negativos (pNI) promedio (rango)

7(0-2 1)

Grado

No respuesta (NR)

15 (28,3)

Buena respuesta

28 (52,8)

Respuesta compl eta

10 (18,9)

CEA promedio (rango)

2,8 (0,6-39, 1)

Linfocitos

Moderado-leve

27 (50,9)

No

26(49,1)

Monodtos

No

37 (69,8)

Sí

16 (30,2)

Quimioterapia previa

5-fluorouracilo

8( 15, 1)

¡rinotecan

1 (1 ,9)

oxaliplatino

27 (50,9)

UFT-LV

17(32, 1)

Nú mero de ciclos promedio de radioterapia previa (rango)

3 (1-11)

Quimioterapia adyuvante

S-tluorouracilo

2 (3 ,8)

¡rinoteean

6(1 1,3)

oxaliplatino-raltitrexed

16 (30,2)

UFT-LV

16 (30,2)

No

13 (24,5)

Número de ciclos promedio de radioterapia adyuvante (rango)

6 (2-8)

Distancia promedio al margen anal (rango)

:s 6 cm

33 (62,3)

> 6cm

20 (37,7)

Puntuación promedio (rango)

0,63 (0,42-5,19)

UFT-LV: uracilo/tegafur-Ieucovorina

En el análisis estadístico se incluyeron los 53 pacientes y se estudió la muestra prctratamicnto. Se obtuvieron consentimientos informados en todos los casos, y el estudio fue previamente aprobado por los correspondientes comités de ética del hospital.

Seguimiento

Los pacientes se siguieron a intervalos de tres meses durante dos años, después cada seis meses durante tres años, y más tarde anualmente. Las evaluaciones consistieron en un examen fisico, hemograma y bioquímica. La colonoscopia, la ecografía y la tomografia comp ut erizada se reali za ron seg ún una s guías estándar (http://www.asco.org/asco/downloads/Colon_Cancer_ Tool_ II-I-05.xls). Siempre que fue posible, se recomendó una confinnación histopatológica de recurrencia.

Respuesta y grado de regresión tumoral (GRT) El GRT se determinó mediante el examen hi stopatológico de los especímenes quirúrgicos, según la cantidad de células tumorales viables y la fibrosis acompañante producida por el tratamiento, de acuerdo al sistema propuesto por Dworak (Dworak, O. el al., 1997 1nt J Coloreet.1 Dis, 12: 19-23).

La respuesta a la quimioradioterapia se clasificó en tres grupos basándose en el GRT: no respuesta tumoral (NR) que incluyó los GRT O Y 1, buena respuesta (GRT 2 Y 3) y respuesta tumoral completa (GRT 4), dado que se pueden establecer estos tres grupos con supervivencias diferenciadas. Los grados de regresión se definen como GRT O y 1 (no regresión o menos del 25% de la masa tumoral); GRT 2 y 3 (regresión mayor del 25% de la masa tumoral con al menos algunas células tumorales viables); y GRT 4 (respuesta completa patológica, no células tumorales viables).

Preparación de las muestras Para el análisis de arrays de baja densidad mediante PCR cuantitativa múltiple se utilizaron las muestras tumorales de los 53 pacientes del estudio, que tenían historia clínico-patológica completa. Las muestras embebidas en parafina se tiñeron con hematoxilina-eosina y fueron analizadas por un patólogo. Se requirió un enriquecimiento en células tumorales superior al 75% y, cuando fue preciso, se realizó una posterior macrodisección con cuchilla de seguridad. El ARN se extrajo de S-lO secciones de cinco micras a partir de las muestras parafinadas utilizando técnicas estándar.

PCR cuantitativa múltiple

La totalidad del contenido en ARN se midió y verificó espectrofotométricamente y

electrofotométricamente. La transcripción inversa se realizó a partir de 200 ng de ARN

total usando el High-Capacity cONA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City,

CA). Las reacciones de PCR cuantitativa múltiple se realizaron en placas de 384

S

pocillos mediante el sistema de PCR cuantitativa múltiple en muestras de 50 ~I con

TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) y SO ¡.tI de ADNc

correspondientes a SO ng de ARN total por canal de tarjeta microfluídica. La expresión

de cada gen se midió en triplicado, y se normalizó en relación a tres genes de referencia

(GAPDH, B2M Y PMSB4).

10

Análisis estadístico

Estadística descriptiva. En el caso de variables cualitativas se calcularon las

frecuencias absolutas de aparición de cada modalidad de la variable y las frecuencias

relativas expresadas en porcentajes. Para las variables cuantitativas se calcularon las

1 S

medidas de tendencia central media o mediana. Como medidas de dispersión se utilizó

la desviación típica y el reconido de la variable.

ESladíslica inferencia/o Para variables cualitativas se aplicó el test de chi al cuadrado

con la correción de Yate, yen el caso de Tablas de 2x2 la prueba exacta de Fisher.

20

Antes de proceder a la aplicación de test de hipótesis para variables cuantitativas se

aplicó la prueba de Kolmogorov-Smirnov (KS) para estudiar el tipo de distribución que

seguía la variable (normal , no normal). Para aquell as variables donde la prueba KS

indicara que seguía una di stribución normal se aplicaron pruebas paramétricas (t de

Student) y en caso contrario test no paramétricos (Wilcoxon, U de Mann-Whitney). El

2S

método de Kaplan-Meier fue empleado para estimar la supervivencia global.

Normalización de Cr•

Como paso previo al análisis de los datos procedentes de la PCR cuantitativa se

procedió a la normalización de los mismos. Para ello se utilizaron dos modelos, que han

30

sido evaluados posteriormente: a) normalizar con tre s genes y b) normalizar con 12

genes. Debido a la variabilidad obtenida con la normalización tipo b) se decidió aplicar

el primer método. En todos los casos se normalizó por la media de cada gen calculada

en toda la serie de pacientes.

2.

Análisisfactorial

Con el fin de reducir dimensiones en la matriz de datos, se utilizó el análisis factorial utilizando los datos normalizados y aplicando el método varimax para rotar los ejes o S componentes. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Componente

I

2 3

ALOX 15-Hs00609608 m I CTNNB I-HsOO 170025 mI MAPKI4-Hs00 176247 m I NOS2A-HsOO 167248 m I PTGES2-Hs00228 159 mI PTGS2-HsOO I53 133 m I

,0 11 ,940 ,930 , 128 ,958 ,564 -,0 14 ,186 ,3 10 ,937 ,064 ,577 ,997 ,010 ,042 -,054 -,033 , 102

10

Tabla 2. Matriz de componentes rotados. Para obtener esta tabla se utili zó un método de extracci ón (análi sis de componentes prin cipal es) y un método de rotación (normalización Varim ax con Kaiser) . La TOtación convergió en cuatro iteraciones.

1 S

Análisis de cOf1glomeradosjerárqlficos Para evaluar la posibl e existencia de g rupos que permitan caracteri zar grupos de pacientes, se reali zaron dos análi sis de conglomerados jerárqui cos: uno por pacientes y otro por genes normali zados. Se utilizó el método del vecino más próximo y la distancia euclídea al cuadrado como medida.

20

Predicción de clase y validación Se utilizó un método de predicción de clase para determinar si los patrones de expresión géni ca podrían ser empleados para predecir la respuesta. Se desarrolló una función multi vanante basada en la ex presión géni ca que predi ce con precisión la cl ase de mi embro (respondedor/no respondedor) en un a muestra de prueba, sobre la base de ex presión de genes clave.

25

n, RESULTADOS

29

Datos clínicos y patológicos

Los datos histopatológicos de los 53 pacientes incluidos en este estudio se ilustran en la

Tabla 1.

S

PCR cuantitativa múltiple y supervivencia

El estudi o de la expresión géni ca en relación a la supervivencia de los pacientes

permitió identificar un perfil de 6 genes con relación estadí sti camente significati va con

la supervivencia global p= 0,009, aunque no se logró la signifi cación estadísti ca cuando

se comparó con la supervivencia libre de enfermedad (Figura 1).

10

PCR cuantitativa múltiple y respuesta tumoral a la quimiorradioterapia

Los tres grados de respuesta denominados no respuesta, buena respuesta y respuesta

completa se distribuyeron en 15 (28,3%), 28 (52,8%) Y 10 ( 18,9%), respecti vamente. El

GRT se relacionó con la supervivencia libre de enfermedad (SLE) de los pacientes,

l S

observándose una clara tendencia a la recidiva a menor GRT. El perfil de 6 genes

encontrado permitió clasificar a los pacientes en los tres grupos de respuesta de una

manera estadí sti camente significati va (p = 0,02, Figura 2).

1Il. DISCUSIÓN

20

Los resultados de este estudio han permitido identificar un perfil de 6 genes con valor

predictivo de respuesta al tratamiento en el cáncer colorrectal y que permite discriminar

significati vamente entre los grados de respuesta patológica clasificados como no

respuesta (grados de regresión GRT O Y 1), buena respuesta (grados de regresión GRT 2

2S

y 3) Y respuesta completa (grados de regresión GRT 4).

La predicción de la respuesta al tratamiento permite adecuar los tratamientos y actuar de

form a más o menos agresiva. Los pacientes que más se pueden beneficiar de esta

predicción son aquell os en los que no exista una indi cación cl ara de neoadyuvancia o

30

adyuvancia, en virtud de las incertidumbres clínicas (pacientes de riesgo intermedio,

como los casos de enfermedad T2N l Y T3NO; aquell os con deficiente estadificación

clínica, especialmente frecuente en relación a la estadificación nodal, pacientes ancianos

con dudosa relación beneficio/ri esgo, etc. ).

La no-respuesta a la terapia antitumoral se predice con una elevada sensibilidad, del

80%.

De nuevo esta predicción es de enorme interés, pues dada la muy escasa

probabilidad

de beneficio, estos enfermos deberían salir del protocolo habitual de

S

tratamiento preoperatorio y se r intervenidos directamente, evitando demoras

innecesarias en el tratamiento local , que dan oportunidad al mayor riesgo de estos

enfermos

de desarrollar metástasis a distancia y complicaciones locales como

obstrucción intestinal. Adicionalmente, se evitaría en estos pacientes la exposición a la

considerable toxicidad de la quimiorradioterapia.

10

La presente invención presenta ventajas frente a otras huellas genómicas conocidas

en el estado de la técnica que predicen la respuesta a la terapia antitumoral

neoadyuvante en pacientes de cáncer colorrectal , ya que el método de la invención

utiliza un menor número de genes, y por primera vez permite comparar la expresión

1 S

de las colecciones de genes con la supervi vencia de los pacientes.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método in vilro para la predi cción de la respuesta clínica a una terapi a

   5

   antitumoral en un paciente di agnosti cado de cáncer colorrectal o para la

   identificación de un paciente di agnosticado de cáncer colorrectal que presenta

   baja probabilidad de responder a un tratamientocon una terapia antitumoral que

   comprende

   (i) determinar los ni veles de expresión de los genes ALOX/5, CTNNBJ,

   10

   MAPK/4, NOS2A , PTCI-:S2 y PTCS2 en una muestra de dicho paciente

   antes de la administración de la terapia,

   (ii) calcular un factor predicti vo en base a los niveles de expresión de dichos

   genes y

   (iii) comparar el valor del factor predictivo obtenido en la etapa (ii) con un

   15

   valor de referencia

   en donde una alteración del valor del factor predi cti vo con respecto al valor de

   referencia es indicativa de una peor respuesta clínica a la terapia antitumo ral o

   de que el paciente tiene una baja probabilidad de responder a la terapia

   antitumoral.

   20

2. 2.

   Un método según la reivindicación I en dond e el factor predictivo se calcula

   medi ante la sum a de los ni vel es de expresió n de los genes, opcionalmente

   corregidos usando un coeficiente para cada gen.

   2S

   3. Un método según la reivindicación 2 en donde el valor de referencia se calcula a

   partir de los valores de expresión de los genes ALOX/5, C TNNB / , MAPK /4,

   NOS2A , PTGES2 y PTGS2 en una pobl ac ión d e mues tras de pacie ntes

   respondedores y no respondedores a la terapi a antitumoral.

   30

   4. Un método según la reivindicación 3 en donde el valor de referencia es la media

   de los val ores obtenidos a partir de la población de muestras de pacientes que no

   responden a la terapi a antitumoral.

3. 5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la respuesta clínica se selecciona de riesgo de recaída, supervivencia global y muerte por enfermedad

   S 6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a S en donde la respuesta clínica es supervivencia global.
4. 7. Un método según las reivindicaciones 1 a 6 en donde la terapia antitumoral se

   selecciona del grupo de quimioterapia, radioterapia y quimioradioterapia. 10
5. 8. Un método según las reivindi caciones 1 a 7 en donde la terapia antitumoral es terapia antitumoral sistémica.
6. 9. Un método según las reivindicaciones 1 a 8 en donde la terapia antitumoral es 15 una terapia antitumoral neoadyuvante.
7. 10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la determinación de los niveles de expresión de los genes ALOX/5, C1NNB/, MAPK/4, NOS2A , PTGES2 y PTGS2 se lleva a cabo mediante la medida de los

   20 niveles del ARN mensajero (ARNm de dichos genes.
8. 11 . Un método según las reivindicaciones I a lOen donde el paciente se selecciona del grupo de

   (i) un paciente que tiene un cáncer colorrectal en estadio T2N 1 o T3NO 25 (ii) paciente anciano
9. 12. Un kit para predecir la respuesta de un paciente que sufre cáncer colorrectal a una terapia antitumoral que comprende reactivos adecuados para la detección de los niveles de expresión de los genes ALUX/5, C1NNB/, MAPK/4, NOS2A,

   30 P¡'(jES2 y P1'(jS2.

10. 13.

    Un kit según la reivindicación 12 en donde la terapia antitumoral es una terapia antitumoral neoadyuvante.

11. 14.

    Uso de un kit según la reivindicación 12 para predecir la respuesta de un paciente que sufre cáncer colorrectal a una terapia antitumoraI.

    S 15. Uso de un kit según la rei vindicación 14 en donde la terapia antitumoral es una terapia antitumoral neoadyuvante.