ES2874398T3

ES2874398T3 - miARN circulantes como marcador de detección temprana y marcador pronóstico

Info

Publication number: ES2874398T3
Application number: ES18188388T
Authority: ES
Inventors: Barbara Burwinkel; Dharanija Madhavan
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2021-11-04
Anticipated expiration: 2034-05-02
Also published as: EP3444362A2; US20150315659A1; US9683264B2; EP3409794A1; ES2877689T3; EP3409794B1; EP3444362A3; EP3444362B1; EP2940151A1

Abstract

Un procedimiento no invasivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, que comprende determinar el nivel de al menos un miARN en una muestra biológica de un paciente con cáncer de mama primario; en el que un nivel alterado de el al menos un miARN en comparación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, en el que el al menos un miARN es miR-486-5p.

Description

DESCRIPCIÓN

miARN circulantes como marcador de detección temprana y marcador pronóstico

Campo de la invención

[0001] La presente invención generalmente se refiere a procedimientos para la detección temprana, pronóstico y predicción del inicio de cáncer de metástasis, preferentemente en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. En particular, la presente invención proporciona un perfil de expresión de miARN en plasma como marcador para la detección temprana, pronóstico y predicción del cáncer de mama, así como regímenes profilácticos y de tratamiento temprano contra el cáncer basados en el estado de expresión de dichos miARN en un sujeto sospechoso de desarrollar cáncer o que tiene cáncer en una etapa temprana. La presente invención proporciona un procedimiento para monitorear la terapia de un paciente que está siendo tratado contra cáncer de mama primario o cáncer de mama metastásico, así como agentes anticancerosos para su uso en la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario en función de la presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN. Además, la presente invención proporciona un procedimiento para dosificar el agente anticanceroso para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer de mama metastásico, así como un kit para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

Antecedentes de la invención

[0002] El cáncer es uno de los problemas médicos y de salud más importantes del mundo. Como la principal causa de muerte en todo el mundo, hubo 12,4 millones de nuevos casos de cáncer y 7,6 millones de muertes relacionadas con el cáncer en 20081. Se ha pronosticado que las muertes por cáncer en todo el mundo aumentarán continuamente y 12 millones de muertes serían causadas por cáncer en el año 20301. El cáncer de mama (CM) es el cáncer más común y la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer entre las mujeres2, con 1,38 millones de casos nuevos y 458.000 muertes en 20083. Aunque los avances terapéuticos han mejorado, la mayoría de los pacientes con CM todavía sufren de una calidad de vida muy reducida o incluso metástasis debido al diagnóstico retardado2'4 *. Aunque estudios recientes de asociación genomática (GWAS, Genome-Wide Association Studies) han detectado con éxito varias variantes genéticas asociadas con el riesgo de CM, no se ha identificado ningún marcador valioso para la detección temprana de CM. Como un evento temprano en el desarrollo de cáncer, el inicio de metástasis en particular en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico parece ser una herramienta particularmente prometedora.

[0003] El cáncer de mama (CM) y específicamente el cáncer de mama metastásico (CMM) son problemas de salud importantes en todo el mundo, ya que representan el mayor número de muertes relacionadas con el cáncer entre las mujeres1. Se ha demostrado que la detección temprana de metástasis mejora la tasa de supervivencia entre los pacientes con CM2, mientras que una mejor estratificación de los pacientes en grupos de buen y mal pronóstico conduciría a una estrategia de medicina más personalizada. Aunque se realizaron investigaciones sobre biomarcadores para estos fines, los marcadores identificados se limitaron a tipos específicos de CMM y carecían de sensibilidad y especificidad3-5. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de biomarcadores predictivos o pronósticos que puedan mejorar la calidad de vida de estos pacientes. Las células tumorales circulantes (CTC) han emergido como un prometedor biomarcador pronóstico en CMM, en general, y ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration - Administración de Alimentos y Medicamentos), aunque se debaten las limitaciones con respecto a sus procedimientos de enriquecimiento y detección6 *. Sin embargo, actualmente, el pronóstico y la evaluación del riesgo se logran en gran medida por características clincopatológicas como la edad de diagnóstico, el tamaño del tumor, el número y los tipos de sitios de metástasis, el estado del receptor, la supervivencia libre de enfermedad a distancia (SLED), etc. 7-9 Sin embargo, no hay marcadores para la detección temprana de metástasis que puedan indicar la propagación de la enfermedad antes de ser clínicamente discernibles a través de técnicas de imagen. El documento WO2010/065961 describe que los niveles de expresión de miR-31 se correlacionan con el riesgo de desarrollar metástasis en pacientes con cáncer de mama primario.

[0004] Por lo tanto, existe una laguna en el área de biomarcadores para predecir el pronóstico en todos los tipos de CMM y la detección temprana de metástasis en CM. Desde su descubrimiento en la placenta, los miARN circulantes, que representan la población de miARN en la porción libre de células de sangre y fluidos corporales, han atraído un gran interés en el campo del descubrimiento de biomarcadores10. Características tales como alta estabilidad, acceso por procedimientos mínimamente invasivos y posibilidad de muestreo repetido los convierten en candidatos ideales para su uso como biomarcadores11. Como se describió anteriormente, para varios tipos de cáncer, en particular, las técnicas no invasivas CM para la detección temprana siguen faltando. Además, sería altamente deseable contar con medios para determinar la susceptibilidad y la evaluación del riesgo para que un sujeto desarrolle esos cánceres y proporcione un procedimiento no invasivo, altamente eficiente, fácil, fiable y de bajo costo para la detección temprana de CM, así como otros cánceres. Este problema técnico se ha resuelto mediante las realizaciones tal como se caracterizan en las reivindicaciones y se describen más adelante e ilustran en los Ejemplos que muestran por primera vez la identificación de miARN circulantes que pueden discriminar a los pacientes en función de su estado de CTC y que podrían predecir el pronóstico en pacientes con CMM mediante la adopción de una estrategia de perfilado global, seguido de validación en dos cohortes independientes.

Resumen de la invención

[0005] La presente invención se refiere generalmente a un procedimiento no invasivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. Como se muestra en los Ejemplos, la presente invención se basa en la observación de un perfil global de miARN circulantes de pacientes con CMM que muestran una correlación entre la presencia, ausencia o nivel alterado de miARN y el riesgo de desarrollar cáncer de mama (CM) y, en particular, cáncer de mama metastásico (CMM).

[0006] En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento no invasivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. Este procedimiento comprende proporcionar una muestra biológica de un paciente con cáncer de mama primario o un paciente con cáncer de mama metastásico y determinar la presencia de al menos un miARN. a saber, miR-486-5p. La presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN se compara a continuación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente que es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario y SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico, respectivamente.

[0007] Además, la determinación de miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-210, miR-215, miR-365, miR-375, miR-429, miR-486-5p, miR-801, miR-1274a, miR-1260 y miR-1274a o cualquier combinación de estos es característica para la supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. En una realización preferida de la invención, la determinación de miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-375, miR-429, miR-1260 y miR-1274a o cualquier combinación de estos es característica para la predicción de la supervivencia libre de progresión (SLP) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0008] En la presente invención, la determinación miR-486-5p es característica para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario.

En una realización de la presente invención, la muestra biológica es sangre periférica o derivado de esta. En una realización preferida de la invención, la muestra biológica es plasma.

[0009] En otra realización de la presente invención, el cáncer de mama metastásico también incluye metástasis en órganos viscerales y/o no viscerales o cualquier combinación de estos. En una realización preferida de la invención, el cáncer de mama metastásico también incluye metástasis en el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos regionales, el hígado o el cerebro, o cualquier combinación de estos.

[0010] La presente descripción se refiere a un procedimiento para monitorear la terapia de un paciente que está siendo tratado contra cáncer de mama primario o cáncer de mama metastásico que comprende:

(a) proporcionar una muestra biológica de dicho paciente y

(b) predecir el inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico como se describió anteriormente.

[0011] Además, se proporciona una composición que comprende al menos dos miARN. En una realización preferida de la invención, la composición comprende miARN como se definió anteriormente. La composición también se puede usar en el procedimiento no invasivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico como se describió anteriormente.

[0012] La presente descripción también se refiere a agentes anticancerosos para su uso en la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario en un paciente. El paciente se caracteriza por la presencia, ausencia o nivel alterado de al menos un miARN en comparación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente que es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario y SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico. En una realización preferida de la invención, el agente anticanceroso se utiliza en la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) en un cáncer de mama metastásico, en el que el inicio se predice según el procedimiento de los procedimientos descritos anteriormente. El anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en fármacos quimioterapéuticos, radioterapia, agentes de anticuerpos y/o agentes terapéuticos dirigidos a hormonas.

[0013] La presente descripción se refiere a un procedimiento de dosificación del agente anticanceroso para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer de mama metastásico. El procedimiento comprende el procedimiento para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico y una preparación de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho agente anticanceroso y/o la administración de la composición farmacéutica con un régimen de dosificación adaptado para la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario.

[0014] La presente descripción también proporciona un kit farmacéutico y de diagnóstico, respectivamente, para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. El kit puede comprender instrucciones para llevar a cabo el procedimiento para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico, y una composición y/o un agente anticanceroso como se describió anteriormente.

[0015] La presente descripción también proporciona un dispositivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. Este dispositivo comprende una unidad de análisis que comprende un agente de detección para determinar la presencia de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-22, miR-141, miR-144, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, mi-429, miR-486-5p, miR-770-5p, miR-1260, miR-1274a o cualquier combinación de estos en una muestra biológica mediante el empleo del procedimiento para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0016] Además, miR-22, miR-141, miR-144, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, mi-429, miR-486-5p, miR-770-5p, miR-1260, miR-1274a o cualquier combinación de estos se utilizan para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

Breve descripción de los dibujos

[0017]

Fig. 1 Agrupación de Pearson de muestras basadas en miARN con P <0,01 para el análisis de limma correspondiente. (a) agrupación de muestras con mal pronóstico (rojo) y buen pronóstico (verde) utilizando los primeros 15 aciertos de miARN del análisis de limma, y (b) agrupación de pacientes que están muertos (rojo) y aquellos que están vivos (verde) utilizando los primeros 86 aciertos de miARN del análisis de limma.

Fig. 2 (A) Curvas de Kaplan-Meier de miARN correlacionadas significativamente con SLP en muestras de referencia de CMM (CMM^ref) y también para el estado de CTC. Las muestras se dicotomizaron como cuartil inferior y resto superior en función de sus niveles de miARN o como CTC-positivo y CTC-negativo en función de su estado CTC. El número de individuos en riesgo en cada estrato en diferentes momentos se indica a lo largo del eje x. (B-C) Curvas de Kaplan-Meier de miARN correlacionadas significativamente con SG en muestras de CMM^refy también para el estado de CTC. Las muestras se dicotomizaron como cuartil inferior y resto superior en función de sus niveles de miARN o como CTC-positivo y CTC-negativo en función de su estado CTC. El número de individuos en riesgo en cada estrato en diferentes momentos se indica a lo largo del eje x.

Fig. 3 Curvas de Kaplan-Meier de miARN correlacionadas significativamente con SLP en muestras de CMM después de una ronda de terapia (CMM-^ic) y también para el estado de CTC. Las muestras se dicotomizaron como cuartil inferior y resto superior en función de sus niveles de miARN o como CTC-positivo y CTC-negativo en función de su estado CTC. El número de individuos en riesgo en cada estrato en diferentes momentos se indica a lo largo del eje x.

Fig. 4 Curvas de Kaplan-Meier de miARN correlacionadas significativamente con SG en muestras CMM-^icy también para el estado de CTC. Las muestras se dicotomizaron como cuartil inferior y resto superior en función de sus niveles de miARN o como CTC positivo y CTC negativo en función de su estado CTC. El número de individuos en riesgo en cada estrato en diferentes momentos se indica a lo largo del eje x.

Fig. 5 Curvas de Kaplan-Meier de miARN correlacionadas significativamente con SG en todas las muestras de la cohorte II. Las muestras se dicotomizaron como menores que mediana y mayores que mediana en función de sus niveles de miARN. El número de individuos en riesgo en cada estrato en diferentes momentos se indica a lo largo del eje x.

Fig. 6 Curvas de error de predicción integradas (CEPI) que se muestran para el modelo nulo sin covariables, modelo de miARN, modelo de CTC y modelo de miARN+CTC en (a) y (b) muestras CMMREF y (c) y (d) muestras MBC1C.

Fig. 7 Gráficos de cajas y bigotes que muestran los niveles de expresión de los miARN con diferencia significativa entre los pacientes que no desarrollaron metástasis y los que lo hicieron en las muestras M0 de la cohorte II, representados por valores de punto de cruce (Cp, Crossing Point)).

Fig. 8 Distribución clínica de pacientes con CMMREF de la cohorte I utilizada para el perfilado de miARN por TLDA (TaqMan Low Density Array -matriz de baja densidad TaqMan). La histología y el estado del receptor se refieren a los del tumor primario del paciente.

Fig. 9 Distribución de las características clínicas de los pacientes de la cohorte I, muestras CMM^ref(n=234) y CMM-^ic(n=119). Los datos del tratamiento se refieren a los administrados a los pacientes antes del reclutamiento en el estudio. a Datos relativos al tumor primario. Abreviaturas-: ^sL^eD - supervivencia libre de enfermedad distante, RE - receptor de estrógeno, RP - receptor de progesterona, HER2 - factor de crecimiento epidérmico humano 2, SLP - supervivencia libre de progresión.

Fig. 10 Resultados del análisis de limma de los miARN candidatos elegidos para la validación con P <0,05, relación de cambio (FC, Fold Change) >2 o <0,5 y Ct (Cycle threshold- umbral del ciclo) promedio <32 para al menos uno del grupo en la comparación.

Fig. 11 Resultados de la prueba de logrank entre los niveles de miRNA o el estado de CTC y el tiempo de supervivencia, representados por HR (Hazard Rate - cociente de riesgo), IC (intervalo de confianza) del 95 % y valores P en muestras CMM^refy CMM¹C. Las muestras se dicotomizaron como cuartil inferior (miARN alto) y resto superior (miARN bajo) en función de sus valores de Cp de miARN, o como CTC positivo y CTC negativo en función de su estado CTC. HR se calculó como la relación de probabilidad de progresión o muerte del grupo miARN alto/CTC-positivo en relación con la del grupo miARN bajo/CTC-negativo. HR mayor que 1 denota que el aumento en la variable disminuye la probabilidad de supervivencia, mientras que aquellos menores que 1 denotan que la disminución en la variable disminuye la probabilidad de supervivencia.

Fig. 12 Resultados de la prueba de suma de rango de Wilcoxon pareada que compara los niveles de miARN al inicio del estudio y 1 ciclo de terapia. Relación de cambio (FC) = 2'ñCp, en el que ACp corresponde a CMM^refCMM^1c.

Fig. 13 Diferentes modelos construidos con análisis de regresión de cox LASSO multivariable validado cruzadamente diez veces para SLP y SG en muestras CMMREF y CMM¹C, y los valores EPI correspondientes.

Fig. 14 Resultados de validación independiente. Se proporcionan HR con IC del 95 % y valores P de la prueba de logrank que representan la correlación de miARN con SG. HR se calculó como la relación de probabilidad de progresión o muerte del grupo alto de miARN en relación con la del grupo bajo de miARN. El FC entre los pacientes M0 que desarrollaron metástasis y aquellos pacientes M0 que no desarrollaron metástasis junto con sus valores de P se representa en «Inicio metastásico». Fig. 15 Correlación del miARN con la supervivencia libre de progresión (SLP) o la supervivencia general (SG)

(A) en muestras de la cohorte I al inicio del estudio: (B) en muestras de la cohorte I después de la terapia. Fig. 16 Comparación de los modelos de miARN con CTC (células tumorales circulantes). (A) Los resultados muestran la comparación del error de predicción del modelo de miARN con el de los marcadores pronósticos para CMM, estado de células tumorales circulantes (CTC) al inicio y después de la terapia; (B) Correlación de miARN con el inicio de metástasis en la cohorte II.

Descripción detallada de la invención

[0018] Los biomarcadores pronósticos que divulgan información sobre la propagación de la enfermedad a sitios distantes, la progresión de la enfermedad y la supervivencia de los pacientes tienen aplicaciones clínicas importantes. Ayudan a los oncólogos en los procedimientos de toma de decisiones y a adoptar un régimen de tratamiento adecuado para los pacientes8. Los biomarcadores basados en la sangre tienen ventajas sobre los marcadores tisulares, ya que se puede acceder a ellos fácilmente y también se pueden monitorear de forma rutinaria.

[0019] Sin embargo, el pronóstico y la evaluación del riesgo se logran en gran medida por características clinciopatológicas como la edad de diagnóstico, el tamaño del tumor, el número y los tipos de sitios de metástasis, el estado del receptor, la supervivencia libre de enfermedad a distancia (SLED), etc.7-9. Además, no hay marcadores para la detección temprana de metástasis que puedan indicar la propagación de la enfermedad antes de ser clínicamente discernibles a través de técnicas de imagen.

[0020] La presente invención se refiere generalmente a un procedimiento para la predicción temprana del inicio de la metástasis y, como se muestra en los Ejemplos, se basa en experimentos realizados según la presente invención que revelan que los biomarcadores basados en la sangre, es decir, los miARN circulantes, podrían asociarse con el inicio de la metástasis, en particular en un paciente con cáncer de mama primario. Además, se podría demostrar que los miARN circulantes son capaces de predecir la supervivencia libre de progresión (SLP) o la supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico (CMM). Por lo tanto, la presente invención proporciona miARN así como sus identificadores de perfil que podrían servir como marcador para la predicción del inicio de metástasis. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento no invasivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico, que comprende:

(a) proporcionar una muestra biológica de un paciente con cáncer de mama primario o un paciente con cáncer de mama metastásico; y

(b) determinar la presencia de al menos un miARN; en el que la presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN en comparación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario y SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico, respectivamente.

[0021] Se han descubierto microARN (miARN) tanto en genomas vegetales como animales como una clase de ARN no codificantes de cadena simple pequeños conservados evolutivos. Varios estudios demostraron que los miARN plasmáticos son notablemente estables, para su revisión, véase, por ejemplo, Creemers y col., Circ Res. 110 (2012), 483-495. Debido a su estabilidad en plasma y circulación, así como a la facilidad por la cual los miARN se pueden detectar de manera cuantitativa mediante procedimientos tales como PCR (Polymerase Chain Reaction - reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real y micromatrices, los miARN circulantes se pueden usar como biomarcadores clínicos.

[0022] Como se ilustra en los Ejemplos adjuntos, el procedimiento de la presente invención en primer lugar se basa en observaciones sobre estrategias de elaboración de perfiles globales seguidos de la validación de los resultados en cohortes que muestran uno o más sitios de metástasis (cohorte I) y/o ninguna metástasis y pacientes con metástasis del control de casos basado en la población de la investigación de factores de riesgo de carcinoma de mama (MARIE, Mamma Carcinoma Risk factor Investigation) que identifican miRNAque podrían predecir el pronóstico en pacientes con cáncer. En particular, que podría predecir el pronóstico en pacientes que padecen cáncer de mama metastásico (CMM). El perfilado global de miARN circulantes a partir de muestras de ^cMM^refy análisis Limma, como se muestra en los Ejemplos, reveló 8 miARN significativos para el mal pronóstico vs. mal pronóstico y 21 miARN que muestran un valor significativo entre la comparación muertos-vivos (Fig. 1 y Fig. 10, Ejemplo 1). Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-22, miR-141, miR-144, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, mi-429, miR-486-5p, miR-770-5p, miR-1260, miR-1274a.

[0023] Dado que múltiples paneles marcadores son más informativos que los miARN individuales26, los paneles de miARN que poseen la mayor precisión y menor redundancia se construyen como se muestra en los Ejemplos. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, se determina la presencia, ausencia o nivel alterado de cualquier combinación del miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-144, miR-193b, miR-215, miR-365, miR-429, miR-486-5p, miR-1260, miR-1274a, lo que podría predecir el pronóstico para el riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario y SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico, respectivamente.

[0024] Dado que la supervivencia libre de progresión (SLP) y la supervivencia general (SG) están estrechamente relacionadas, se ha probado si los miARN de valor pronóstico podrían validarse utilizando el procedimiento de validación de la presente invención, véanse los Ejemplos, para identificar miARN que serían capaces de predecir SLP y SG.

[0025] El análisis reveló que miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-375, miR-429, miR-1274a, miR-210, miR-365, miR-486-5p, miR-801 y miR-1274a se correlacionaron con SG en pacientes con CMM y es característico de SG (Fig. 11). Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la expresión de miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-210, miR-215, miR-365, miR-375, miR-429, miR-486-5p, miR-801, miR-1260 y miR-1274a o cualquier combinación de estos se determina para su uso en la caracterización para la supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0026] Además, se han identificado niveles plasmáticos de miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-375, miR-429 y miR-1274a que están significativamente asociados a SLP (Fig. 11). Por consiguiente, el procedimiento realizado según la presente descripción comprende la determinación de miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-375, miR-429 y miR-1274a o cualquier combinación de estos, en el que la presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN es característico para la predicción de la supervivencia libre de progresión (SLP) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0027] Curiosamente, se evaluó que la mayoría de los miARN permanecieron significativamente correlacionados con SLP y SG incluso después de un ciclo de terapia. Esto es importante, ya que el pronóstico de un paciente es dinámico y debe cambiar dependiendo de su respuesta a la terapia, y el biomarcador que se ha identificado debe reflejar el verdadero estado pronóstico actual del paciente.

[0028] Como se muestra en el Ejemplo 6 y la Fig. 14, los miARN miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-210, miR-215 y miR-486-5p fueron capaces de predecir la supervivencia libre de enfermedad a distancia (SLED) y, por lo tanto, demuestra su uso como marcadores de detección temprana de metástasis, que pueden predecir la propagación de la enfermedad incluso dos años antes del diagnóstico clínico de metástasis. En vista de los resultados mostrados en las Figuras y Ejemplos, el procedimiento se utiliza para la predicción del inicio de metástasis en una paciente con cáncer de mama primario. En particular, la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario se realiza determinando los miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-210, miR-215 y/o miR-486-5p que se han demostrado que son característicos para el inicio de la metástasis (Fig. 14).

[0029] Los términos «muestra biológica», «muestra» y «muestra clínica» se utilizan de forma intercambiable en esta invención e incluyen, pero no se limitan a, biopsia de tejido, material de autopsia, muestras de patología, secciones de tejidos, células, fluidos corporales, tales como sangre, esputo, suero, leche, saliva u orina, o fracciones y/o componentes de estos. Como se ilustra en los Ejemplos, se han utilizado muestras de sangre que proporcionan la ventaja de una recolección fácil de las muestras y la posibilidad de recurrir a muestras de sangre recolectadas previamente para otros fines de diagnóstico. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, la muestra del sujeto a analizar según el procedimiento de la presente invención es un fluido corporal, preferentemente sangre periférica o derivado de esta. En una realización particularmente preferida de la invención, la muestra es plasma, véanse también los Ejemplos.

[0030] Los términos «control», «muestra de control» o «valor de referencia» que se utilizan de forma intercambiable en esta invención, deben entenderse como una muestra o estándar utilizado para la comparación con la muestra experimental. El control puede incluir una muestra obtenida de un sujeto sano sin cáncer o una muestra no tumoral. Adicionalmente, un control también puede ser un valor de referencia estándar o intervalo de valores, es decir, tal como miARN expresados estables en las muestras, por ejemplo, el control endógeno cel-miR-39. Sin embargo, como se muestra en los Ejemplos, los valores determinados según la presente invención también pueden usarse como valor de control o de referencia. En particular, por primera vez se han identificado dos controles endógenos, que mostraron una alta estabilidad a través de las muestras de plasma CMM. Como se muestra en el Ejemplo 1, los dos miARN identificados que se descubrió que eran los miARN expresados de forma más estable y, por lo tanto, se utilizaron para normalizar los datos de validación, fueron miR-29a y miR-139-5p. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, miR-29a y miR-139-5p se utilizan como controles endógenos para normalizar los datos de validación.

[0031] En este contexto, se entiende que a los efectos del procedimiento de la presente invención el término «control» también incluye realizaciones en las que una muestra de un sujeto que previamente se determinó que padece o está en riesgo de desarrollar cáncer puede ser la fuente de una muestra de control, independientemente de si el sujeto ha sido diagnosticado o no con un procedimiento de la presente invención o una herramienta de diagnóstico equivalente. De manera similar, el término «valor de referencia» incluye realizaciones en las que se ha determinado que el valor de referencia estándar o intervalo de valores es indicativo del inicio de desarrollo del cáncer, en particular cáncer de mama (CM), inicio de metástasis, supervivencia general (SG) y/o supervivencia libre de progresión (SLP), y por lo tanto puede servir como un «positivo» sin la necesidad de un control o valor de referencia obtenido de un voluntario sano. Por consiguiente, en una realización, los valores determinados según el procedimiento de la presente invención para sujetos afectados con cáncer representados en cualquiera de las Figuras 11-15 generalmente pueden servir como valores de referencia.

[0032] La metástasis también se puede propagar de la mama a otros órganos distantes. Los sitios más comunes de metástasis en otros órganos se muestran en la Fig. 9. Por lo tanto, en otra realización de la presente invención, el cáncer de mama metastásico también puede incluir metástasis de otros órganos distantes, en particular metástasis en órganos viscerales y no viscerales. En una realización preferida de la invención, la metástasis se encuentra en el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos regionales, el hígado o el cerebro o cualquier combinación de estos.

[0033] Además, se diseña una composición que comprende al menos dos miARN como se definió anteriormente. Además, dicha composición puede comprender medios adecuados para la detección, tales como reactivos usados convencionalmente en procedimientos de diagnóstico basados en ácido inmunológico o nucleico. En una realización preferida de la invención, la composición se utiliza en el procedimiento no invasivo como se describió anteriormente para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0034] Además de la capacidad de como detectores tempranos y/o predictores de metástasis, la presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN como se describió anteriormente en comparación con un valor de referencia o control correspondiente, se puede usar para monitorear la terapia de un paciente que está siendo tratado contra cáncer de mama primario o cáncer de mama metastásico. Como se muestra en los Ejemplos y explicaciones de esta invención, la determinación y/o discriminación del pronóstico de un paciente mediante la determinación del nivel de expresión es posible. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a un procedimiento para monitorear la terapia de un sujeto que está siendo tratado contra cáncer de mama primario o cáncer de mama metastásico. En particular, el procedimiento comprende las etapas de proporcionar una muestra del sujeto y predecir y determinar el inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico como se describió anteriormente. La muestra utilizada en el procedimiento para monitorear la terapia es sangre periférica, en una realización preferida particular plasma. Además, el perfil de expresión de miARN alterado en comparación con una muestra de referencia, obtenida, por ejemplo, del sujeto antes o en una etapa anterior del tratamiento, indica la eficacia de un curso de tratamiento que se somete al sujeto.

[0035] Además, debido a la posibilidad de la detección temprana y la predicción del cáncer, en particular el cáncer de mama metastásico, se puede desarrollar un régimen de tratamiento. En vista de la probabilidad y/o el pronóstico determinado, por ejemplo, bueno vs. malo, uno o más genes candidatos se pueden utilizar como biomarcadores para la predicción temprana del cáncer como se muestra en los Ejemplos y explicaciones anteriores. Además, se puede contemplar el tratamiento contra el cáncer en vista de la expresión de miARN alterada de la presente invención. Esto es particularmente ventajoso ya que se puede realizar un tratamiento correspondiente al pronóstico, es decir, la expresión de miARN. Una ventaja adicional es el tratamiento más preciso que puede ser posible debido a la gravedad, es decir, el pronóstico. En particular, se podrían evitar los efectos secundarios del tratamiento del cáncer, dependiendo de la gravedad del cáncer y el tratamiento, tales como los efectos secundarios típicos de la quimioterapia.

[0036] En este contexto, la presente descripción incluye la provisión de una terapia adecuada para el sujeto afectado o en riesgo de desarrollar cáncer. La terapia incluye la administración de un agente anticanceroso para su uso en el tratamiento, prevención o mejora del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario en un paciente, en la que dicho paciente se caracteriza por la presencia, ausencia o nivel alterado de al menos un miARN. En una realización preferida de la invención, el nivel de miARN se compara con un valor de referencia o muestra de control correspondiente que es indicativo del riesgo de inicio de metástasis. El paciente que obtiene un tratamiento con el agente anticanceroso y tiene el riesgo de inicio de metástasis es preferentemente un paciente que tiene el riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario y SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0037] Como ya se mencionó anteriormente, una ventaja de la presente invención es que el procedimiento permite la identificación del inicio de la metástasis. Por esta razón, el tratamiento con el agente anticanceroso para prevenir, mejorar o tratar el inicio de metástasis en un sujeto puede producirse en una etapa temprana del cáncer. Por lo tanto, el tratamiento también podría servir como una especie de prevención para evitar el inicio de metástasis o síntomas de esta. El agente anticanceroso se puede administrar al sujeto a una dosis adecuada y se puede efectuar de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o administración espinal o cerebral, pero también en formulaciones aerosólicas y formulaciones para administración rectal o vaginal con un portador adecuado.

[0038] La dosis será determinada por el médico tratante y los factores clínicos, pero también se puede ajustar según el diagnóstico como se estableció anteriormente o la progresión o regresión del inicio de la metástasis que se evaluará, por ejemplo, mediante el procedimiento para la predicción del inicio de la metástasis como se describió anteriormente. Por consiguiente, la presente descripción se refiere a un procedimiento de dosificación del agente anticanceroso para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer de mama metastásico, que comprende

(a) para la predicción del inicio de la metástasis como se describió anteriormente; y

(b) preparar una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho agente anticanceroso; y/o (c) administrar dicha composición farmacéutica con un régimen de dosificación adaptado para la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario.

[0039] El agente anticanceroso puede ser uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en, pero no se limita a, fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino, ciclofosfamida, taxanos, bisfosfonato; radioterapia; agentes de anticuerpos tales como trastuzumab, bevacizumab; agentes terapéuticos dirigidos a hormonas (terapia endocrina) tales como tamoxifeno, letrozol, exemestán. En una realización de la presente invención, el agente anticanceroso puede ser útil en la mejora, prevención o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) en un cáncer de mama metastásico que se predice según el procedimiento descrito anteriormente.

[0040] La presente descripción también se refiere a un kit que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más ingredientes del procedimiento descrito anteriormente. Por ejemplo, el kit es adecuado para la determinación del nivel de expresión de miARN según la presente invención. En particular, el kit puede comprender uno o más pares de cebadores para amplificar al menos un miARN o un fragmento y/o para analizar el producto amplificado por dicho par de cebadores. El al menos un miARN identificado se selecciona del grupo que consiste en miR-141, miR-144, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, mi-429, miR-486-5p, miR-1260, miR-1274A. Por consiguiente, se diseña un kit para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0041] El kit utilizado según el procedimiento de la presente descripción permitirá la predicción temprana del inicio de cáncer de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico. La expresión de miARN determinada usando el kit mencionado anteriormente, en el que la presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN en comparación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente es indicativa del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario y SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico, respectivamente. La presencia, ausencia o nivel alterado de el al menos un miARN se mide en sangre periférica, preferentemente plasma. Además o alternativamente, el kit puede comprender además instrucciones para llevar a cabo dicho procedimiento y opcionalmente estándares para un control o referencia, así como reactivos e/o instrucciones para su uso en ensayos de diagnóstico apropiados. Los resultados o salida obtenidos por el kit se pueden proporcionar en una salida de papel, una visualización en una pantalla, una salida gráfica y salida audible. Además, la salida de datos incluye, pero no se limita a, valores numéricos, presentaciones gráficas, información cuantitativa e información cualitativa. Además, se puede incluir en el kit información o pautas para interpretar los datos que proporcionan un valor de corte o nivel de expresión de el al menos un miARN que es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, o SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico. Además, el kit para su uso según el procedimiento de la presente invención también puede comprender composiciones así como uno o más agentes anticancerosos como se describió anteriormente.

[0042] Además, la presente descripción se refiere a un dispositivo para predecir el cáncer de mama y/o el inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, o la SLP o SG de un paciente con cáncer de mama metastásico. Este dispositivo puede comprender dos unidades, es decir, una unidad de análisis y una unidad de evaluación, que pueden separarse entre sí como dos unidades o dispositivos independientes o formar una unidad. En una realización preferida de la invención, el dispositivo se forma a partir de una unidad que comprende la unidad de análisis y evaluación. La unidad de análisis comprende un agente de detección para determinar la presencia de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-141, miR-144, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, mi-429, miR-486-5p, miR-1260, miR-1274a o cualquier combinación de estos. Además, la unidad de análisis puede comprender un receptáculo para una muestra de un sujeto que se sospecha que padece o está en riesgo de desarrollar cáncer, preferentemente cáncer de mama, particularmente preferido inicio de metástasis en cáncer de mama primario, que podría ser, por ejemplo, una tira reactiva desechable. La unidad de evaluación comprende un procesador de datos que tiene incorporado de forma tangible un algoritmo para llevar a cabo una comparación de la cantidad determinada por la unidad de análisis con una referencia almacenada y que es capaz de generar un archivo de salida que contiene un diagnóstico establecido basado en dicha comparación. Además o alternativamente, el nivel de expresión de miARN expresados de forma estable puede determinarse y usarse para la comparación. En particular, se puede utilizar miARN miR-29a, miARN-139-5p y/o cel-miR-39.

[0043] Además, el miR-141, miR-144, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, mi-429, miR-486-5p, miR-1260, miR-1274a o cualquier combinación de estos se utiliza/n para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario o la supervivencia libre de progresión (SLP) o supervivencia general (SG) de un paciente con cáncer de mama metastásico.

[0044] Estos y otros aspectos se describen y abarcan por la descripción y los Ejemplos de la presente invención. La bibliografía adicional relativa a cualquiera de los materiales, procedimientos, usos y compuestos que se emplearán según la presente invención puede recuperarse de bibliotecas y bases de datos públicas, utilizando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública «Medline», que es alojada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, National Center for Biotechnology Information) y/o la Biblioteca Nacional de Medicina en los Institutos Nacionales de

[0045] Salud (NLM.NIH, National Library of Medicine en the National Institutes of Health). Otras bases de datos y direcciones web, como las del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, European Bioinformatics Institute), que forma parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL, European Molecular Biology Laboratory), son conocidas por el experto en la materia y también se pueden obtener utilizando motores de búsqueda en Internet. En Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 se ofrece una visión general de la información sobre patentes en biotecnología y un estudio de las fuentes pertinentes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para la sensibilización actual.

[0046] La descripción anterior generalmente describe la presente invención. A menos que se indique lo contrario, a un término tal como se usa en esta invención se le da la definición tal como se proporciona en el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular, Oxford University Press, 1997, revisado 2000 y reimpreso 2003, ISBN 0 198506732. A lo largo del texto de la presente memoria descriptiva se citan varios documentos. Las citas bibliográficas completas se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva inmediatamente anterior a las reivindicaciones. No hay admisión de que cualquier documento citado sea efectivamente técnica anterior en cuanto a la presente invención.

[0047] Se puede obtener una comprensión más completa mediante referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en esta invención únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Material y procedimientos

Muestras y diseño del estudio

[0048] Las muestras utilizadas en este estudio pertenecieron a dos cohortes del estudio. La cohorte I consistió en 237 pacientes con presencia confirmada radiológicamente de uno o más sitios de metástasis, por lo que se les diagnosticó CMM en el momento de la extracción de sangre. La progresión tumoral se monitoreó rutinariamente aproximadamente cada 3 meses y la respuesta se clasificó según las pautas RECIST20. Se recogió sangre periférica en tubos EDTA (Sarstedt S-Monovette R, Numbrecht, Alemania) después del reclutamiento en el estudio (muestras de CMMREF).

[0049] De los 237 pacientes, se recolectó una muestra de sangre adicional de 117 pacientes con CMM después de completar una ronda de terapia (muestras de CMM1C). La sangre se procesó dentro de las 2 horas posteriores a la flebotomía mediante un protocolo de centrifugación de dos etapas; 1300 g durante 20 min a 10 °C seguido de 15500 g durante 10 min a 10 °C del sobrenadante plasmático obtenido de la primera etapa. El plasma separado de esta manera se congeló a presión y se almacenó a -80 °C. Simultáneamente a cada extracción de sangre, el estado de CTC se determinó adicionalmente mediante la evaluación de CTC por el sistema CellSearch R (Veridex, LLC, Raritan, NJ). Dependiendo del número de CTC, los pacientes fueron designados como CTC positivos (5 CTC/7,5 ml de sangre) o CTC negativos (<5 CTC/7,5 ml de sangre o ningún CTC detectable). Las muestras de la cohorte II se extrajeron del control de casos basado en la población MARIE (Mamma Carcinoma Risk factor Investigation), en el que los sujetos del estudio eran de dos tipos; aquellos sin metástasis (M0, n =265) y aquellos con metástasis (M1, n =67) al inicio del estudio. Se recogieron muestras de plasma de cada paciente aquí. Aquí, las muestras de sangre se centrifugaron a 3300 g durante 10 minutos. El plasma se separó y almacenó a -80 °C. Las muestras de plasma se descongelaron y se aplicó una segunda etapa de centrifugación (12000 g durante 10 minutos). Se alícuotaron 200 ml de sobrenadante de esta etapa en un tubo de 2 ml y se almacenaron a -80 °C. SLP, SG y SLED se calcularon como tiempo, en meses, desde la extracción de sangre hasta la progresión de la enfermedad o el último examen radiológico, la muerte o la última visita, y el desarrollo de metástasis o el último tiempo de seguimiento, respectivamente. Todas las muestras eran femeninas y de origen caucásico. El estudio se realizó según los principios consagrados en la Declaración de Helsinki y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Heidelberg (Heidelberg, Alemania). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El estudio consistió en tres fases: (1) fase de descubrimiento, (2) fase de validación y (3) segunda fase de validación independiente. Mientras que las muestras de la cohorte I del estudio se usaron para las dos primeras fases, las muestras de la cohorte II del estudio se usaron para la fase final. miRNA se extrajo de 400 ml de plasma (cohorte I) o 200 ml de plasma (cohorte II) usando TRIzol R LS (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, EE. UU.) y Qiagen miRNeasy kit (Qiagen, Hilden, Alemania), y enriquecimiento en 10 fmol de cel-miR-39, como se describió anteriormente17.

Perfilado global de miARN circulantes a partir de muestras de CMMREF

[0050] El miARN circulante del plasma de muestras de CMMREF se perfiló mediante tarjetas de microARN humano TaqMan R v3.0 (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, Carlsbad, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 3 ml de muestra de miARN se transcribieron inversamente mediante cebadores Megaplex™ RT, Grupo A humano o Grupo B v3.0 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, EE. UU.). Se preamplificaron 5 ml de producto RT con cebadores MegaplexTM PreAmp, Grupo A humano o Grupo B v3.0 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, EE. UU.). El producto final se utilizó para la reacción cuantitativa de PCR (qPCR, quantitative Polymerase Chain Reaction) que se llevó a cabo en la máquina Applied Biosystems 7900HT. El valor de Ct de cada miARN se calculó mediante el software SDS v2.2 mediante el uso de valores iniciales y umbrales automáticos. Se perfilaron 20 muestras con buen pronóstico (SLP y SG>16 meses) y 20 muestras con mal pronóstico (SLP o SG<3 meses) y se midieron 754 miARN (Fig. 8). Se filtraron miARN no detectados o con Ct>35 en todas las 40 muestras. Los datos a continuación se normalizaron cuantitativamente y se aplicó una etapa de filtración adicional para eliminar miARN con intervalo intercuartílico (IQR, InterQuartile Range) <1,5. Los miARN normalizados restantes después de estas etapas de filtración se utilizaron para un análisis estadístico adicional.

Validación de miARN candidatos

[0051] Los miARN candidatos seleccionados de la ronda de descubrimiento anterior se validaron inicialmente en un conjunto de muestras expandidas de 237 CMM^refy 117 CMM-^icde la cohorte I mediante ensayos TaqMan R individuales (Fig. 9). Esto fue seguido por una validación independiente en 332 muestras de la cohorte II. Se introdujo una entrada de volumen constante de 2 ml de muestra en la reacción de transcripción inversa, en la que se multiplexaron un máximo de 3 miARN en una mezcla de reacción de 7,5 ml. Se sometieron 2,3 ml de producto transcrito inversamente a qPCR en una mezcla de reacción de 5 ml que contenía TaqMan R Universal PCR Master Mix, No AmpEraseUNG (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, EE. UU.), usando Roche LightCycler R 480 (Roche Applied Sciences, Alemania) por triplicado. miRNA se normalizó a control exógeno, cel-miR-39, y se realizaron los controles endógenos identificados para la validación inicial en la cohorte I, mientras que para la validación posterior en la cohorte II solo se realizó la normalización cel-miR-39. Cuando no se detectó un miARN en una muestra, se reemplazó con el Cp máximo en todas las muestras para ese miARN y se utilizó para el análisis de datos.

Análisis estadístico

[0052] Todo el análisis estadístico se realizó en el entorno R3.0.121. Para analizar los datos de TLDA, se utilizó el paquete HTqPCR22 de Bioconductorv2.1323. El análisis de limma se realizó para comparar el perfil de miARN de (1) muestras con buen y mal pronóstico, y (2) muestras de pacientes que murieron con aquellos que estaban vivos. Los miARN se eligieron como candidatos para la fase de validación si tenían P<0,05 y nivel de cambio (FC)>2 o <0,5 para una de las comparaciones anteriores, y Ct promedio <32 en uno del grupo analizado. El agrupamiento de muestras de Pearson basado en su progresión o estado de vida se logró en función de los niveles de miARN de aquellos que tenían P<0,05 en el análisis de limma correspondiente. Los controles endógenos se identificaron a partir de un conjunto de miARN con 1QR<1 y Ct media <30 usando NormFinder24. En la cohorte de validación, se evaluó la correlación entre los niveles de miARN y SLP, SG o SLED mediante pruebas de logrank y construcción de curvas de Kaplan-Meier. Los modelos de miARN con mayor precisión de predicción y menor redundancia se construyeron utilizando modelos de Cox LASSO, en LOS que se utilizó un término de penalización de LASSO para la selección automática de variables de miARN relevantes (con ajuste de parámetros de penalización realizado mediante validación cruzada de 10 veces), y permitiendo que solo los miARN que fueron significativos en el análisis univariado ingresen al modelo. Además de los modelos de miARN, también se construyeron modelos con estado CTC solo o miARN junto con estado CTC. El valor pronóstico de los modelos se evaluó mediante estimaciones de muestreo con reemplazamiento (estimaciones bootstrap) de 0,632+ de curvas de error de predicción y se resumió como la curva de error de predicción integrado (EPI), y se comparó el EPI de diferentes modelos. Los datos de miARN se dicotomizaron como niveles bajos de miARN y niveles altos de miARN, mientras que el estado de CTC se mantuvo en su estado binario (CTC positivo y CTC negativo), y se utilizó para el análisis de supervivencia anterior. La comparación de las muestras se realizó mediante pruebas de suma de rango de Wilcoxon con valor P bidireccional, ya sea pareado o no pareado dependiendo de las muestras que se comparan.

Ejemplo 1: Identificación de miARN circulantes con valor pronóstico potencial

[0053] El perfil de muestras de plasma de pacientes con dos resultados pronósticos extremos dio como resultado la identificación de miARN candidatos para predecir SLP o SG. Después de las etapas de filtrado iniciales para eliminar los miARN no detectados y cuyos niveles fueron invariantes en todas las muestras, quedaron 199 miARN que se utilizaron para comparaciones y agrupaciones. El análisis de limma produjo 8 miARN que fueron significativamente diferentes entre los casos con buen y mal pronóstico, mientras que 21 miARN fueron significativos para la comparación muertos-vivos. Seis miARN a saber, miR-22, miR-144, miR-149, miR-200a, miR-200b y miR-200c fueron aciertos comunes para ambas comparaciones. En total se eligieron 20 miARN para validación adicional: miR-22, miR-141, miR-144, miR-146b-3p, miR-149, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-365, miR-375, miR-429, miR-486-5p, miR-618, miR-758, miR-770-5p, miR-1260 y miR-1274a (Fig. 10). La agrupación de las muestras en mal pronóstico y buen pronóstico (prueba de chi cuadrado P = 0,00016) o en pacientes vivos y muertos (prueba de chi cuadrado P <0,000001) en función de sus respectivos aciertos superiores se muestra en la Figura 1. Además de identificar los miARN circulantes con capacidades pronósticas, se encontró que la combinación de miR-29a y miR-139-5p era el miARN o miARN expresados de forma más estable por NormFinder con un valor de estabilidad de 0,004. Por lo tanto, se utilizó una combinación de estos miARN junto con cel- miR-39 exógenamente enriquecido para la normalización en las rondas de validación

Ejemplo 2: Se ha confirmado que dieciséis miARN están significativamente correlacionados con la supervivencia en pacientes con CMM

[0054] Los miARN candidatos se verificaron primero en las 40 muestras utilizadas en la fase de descubrimiento mediante ensayos TaqMan R individuales. Se encontró que miR-146b-3p, miR-149, miR-618, miR-758 y miR-770-5p estaban presentes en niveles muy bajos o indetectables y, por lo tanto, no se analizaron en etapas adicionales. A la lista de los 15 miARN restantes, se añadieron miR-210 y miR-801, ya que ya se había demostrado que están asociados con la supervivencia en pacientes con CMM en un estudio previo17. En las muestras de CMM^ref, hubo en total 187 pacientes con progresión (83 %) y 38 sin progresión (17 %); 85 pacientes que habían muerto (36 %) y 149 que todavía estaban vivos (64 %). Las pruebas de Logrank después de estratificar las muestras en función de sus niveles de miARN revelaron que 12 miARN, miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-375, miR-429, miR-801 y miR-1274a se correlacionaron significativamente con SLP (P<0,04 para todos, Figura 2). Por otro lado, se encontró que todos los miARN excepto miR-22 estaban asociados con SG (P<0,05 para todos, Figura 2 y Figura 10). Por lo tanto, se confirmó que 16 de los 17 miARN candidatos poseen importancia pronóstica con respecto a SLP y/o SG. También se encontró que el estado de CTC era un predictor significativo de SLP (P=0,006) y SG (P<0, 00001) (Figura 2, 2).

Ejemplo 3: Los miARN circulantes corresponden a la supervivencia después de un ciclo de terapia [0055] Para evaluar si la capacidad pronóstica de los ARNmi era válida incluso después de la terapia, los niveles de miARN se midieron en muestras de 117 CMM-^ic. De los 117 pacientes analizados, 88 pacientes tenían progresión (79 %) y 23 no tenían progresión (21 %), mientras que 35 (30 %) habían muerto y 81 seguían vivos (70 %). Por lo tanto, la distribución de SLP y SG fue similar a las de las muestras de CMM^refanalizadas. Se encontró que la mayoría de los miARN seguían asociados con la supervivencia y que la correlación era, en general, más fuerte en las muestras MBC1C con respecto a sus valores P (P<0,04 para todos, Figura 3, 4). Sin embargo, miR-144, miR-215 y miR-801 ya no se correlacionaron significativamente con SLP y SG, y miR-365, miR-486-5p y miR-1260 ya no se correlacionaron significativamente con SG después de la terapia (Fig. 11).

Ejemplo 4: Correlación de los miARN circulantes con la supervivencia general confirmada en una cohorte independiente

[0056] Los 16 miARN que predicen significativamente la SG, se interrogaron en una segunda cohorte independiente que consistió en 335 muestras (tanto M0 como M1) de la cohorte II. Se confirmaron siete miARN, miR-144, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-210, miR-215 y miR-486-5p para predecir la SG en estas muestras (P<0,01 para todos) (Figura 5).

Ejemplo 5: El panel de miARN funciona mejor que el estado CTC

[0057] Los modelos de miARN que tenían el mayor poder predictivo se construyeron con regresión logística LASSO que permite la selección automática de variables con respecto a sus niveles de miARN de las muestras CMM^refy CMM-^ic. En el conjunto de muestras CMM^ref, el modelo contenía 10 (miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-215, miR-429, miR-801 y miR-1274a) y 11 miARN (miR-141, miR-144, miR-193b, miR-200a, miR-200b, miR-215, miR-429, miR-486-5p, miR-801, miR-1260 y miR-1274a) para SLP y SG, respectivamente, mientras que en el conjunto de muestras CMM-^ic, el modelo final consistía en solo un pequeño subconjunto de estos miARN para predecir SLP (miR-141, miR-200c, miR-429 y miR-1274a) y SG (miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-429 y miR-1274a) (Fig. 13). Mientras que para SLP, el modelo de miARN tuvo solo una CEPI marginalmente menor que el estado de CTC (Figura 6a), para SG, el modelo de Cox con variables de miARN rindió significativamente mejor que el modelo con estado de CTC (Figura 6b). La diferencia entre los dos modelos fue mucho más profunda en el conjunto de muestras CMM-^ic(Figura 6c, 6d). Agregar el estado de CTC a las variables de miARN no mejoró la precisión de los modelos de miARN, con la excepción de SLP en el conjunto de datos de CMM^ref, en el que se propuso la combinación no ajustada de miARN y CTC como el mejor modelo (Figura 6). En el conjunto de datos, se encontró que la metástasis pulmonar, la metástasis visceral, el número de sitios de metástasis y el estado RP del tumor primario estaban significativamente asociados con SLP y SG (datos no mostrados). La comparación de modelos para predecir la supervivencia que contienen estas variables clínicas con y sin la adición de miARN demostró que la adición de miARN disminuyó el error de predicción para SLP (CEPI de 1,97 a 1,92) y SG (CEPI 1,47 de 1,30).

Ejemplo 6: Los miARN circulantes identificados también pueden servir como detectores tempranos de metástasis

[0058] Los 16 miARN validados con éxito también se analizaron para determinar su relación con SLED en muestras M0 de la cohorte II. De los 250 sujetos 52 (20%) desarrollaron metástasis en 2 años y 196 (80 %) no desarrollaron metástasis durante al menos 50 meses. El análisis mostró el potencial de miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-210, miR-215 y miR-486-5p para correlacionarse con SLED y así detectar el inicio de metástasis incluso 2 años antes del evento (P<0,02) (Figura 7).

BIBLIOGRAFÍA

[0059]

1. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011;61:69-90.

2. Cardoso F, Castiglione M, Group EGW. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2009;20 Suppl 4:15-8.

3. Lumachi F, Brandes AA, Ermani M, Bruno G, Boc- cagni P. Sensitivity of serum tumor markers CEA and CA 15 3 in breast cancer recurrences and correlation with different prognostic factors. Anticancer Res. 2000;20:4751-5.

4. Harris L, Fritsche H, Mennel R, Norton L, Ravdin P, Taube S, et al. American Society of Clinical Oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer. J Clin Oncol. 2007 Nov;25(33):5287-5312.

5. Hanash SM, Baik CS, Kallioniemi O. Emerging molecular biomarkers-blood-based strategies to detect and monitor cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2011;8:142-50.

6. Alix-Panabi'eres C, Pantel K. Technologies for detection of circulating tumor cells: facts and vision. Lab Chip.

2013 Oct;.

7. Largillier R, Ferrero JM, Doyen J, Barriere J, Nam- er M, Mari V, et al. Prognostic factors in 1,038 women with metastatic breast cancer. Ann Oncol. 2008 Dec;19(12):2012-2019.

8. Taneja P, Maglic D, Kai F, Zhu S, Kendig RD, Fry EA, et al. Classical and Novel Prognostic Markers for Breast Cancer and their Clinical Significance. Clin Med Insights Oncol. 2010;4:15-34.

9. Khanfir A, Lahiani F, Bouzguenda R, Ayedi I, Daoud J, Frikha M. Prognostic factors and survival in metastatic breast cancer: A single institution experience. Reports of Practical Oncology & Radiotherapy. 2013;18(3):127-132.

10. Chim SSC, Shing TKF, Hung ECW, Leung T^y, Lau TK, Chiu RWK, et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin Chem. 2008 Mar;54(3):482-490.

11. Turchinovich A, Weiz L, Langheinz A, Burwinkel B. Characterization of extracellular circulating micro- RNA. Nucleic Acids Research. 2011;39:7223-33.

12. Zhao H, Shen J, Medico L, Wang D, Ambrosone CB, Liu S. A pilot study of circulating miRNAs as potential biomarkers of early stage breast cancer. PLoS One. 2010;5(10):e13735.

13. Cuk K, Zucknick M, Heil J, Madhavan D, Schott S, Turchinovich A, et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 2013;132:1602-12.

14. Mar-Aguilar F, Mendoza-Ram'irez JA, Malag'on- Santiago I, Espino-Silva PK, Santuario-Facio SK, Ruiz-Flores P, et al. Serum circulating microRNA profiling for identification of potential breast cancer biomarkers. Dis Markers.

2013;34(3):163-169.

15. Cuk K, Zucknick M, Madhavan D, Schott S, Golatta M, Heil J, et al. Plasma MicroRNA Panel for Minimally Invasive Detection of Breast Cancer. PLoS One. 2013;8(10):e76729.

16. Madhavan D, Cuk K, Burwinkel B, Yang R. Cancer diagnosis and prognosis decoded by bloodbased circulating microRNA signatures. Front Genet. 2013;4:116.

17. Madhavan D, Zucknick M, Wallwiener M, Cuk K, Modugno C, Scharpff M, et al. Circulating miRNAs as surrogate markers for circulating tumor cells and prognostic markers in metastatic breast cancer. Clin Cancer Res.

2012;18:5972-82.

18. Roth C, Rack B, Muller V, JanniW, Pantel K, Schwarzenbach H. Circulating microRNAs as blood- based markers for patients with primary and metastatic breast cancer. Breast Cancer Research. 2010;12(6):R90.

19. van Schooneveld E, Wouters MC, Van der Au-wera I, Peeters DJ, Wildiers H, Van Dam PA, et al. Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers. Breast Cancer Res. 2012;14(1):R34.

20. Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer. 2009 Jan;45(2):228-247.

21. Team RDC. R: A language and environment for statistical computing. R foundation for statistical computing, Vienna, Austria.. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org.; 2010.

22. Dvinge H. HTqPCR - high-throughput qPCR analysis in R and Bioconductor; 2010.

23. Gentleman R, Carey V, Bates D, Bolstad B, Det- tling M, Dudoit S, et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biology. 2004;5(10):R80.

24. Andersen CL, Jensen JL, 0rntoft T^f. Normalization of real-time quantitative reverse transcription- PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 2004 Aug;64(15):5245-5250.

25. Kroh EM, Parkin RK, Mitchell PS, Tewari M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription- PCR (qRT-PCR). Methods. 2010;50(4):298-301.

26. Shek LL, Godolphin W. Model for breast cancer survival: relative prognostic roles of axillary nodal status, TNM stage, estrogen receptor concentration, and tumor necrosis. Cancer Res. 1988 Oct;48(19):5565-5569.

27. Gregory PA, Bert AG, Paterson EL, Barry SC, Tsykin A, Farshid G, et al. The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1. Nat Cell Biol. 2008;10(5):593-601. 28. Dykxhoorn DM, Wu Y, Xie H, Yu F, Lal A, Pet- rocca F, et al. miR-200 enhances mouse breast cancer cell colonization to form distant metastases. PLoS ONE. 2009;4(9):e7181.

29. Viticchi'e G, Lena AM, Latina A, Formosa A, Gregersen LH, Lund AH, et al. miR-203 controls proliferation, migration and invasive potential of prostate cancer cell lines. Cell Cycle. 2011;10:1121-1131.

30. Ward A, Balwierz A, Zhang JD, Kublbeck M, Pa- witan Y, Hielscher T, et al. Re-expression of micro- RNA-375 reverses both tamoxifen resistance and accompanying EMT-like properties in breast cancer. Oncogene. 2012 Apr;128:-31. Tahiri A, Leivonen SK, L'uders T, Steinfeld I, Ragle Aure M, Geisler J, et al. Deregulation of cancer-related miRNAs is a common event in both benign and malignant human breast tumors. Carcinogenesis. 2013 Nov;. 32. Yan LX, Huang XF, Shao Q, HuangMY, Deng L,Wu QL, et al. MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage, lymph node metastasis and patient poor prognosis. RNA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento no invasivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, que comprende

determinar el nivel de al menos un miARN en una muestra biológica de un paciente con cáncer de mama primario; en el que un nivel alterado de el al menos un miARN en comparación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, en el que el al menos un miARN es miR-486-5p.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que se utiliza un miARN expresado estable como control endógeno.

3. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que miR-29a y/o miR-139-5p se utilizan como control endógeno.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica es sangre periférica o derivado de la misma, específicamente plasma.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho cáncer de mama metastásico también incluye metástasis en órganos viscerales y no viscerales, preferentemente el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos regionales, el hígado o el cerebro o cualquier combinación de los mismos.

6. Un procedimiento de monitoreo de la terapia de un paciente que se está tratando contra cáncer de mama primario o cáncer de mama metastásico que comprende predecir el riesgo de propagación de una enfermedad en un paciente con cáncer de mama primario o un paciente con cáncer de mama metastásico, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

7. Uso de una composición que comprende al menos dos miARN, tal como se define en la reivindicación 2, en el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Agente anticanceroso para su uso en la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario en un paciente, en el que dicho paciente se caracteriza por el nivel alterado de al menos un miARN en comparación con un valor de referencia o muestra de control correspondiente que es indicativo del riesgo de inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, en el que el inicio de metástasis en un cáncer de mama primario se predice según el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El agente anticanceroso para su uso según la reivindicación 8, que se selecciona del grupo que consiste en fármacos quimioterapéuticos, radioterapia, agentes de anticuerpos y/o agentes terapéuticos dirigidos a hormonas.

10. Un procedimiento de adaptación del régimen de dosificación de un agente anticanceroso para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer de mama metastásico, que comprende

(a) el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y

(b) preparar una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho agente anticanceroso y/o (c) adaptar el régimen de dosificación de la composición farmacéutica para la prevención, mejora o tratamiento del inicio de metástasis en un cáncer de mama primario.

11. Uso de un kit para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho kit uno o más pares de cebadores para amplificar al menos un miARN o un fragmento y/o para analizar el producto amplificado por dicho par de cebadores.

12. Uso del kit de la reivindicación 12, en el que el kit comprende agentes para la determinación de una combinación específica de miARN y una composición, tal como se define en la reivindicación 8, preferentemente en el que se determina la expresión de miR-486-5p.

13. Uso de un dispositivo para la predicción del inicio de metástasis en un paciente con cáncer de mama primario, que comprende una unidad de análisis que comprende un agente de detección para determinar la presencia de al menos un miARN, en el que el al menos un miARN es miR-486-5p, en una muestra biológica mediante el empleo del procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. Uso de miR-486-5p en un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.