ES2391562T3 - Antígenos de leishmania para su uso en la terapia y el diagnóstico de la leishmaniasis - Google Patents

Antígenos de leishmania para su uso en la terapia y el diagnóstico de la leishmaniasis Download PDF

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Rhea M. Coler
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Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (i) un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2; y (ii) un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 24.

Description

Antígenos de leishmania para su uso en la terapia y el diágnóstico de la leishmaniasis.
Campo Técnico
La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión, composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis, y para estimular respuestas inmunitarias en pacientes. La invención se refiere más concretamente a proteínas de fusión que comprenden antígenos de Leishmania, porciones inmunogénicas o variantes de las mismas, y a vacunas y composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de fusión. Las vacunas y composiciones farmacéuticas se pueden utilizar, por ejemplo, para la prevención y la terapia de la leishmaniasis, así como para la detección de la infección por Leishmania.
Antecedentes de la Invención
Los organismos de Leishmania son parásitos protozoicos intracelulares de macrófagos que causan una amplia gama de enfermedades clínicas en seres humanos y animales domésticos, principalmente perros. En algunas infecciones, el parásito puede permanecer en estado latente durante muchos años. En otros casos, el anfitrión puede desarrollar una de una variedad de formas de leishmaniasis. Por ejemplo, la enfermedad puede ser asintomática o puede manifestarse como leishmaniasis visceral subclínica, que se caracteriza por síntomas leves de malestar, diarrea y hepatomegalia intermitente. Los pacientes con enfermedad subclínica o asintomática usualmente tienen bajos títulos de anticuerpos, haciendo que la enfermedad sea difícil de detectar con las técnicas convencionales. Alternativamente, la leishmaniasis puede manifestarse como una enfermedad cutánea, que es un problema médico grave, pero es generalmente autolimitante, o como una enfermedad de la mucosa altamente destructiva, que no es auto-limitante. Finalmente, y de forma más grave, la enfermedad puede manifestarse como una infección visceral aguda que implica el bazo, el hígado y los ganglios linfáticos, que, si no se trata, generalmente es una enfermedad fatal. Los síntomas de la leishmaniasis visceral aguda incluyen hepatoesplenomegalia, fiebre, leucopenia, anemia e hipergammaglobulinemia.
La leishmaniasis es un grave problema en muchas partes del mundo, incluyendo Brasil, China, África Oriental, India y zonas de Oriente Medio. La enfermedad también es endémica en la región mediterránea, incluyendo el sur deFrancia, Italia, Grecia, España, Portugal y Norte de África. El número de casos de leishmaniasis se ha incrementado espectacularmente en los últimos 20 años, y existen hoy en el mundo millones de casos de esta enfermedad. Alrededor de 2 millones de nuevos casos se diagnostican cada año, el 25% de los cuales son de leishmaniasis visceral. No hay, sin embargo, vacunas ni tratamientos eficaces disponibles en la actualidad.
El diagnóstico preciso de la leishmaniasis es frecuentemente difícil de lograr. Existen 20 especies de Leishmania que infectan a los seres humanos, incluyendo L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica, y L. guyanensis, y no hay signos distintivos o síntomas que indiquen inequívocamente la presencia de infección por Leishmania. Se han utilizado métodos de detección de parásitos, pero estos métodos no son sensibles ni prácticos clínicamente. Las pruebas cutáneas actuales normalmente utilizan parásitos completos o lisados. Estas pruebas generalmente son insensibles, irreproducibles y propensas a la reacción cruzada con una variedad de otras enfermedades. Además, las preparaciones empleadas en tales pruebas son a menudo inestables. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos mejorados para la detección de la infección por Leishmania.
Las vacunas experimentales actuales consistentes en organismos completos no han demostrado su eficacia en seres humanos. En consecuencia, sigue habiendo una necesidad en la técnica de vacunas para prevenir la leishmaniasis en seres humanos y en perros, y para la mejora de composiciones terapéuticas para el tratamiento de la leishmaniasis.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona proteínas de fusión, composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis, así como para estimular respuestas inmunitarias en pacientes. En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende (i) un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12 o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2; y (ii) un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12 o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 24. También se proporcionan secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión anteriores, los vectores de expresión recombinantes que comprenden estas secuencias de ADN y las células anfitrionas transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.
En ciertas realizaciones específicas, dichas proteínas de fusión comprenden un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 95, 98, 99 y 101. Las proteínas de fusión pueden comprender adicionalmente un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6 y/o del SEQ ID NO: 10.
En aspectos relacionados, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las proteínas de fusión descritas en la presente memoria, o un polinucleótido que codifica dichas proteínas de fusión, y un portador fisiológicamente aceptable. También se proporcionan vacunas que comprenden una o más de dichas proteínas de fusión o polinucleótidos, junto con un inmunoestimulador. En realizaciones específicas de estos aspectos, el antígeno de Leishmania tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2, y 24.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en el método de detección de la infección por Leishmania en un paciente. El método comprende (a) poner en contacto células dérmicas del paciente con la composición farmacéutica, y (b) detectar una respuesta inmunitaria en la piel del paciente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas como se ha descrito antes para su uso en métodos para inducir inmunidad protectora frente a la leishmaniasis en un paciente.
En un aspecto adicional, se proporcionan kits de diagnóstico para detectar la infección por Leishmania en un paciente. Los kits de diagnóstico comprenden: (a) una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente; y (b) un aparato suficiente para poner en contacto la composición farmacéutica con las células dérmicas de un paciente.
Se describen en la presente memoria los métodos para estimular una respuesta inmunitaria celular y/o humoral en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o una vacuna como se ha descrito anteriormente.
También se describen en la presente memoria los métodos para tratar a un paciente aquejado una enfermedad sensible a la estimulación por IL-12, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o una vacuna como se ha descrito anteriormente.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes mediante la referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 muestra la estimulación de la proliferación de células T obtenidas de ratones BALB/c inmunizados frente
L. donovani (representado por el índice de estimulación) por macrófagos infectados por L. donovani tras la incubación durante 24, 48 y 72 horas.
La Figura 2 ilustra perfiles de HPLC representativos de péptidos aislados de moléculas del MHC clase II de macrófagos P388D1. El panel A muestra péptidos aislados de macrófagos no infectados y el panel B muestra péptidos aislados de macrófagos infectados con L. donovani. Las flechas en el panel B indican picos de péptidos presentes únicamente en la preparación de macrófagos infectados.
La Figura 3 ilustra la expresión y purificación del antígeno de Leishmania Ldp23 como una proteína de fusión recombinante. El panel A muestra un gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de E. coli lisada sin (calle 1) y con (calle 2) inducción con IPTG de la expresión de Ldp23. La flecha indica la proteína de fusión recombinante. El Panel B muestra la proteína de fusión después de la escisión de un gel de SDS-PAGE preparativa, electroelución, diálisis contra PBS y SDS-PAGE analítica.
La Figura 4 presenta un análisis de transferencia de Northern de ARN total preparado de L. donovani, L. major, L. amazonensis y L. pifanoi con un gen Ldp23 marcado con P32. 1, 2 y 3 hacen referencia a ARN obtenido de promastigotas en la fase de crecimiento logarítmico, promastigotas en la fase de crecimiento estacionario y formas amastigotas, respectivamente.
La Figura 5 muestra un análisis de transferencia Western de antígenos de promastigotas de L. donovani incubados con suero de conejo pre-inmune (calle A) o con antisuero de conejo anti-Ldp23 (calle B).
La Figura 6 ilustra la expresión superficial de Ldp23 en promastigotas de L. donovani vivos. La línea punteada muestra la inmunofluorescencia indirecta realizada utilizando suero pre-inmune de ratón y la línea continua muestra el resultado obtenido con el antisuero anti-GST-Ldp23 de ratón. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante FACScan.
La Figura 7 muestra la estimulación de la proliferación de células T específicas de Leishmania por Ldp23. Los resultados se presentan como número el relativo de células como una función de la intensidad de fluorescencia. Las células T (105/pocillo) se purificaron a partir de ganglios linfáticos de ratones BALB/c inmunizados en la almohadilla plantar con promastigotas de L. donovani en CFA y se cultivaron con diversas concentraciones de Ldp23 recombinante purificado en presencia de 2x105 células mononucleares del bazo BALB/c normales tratadas con mitomicina C. Se midió la proliferación de células T a las 27 horas de cultivo. Los valores se expresan como cpm y representan la media de incorporación de [3H]-TdR de cultivos por triplicado.
La Figura 8 ilustra la producción de citoquinas inducida mediante Ldp23 por las células de ganglios linfáticos de ratones BALB/c. Los cultivos se incubaron con cantidades variables de Ldp23 o producto lisado de Leishmania, presentadas como µg/mL, y se analizaron mediante ELISA para determinar la producción de interferón-γ (panel A) o interleuquina-4 (panel B), ambos los cuales se muestran como ng/ml.
La Figura 9 muestra la amplificación por PCR de ARNm de citoquina aislado de PBMC de un paciente con leishmaniasis mucosa (Panel A) y leishmaniasis cutánea (panel B) antes y después de la estimulación con polipéptidos representativos de la presente invención. Las calles O y - indican el nivel de productos de PCR en el inicio del cultivo y después de 72 horas de cultivo, respectivamente, en ausencia de polipéptido añadido; las calles Lb, 83a y 83b indican el nivel de productos de PCR después de cultivo de PBMC con producto lisado de L. braziliensis, y antígenos Lbhsp83a y Lbhsp83b de Leishmania, respectivamente.
La Figura 10 presenta una comparación de los niveles de interferón-γ (panel A) y TNF-α (panel B) en los sobrenadantes de cultivos de 72 horas de PBMC de individuos infectados por Leishmania y de control en respuesta a la estimulación con producto lisado de parásitos o los polipéptidos indicados.
La Figura 11 ilustra los niveles de p40 de IL-10 (en pg/mL) en el sobrenadante de cultivos de PBMC de individuos infectados con L. braziliensis y controles no infectados 72 horas después de la estimulación con producto lisado de promastigota parásito (Lb), Lbhsp83a o Lbhsp83b.
La Figura 12 presenta las reactividades de los sueros de pacientes infectadas con L. braziliensis con polipéptidos representativos de la presente invención en una ELISA convencional. Los valores se expresan como absorbancia a 405 nm.
Las Figuras 13A y 13B ilustran el nivel de IL-4 e IFN-γ (en pg/mL) secretados estimulados en cultivos de ganglios linfáticos de ratón mediante la adición de polipéptidos representativos de la presente invención.
La Figura 14 muestra el nivel de IFN-γ (en pg/mL) secretado por PBMC humanas infectadas por Leishmania y no infectadas estimuladas por el antígeno M15 de Leishmania, en comparación con los niveles estimulados por producto lisado de L. major y L-Rack, un antígeno que no parece ser reconocido por seres humanos infectados por Leishmania.
La Figura 15 muestra el nivel de IFN-γ (en pg/mL) secretado por PBMC humanas infectadas y no infectadas estimuladas por antígenos de Leishmania solubles (antígenos S), en comparación con los niveles estimulados por producto lisado de L. major y L-Rack.
La Figura 16 ilustra la proliferación de cultivos de ganglios linfáticos murinos estimulados por la adición de polipéptidos representativos de la presente invención. Los valores se expresan como cpm.
La Figura 17 muestra la proliferación de PBMC humanas, preparadas a partir de individuos inmunes a Leishmania y no infectados, estimulados por M15, en comparación con la proliferación estimulada por producto lisado de L. mayor y L-Rack. Los valores se expresan como cpm.
La Figura 18 ilustra la proliferación de PBMC humanas, preparadas a partir de individuos infectados con Leishmania y no infectados, estimulados por antígenos de Leishmania solubles en comparación con la proliferación estimulada por el medio de cultivo, producto lisado de L. major y L-Rack. Los valores se expresan como cpm.
La Figura 19 presenta una comparación de una secuencia Lbhsp83 (SEQ ID NO: 6) con secuencias homólogas de
L. amazonensis (Lahsp83) (SEQ ID NO: 16), T. cruzi (Tchsp83) (SEQ ID NO: 17) y humanas (Huhsp89) (SEQ ID NO: 18)
La Figura 20 ilustra la reactividad de sueros de conejo producidos contra antígenos solubles de Leishmania y producto lisado de promastigota de Leishmania (calle 1) y antígenos solubles de Leishmania (calle 2).
La Figura 21 muestra el ADNc y la secuencia pronosticada de aminoácidos para el antígeno Lmspla de Leishmania.
La Figura 22 muestra una transferencia Southern de ADN genómico de L. major digerido con un panel de enzimas de restricción (calles 1 a 7) y otras seis especies de Leishmania digeridas con PstI (calles 8 a 13) sondadas inserto de ADNc completo de Lmspla.
La Figura 23 muestra una transferencia Southern de ADN genómico de L. major digerido con un panel de enzimas de restricción, otras seis especies de Leishmania digeridas con PstI y los patógenos infecciosos T. cruzi y T. brucei, sondeados con el inserto de ADNc completo del antígeno de Leishmania MAPS-1A.
La Figura 24 ilustra la proliferación de PBMC aisladas de individuos no infectados, pacientes con leishmaniasis mucosal activa y pacientes después de la infección con kala-azar, estimuladas por MAPS-1A.
La Figura 25 ilustra la proliferación de cultivos de ganglios linfáticos murinos estimulados por MAPS-1A.
La Figura 26 ilustra la reactividad de MAPS-1A con sueros de pacientes humanos con leishmaniasis.
La Figura 27 ilustra la reactividad de MAPS-1A con sueros de ratones inmunizados contra y/o infectados con leishmaniasis.
La Figura 28 ilustra la eficacia de la inmunización con antígenos solubles de Leishmania o una mezcla de Ldp23, LbeiF4A y M15 más coadyuvante para conferir protección contra la infección (medida por la hinchazón de la almohadilla plantar) en un sistema modelo murino de leishmaniasis, en comparación con la administración de coadyuvante solo.
La Figura 29 ilustra la eficacia de la inmunización con MAPS-1A más coadyuvante para conferir protección contra la infección (medida por la hinchazón de la almohadilla plantar) en un sistema modelo murino de leishmaniasis, en comparación con la administración de coadyuvante solo.
La Figuras 30A y B ilustran la proliferación de cultivos de ganglios linfáticos murinos estimulados con cualquiera de LcgSP8, LcgSP10 o LcgSP3.
La Figura 31 ilustra la eficacia de la inmunización con antígenos solubles de Leishmania, MAPS-1A y M15 más coadyuvante, IL-12, para conferir protección contra la infección (medida por la hinchazón de la almohadilla plantar) en un sistema modelo murino de leishmaniasis, en comparación con la administración de coadyuvante IL-12.
La Figura 32 ilustra la eficacia de la inmunización con ADN de M15 y ADN de MAPS-1A para conferir protección contra la infección (medida por la hinchazón de la almohadilla plantar) en un sistema modelo murino de leishmaniasis, en comparación con ADN de control y solución salina.
La Figura 33 ilustra la eficacia de la inmunización con proteínas de fusión de Leishmania más IL-12 como coadyuvante, para conferir protección contra la infección en un sistema modelo murino de leishmaniasis.
La Figura 34 ilustra la eficacia de la inmunización con proteínas de fusión de Leishmania más coadyuvante MPL-SE, para conferir protección contra la infección en un sistema modelo murino de leishmaniasis.
Descripción Detallada de la Invención
Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere en general a proteínas de fusión, composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis, así como para estimular respuestas inmunitarias en pacientes.
En un primer aspecto la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden (i) un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2; y (ii) un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 24.
Opcionalmente, las porciones inmunogénicas de Leishmania pueden ser capaces de generar al menos 50% de la respuesta generada por el antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 2 o el antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 24 respectivamente en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12.
En una realización concreta, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 101. En una realización preferida las proteínas de fusión comprenden el polipéptido codificado por el SEQ ID NO: 101.
En una realización concreta, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 95. En una realización preferida las proteínas de fusión consisten en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 95.
En una realización concreta, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 96. En una realización preferida las proteínas de fusión consisten en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 96.
En una realización concreta, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 97. En una realización preferida las proteínas de fusión consisten en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 97.
En un aspecto adicional de la presente invención, las proteínas de fusión descritas anteriormente pueden comprender adicionalmente un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de interferón alfa, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 6. Preferiblemente, la proteína de fusión comprende adicionalmente una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 6 capaz de lograr generar al menos 50% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa
o interleuquina 12.
En otra realización más de la presente invención, las proteínas de fusión descritas más arriba pueden comprender adicionalmente un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 10. Preferiblemente, la proteína de fusión comprende además una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 10 capaz de lograr generar al menos 50% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12. En otro aspecto de la invención se proporcionan los polinucleótidos que codifican la proteína de fusión descrita más arriba. Asimismo se proporcionan vectores de expresión recombinantes que comprenden los polinucleótidos.
En otro aspecto de la invención se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión descritas más arriba, o los polinucleótidos que las codifican, y un portador fisiológicamente aceptable.
En otro aspecto de la invención se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden las proteínas de fusión descritas más arriba, o los polinucleótios que las codifican, y un inmunoestimulador.
Dichos inmunoestimuladores se pueden seleccionar del grupo que consiste en: aminoalquilglucosamínido- 4fosfatos; monofosforil lípido A; y monofosforil lípido A 3-des-O-acilado. En una realización las composiciones inmunogénicas pueden comprender adicionalmente un vehículo de liberación, tal como una microesfera biodegradable.
En otro aspecto de la presente invención se proporcionan las composiciones farmacéuticas y las composiciones inmunogénicas descritas más arriba para su uso en un método de inducción de inmunidad protectora contra la leishmaniasis en un paciente.
En otro aspecto de la invención se proporcionan las composiciones farmacéuticas descritas más arriba para su uso en un método para detectar la infección por Leishmania en un paciente, comprendiendo el método las etapas de (a) poner en contacto células dérmicas del paciente con la composición farmacéutica; y (b) detectar la respuesta inmunitaria sobre la piel del paciente. Preferiblemente la respuesta inmunitaria es el endurecimiento.
En otro aspecto de la invención se proporciona un kit de diagnóstico que comprende (a) una composición farmacéutica descrita más arriba y (b) un dispositivo suficiente para poner en contacto células dérmicas de un paciente con la composición farmacéutica.
En otro aspecto de la invención se proporciona una vacuna que comprende (a) una proteína de fusión descrita más arriba o (b) un polinucleótido descrito más arriba, o (c) un vector de expresión recombinante que comprende dicho polinucleótido; y (d) un coadyuvante. Dicha vacuna puede ser proporcionada para su uso en un método de inducción de inmunidad protectora contra la leishmaniasis en un paciente.
Los polipéptidos descritos incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de antígenos de Leishmania que comprende las secuencias citadas en la SEQ ID NO: 2 (referido en la presente memoria como M15), SEQ ID NO: 4 (referido en la presente memoria como Ldp23), SEC ID NO: 6 (referido en la presente memoria como Lbhsp83), SEQ ID NO: 8 (referido en la presente memoria como Lt-210), SEQ ID NO: 10 (referido en la presente memoria como LbeIF4A), SEQ ID NO: 20 (referido en la presente memoria como Lmsp1a), SEQ ID NO: 22 (referido en la presente memoria Lmsp9a), SEQ ID NO: 24 y 26 (referidos en la presente memoria como MAPS-1A), y SEQ ID NO: 36-42, 49-53 y 55. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "polipéptido" abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas completas (es decir, antígenos), donde los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces covalentes. Por lo tanto, un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de uno de los antígenos anteriores puede consistir enteramente de la porción inmunogénica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse del antígeno de Leishmania nativo o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias pueden (pero no necesariamente) ser inmunogénicas. Un antígeno "que tiene" una secuencia particular es un antígeno que contiene, dentro de su secuencia completa, la secuencia citada. El antígeno nativo puede, o no, contener una secuencia de aminoácidos adicional.
Una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania es una porción que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria (es decir, celular y/o humoral) en un paciente (tal como un ser humano o un perro) infectado actualmente
o previamente con Leishmania y/o en cultivos de células de ganglios linfáticos o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos infectados actualmente o previamente con Leishmania. Las células en las que se provoca una respuesta pueden comprender una mezcla de tipos de células o pueden contener células de componentes aislados (incluyendo, pero no limitadas a, células T, células NK, macrófagos, monocitos y/o células B). En particular, las porciones inmunogénicas son capaces de inducir la proliferación de células T y/o una respuesta de citoquina de tipo Th1 dominantemente (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-γ, y/o TNF-α por las células T y/o células NK, y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B). Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente memoria generalmente se pueden identificar utilizando mecanismos conocidos por los expertos normales en la técnica, incluyendo los métodos representativos proporcionados en la presente memoria.
Las composiciones y métodos de la presente invención también abarcan variantes de los polipéptidos anteriores que comprenden las proteínas de fusión de la presente invención. Un polipéptido "variante", según se utiliza en la presente memoria, es un polipéptido que difiere de una proteína nativa en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de manera que la inmunogenicidad del polipéptido no disminuye sustancialmente. En otras palabras, la capacidad de una variante para reaccionar con antisueros específicos del antígeno puede aumentar o permanecer invariable, con respecto a la proteína nativa, o puede disminuir menos de 50%, y preferiblemente menos de 20%, con respecto a la proteína nativa. Tales variantes pueden ser identificadas generalmente modificando una o más secuencias de polipéptidos y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con anticuerpos o antisueros específicos del antígeno como se describe en la presente memoria. Las variantes preferidas incluyen aquellas en las que una o más porciones, tales como la secuencia líder N-terminal o el dominio transmembrana, han sido eliminados. Otras variantes preferidas incluyen las variantes en las que una pequeña porción (p. ej., 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos) ha sido eliminada del extremo N y/o C de la proteína madura.
Las variantes de polipéptidos descritas en la presente memoria incluyen aquellas que muestran una identidad (determinada como se describe más arriba) de al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más con los polipéptidos descritos en la presente memoria.
Preferiblemente, una variante contiene sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido está sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos espera que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanezcan sustancialmente inalteradas. Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar generalmente basándose en la similitud de la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobia, la hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargada que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparragina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también puede contener (o alternativamente contiene) cambios no conservativos. Preferiblemente, las variantes de polipéptidos difieren de una secuencia nativa por la sustitución, deleción o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también pueden estar modificadas (o alternativamente están modificadas), por ejemplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (p. ej., una secuencia endógena que codifica una proteína o porción de la misma) o puede comprender una variante, o un equivalente biológico o funcional antigénico de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente más abajo, preferiblemente de manera que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no disminuya, con respecto a una proteína tumoral nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado se puede evaluar generalmente como se describe en la presente memoria. El término "variantes" también incluye los genes homólogos de origen xenogénico.
Cuando se comparan secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, se dice que dos secuencias son "idénticas" si las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de las dos secuencias son iguales cuando se alinean para determinar la máxima correspondencia, como se describe más abajo. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente comparando las secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado óptimamente las dos secuencias.
El alineamiento óptimo de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo utilizando el programa Megalign del grupo Lasergene de soporte lógico bioinformático (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff,
M.O.
(1978) A model of evolutionary change in proteins – Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff,
M.O.
(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgind, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor. 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy – the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Franciso, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Alternativamente, el alineamiento óptimo de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante los métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Soporte Lógico de Genetics Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos por Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Se pueden utilizar BLAST y BLAST 2.0, por ejemplo, con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. El soporte lógico para realizar los análisis BLAST se encuentra disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, se pueden calcular las puntuaciones cumulativas utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos que se emparejan; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos que se emparejan erróneamente; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La extensión de las palabras comunes en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento cumulativa cae en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación cumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectancia (E) de 10, y los alineamientos de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), (B) de 50, expectancia (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) de 20 por ciento o menos, normalmente de 5 a 15 por ciento, o de 10 a 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentran bases de ácido nucleico o residuos de aminoácido idénticos en ambas secuencia para dar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la secuencia de referencia (esto es, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para dar el porcentaje de identidad de las secuencias.
Por consiguiente, las proteínas de fusión, y los polinucleótidos que las codifican de la presente invención pueden comprende secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que tienen una identidad sustancial con las secuencias descritas en la presente memoria, por ejemplo aquellas que comprenden una identidad de secuencia de al menos 50%, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o superior en comparación con una secuencia de polinucleótido o polipéptido de esta invención utilizando los métodos descritos en la presente memoria, (p. ej., análisis BLAST utilizando parámetros convencionales, como se describe más abajo). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del código genético, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares.
También se describen en la presente memoria polinucleótidos y polipéptidos aislados que comprenden diferentes longitudes de tramos contiguos de secuencia idéntica o complementaria a una o más de las secuencias descritas en la presente memoria. Por ejemplo, esta invención proporciona polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o 1.000 o más nucleótidos contiguos de una o más secuencias descritas en la presente memoria así como todas las longitudes intermedias. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los enteros de 200 a 500; de 500 a 1.000, y similares.
Los polinucleótidos de la presente invención, o sus fragmentos, con independencia de la longitud de la propia secuencia codificante, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada preferiblemente la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, se contempla que sean útiles en muchas implementaciones de esta invención segmentos de ADN ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud, y similares, (incluyendo todas las longitudes intermedias).
También se describen en la presente memoria polinucleótidos que son capaces de hibridar en condiciones moderadamente restrictivas con una secuencia de polinucleótidos proporcionada en la presente memoria, o un fragmento de la misma, o una secuencia complementaria de la misma. Los mecanismos de hibridación son bien conocidos en la técnica de la biología molecular. Con fines ilustrativos, las condiciones moderadamente restrictivas adecuadas para someter a ensayo la hibridación de un polinucleótido de esta invención con otros polinucleótidos incluyen prelavado en una solución de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido de lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene SDS al 0,1%.
Por otra parte, los expertos normales en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en la presente invención. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente memoria están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no necesitan, tener una estructura o una función alterada. Los alelos pueden ser identificados utilizando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de bases de datos).
"Polipéptidos" según se describe en la presente memoria también incluye polipéptidos combinados, también referidos como proteínas de fusión. Un "polipéptido combinado" es un polipéptido que comprende al menos una de las porciones inmunogénicas anteriores y una o más secuencias de Leishmania inmunogénicas adicionales, que están unidas a través de un enlace peptídico a una cadena de aminoácidos única. Las secuencias se pueden unir directamente (es decir, sin aminoácidos intermedios) o se pueden unir por medio de una secuencia conectora (por ejemplo, Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos componentes.
Las proteínas de fusión se pueden preparar generalmente utilizando técnicas convencionales, incluyendo la conjugación química. Preferiblemente, una proteína de fusión es expresada como una proteína recombinante, permitiendo la producción de niveles incrementados, con respecto a una proteína no fusionada, en un sistema de expresión. Brevemente, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos se pueden ensamblar por separado, y ligar en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico de manera que los marcos de lectura de las secuencias estén en marco. Esto permite la traducción a una única proteína de fusión que conserva la actividad biológica de ambos componentes polipeptídicos.
Se puede emplear una secuencia conectora peptídica para separar el primer y el segundo componentes polipeptídicos una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia conectora peptídica se incorpora a la proteína de fusión utilizando mecanismos convencionales bien conocidos en la técnica. Se pueden elegir secuencias conectoras peptídicas adecuadas basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con epítopos funcionales en el primer y el segundo polipéptidos; y (3) la carencia de residuos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias conectoras peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. También se pueden utilizar otros aminoácidos neutros próximos, tales como Thr y Ala en la secuencia conectora.
Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear de manera ventajosa como conectores incluyen aquellas descritas por Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.935.233 y Patente de los Estados Unidos Núm. 4.751.180. La secuencia conectora puede tener generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No se requieren secuencias conectoras cuando el primer y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N terminales no esenciales que se pueden utilizar para separar los dominios funcionales y evitar las interferencias estéricas.
Las secuencias de ADN ligadas están conectadas operablemente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados solamente 5' con respecto a la secuencia de AN que codifica los primeros polipéptidos. De un modo similar, los codones de terminación requeridos para finalizar la traducción y las señales de terminación de la transcripción solamente están presentes 3' con respecto al segundo polípéptido. Las preparaciones de proteínas de fusión de antígenos de Leishmania se describen más abajo en el Ejemplo 19.
En general, los antígenos de Leishmania que tienen propiedades inmunogénicas, y las secuencias de ADN que codifican dichos antígenos, se pueden preparar usando cualquiera de una variedad de procedimientos de una o más especies de Leishmania, incluyendo, pero no limitadas a, L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica y L. guyanensis. Dichas especies están disponibles, por ejemplo, a partir de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), Rockville, MD. Por ejemplo, los péptidos aislados de moléculas MHC de clase II de macrófagos infectados con una especie de Leishmania se pueden utilizar para rescatar los correspondientes antígenos donadores de Leishmania. Las moléculas del MHC de clase II son expresadas principalmente por células del sistema inmunitario, incluyendo macrófagos. Estas moléculas presentan péptidos, que tienen generalmente 13-17 aminoácidos de longitud, derivados de antígenos foráneos que se degradan en vesículas celulares. Los antígenos peptídicos unidos son reconocidos por las células T CD4. Por consiguiente, los péptidos foráneos aislados de moléculas MHC clase II de, por ejemplo, macrófagos murinos infectados con Leishmania, se puede utilizar para identificar las proteínas de Leishmania inmunogénicas.
Brevemente, los péptidos derivados de antígenos de Leishmania se pueden aislar comparando el perfil de HPLC de fase inversa de los péptidos extraídos de los macrófagos infectados con el perfil de los péptidos extraídos de células no infectadas. Los péptidos que dan lugar a distintos picos de HPLC únicos para macrófagos infectados se pueden secuenciar después utilizando, por ejemplo, la química de Edman como describen Edman y Berg, en Eur. J. Biochem, 80:116-132 (1967). Un fragmento de ADN correspondiente a una porción de un gen de Leishmania que codifica el péptido se puede amplificar después a partir de una genoteca de ADNc de Leishmania utilizando un cebador oligonucleotídico efector derivado de la secuencia peptídica y un cebador oligo dT antisentido. El fragmento de ADN resultante se puede usar después como sonda para escrutar una genoteca d Leishmania para determinar un ADNc completo o un clon genómico que codifica el antígeno de Leishmania. Tales escrutinios se pueden realizar generalmente usando mecanismos bien conocidos por los expertos normales en la técnica, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Se puede utilizar este enfoque para identificar un antígeno de 23 kD de Leishmania donovani (referido en la presente memoria como Ldp23). La secuencia de un polinucleótidos que codifica Ldp23 se proporciona en el SEC ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de Ldp23 se proporciona en el SEC ID NO: 4. Utilizando los métodos descritos en la presente memoria, se ha demostrado que Ldp23 induce una respuesta inmunitaria Th1 en células T preparadas a partir de ratones infectados por Leishmania.
Alternativamente, una genoteca de expresión de ADNc o genómico de Leishmania se pueden escrutar con suero de un individuo infectado por Leishmania, utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Los polinucleótidos que codifican antígenos reactivos se puede usar después para expresar el antígeno recombinante para la purificación. Las propiedades inmunogénicas de los antígenos de Leishmania purificados se pueden evaluar después utilizando, por ejemplo los métodos representativos descritos en la presente memoria.
Por ejemplo, los sueros de ratones infectados por Leishmania se pueden utilizar para escrutar una genoteca de ADNc preparada a partir de amastigotas de Leishmania. A continuación se pueden expresar los clones reactivos y analizar las proteínas recombinantes para determinar la capacidad para estimular células T o células NK derivadas de individuos inmunes a Leishmania (es decir, individuos que tienen evidencia de infección, como se documenta por la reactividad serológica positiva con anticuerpos específicos de Leishmania y/o una respuesta DTH específica de Leishmania, sin síntomas clínicos de leishmaniasis). Este procedimiento se puede utilizar para obtener un polinucleótidos recombinante que codifica el antígeno de Leishmania designado M15. La secuencia de dicho polinucleótido se proporciona en el SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada se proporciona en el SEC ID NO: 2
Se puede utilizar un enfoque similar para aislar un polinucleótido genómico que codifica un antígeno de Leishmania braziliensis inmunogénico, referido en la presente memoria como Lbhsp83. Más específicamente, se puede aislar un clon genómico que codifica Lbhsp83 por medio de escrutinio de una genoteca de expresión de L. braziliensis con suero de un individuo infectado por Leishmania. El ADN que codifica Lbhsp83 es homólogo al gen que codifica la proteína eucariótica de choque térmico de 83 kD. La secuencia de un polinucleótido que codifica casi todo Lbhsp83 se presenta en el SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en el SEC ID NO: 6. Utilizando los métodos descritos a continuación, se ha encontrado que Lbhsp83 estimula la proliferación, y un perfil de citoquinas mixto Th1 y Th2, en PBMC aisladas de pacientes infectados con L. braziliensis. Por consiguiente, Lbhsp83 es un antígeno de Leishmania inmunogénico. Se ha encontrado que las regiones de Lbhsp83 que no se conservan con el gen de mamífero son particularmente potentes para la estimulación de células T y la unión de anticuerpos. Tales regiones se pueden identificar, por ejemplo, mediante inspección visual de la comparación de secuencias proporcionada en la Figura 19.
Este enfoque también se puede utilizar para aislar un polinucleótido que codifica un antígeno inmunogénico de L. tropica de 210 kD, referido en la presente memoria como Lt-210. La preparación y caracterización de Lt-210, y las porciones inmunogénicas del mismo (tales como Lt-1 y la repetición inmunogénica y las secuencias no repetidas), se describe con detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie 08/511.872, presentada el 4 de agosto 1995. La secuencia de un polinucleótido que codifica Lt-1 se proporcionan en el SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en el SEQ ID NO: 8.
El enfoque anterior se puede utilizar además para aislar un polinucleótido que codifica un antígeno de L. braziliensis referido en la presente memoria como LbeIF4A. En resumen, dicho clon se puede aislar por escrutinio de una genoteca de expresión de L. braziliensis con sueros obtenidos de un paciente afectado con leishmaniasis mucosa, y analizando los antígenos reactivos para determinar la capacidad para estimular respuestas proliferativas y producción de citoquina Th1 preferente en PBMC aisladas de pacientes infectados con Leishmania, como se describe a continuación. La preparación y caracterización de LbeIF4A se describe con detalle en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos con los Núms. de Serie 08/454.036 y 08/488.386, que son continuaciones en parte de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con el Núm. de Serie 08/232.534, presentada el 22 de abril 1994. La secuencia de un polinucleótido que codifica LbeIF4A se proporciona en el SEC ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en el SEQ ID NO: 10. Los homólogos de LbeIF4A, tales como el encontrado en
L. major, también se puede aislar utilizando este enfoque, y están dentro del alcance de la presente invención.
Las composiciones descritas en la presente memoria también pueden contener, o alternativamente, contienen antígenos solubles de Leishmania. Según se utiliza en la presente memoria, "antígenos soluble de Leishmania" hace referencia a una mezcla de por lo menos 8 antígenos de Leishmania diferentes que se pueden aislar a partir del sobrenadante de promastigotas de Leishmania de cualquier especie cultivada durante 8-12 horas en medio libre de proteínas. En resumen, los organismos se cultivan hasta la fase logarítmica tardía en medio complejo con suero hasta que llegan a una densidad de 2-3 x 107 organismos viables por mL de medio. Los organismos se lavan cuidadosamente para eliminar los componentes del medio y se resuspenden a 2-3 x 107 organismos viables por ml de medio libre de suero definido que consiste en un medio con partes iguales de RPMI 1640 y medio 199, ambos de Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Después de 8-12 horas, el sobrenadante que contiene antígenos solubles de Leishmania se separa, se concentra 10 veces y se somete a diálisis frente a solución salina tamponada con fosfato durante 24 horas. La presencia de al menos ocho antígenos diferentes dentro de la mezcla de antígenos de Leishmania se puede confirmar utilizando SDS-PAGE (es decir, a través de la observación de por lo menos 8 bandas diferentes). Las propiedades inmunogénicas de los antígenos solubles de Leishmania se pueden confirmar mediante la evaluación de la capacidad de la preparación para producir una respuesta inmunitaria en cultivos de células de ganglios linfáticos y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos infectados Leishmania actualmente o previamente. Dicha evaluación puede realizarse como se describe a continuación.
Se pueden aislar los antígenos individuales presentes en la mezcla de antígenos solubles de Leishmania inmunizando ratones o conejos con sobrenadante de cultivo de Leishmania, que contiene antígenos solubles, y empleando el suero resultante para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de Leishmania como se describe con detalle a continuación. Este procedimiento se puede utilizar para aislar polinucleótidos recombinantes aislados que codifican los antígenos de L. major referidos en la presente memoria como Lmsp1a, Lmsp9a y MAPS-1. Las secuencias de ADN que codifican Lmsp1a, Lmsp9a y MAPS-1A se proporcionan en los SEQ ID NO: 19, 21 y 23, respectivamente, presentándose las correspondientes secuencias de aminoácidos pronosticadas en los SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente. De manera similar, los sueros de ratones o conejos inmunizados con sobrenadante de cultivo de L. major pueden ser utilizados para escrutar una genoteca de ADN genómico de L. major. Como se detalla más abajo, este procedimiento se puede utilizar para aislar polinucleótidos que codifican los antígenos de L. major referidos en la presente memoria como LmgSP1, LmgSP3, LmgSP5, LmgSP8, LmgSP9, LmgSP13, LmgSP19, y polinucleótidos que codifican los antígenos de L. chagasi LcgSP1, LcgSP3, LcgSP4, LcgSP8, y LcgSP10. Las secuencias de ADN que codifican estos antígenos se proporcionan en los SEQ ID NO: 29-35 y 44-48, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos correspondientes en los SEQ ID NO: 36-42 y 49-53. Los antígenos de L. major referidos en la presente memoria como 1G6-34, 1E6-44, 4A5-63, 1B11-39, 2A1037, 4G2-83, 4H6-41 y 8G3-100 pueden ser aislados por medio de la clonación para la expresión de las células T CD4+ tal como se describe a continuación. Las secuencias de ADN que codifican estos antígenos se proporcionan en los SEQ ID NO: 72-79, respectivamente, proporcionándose las correspondientes secuencias de aminoácidos predichas en los SEQ ID NO: 80-87. Las propiedades inmunogénicas de los antígenos de Leishmania aislados pueden evaluarse utilizando, por ejemplo, los métodos representativos descritos en la presente memoria.
Independientemente del método de preparación, los antígenos descritos en la presente memoria son inmunogénicos. En otras palabras, los antígenos (y porciones inmunogénicas de los mismos) son capaces de provocar una respuesta inmunitaria en cultivos de células de ganglios linfáticos y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos infectados actualmente o previamente por Leishmania. Más específicamente, los antígenos y las porciones inmunogénicas de los mismos, tienen la capacidad de inducir la proliferación de células T y/o provocar una respuesta de citoquinas de tipo Th1 dominante (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-γ, y/o TNF-α por las células T y/o las células NK; y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B) en células aisladas de individuos infectados por Leishmania actualmente o previamente. Un individuo infectado por Leishmania puede estar aquejado de una forma de leishmaniasis (tal como subclínica, cutánea, mucosa o visceral activa) o puede ser asintomática. Dichos individuos pueden identificarse utilizando métodos conocidos por los expertos normales en la técnica. Los individuos con leishmaniasis pueden ser identificados basándose en hallazgos clínicos asociados con por lo menos uno de los siguientes: aislamiento de parásitos de lesiones, una prueba cutánea positiva con producto lisado de Leishmania o una prueba serológica positiva. Los individuos asintomáticos son individuos infectados que no presentan signos ni síntomas de la enfermedad. Tales individuos pueden ser identificados basándose en una prueba serológica positiva y/o una prueba cutánea con producto lisado de Leishmania.
El término "PBMC", que se refiere a una preparación de células nucleadas que consiste principalmente en linfocitos y monocitos que están presentes en sangre periférica, abarca tanto mezclas de células como preparaciones de uno
o más tipos de células purificadas. Las PBMC se pueden aislar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las PBMC se pueden aislar por centrifugación de densidad a través de, por ejemplo, Ficoll™ (Winthrop Laboratories, Nueva York). Los cultivos de ganglios linfáticos generalmente se pueden preparar mediante la inmunización de ratones BALB/c (por ejemplo, en la almohadilla plantar posterior) con promastigotas de Leishmania emulsionadas en coadyuvante completo de Freund. Los ganglios linfáticos de drenaje se puede escindir después de la inmunización y las células T pueden purificarse en una columna de anti-Ig de ratón para eliminar las células B, seguido por un paso a través de una columna Sephadex G10 para eliminar los macrófagos. De manera similar, las células de los ganglios linfáticos se pueden aislar de un ser humano después de una biopsia o una extirpación quirúrgica de un ganglio linfático.
La capacidad de un polipéptido (por ejemplo, un antígeno de Leishmania o una porción u otra variante del mismo) para inducir una respuesta en PBMC o cultivos de células de ganglios linfáticos se puede evaluar poniendo en contacto las células con el polipéptido y midiendo una respuesta adecuada. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 2 x 105 células varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 μg, y preferiblemente es de aproximadamente 1-10 microgramos. La incubación del polipéptido con las células se realiza normalmente a 37° C durante aproximadamente 1-3 días. Después de la incubación con el polipéptido, las células se analizan para determinar una respuesta apropiada. Si la respuesta es una respuesta proliferativa, se puede emplear cualquiera de una variedad de mecanismos bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Por ejemplo, se pueden exponer las células a un pulso de timidina radioactiva y medir la incorporación del marcador al ADN celular. En general, un polipéptido que da como resultado al menos un aumento de tres veces en la proliferación por encima del fondo (es decir, la proliferación observada para las células cultivadas sin polipéptido) se considera capaz de inducir la proliferación.
Alternativamente, la respuesta que se va a medir puede ser la secreción de una o más citoquinas (tales como el interferón γ (IFN-γ), interleuquina 4 (IL-4), interleuquina 12 (p70 y/o p40), interleuquina 2 (IL-2) y/o factor de necrosis tumoral α (TNF-α)) o el cambio en el nivel de ARNm que codifica uno o más citoquinas específicas. En particular, la secreción de interferón γ, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral α y/o interleuquina 12 es indicativa de una respuesta Th1, que es responsable del efecto protector contra Leishmania. Los análisis para cualquiera de las citoquinas anteriores generalmente se pueden realizar utilizando métodos conocidos por los expertos normales en la técnica, tales como un ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA). Los anticuerpos adecuados para su uso en tales análisis pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes tales como Chemicon, Temucula, CA y PharMingen, San Diego, CA, y generalmente se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de ARNm que codifica uno o más citoquinas específicas puede evaluarse, por ejemplo, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En general, un polipéptido que es capaz de inducir, en una preparación de aproximadamente 1-3 x 105 células, la producción de 30 pg/ml de IL-12, IL-4, IFN-γ, TNF-α o IL- 12 p40, o 10 pg/mL de IL-12 p70, se considera capaz de estimular la producción de una citoquina.
Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente memoria se pueden preparar e identificar usando mecanismos bien conocidos, tales como los que resumen Paul, en Fundamental Immunology , 3ª ed., 243247 (Raven Press, 1993) y las referencias allí citadas. Tales técnicas incluyen polipéptidos de escrutinio derivados del antígeno para determinar las propiedades inmunogénicas utilizando, por ejemplo, los mecanismos representativos descritos en la presente memoria. Una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que, en tales análisis representativos, genera una respuesta inmunitaria (por ejemplo, proliferación y/o producción de citoquinas) que es sustancialmente similar a la generada por el antígeno completo. En otras palabras, una porción inmunogénica de un antígeno puede generar al menos aproximadamente 25%, y preferiblemente al menos aproximadamente 50%, de la respuesta generada por el antígeno completo en los análisis modelo descritos en la presente memoria.
Las porciones y otras variantes de antígenos inmunogénicos de Leishmania pueden ser generadas por medios sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden generarse utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Por ejemplo, tales polipéptidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de los mecanismos en fase sólida disponibles en el mercado, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, donde los aminoácidos se añaden sucesivamente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible en el mercado disponible de proveedores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y puede ser manejado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno nativo pueden prepararse fácilmente a partir de una secuencia de ADN que codifica el antígeno. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas anfitrión/vector adecuados que secretan la proteína recombinante a los medios de cultivo se pueden concentrar primero utilizando un filtro disponible en el mercado. Después de la concentración, el producto concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente una proteína recombinante.
En general, se puede emplear cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos normales en la técnica para expresar los polipéptidos recombinantes de esta invención. Se puede lograr la expresión en cualquier célula anfitriona apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante. Las células anfitrionas adecuadas incluyen células de procariotas, de levaduras y de eucariotas superiores. Preferiblemente, las células anfitrionas empleadas son E. coli, levadura o una línea celular de mamífero tal como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar antígenos de origen natural, porciones de antígenos de origen natural, u otras variantes de los mismos. Por ejemplo, las variantes de un antígeno nativo pueden prepararse generalmente usando técnicas convencionales, tales como mutagénesis de sitio específico dirigida por oligonucleótidos, y se pueden eliminar secciones de la secuencia de ADN para permitir la preparación de polipéptidos truncados.
También se describen en la presente memoria secuencias de repetición epitópica, o epítopos antigénicos, de un antígeno de Leishmania, junto con polipéptidos que comprenden al menos dos de tales epítopos antigénicos contiguos. Según se utiliza en la presente memoria un "epítopo" es una porción de un antígeno que reacciona con sueros de individuos infectados por Leishmania (es decir, un epítopo se une específicamente a uno o más anticuerpos presentes en tales sueros). Como se comentó anteriormente, los epítopos de los antígenos descritos en la presente solicitud pueden ser identificados generalmente usando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización, los epítopos antigénicos de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos proporcionada en los SEQ ID NO: 43, 56, 57 o 58. Como se comenta con más detalle a continuación, los epítopos antigénicos proporcionados en la presente memoria pueden ser empleados en el diagnóstico y el tratamiento de la infección por Leishmania, ya sea solos o combinados con otros antígenos de Leishmania o epítopos antigénicos. Los epítopos antigénicos y los polipéptidos que comprenden tales epítopos se pueden preparar por métodos sintéticos, como se describe en general más arriba y con detalle en el Ejemplo 15.
En ciertos aspectos de la presente invención, descritos con detalle a continuación, las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos, epítopos antigénicos y/o antígenos solubles de Leishmania se pueden incorporar a composiciones farmacéuticas o vacunas.
Las composiciones farmacéuticas comprenden una o más proteínas de fusión, cada una de las cuales puede contener una o más de las anteriores secuencias (o variantes de las mismas), y un portador fisiológicamente aceptable. Las vacunas, también referidas como composiciones inmunogénicas, comprenden una o más de las proteínas de fusión anteriores y un inmunoestimulador, tal como un coadyuvante (por ejemplo, LbeIF4A, interleuquina 12 u otras citoquinas) o un liposoma (en el que se incorpora el polipéptido). Muchos coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de las respuestas inmunitarias, tal como lípido A, proteínas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Ciertos coadyuvantes son asequibles comercialmente, como por ejemplo Coadyuvante Incompleto y Coadyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Coadyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rathway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. Las citoquinas, tales como GM-CSF, interleuquina 2, 6, 12 y otros factores de crecimiento similares, también se pueden utilizar como coadyuvantes.
En ciertas realizaciones de la invención, la composición coadyuvante es preferiblemente una que induce una respuesta inmunitaria predominantemente de tipo Th1. Algunos coadyuvante preferidos para lograr una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, junto con una sal de aluminio. Los coadyuvantes MPL® son asequibles de Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.436.727; 4.877;611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido de CpG está desmetilado) también inducen una respuesta predominantemente de tipo Th1. Tales oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también son descritas, por ejemplo, por Sato et al., Science 273:352, 1996. Otro coadyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o sus derivados, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones coadyuvantes de la presente invención, por ejemplo combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, β-escina, o digitonina.$$$
Alternativamente, las formulaciones de saponina se pueden combinar con vehículos para vacunas compuestos por quitosana u otros polímeros policatiónicos, partículas de polilactida y polilactida-co-glicólido, matriz polimérica basada en poli-N-acetil glucosamina, partículas compuestas por polisacáridos o polisacáridos modificados químicamente, liposomas y partículas basadas en lípidos, partículas compuestas por monoésteres de glicerol, etc. Las saponinas también se pueden formular en presencia de colesterol para formar estructuras particuladas tales como liposomas o ISCOM. Además, las saponinas se pueden formular junto con un éster o éster de polioxietilano, en una solución o suspensión no particulada, o en una estructura particulada tal como un liposoma paucilamelar o ISCOM. Las saponinas también se pueden formular con excipientes tales como Carbopol® para incrementar la viscosidad, o se pueden formular en forma de polvo seco con un excipiente en polvo tal como lactosa.
En una realización preferida, el sistema coadyuvante incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de coadyuvante QS21 y 3D-MPL®, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde QS21 es extinguido con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación coadyuvante particularmente preferida que emplea QS21, 3D-MPL® y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.
Otro sistema coadyuvante mejorado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina, concretamente la combinación de CpG y QS21, se describe en el documento WO 00(09159. Preferiblemente la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol.
Los coadyuvantes ilustrativos adicionales para su uso en las composiciones de la invención incluyen Montanide ISA 720 (Serpic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de coadyuvantes SBAS (p. ej., SBAS-2 o SBAS-4, asequible de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Enhanzayn® (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGP), tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm.6.113.918 y la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos pendiente Núm. de Serie 09/074.720, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad, y coadyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1.
Otros coadyuvantes preferidos incluyen moléculas coadyuvantes de fórmula general
(I):HO(CH2CH2O)n-A-R,
donde, n es 1-50, A es un enlace o –C(O)-, R es alquilo C1-C50 o Fenilalquilo C1-C50.
En la presente memoria se describe una formulación de vacuna que comprende un éter de polioxietileno de fórmula general (I), donde n está entre 1 y 50, preferiblemente 4-24, muy preferiblemente 9; el componente R es alquilo C1-C50, preferiblemente C4-C20 y muy preferiblemente alquilo C12, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno deben estar en el intervalo de 0,1-20%, preferiblemente de 0,1-10%, y muy preferiblemente en el intervalo de 0,1-1%. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter polioxietilen-4laurílico, éter polioxietilen-9-estearílico, éter polioxietilen-8-estearílico, éter polioxietilen-4-laurílico, éter polioxietilen35-laurílico, y éter polioxietilen-23-laurílico. Los éteres de polioxietileno, tales como el éter polioxietilen-laurílico se describen en el Índice Merck (12ª edición: entrada 7717). Estas moléculas coadyuvantes se describen en el documento WO 99/52549. El éter de polioxietileno de acuerdo con la fórmula general (I) anterior se puede combinar, si se desea, con otro coadyuvante. Por ejemplo, una combinación coadyuvante favorable es preferiblemente con CpG como se describe en la Solicitud de Patente pendiente del Reino Unido GB 9820956.2.
Las vacunas pueden contener adicionalmente un vehículo de liberación, tal como una microesfera biodegradable (descrita, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.897.268 y 5.075.109). Las composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros antígenos de Leishmania, ya sea incorporados a un polipéptido combinado o presente en uno o más polipéptidos separados.
Alternativamente, una composición farmacéutica o vacuna puede contener un inmunoestimulador tal como, un coadyuvante (p. ej., LbelF4, interleuquina 12 u otras citoquinas) o ADN que codifica tales intensificadores, y ADN que codifica uno o más de los polipéptidos como se ha descrito anteriormente, de tal manera que el polipéptido se genera in situ. En tales composiciones farmacéuticas y vacunas, el ADN puede estar presente en cualquiera de una variedad de sistemas de liberación conocidos por los expertos normales en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, bacterias y sistemas de expresión virales. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos adecuados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de liberación bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus de Calmette-Guerriή) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie celular. En una realización preferida, el ADN puede ser introducido usando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vaccinia u otro virus de la viruela, retrovirus, o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus de replicación competente, no patógeno (defectuoso). Los mecanismos para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidos por los expertos normales en la técnica. El ADN también puede estar "desnudo", como describen, por ejemplo, Ulmer et al., en Science 259:1745-1749 (1993) y revisado por Cohen, Science 259:16911692 (1993). La absorción de ADN desnudo se puede aumentar revistiendo perlas biodegradables con ADN, que son eficazmente transportadas a las células.
Si bien se puede emplear cualquier portador adecuado conocido por los expertos normales en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el portador preferiblemente comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (por ejemplo, poliláctico-galactido) también se pueden emplear como portadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos. Núms. 4.897.268 y 5.075.109.
Cualquiera de una variedad de coadyuvantes se puede emplear en las vacunas de esta invención para potenciar no específicamente la respuesta inmunitaria. La mayoría de los coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador inespecífico de las respuestas inmunitaria, tal como lípido A, Bordetella pertussis, o Mycobacterium tuberculosis. Los coadyuvantes adecuados están disponibles en el mercado como, por ejemplo, el Coadyuvante Incompleto y el Coadyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI), Coadyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), alumbre, microesferas biodegradables, monofosforil lípido A y quil A. Los coadyuvantes preferidos incluyen LbeIF4A, IL-12 y otras citoquinas tales como IFN-γ o factor estimulador de colonias de granulocitos - macrófagos (GM-CSF). En virtud de su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria Th1 exclusiva, es particularmente preferido el uso de LbeIF4A, y variantes del mismo, como coadyuvante en las vacunas de la presente invención.
En una realización preferida, las composiciones de la presente invención incluyen múltiples polipéptidos seleccionados con el fin de proporcionar una protección mejorada contra una variedad de especies de Leishmania. Tales polipéptidos se pueden seleccionar basándose en las especies de origen del antígeno nativo o basándose en un alto grado de conservación de la secuencia de aminoácidos entre diferentes especies de Leishmania. Una combinación de polipéptidos individuales puede ser particularmente eficaz como vacuna profiláctica y/o terapéutica debido a que (1) la estimulación de la proliferación y/o la producción de citoquinas por polipéptidos individuales puede ser aditiva, (2) la estimulación de la proliferación y/o la producción de citoquinas por una combinación de polipéptidos individuales pueden ser sinérgicas, (3) una combinación de polipéptidos individuales puede estimular los perfiles de citoquinas de tal forma que sean complementarios entre sí y/o (4) los polipéptidos individuales pueden ser complementarios entre sí cuando algunos de ellos se expresan más abundantemente en las especies individuales o cepas de Leishmania responsables de la infección. Una combinación concreta contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 y LbeIF4A. Alternativamente, o además, la combinación puede incluir uno o más polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de otros antígenos de Leishmania descritos en la presente memoria, y/o antígenos solubles de Leishmania.
En otra realización, las composiciones de la presente invención incluyen combinaciones de los polipéptidos descritos más arriba empleados con una variedad de coadyuvantes, tales como IL-12 (proteína o ADN) para conferir una respuesta protectora contra una variedad de especies de Leishmania.
En otra realización más, las composiciones de la presente invención incluyen constructos de ADN de las diferentes especies de Leishmania solos o combinados con una variedad de coadyuvantes, tales como IL-12 (proteína o ADN) para conferir una respuesta protectora contra una variedad de especies de Leishmania.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores pueden utilizarse, por ejemplo, para inducir inmunidad protectora contra Leishmania en un paciente, tal como un ser humano o un perro, para prevenir la leishmaniasis. Las dosis apropiadas y los métodos de administración para estos propósitos se describen en detalle a continuación.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en la presente memoria también se pueden utilizar para estimular una respuesta inmunitaria, que puede ser celular y/o humoral, en un paciente. Para pacientes infectados por Leishmania, las respuestas inmunitarias que pueden generarse incluyen una respuesta inmunitaria Th1 preferente (es decir, una respuesta caracterizada por la producción de las citoquinas interleuquina 1, interleuquina 2, interleuquina 12 y/o interferón γ, así como factor de necrosis tumoral α). Para pacientes no infectados, la respuesta inmunitaria puede ser la producción de interleuquina 12 y/o interleuquina 2, o la estimulación de las células T gamma delta. En cualquier categoría de paciente, la respuesta estimulada puede incluir la producción de IL-12. Dichas respuestas también pueden ser logradas en muestras biológicas de PBMC o de sus componentes derivados de individuos infectados por Leishmania o no infectados. Como se señaló anteriormente, los análisis para determinar cualquiera de las citoquinas anteriores generalmente se pueden realizar utilizando métodos conocidos por los expertos normales en la técnica, tales como un análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA).
Las composiciones farmacéuticas y vacunas adecuadas para uso en este aspecto de la presente invención son aquellas que contienen al menos una proteína de fusión de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en la presente memoria también se pueden usar para tratar a un paciente que padece una enfermedad sensible a la estimulación de IL-12. El paciente puede ser cualquier animal de sangre caliente, tal como un ser humano o un perro. Dichas enfermedades incluyen infecciones (que pueden ser, por ejemplo, bacterianas, virales o protozoicas) o enfermedades tales como el cáncer. Por ejemplo, la enfermedad puede ser la leishmaniasis, y el paciente puede mostrar síntomas clínicos o puede ser asintomático. En general, la capacidad de respuesta de una enfermedad particular a la estimulación por IL-12 puede determinarse evaluando el efecto del tratamiento con una composición farmacéutica o vacuna de la presente invención sobre correlaciones clínicas de inmunidad. Por ejemplo, si el tratamiento da como resultado una mayor respuesta Th1 o la conversión de un perfil Th2 en Th1, con una mejora clínica complementaria en el paciente tratado, la enfermedad es sensible a la estimulación por IL-12. La administración de polipéptido puede ser como se describe a continuación, o puede prolongarse durante un período de tiempo más largo, dependiendo de la indicación. Preferiblemente, los polipéptidos empleados en las composiciones farmacéuticas y vacunas son complementarios, como se ha descrito anteriormente. Una combinación concreta contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 y LbeIF4A, Lmsp1a, Lmsp9a y MAPS-1A. También se pueden emplear antígenos solubles de Leishmania.
Las rutas y frecuencia de administración, así como la dosificación, para los aspectos anteriores de la presente invención variarán de un individuo a otro y se pueden establecer paralelismos con los que actualmente se están utilizando en la inmunización contra otras infecciones, incluyendo infecciones por protozoos, virus y bacterias. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse por medio de inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, por aspiración) o por vía oral. Se pueden administrar entre 1 y 12 dosis durante un período de 1 año. Para la vacunación terapéutica (es decir, el tratamiento de un individuo infectado), se administran preferiblemente12 dosis, a intervalos de un mes. Para el uso profiláctico, se administran preferiblemente 3 dosis, a intervalos de 3 meses. En cualquier caso, se pueden administrar después periódicamente vacunas de refuerzo. Pueden ser apropiados protocolos alternativos para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o ADN que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de originar una respuesta inmunitaria en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de la leishmaniasis durante por lo menos 1 -2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producido in situ por el ADN en una dosis) varía de aproximadamente 100 ng a
aproximadamente 1 mg por kg de anfitrión, normalmente de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 100 μg.
Los tamaños adecuados de las dosis variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente variarán de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.
En otro aspecto, esta invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en el diagnóstico de la infección por Leishmania en un paciente mediante una prueba cutánea. Según se utiliza en la presente memoria, una "prueba cutánea" es cualquier análisis realizado directamente en un paciente en el que se mide una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (tal como endurecimiento y enrojecimiento acompañante) después de la inyección intradérmica de uno o más polipéptidos como se ha descrito anteriormente. Esta inyección se puede lograr usando cualquier dispositivo adecuado suficiente para poner en contacto el polipéptido o los polipéptidos con las células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 ml. Preferiblemente, la reacción se mide al menos 48 horas después de la inyección, más preferiblemente 72 horas después de la inyección.
La reacción DTH es una respuesta inmunitaria mediada por células, que es mayor en pacientes que han sido expuestos previamente a una prueba con antígeno (es decir, una porción inmunogénica de un polipéptido empleado,
o una variante del mismo). La respuesta puede medirse visualmente, utilizando una regla. En general, el endurecimiento que es mayor que aproximadamente 0,5 cm de diámetro, preferiblemente mayor de aproximadamente 1,0 cm de diámetro, es una respuesta positiva, indicativa de infección por Leishmania, que puede
o no manifestarse como una enfermedad activa.
Las proteínas de fusión de esta invención preferiblemente se formulan, para su uso en una prueba cutánea, en forma de composiciones farmacéuticas que contienen al menos una proteína de fusión y un portador fisiológicamente aceptable, como se ha descrito anteriormente. Tales composiciones contienen típicamente uno o más de los polipéptidos anteriores en una cantidad que varía de aproximadamente 1 μg a 100 μg, preferiblemente de aproximadamente 10 μg a 50 μg en un volumen de 0,1 ml. Preferiblemente, el portador empleado en dichas composiciones farmacéuticas es una solución salina con conservantes apropiados, tales como fenol y/o Tween $80 ™.
Las proteínas de fusión de la invención también se pueden emplear combinadas con uno o más antígenos de Leishmania conocidos en el diagnóstico de la leishmaniasis, utilizando, por ejemplo, la prueba cutánea descrita anteriormente. Preferiblemente, las proteínas de fusión se eligen de tal manera que los polipéptidos que comprenden sean complementarios entre sí. Los ejemplos de los antígenos de Leishmania conocidos que pueden ser útilmente empleados junto con los polipéptidos de la invención incluyen K39 (Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993 90:775-779).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. Cualquiera de los ejemplos que puede estar fuera del alcance de la invención reivindicada se proporciona solamente para ayudar el experto en la técnica a comprender el campo técnico de la invención.
Ejemplo 1
Preparación de M15
Este ejemplo ilustra la preparación de un antígeno de Leishmania M15, que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO: 2.
Se escrutó una genoteca de expresión de ADNc de amastigota de L. major (cepa Friedlan) preparada en el vector
λZAP II (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando suero obtenido de
ratones BALB/c infectados con L. major (8 semanas después de la inoculación). Se escrutaron aproximadamente
40.000 placas y se purificaron hasta la homogeneidad cuatro clones que expresaban antígenos reactivos por medio de dos rondas subsiguientes de escrutinio de baja densidad. Se escindieron los insertos del fagémido Bluescript de los clones positivos para su análisis adicional. Con posterioridad se utilizó un fragmento de restricción EcoRI/SstII desde el extremo 5' de un inserto de ADNc parcial aislado durante la primera ronda de escrutinio (pLmal-1) como sonda para escrutar de nuevo los clones que contenían insertos de ADNc completo. La sonda se marcó para actividad específica alta (~109 cpm/μg) con [α-32 P]dCTP utilizando el método del cebador al azar y se utilizó para escrutar ~10.000 placas de la genoteca de expresión de L. major descrita más arriba. Los clones positivos se compararon mediante digestión con enzimas de restricción y el clon con el inserto más grande (pfll-1) fue elegido para análisis posteriores.
Los análisis de la secuencia de ADN se realizaron en un secuenciador automatizado de Applied Biosystems utilizando polimerasa Taq y terminadores ddNTP acoplados a colorante o cebadores de secuenciación marcados con colorante. La secuencia completa del inserto de 2685 pb se determinó utilizando una combinación de secuenciación dirigida por el cebador y secuenciación de una serie de subclones de deleción con Exonucleasa III solapantes generados utilizando el sistema Erase-a-base (Promega, Madison, WI). La secuencia de este inserto se proporciona en el SΕQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos deducida se proporciona en el SΕQ ID NO: 2.
El inserto completo del clon pfl-1 se escindió por digestión con BamRl/KpnI y se subclonó en marco en pQE31 digerido con BamHI/KpnI (QUIAGEN) para generar el constructo pM151A. La E. coli que contenía este constructo expresó induciblemente altos niveles del antígeno de L. major codificado por pfll-1 (denominado M15) con la adición de una etiqueta de 6-histidina en el extremo amino. Se indujo la expresión de la proteína recombinante en cultivos de gran volumen (500 ml) de células anfitrionas de E. coli que contenían el constructo pM151A mediante la adición de IPTG 2 mM a la fase de crecimiento semi-logarítmica. El crecimiento continuó durante 4 a 5 horas y después las bacterias se sedimentaron y se lavaron una vez con PBS frío. Las bacterias se resuspendieron en 20 ml de tampón de lisis (Na2HPO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, mercaptoetanol 10 mM) que contenía 20 mg de lisozima y se lisaron mediante una incubación durante 1 hora a 4°C seguido de breve sonicación. El material insoluble se separó por centrifugación a 10.000 xg durante 10 minutos y aunque se encontró que la proteína recombinante se distribuía uniformemente entre las fracciones soluble e insoluble, se desechó el material insoluble en este punto. La proteína recombinante que contenía la etiqueta de histidina amino terminal se purificó por afinidad utilizando resina Ni-NTA (QIAGEN) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 8 ml de resina Ni-NTA resuspendida en tampón de lisis a la fracción de producto lisado soluble y se llevó a cabo la unión con mezclado constante durante 1 hora a 4°C. Después la mezcla se cargó en una columna de flujo por gravedad y el material no unido se dejó fluir. La matriz de Ni-NTA se lavó 3 veces con 25 ml de tampón de lavado (Na2HPO4 50 mM, pH 6,0, NaCl 300 mM, β-Mercaptoetanol 10 mM) y el material unido se hizo eluir en 25 ml de tampón de elución (Na2HPO4 50 mM pH 5,0, NaCl 300 mM, β-mercaptoetanol 10 mM). El material eluido se sometió después a diálisis frente a 3 cambios de PBS, se filtró en condiciones estériles y se almacenó a -20°C. Se demostró mediante análisis SDS-PAGE que la proteína recombinante purificada estaba libre de cualquier cantidad significativa de proteína de E. coli. Se supuso que un pequeño número de bandas de peso molecular más bajo eran los productos proteolíticos del antígeno de L. major basándose en su reactividad mediante análisis de transferencia Western. Se generó un antisuero policlonal de título alto contra M15 en conejos mediante inyección subcutánea repetida de proteína recombinante. El análisis de transferencia Western de productos lisados de promastigotas y amastigotas de L. major utilizando este antisuero indicó que la proteína se expresaba constitutivamente a través del ciclo de vida del parásito.
Ejemplo 2
Preparación de Ldp23
Este ejemplo ilustra la preparación de un antígeno de Leishmania Ldp23, que tiene la secuencia proporcionada en el SEC ID NO: 4.
A. Purificación de Péptidos Asociados con el MHC de Clase II de Macrófagos P388D1 Infectados con L. donovani
Para verificar que la infección in vitro de macrófagos podría cargar sus moléculas del MHC de clase II con péptidos de parásitos, se llevaron a cabo experimentos iniciales para someter a ensayo la capacidad de la línea celular de macrófagos infectados con L. donovani P388D1 para presentar antígenos de parásitos a células T específicas de L. donovani. Se eligió ésta línea celular de macrófagos porque tiene el mismo haplotipo H-2 que el ratón BALB/c, que es una cepa de ratón moderadamente susceptible a la infección por L. donovani y se seleccionó para llevar a cabo los experimentos in vivo. Utilizando una proporción de 3-5 parásitos por célula y una incubación inicial a temperatura ambiente durante 4-6 horas seguido de 37°C durante 24-48 horas, cerca de 90% de los macrófagos fueron infectados. El nivel de expresión de moléculas del MHC clase II, determinado por medio de análisis FACS, indicó que la infección no ocasionaba un efecto sobre los niveles de expresión de MHC de clase II cuando se comparaba con las células de control no infectadas.
Para someter a ensayo la capacidad de las células P388D1 infectadas con L. donovani para presentar antígenos de parásitos, se infectaron macrófagos como se indicó anteriormente y se incubaron a 26°C durante 6 horas, y luego a 37°C, durante 24, 48 o 72 horas. En cada uno de estos momentos puntuales las células no adherentes y los parásitos libres se lavaron y las células adherentes se desprendieron mecánicamente, se lavaron y se fijaron con paraformaldehído. Estas células se utilizaron después como células presentadoras de antígenos (APC) para purificar células T de ganglio linfático de ratones BALB/c inmunizados con promastigotas de L. donovani. Para generar estas células T específicas anti-L. donovani, se inmunizaron ratones BALB/c (H-2d) de ambos sexos (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a las 8 a 14 semanas de edad en la almohadilla plantar trasera con 5-10 x 106 promastigotas de L. donovani emulsionados en coadyuvante completo de Freund (CFA) (Difco Laboratories, Madison, MI) como describen Rodrigues et al., en Parasite Immunol. 14:49 (1992). Los ganglios linfáticos de drenaje se extirparon 8 días después de la inmunización y las células T se purificaron en una columna de anti-Ig de ratón para eliminar las células B, como se describen Bunn-Moreno y Campos-Neto, en J. Immunol. 127:427 (1981), seguido de un pase a través de una columna Sephadex G10 para separar los macrófagos.
El índice de estimulación se calculó dividiendo las cpm obtenidas para las células cultivadas en presencia de macrófagos P388D1 infectados por las cpm obtenidas para las células cultivadas en presencia de macrófagos no infectados, pero sometidas a las mismas condiciones que los macrófagos infectados. Los resultados que se muestran la Figura 1 indican que los macrófagos P388D1 infectados con L. donovani procesan los antígenos de parásitos y que la presentación óptima se produce después de 48 horas de la infección. No se observó estimulación de las células T por los macrófagos no infectados.
Para aislar los péptidos de L. donovani asociados con el MHC de clase II, se infectaron macrófagos P388D1 con promastigotas de L. donovani para una incubación inicial de 6 horas a la temperatura ambiente. Después los cultivos se transfirieron a 37°C durante el resto del período de incubación de 48 horas. En una proporción de 3-5 parásitos por macrófago, casi el 90% de los macrófagos fueron infectados después de 24 horas de incubación a 37°C.
Las moléculas del MHC de clase II se purificaron después por afinidad. Se utilizaron aproximadamente 1,5 x 1010 macrófagos P388D1 infectados con L. donovani o un número igual de no infectados para cada purificación. Las células se recogieron, se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos en tampón de lisis frío (PBS, Nonidet P40 al 1%, yodoacetamida 25 mM, azida de sodio al 0,04%, aprotinina 1 mM y PMSF 1 mM). El material insoluble se eliminó por centrifugación a 40.000 g durante 1 hora y el sobrenadante se recicló durante la noche a 4°C sobre una columna de Sefarosa anti-moléculas del MHC de clase II (H-2d) (columna de Proteína G-Sefarosa a la que se había unido el anticuerpo monoclonal MK-D6). Los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma MK-D6 (Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD) se emplearon como fuente de anticuerpo monoclonal anti-MHC de clase II (H-2d). La columna se lavó con 50 ml de tampón de lisis y después con 50 ml de PBS que contenía detergente octilglucopiranosido al 0,5%. Las moléculas unidas se hicieron eluir de la columna con ácido acético 1 M en NaCl al 0,2%. Las moléculas de MHC/péptido se separaron de la IgG (anticuerpo monoclonal MK-D6) utilizando una unidad de filtro Centricon 100 (Amicon Division, WR Grace & Co., Beverly, MA). Los péptidos se disociaron después de las moléculas de clase II mediante la adición de ácido acético 2,5 M, seguido de la separación utilizando una unidad de filtro Centricon 10. La preparación de péptidos resultante, presente en la muestra de bajo peso molecular, se secó después utilizando un concentrador Speed Vac (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY).
Los péptidos se redisolvieron en 200 μl de TFA al 0,05% y se separaron por medio de cromatografía de líquidos de
alta resolución fase inversa (RP-HPLC) utilizando una columna C-18 Vydac de 2,1 mm x 25 cm a una velocidad de flujo de 0,15 ml/min empleando un gradiente de acetonitrilo al 1 - 30% (60 min) seguido de un gradiente de 30 a 60% (30 min) y a continuación un gradiente de 60 a 80% (90-110 min). Las células P388D1 no infectadas se trataron de una manera similar para que sirvieran como control de fondo para los péptidos asociados con el MHC de clase II endógeno. La Figura 2 muestra un experimento representativo; se indican cuatro picos distintos que están presentes solo en el material aislado de los macrófagos infectados (panel B), y no en el material aislado de macrófagos no infectados (panel A).
De las tres extracciones de péptidos independientes, se aislaron veinticinco picos distintos de péptidos de la HPLC de macrófagos infectados con L. donovani y se sometieron a análisis de la secuencia de proteínas utilizando la degradación de Edman automática en un secuenciador de proteínas en fase gaseosa Applied Biosystems 477. La secuencia de proteínas y el análisis de los aminoácidos se llevaron a cabo a través de la W.M. Keck Foundation, Biotechnology Resource Laboratory, Universidad de Yale, New Haven, CT. En prácticamente ninguna de la determinaciones, se pudo realizar ninguna asignación para la primera posición. Asimismo, en la mayoría de los casos la definición de los residuos de aminoácido de las posiciones 10-15 se basó en la dominancia cuantitativa de un residuo sobre otros. Utilizando este enfoque, las secuencias obtenidas para varios péptidos mostraron la presencia de 3-6 residuos diferentes en muchos de los 10-15 ciclos de secuencia analizados para cada determinación, reflejando una mezcla de péptidos. Además, no pudieron obtenerse las secuencias para algunos picos debido a que los péptidos fueron bloqueados. No obstante, se determinaron tres secuencias de péptidos. Se buscaron las secuencias de aminoácidos para determinar la identidad con las proteínas de la base de datos GenBank utilizando los programas GENPETP, PIR y SWISSPROT. El análisis de la base de datos de secuencias reveló que uno de los péptidos era muy homólogo a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de diversas especies. Otro péptido tuvo homología con el factor de elongación de varias especies, incluyendo Leishmania. La tercera secuencia no estaba claramente relacionada con ninguna de las proteínas conocidas, y se muestra a continuación:
XQXPQ(L/K)VFDEXX (SEQ ID NO: 11).
B.Clonación y Secuenciación del Gen Ldp23
Con el fin de recuperar la proteína de L. donovani que se había procesado en un péptido asociado con las moléculas del MHC de clase II de macrófagos infectados, se eligió la secuencia de péptidos de origen incierto para guiar la estrategia de clonación para el gen del parásito correspondiente. Inicialmente se amplificó un fragmento de ADN de ADNc de promastigotas de L. donovani mediante PCR. El cebador efector fue un oligonucleótido derivado del péptido (5'> GGAATTCCCCInCAGCTInGTInTTCGAC <3') (SEQ ID NO: 12) que contenía un sitio para la endonucleasa de restricción EcoRI (subrayado). Las bases se seleccionaron siguiendo el uso de codones preferentes de L. donovani, como describieron Langford et al., en Exp. Parasitol. 74:360 (1992). La inosina se utilizó para los residuos de las posiciones 4, 6 y 7 debido a la escasa seguridad de uso de codones para los aminoácidos correspondientes. Además, el ácido L-glutámico carboxi terminal no se incluyó para el diseño del cebador. El cebador antisentido fue un oligonucleótido de poli-timidina (oligo dT, cebador aguas abajo) que contenía un sitio para la endonucleasa de restricción XhoI.
El fragmento del gen se amplificó a partir de una preparación de ADNc de promastigotas de L. donovani utilizando las siguientes condiciones de reacción: un ciclo de 3 min a 94°C inmediatamente seguido de 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 45°C y 1 min a 72°C. El ADNc de L. donovani se preparó a partir de 5 x 107 formas promastigotas lavadas cosechadas en la fase de crecimiento log (3 días de cultivo). El ADNc se obtuvo utilizando un kit Invitrogen cDNA Cycle® (Invitrogen Co., San Diego, CA). Los cebadores oligonucleotídicos fueron sintetizados por el Laboratorio de Síntesis de ADN, Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Yale.
Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel. Se obtuvo sólo una banda de aproximadamente 300 pb. Este fragmento se clonó y su secuencia confirmó la secuencia del cebador basado en el péptido incluyendo el codón de ácido glutámico, deliberadamente no incluido en la secuencia del cebador.
El fragmento del gen amplificado por PCR se ligó en el vector pCR™ utilizando el sistema de clonación TA (Invitrogen Co., San Diego, CA). Los transformantes se seleccionaron en medio LB que contenía 100 μg/ml de ampicilina y el ADN plasmídico se aisló usando el kit de purificación de ADN Wizard™ Minipreps (Promega Co., Madison, WI). El ADN del inserto se liberó con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI (New England Biolabs, Beverly, MA), se purificó a partir de una electroforesis en gel de agarosa y se marcó con 32P utilizando un método de cebado al azar (Megaprime Labeling Kit, Amersham Life Science, Buckinghamshire, Inglaterra).
Este fragmento de ADN se utilizó como sonda para sondear una genoteca de ADNc de promastigotas de L. donovani como describen Skeiky y col., en Infect. Immun. 62:1643 (1994). Se escindió un ADNc de aproximadamente 650 pb (Ldp23) del fagémido por escisión in vivo utilizando el protocolo de Stratagene. La secuenciación del ADN se realizó utilizando el sistema Sequenase versión 2 (kit de secuenciación de ADN) en presencia o ausencia de 7-desaza-GTP (United States Biochemical Cleveland, OH). La secuencia se proporciona como el SEQ ID NO: 3, y muestra una homología completa con el fragmento de la PCR de 300 pb original. Se identificó un marco de lectura abierto de 525 pb que contenía un codón ATG que sigue las últimas 4 bases de la secuencia líder empalmada y 3 codones de terminación adyacentes a la cola de poli A. Este marco también codifica la secuencia carboxi terminal (KVFDE) (SEQ ID NO: 13) del péptido asociado con el MHC de clase II purificado. El análisis de secuencia de la secuencia de la proteína deducida reveló un sitio de glicosilación potencial (Asn-Cys-Ser) en las posiciones 68-70.
El análisis de la secuencia se realizó utilizando los programas del Grupo de Ordenadores Genéticos de la Universidad de Wisconsin y las bases de datos EMBL de secuencias de proteínas y ADN. La búsqueda de homología del gen Ldp23 con secuencias conocidas no reveló ninguna homología significativa.
C. Expresión Bacteriana y Purificación de la Proteína Recombinante
La proteína donadora del péptido L. donovani recombinante se produjo en E. coli transformada con el vector de expresión pGEX 2T en el que se había subclonado en marco el gen Ldp23. Se utilizó la PCR para subclonar el gen clonado en marco en el vector de expresión pGEX 2T. Los cebadores que contenían las enzimas de restricción apropiadas, el sitio de iniciación, y los codones de terminación fueron: 5'> GGATCC ATGGTCAAGTCCCACTACATCTGC <3' (SEQ ID NO: 14) para el cebador aguas arriba y 5'> GAATTC AGACCGGATAGAAATAAGCCAATGAAA <3' (SEQ ID NO: 15) para el cebador aguas abajo (los sitios de restricción de BamHI y EcoRI están subrayados respectivamente). Las condiciones de la PCR fueron las indicadas anteriormente para la amplificación del fragmento de ADN relacionado con el péptido original. El molde utilizado fue el plásmido pBluescript que contenía el gen clonado a partir de la genoteca de ADNc.
La expresión en exceso de la proteína de fusión recombinante se llevó a cabo mediante crecimiento de E. coli transformada (DH5α) e inducción del promotor tac con isopropil-β-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM (Stratagene, La Jolla, CA). Se recogieron las células, se centrifugaron, y se analizaron para determinar la presencia de la proteína de fusión por medio de SDS-PAGE. Se produjo una proteína de fusión glutatión-S-transferasa de 43-44 kD, indicando una proteína de Leishmania de aproximadamente 18 kD, ya que la glutatión-S-transferasa (GST) tiene un PM de 26 kD. Sin embargo, la proteína de fusión era muy insoluble y por lo tanto no pudo ser purificada mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de glutatión. El uso de bajas concentraciones de detergentes como SDS, sarcosilo, desoxicolato, y octil-glucopiranósido durante las etapas de extracción fue eficaz para solubilizar la proteína pero desafortunadamente evitó su unión a la columna de glutatión. Otras maniobras, tales como el crecimiento de la E. coli y la incubación e inducción del promotor tac con IPTG a 33°C, no mejoraron la solubilidad de las proteínas. Sin embargo, la purificación se logró mediante SDS-PAGΕ preparativa. La banda se visualizó con KCl 0,1 M, se cortó y se sometió a electroelución a partir del gel seguido de diálisis extensiva contra PBS y concentración en filtros Centricon 10.
Se obtuvieron aproximadamente 500 μg de proteína purificada. La proteína purificada se muestra en la Figura 3. En el panel A, la E. coli (DH5α) transformada con el vector de expresión pGΕX 2T que contenía el gen Ldp23 se cultivó en medio LB y se indujo el promotor tac con IPTG durante 3 horas. Las células se sedimentaron, se resuspendieron en tampón de carga y se sometieron a SDS-PAGΕ (10%) en condiciones reductoras. El gel se tiñó con azul de Coomassie. La calle 1 muestra la E. coli no inducida y la calle 2 muestra la E. coli inducida. La flecha indica la proteína recombinante. El panel B muestra la proteína preparada como en el panel A y se sometida a una SDS-PAGE preparativa. La banda correspondiente a la proteína de fusión recombinante expresada en exceso se identificó por medio de KCl, se cortó, se sometió a electroelución de la tira de gel, se sometió a diálisis frente a PBS y se sometió a SDS-PAGE analítica (12%). Los números en el lado izquierdo indican los pesos moleculares de los marcadores. Los intentos para purificar más la proteína de Leishmania mediante su escisión de la proteína de fusión GST con trombina fueron infructuosos.
D.Expresión de Ldp23
Para asegurarse de que el péptido Ldp23 se expresaba en organismos de Leishmania, se realizó un análisis de transferencia Northern utilizando ARN preparado a partir de diferentes fases de crecimiento (logarítmicas y estacionarias) de promastigotas y a partir de la forma amastigota de estos parásitos.
Se preparó el ARN a partir de 2 x 107 células de parásitos utilizando el kit de aislamiento Micro RNA (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones recomendadas por la compañía. Se preparó ARN de promastigotas de L. donovani (fase de crecimiento logarítmica); de promastigotas de L. major (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria); de L. amazonensis, tanto promastigotas (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria) como amastigotas purificados de ratones infectados CBA/J; y de L. pifanoi, tanto promastigotas (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria) como amastigotas (del medio de cultivo axénico). Los promastigotas de L. donovani (cepa 1S), L. amazonensis (MHOM/BR/77/LTB0016), L. major (MHOM/IR/79/LRC-L251) y L. pifanoi (MHOM/VE/60/Ltrod) se hicieron crecer y se mantuvieron a 26°C en medio de Schneider que contenía FCS al 20% y 50 μg/ml de gentamicina. Las formas amastigotas de L. amazonensis fueron obtenidas por centrifugación diferencial de una lesión de la almohadilla plantar "de tipo purulento" de un ratón CBA/J infectado durante 6 meses con este parásito. Se obtuvieron amastigotas de L. pifanoi de cultivo axénico como informaron previamente Pan et al., en J. Euk. Microbiol. 40:213 (1993).
La hibridación se llevó a cabo a 45°C en presencia de formamida al 50%, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,1%,
100 μg/ml de ADN de esperma de salmón de hebra sencilla y 5x SSPE utilizando filtros de membrana de Nytran de 0,45 μm (Schleicher & Schuell, Keene, NH). La sonda fue el gen Ldp23 marcado con 32P.
La Figura 4 muestra que se observó una sola banda de ARN de 680 pb para todas las fases de crecimiento y formas de todas las Leishmania sometidas a ensayo. En la figura 4, los números 1, 2 y 3 se refieren al ARN obtenido de promastigotas en la fase de crecimiento logarítmico, promastigotas en la fase de crecimiento estacionario y formas amastigotas, respectivamente, y los números del lado izquierdo indican los pesos moleculares de los marcadores en pares de bases. Este resultado es coherente con el tamaño de gen correspondiente (525 bp) y con el peso molecular de la proteína expresada y los puntos para la distribución ubicua y la expresión de este gen en el género Leishmania.
E. Inducción de la Respuesta de Anticuerpos anti-L. donovani en Ratones y Conejos por Medio de Proteína Recombinante Purificada
Con el fin de evaluar la inmunogenicidad de la proteína de Leishmania recombinante, y para investigar su expresión en los parásitos, se inmunizaron los ratones y los conejos con la proteína de fusión GST en CFA. Los ratones BALB/c se inmunizaron en la almohadilla plantar trasera con 5-10 μg de proteína emulsionada en CFA. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Los ratones fueron reforzados 7 días más tarde con 5-10 μg de proteína emulsionada en coadyuvante incompleto de Freund (IFA) inoculado en la cavidad peritoneal. Los ratones se desangraron 7 días después de la segunda inmunización. Los conejos blancos New Zealand (Millbrook Farm, Amherst, MA) se inmunizaron de acuerdo con el siguiente protocolo: una inyección intra-muscular (IM) de 25-30 μg de proteína recombinante purificada emulsionada en CFA en cada muslo el día uno; una inyección IM de 25-30 μg de proteína purificada emulsionada en CFA en cada hombro el día 7; el día 15, se inyectaron 25-30 μg de la proteína purificada en PBS en el tejido subcutáneo. El conejo se desangró 7 días después de la última inmunización.
Se prepararon los sueros y se midió la respuesta de anticuerpos anti-Leishmania se midió por análisis de transferencia Western y por FACScan. En ambos casos se utilizaron promastigotas de L. donovani como antígeno. Se cultivaron aproximadamente 2 × 106 promastigotas de L. donovani en medio de Schneider durante 3 días (fase log), se lavaron con PBS, se lisaron con tampón de carga de SDS-PAGE y se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras utilizando un gel de poliacrilamida al 15%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P de 0,45 μ (Millipore Co., Bedford, MA) utilizando un electroblotter de tipo húmedo (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, Bio Rad Life Science Division, Richmond, CA) durante 2 horas a 50 V. Las membranas se bloquearon durante la noche a temperatura ambiente con PBS que contenía suero normal de cabra al 3% (NGS), Tween-20 al 0,2% y azida de sodio al 0,05%, seguido de 3 lavados con PBS. Las transferencias se incubaron después durante 3-4 horas a 4°C con una dilución 1/200 de suero de conejo preinmune (calle A, Figura 5)
o con la misma dilución de antisuero anti-proteína de fusión de conejo (calle B, Figura 5). El suero se absorbió previamente 2 veces con H-37 RA de Mycobacterium tuberculosis no viable desecado (Difco Laboratories, Detroit, MI) y se diluyó en PBS que contenía NGS al 1% y leche de vaca en polvo desnatada al 5% (Carnation, Nestlé Food Company, Glendale, CA). Las membranas se lavaron a continuación con PBS, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI), se lavaron una vez con PBS y 2x con tampón veronal pH 9,4. La reacción se visualizó utilizando la mezcla de sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato y nitroazul de tetrazolio (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La Figura 5 muestra que el antisuero anti-proteína recombinante de conejo detecta una sola proteína de 23 kDa (Ldp23) en la preparación de antígeno de extracto bruto de Leishmania. No se observaron bandas cuando se utilizó un antisuero anti-GST (no mostrado). Además, el análisis FACScan (Figura 6) muestra que el anticuerpo inducido por Ldp23 recombinante reacciona con promastigotas intactos vivos de L. donovani, lo que apunta a una expresión en la superficie celular de esta molécula sobre estos organismos. La línea discontinua de la Figura 6 muestra la inmunofluorescencia indirecta realizada utilizando suero pre-inmune del ratón y la línea continua de la Figura 6 muestra el resultado obtenido con el antisuero anti-GST-Ldp23 de ratón. Ambos sueros se diluyeron a 1/100. Los parásitos se lavaron con tampón de tinción y se incubaron con anticuerpo inmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugado con FITC. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante FACScan.
F.Reconocimiento de Ldp23 Recombinante por Células T de Nódulos Linfáticos Específicas de Leishmania
Para someter a ensayo la respuesta de las células T a la proteína Ldp23, se realizaron dos series de experimentos. En el primer experimento, se estimularon las células T de ganglios linfáticos (105/pocillo) de ratones BALB/c inmunizados con promastigotas de L. donovani (como se describió anteriormente) para que proliferaran con 2 x 105 células de bazo mononucleares tratadas con Mitomicina C (APC) y se pulsaron con la proteína de fusión recombinante purificada. Se midió la proliferación de las células T a las 72 horas de cultivo. Los valores se expresan en la Figura 7 como cpm y representan la media de incorporación de [3H]TdR de cultivos por triplicado. Las cpm del fondo de las células (células T + APC) cultivadas en presencia de medio solo fueron 1291. Figura 7 muestra que las células T específicas de Leishmania proliferan bien y de una manera dosis-respuesta a Ldp23 recombinante. No se observó respuesta cuando se añadió GST purificado en lugar de la proteína de fusión recombinante ni cuando las células T de ganglios linfáticos de los ratones inmunizados con CFA solo fueron estimuladas para que proliferaran en presencia de la proteína de fusión de Leishmania (no mostrado).
El reconocimiento de la proteína Ldp23 recombinante por células T específicas de Leishmania también se sometió a ensayo utilizando dos modelos murinos de la leishmaniasis, los ratones BALB/c altamente susceptibles a L. major y los ratones CBA/J susceptibles a L. amazonensis como describen Champsi y McMahon-Pratt, Infect. Immun.
56:3212 (1988). Estos modelos fueron seleccionados para investigar el patrón de citoquina inducido por Ldp23. En el modelo de ratón de leishmaniasis, la resistencia está asociada con las citoquinas Th 1 mientras que la susceptibilidad está relacionada con las respuestas Th 2.
Se obtuvieron células de nódulo linfático 3 semanas después del inicio de la infección de ratones BALB/c con L. major y se midió la capacidad de estas células para reconocer Ldp23 recombinante mediante la proliferación y la producción de las citoquinas IFN-γ e IL-4. Se cultivaron 2 x 106 células obtenidas del ganglio linfático de drenaje poplíteo de los ratones infectados durante 72 horas en presencia de Ldp23 recombinante o producto lisado de Leishmania. Los niveles de IFN-γ e IL-4 en los sobrenadantes de cultivo se midieron por medio de ELISA como se describió previamente (Chatelain et al., J. Immunol. 148:1172 (1992), Curry et al., J. Immunol. Meth. 104:137 (1987), y Mossman y Fong, J. Immunol Meth 116:151 (1989)) utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-γ y anti-IL-4 (PharMingen, San Diego, CA).
Ldp23 estimuló la proliferación de estas células (no mostrado) e indujo una respuesta de citoquinas de tipo Th 1 típica como indicó la producción de altos niveles de IFN-γ (panel A de la Figura 8) y no de IL-4 (panel B de la Figura 8). La estimulación de estas células con un producto lisado bruto de Leishmania produjo un perfil de citoquina Th mixto. Se obtuvo exactamente el mismo patrón de producción de citoquinas en los ratones CBA/J infectados con L. amazonensis (no mostrado). Estos resultados indican claramente que Ldp23 es un activador potente y selectivo de las citoquinas Th 1 por células de ratón.
Ejemplo 3
Preparación de Hsp83
Este ejemplo ilustra la preparación de un antígeno Hsp83 de Leishmania, que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO:. 6
Se construyó una genoteca de expresión genómica con ADN cortado de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) en el bacteriófago λZAP II (Stratagene , La Jolla, CA). La genoteca de expresión se escrutó con suero preadsorbido de Escherichia coli de un individuo infectado con L. braziliensis con LM. Las placas inmunoreactivas se purificaron y el fagémido pBSK(-) se escindió mediante los protocolos sugeridos por el fabricante. Se llevaron a cabo las deleciones anidadas con exonucleasa III para generar deleciones solapantes para las preparaciones del molde de hebra sencilla y la secuenciación. Los moldes monocatenarios se aislaron después de la infección con el fago coadyuvante VCSM13 según lo recomendado por el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenciaron mediante el método de terminación de cadena didesoxi o por el sistema de terminación Taq Dye utilizando el secuenciador automático Applied Biosystems modelo 373A.
Los antígenos recombinantes producidos por estos clones se purificaron a partir de 500 ml de cultivos inducidos con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) como describen Skeiky y col., J. Exp.. Med. 176:201-211 (1992). Estos antígenos se analizaron a continuación para determinar la capacidad para estimular en PBMC de individuos infectados por Leishmania la proliferación y secreción de citoquinas. La sangre periférica se obtuvo de individuos que vivían en una zona (Corte de Pedra, Bahía, Brasil), donde L. braziliensis es endémica y donde se han llevado a cabo estudios epidemiológicos, clínicos e inmunológicos durante más de una década, y las PBMC se aislaron a partir de sangre total mediante centrifugación por gradiente de densidad a través de Ficoll (Winthrop Laboratories, New York, NY). Para los ensayos de proliferación in vitro, se cultivaron de 2 X 105 a 4 X 105 células por pocillo en medio completo (RPMI 1640 con un suplemento con gentamicina, 2-mercaptoetanol, L-glutamina y suero humano A+ escrutado agrupado al 10%; Trimar, Hollywood, Calif.) en placas de fondo plano de 96 pocillos con o sin 10 µg de los antígenos indicados por ml o 5 µg de fitohemaglutinina por ml (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) durante 5 días. Las células se pulsaron a continuación con 1 µCi de [3H-timidina] para las 18 h finales de cultivo. Para la determinación de la producción de citoquinas se cultivaron de 0,5 a 1 ml de PBMC de 1 X 106 a 2 x 106 células por ml con o sin los antígenos de Leishmania durante 48 y 72 h.
Los sobrenadantes y las células se recogieron y analizaron para determinar las citoquinas o los ARNm de citoquinas secretados. Las alícuotas de los sobrenadantes se analizaron para determinar el interferón gamma (IFN-γ), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), la interleuquina-4 (IL-4), y la IL-10 como describen Skeiky y col., J. Exp.. Med. 757:1527-1537 (1995). Para el análisis PCR del ARNm de las citoquinas, se aisló el ARN total de las PBMC y se sintetizó el ADNc utilizando poli(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ) y transcriptasa inversa de virus de la micloblastosis aviar. Después de la normalización para la β-actina, el ADNc diluido se amplificó mediante PCR utilizando polimerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) con concentraciones 0,2 µM de los cebadores externos 5' y 3' respectivos en un volumen de reacción de 50 µl. Las secuencias de nucleótidos de los pares primarios y las condiciones de PCR utilizadas fueron las descritas por Skeiky y col., J. Exp.. Med. 181:1521-1531 (1995). Los autores de la presente invención verificaron que sus condiciones de PCR estuvieran dentro del rango semicuantitativo realizando inicialmente diluciones en serie de los ADNc y variando el número de ciclos utilizados para la PCR. Se digirieron los plásmidos que contenían las secuencias humanas para IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, y βactina, y los insertos de ADN se purificaron después de la separación en geles de agarosa al 1%. Se prepararon sondas radiomarcadas con 32P mediante el método de cebado al azar. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5%, se transfirieron a membranas de nailon, y se sondearon con el inserto de ADN marcado con 32P apropiado.
Se identificó un clon recombinante en los ensayos anteriores que, tras la comparación de la secuencia de su secuencia de aminoácidos pronosticada con secuencias de otras proteínas, se identificó como un homólogo de Leishmania braziliensis de la proteína de choque térmico eucariótica de 83 kD (Lbhsp83). La secuencia del clon se proporciona en el SEQ ID NO: 5 y la secuencia de la proteína deducida se proporciona en el SEQ ID NO: 6. Sobre la base de la homología, este clon, designado Lbhsp83a, parece carecer de los primeros 47 residuos de la longitud completa de 703 residuos de aminoácidos. Lbhsp83 tiene una homología global de 94% (91% de identidad y 3% de sustituciones conservativas), 91% (84% de identidad y 7% de sustituciones conservativas) y 77% (61% de identidad y 16% de sustituciones conservativas) con hsp83 de L. amazonensis, hsp83 de T. cruzi y hsp89 humana, respectivamente. También se aisló un segundo clon (designado Lbhsp83b), que contenía la porción C-terminal de 43 kD de hsp83 (residuos 331 a 703). La Figura 19 presenta una comparación de la secuencia de Lbhsp83 con hsp83 de L. amazonensis (Lahsp83), hsp83 de T. cruzi (Tchsp83) y hsp89 humana (Huhsp89).
Los resultados de los ensayos de proliferación utilizando Lbhsp83a se muestran en la Tabla 1. Las células de todos los pacientes con leishmaniasis mucosa (LM) proliferaron fuertemente en respuesta a Lbhsp83a, con índices de estimulación (IE) de 19 a 558 (en comparación con 20 a 1.634 para el producto lisado de parásitos). La proliferación de PBMC de leishmaniasis cutánea (LC) de los pacientes fue variable y excepto por los niveles en dos pacientes (IV y VII), los niveles fueron significativamente inferiores a los de pacientes con LM. En comparación, las respuestas proliferativas de los individuos con LC autocurable a Lbhsp83a fueron similares a las de los individuos con LM. Sin embargo, las respuestas de los seis de individuos autocurables a Lbhsp83 fueron consistentemente más altos que los de Lbhsp83b. Esto sugiere que las PBMC de pacientes con LC autocurable reconocen preferentemente uno o más epítopos de células T localizados dentro de la porción amínica de Lbhsp83.
Tabla 1
Proliferación in vitro de PMBC de Individuos Infectados por L. braziliensis en Respuesta a Lbhsp83
Incorporación de [3H]timidina media [103 cpm (DT)], SI con: ______________________________________________________________ Grupo y Paciente Producto Lisado Lbhsp83a Lbhsp83b
LM I 41,3, (1,3), 2942,5, (6,6), 22146,7, (1,4), 318 II44,2, (0,5), 10420, (3,7), 4736,7, (0,76), 86 III27,4, (1,5), 1508,1, (1,7), 449,9, (0,32), 54 IV52,7, (3,3), 13854,1, (6,2), 14232,0, (1,3), 84 V140,6, (7,6), 308151,8, (57), 333150,4, (7,9), 331 VI15,8, (1,8), 2021,3, (4,4), 2814,4, (1,3), 19 VII300,1, (9,4), 1634102,1, (7,6), 55841,7, (4,9), 228
LC I0,26, (0,0), 1,50,57 (0,3), 3,30,43 (0,17), 3,3 II55,63, (8,6), 2180,42, (0,0), 1,60,8, (0,14), 3,2 III0,39, (0,5), 4,0 3,4, (0,5), 9 2,6, (0,9), 6,6 IV19,14, (1,3), 877,17, (0,6),325,9, (0,9), 27 V0,32, (0,2), 3,01,47, (0,5), 140,3, (0,1), 3,0 VI0,77, (0,1), 4,71,44, (0,2), 91,3, (0,6), 8,0 VII4,01, (1,0), 2,060,3, (8,5), 1566,7, (3,9), 16,6
LC autocurable I19,7, (4,4), 9461,3, (4,6), 293 5,0, (2,0), 24 II 0,6, (0,1), 6,5 7,0, (2,0), 79 1,2, (0,8), 13 III 59,6, (7,1), 519 49,4, (3,1), 429 21,4, (3,7), 186 IV 0,2, (0,1), 1,6 13,1, (1,7), 108 0,6, (0,1), 5 V 27,1, (2,0), 225 6,3, (2,6), 52 3,0, (1,5), 25 VI 130,3, (14), 340 28,2, (2,9), 74 7,7, (3,8), 20
Control (no infectados) I 0,19, (0,0), 1,4 0,18 (0,0), 1,3 0,40 (0,16), 2,8 II 0,31, (0,1), 1,7 0,19, (0,0), 1,0 0,27, (0,0), 1,5 III 0,44, (0,2), 4,1 0,48 (0,1), 5,0 0,51 (0,2), 5,2 IV 0,4, (0,1), 3,2 0,52, (0,2), 5,1 0,50, (0,1), 5,0
Un análisis más detallado de los patrones de citoquinas de PBMC de pacientes con LM se realizó mediante PCR de transcriptasa inversa. Los ARNm de citoquinas se evaluaron en las células antes del cultivo (Figura 9, calles O) o después del cultivo siguiente en ausencia (calles -) o presencia del antígeno indicado para 48 y 72 h. La Figura 4A muestra los resultados para cinco de los seis pacientes con LM cuyas PBMC fueron analizadas. En aproximadamente la mitad de los pacientes con LM, las PBMC no cultivadas (en reposo) tuvieron niveles detectables de ARNm para IFN-γ, IL-2 e IL-4 pero no para IL-10. Las PBMC del paciente con LC, sin embargo, tuvieron ARNm de IL-10 en el estado en reposo además de ARNm para las otras citoquinas sometidas a ensayo (Figura 4B). Tras el cultivo in vitro sin antígeno, los niveles de ARNm para IFN-γ, IL-2 e IL-4 en células en reposo de pacientes con LM disminuyeron a los niveles de fondo, mientras que los niveles de ARNm de IL-10 aumentaron. En contraste, en la mayoría de las PBMC de pacientes con LC tuvieron niveles de ARNm de IL-10 estables o aumentados, mientras que los ARNm para IL-2, IFN-γ, e IL-4 se redujeron a niveles apenas detectables en ausencia de estimulación con antígenos.
En PBMC de tres pacientes LM, la estimulación con producto lisado dio como resultado el aumento de la expresión de ARNm para IFN-γ, IL-2 e IL-4 pero no para IL-10. En comparación, ambos polipéptidos Lbhsp83 provocaron la producción de ARNm para IFN-γ e IL-2 a partir de todas las PBMC de pacientes con LM sometidas a ensayo. En contraste, los perfiles de ARNm para IL-10 y IL-4 fueron diferentes para los dos polipéptidos hsp83. Lbhsp83a estimuló la producción de ARNm de IL-10 pero no de IL-4 (pacientes I, II, III, y IV), mientras que Lbhsp83b estimuló la producción de ARNm de IL-4 pero no de IL-10 en los seis pacientes.
Todos los pacientes con LC sometidos a ensayo respondieron a ambos polipéptidos Lbhsp83 así como al producto lisado de parásito por regulación al alza de la síntesis de ARNm para IL-2 e IFN-γ, y en dos de cuatro pacientes (I y IV), el nivel de IL-4 ARNm también aumentó, indicando estimulación de ambas citoquinas Th1 y Th2. Curiosamente y como en el caso de PBMC no cultivadas de pacientes con LM que no tenían niveles detectables de ARNm de IL10, Lbhsp83a y no Lbhsp83b estimuló las PBMC de un paciente (IV) con LC para sintetizar ARNm de IL-10. Sin embargo, en los otros tres pacientes (I, II, y III) con niveles de reposo de ARNm de IL-10, ambos polipéptidos rLbhsp83 así como el producto lisado de parásitos regularon a la baja la expresión de ARNm de IL-10.
También se sometieron a ensayo los sobrenadantes de PBMC para determinar la presencia de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 secretadas. Las células de todos los pacientes con LM y LC autocurable (siete y seis pacientes, respectivamente) y de cuatro de siete pacientes con LC se analizaron para determinar el IFN-γ secretado después de la estimulación con ambos polipéptidos rLbhsp83, producto lisado de parásitos y Lbhsp70, una proteína de L. braziliensis homóloga a la proteína de choque térmico eucariótica de 70 kD (Figura 10A). En general, las PBMC paciente estimuladas con rLbhsp83a secretan niveles de IFN-γ más altos de lo que lo hace rLbhsp83b (0,2 a 36 y 0,13 a 28 ng/ml, respectivamente). La presencia de IFN-γ secretado se correlacionó bien con el ARNm correspondiente detectado mediante PCR.
Las PBMC de cuatro de cinco pacientes (I, II, V, y VII) con LM tuvieron niveles (0,8 a 2,2 ng/ml) de TNF-α en el sobrenadante más altos que los detectados en cultivos de PBMC de controles no infectados después de la estimulación con producto lisado de parásito (Figura 10B). De manera similar, las mismas PBMC fueron estimuladas por rLbhsp83 para producir niveles de TNF-α en el sobrenadante que oscilaban de 0,61 a 2,9 ng/ml. En comparación con las de los controles no infectados, las PBMC de tres (I, V, y VI), cinco (I, II, IV, V, y VI), y dos (II y V) de seis individuos analizados produjeron niveles superiores de TNF-α en respuesta a producto lisado de parásito, rLbhsp83a y rLbhsp83b, respectivamente. Los niveles de TNF-α producidos por PBMC de pacientes con LC en respuesta a producto lisado de parásito fueron comparables a los producidos por controles no infectados. Sin embargo, rLbhsp83 estimuló la producción de TNF-α en las PBMC de dos de estos pacientes. rLbhsp83a estimuló niveles superiores de producción de TNF-α a los que logró rLbhsp83b. En ausencia de estimulación de antígeno, solo las PBMC de pacientes con LM (cinco de seis) produjeron niveles detectables de TNF-α en el sobrenadante (60 a 190 pg/ml).
De acuerdo con el ARNm de IL-10, IL-10 se detectó mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo de PMBC estimulados con antígeno de pacientes con LM y LC. Los niveles (49 a 190 pg) fueron significativamente superiores (hasta 10 veces) tras la estimulación con rLbhsp83a en comparación con los posteriores a la estimulación paralela de las mismas células con rLbhsp83b (Figura 11). El producto lisado de parásito también estimuló las PMBC de algunos de los pacientes para producir IL-10. Aunque rLbhsp83 estimuló las PMBC de individuos no infectados para producir IL-10, con una excepción, los niveles fueron inferiores a los observados con PMBC de paciente. No se detectó IL-4 en ninguno de los sobrenadantes analizados. Por lo tanto, el nivel de cualquier IL-4 secretada está por debajo del límite de detección del ELISA empleado (50 pg/ml). Tomados en conjunto, los resultados demuestran que un perfil de citoquinas de tipo Th1 predominante está asociado con PMBC de individuos infectados por L. braziliensis después de la estimulación con polipéptidos rLbhsp83.
Para determinar la correlación entre las respuestas de células T observadas y producción de anticuerpos contra Lbhsp83, los autores de la presente invención compararon las reactividades del anticuerpo (inmunoglobulina G) contra Lbhsp83 en sueros de los tres grupos de pacientes (Figura 12). Las reactividades de ELISA de sueros de pacientes con LM con rLbhsp83a fueron comparables a las observadas con producto lisado de parásitos, y en general, hubo una correlación directa entre el título de anticuerpos anti-Lbhsp83 del paciente con LM y la proliferación de células T. De 23 muestras de suero de pacientes con LM analizadas, 22 fueron positivas (~96%) con valores de absorbancia de 0,20 a >3,0. Once de las muestras de suero de pacientes con LM tuvieron valores de densidad óptica que fueron > 1. En general, los pacientes con LC tuvieron títulos de anticuerpos anti-Lbhsp83 significativamente más bajos ẋ = 0,74; error típico de la media [ETM] = 0,1) en comparación con aquellos de pacientes con LM. Por lo tanto, los títulos de anticuerpos anti-rhsp83 de pacientes con LM y LC se correlacionaban con sus respectivas respuestas proliferativas de células T. Los títulos de anticuerpos anti-rLbhsp83 fueron significativamente superiores en pacientes con LM (ẋ = 1,5;. ETM = 0,2) que en pacientes con LC autocurable (ẋ = 0,35; ETM = 0,056), aunque sus respuestas de células T proliferativas fueron similares. De hecho, los títulos de anticuerpos anti-Lbhsp83 en el suero de pacientes con LC autocurable fueron comparables a los de los controles no infectados (ẋ = 0,24; ETM = 0,028). Mediante el uso de 2 desviaciones típicas mayores que el valor de absorbancia medio del control no infectado (0,484) como un criterio de reactividad positiva contra Lbhsp83, ocho de nueve de las muestras de suero de los pacientes autocurables analizadas fueron negativas.
Ejemplo 4
Preparación de clones que codifican LT-210
Este ejemplo ilustra la preparación de clones que codifican porciones del antígeno Lt-210 de Leishmania, y que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO: 8.
Se construyó una genoteca de expresión a partir de ADN genómico de L. tropica (MHOM/SA/91/WR1063C). El ADN se aisló solubilizando promastigotas de L. tropica en Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, EDTA 50 mM, SDS al 1% y tratando
con 100 μg/ml de RNasa A y 100 μg/ml de proteinasa K. La muestra se extrajo sucesivamente con un volumen igual
de fenol, fenol:cloroformo (1:1), y cloroformo. El ADN se precipitó mediante la adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol del 95%. El precipitado se resuspendió en Tris 10 μM, EDTA 1 mM. El ADN se cortó mediante paso a través de una aguja de calibre 30 a un intervalo de tamaño de 2-6 kilobases, y se reparó mediante incubación con ADN PolI en presencia de DATP, dCTP, dGTP, y dTTP 100 mM cada uno. Se ligaron adaptadores de EcoRI a los fragmentos de ADN. Después de la eliminación de los adaptadores no ligados mediante el paso sobre una columna Sephadex™ G-25, los fragmentos se insertaron en lambda ZAPII cortado con EcoRI (Stratagene, La Jolla, CA).
Se sembraron aproximadamente 43.000 ufp y se escrutaron con sueros aislados de pacientes con leishmaniasis viscerotrópica (VTL). Los sueros de pacientes con VTL fueron recibidos de los Dres. M. Grogl y A. Magill. El grupo de pacientes con VTL incluyó ocho individuos de los que se aislaron y cultivaron los parásitos, siete de los cuales habían confirmado la infección por L. tropica. Otros cuatro pacientes fueron negativos para los cultivos, pero aún se consideraron que estaban infectados basándose en cualquiera de los análisis de PCR o un frotis de anticuerpo monoclonal positivo (Dr. Max Grogl, comunicación personal). Las muestras de suero de los 11 pacientes infectados se agruparon y se eliminó la reactividad anti-E. coli mediante cromatografía de afinidad (Sambrook et al., más arriba, págs. 12.27 a 12.28). Los fagos lambda que expresaban proteínas reactivas se detectaron después de la unión del anticuerpo por la proteína A-peroxidasa de rábano picante y el sustrato ABTS.
Se identificaron y purificaron tres clones, Lt-1, Lt-2, y Lt-3, que contenían una porción del gen Lt-210. Los clones oscilaron de un tamaño de 1,4 a 3,3 kb y los polipéptidos codificados de 75 kD, 70 kD, y 120 kD, respectivamente. Estos tres clones contenían secuencias parciales del gen Lt-210. Lt-1 y Lt-2 son clones solapantes y se eligieron para su estudio adicional.
Se determinaron las secuencias de ADN de Lt-1 y Lt-2. Se utilizó la digestión con Exonucleasa III para crear deleciones solapantes de los clones (Heinikoff, Gene 28:351-359, 1984). Se preparó un molde de hebra sencilla y la secuencia se determinó con un secuenciador automático Applied Biosystems modelo 373A o mediante secuenciación didesoxi de Sanger. Se determinó la secuencia de las dos hebras de la porción codificante del clon Lt
1. Se determinó la secuencia parcial de una cadena del clon Lt-2.
El SΕQ ID NO: 7 presenta la secuencia de ADN de Lt-1, y el SΕQ ID NO: 8 proporciona la secuencia de aminoácidos pronosticada del marco de lectura abierto. La secuencia de ADN de la porción codificante del clon Lt-1 incluye una secuencia de nucleótidos repetida en la porción 5' del clon que contiene ocho copias de una repetición de 99 pb, tres copias de una unidad repetitiva de 60 pb, que forma parte de la repetición de 99 pb más grande, y 800 pb de la secuencia no repetida. La secuencia de aminoácidos deducida de la repetición de 99 pb contiene degeneraciones limitadas. La masa de la proteína recombinante pronosticada es de 67.060 Daltons. Una búsqueda en la base de datos de PIR con la secuencia de aminoácidos pronosticada del marco de lectura abierto no produjo una homología significativa con las secuencias previamente presentadas. La estructura secundaria pronosticada de la porción de repetición del clon es completamente α-helicoidal.
El análisis de la secuencia de Lt-2 reveló que la porción 3' del clon consistía en una mezcla de repeticiones de 60 y 99 pb que eran idénticas, exceptuando degeneraciones ocasionales, a las repeticiones de 60 y 99 pb observadas en Lt-1. Colectivamente, los datos de secuenciación sugieren que Lt-1 y Lt-2 son diferentes porciones del mismo gen, estando Lt-2 aguas arriba de Lt-1, posiblemente con una pequeña superposición.
El análisis de hibridación confirmó que rLt-2 y rLt-1 contienen secuencias solapantes. Los ADN genómicos de diversas especies de Leishmania se restringieron con una variedad de enzimas, separadas por electroforesis en gel de agarosa, y se transfirieron sobre un filtro de membrana Nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Insertos de rLt1 y rLt-2 se marcaron con 32P-CTP mediante transcriptasa inversa a partir de cebadores de oligonucleótidos al azar y se utilizaron como sondas después de la separación a partir de los nucleótidos no incorporados en una columna Sephadex G-50. Se realizaron hibridaciones utilizando la sonda rLt-1 o rLt-2 en NaH2PO4 0,2 M/NaCl 3,6 M a 65°C, mientras se realizaba la hibridación utilizando la sonda rLt-lr en NaH2PO4 0,2 M/NaCl 3,6 M/EDTA 0,2 M a 60°C durante la noche. Los filtros se lavan en NaCl 0,075 M/citrato de sodio 0,0075 M pH 7,0 (NaCl0,15 M/citrato de sodio 0,0150 M para la sonda de Lt-lr), más SDS al 0,5% a la misma temperatura que la hibridación.
Se analizaron ADN genómicos de varias especies de Leishmania incluyendo L. tropica mediante transferencias Southern como se ha descrito anteriormente usando los insertos Lt-1, Lt-2, y Lt-lr por separado como sondas. Colectivamente, varias digestiones de ADN de L. tropica indican que este gen tiene un número bajo de copias. Se observó un patrón de solapamiento similar, utilizando el inserto Lt-1 o Lt-2 como sonda, coherente con la premisa de que estos dos clones contienen secuencias cercanas o que se solapan entre sí. Además, las secuencias que hibridan con estos clones están presentes en otras especies de Leishmania.
Los productos aislados de L. tropica tienen heterogeneidad limitada. Se realizaron análisis Southern del ADN genómico digerido de cuatro cepas de parásito L. tropica aisladas de pacientes con VTL y tres cepas de parásitos L. tropica aisladas de casos de LC (dos humanos, un canino). El inserto Lt-lr descrito a continuación se marcó y se utilizó como sonda. Los siete productos aislados de L. tropica diferentes produjeron intensidades y patrones de restricción similares, solo con un único polimorfismo de longitud de fragmento de restricción entre los productos aislados. Estos datos, junto con los análisis Southern con enzimas adicionales, indican heterogeneidad limitada en esta región entre los productos aislados de L. tropica.
Las proteínas recombinantes de Lt-1 y Lt-2 se expresaron y purificaron. El conjunto de deleciones anidadas de Lt-1 formado por secuenciación incluyó un clon denominado Lt-lr, que contiene una y un tercio de repeticiones. Este polipéptido también se expresó y purificó. Se llevó a cabo la escisión in vivo del fagémido pBluescript SK- de Lambda Zap II de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las partículas virales de fagémidos se utilizaron para infectar E. coli XL-1 Blue. La producción de proteína se indujo mediante la adición de IPTG. La proteína se recuperó lisando en primer lugar sedimentos de bacterias inducidas en tampón (LB, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, ΕDTA 10 mM) usando una combinación de lisozima (750 μg/mL) y sonicación. Se recuperaron rLt-1, rLt-2, y rLt-lr a partir de los cuerpos de inclusión después de la solubilización en urea 8M (rLt-1 y rLt-2) o urea 4M (rLt-lr). Las proteínas rLt-1 y rLt-2 fueron enriquecidas y separadas por precipitación con sulfato de amonio 25%-40% y rLt-lr fue enriquecido mediante precipitación con sulfato de amonio al 10%-25%. Las proteínas se purificaron adicionalmente mediante electroforesis en gel preparativa de SDS al 10%-PAGΕ. Las proteínas recombinantes se eluyeron de los geles y se dializaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La concentración se midió mediante análisis BCA Pierce (Rockford, IL), y la pureza se evaluó mediante tinción con azul de Coomassie después de la SDS-PAGE.
Ejemplo 5
Preparación de LbeIF4A
Este ejemplo ilustra la clonación molecular de una secuencia de ADN que codifica el antígeno ribosómico LbeIF4A de L. braziliensis.
Se construyó una genoteca de expresión genómica con ADN cortado de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) en el bacteriófago λZAPII (Stratagene, La Jolla, CA). La genoteca de expresión se escrutó con sueros de paciente preadsorbidos con E. coli de un individuo infectado por L. braziliensis con leishmaniasis mucosa. Las placas que contenían los antígenos recombinantes inmunoreactivos se purificaron, y el fagémido pBSK(-) se escindió utilizando los protocolos del fabricante. Se realizaron las deleciones anidadas con Exonucleasa III para generar deleciones solapantes para preparaciones de moldes de hebra sencilla y la secuenciación. Los moldes de hebra sencilla se aislaron después de la infección con el fago auxiliar VCSM13 según lo recomendado por el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenciaron mediante el método de terminación de cadena didesoxi o mediante el sistema de terminación con colorante Taq utilizando el Secuenciador Automático Applied Biosystems modelo 373A.
Los antígenos recombinantes inmunorreactivos se analizaron a continuación en ensayos con células T de pacientes para determinar su capacidad de estimular una producción proliferativa y de citoquina, como se describe más adelante en los Ejemplos 7 y 8.
En los ensayos anteriores se identificó un clon recombinante que, tras la comparación de secuencia de su secuencia de aminoácidos pronosticada con secuencias de otras proteínas, se identificó como un homólogo del factor de iniciación eucariótico 4A (eIF4A) de Leishmania braziliensis. El clon aislado (pLeIF.1) carecía de los primeros 48 residuos de aminoácidos (144 nucleótidos) de la secuencia de la proteínas completa. El inserto pLeIF.1 se utilizó con posterioridad para aislar la secuencia genómica completa.
El SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de nucleótidos completa del polipéptido LbeIF4A completo. El marco de lectura abierto (nucleótidos 115 a 1323) codifica una proteína de 403 aminoácidos con un peso molecular pronosticado de 45,3 kD. Una comparación de la secuencia de proteínas pronosticada de LbeIF4A con las proteínas homólogas de tabaco (TeIF4A), ratón (MeIF4A) y levadura (YeIF4A) muestra una extensa homología de secuencia, siendo los primeros 20-30 aminoácidos los más variables. Las longitudes (403, 413, 407, y 395 aminoácidos), pesos moleculares (45,3, 46,8, 46,4, y kDa 44,7), y puntos isoeléctricos (5,9, 5,4, 5,5, y 4,9) de LbeIF4A, TeIF4A, MeIF4A y YeIF4A, respectivamente, son similares. LbeIF4A muestra una homología global de 75,5% (identidad de 57%, sustitución conservativa 18,5%) con TeIF4A, 68,6% (identidad de 50%, sustitución conservativa 18,6%) con MeIF4A y 67,2% (identidad de 47,6%, sustitución conservativa 19,6%) con YeIF4A.
Ejemplo 6
Preparación de Antígenos Solubles de Leishmania
Este ejemplo ilustra la preparación de antígenos solubles de Leishmania de un sobrenadante de cultivo de L. major. Se cultivaron promastigotas de L. major hasta la fase logarítmica tardía en medio complejo con suero hasta que se alcanzó una densidad de 2-3 x107 organismos viables por mL de medio. Los organismos se lavaron concienzudamente para eliminar componentes del medio y se resuspendieron a 2-3 x 107 organismos viables por mL de medio sin suero definido consistente en partes iguales de RPMI 1640 y medio 199, ambos de Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Al cabo de 8-12 horas, se eliminó el sobrenadante, se concentró 10 veces y se dializó contra solución salina tamponada con fosfato durante 24 horas. La concentración de proteína se determinó a continuación y la presencia de al menos ocho antígenos diferentes se confirmó mediante SDS-PAGE. Esta mezcla se denomina en la presente memoria "antígenos solubles de Leishmania."
Ejemplo 7
Comparación de la Producción de interleuquina-4 e interferón-γ Estimulada por Antígenos de Leishmania
Este ejemplo ilustra las propiedades inmunogénicas de los antígenos preparados de acuerdo con los Ejemplos 1, 2, 5 y 6, determinadas por su capacidad de estimular IL-4 e IFN-γ en cultivos de ganglios linfáticos de ratones infectados y en preparaciones de PBMC de humanas. Se prepararon cultivos de ganglios linfáticos para su uso en estos estudios a partir de ratones BALB/c infectados por L. major 10 días después de la infección, como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las PBMC se prepararon utilizando sangre periférica obtenida de individuos con infecciones por L. donovani curadas que eran inmunológicamente sensibles a Leishmania. El diagnóstico de los pacientes se realizó mediante hallazgos clínicos asociados con al menos uno de los siguientes: aislamiento de parásitos de lesiones, una prueba cutánea positiva con producto lisado de Leishmania o una prueba serológica positiva. Las personas no infectadas fueron identificadas basándose en la falta de signos o síntomas clínicos, la falta de antecedentes de exposición o de viajes a zonas endémicas, y la ausencia de una respuesta serológica o celular a los antígenos de Leishmania. La sangre periférica se recogió y las PBMC se aislaron por centrifugación de densidad a través de Ficoll™ (Winthrop Laboratories, New York).
Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a ensayo para determinar los niveles de IL-4 e IFN-γ secretados. El IFN-γ se cuantificó mediante un ELISA doble sándwich utilizando mAb de ratón anti-IFN-γ humano (Chemicon, Temucula, CA) y suero policlonal de conejo anti-IFN-γ humano. El rIFN-γ humano (Genentech Inc., San Francisco, CA) se utilizó para generar una curva convencional. La IL-4 se cuantificó en los sobrenadantes mediante un ELISA doble sándwich utilizando un mAb de ratón anti-IL-4 humana (M1) y sueros policlonales de conejo anti-IL-4 humana (P3). La IL-4 (Immunex Corp., Seattle, WA) se utilizó para generar una curva convencional que variaban de 50 pg/ml a 1 ng/ml.
Las Figuras 13A y 13B, ilustran el nivel medio de IL-4 e IFN-γ secretados, respectivamente, 72 horas después de la adición de 10 µg/mL de cada uno de los siguientes antígenos a un cultivo de ganglios linfáticos preparado como se describió anteriormente: antígeno soluble de Leishmania (es decir, un extracto preparado de promastigotas rotos que contiene membrana y antígenos internos (SLA)), Ldp23, LbeIF4A (LeIF), Lbhsp83, M15 y LmelF (el homólogo de LbeIF4A de L. major). También se muestran los niveles de IL-4 e IFN-γ secretados en medio solo (es decir, no estimulado). Mientras que los SLA producen una respuesta predominantemente Th2 de células de nódulos linfáticos de ratones infectados por Leishmania, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 y M15 produjeron cantidades de IL-4 relativamente pequeñas y grandes cantidades de IFN-γ, de acuerdo con un perfil de respuesta Th1.
La Figura 14 muestra el nivel de IFN-γ secretado en producto filtrado de cultivo de preparaciones de PBMC humanas infectadas y no infectadas 72 horas después de la adición de 10 µg/ml de producto lisado de L. major, M15
o L-Rack, un antígeno de Leishmania inmunodominante en leishmaniasis murina. De una manera similar, la Figura 15 ilustra el nivel de IFN-γ secretado en producto filtrado de cultivo de preparaciones de PBMC humanas infectadas y no infectadas 72 horas después de la adición de 10 μg/ml de producto lisado de L. major, antígenos solubles de Leishmania (preparados como se ha descrito en el Ejemplo 6) o L-Rack. Estos resultados indican que M15 y los antígenos solubles de Leishmania, pero no L-Rack, son estimuladores potentes de la producción de IFN-γ en PBMC de pacientes, pero no en PBMC obtenidas de individuos no infectados. De este modo, M15 y los antígenos solubles de Leishmania producen un perfil dominante de citoquinas Th1 en ratones y seres humanos infectados con Leishmania.
Ejemplo 8
Comparación de la Proliferación Estimulada por Antígenos de Leishmania
Este ejemplo ilustra las propiedades inmunogénicas de los antígenos preparados de acuerdo con los Ejemplos 1, 2, 5 y 6, determinadas por su capacidad para estimular la proliferación en cultivos de ganglios linfáticos de ratones infectados y en preparaciones de PBMC humanas.
Para los ensayos de proliferación in vitro, se cultivaron 2 - 4 x 105 células/pocillo en medio completo (RPMI 1640 con un suplemento de gentamicina, 2-ME, L-glutamina, y suero humano A+ agrupado escrutado al 10%; Trimar, Hollywood, CA) en placas de fondo plano de 96 pocillos con o sin 10 µg/ml de los antígenos indicados o 5 µg/ml de PHA (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) durante cinco días. Las células se pulsaron a continuación con 1 µCi de [3H]-timidina durante las últimas 18 horas de cultivo.
La Figura 16 ilustra la proliferación observada después de la adición de 10 μg/ml o 20 μg/mL de cada uno de los siguientes antígenos a un cultivo de ganglios linfáticos preparado como se ha descrito en el Ejemplo 7: SLA, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83, y M15. También se muestra el nivel de proliferación sin la adición de antígeno. Los datos se representan como cpm medias. Estos resultados demuestran que una variedad de antígenos de Leishmania son susceptibles de proliferación estimuladora de células de los ganglios linfáticos de ratones infectados por Leishmania.
Las Figuras 17 y 18 ilustran la proliferación observada en preparaciones de PBMC humanas de individuos inmunes a Leishmania y no infectados después de la adición de 10 µg/mL de M15 y antígenos solubles de Leishmania, respectivamente. Estos valores se comparan con la proliferación observada tras la adición de medio de cultivo, producto lisado de L. major o L-Rack. Los resultados muestran que M15 y los antígenos solubles de Leishmania estimulan la proliferación en PBMC inmunes a Leishmania, pero no en PBMC obtenidas de individuos no infectados, demostrando que M15 y los antígenos solubles (pero no L-Rack) son reconocidos por PBMC de individuos inmunes a Leishmania debido a una infección previa.
Ejemplo 9
Preparación de LMSP1A Y LMSP9A
Este ejemplo ilustra la preparación de dos antígenos solubles de Leishmania, Lmsp1a y Lmsp9a.
A.Purificación de Lmsp1a y Lmsp9a partir de una mezcla de antígenos solubles de L. major
Se produjo un título elevado de sueros de conejo contra antígenos solubles de L. major, preparados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6. Específicamente, un conejo blanco New Zealand se inmunizó por vía subcutánea en múltiples sitios con 180 µg de antígenos solubles de L. major en una suspensión que contenía 100 µg de muramildipéptido y coadyuvante incompleto de Freund al 50%. Seis semanas más tarde, el conejo recibió un refuerzo subcutáneo de 100 µg de la misma preparación de antígenos solubles en coadyuvante incompleto de Freund. Esto estuvo seguido de dos refuerzos intravenosos espaciados dos semanas, cada uno con 100 µg de la preparación de antígeno soluble. Los sueros se obtuvieron del conejo 11 días después del refuerzo final.
Las reactividades con anticuerpos de E. coli se eliminaron de los sueros de conejo mediante pre-adsorción sobre filtros de nitrocelulosa que contenían productos lisados de E. coli. Los sueros adsorbidos se evaluaron por medio de análisis de transferencia Western utilizando 10 µg de producto lisado de promastigota de Leishmania (calle 1) y 1 µg de mezcla de antígeno soluble de L. major (calle 2). Como se muestra en la Figura 20, se encontró que los sueros de conejo que era reactivos con siete antígenos dominantes de la mezcla de antígenos solubles de L. major con pesos moleculares que oscilaban de 18 a >200 kDa. Una exposición cuatro veces más larga de la misma transferencia reveló tres especies inmunorreactivas adicionales con pesos moleculares menores de 18 kDa. Los mismos sueros reaccionaron con aproximadamente 10 antígenos del producto lisado de promastigota, pero con un patrón significativamente diferente del observado con los antígenos solubles de L. major (Figura 20). Esto sugiere la modificación post-traduccional potencial del mismo antígeno antes (localización intracelular) y después de la secreción/circulación. Tales modificaciones pueden incluir la escisión de una secuencia líder y/o la adición de moléculas de carbohidratos a los antígenos secretados/puestos en circulación.
Los sueros de conejo descritos anteriormente se utilizaron con posterioridad para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de L. major preparada a partir de ARN de promastigotas de L. major utilizando el kit unidireccional Lambda ZAP (uni-ZAP) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se escrutaron un total de 70.000 pfu de la genoteca de ADNc amplificada con los sueros de conejo a una dilución 1:250. Se confirmaron diecinueve clones positivos en el escrutinio terciario. El fagémido se escindió y el ADN de cada uno de los 19 clones se secuenciaron utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied Biosystems División Modelo 373A. Se encontró que la totalidad de los 19 clones representan dos secuencias distintas, conocidas como Lmsp1a y Lmsp9a. Las secuencias de ADNc determinadas para Lmsp1a y Lmsp9a se proporcionan en los SΕQ ID NO: 19 y 21, respectivamente, con las secuencias de aminoácidos correspondientes se proporcionan en los SΕQ ID NO: 20 y 22,
respectivamente.
B.Caracterización de Lmsp1a y Lmsp9a
La Fig. 21 muestra el ADNc completo (SEQ ID NO: 19) y secuencia de aminoácidos pronosticada (SEQ ID NO: 20) para el antígeno Lmsp1a. El inserto EcoRI/XhoI tiene 1019 pb de largo y contiene las siguientes características: a) los últimos 17 nt de la secuencia líder empalmada característica de todos los ARNm codificados nuclearmente de Trypanosoma; b) 39 nt de la secuencia 5' no traducida; c) un marco de lectura abierto de 453 nt de longitud que codifica una secuencia deducida de 151 aminoácidos con una masa molecular pronosticada de 16.641 kDa, y d) 471 nt de la secuencia 3' no traducida que termina con una cola poli A. La secuencia de aminoácidos pronosticada contiene tres posibles sitios de fosforilación en los residuos de aminoácidos 3, 85 y 102. Además, Lmsp1a contiene una secuencia RGD en el residuo 104, una secuencia que puede jugar un papel en la invasión por parásitos de los macrófagos. Se ha demostrado que las secuencias de RGD median la unión de varias proteínas de adherencia a sus receptores de la superficie celular. No hay ninguna secuencia líder obvia (señal secretora) en la porción amino terminal lo que sugiere que la proteína podría ser puesta en circulación o excretada. Lmsp1a parece ser uno de los antígenos más abundantes encontrados en el sobrenadante de cultivo de promastigotas vivos, ya que 17 de los 19 clones contienen secuencias de longitudes variables idénticas a Lmsp1a.
La comparación de la secuencia de aminoácidos de Lmsp1a con secuencias conocidas utilizando el sistema DNA STAR (Versión 87) reveló que Lmsp1a comparte entre 65% a 70% de homología con la proteína nucleósido difosfato quinasa eucariótica, también mencionada en ratones y seres humanos como un gen inhibidor de la metástasis tumoral.
El análisis de transferencia Southern del ADN genómico de L. major (cepa Friedlander) digerido con un panel de enzimas de restricción (calles 1 a 7) y de otras seis especies de Leishmania de diferentes localizaciones geográficas digerido con PstI (calles 8 a 13) utilizando el inserto de ADNc completo de Lmsp1a, demostró que Lmsp1a está presente en todas las especies caracterizadas con un alto grado de conservación (Fig. 22). Esto sugiere la importancia evolutiva del mantenimiento de Lmsp1a y la existencia de especies homólogas entre todas las especies de Leishmania.
Los otros dos clones de ADNc aislados a partir de la mezcla de antígeno soluble de L. major representan secuencias idénticas (referida como Lmsp9a; SEQ ID NO: 21), lo que sugiere que las dos copias resultaron de la amplificación de la genoteca primaria. La secuenciación del ADNc de Lmsp9a reveló que el clon no contiene la secuencia 5' completa ya que ésta carece tanto de la secuencia líder empalmada como de la 5' no traducida. El extremo 3' del ADNc contiene un tramo poli A, como sería de esperar para un ARNm de Leishmania. De la secuencia pronosticada traducida (SEQ ID NO: 22), 34 de los 201 aminoácidos (17%) representan residuos de cisteína. La comparación de la secuencia de proteína pronosticada con las de proteínas conocidas como las descritas anteriormente, reveló alguna homología con otras proteínas ricas en cisteína tales como el antígeno de superficie principal de trofozoitos de Giardia lamblia y proteasas de tipo furina.
Ejemplo 10
Preparación y Caracterización de MAPS-1A
Este ejemplo ilustra la preparación y caracterización del antígeno de Leishmania MAPS-1A (SEQ ID NO: 24).
Se obtuvo una reserva de sueros a partir de 5 ratones BALB/c que habían recibido una inmunización primaria y dos refuerzos de sobrenadante de cultivo bruto de promastigota de L. major como se describe a continuación en el Ejemplo 12. Se demostró con posterioridad que estos ratones eran protegidos cuando se sensibilizaban con una dosis de promastigotas vivos de L. major que generalmente eran letales. Los sueros de ratón obtenidos de este modo se utilizaron para escrutar una genoteca de expresión de amastigotas de ADNc de L. major preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se aislaron varios clones serorreactivos y se secuenciaron utilizando un Secuenciador Automático Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 373A (Foster City, CA).
Se encontró que uno de estos clones, referido en la presente memoria como MAPS-1A estaba completo. La comparación de las secuencias de ADNc y de aminoácidos deducidas para los MAPS-1A (SEQ ID NOS: 23 y 24, respectivamente) con secuencias conocidas en el banco de genes utilizando el sistema DNA STAR no reveló homologías significativas con secuencias conocidas de Leishmania, aunque se encontró cierta similitud de secuencia con un grupo de proteínas, conocidas como antioxidantes específicos de tiol, que se encuentra en otros organismos.
La proteína MAPS-1A recombinante que tenía una etiqueta de HIS en el extremo amino se preparó usando un sistema de alto nivel de expresión de E. coli y la proteína recombinante se purificó mediante cromatografía de afinidad como se describe en el Ejemplo 1. El análisis de transferencia Southern de ADN genómico de L. major digerido con un panel de enzimas de restricción, otras siete especies de Leishmania digerido con PstI, y otros dos patógenos de enfermedades infecciosas (T. cruzi y T. brucei), utilizando el inserto de longitud completa de MAPS1A, demostró que MAPS-1A está presente en las ocho especies de Leishmania sometidas a ensayo (Figura 23). El análisis de transferencia Northern de los ARN de promastigotas y amastigotas de L. major indicó que los MAPS-1A se expresa constitutivamente.
Utilizando cebadores oligonucleotídicos (SEQ ID NOs: 27 y 28) basados en la secuencia de ADNc de MAPS-1A proporcionada en el SEQ ID NO: 23, se aisló el gen correspondiente de L. tropica por medio de PCR (utilizando 30 ciclos de la siguiente secuencia de temperatura por etapas: 94°C, 1 minuto; 50°C, 1 minuto ; 72°C, 1 minuto). La secuencia de ADNc determinada para la proteína MAPAS-1ª de L. tropica se proporciona en el SEQ ID NO: 25, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en el SEQ ID NO: 26.
La capacidad de MAPS-1A recombinante para estimular la proliferación celular se investigó como sigue. Se prepararon PBMC de 3 pacientes infectados por L. braziliensis con leishmaniasis mucosa activa, de 4 pacientes post-infección por kala-azar (previamente infectados con L. chagasi y/o L. donovani) y de 3 individuos no infectados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7. La capacidad de MAPS-1A para estimular la proliferación de estas PBMC se determinó como se ha descrito en el Ejemplo 8 anterior. Como se muestra en la Figura 24, se observaron niveles significativos de proliferación de PBMC específica de MAPS-1A en 2 de los 7 pacientes de Leishmania.
La capacidad de MAPS-1A para estimular la proliferación en cultivos de ganglios linfáticos ratones se determinó como se ha descrito en el Ejemplo 8. La Figura 25 muestra la cantidad de proliferación estimulada por MAPS-1A (a 25 µg/ml, 5 µg/ml y 1 µg/ml) en comparación con la estimulada por el control positivo de ConA y por proteínas de sobrenadante de promastigotas de L. major brutas, 20 días después de la infección con L. major. Las células aisladas 20 días después de la infección fueron altamente sensibles a MAPS-1A, mientras que las células aisladas 10 días después de la infección eran insensibles.
Ejemplo 11
Inmunorreactividad de antígenos solubles de Leishmania con sueros de pacientes infectados por Leishmania
La reactividad de MAPS-1A con sueros de individuos no infectados, de pacientes humanos de leishmaniasis con infección cutánea, de pacientes humanos con leishmaniasis visceral aguda, y de ratones BALB/c infectados por L. major se determinó como sigue.
Los análisis se realizaron en placas de 96 pocillos recubiertas con 200 ng de antígeno diluido a 50 µl en tampón carbonato de recubrimiento, pH 9,6. Los pocillos se recubrieron durante la noche a 4°C (o 2 horas a 37°C). Los contenidos de la placa se retiraron a continuación y los pocillos se bloquearon durante 2 horas con 200 µl de PBS/BSA al 1%. Después de la etapa de bloqueo, los pocillos se lavaron cinco veces con PBS/Tween 20™ al 0,1%. A continuación se añadieron a cada pocillo 50 μl de sueros, diluidos 1:100 en PBS/Tween 20™ al 0,1%/BSA al
0,1%, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después de nuevo cinco veces con PBS/Tween 20™ al 0,1%.
El producto conjugado enzimático (peroxidasa de rábano picante - Proteína A, Zymed, San Francisco, CA) se diluyó
a continuación 1:10.000 en PBS/Tween 20™ al 0,1%/BSA al 0,1%, y se añadieron 50 μl de producto conjugado
diluido a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los pocillos se lavaron cinco veces con PBS/Tween 20™ al 0,1%. Se añadieron 100 µl de tetrametilbencidina (TMB)peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), sin diluir, y se incubaron durante aproximadamente 15 minutos. La reacción se detuvo con la adición de 100 µl de H2SO4 1 N a cada pocillo, y las placas se leyeron a 450 nm.
Como se muestra en la Figura 26, aproximadamente el 50% de las muestras de pacientes con leishmaniasis humana mostraron reactividades con MAPS-1A recombinante sustancialmente por encima del fondo. La Figura 27 muestra la reactividad de MAPS-1A con diluciones crecientes de sueros de ratones BALB/c a los que se había administrado previamente ya sea (i) solución salina; (ii) el coadyuvante B. pertussis; (iii) antígenos solubles de Leishmania más B. pertussis; (iv) promastigotas de L. major vivos, o (v) antígenos solubles de Leishmania más B. pertussis seguido de promastigotas vivos de L. major (como se describe más adelante en el Ejemplo 12). Se observaron absorbancias considerablemente más altas con sueros de ratones infectados con promastigotas vivos de
L. major y con ratones infectados con promastigotas vivos de L. major después de la inmunización con antígenos solubles de Leishmania más B. pertussis, que con los sueros de los otros tres grupos de ratones, lo que indica que los títulos de anticuerpos anti-MAPS-1A aumentan después de la infección por Leishmania.
Ejemplo 12
Uso de Antígenos de Leishmania para la Vacunación Contra la Infección por Leishmania
Este ejemplo ilustra la eficacia de los antígenos de Leishmania para conferir protección contra la enfermedad en el sistema modelo de leishmaniasis murino experimental. Para una discusión del sistema modelo de leishmaniasis murino véase, por ejemplo, Reiner et al. Annu. Rev. Immunol.,13:151-77, 1995.
La eficacia de (i) antígenos de Leishmania solubles brutos, (ii) MAPS-1A, y (iii) una mezcla de Ldp23, LbeIF4A y M15, como vacunas contra la infección por Leishmania se determinó como sigue. Se inmunizaron por vía intraperitoneal ratones BALB/c (5 por grupo) tres veces a intervalos bisemanales con (i) 30 µg de antígenos de Leishmania solubles brutos, (ii) 20 µg de MAPS-1A o (iii) una mezcla que contenía 10 µg de cada uno de LeIF, Ldp23 y M15, junto con 100 µg del coadyuvante C. parvum. Dos grupos de control se inmunizaron con solución salina o C. parvum solo. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones se estimularon con 2 x 105 de promastigotas de la fase log. tardía de L. mayor. La infección se controló semanalmente mediante la medición de la inflamación de la almohadilla plantar. La cantidad de inflamación de la almohadilla plantar observada en los ratones inmunizados con antígenos de Leishmania solubles brutos, una mezcla de Ldp23, LbeIF4A y M15 (Figura 28), o MAPS-1A (Figura 29) fue significativamente menor que la observada en ratones inmunizados con C. parvum solo. Estos resultados demuestran que los antígenos de Leishmania de la presente invención son eficaces para conferir protección contra la infección por Leishmania.
Ejemplo 13
Aislamiento de ADN que Codifica Antígenos Solubles de una Genoteca de ADN Genómico de L. major
Este ejemplo ilustra el aislamiento de siete genes de antígenos de Leishmania solubles de una genoteca de de ADN genómico de L. major.
5 Se preparó una genoteca de expresión de ADN genómico de L. major a partir de promastigotas de L. major utilizando el kit unidireccional Lambda ZAP (uni-ZAP) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Esta genoteca se escrutó con sueros de conejo de alto título producidos contra antígenos solubles de L. major, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9. Se identificaron siete clones positivos. El fagémido se escindió y el ADN de cada uno de los siete clones se secuenció utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied
10 Biosystems Division Modelo 373A. Las secuencias de ADN para estos antígenos, referidos como LmgSP1, LmgSP3, LmgSP5, LmgSP8, LmgSP9, LmgSP13, LmgSP19, se proporcionan en los SEQ ID NO: 29-35, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos correspondientes en los SEQ ID NO: 36-42, respectivamente. Se encontró que LmgSP13 contenía una secuencia repetitiva de 39 amino ácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43.
Estudios posteriores dieron como resultado el aislamiento de una secuencia completa para LmgSP9. La secuencia
15 de ADN completa se proporciona en el SEC ID NO: 54, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos pronosticada en el SEQ ID NO: 55. Se encontró que la secuencia de aminoácidos contenía seis unidades repetitivas de 14 aminoácidos (SEQ ID NO: 56), dividiéndose adicionalmente cada unidad en dos unidades de 7 aminoácidos, proporcionadas en los SEQ ID NO: 57 y 58.
La comparación de la secuencias de ADN y de aminoácidos para los antígenos aislados como se describió
20 anteriormente, no reveló homologías significativas con LmgSP1, LmgSP3, y LmgSP13. Se encontró que LmgSP5 estaba relacionado con la familia del antígeno 2 de superficie de Promastigotas (PSA2) conocida. Se encontró que LmgSP8 tenía cierta homología con una secuencia identificada previamente en E. coli (ácido 2-succinil-6-hidroxi-2,4ciclohexadieno-1-carboxílico sintasa). LmgSP9 y LmgSP19 resultaron ser homólogos a una proteína de superficie hidrófila de L. major denominada Gen B (Flinn, HM et al. Mol. Biochem. Parasit. 65:259-270, 1994), y a la ubiquitina,
25 respectivamente. Para el mejor conocimiento de los autores de la presente invención, no se había demostrado previamente que ninguno de estos antígenos mostrado provocara respuestas de células T o B.
En estudios adicionales, se amplificó un fragmento de ADN de 220 pb de LmgSP5 y se utilizó para escrutar una genoteca genómica de L. Major en Lambda ZAP. Se purificaron diecisiete clones positivos después del escrutinio secundario. Para seleccionar un clon que tenía una probabilidad de tener la secuencia 5' del inserto LmgSP5, se 30 utilizó un oligonucleótido marcado de la región 5' para escrutar el ADN de los clones positivos secundarios. El ADN de tres clones hibridó con el oligonucleótido 5', hibridando un clon más fuertemente que los otros dos. Se encontró que este clon (secuencia de ADNc proporcionada en el SEQ ID NO: 103) contenía un inserto de 2421 pb que contenía el marco de lectura abierto completo del gen PSA-2 novedoso. Este ORF se amplificó y se clonó en el vector de expresión pET-17b para la expresión de la proteína recombinante en E. coli. La secuencia de ADNc del
35 ORF se proporciona en el SEQ ID NO: 102, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en el SEQ ID NO: 104.
La reactividad de LmgSP9 recombinante con sueros de pacientes con leishmaniasis visceral, (tanto de Sudán como de Brasil) y de donantes normales se evaluó mediante ELISA como se ha descrito anteriormente. Los valores de absorbancia se compararon con los obtenidos utilizando el antígeno K39 de Leishmania conocido descrito 40 anteriormente, empleándose producto lisado de L. chagasi como control positivo. Los resultados representativos de estos análisis se proporcionan a continuación en la Tabla 2, donde todos los pacientes de Brasil y los de Sudán designados como "VL" estuvieron aquejados de leishmaniasis visceral. Los resultados demostraron que LmgSP9 detecta específicamente anticuerpos en la mayoría de los individuos con leishmaniasis visceral, independientemente de su ubicación geográfica. En algunos casos, los valores de absorbancia de la reactividad de los anticuerpos a
45 LmgSP9 fueron comparables a los observados con K39. Además, LmgSP9 detectó varios casos de leishmaniasis que no fueron detectados utilizando K39. Estos resultados indican que LmgSP9 se puede utilizar para complementar la reactividad de K39.
Tabla 2
Reactividad de LmgSP9 con sueros de pacientes con Leishmania
Paciente Núm.
Producto lisado de L. chagasi K39 LmgSP9
Muestras Sudaneses:
B19
1,067 0,306 0,554
B25
1,884 3,435 0,974
B43
1,19 3,225 0,86
Reactividad de LmgSP9 con sueros de pacientes con Leishmania
Paciente Núm.
Producto lisado de L. chagasi K39 LmgSP9
B47
2,405 2,892 0,375
B50
0,834 0,748 0,432
B58
0,921 0,235 0,92
B63
1,291 0,303 0,764
B70
0,317 0,089 3,056
VL4
1,384 3,035 2,965
VL11
0,382 0,144 0,142
VL12
0,277 0,068 0,098
VL13
0,284 0,12 0,194
Muestras brasileñas:
105
3,508 3,53 0,374
106
2,979 3,373 2,292
107
2,535 3,444 0,46
109
1,661 3,415 3,319
111
3,595 3,537 0,781
112
2,052 3,469 0,63
113
3,352 3,429 0,963
114
2,316 3,437 1,058
115
2,073 3,502 1,186
116
3,331 3,461 0,96
Donantes normales:
129
0,157 0,104 0,08
130
0,195 0,076 0,095
131
0,254 0,134 0,086
132
0,102 0,035 0,043
Con el fin de obtener una mayor especificidad para la detección de anticuerpos en sueros de pacientes con leishmaniasis visceral, se aisló un homólogo de LmgSP9 a partir L. chagasi, uno de los agentes causantes de la leishmaniasis visceral. Se escrutaron un total de 80.000 ufp de una genoteca genómica de L. chagasi amplificada 5 con la región codificante completa de LmgSP9 (amplificada a partir de ADN genómico de L. major). Se purificaron hasta su homogeneidad siete clones hibridantes. Las secuencias de ADN determinadas para dos de estos clones, referidos como Gene A de Lc y Gene B de Lc, se proporcionan en los SEQ ID NO: 59 y 60, respectivamente, proporcionándose las correspondientes secuencias de aminoácidos pronosticadas en los SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente. Se encontró que el marco de lectura abierto para Gene A de Lc mostraba cierta homología con
10 Gene A/C, previamente aislado de L. major (McKlean et al., Mol. Bio. Parasitol., 85:221-231, 1997). El marco de lectura abierto para Gene B de Lc mostró cierta homología con Gene B de L. major, comentado anteriormente, y se encontró que contiene once repeticiones de una unidad repetitiva de 14 aminoácidos (SEQ ID NO: 63), dividiéndose adicionalmente cada repetición en dos unidades de 7 aminoácidos, proporcionadas en los SEQ ID NO: 64 y 65.
Los potenciales diagnósticos de Gene A de Lc y Gene B de Lc fueron evaluados mediante ELISA como se ha
15 descrito anteriormente, utilizando sueros de pacientes con leishmaniasis visceral de Sudán y Brasil, y de los controles no infectados. Los valores de absorbancia se compararon con los obtenidos utilizando LmgSP9. Se obtuvieron valores de absorbancia mucho más altos con Gene A de Lc y Gene B de Lc que con LmgSP9, pareciendo ser más eficaz Gene B de Lc que parece ser más eficaz que Gene A de Lc en la detección de anticuerpos en algunos casos. Estos resultados indican que Gene B de Lc es altamente eficaz en el diagnóstico de la leishmaniasis visceral.
Con el fin de evaluar el potencial diagnóstico de las repeticiones encontradas dentro de Gene B de Lc, se sintetizó una serie de 6 péptidos (SEQ ID NO: 66-71; referida como Pep 1-6), que difiere en un residuo R o H. Se llevó a cabo un ELISA utilizando la proteína LcGene B completa y los seis péptidos. Los valores de absorbancia obtenidos con Pep 3 fueron superiores a los obtenidos con los otros 5 péptidos, sin embargo, no fueron tan altos como los obtenidos con la proteína completa.
Ejemplo 14
Aislamiento y Caracterización de ADN que Codifica Antígenos Solubles de una Genoteca de ADN genómico de L. chagasi
Este ejemplo ilustra la preparación de cinco genes de antígenos solubles de Leishmania de una genoteca de ADN genómico de L. chagasi.
Se preparó una genoteca de expresión de ADN genómico de L. chagasi a partir de promastigotas de L. chagasi utilizando el kit Lambda ZAP unidireccional (uni-ZAP) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Esta genoteca se escrutó con un suero de conejo de alto título producido contra antígenos solubles de L. major, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9. Se identificaron cinco clones positivos. El fagémido se escindió y el ADN de cada uno de los Cinco clones se secuenció utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 373A. Las secuencias de ADN para estos antígenos, denominados LcgSP1, LcgSP3, LcgSP4, LcgSP8, y LcgSP10 se proporcionan en los SEQ ID NO: 44-48, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos correspondientes en los SEQ ID NO: 49-53, respectivamente.
La comparación de estas secuencias con secuencias conocidas en el banco de genes descrito anteriormente no reveló homologías conocidas con LcgSP3, LcgSP4, LcgSP8 y LcgSP10. Se encontró que LcgSP1 era homólogo al antígeno HSP70 conocido.
Las Figuras 30A y B ilustran la respuesta proliferativa de ganglios linfáticos murinos a LcgSP8, LcgSP10 y LcgSP3 recombinantes. Los ganglios linfáticos se tomaron ratones BALB/c 17 días después de la infección con L. major. La infección se produjo por inyección en la almohadilla plantar de 2 x 106 parásitos/almohadilla plantar. Las células fueron estimuladas con antígeno recombinante y la proliferación se midió a las 72 horas utilizando 3H-timidina. La Figura 30A muestra CPM, una medición directa de la actividad mitótica en respuesta a los antígenos, y la Figura 30B muestra el índice de estimulación, que mide la respuesta proliferativa con respecto al control negativo.
Ejemplo 15
Aislamiento de ADN que Codifica Antígenos de L. major mediante Clonación de la Expresión de Células T CD4 +
Este ejemplo ilustra el aislamiento de antígenos de L. major en células T utilizando un enfoque de escrutinio directo de células T.
Se obtuvieron líneas celulares CD4 + T específicas de Leishmania a partir de las PBMC de un individuo que dio positivo en la prueba cutánea de leishmania pero no tenía historia clínica de la enfermedad. Estas líneas de células T se utilizaron para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de amastigotas de L. major preparados como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los clones inmunorreactivos se aislaron y se secuenciaron como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de ADNc determinadas para los 8 clones aislados referidos como 1G6-34, 1E6-44, 4A5-63, 1B11-39, 2A10-37, 4G2-83, 4H6-41, 8G3-100 se proporcionan en los SEQ ID NO: 72-79, respectivamente, proporcionándose las correspondientes secuencias de aminoácidos en los SEQ ID NO: 80-87, respectivamente. Se cree que las secuencias de ADNc proporcionadas para 1E6-44, 2A10-37, 4G2-83, 4H6-41 y 8G3-100 representan clones parciales. Se demostró que todos estos clones estimulaban la proliferación de células T.
La comparación de estas secuencias con las del banco de genes como se ha descrito anteriormente no reveló homologías conocidas con el antígeno 4A5-63. Se encontró que 1G6-34 tenía cierta homología con la histona H2B previamente identificada en L. Enrietti. Los antígenos 1E6-44, 1B11-39 y 8G3 100 mostraron cierta homología con secuencias previamente identificadas en otros eucariotas, en particular Saccharomyces cerevisiae. Se encontró que 2A10-37 y 41-4H6 eran homólogas a las dos proteínas alfa tubulina previamente identificada de L. donovani y beta tubulina de L. major, respectivamente, y se encontró que 4G2-83 era homóloga al factor 2 de iniciación y elongación identificado previamente en T. cruzi.
Posteriores estudios de clonación completos, utilizando técnicas convencionales, condujeron al aislamiento de una secuencia de ADNc prolongada para 1E6-44, proporcionada en el SEQ ID NO: 105. La secuencia de aminoácidos correspondiente se proporciona en el SEQ ID NO: 106. Una secuencia de ADNc prolongada para 2A10-37 se proporciona en el SEQ ID NO: 107. Se encontró que esta secuencia contenía un marco de lectura abierto completo que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 108. Una secuencia de ADNc prolongada para 4G2-83 se proporciona en el SEQ ID NO: 109. Esta secuencia contiene un marco de lectura abierto que codifica la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 110. Una secuencia de ADNc prolongada para 8G3-100 se proporciona en el SEQ ID NO: 111, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en el SEQ ID NO: 112.
Los ocho antígenos descritos anteriormente (1G6-34, 1E6-44, 4A5-63, 1B11-39, 2A10-37, 4G2-83, 4H6-41, 8G3100) se expresaron en E. coli en forma de proteínas de fusión recombinantes que contienen etiquetas de histidina Nterminales y se purificaron hasta la homogeneidad utilizando cromatografía de afinidad con níquel. Las 8 proteínas recombinantes purificadas provocaron fuertes respuestas proliferativas a partir de las células celulares T CD4+ empleadas en el escrutinio de la genoteca. También se observó reactividad de las células T con 1G6-34, 4H6-41 y 8G3-100 en células T generadas tanto contra producto filtrado de cultivo de promastigotas de Leishmania como contra producto filtrado de cultivo de amastigotas, indicando que estos antígenos se expresan en las fases vitales tanto de promastigota como de amastigota a niveles que son suficientes para evocar una respuesta inmunitaria celular fuerte.
Se examino la capacidad de los 8 antígenos para estimular la proliferación y la producción de IFN-γ en PBMC de pacientes con leishmaniasis cutánea activa (LC) y de donantes normales como se ha descrito anteriormente. Además de los 8 antígenos, también se sometieron a ensayo el producto lisado de promastigota de Leishmania (LPr) y el derivado de proteína purificado de M. tuberculosis (PDD). El número de pacientes y/o donantes que responden a cada antígeno se muestra en la Tabla 3 de más abajo. Todos los pacientes de LC respondieron al menos a uno de los 8 antígenos. Muy destacadamente, los antígenos 1G6-34 y 4H6-41 provocaron proliferación celular en 6/7 y 7/7 pacientes de LC, respectivamente, y producción de IFN-γ en 6/7 y 5/6 pacientes de LC, respectivamente. Además 1G6-34 no fue reconocido por las PBMC de donantes de control no infectados.
Tabla 3
Proliferación Celular y Producción de IFN-γ en PBMC de Pacientes con Leishmaniasis Cutánea
Pacientes CL
Donantes normales
Antígeno
Producción de IFN-γ Proliferación Celular Producción de IFN-γ Proliferación Celular
LPr
7/7 6/7 3/8 5/8
1G6-34
6/7 5/7 0/8 0/8
1E6-44
0/7 4/7 5/8 2/8
4A5-63
1/7 1/7 0/8 0/8
1B11-39
5/7 3/7 1/8 0/8
2A10-37
1/7 3/7 1/8 0/8
4H6-41
7/7 5/7 3/8 1/8
8G3-100
0/7 2/7 5/8 2/8
PPD
7/7 7/7 7/8 7/8
Ejemplo 16
Síntesis de Polipéptidos
Los polipéptidos pueden ser sintetizados en un sintetizador de péptidos Perkin Elmer/Applied Biosystems División 430A utilizando la química FMOC con activación con HPTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'tetrametiluronio). Una secuencia Gly-Cys-Gly puede unirse al extremo amino del péptido para proporcionar un método de conjugación, unión a una superficie inmovilizada, o marcaje del péptido. La escisión de los péptidos del soporte sólido puede llevarse a cabo usando la siguiente mezcla de escisión: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Después de escindir durante 2 horas, los péptidos se pueden precipitar en metil-t-butil-éter frío. Los sedimentos de los péptidos se pueden disolver a continuación en agua que contiene ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y liofilizar antes de la purificación por HPLC de fase inversa C18. Se puede utilizar un gradiente de acetonitrilo de 0%-60% (que contiene TFA al 0,1%) en agua (que contiene TFA al 0,1%) para eluir los péptidos. Después de la liofilización de las fracciones puras, los péptidos se pueden caracterizar utilizando espectrometría de masas de electropulverización u otros tipos de espectrometría de masas y mediante análisis de aminoácidos.
Ejemplo 17
Uso de Antígenos de Leishmania Más Coadyuvante para la Vacunación Contra la Infección por Leishmania
Este ejemplo ilustra la eficacia de los antígenos de Leishmania recombinantes, M15 y MAPS, más un coadyuvante, IL-12, para conferir protección contra la enfermedad en el sistema modelo de leishmaniasis murina experimental. Para la discusión del sistema modelo de leishmaniasis murina, véase, por ejemplo, Reiner et al. Annu. Rev. Immunol.,13:151-77, 1995. La eficacia de M15 y MAPS combinados con IL-12, como vacuna contra la infección por Leishmania se determinó como sigue: Se inmunizaron subcutáneamente ratones BALB/C (5 por grupo) en la almohadilla plantar izquierda, mezclando los 10 µg de los antígenos individuales con 1 µg de IL-12. Como controles, se inmunizaron tres grupos separados de ratones con antígenos solubles de producto lisado de Leishmania (SLA) más IL-12, con IL-12 sola o con PBS. Tres semanas después de la última inmunización los ratones se infectaron en la almohadilla plantar derecha con 2 x 105 formas promastigota de L. major (fase estacionaria). A continuación se midió semanalmente la hinchazón de la almohadilla plantar. Los resultados se expresan en la Fig. 31 e indican claramente que los ratones inmunizados con M15 o MAPS e IL-12 quedaron muy protegidos frente a la infección. La protección inducida por estos antígenos fue tan eficaz o más que la inducida por SLA + IL-12, un régimen conocido por inducir buena protección contra la leishmaniasis en este modelo animal (Afonso, L.C.C., T. M. Scharton, L. Q. Vieira, M. Wysocka, G. Trinchieri, y P. Scott. 1994. The adjuvant effect of intereukin-12 in a vaccine against Leishmania major. Science 263:235-237). Se obtuvo el mismo patrón de protección descrito anteriormente, es decir, M15, MAPS, y SLA, indujeron protección contra la infección por L. major cuando se utilizó como coadyuvante C. parvum en lugar de IL-12 (Ejemplo 12). Estos resultados demuestran que los antígenos recombinantes M15 y MAPS inducen una protección excelente contra la infección por L. major en el modelo BALB/c de leishmaniasis humana. Además, ambos antígenos indujeron protección cuando se sometieron a ensayo en dos formulaciones de coadyuvante diferentes, (por ejemplo, IL-12 y C. parvum). Este descubrimiento tiene una enorme significación puesto que demuestra que la inmunidad contra la leishmaniasis puede ser inducida por antígenos específicos liberados en coadyuvantes que son adecuados para uso en seres humanos.
Ejemplo 18
Uso de ADN de Leishmania para la Vacunación contra la Infección por Leishmania
Este ejemplo ilustra la eficacia del ADN de Leishmania para conferir protección contra la enfermedad en el sistema modelo de leishmaniasis murina experimental. Para una discusión del sistema modelo de leishmaniasis murina véase, por ejemplo, Reiner et al. Annu. Rev. Immunol.,13:151-77, 1995. Las propiedades de protección de los antígenos recombinantes se sometió a ensayo inmunizando ratones con ADN desnudo que contenía los genes M15 y MAPS correspondientes. El constructo de ADN utilizado fue el vector pcDNA3.1 (Invitrogen) que contenía un promotor de CMV. Se inyectaron 100 µg de las preparaciones de ADN desnudo indicadas a ratones BALB/c (5 por grupo) en la almohadilla plantar izquierda tres veces (con tres semanas de diferencia). De extrajo sangre de los ratones antes y después de las inmunizaciones para verificar el desarrollo de la respuesta inmunitaria específica. La respuesta de anticuerpos se evaluó mediante ELISA. Los anticuerpos IgG2a anti-M15 y anti-MAPS se detectaron después de la segunda inmunización en el suero de los ratones inmunizados con el ADN desnudo respectivo. La presencia de anticuerpos específicos indica que la inmunización con ADN da como resultado la producción de antígenos proteicos específicos. Tres semanas después de la última inmunización, los ratones se sensibilizaron después en la almohadilla plantar derecha con 2 x 105 formas promastigota de L. major (fase estacionaria). A continuación se midió la hinchazón de la almohadilla plantar semanalmente en lo sucesivo. Los resultados se expresan en la Fig. 32 e indicaron claramente que, de nuevo, los ratones inmunizados con ADN desnudo que contenía los genes M15 o MAPS protegían enormemente contra la infección por L. major. Estos resultados demuestran que los genes tanto M15 como MAPS inducen una protección excelente contra la infección por L. major en el modelo BALB/c de leishmaniasis humana.
Ejemplo 19
Preparación y Caracterización de las Proteínas de Fusión de Leishmania
Las proteínas de fusión que comprenden los antígenos de Leishmania MAPS-1A (SEQ ID NO: 24), M15 (SEQ ID NO: 2), Lbhsp83 (SEQ ID NO: 6) y LbeIF4A (SEQ ID NO: 10) se prepararon como sigue.
Se preparó un constructo de fusión de MAPS-1ª y M15 amplificando en primer lugar mediante PCR la secuencia codificante completa de MAPS-1A utilizando los cebadores de los SEQ ID NO: 88 y 89. Los productos resultantes se digirieron con NdeI y BamHI. Los productos ligados se transformaron en E. coli y los transformantes que contenían el inserto correcto se identificaron mediante digestión de restricción y se verificaron mediante secuenciación de ADN. El plásmido MAPS-1A-pET se digirió con BamHI y EcoRI. Los últimos cortes en la secuencia poliligadora del vector pET que está localizada aguas abajo del sitio BamHI.
Los cebadores de los SEQ ID NO: 90 y 91 se emplearon para amplificar mediante PCR la secuencia codificante completa de M15 y el producto resultante se digirió con BamHI y EcoRI seguido de subclonación en el plásmido MAPS-1A-pET predigerido anterior. Los productos ligados se transformaron a continuación en E. coli y los transformantes con el inserto correcto se identificaron mediante digestión de restricción y se verificaron mediante secuenciación de ADN. El constructo MAPS-1A-M15 pET se transformó en el anfitrión bacteriano (BL21; pLysE). La expresión de la proteína dio como resultado una única molécula recombinante con un peso molecular pronosticado de 85,7 kDa. La proteína de fusión MAPS-1A-M15 recombinante también contenía 33 residuos de aminoácido del vector circulante como resultado de la eliminación del codón de parada de M15 y con posterioridad se digirió con EcoRI. La secuencia de ADN del constructo MAPS-1A-M15 se proporciona en el SEQ ID NO:101.
Los cebadores de los SEQ ID NO: 92 y 93 se utilizaron para amplificar mediante PCR los primeros 226 residuos de aminoácido de LbeIF4A. El producto de PCR resultante se digirió con EcoRI y se subclonó en el plásmido MAPS-1AM15-pET. Los productos ligados se transformaron a continuación en E. coli y los transformantes con el inserto y la orientación correctos se identificaron mediante digestión de restricción y se verificaron mediante secuenciación de ADN. La proteína recombinante expresada se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre una columna con Ni. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteína de fusión MAPS-1A-M15-LbeIF4A se proporcionan en los SEQ ID NO: 94 y 95, respectivamente.
Se prepararon proteínas de fusión adicionales utilizando la metodología descrita con anterioridad. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión MAPS-1A-M15-Lbhs83 y MAPS-1A-M15-Lbhs83-LbeIF4A se proporcionan en los SEQ ID NO: 96 y 97, respectivamente. La secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 97 se proporciona en el SEQ ID NO: 98. Las secuencias de ADN de los vectores MAPS-1A-M15-Lbhs83 y MAPS-1A-M15-Lbhs83-LbeIF4A empleados en las vacunas de ADN se proporcionan en los SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente.
Ejemplo 20
Uso de Proteínas de Fusión de Leishmania Más Coadyuvante para la Vacunación Contra la Infección por Leishmania
La capacidad de las proteínas de fusión de Leishmania MAPS1A-M15 (referida como diFusión) y MAPS1A-M15-LbeIF4A (referida como triFusión), más coadyuvante, para conferir protección contra la enfermedad en el sistema modelo de leishmaniasis murina experimental se examinó a continuación.
Las diFusión y triFusión se prepararon como se ha descrito anteriormente. En una primera serie de experimentos, se inmunizaron grupos de ratones BALB/c con los antígenos recombinantes individuales, (MAPS1A, M15 o LbeIF4A), la diFusión o la triFusión, con IL-12 como coadyuvante, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 17. Los ratones de control se inmunizaron con IL-12 o solución salina. Antes de la sensibilización, se sacrificaron algunos ratones (tres por grupo) y se investigaron la respuestas inmunitarias a las proteínas de fusión y a los antígenos individuales. Se evaluaron las respuestas tanto de las células T (producción de citoquinas por las células del bazo) como de las células B (respuesta de anticuerpos). Los resultados indicaron que la inmunización de los ratones con las proteínas de fusión no interfiere con la inmunogenicidad de los antígenos individuales. Más específicamente, se observaron respuestas Th1 (es decir inducción de la producción de IFN-γ y producción específica de IgG2a) tanto para MAPS1A como para M15, cuando los ratones se inmunizaron con ambas proteínas recombinantes diFusión y triFusión. Además, la inmunización con triFusión dio como resultado una buena respuesta inmunitaria a LeIF.
Para evaluar la protección conferida por estas proteínas de fusión, los ratones inmunizados y de control se infectaron en la almohadilla plantar derecha con 2 x 103 formas amastigota de L. major y se midió semanalmente después de eso la hinchazón de la almohadilla plantar. Los resultados, mostrados en la Fig. 33, indicaron claramente que ambas proteínas de fusión inducían protección comparable a MAPS1A y M15.
Se realizó una segunda serie de experimentos en los que se empleó MPL-SE (Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamilton, MT) como coadyuvante. Se inmunizaron tres veces (intervalo de tres semanas) ratones BALB/c con 2 µg de los antígenos individuales (MAPS1A, M15 o LbeIF4A), las proteínas diFusión o triFusión más MPL-SE, y se sometieron a ensayo para determinar la inmunogenicidad de los antígenos y para determinar la protección como se ha descrito antes. Como con los experimentos realizados con IL-12 como coadyuvante, los ratones inmunizados con los antígenos individuales así como con las proteínas de fusión mostró ambas respuestas de células T y B específicas contra los antígenos inmunizantes. Por otra parte, no se observó competición antigénica entre los antígenos individuales cuando se utilizan las proteínas de fusión como inmunógenos.
Como con los estudios de protección en los que se utilizó IL-12 como coadyuvante, la protección se logró con los antígenos individuales MAS1A y M15, así como con las dos proteínas de fusión (Fig. 34). Se observó una protección ligeramente mejor en el grupo de ratones inmunizados con la triFusión en lugar de los ratones inmunizados con la diFusión.
Lista de secuencias
<110> Corixa Corporation Reed, Steven G. Campos-Neto, Antonio Webb, John R. Dillion, Davin C. Skeiky, Yasir A.W. Bhatia, Ajay Coler, Rhea Probst, Peter
<120> ANTÍGENOS DE LEISHMANIA PARA SU USO EN LA TERAPIA Y EL DIÁGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS
<130> 210121.42007PC
<140> PCT
<141> 2001-04-05
<160> 112
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3134
<212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(3134)
<223> n = A,T,C o G
<400> 1
<210> 2
<211> 546
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 2
<210> 3
<211> 676
<212> ADN
<213> Leishmania donovani
<400> 3
<210> 4 5 <211> 175
<212> PRT
<213> Leishmania donovani
<900> 4 10
<210> 5
<211> 2040 15 <212> ADN
<213> Leishmania braziliensis
<400> 5
<210> 6 5 <211> 656
<212> PRT
<213> Leshmania braziliensis
<400>
6 10
<210> 7
<211> 1771
<212> ADN
<213> Leishmania tropica
<400> 7
<210> 8
<211> 566
<212> PRT
<213> Leishmania tropica
<400> 8
<210> 9
<211> 1618
<212> ADN
<213> Leishmania braziliensis
<400> 9
<212> PRT
<213> Leishmania braziliensis
<400>
10 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Leishmania donovani
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(5)
<223> Xaa =cualquier aminoácido
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Leu o Lys
<221> VARIANTE
<222> (7)...(12)
<223> Xaa =cualquier aminoácido
<400> 11
<210> 12
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR sentido
<221> base_modificada
<222> (1)...(26)
<223> I
<221> característica_misc
<222> (1)...(26)
<223> n = A,T,C o G
<400> 12
ggaattcccc ncagctngtn ttcgac26
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Leishmania donovani
<400> 13
<210> 14
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 14
ggatccatgg tcaagtccca ctacatctgc30
<210> 15
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 15
gaattcagac cggatagaaa taagccaatg aaa33
<210> 16
<211> 701
<212> PRT
<213> Leishmania amozonensis
<400> 16
<212> PRT
<400>
17 10
<210> 18
<211> 732
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 18
<210> 19
<211> 1019
<212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 19
<210> 20
<211> 151
<212> PRT 15 <213> Leishmania major
<400> 20 <212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 21 10
<210> 22
<211> 320 15 <212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 22 <212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 23 10 <210> 24
<211> 199 5 <212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 24
<210> 25
<211> 637
<212> ADN 15 <213> Leishmania tropica
<400> 25
<210> 26
<211> 206
<212> PRT
<213> Leishmania tropica
<400> 26
10 <210> 27
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
15 <220>
<223> Cebador de PCR
<400> 27
20 caattacata tgcatcacca tcaccatcac atgtcctgcg gtaacgccaa g 51
<210> 28
<211> 31
<212> ADN 25 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
30 <400> 28
catggaattc ttactgcttg ctgaagtatc c 31
<210> 29 35 <211> 520
<212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(520)
<223> n = A, T, C o G
<400> 29
<210> 30
<211> 600
<212> ADN
<213> Leishmania major 15
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(600)
<223> A, T, C o G 20
<400> 30
25 <210> 31
<211> 600
<212> ADN
<213> Leishmania major
30 <220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(600)
<223> n = A, T, C o G
35 <400> 31 <210> 32
<211> 600
<212> ADN
<213> Leishmania major 5
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(600)
<223> n = A,T,C o G 10
<400> 32
15 <210> 33
<211> 600
<212> ADN
<213> Leishmania major
20 <220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(600)
<223> n = A,T,C o G
25 <400> 33
<210> 34 30 <211> 516
<212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 34 35
<210> 35
<211> 822
<212> ADN
<213> Leishmania major 5
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(822)
<223> n = A,T,C o G 10
<400> 35
15 <210> 36
<211> 146
<212> PRT
<213> Leishmania major
20 <220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(146)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
25 <400> 36
<210> 37
<211> 77
<212> PRT
<213> Leishmania major
5 <220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(77)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
10 <400> 37
<210> 38 15 <211> 68
<212> PRT
<213> Leishmania major
<220> 20 <221> VARIANTE
<222> (1)...(68)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 38 25
<210> 39
<211> 65 30 <212> PRT
<213> Leishmania major
<220>
<221> VARIANTE 35 <222> (1)...(65)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 39 <210> 40
<211> 78 5 <212> PRT
<213> Leishmania major
<220>
<221> VARIANTE 10 <222> (1)...(78)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 40
<210> 41
<211> 169
<212> PRT 20 <213> Leishmania major
<400> 41 <210> 42
<211> 98 5 <212> PRT
<213> Leishmania major
<220>
<221> VARIANTE 10 <222> (1)...(98)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 42
<210> 43
<211> 39
<212> PRT
<213> Leishmania major 20 <400> 43
<210> 44
<211> 600 25 <212> ADN
<213> Leishmania chagasi
<220>
<221> característica_misc 30 <222> (1)...(600)
<223> n = A,T,C o G
<400> 44
<210> 45
<211> 1748
<212> ADN
<213> Leishmania chagasi
<400> 45
<210> 46
<211> 560
<212> ADN 15 <213> Leishmania chagasi
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(560) 20 <223> n = A,T,C o G
<400> 46 – <210> 47
<211> 600 5 <212> ADN
<213> Leishmania chagasi
<220>
<221> característica_misc 10 <222> (1)...(600)
<223> n = A,T,C o G
<400> 47
<210> 48
<211> 1053
<212> ADN 20 <213> Leishmania chagasi
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(1053). 25 <223> n = A,T,C o G
<400> 48 <210> 49
<211> 136 5 <212> PRT
<213> Leishmania chagasi
<400> 49
<210> 50
<211> 510
<212> PRT 15 <213> Leishmania chagasi
<400> 50 <210> 51
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Leishmania chagasi
<220>
<221> VARIANTE 10 <222> (1)...(107)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 51
<210> 52
<211> 63
<212> PRT
<213> Leishmania chagasi
<400> 52
<210> 53
<211> 324
<212> PRT 15 <213> Leishmania chagasi
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(324) 20 <223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 53 <210> 54
<211> 1585 5 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc 10 <222> (1)..(1585)
<223> n = A,T,C o G
<400> 54
<210> 55
<211> 320
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 55
<210> 56
<211> 14
<212> PRT 15 <213> Leishmania major
<400> 56 5 <210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> Leishmania major
10 <400> 57
<210> 58 15 <211> 7
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 58 20
<210> 59
<211> 264 25 <212> ADN
<213> Leishmania chagasi
<400> 59
<210> 60
<211> 744
<212> ADN 35 <213> Leishmania chagasi
<400> 60
<210> 61
<211> 80
<212> PRT
<213> Leishmania chagasi 45
<400> 61
5 <210> 62
<211> 247
<212> PRT
<213> Leishmania chagasi
10 <400> 62
<210> 63 15 <211> 14
<212> PRT
<213> Leishmania chagasi <220>
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = His o Arg
<221> VARIANTE
<222> (12)...(12)
<223> Xaa = Gly o Asp
<221> VARIANTE
<222> (13)...(13)
<223> Xaa = Asp o Gly
<400> 63
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> Leishmania chagasi
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = His o Arg
<400> 64
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Leishmania chagasi
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Gly o Asp
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Asp o Gly
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido sintético para evaluar el potencial diagnóstico de repetición en Lc Gen B
<400> 66 <210> 67
<211> 31
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido sintético para evaluar el potencial diagnóstico de repetición en Lc Gen B
<400> 67
<210> 68
<211> 45
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido sintético para evaluar el potencial diagnóstico de repetición en Lc Gen B
25 <400> 68
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 35 <223> Péptido sintético para evaluar el potencial diagnóstico de repetición en Lc Gen B
<400> 69
<210> 70
<211> 31
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido sintético para evaluar el potencial diagnóstico de repetición en Lc Gen B
<400> 70
<210> 71
<211> 45 5 <212> PRT
<213> Gly Cys Gly Pro Lys Glu Asp Gly His Thr Gln
<220>
<223> Péptido sintético para evaluar el potencial diagnóstico de repetición en Lc Gen B 10
<400> 71
15 <210> 72
<211> 664
<212> ADN
<213> Leishmania major
20 <220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(664)
<223> n = A,T,C o G
25 <400> 72
<210> 73 30 <211> 1432
<212> ADN
<213> Leishmania major
<220>35 <221> característica_misc
<222> (1) ... (1432)
<223> n = A, T, C o G
<400> 73 40 <210> 74
<211> 873 5 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc 10 <222> (1).1. (873)
<223> n = A,T,C o G
<400> 74
<210> 75
<211> 1238
<212> ADN 20 <213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc
<222> (1) ... (1238) 25 <223> n = A,T,C o G
<400> 75 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220> 10 <221> característica_misc
<222> (1) ... (712)
<223> n = A,T,C o G
<400> 76 15
<210> 77
<211> 1086 20 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc 25 <222> (1)...(1086)
<223> n = A,T,C o G
<400> 77 <210> 78
<211> 447 5 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc 10 <222> (1)...(447)
<223> n = A,T,C o G
<400> 78
<210> 79
<211> 375
<212> ADN 20 <213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc
<222> (1)...(375) 25 <223> n = A,T,C o G
<400> 79
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 80
<210> 81 10 <211> 381
<212> PRT
<213> Leishmania major
<220> 15 <221> VARIANTE
<222> (1)...(381)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 81 20
<210> 82
<211> 191
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400>. 82
<210> 83 15 <211> 273
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 83 20
<210> 84
<211> 200
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 84
<210> 85
<211> 361 5 <212> PRT
<213> Leishmania major
<220>
<221> VARIANTE 10 <222> (1)...(361)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 85 <210> 86
<211> 149 5 <212> PRT
<213> Leishmania major
<220>
<221> VARIANTE 10 <222> (1)...(149)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 86
<210> 87
<211> 69
<212> PRT 20 <213> Leishmania major
<400> 87
<210> 88
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 88
agtattcata tgcaccacca ccaccaccac atgtcctgcg gtaacgccaa gatc 54
<210> 89
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 89
ctcacaggat ccctgcttgc tgaagtatcc ttc 33
<210> 90
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 90
catttcggat ccatggacgc aactgagctg aagaac 36
<210> 91
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 91
cgtagagaat tcctgaccaa aacgaatgat gcc 33
<210> 92
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador de PCR
<400> 92
caccacgaat tcatggcgca gaatgataag atc 33
<210> 93
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 93
actgacctcg aggaattctt agtcgcgcat gaac 34
<210> 94
<211> 3012
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de ADN que codifica construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos de Leishmania
<400> 94 <210> 95
<211> 982 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos de Leishmania 10
<400> 95
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos de Leishmania
<400> 96
<210> 97
<211> 1427 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos de Leishmania 10
<400> 97
<210> 98
<211> 4929 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de ADN que codifica construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos 10 de Leishmania
<400> 98 <210> 99
<211> 4233 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de ADN que codifica construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos 10 de Leishmania
<400> 99
<210> 100
<211> 4917 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de ADN que codifica construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos 10 de Leishmania
<400> 100
<210> 101
<211> 2735
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de ADN que codifica construcciones de fusión (poli-proteína) que comprenden múltiples antígenos de Leishmania
<400> 101
<210> 102
<211>
1713 10 <212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 102
<210> 103
<211>
2421 5 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc 10 <222> (1) ... (2421)
<223> n=A, T, C o G
<400> 103
<210> 104
<211> 570
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 104
<210> 105
<211> 1688
<212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 105
<210> 106
<211> 380
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 106
<210> 107
<211> 1565
<212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 107
<210> 108
<211> 451
<212> PRT 15 <213> Leishmania major
<400> 108 <210> 109
<211> 1908 5 <212> ADN
<213> Leishmania major
<220>
<221> característica_misc 10 <222> (1)...(1908)
<223> n = A,T,C o G
<400> 109
<210> 110
<211> 845
<212> PRT 10 <213> Leishmania major
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(845) 15 <223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 110
<210> 111
<211> 997
<212> ADN
<213> Leishmania major
<400> 111
<210> 112
<211> 322
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 112

Claims (34)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una proteína de fusión que comprende:
    (i)
    un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa
    o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2; y
    (ii)
    un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa
    o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO:
  2. 24.
  3. 2. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
    (i)
    una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 2, capaz de generar al menos 50% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12; y
    (ii)
    una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 24, capaz de generar al menos 50% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12.
  4. 3.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 101.
  5. 4.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3, que consiste en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos codificada por el SEQ ID NO: 101.
  6. 5.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende el polipéptido codificado por el SEQ ID NO: 101.
  7. 6.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 5, que consiste en el polipéptido codificado por el SEQ ID NO: 101.
  8. 7.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 95.
  9. 8.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, que consiste en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 95.
  10. 9.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 96.
  11. 10.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, que consiste en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 96.
  12. 11.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 97.
  13. 12.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11, que consiste en una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 97.
  14. 13.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 6.
  15. 14.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 6 capaz de generar al menos 50% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa
    o interleuquina 12.
  16. 15.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, 13 o 14, que comprende adicionalmente un polipéptido que comprende un antígeno de Leishmania que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID
    NO: 10, una porción inmunogénica de dicho antígeno capaz de generar al menos 25% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12, o una variante de dicho antígeno que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 10.
  17. 16.
    Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que consiste en el SEQ ID NO: 10 capaz de generar al menos 50% de la respuesta generada por dicho antígeno en un modelo de secreción de interferón gamma, interleuquina 2, factor de necrosis tumoral alfa o interleuquina 12.
  18. 17.
    Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
  19. 16.
  20. 18.
    Un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17.
  21. 19.
    Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y un portador fisiológicamente aceptable.
  22. 20.
    Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, y un portador fisiológicamente aceptable.
  23. 21.
    Una composición inmunogénica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un inmunoestimulador.
  24. 22.
    Una composición inmunogénica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 17 y un inmunoestimulador.
  25. 23.
    La composición de la reivindicación 21 o 22, donde el inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en: aminoalquilglucosaminido-4-fosfatos; monofosforil lípido A; y monofosforil lípido A 3-des-O-acilado.
  26. 24.
    Una composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, que comprende adicionalmente un vehículo de liberación.
  27. 25.
    La composición inmunogénica de la reivindicación 24, donde el vehículo de liberación es una microesfera biodegradable.
  28. 26.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 19 o 20, para su uso en un método para inducir inmunidad protectora contra la leishmaniasis en un paciente.
  29. 27.
    La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, para su uso en un método para inducir inmunidad protectora contra la leishmaniasis en un paciente.
  30. 28.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 19 o 20, para su uso en un método para detectar la infección por Leishmania en un paciente, comprendiendo el método las etapas de:
    a) poner en contacto células dérmicas del paciente con la composición farmacéutica; y b) detectar una respuesta inmunitaria en la piel del paciente.
  31. 29.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 28, donde la respuesta inmunitaria es el endurecimiento.
  32. 30.
    Un kit de diagnóstico que comprende: a) una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19; y b) un aparato suficiente para poner en contacto las células dérmicas de un paciente con la composición
    farmacéutica.
  33. 31.
    Una vacuna que comprende: a) una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; o b) el polinucleótido de la reivindicación 17; o c) un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 18; y d) un coadyuvante.
  34. 32.
    La vacuna de la reivindicación 31, para su uso en la inducción de inmunidad protectora contra la leishmaniasis en un paciente.
    Respuestas Proliferativas de BALB infectados con L. major (20 días después de la infección) a proteína MAPS recombinante
    Análisis ELISA de suero de pacientes humanos de leishmaniasis con título de
    anticuerpos específicos de MAPS (8/27/96)
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