ES2387491A1 - Procedimiento y sistema para la obtención de imágenes cuantitativas en microscopía óptica de fase. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento y sistema para la obtención de imágenes cuantitativas en microscopia óptica de fase.Procedimiento para la obtención de imágenes de muestras en microscopía óptica que permite obtener imágenes con información completa cuantitativa de fase o diferencia de camino óptico de muestras (M) microscópicas mediante la generación de imágenes simultaneas de gradiente de fase.La luz emergente de la muestra, iluminada por una diversidad de ondas planas, se divide en cuatro haces mediante el uso de medios ópticos o electro-ópticos. Simultáneamente se genera la imagen de la muestra con los cuatro haces sobre un sensor matricial. Las imágenes están directamente relacionadas con el gradiente. Un algoritmo de integración numérica obtiene la fase a partir de la información de gradiente.De utilidad especial como técnica de microscopia en biología y biomedicina.
Description
Procedimiento y sistema para la obtencion de imagenes cuantitativas en microscopia optica de fase
La presente invencion se refiere a un metodo y sistema para la obtencion de imagenes de objetos microscopicos con informacion cuantitativa de fase especialmente indicado para el estudio de muestras de interes biologico .
En microscopia, en muchas ocasiones no es posible o conveniente el uso de tinciones. En estos casos, los medios biologicos resultan frecuentemente transparentes, de forma que su observacion solo es posible a traves de la deteccion de la variacion del indice de refraccion. Cuando la luz atraviesa estos medios esta variacion espacial del indice queda impresa en la fase del campo electrico de la luz. Desafortunadamente la fase no puede observarse directamente. Para solventar esta dificultad existen diferentes tecnicas clasicas como el microscopio de Zernike o el de Nomarski. Los microscopios comerciales incluyen la posibilidad de su uso, sin embargo, la informacion proporcionada es parcial: puede detectarse la presencia de estructuras relacionadas con variaciones de indice pero no se pueden cuantificar. Posteriormente se han propuesto tecnicas interferenciales (holograficas) (Cuche, E., F. Bevilacqua, et al. (1999). "Digital holography for quantitative phase-contrast imaging." Opt. Lett. 24(5): 291-293; Charriere, F., A. Marian, et al. (2006). "Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy." Opt. Lett. 31(2): 178-180) que proporcionan informacion completa pero que involucran el uso de luz coherente, haces de referencia y requieren mantener estabilidad mecanica en el sistema durante el registro. En su lugar, se ha propuesto la deteccion directa de la fase con un sensor basado en la tecnica de desplazamiento lateral Bon, P., G. Maucort, et al. (2009). "Quadriwave lateral shearing interferometry for quantitative phase microscopy of living cells." Opt. Express 17(15): 13080-13094 pero que involucra complejidad instrumental y tiene limitaciones relacionadas con la coherencia de la luz y la densidad de datos obtenible.
El sistema de iluminacion y adquisicion de datos en microscopia cuantitativa de fase que la invencion propone, resuelve, de forma plenamente satisfactoria, la problematica anteriormente expuesta en los distintos aspectos comentados. En particular: simplifica el procedimiento y proporciona gran densidad de datos de forma ajustable.
Para ello, la invencion se basa en la conjugacion, mediante un objetivo de microscopio y otros componentes opticos convencionales, de la luz que ha atravesado la muestra sobre un plano intermedio donde se divide en cuatro partes mediante un dispositivo optico o electro-optico. Una vez dividida, la luz se conduce opticamente a un sensor matricial que detecta cuatro imagenes de la muestra que son procesadas digitalmente dando lugar a un mapa bidimensional del cambio de fase generado por la muestra.
El plano donde se divide el haz de luz en cuatro, es un plano focal o plano donde se ha generado la transformada de Fourier del campo electrico.
En un ejemplo preferencial, la division anterior se produce mediante un dispositivo optico refractivo consistente en una piramide de cuatro caras cuyos vertices definen la localizacion espacial de dos ejes X e Y siendo el eje Z el correspondiente al eje optico de todo el sistema optico. Cada uno de los prismas que componen la piramide desvian la luz en hacia sus respectivas bases, que estan opuestas.
La optica posterior al componente de division de haz, conjuga el plano de la muestra con un sensor matricial tal como un CCD donde se obtienen cuatro imagenes simultaneas. Esta optica puede ser variable de forma que permita modificar los aumentos de la muestra sobre el sensor y por tanto el muestreo de la fase.
En condiciones estaticas, el sensor registra senales relacionadas con el gradiente local de la fase introducida por la muestra pero con un rango de medida restringido y poca ganancia. Para mejorar la ganancia es ventajoso
modular el sistema.
En una configuracion alternativa, la modulacion se obtiene mediante la oscilacion del haz o del dispositivo divisor durante el tiempo de adquisicion de las imagenes, de forma que la senal registrada sea proporcional al gradiente estableciendose la ganancia a traves del control de la amplitud de oscilacion. En estas condiciones, el
gradiente de la fase
es proporcional a las senales Sx ySxy que se obtienen a partir de
xy
las cuatro imagenes J )Ixyen el sensor mediante las expresiones
i
Finalmente la fase se reconstruye computacionalmente a partir de la informacion de gradiente con un algoritmo de integracion.
En una configuracion alternativa y preferente, la modulacion de la senal se obtiene de forma estatica mediante la iluminacion de la muestra utilizando como fuente una superficie emisora plana simetrica de luz incoherente de extension controlable. Esta fuente se conduce opticamente al plano de la muestra de tal manera que, en virtud a la incoherencia de la fuente, es posible considerar que la muestra es atravesada simultaneamente por una multiplicidad de haces colimados con diferentes angulos respecto al eje optico que generan simultaneamente una multiplicidad de transformadas de Fourier desplazadas lateralmente sobre el elemento divisor de haz. La extension de la fuente es responsable de la ganancia del sistema dado que la distancia de un punto de la fuente al eje optico esta directamente relacionada con el desplazamiento generado sobre el elemento divisor de haz.
Para complementar la descripcion que se realiza y con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caracteristicas de la invencion, de acuerdo con un ejemplo preferente de realizacion practica del mismo, se acompana, como parte integrante de dicha descripcion, un juego de dibujos en donde, con caracter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
La figura 1 muestra de forma esquematica el principio general del instrumento que se propone.
La figura 2 ilustra el procedimiento a partir de las imagenes involucradas.
A la vista de las figuras resenadas puede observarse como el procedimiento de la invencion se basa en la utilizacion de un sistema optico para conjugar la luz emergente a traves de la muestra sobre un detector una vez que el haz ha sido dividido por el efecto de, preferentemente, un componente refractor piramidal en el plano correspondiente a la transformada de Fourier.
Tal como se representa en la figura 1(a), se ilumina una muestra (M) con fuente de luz incoherente consistente en un emisor extenso (F) que tiene acoplado un diafragma (D) para controlar la extension de la fuente. Este diafragma se situa en el plano focal anterior de una lente de tal manera que a la salida de la lente (L1) el haz de luz se puede considerar una superposicion de ondas planas con una diversidad de direcciones de propagacion distribuidas de forma simetrica alrededor del eje optico. El campo asi generado a la salida de la lente, se conjuga opticamente mediante las
lentes (L2) y (L3) sobre la muestra (M).
Tal como se muestra en la figura 1(b) un objetivo de microscopio (OM) y una lente (L4) conjugan la luz emergente de la muestra sobre una lente (L5). En el plano focal imagen de esta lente, se situa la piramide refractora (P). Una lente (L6) sirve para conjugar el plano de la muestra sobre un sensor matricial (S).
5 En la figura 2 (a) se muestra el retardo de fase o diferencia de camino optico generado por una muestra consistente en dos microesferas transparentes. En la figura 2 (b) la imagen que obtendria el sensor. En las imagenes de la figura 2, (c) y (d) los gradientes en las direcciones X e Y calculados a partir de la imagen anterior. En la figura 2 (e), la imagen correspondiente a la fase reconstruida a partir de la integracion de la informacion contenida en las imagenes anteriores.
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1.- Procedimiento para la obtencion de imagenes de fase de muestras en microscopia optica, caracterizado por que comprende los pasos de:a. iluminar una muestra (M) mediante un haz de luz,5 b. conjugar la luz que ha atravesado la muestra en un plano intermedio donde el haz se divide en cuatro mediante un dispositivo divisor (P) optico o electro-optico, obteniendose asi una informacion de gradiente
- c.
- conducir opticamente los haces de luz resultado de la division a un sensor matricial (S)
- d.
- aplicar un algoritmo de integracion numerica para obtener la fase a partir de la informacion registrada de gradiente
10 2.- Procedimiento segun la reivindicacion 1 caracterizado porque se modula la senal antes de iluminar la muestra mediante la utilizacion de una fuente de luz incoherente con superficie de emision plana de extension controlable. - 3.- Procedimiento segun la reivindicacion 1 caracterizado porque se modula la senal mediante la oscilacion del haz tras atravesar la muestra (M).
- 4.- Procedimiento segun la reivindicacion 1 caracterizado porque se modula la senal mediante la oscilacion 15 del dispositivo divisor (P).
- 5.- Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el divisor del haz es una piramide de cuatro caras.
- 6.- Sistema de microscopia de fase para llevar a cabo el procedimiento de la reivindicacion 5 caracterizado porque comprende una fuente emisora de luz incoherente (F), con superficie de emision plana y extendible, medios opticos20 de transmision de la luz a traves de un plano de muestra (M), un sensor matricial (S), una piramide de cuatro caras situada en un plano entre la muestra y el sensor (S) para separar el haz en cuatro, obteniendo asi una informacion de gradiente y medios de programa para aplicar un algoritmo de integracion numerica para obtener la fase a partir de la informacion de gradiente.FIGURA 1OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCASN.O solicitud: 201130259ESPANAFecha de presentacion de la solicitud: 28.02.2011Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl.: G02B21100 (2006.01) G01B9104 (2006.01)DOCUMENTOS RELEVANTES
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- CN 101893755 A (XI AN OPTICS PRECISION MECH) 24.11.2010, todo el documento. 1,2,5,6
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- US 4200353 A (HOFFMAN, R.) 29.04.1980, resumen; columna 1, linea 62 - columna 2, linea 30; columna 2, linea 58 - columna 4, linea 35; figuras 1,2,2A. 1-6
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- US 20090135486 A1 (MCNULTY, I.) 28.05.2009, todo el documento. 1,2,5,6
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- WO 9529420 A1 (DODT, H.) 02.11.1995, todo el documento. 1-6
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- US 4577940 A (KRASINSKI, J. et al.) 25.03.1986
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- JP 11119107 A (OLYMPUS OPTICAL CO.) 30.04.1999
- Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgacion no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentacion de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentacion de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nO:
- Fecha de realizaci6n del informe 12.06.2012
- Examinador O. Gonzalez Penalba Pagina 1/4
INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICANO de solicitud: 201130259Documentacion minima buscada (sistema de clasificacion seguido de los simbolos de clasificacion) G02B, G01B Bases de datos electronicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos debusqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, INSPECInforme del Estado de la Tecnica Pagina 2/4OPINION ESCRITANO de solicitud: 201130259Fecha de Realizacion de la Opinion Escrita: 12.06.2012Declaraci6n- Novedad (Art. .1 LP 11/198 )
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 )
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicacion industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opini6n.-La presente opinion se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Tecnica Pagina 3/4OPINION ESCRITANO de solicitud: 2011302591. Documentos considerados.-A co ntinuacion se r elacionan l os documentos pertenecientes al estado de l a t ecnica t omados en c onsideracion para l a realizacion de esta opinion.- Documento
- Numero Publicaci6n o Identificaci6n Fecha Publicaci6n
- D01
- CN 101893755 A (XI AN OPTICS PRECISION MECH) 24.11.2010
- D02
- US 4200353 A (HOFFMAN, R.) 29.04.1980
- D03
- US 20090135486 A1 (MCNULTY, I.) 28.05.2009
- 2. Declaraci6n motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecuci6n de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci6nSe ha considerado, dentro del limite de tiempo establecido al efecto, que la invencion definida en las reivindicaciones 1-6 de la pr esente S olicitud parece t ener n ovedad y act ividad i nventiva p or no estar co mprendida en el estado d e l a t ecnica n i poder deducirse de este de forma evidente por un experto en la materia.En los documentos citados en el presente Informe sobre el Estado de la Tecnica (IET) se recogen diversos aspectos del campo tecnologico de la invencion, con algunas caracteristicas del objeto tecnico definido en dichas reivindicaciones, pero ninguno de ellos aporta una solucion tecnica completa similar para un microscopio de contraste de fase con modulacion. Asi, por e jemplo, el documento D01, c itado en el I ET co n l a c ategoria A , co mo m ero r eflejo d el est ado d e l a tecnica, describe u n m icroscopio d e f luorescencia c on un a i luminacion est ructurada m ediante el uso d e un a l ente pi ramidal qu e genera un ca mpo de i nterferencia de cu atro haces. Sin embargo, este elemento divisor esta situado antes de la muestra, como componente de iluminacion, y no despues, en un plano conjugado intermedio, como en la invencion. Por su parte, en el documento D02, tambien citado en el IET con la categoria A, se describe una disposicion estructural para un microscopio de contraste de fase con modulacion parecida a la de la invencion, pero en este caso el elemento modulador es diferente: no es un pr isma qu e di vida l a l uz en cu atro hace s, si no un e lemento opt ico pr ovisto de u na hendidura co n zo nas de transmitancia diferentes que provocan un gradiente de fase reconstruible. Y otro tanto puede decirse del documento D03, en el que el elemento modulador es una lente de enfoque de voluta o espiral.Parece concluirse, por lo tanto, que la invencion tiene novedad y actividad inventiva segun los Articulos 6 y 8 de la vigente Ley de Patentes.Informe del Estado de la Tecnica Pagina 4/4
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG2A | Definitive protection |
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