WO2012117139A1 - Procedimiento y sistema para la obtención de imágenes cuantitativas en microscopía óptica de fase - Google Patents
Procedimiento y sistema para la obtención de imágenes cuantitativas en microscopía óptica de fase Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method and system for obtaining images of microscopic objects with quantitative phase information especially indicated for the study of samples of biological interest.
- the lighting and data acquisition system in quantitative microscopy phase that the invention proposes, solves, in a fully satisfactory way, the problem described above in the different aspects mentioned.
- the invention is based on the conjugation, by means of a microscope objective and other conventional optical components, of the light that has passed through the sample on an intermediate plane where it is divided into four parts by means of an optical or electro-optical device. Once divided, the light is optically conducted to a matrix sensor that detects four images of the sample that are digitally processed resulting in a two-dimensional map of the phase change generated by the sample.
- the plane where the beam of light is divided into four is a focal plane or plane where the Fourier transform of the electric field has been generated.
- the above division is produced by a refractive optical device consisting of a four-sided pyramid whose vertices define the spatial location of two X and Y axes, with the Z axis corresponding to the optical axis of the entire optical system.
- a refractive optical device consisting of a four-sided pyramid whose vertices define the spatial location of two X and Y axes, with the Z axis corresponding to the optical axis of the entire optical system.
- Each of the prisms that make up the pyramid deflects the light towards their respective bases, which are opposite.
- the optics after the beam division component conjugates the sample plane with a matrix sensor such as a CCD where four simultaneous images are obtained.
- This optics can be variable in a way that allows modifying the increases of the sample on the sensor and therefore the sampling of the phase.
- the senor records signals related to the local gradient of the phase introduced by the sample but with a restricted measuring range and low gain. To improve the gain it is advantageous to modulate the system.
- the modulation is obtained by oscillating the beam or the dividing device during the time of acquisition of the images, so that the recorded signal is proportional to the gradient by establishing the gain through the oscillation amplitude control. Under these conditions, the phase gradient is proportional to the signals. (S x (x, y), S y (x, y)) which are obtained from the four images I ⁇ (x, y) on the sensor by means of the expressions
- phase is reconstructed computationally from the gradient information with an integration algorithm.
- the signal modulation is obtained statically by lighting the sample using as a source a symmetrical flat emitting surface of incoherent light of controllable extension.
- This source is optically directed to the plane of the sample in such a way that, by virtue of the inconsistency of the source, it is possible to consider that the sample is traversed simultaneously by a multiplicity of collimated beams with different angles relative to the optical axis that simultaneously generate a multiplicity of Fourier transforms displaced laterally on the beam splitter element.
- the extension of the source is responsible for the gain of the system since the distance of a point from the source to the optical axis is directly related to the displacement generated on the beam splitter element.
- FIG 1 schematically shows the general principle of the proposed instrument.
- Figure 2 illustrates the procedure from the images involved.
- the method of the invention is based on the use of an optical system to conjugate the light. emerging through the sample on a detector once the beam has been divided by the effect of, preferably, a pyramidal refractor component in the plane corresponding to the Fourier transform.
- a sample (M) with incoherent light source consisting of an extensive emitter (F) having a diaphragm (D) coupled to control the source extension is illuminated.
- This diaphragm is located in the anterior focal plane of a lens such that at the exit of the lens (L1) the light beam can be considered a superposition of plane waves with a diversity of propagation directions symmetrically distributed around the lens. optical axis
- the field thus generated at the lens outlet is optically conjugated by the lenses (L2) and (L3) on the sample (M).
- the refractive pyramid (P) is located in the focal plane image of this lens.
- a lens (L6) serves to conjugate the sample plane on a matrix sensor (S).
- Figure 2 (a) shows the phase delay or optical path difference generated by a sample consisting of two transparent microspheres.
- FIG 2 (b) the image that the sensor would obtain.
- the images in Figure 2 (c) and (d) the gradients in the X and Y directions calculated from the previous image.
- Figure 2 (e) the image corresponding to the reconstructed phase from the integration of the information contained in the previous images.
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Abstract
Procedimiento para la obtención de imágenes de muestras en microscopía óptica que permite obtener imágenes con información completa cuantitativa de fase o diferencia de camino óptico de muestras (M) microscópicas mediante la generación de imágenes simultaneas de gradiente de fase. La luz emergente de la muestra, iluminada por una diversidad de ondas planas, se divide en cuatro haces mediante el uso de medios ópticos o electro- ópticos. Simultáneamente se genera la imagen de la muestra con los cuatro haces sobre un sensor matricial. Las imágenes están directamente relacionadas con el gradiente. Un algoritmo de integración numérica obtiene la fase a partir de la información de gradiente. De utilidad especial como técnica de microscopia en biología y biomedicina.
Description
PROCEDIMIENTO Y SISTEMA PARA LA OBTENCIÓN DE IMÁGENES CUANTITATIVAS EN MICROSCOPÍA ÓPTICA DE FASE
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método y sistema para la obtención de imágenes de objetos microscópicos con información cuantitativa de fase especialmente indicado para el estudio de muestras de interés biológico .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En microscopía, en muchas ocasiones no es posible o conveniente el uso de tinciones. En estos casos, los medios biológicos resultan frecuentemente transparentes, de forma que su observación solo es posible a través de la detección de la variación del índice de refracción. Cuando la luz atraviesa estos medios esta variación espacial del índice queda impresa en la fase del campo eléctrico de la luz. Desafortunadamente la fase no puede observarse directamente. Para solventar esta dificultad existen diferentes técnicas clásicas como el microscopio de Zernike o el de Nomarski. Los microscopios comerciales incluyen la posibilidad de su uso, sin embargo, la información proporcionada es parcial: puede detectarse la presencia de estructuras relacionadas con variaciones de índice pero no se pueden cuantificar. Posteriormente se han propuesto técnicas interferenciales (holográficas) (Cuche, E., F. Bevilacqua, et al. (1999). "Digital holography for quantitative phase- contrast imaging." Opt. Lett. 24(5): 291 -293; Charriére, F., A. Marian, et al. (2006). "Cell refractive índex tomography by digital holographic microscopy." Opt. Lett. 31 (2): 178-180) que proporcionan información completa pero que involucran el uso de luz coherente, haces de referencia y requieren mantener estabilidad mecánica en el sistema durante el registro. En su lugar, se ha propuesto la detección directa de la fase con un sensor basado en la técnica de desplazamiento lateral Bon, P., G. Maucort, et al. (2009). "Quadriwave lateral shearing interferometry for quantitative phase microscopy of living cells." Opt. Express 17(15): 13080-13094 pero que involucra complejidad instrumental y tiene limitaciones relacionadas con la coherencia de la luz y la densidad de datos obtenible.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El sistema de iluminación y adquisición de datos en microscopía cuantitativa
de fase que la invención propone, resuelve, de forma plenamente satisfactoria, la problemática anteriormente expuesta en los distintos aspectos comentados. En particular: simplifica el procedimiento y proporciona gran densidad de datos de forma ajustable.
Para ello, la invención se basa en la conjugación, mediante un objetivo de microscopio y otros componentes ópticos convencionales, de la luz que ha atravesado la muestra sobre un plano intermedio donde se divide en cuatro partes mediante un dispositivo óptico o electro-óptico. Una vez dividida, la luz se conduce ópticamente a un sensor matricial que detecta cuatro imágenes de la muestra que son procesadas digitalmente dando lugar a un mapa bidimensional del cambio de fase generado por la muestra.
El plano donde se divide el haz de luz en cuatro, es un plano focal o plano donde se ha generado la transformada de Fourier del campo eléctrico.
En un ejemplo preferencial, la división anterior se produce mediante un dispositivo óptico refractivo consistente en una pirámide de cuatro caras cuyos vértices definen la localización espacial de dos ejes X e Y siendo el eje Z el correspondiente al eje óptico de todo el sistema óptico. Cada uno de los prismas que componen la pirámide desvían la luz en hacia sus respectivas bases, que están opuestas.
La óptica posterior al componente de división de haz, conjuga el plano de la muestra con un sensor matricial tal como un CCD donde se obtienen cuatro imágenes simultaneas. Esta óptica puede ser variable de forma que permita modificar los aumentos de la muestra sobre el sensor y por tanto el muestreo de la fase.
En condiciones estáticas, el sensor registra señales relacionadas con el gradiente local de la fase introducida por la muestra pero con un rango de medida restringido y poca ganancia. Para mejorar la ganancia es ventajoso modular el sistema.
En una configuración alternativa, la modulación se obtiene mediante la oscilación del haz o del dispositivo divisor durante el tiempo de adquisición de las imágenes, de forma que la señal registrada sea proporcional al gradiente estableciéndose la ganancia a través del control de la amplitud de oscilación. En estas condiciones, el gradiente de la fase es proporcional a las señales
(Sx (x,y) , Sy (x, y)) q ue se obtienen a partir de las cuatro imágenes I¡(x, y) en el sensor mediante las expresiones
Finalmente la fase se reconstruye computacionalmente a partir de la información de gradiente con un algoritmo de integración.
En una configuración alternativa y preferente, la modulación de la señal se obtiene de forma estática mediante la iluminación de la muestra utilizando como fuente una superficie emisora plana simétrica de luz incoherente de extensión controlable. Esta fuente se conduce ópticamente al plano de la muestra de tal manera que, en virtud a la incoherencia de la fuente, es posible considerar que la muestra es atravesada simultáneamente por una multiplicidad de haces colimados con diferentes ángulos respecto al eje óptico que generan simultáneamente una multiplicidad de transformadas de Fourier desplazadas lateralmente sobre el elemento divisor de haz. La extensión de la fuente es responsable de la ganancia del sistema dado que la distancia de un punto de la fuente al eje óptico está directamente relacionada con el desplazamiento generado sobre el elemento divisor de haz.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se realiza y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña, como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
La figura 1 muestra de forma esquemática el principio general del instrumento que se propone.
La figura 2 ilustra el procedimiento a partir de las imágenes involucradas.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
A la vista de las figuras reseñadas puede observarse cómo el procedimiento de la invención se basa en la utilización de un sistema óptico para conjugar la luz
emergente a través de la muestra sobre un detector una vez que el haz ha sido dividido por el efecto de, preferentemente, un componente refractor piramidal en el plano correspondiente a la transformada de Fourier.
Tal como se representa en la figura 1 (a), se ilumina una muestra (M) con fuente de luz incoherente consistente en un emisor extenso (F) que tiene acoplado un diafragma (D) para controlar la extensión de la fuente. Este diafragma se sitúa en el plano focal anterior de una lente de tal manera que a la salida de la lente (L1 ) el haz de luz se puede considerar una superposición de ondas planas con una diversidad de direcciones de propagación distribuidas de forma simétrica alrededor del eje óptico. El campo así generado a la salida de la lente, se conjuga ópticamente mediante las lentes (L2) y (L3) sobre la muestra (M).
Tal como se muestra en la figura 1 (b) un objetivo de microscopio (OM) y una lente (L4) conjugan la luz emergente de la muestra sobre una lente (L5). En el plano focal imagen de esta lente, se sitúa la pirámide refractora (P). Una lente (L6) sirve para conjugar el plano de la muestra sobre un sensor matricial (S).
En la figura 2 (a) se muestra el retardo de fase o diferencia de camino óptico generado por una muestra consistente en dos microesferas transparentes. En la figura 2 (b) la imagen que obtendría el sensor. En las imágenes de la figura 2, (c) y (d) los gradientes en las direcciones X e Y calculados a partir de la imagen anterior. En la figura 2 (e), la imagen correspondiente a la fase reconstruida a partir de la integración de la información contenida en las imágenes anteriores.
Claims
1 .- Procedimiento para la obtención de imágenes de fase de muestras en microscopía óptica, caracterizado por que comprende los pasos de:
- a. iluminar una muestra (M) mediante un haz de luz,
- b. conjugar la luz que ha atravesado la muestra en un plano intermedio donde el haz se divide en cuatro mediante un dispositivo divisor (P) óptico o electro-óptico, obteniéndose así una información de gradiente
- c. conducir ópticamente los haces de luz resultado de la división a un sensor matricial (S)
- d. aplicar un algoritmo de integración numérica para obtener la fase a partir de la información registrada de gradiente
2 - Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque se modula la señal antes de iluminar la muestra mediante la utilización de una fuente de luz incoherente con superficie de emisión plana de extensión controlable.
3. - Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque se modula la señal mediante la oscilación del haz tras atravesar la muestra (M).
4. - Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque se modula la señal mediante la oscilación del dispositivo divisor (P).
5. - Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el divisor del haz es una pirámide de cuatro caras.
6. - Sistema de microscopía de fase para llevar a cabo el procedimiento de la reivindicación 5 caracterizado porque comprende una fuente emisora de luz incoherente (F), con superficie de emisión plana y extendible, medios ópticos de transmisión de la luz a través de un plano de muestra (M), un sensor matricial (S), una pirámide de cuatro caras situada en un plano entre la muestra y el sensor (S) para separar el haz en cuatro, obteniendo así una información de gradiente y medios de programa para aplicar un algoritmo de integración numérica para obtener la fase a partir de la información de gradiente.
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| EP2682800A4 (en) | 2017-11-22 |
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