ES2386831B1 - Uso de inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) y sus composiciones, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 (DM1) - Google Patents

Abstract

Uso de inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) y sus composiciones, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y la prevención de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 (DM1).#Uso de de una composición, que comprende al menos un inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS), y preferentemente el L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la prediabetes y la diabetes mellitus tipo 1 en un mamífero.

Description

USO de Inhibidores de la actividad de las NO sintasas (NOS) y sus

composiciones. en la elaboración de un medicamento para el tratamiento

y la prevención de la prediabetl!s y la diabetes mellitus tipo 1 (DM1)

5

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la

farmacologia , y se refiere al uso de inhibidores de la actividad de las NO

sintasas (NOS) , para la elaboración de un medicamento o composición

farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1

(DM1 ).

JO

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La diabetes mellitus (DM) es un sindrome de elevada morbi-mortalidad, que

cursa con una permanente elevación de la glucemia debido a un déficit

15

absoluto o relati vo de la secreción de insulina por la célula beta del islote

pancreático. Este déficit es debido" la muerte, principalmente por apoptosis,

de las células beta como consecuencia de un proceso autoinmune que se inicia

mucho antes de la aparición de los primeros sintomas de la enfermedad . La

observación de los procesos prolifer"tivos a lo largo de la insulitis sugieren que

20

además de la muerte celular existen también mecanismos que frenan el

proceso regenerati vo de la célula beta en respuesta a estos daños.

La diabetes mellitus puece ser delinida como una elevación crónica de la

glucosa en sangre (hiperglucemia). Con frecuencia se acompaña de polidipsia ,

25

poliuria y pérdida de peso y puede, Eln ausencia de tratamiento, desencadenar

coma y muerte. La hiperglucemia y otras alteraciones bioquimicas son

producidas por una insuficiente secreción o acción de la insulina , que es una

hormona responsable del control elel metabolismo de la glucosa , grasa y

aminoácidos. La DM representa un alto riesgo para padecer enfermedad

30

progresiva de la retina , el riñón y los nervios periféricos; además, agrava el

proceso aterosclerótico afectando, especialmente, al corazón , los miembros

inferiores y el cerebro.

La diabetes metlitus tipo 1 (DM1), tanto en humanos como en animates, es un

proceso autoinmune que se manifiesta por infiltración linfomonocitaria

pancreática y por ta presencia de anticuerpos antiislotes circulantes y que cursa

con deterioro funcional y estructural progresivo de la masa de células beta

5

(Castaño & Eisenbarth. Annu Rev Immunol. 1990; 8 647-79). Representa entre

el 5 y el 10% de los casos totales dEl diabetes, pero el hecho de que tenga su

comienzo en la infancia y las graves complicaciones que lleva asociada tanto a

corto como a largo plazo la con viert,an en una patologia de alto impacto tanto

social como sanitario. En cuanto a su patogénesis existe un grado variable de

10

predisposición genética junto a determinados factores ambientales que

determinan las alteraciones inmunológicas y metabólicas que causan

finalmente el sindrome de hiperglucemia crónica . Afecta, fundamentalmente, a

población joven (1 /500 niños; 11:200 adolescentes) considerándose una

incidencia en nuestro pais de 10-1¿~ casos/100.000 habitantes/año (Goday &

J5

Serrano-Rios 1994. Med Chn (Bare) 102 (8): 306-15; Mathis et al., 2001 .

Nature. 414 (6865): 792-8).

La DM1 se inicia con un desorden de la inmunoregulación de origen

desconocido que da lugar a la pres,antación de autoantígenos pancreáticos a

20

linfocitos T autoreactivos. Esto provoca su activación y posterior reclutamiento

al territorio pancreático dando lugar a una infiltración linfomonocitaria, con

participación de macrófagos y células dendríticas, que deriva en un proceso

inflamatorio local conocido como insulitis. Las células del infiltrado, bien de

forma directa o mediante la liberación de citoquinas inflamatorias (IL-1beta,

25

TNF-alfa e IFN-gamma) inducen un proceso de muerte de la célula beta,

mayoritariamente por apoptosis, qUEl es un proceso activo y programado de

muerte celular, regulado por genes y controlado por diversos factores (Mathis

et al. , 2001 . Nature 414 (6865): 792-8.).

30

El periodo que precede el inicio clinico de la enfermedad se denomina

prediabetes. El evento que detE3rmina su inicio es la aparición de

autoanticuerpos (Ziegler et al., 1999. Diabetes Careo 1999;22:1296 -1301) y a

partir de entonces comienza una etapa de duración variable, asintomática yen

la que se va produciendo la pérdida gradual de la masa beta como

consecuencia del proceso autoinmune. Cuando la destrucción de las células

beta es muy evidente aparece un nuevo evento que es la pérdida de la primera

5

fase de la respuesta secretora de la célula beta a una sobrecarga intravenosa

de glucosa (Srikanta et al 1983). Esta etapa culmina con el inicio clinico de la

enfermedad que tiene lugar cuando la masa beta pancreática ha descendido

hasta el 10-20% de su totalidad .

10

Se han descrito distintos mecanismos por los cuales las citoquinas

proinflamatorias inducen apoptosis en las células beta pancreáticas. IL-1beta,

IFN-gamma o TNF-alfa se unen a receptores especificos de membrana que se

encuentran presentes en la célula beta, activando rutas de señalización entre

las que se encuentran las MAPK (mitogen-activated protein kinase) y la de

J5

activación de NF-kB. Estudios realizados en líneas celulares productoras de

insulina prueban que la vía preferencial activada por acción apoptótica de las

citoquinas proinflamatorias dentro dI" las MAPK es la via de JNK. Las rutas

alternativas ERK1 /2 y p38 no parecen participar en la respuesta de apoptosis

ya que su inhibición no altera el porcentaje de células apoptóticas inducido por

20

citoquinas (Ammendrup et al. , 2000. Diabetes. 49 (9): 1468-76). La importancia

de la via JNK en la señalización de apoptosis por las citoquinas

proinflamatorias se prueba también por el hecho de que péptidos inhibidores de

dicha ruta bloquean la muerte de líneas celulares productoras de insulina

sensibles a IL-1 beta en respuesta a la citoquina (Bonny et al., 2001 . Diabetes

25

50 (1): 77-82). Además de la capacidad proapoptotica de las citoquinas

proinflamatorias, nuestro grupo ha podido observar un efecto antiproliferativo

de las mismas sobre islotes murinos cultivados que parece estar mediada, al

menos en parte por una inhibición de la via de señalización de ERK1 12,

perteneciente al grupo de las MAPK (Blandino-Rosano et al. , 2008. J Mol

30

Endocrinol. 41 35-44). Este descenso en los niveles de proliferación puede ser

también demostrado "in vivo" en la rata BB, un modelo animal de DM1 , en

"

estadios muy tempranos de la insulitis, antes de que comience el incremento

de apoptosis de las células beta.

El óxido nitrioo es una molécula que actúa como segundo mensajero en

5

numerosos procesos biológioos entre los que se destacan el oontrol del tono

muscular, la funcionalidad neuronal y la respuesta inmune y, en determinadas

situaciones, puede ejercer también acciones citotoxicas . Es producido a partir

del aminoácido L-arginina por la enzima óxido nitrico sintasa (NOS) que se

encuentra presente en los tejidos como una de las siguientes isoformas:

10

neuronal (nNOS o NOS 1), endotelial (eN OS o NOS 111) e inducible (iNOS o

NOS 11) (Moneada el al. , 1991. Phó'rmacol Rev. 43 (2): 109-42). Además de

estar reguladas en cuanto a su expresión ya que las dos primeras son

constitutivas y la tercera inducible, las isoformas de NOS pueden ser también

reguladas mediante modificaciones postranscripcionales que modifican su

J5

estabilidad o su actividad (Bredt el al , 1992. J Biol Chem. 267 (16): 10976-818

10; Michel el al., 1993. Proc Natl Acad Sci U S A 90 (13): 6252-6; Chesler el al.,

2004. J Inlerferon Cytokine Res. 24 (:2): 141-9.).

En las células beta pancreáticas se ha demostrado la presencia de nNOS en

20

condiciones basales. El NO que pl'Oduce actúa regulando, entre otros, los

procesos de producción de insulina (Lajoix el al. , 2001. Diabetes 50 (6): 1311

23; Rizzo & Pistan 2003. J Cefl 13iol 161 (2): 243-8). Ante determinados

estimulas oomo pueden ser alguna de las citoquinas proinflamatorias, la célula

beta responde sintetizando la forma inducible de la NOS (iNOS). Las altas

25

concentraciones de NO producidas por la iNOS han sido oonsideradas

clásicamente responsables, al menos en gran medida , de la destrucción de las

células beta durante la DM1 (Eizirik el al., 1986. Diabelologia 39 (8): 875-90).

Los mecanismos de acción del NO son diversos y están mediados por las

30

interacciones que realiza con distintas proteínas regulando su función, así

como por la capacidad de reaccionar con radicales libres dando lugar a

productos oomo los óxidos de nitrógeno o el peroxinitrito, potentes agentes

,.

.,

oxidantes que reaccionan con distintas moléculas ocasionándoles daño en su

estructura.

Clásicamente, se habia descrito que la inducción de apoptosis en la célula beta

5

por NO durante la DM1 , estaba mediada por la acción de algunos de estos

agentes oxidantes sobre el DNA provocando daños en las bases y cortes en la

hélice. Este daño en el DNA activaria p53 que a su vez es un factor inductor de

genes proapoptoticos como BAX, FAS y los miembros BH3-only de la familia

de BcI-2 NOXA Y PUMA. (Eizirik et al., 1996. Diabetologia 39 (8): 875-90). Sin

lO

embargo, estudios más recientes sugieren una via de apoptosis mediada por

NO independiente de p53 (Messmer & Brune 1996. Biochem J. 319 (Pt 1) (299

305). Se ha descrito que en célula beta primaria obtenida de rata , la apoptosis

inducida por las citoquinas proinflamatorias IL-1 beta+ TNF-alfa+IFN-gamma

está mediada en gran parte por NO, que actuaria inhibiendo la expresión de la

J5

bomba de Ca2+ ATPasa2b del retículo endoplásmico (SERCA2b)

paralelamente a la inducción de Gadd153/CHOP y de otros componentes de la

respuesta a estrés de retículo con la participación específica de la caspasa 12.

(Cardozo et al. , 2005. Diabetes 54 (;~): 452-61 , Eizirik et al. , 2008. Endocr Rev

29 (1): 42-61). Estudios recientes realizados en la linea de insulinoma de rata

20

RIN-r muestran también la importancia de la via mitocondrial en la apoptosis

mediada por el NO inducido tras el cultivo en presencia de las citoquinas IL

1beta e IFN-gamma (Holohan et al., :2008. J Gell Mol Med. 12 (2): 591-606). En

contraste con el efecto proapoptótico del NO sobre la célula beta, ha sido

descrito también un efecto promotor de la supervivencia cuando actúa a bajas

25

concentraciones a través de la ruta PI3-KlAkt (Tejedo et al., 2004.

Endocrinology. 145 (5): 2319-27).

La proliferación celular es otro proceso biológico en el que se ha descrito un

papel regulador del NO. Aunque su mayor efecto es inhibitorio, existen trabajos

30

que muestran un efecto del NO activando la proliferación en determinados

sistemas celulares. El efecto citostático del NO está asociado a altas

concentraciones y tiene lugar a través de diversos mecanismos moleculares

"

(Villalobo 2006. Febs J. 273 (11): 23:29-44). De forma general se ha observado

que el NO inhibe la transición de las fases G1 a S durante el ciclo celular. Esto,

en algunos casos, puede ser debido a la sobreexpresión de p21 , molécula

supresora de ciclo, que provoca la caída de Cdk2 y la hipofosforilación de la

5

proteína del retinoblastoma (Villalobo 2006. Febs J. 273 (11): 2329-44). Se ha

descrito también, en células de tumores de mama, que el aumento de NO

conlleva una disminución de la cielin" D1 sin cambios en la cielina E (Pervin el

al., 2001. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6): 3583-8). En algunos tipos

celulares, el efecto antiproliferativo d,al NO está mediado por la activación de la

10

enzima guanilato ciclasa y el subsecuente aumento de GMPc, que activa a su

vez a PKG y culmina con la fosforilación de Raf-1 y la interrupción de la vía de

señalización de ERK112 (Yu et al., 1997. Cireulalion. 95 (5): 1269-77). NO

puede ejercer también su efecto independientemente del GMPc

interaccionando directamente con moléculas relacionadas con el ciclo celular o

J5

con la señalización a través de factores de crecimiento y modificando su

actividad (Estrada et al. 1997. Biochem J. 326 (Pt 2) 369-76). En cuanto al

efecto proliferativo del NO, este ha sido descrito, a concentraciones bajas, en

fibroblastos, en lineas tumorales de células ductales pancreáticas y en células

PC12 (Hajri el al. , 1998. Br J Caneer. 78 (7): 841-9; Bal-Price el al., 2006. Nitric

20

Oxide. 14 (3): 238-46).

En célula beta pancreática, el papel del NO en la proliferación bajo condiciones

fisiológicas o en respuesta a daño ha sido muy poco estudiado. Estudios

recientes muestran que la activación de las rutas de producción de NO

25

mediante el suministro de L-Arginina, estimula la neogénesis de células beta en

un modelo murino de diabetes inducida por Alloxan (Vasilijevic el al., 2007. J

Physiol. 584 (Pt 3): 921-33). En contraste con este efecto restaurador del NO,

observaciones preliminares realiza,jas por nuestro grupo muestran que el

efecto antiproliferativo de las citoquinas proinflamatorias sobre las células beta

30

de los islotes en cultivo podría estar mediado por NO ya que se revierte en

presencia de L-NMMA, un inhibidor de la actividad de la NOS. Este efecto del

NO es independiente de la apoptosis ya que se puede observar también en

cultivos de islotes tratados con el inhibidor de caspasas z-VAD-fmk donde el porcentaje de apoptosis inducida por las citoquinas no varia con respecto a los cultivos control.

El único abordaje terapéutico de la DM1 ha sido hasta muy recientemente la

administración de insulina hasta normalizar los valores de glucosa en sangre.

Sin embargo, a lo largo de las últimas décadas han surgido estrategias terapéuticas, en la actualidad en distintas fases de desarrollo, que persiguen el restablecimiento de la función beta pancreática. Entre ellas se incluyen las que tienen como objetivo la sustitución del tejido destruido mediante trasplantes, tanto de páncreas completo como de islotes aislados, y las encaminadas a recuperar masa de células beta a partir de una población inicial de precursores (neogénesis) o de las propias células beta (proliferación). En este sentido seria

muy importante conocer los mecanismos íntimos que regulan la regeneración

de las células beta pancreáticas y su afectación por el proceso patogénico de la DM1

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Los autores de la presente invención han demostrado que el uso de Inhibidores de la actividad de los inhibidores de la sintasa de óxido nítrico, también denominados NO sintasas (NOS), asi como sus composiciones farmacéuticas, son útiles para la prevención y el tratamiento de la diabetes mellítus tipo 1, actuando también en el periodo de prediabetes, y preferiblemente en el periodo de prediabetes con componente auto inmune.

Asi pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de de una composición, que comprende al rnenos un inhibidor de la actividad de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1 en un

mamífero, incluyendo un humano, o alternativamente, a un inhibidor de la

actividad de cualquiera de las NO "intasas (NOS), para la prevención y/o el

"

tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1. Otro aspecto de la invención se

refiere al uso de una composición , que comprende un inhibidor de la actividad

de cualquiera de las NO sintasas (NOS), para la elaboración de un

medicamento para el tratamiento de la prediabetes en un mamifero, incluyendo

5

un humano, y más preferibleml3nte la prediabetes con componente

autoinmune, o alternativamente , a un inhibidor de la actividad de cualquiera de

las NO sintasas (NOS), para el tratamiento de la prediabetes en un mamífero,

incluyendo un humano, y más preferiblemente la prediabetes con componente

autoinmune .

10

En una realización preferida de la presente invención , el inhibidor de la

actividad de las NO sintasas (NOS) se seleccionan de la lista que comprende:

(a) una molécula orgánica ,

(b) una molécula de RNA,

J5

(c) un oligonucleótido antisentido,

(d) un anticuerpo, °

(e) una ribozima, o

cualquiera de sus combinaciones.

20

El término "NO sintasas" (NOS), se refiere a una familia de enzimas

eucarioticas que catalizan la producción de óxido nitrico (NO) a partir de la L

arginina , a tra vés de una catálisis orgánica de oxidorreducción (reacción

RedOx), sin gasto de energía o ATP. Tienen como Número EC: 1.14.13.39.

Son oxidorreductasas (ya que tiene un dominio oxidasa y un dominio

25

reductasa) responsable de la sintesis de óxido nítrico (ON , siglas en español , y

NO, siglas en inglés y más aceptado por poseer el orden de electronegatividad

creciente) a partir del átomo terminal de nitrógeno de la L-arginina en presencia

de nad-fosfato reducido o NADPH (nicotinamida-adenin-dinucleótido fosfato

reducido) y dioxigeno (O,). NOS es la única enzima conocida que une FAD

30

(flavín-adenín-dinucleótido), FMN (flavín mononucleótido), hemo,

tetrahidrobiopterina (BH,) y calmodulina. Catalizan la siguiente reacción :

L-Arg + NADPH + H+ + 02 ~NOHLA + NADP+ + H20

NOHLA + y, NADPH + Y, H+ + 02 ~L-citrulina + Y, NADP+ + NO + H20

Los distintos miembros de la famil ia NOS están codificadas por diferentes

5

genes. Hay tres isoformas conocidas, dos son constitutivas (CNOS) y la tercera

es inducible (iNOS). La clonación de enzimas NOS señala que NOS2 es

inducible, mientras que NOS3 y NOS1 son constitutivos, en cerebro y en tejido

endotelial respectivamente. En esta memoria, el término "NO sintasas" se

refiere a cualquiera de los miembros de la familia.

10

Así, la NOS3 (nitric oxide synthase 3, endothelial cell), también denominada

como EC-NOS; NOS type 111; NOSIII; OTTHUMP00000213183; cNOS;

constitutive NOS; endothelial NOS; nitric oxide synthase, endotelial, está

codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 7 (7q36). Tiene

J5

varias isoformas, Sus secuencias arninoacídicas se encuentra en la SEO ID

NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4

En el contexto de la presente invención, NOS3 se refiere también a cualquiera

de sus isoformas, y se define también por una secuencia de nucleótidos o

20

polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida

en las SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4, y que

comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacidica de la SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2,

25

SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotidica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b)

debido a la degeneración del código !lenético,

30

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídic:a con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO

ID NO: 3 y SEO ID NO: 4 y en las; que el polipéptido codificado por dichos

ácidos nucleicos posee la aclividad y las caracleristicas estruclurales de

cualquiera de las isoformas de la NOS3.

5

La NOS2 (nitric oxide synthase 2, inducible), lambién denominada como NOS

type 11; NOS, type 11; hepatocyle NOS; inducible NO synthase; inducible NOS;

nitric oxide synlhase 2A (inducible, hepatocytes); nitric oxide synthase,

inducible; nitric oxide synthase, macrophage; peplidyl-cysteine S-nilrosylase

NOS2, eslá codificado por un gen que se encuenlra en el cromosoma 17

10

(17q11.2-q12). Su secuencia aminoacidica se encuenlra en la SEO ID NO: 5.

En el contexto de la presenle invención, NOS2 se define también por una

secuencia de nucleólidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificanle de la proleina recogida Eln la SEO ID NO: 5, y que comprenderia

J5

diversas variantes procedenles de:

a) moléculas de ácido nucl eico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacidica de la SEO ID NO: 5,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotidica de a),

20

e) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b)

debido a la degeneración del código !lenético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídic:a con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 5, y en las que el

25

polipéplido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la aclividad y las

caracterislicas eslructurales del péptido NOS2.

La NOS1 (nitric oxide synthase 1, neuronal), lambién denominada como NOS;

bNOS; nNOS; IHPS1 ; N-NOS; NC-NOS; NOS1 , eslá codificado por un gen que

30

se encuenlra en el cromosoma 12 (12q24.2-q24.31). Su secuencia

aminoacidica se encuenlra en la SEClID NO: 6.

En el contexto de la presente invención, NOS1 se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante de la proteina recogida en la SEO ID NO: 6, y que comprenderia

diversas variantes procedentes de:

5

a) moléculas de ácido nud eico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacidica de la SEO ID NO: 6,

b) moléculas de ácido nudeico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinudeotidica de a),

c) moléculas de ácido nudeico cuya secuencia difiere de a) y/o b)

lO

debido a la degeneración del código !lenético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacidic:a con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 6, y en las que el

polipéptido codificado por dichos ácidos nudeicos posee la actividad y las

J5

características estructurales del péptido NOS1.

Los inhibidores de las NO sintasas son conocidos en el estado de la técnica.

Asi por ejemplo, se encuentran entre estos inhibidores L-NAME, 1400W, 1

amino-2-h id ro x i g u a n i d i na , á cid o 1-pirrolidinacarboditioico, 2-etil-2

20

tiopseudourea , 7-nitroindazol , aminoguanidina, mesilato de bromocriptina,

péptido dominio "scaffolding" de calveolina-1 , clorpromazina, dexametasona,

cloruro de difenileneiodonio, L-NIO, L-tiocitrulina , mercaptoetilguanidina,

ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos,

derivados o análogos, o cualquiera de sus combinaciones. Por tanto, en otra

25

realización preferida de la presente invención , los inhibidores de la actividad de

las NO sintasas (NOS) se seleccionan de la lista que comprende: L-NAME ,

1400W, 1-amino-2-hidroxiguanidina, ácido 1-pirrolidinacarboditioico, 2-etil-2

tiopseudourea , 7-nitroindazol , aminoguanidina, mesilato de bromocriptina,

péptido dominio "scaffo/ding" de calveolina-1 , clorpromazina , dexametasona,

30

cloruro de difenileneiodonio , L-NIO, L-tiocitrulina , mercaptoetilguanidina,

ADMA, L-NNA, N-PLA, L-NMMA o cualquiera de sus sales, profármacos,

derivados o análogos, o cualquiera dl3 sus combinaciones.

L-NAME, Hel (N"-Nitro-L-arginine Methyl Ester, Hydrochloride. N"-NOrL-ArgaMe, N"-NOrL-Arg-Ome) es un análogo de la arginina permeable en la célula y que actua como un inhibidor compelilivo y len lamente reversible de la NOS endolelial (leso = 500 nM). Inhibe de forma prolongada la relajación inducida por acelilcolina en anillos aorticos de rala (leso = 400 nM).

1400W, N-(3-Aminomethyl)benzylac6'tamidine, 2Hel. Es un inhibidor seleclivo e irreversible de la NOS inducible (iNOS, Ko = 7 nM) en ensayos "in vitro" e "in vivo". Tiene un efecto prolector en modelos de isquemia cerebral reduciendo el volumen de las lesiones isquémicas.

1-Amino-2-hidroxiguanidina, p-Toluenesulfonalo. Inhibidor permeable a la célula de la forma inducible de la NOS (leso = 68 ~M). Ensayado en

macrofagos murinos y celulas musculares lisas de aorta de rata en cultivo

Ácido 1-pirrolidinacarboditioico, sal de amonio. Inhibidor permeable a la célula

de la aclividad óxido nitrico sinlasa. Ensayado en macrofagos alveolares.

2-etil-2-tiopseudourea, Bromhidrato. Inhibidor potente, compelitivo y permeable a la célula de las Ires isoformas de la NOS (K, =17 nM para iNOS; K, = 36 nM para eNOS; K, =29 nM para nNOS).

7-Nilroindazol (eAS 2942-42-9). Inhibidor reversible y competitivo de la NOS con una alta especificidad para la forma neuronal (leso = 710 nM) aunque lambien se ha descrito aclividad inhibidora de la NOS endotelial bovina (leso = 800 nM).

Aminoguanidina, Hemisulfato. Inhibidor de las formas constilutiva (leso = 526 ~M) e inducible (leso = 250 ~M) de la NOS. Ensayado en homogeneizados de lejido ileal de rata.

Mesilato de bromocriplina. Inhibidor potente y seleclivo de la NOS neuronal

(ICso = 10 ~M) afectando su activación por calmodulina. Presenta solo un suave

efecto inhibitorio sobre la NOS inducible de los macrofagos (ICso >100 ~M).

Presenta además capacidad inhibitoria de la secreción de prolactina, actua

como agonista del receptor de dopamina D" modula la función de la P

5

glicoproteina e inhibe las actividades Mg" ATPasa (ICso = 300 nM) y P-gp

ATPasa inducida por verapamil (K; = 200 nM).

Péptido dominio "scaffolding" de calveolina-1. Es un peptido permeable a la

célula formado por el dominio "scaffolding" de calveolina-1 (C1-SD82.'01 ) unido

10

por el extremo animo terminal " la secuen cia de internalización de

Antennapedia. Ha sido descrito que bloquea "in vitro" la actividad eNOS y

reduce tumorigenesis e inflamación "in vivo",

Clorpromazina, Clorhidrato. Inhibe la NOS en cerebro de ratón y previene la

J5

inducción de NOS por lipopolisacarido en pulmón murino.

Dexamethasona. Es uno de los glucocorticoides más activos y estables. Entre

sus númerosas acciones, está la de inhibir la forma inducible de la NOS en

células endoteliales (ICso = 5 nM).

20

Clonuro de difenileneiodonio (DIP). Es un inhibidor permeable a la célula e

irreversible de la NOS endoteliaL Se ha descrito que inhibe la relajación

inducida por acetilcolina en anillos aórticos de rata previamente contraidos (ICso

= 180 nM). También inhibe NOS ¡nducible en macrófagos (ICso = 50 nM).

25

L-NIO L-N' -(1-lminoetil)omitina, dihidrocloruro. Potente inhibidor permeable a la

célula con mucha mayor especificidad por la NOS endotelial (eNOS; ICso = 500

nM) que otros análogos de arginina como L-NAME y L-NMMA. Inhibe la

relajación inducida por acetilcolina de anillos aorticos de rata (ICso = 2 ~M) Y

30

causa un incremento dosis dependiEmte de la presión arterial media en ratas

(ECso = 19.5 mg/kg).

5

L-NIL, dihidrocloruro. Inhibidor permeable a la célula , potente y selectivo de la NOS que presenta una especificidad 28 veces mayor por la forma inducible de la NOS (leso = 3.3 ~M) que por su forma neuronal (leso = 92 ~M). Presenta una potencia inhibitoria 10 veces superior a la de L-NMMA inhibiendo la producción de N02-inducida por interferón (leso = 460 nM).

L-Tiocitrullina, dihidrocloruro. Inhibidor permeable a la célula y selectivo de la forma neuronal de la NOS (K, = 60 nM).

10

Mercaptoetilguanidina, Hel. Inhibidor de la NOS inducible y secuestrador de peroxinitritos. Causa además una inhibición dosisdependiente de actividad eOX-1 yeOX-2.

J5

ADMA, 2Hel (W,W-Dimethyl-L-argil1ine), Dihidrocloruro Inhibidor permeable a la célula y reversible de la NOS ensayado "in vitro" (leso = 2-3 ~M)e "in vivo". Causa vasoconstricción y bradicardia de una forma dosis-dependiente.

20

L-NNA (W-Nitro-L-arginine. W-NO:rL-Arg). Potente inhibidor reversible y permeable a la célula de las isoforrnas neuronal y endotelial de la NOS. "In vivo" causa una reducción en la frecuencia cardiaca y profunda vasoconstricción.

25

N-PLA (W-Propyl-L-arginine. N'''-Propyl-L-arginine). Inhibidor potente, permeable a la célula, competitivo y tiempo-dependiente de la forma neuronal de la NOS (K, = 57 nM para nNOS; K, = 180 ~M para iNOS; K, = 8.5 ~M para eNOS).

30

L-NMMA (W-Monomethyl-L-arginine, Monoacetate Salt (N"'-Me-L-Arg, W-MeL-Arg, AcOH)) es un análogo de la L-arginina y actua como inhibidor competitivo de las tres isoformas de la NOS (K, = 700 nM fpara eNOS; K, = 3.9 ~M fpara iNOS; K, = 650 nM para nNOS). Inhibe la relajación inducida por histamina y acetilcolina en arteria pulmonar intacta de cobaya contraída

mediante norepinefrina con una K, = !).5 ~M (Ensayo "ex vivo").

5

En otra realización más preferida de la presente invención , el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) es la Nw-monometil-L-arginina (L-NMMA), de fórmula (1):

10

(1)

J5 20

o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos. Tal como aquí se utiliza, el término ~derivado" incluye tanto a compuestos farmacéutica mente aceptables, entre ellos, derivados del compuesto de fórmula (1), que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como derivados farmacéutica mente no aceptables, ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados: farmacéutica mente aceptables.

25 30

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el de fórmula (1). El término "profármaco" tal como aqui se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto inhibidor de cualquiera de las NOS sintasas, entre ellos el de fórrnula (1), por ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxilicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar , directa o indirectamente, dichos inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el compuesto de fórmula (1) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad de inhibidores de

cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el compuesto de fórmula (1)

cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación de inhibidores

de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos el compuesto de fórmula (1) en

un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica

5

siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el

compuesto de fórmula (1) en un compartimento biológico de un individuo. La

preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos

convencionales conocidos por los expertos en la materia.

10

Los inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y entre ellos la Nw

monometil-L-arginina (L-NMMA), o sus sales, profármacos, derivados o

análogos, pueden administrarse en una forma substancialmente pura a un

mamífero, y preferiblemente un humano, o puede administrarse como parte de

una composición más compleja . Cuando se administra formando parte de una

J5

composición, la cantidad de inhibidores de cualquiera de las NOS sintasas, y

entre ellos el Nul-monometil-L-arginina (L-NMMA), o sus sales, profármacos,

derivados o análogos, es tal que alcanza el efecto deseado, siendo por tanto

una cantidad efectiva

20

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia

a cualquier sustancia usada para prevención , diagnóstico, alivio, tratamiento o

curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la

presente invención, la enfermedad es la prediabetes o la diabetes mellitus tipo

1.

25

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa",

"substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente

farmacéutica mente activo" significa cualquier componente que potencialmente

proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el

30

diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o

que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El

término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la

elaboración del fármaco y están presenles en el mismo de una forma

modificada previsla que proporciona la actividad específica o el efecto.

Las composiciones de la presente ínvención pueden formularse para su

5

administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo

al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la lécnica.

Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos

biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tampanadas

o no tampanadas y tienen compommtes activos o inactivos adicionales. Los

10

componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica,

conservan les incluyendo, pero sin limilarse a, agenles antimicrobianos,

antioxidantes, quelanles, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa,

vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse

para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse

J5

con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a;

aglutinantes tales como celulosa microcristalina , goma tragacanto, o gelatina ;

excipientes tales corno almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como

ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de

magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal ; agentes

20

edulcorantes tales como sacarosa (1 sacarina; o agentes aromatizantes tales

como menta o salicilato de metilo.

Tales composiciones ylo sus formulaciones pueden administrarse a un animal,

incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas,

25

incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular,

subcutáneo, intracecal , intraventricular, oral , enteral , parenteral , intranasal o

dérmico. Preferiblemente, la vía de a,jministración es oral.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende

30

de una variedad de factores, corno por ejemplo, la edad, peso, sexo,

tolerancia , ... del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la

expresión "cantidad terapéutica mente efectiva" se refiere a la cantidad de

inhibidores de la NOS sintasas, y particularmente de la Nw-monometil-L

arginina (L-NMMA), o de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o de

sus combinaciones, que produzcan el efecto deseado y, en general , vendrá

determinada, entre otras causas, por las caracteristicas propias de dichos

5

profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los

"adyuvantes" y "vehiculos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser

utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los

técnicos en la materia .

10

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la

absorción, distribución o acción de cualquiera de los principios activos de la

presente invención , estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación

del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo

hagan más agradable. Asi pues, los excipientes podrian tener la función de

J5

mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o

celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del

medicamento como por ejemplo para aislarto del aire y/o la humedad , función

de relleno de una pastilla , cápsula o cualquier otra forma de presentación como

por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la

20

disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro

tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término excipiente "farmacéutica mente aceptable" hace referencia a que el

excipiente esté permitido y evalualjo de modo que no cause daño a los

25

organismos a los que se administra.

Además, el excipiente debe ser farmacéutica mente adecuado, es decir, un

excipiente que permita la actividad del principio activo o de los principios

activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el

30

principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente invención .

Un "vehiculo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o

combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en

la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, liquidos, disolventes o tensioactivos.

5 10

El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las células de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

J5

Otro aspecto de la in vención se refil3re a un método de selección de agentes terapéuticos útiles en la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1, o en el tratamiento de la predi2lbetes, preferentemente con componente autoinmune, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:

20

(a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) a una determinada concentración del compuesto a analizar, y (b) comparar dicha actividad ,je las NO sintasas con un valor normal o con los valores en ausencia de dicho compuesto.

25 30

En una realización preferida de este aspecto de la invención , el primer método de la invención comprende: (a)determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) a una determinada concentración del compuesto a analizar, y (b)comparar dicha acti vidad de las NO sintasas (NOS) con los valores en presencia de un compuesto empleado en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar la diabetes mellitus tipo 1.

20

En una realización particular de esle aspecto de la invención, el compueslo empleado en el paso (b) es el L-NMMA.

5 10

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de la diabetes mellitus tipo I que comprende: (a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) en una muestra extraída de un mamífero, (b) comparar los valores de la actividad de las NO sintasas (NOS) obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.

J5

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expHrtos en la materia, otros objetos, ventajas Y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención .

20

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

25

Figura 1: Evolución de la proliferBlci6n de la célula beta en el modelo "in vivo" durante el tratamiento,. Los tejidos pancreáticos fueron inmunomarcados con BrdU e Insulina y se contaron un total de 100 islotes por animal: 50 de la cabeza y 50 de la cola del páncreas. En las gráficas se muestran los resultados como n' de células BrdU+lns+ por unidad de área de islote expresándose como la media ± e.e.m . para n=3 animales. ·psO,05.

30

Figura 2: Evolución del área relativa de los islotes en el modelo "in vivo" durante el tratamiento. Se contaron un total de 40 islotes en varias secciones de páncreas de los animales, 20 dEl la cabeza y 20 de la cola. En el eje de ordenadas de la gráfica se muestra el ratio entre el área total de islotes y el

área total de la secciones, expresado como la media±e.e.m. en n=3 animales. ·psO,05.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los inhibidores de las NO sintasas (NOS), y preferentemente del L·NMMA, en la prevención y/o el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1, Y de la prediabetes, en un mamífero.

Tratamiento farmacológico de un modelo animal de Diabetes auto inmune

con un inhibidor general de la sintasa de óxido nítrico.

Tratamiento de los animales: Los animales utilizados fueron ratas Biobreeding (BB) un modelo de diabetes autoinmune que inicia una diabetes espontánea a partir de las 10 semanas de vida aproximadamente. Se separaron aleatoriamente en dos grupos, control y tratado, y a las 5 semanas se inicio HI tratamiento que consistió en:

Grupo Control: Consta de 3 animales sometidos a la administración diaria intraperitoneal de 200 microlitros del vehículo en que se encuentra diluido el tratamiento -? 0,5% DMSO en suero salino Grupo tratado: Consta de tres animales sometidos a la administración diaria intraperitoneal de 200 microlitros de LNMMA diluido en vehiculo a una dosis de 30mg/kg.

Ambos grupos de animales fueron sacrificados a las 7 semanas de edad utilizando para ello una cámara (je C02. Para realizar los estudios de proliferación celular se les inyectó intraperitonealmente 6 horas antes del sacrificio 5··Bromo 2·· Deoxiuridina (BrdU), un análogo de la Timidina que se incorpora al ADN de las células proliferantes a una concentración de 100 mg/Kg. De los animales se extrajeron los páncreas que fueron divididos en

cabeza (zona proxima al duodeno) y cola (zona próxima al bazo) y se

almacenaron a -80'C hasta que fueron procesadas mediante corte en criostato,

obleniendose secciones de 10 micras de grosor.

5

Estudio de proliferación en células beta de los islotes pancreáticos

Los cortes de tejido de cabeza y cola de páncreas fueron fijados con

paraformaldehido al 4% en PBS durante 30 minutos a 4'C. La proliferación de

las células beta pancreáticas fue determinada mediante inmunomarcaje

simultáneo con fluorescencia de Brd:U e insulina siguiendo los pasos que se

10

especifican a continuación:

Permeabilización con Tritón X-100 al 0,02% en PBS, 30 minutos a

temperatura ambiente.

Tratamiento con una solución de HCI 2N en PBS durante 25 minutos con

el fin de facilitar la accesibilidad del anticuerpo al BrdU .

J5

Neutralización mediante 2 incubaciones de 15 minutos con tampón

Borato 0,1 M, pH 8.

Inmunomarcaje de los tejidos incubándolos durante un minimo de 12 h

a 4'C con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU y otro policlonal

anti-insulina de cobaya .

20

Revelado mediante incubación durante 1 hora a temperatura ambiente

con acticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de raton y cobaya

conjugados, respecti vamente, con los ftuoróforos Alexa 546 y Alexa 488 .

La cuantificación de células beta proliferativas se realizó mediante el contaje,

25

utilizando el objetivo 40x, de células BrdU e insulina positivas en 50 islotes al

azar, con un microscopio confocal (Leyca TCS SL). Los resultados fueron

expresados como N' celulas proliferantes (BrdU' lnsulina' )/Area insulina'

(milimetros' )

30

Histomorfometria

La proporción de área celular beta en relación con el área del páncreas, se de

determinó en las secciones de tejido de cabeza y cola de páncreas fijadas con

Parafolmaldehido al 4% en PBS me,jiante una técnica de inmunohistoquimica revelada mediante diaminobenzidina siguiento los pasos que se detallan a

continuación:

Permeabilización utilizando Tritón X-100 al 0,02% en PBS durante 30

minutos a temperatura ambiente. Neutralización de las peroxidasas endogenas mediante incubación con agua oxigenada al 3% en metanol durante 1 minuto.

Lavados con PBS 5 minutos p veces). Bloqueo con BSA al 1 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Incubación con un anticuerpo anti-insulina producido en ratón a una concentración 1:1000 en solución de bloqueo (BSA al 1% en PBS) un minimo de 12h a 4'C. Lavados con PBS 5 minutos p veces) Incubación con un anticuerpo secundario anti IgG de ratón conjugado con avidina a una concentración de 1/200 en solución de bloqueo

durante 1 hora a temperatura ambiente.

Lavados con PBS 5 minutos p veces). Incubación con estreptavidina-peroxidasa 1/100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lavados con PBS 5 minutos p veces). Revelado del marcaje mediante incubación de las secciones con Diaminobencidina y peróxido de hidrógeno diluidos en PBS durante 1

minuto aproximadamente, a temperatura ambiente.

Lavados con PBS 5 minutos p veces) Contratinción del tejido con hematoxilina. Deshidratación de los tejidos mediante el paso por una sucesión de alcoholes de graduación creciente y montaje de las preparaciones para su estudio microscópico utilizando medio Entellán.

La cuantificación se realizó mediante examen microscópico utilizando un

microscopio Olympus BX-40, analiz;indose las imágenes mediante la cámara Olympus DP71 y el software Cel! D. Se cuantificó el total de las áreas de 20

islotes, considerándose área de islote como área Insulina' área total del páncreas.

relativizándola al

5

La significación estadistica se calculó mediante el test no paramétrico Mann-Withney test en una población n=3 animales por grupo.

Resultados obtenidos

10 J5

Los resultados pueden observarse en las Fig . 1 -2. Como se puede observar en la figura 1, la proliferación tanto en la cabeza como en la cola del páncreas disminuye significativamente en lo:s individuos tratados con vehículo. Sin embargo, en los animales tratados con el inhibidor de la NOS este descenso en proliferación , aunque se sigue observando en la cola del páncreas, es totalmente revertido en la cabeza del mismo donde los niveles de proliferación se mantienen igual que los existentes a las 5 semanas antes del comienzo del proceso autoinmune.

20 25 30

En cuanto al estudio del área relativa de los islotes, en la figura 2 se puede observar una disminución de la misma a lo largo del tiempo del ensayo tanto en la cabeza como en la cola del páncreas. El tratamiento con L-NMMA consiguió una reversión significativa de este parámetro en la cabeza del páncreas, sin embargo la reversión en la cola del páncreas fue de menor magnitud y no alcanzó la significación estadística aunque se observa una tendencia a la misma . Como puede observarse en los resultados mostrados, la proliferación tanto en la cabeza como en la cola de los i:slotes de páncreas controles disminuye significativamente en los individuos no tratados en la etapa inicial periodo de insulitis. En cambio , en los individuos tratados con el inhibidor de la NOS LNMMA este efecto antiproliferativo revierte de forma total , al menos en la cabeza del páncreas, por lo que podríamos deducir que el inhibidor de la NOS

ejerce un efecto protector en el islote, ya que mantiene los niveles de proliferación igual a los estadios previos a la insulitis.

Es destacable el efecto diferencial observado en la cabeza y en la cola del páncreas. Esto podría estar relacionado con la biodisponibilidad del fármaco en ambas zonas o con una diferente capacidad proliferativa de los islotes en

respuesta a estímulos.

Los inhibidores de las óxido nitrico sintasa han sido probados con diferentes resultados en el tratamiento de otra:s patologias utilizando modelos animales. En los últimos 5 años han sido descritos resultados en modelos de daño derivado del fenómeno de isquemia reperfusión (Barocefli el al, 2006 Nilric Oxide 14(3): 212-8), lesiones neuronales (Wang el al, 2009 Exp Neurol. Jan 19.), esclerosis lateral amiotrófica o modelos de daño renal inducidos por fármacos (Ghaznavi R el al,2007 Arch Toxicol. 81(6): 453-7). En este sentido

merecen una atención especial los ensayos realizados en pacientes con

enfermedad arterial coronaria (Kaufmann el al,2007 Am J Physiol Hear1 Girc Physiol. 293(4): H2178-82.) en los que la inhibición de la NOS aumenta la reserva de flujo coronario y los ensayos clinicos en pacientes con infarto de miocardio complicado con shock cardiogénico (fase 111) que no mostraron beneficios cl inicos pero sin embargo rindieron excelentes resultados en cuanto a bioseguridad (Kaluski et al , 2008 Fulure Gardiol. 4(2):183-9).

Estos antecedentes unidos a los resullados mostrados proponen a los inhibidores de la NOS como una posible alternativa terapéutica en el tratamiento de la prediabetes, utilizándolo desde las etapas iniciales de la etapa preclinica con el objeto de mantener la capacidad regenerati va de las células beta de los islotes pancreáticos en respuesta al daño autoinmune.

La utilización de este fármaco como proponen en los ejemplos, plantea la idea original de actuar no solo sobre los agentes inductores del daño directo a la célula beta, sino sobre el microambiente patogénico que se establece en el

islote pancreático a lo largo del periodo de prediabetes manteniendo la capacidad proliferativa de la célula beta y permitiéndole por tanto llevar a cabo una respuesta regenerati va ante la agresión autoinmune que tendrá lugar

previamente al inicio clínico.

Además, respecto a la seguridad dl3 la utilización de este fármaco (LNMMA), ésta quedo demostrada en un ensayo clinico fase 111 realizado en pacientes con infarlo de miocardio complicado con shock cardiogénico que no mostró

beneficios clínicos pero sin embargo rindió excelentes resultados en cuanto a

10 bioseguridad (Kaluski el al, 2008 Fulure Cardiol. 4(2):183-9.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1-Uso de una composición , que comprende el inhibidor de la actividad de las NO sintasas (NOS) L-NMMA, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, para la elaboración de un

   medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la prediabetes o

   de la diabetes mellitus tipo 1 en un mamifero.

   2-El uso de la composición sE~gún la reivindicación anterior, donde la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente

   aceptable.

   3-El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2,

   donde la composición además comprende otro principio activo.

   4-Método de obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de la diabetes mellitus tipo I y de la prediabetes, que comprende:

   (a) determinar la actividad de las NO sintasas (NOS) en una muestra

   extraída de un mamífero,

   (b) comparar los valores de la actividad de las NO sintasas (NOS)

   obtenidos en a) con 108 valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.