ES2381289B2 - SYNTHETIC COMPOSITION WITH XEROPROTECTOR EFFECT - Google Patents
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Abstract
Composición sintética con efecto xeroprotector#La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa. La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.Synthetic composition with xeroprotective effect # The present invention relates to a synthetic xeroprotective composition, similar to that obtainable from the microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with accession number CECT7623, which comprises glutamine, glucose and trehalose. The present invention also relates to the use of the xeroprotective composition for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%.
Description
Composición sintética con efecto xeroprotector. Synthetic composition with xeroprotector effect.
La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa. The present invention relates to a synthetic xeroprotective composition, similar to that which can be obtained from the microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with accession number CECT7623, which comprises glutamine, glucose and trehalose.
La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula The present invention also refers to the use of the xeroprotective composition for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, a isolated organ, an isolated biological tissue, a cell
o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se refiere a un método para la conservación de dicho material biológico. or a molecule with biological activity such as an enzyme with lipase activity. In addition, the present invention relates to a method for the conservation of said biological material.
Estado de la técnica anterior Prior art
La conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural, produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad vital. La liofilización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas. The conservation of biological materials by dehydration and osmoconcentration is a known technology. When the task of conserving sensitive biomolecules became necessary, simple drying by dehydration failed, since the structural water was eliminated, producing subsequent denaturation and loss of vital activity. Lyophilization has become the most accepted method for the long-term preservation of sensitive biomolecules, for example widely used for the conservation of live attenuated vaccines.
Los métodos actuales de conservación requieren de gran costo en energía y generalmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la liofilización producen reducciones significativas en la actividad/viabilidad del material conservado. Current conservation methods require high energy costs and generally need storage at low temperatures. Sometimes, after its conservation, the biological material has an activity and / or viability that does not reach satisfactory levels. Conservation methods, such as drying at room temperature, liquid formulations, freezing with cryoprotectants, or lyophilization produce significant reductions in the activity / viability of the conserved material.
Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la liofilización confiere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto final, y se requiere aún refrigeración para reducir eldeterioro durante el almacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la “cadena de frío” es difícil, pueden conducir finalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible. The processes currently used are slow and involve high energy consumption. In addition, lyophilization confers only a modest level of thermotolerance in the final product, and cooling is still required to reduce deterioration during storage. This is a particular problem for live vaccines intended for use in tropical climates, since they lose activity, with the unfortunate result that vaccination programs carried out in the countryside in tropical countries, where the control of the “cold chain” is difficult, they can ultimately lead to the vaccination of patients with a lower than standard vaccine or, in some cases, unusable.
Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de microorganismos, plantas y animales adquirieron la notable y elegante capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina,lalevadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa (α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranósido). During evolutionary natural selection, certain species of microorganisms, plants and animals acquired the remarkable and elegant ability to tolerate extreme dehydration, remaining dormant in hostile environments for very long periods of time and still capable of acquiring a complete vital activity once hydrated again. . Examples include the "resurrection plant" Selaginella lepidophyla, Artemia salina sea shrimp, Saccharomyces cerevisiae, or the Macrobiotus hufelandi tardigrade. These organisms are called cryptiobiotics and the procedure by which they survive is known as anhydrobiosis. All species of animals and plants that have this capacity contain protective molecules that form amorphous crystals, such as trehalose disaccharide (α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside).
La formación y uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS (α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol) y GPM (α-D-glucopiranosil-1-6-manitol)] y sus componentes individuales GPS y GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, rafinosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina. The formation and use of amorphous crystals is well documented (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Some of the preservatives that form these crystals are suitable for this type of preservation and include non-reducing carbohydrates such as trehalose, hydroxyectoin, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [GPS mixture (α-D-glucopyranosyl-1-6-sorbitol) and GPM (α-D-glucopyranosyl-1-6-mannitol)] and its individual GPS and GPM components. Non-reducing glycosides of polyhydroxy compounds such as neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosyl trehalose, sucrose, lactose sucrose, raffinose, etc. Other amorphous crystal-forming preservatives include amino acids such as hydroxyectoin.
La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suficientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa. The presence of water in the dry state is generally less than 0.2 g / g dry cell weight in most cryptobionts. These water levels are sufficient for these invertebrate organisms or microorganisms to resist extreme dehydration, high temperatures, ionizing radiation or also, in some species of tardigrades, pressures of up to 600 MPa.
Explicación de la invención Explanation of the invention.
La presente invención se refiere a una composición sintética con efecto xeroprotector que comprende glutamina, glucosa y trehalosa, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, según se describe en la patente P200931116. The present invention relates to a synthetic composition with xeroprotective effect comprising glutamine, glucose and trehalose, similar to that obtainable from the microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7623, as described in patent P200931116.
La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula The present invention also refers to the use of the xeroprotective composition for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, a isolated organ, an isolated biological tissue, a cell
o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. or a molecule with biological activity such as an enzyme with lipase activity.
La capacidad para conservar material biológico sensible por períodos de tiempo indefinido en forma activa o viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionar la conservación de material biológico que presenta dificultades para su estabilización. El material biológico preservado con la composición es estable por períodos largos de tiempo. The ability to conserve sensitive biological material for indefinitely active or viable periods of time is of importance in applications for the medical, agricultural and industrial sectors. In the present invention, tools are offered to solve the conservation of biological material that presents difficulties for its stabilization. The biological material preserved with the composition is stable for long periods of time.
Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir, la suma del efecto en la conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene glutamina, glucosa o trehalosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico. As shown in the examples of the present invention, the use of a composition containing each of the components separately for the conservation of the activity of a lipase enzyme, that is, the sum of the effect on the conservation of the activity Enzymatic composition of a composition containing glutamine, glucose or trehalose, is less than the preservation effect produced by a composition containing all components, that is, the xeroprotective composition has a synergistic effect on its ability to conserve biological material.
En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo CECT7623, depositado en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 10 de noviembre de 2009 al que le correspondió el nº de depósito CECT7623, con el término “4J27”, o como “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia/Edificio de investigación/Campus de Burjassot/46100 Burjassot (Valencia). From now on, reference may be made to the microorganism CECT7623, deposited in the Spanish type crop collection (CECT) on November 10, 2009, to which the deposit number CECT7623, with the term “4J27”, or as “microorganism of the present invention ”or the“ microorganism of the invention ”. The address of said International Deposit Authority is: University of Valencia / Research building / Campus of Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia).
La composición sintética objeto de esta invención es equivalentes a la que conforman los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D), según se describe en la patente P20093116. The synthetic composition object of this invention is equivalent to that formed by the bacterial milking products of strain 4J27 after extraction by drying by air incubation (4J27D), as described in patent P20093116.
El término “composición xeroprotectora” tal como se entiende en la presente invención, se refiere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético. The term "xeroprotective composition" as understood in the present invention refers to a composition that prevents the adverse effects of total or partial drying of material of biological origin or material of synthetic origin.
El material biológico se refiere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas, virus, partículas virales o cualquier molécula que comprenda cualquiera de los elementos anteriores o cualquier molécula orgánica que tenga un efecto farmacológico, inmunogénico y/o fisiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes anti-infectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; antiartríticos, antiasmáticos, antiinflamatorios, antioplásticos, antipruríticos, antipsicóticos, antipiréticos, antiespasmódicos, preparaciones cardiovasculares (incluyendo bloqueantes de canales de calcio, bloqueadores beta, o antiarrítmicos), agentes contra la hipertensión, diuréticos, vasodilatadores, estimuladores del sistema nervioso central, antitusivos, preparaciones anti resfriados, descongestionantes, agentes de diagnóstico, hormonas, estimuladores del crecimiento óseo, inhibidores de la resorción de la médula ósea, inmunosupresores, relajantes musculares, psicoestimulantes, sedantes, tranquilizantes, proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos (tanto naturales, como sintéticos, como productos recombinantes), moléculas de ácidos nucleicos (tanto en forma polimérica de dos o más nucleótidos de ADN o ARN, incluyendo tanto moléculas de cadena doble como de cadena sencilla, construcciones genéticas, vectores de expresión, ARN antisentido, sentido o moléculas ARNi) o nucleótidos (como por ejemplo, pero sin limitarse, el dATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP, de utilidad en la técnica de PCR, secuenciación, etc). The biological material refers to any compound produced directly by a living organism in any state of development, in any cellular compartment, whatever the nature, composition or structure thereof, or that comes from an organism that is no longer alive. Said biological material can be, for example, but not limited to, a cell, nucleic acid, protein, enzyme, polysaccharide, lipid, phospholipid, liposomes, viruses, viral particles or any molecule comprising any of the foregoing elements or any organic molecule that have a pharmacological, immunogenic and / or physiological effect of local and / or systemic action. The biological material may comprise therapeutic agents; anti-infective agents such as antibiotics, antivirals; analgesics or combinations of analgesics; antiarthritic, anti-asthmatic, anti-inflammatory, antioplastic, anti-pruritic, antipsychotic, antipyretic, antispasmodic, cardiovascular preparations (including calcium channel blockers, beta blockers, or antiarrhythmics), anti-hypertension agents, diuretics, vasodilators, central nervous system stimulants, central nervous system stimulants, central nervous system anti-cold preparations, decongestants, diagnostic agents, hormones, bone growth stimulators, bone marrow resorption inhibitors, immunosuppressants, muscle relaxants, psychostimulants, sedatives, tranquilizers, proteins, peptides or fragments thereof (both natural, such as synthetic, as recombinant products), nucleic acid molecules (both in polymeric form of two or more DNA or RNA nucleotides, including both double chain and single chain molecules, genetic constructs, expression vectors, antisense RNA, om sense RNAi olelecules) or nucleotides (such as, but not limited to, dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP, useful in the technique of PCR, sequencing, etc.).
El material de origen sintético se refiere a un tipo de material que no ha sido producido o sintetizado por un organismo vivo directamente sino que ha sido creado por el ser humano como por ejemplo, pero sin limitarse, una secuencia de ADN amplificada por PCR, o una proteína o enzima modificada intencionadamente o no. Asimismo, el material biológico se refiere también a un organismo invertebrado, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido aislado o una célula. Material of synthetic origin refers to a type of material that has not been produced or synthesized directly by a living organism but has been created by humans, for example, but not limited to, a DNA sequence amplified by PCR, or a protein or enzyme modified intentionally or not. Likewise, the biological material also refers to an invertebrate organism, a microorganism, an isolated organ, an isolated tissue or a cell.
Así, la presente invención se refiere a la una composición xeroprotectora sintética, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa. Thus, the present invention relates to a synthetic xeroprotective composition, which comprises glutamine, glucose and trehalose.
Una realización más preferida se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención o a la composición xeroprotectora sintética que comprende una proporción de entre 0,5 y 1,5 de glutamina, 2 y 4 de glucosa, y 4y8de trehalosa. Es decir, una proporción (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (0,5 a 1,5):(2 a 4):(4 a 8), respectivamente. Una realización aún más preferida se refiere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), es de (0,7 y 1,3):(2,5 y 3,5):(5 y 7), respectivamente. Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (1):(2,8):(5,8), respectivamente. A more preferred embodiment refers to the xeroprotective composition produced by the microorganism of the invention or to the synthetic xeroprotective composition comprising a ratio between 0.5 and 1.5 of glutamine, 2 and 4 of glucose, and 4 and 8 of trehalose. That is, a ratio (glutamine) :( glucose) :( trehalose), of (0.5 to 1.5) :( 2 to 4) :( 4 to 8), respectively. An even more preferred embodiment refers to the xeroprotective composition where the ratio of (glutamine) :( glucose) :( trehalose) is (0.7 and 1.3) :( 2.5 and 3.5) :( 5 and 7), respectively. Preferably the xeroprotective composition has a ratio of (glutamine) :( glucose) :( trehalose), of (1) :( 2.8) :( 5.8), respectively.
El término “proporción” tal como se entiende en la presente invención se refiere a la correspondencia debida de los elementos de la composición (β-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutamina y glucosa; o glutamina, glucosa y trehalosa) relacionados entre sí. Es decir, se refiere a una relación matemática que vincula los elementos de la composición. The term "proportion" as understood in the present invention refers to the corresponding correspondence of the elements of the composition (β-hydroxybutyrate, glucuronic acid, glutamic acid, glutamine and glucose; or related glutamine, glucose and trehalose) . That is, it refers to a mathematical relationship that links the elements of the composition.
En adelante se podrá hacer referencia a cualquier composición descrita en los párrafos anteriores como “composición de la presente invención” o “composición de la invención”. Hereinafter reference may be made to any composition described in the preceding paragraphs as "composition of the present invention" or "composition of the invention".
Otro aspecto de la presente invención es el uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico con un contenido en humedad residual igual o inferior al 10%. El contenido de humedad residual del material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión “material biológico en estado seco”. En estas condiciones, el conservante o estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo, y sólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas. De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador. Another aspect of the present invention is the use of the composition of the invention for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%. The residual moisture content of the biological material may be equal to or less than 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1% residual moisture. The preservation of said material can be carried out by stabilizing it. In the present invention, the term "dry material biological material" can be used to refer to this type of biological material. Under these conditions, the preservative or stabilizer coalesces to reach a non-crystalline, vitreous, and solid state (for example an amorphous crystal). The organic crystal particles that are formed by drying the biological material with the stabilizer are covered by the stabilizer that produces high stability by drastically reducing chemical reactions. In this way the dried biological material is embedded in the amorphous crystal formed by the stabilizer.
El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido. The dry biological material in the presence of the stabilizer that forms the amorphous crystal is resistant to plastics in the liquid state, while the material that is not dry in the presence of these stabilizers is not resistant to plastics in the liquid state.
El material biológico seco en estas formas puede encontrarse en estado no particulado y puede suministrarse en formas por ejemplo, pero sin limitarse, molduras o sólidos en 3 dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches, hojas, bolas, o pepitas de material biológico seco. The dry biological material in these forms can be in a non-particulate state and can be supplied in forms, for example, but not limited to, moldings or solids in 3 dimensions such as, but not limited to, blocks, pads, patches, sheets, balls, or seeds of dry biological material.
El término “humedad residual” tal como se emplea en la presente invención se refiere a la cantidad de humedad que contiene un producto después de pasado por algún tipo de proceso capaz de eliminar agua del mismo. La humedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del total de la masa. Es decir un valor de humedad residual de un producto igual a un 10% significa que 10 g de cada 100 g del producto corresponden a agua. La humedad residual puede ser medida mediante métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico. The term "residual moisture" as used in the present invention refers to the amount of moisture a product contains after it has passed through some type of process capable of removing water from it. Residual humidity is the mass percentage of the product that corresponds to water with respect to the total mass. In other words, a residual moisture value of a product equal to 10% means that 10 g of every 100 g of the product correspond to water. Residual humidity can be measured by methods known in the state of the art such as, but not limited to, by the titrimetric method, the azeotropic method or the gravimetric method.
El término “conservación de material biológico” hace referencia al mantenimiento o cuidado de la permanencia de las características intrínsecas del material biológico. The term "conservation of biological material" refers to the maintenance or care of the permanence of the intrinsic characteristics of the biological material.
Una realización preferida se refiere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. La célula puede ser procariota o eucariota. La célula puede ser una célula de un microorganismo en cualquier estado de desarrollo. La célula puede ser somática o germinal, vegetal o animal. Dicha célula puede proceder de cualquier organismo o microorganismo y puede presentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo, pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El microorganismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse Escherichia coli, Salmonella. typhimurium, Pseudomonas putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. o Bifidobacterium spp.. El microorganismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo. A preferred embodiment refers to the use of the composition of the invention for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue or a cell. The cell can be prokaryotic or eukaryotic. The cell can be a cell of a microorganism in any state of development. The cell can be somatic or germinal, plant or animal. Said cell can come from any organism or microorganism and can occur in any state of differentiation, such as, but not limited to, from a culture of a cellular tissue or organs, sperm, ovules or embryos. The cell can be a totipotent, multipotent or unipotent stem cell. The microorganism can be unicellular or multicellular. The unicellular microorganism is selected from the list comprising, but not limited to Escherichia coli, Salmonella. typhimurium, Pseudomonas putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. or Bi fi dobacterium spp .. The multicellular microorganism can be, for example, but not limited to a nematode.
La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicación y división celular. Por otra parte la célula puede haber sido tratada, manipulada o mutada antes de su conservación. Por ejemplo, pero sin limitarse, una célula puede haberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las células que se conservan pueden formar una población homogénea o heterogénea, por ejemplo, pero sin limitarse, una librería de células en la que cada una contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes. The cell conserved by the composition of the present invention is a viable cell that is, it is capable of performing the normal functions of the cell including cell replication and division. On the other hand, the cell may have been treated, manipulated or mutated before preservation. For example, but not limited to, a cell may have become competent for transformations or transfections, or it may contain recombinant nucleic acids. The cells that are conserved can form a homogeneous or heterogeneous population, for example, but not limited to, a library of cells in which each one contains a variation of some nucleic acid. Preferably the cells are non-anhydrobotic cells (desiccation sensitive cells) such as, but not limited to, cells from non-anhydrobial prokaryotic microorganisms that are generally not sporulant.
La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse, en condiciones de alta osmolaridad (alta concentración de sales) que estimulen la producción intracelular de trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos. The conservation of the microorganism can be improved by culture under conditions that increase the intracellular concentration of trehalose or other amorphous crystal-forming stabilizers. For example, but not limited, under conditions of high osmolarity (high concentration of salts) that stimulate the intracellular production of trehalose or other amorphous crystal-forming stabilizers.
El organismo invertebrado es pero sin limitarse, una larva de insecto o un crustáceo. Dichos organismos invertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrolla. The invertebrate organism is, but is not limited to, an insect larva or a crustacean. Said invertebrate organisms can be preserved under drying conditions, allowing the vital activity thereof, so that, when rehydrated, said organisms have the ability to move. The seedling is a plant in its early stages of development, from germinating until it develops.
La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo vertebrado perteneciente a la Superclase Tetrapoda (con cuatro extremidades), Clase Amphibia (anfibios) o Clase Reptilia (reptiles), o cualquiera de sus partes (Vernon y Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon y Jackson llevaron a cabo un estudio sobre la rana Leopardo (Rana pipiens), en el que de forma natural se seca su piel, lengua, bazo, e hígado con una pérdida de agua de entre un 43-81% del contenido de agua total. The composition of the invention can be used for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is a vertebrate organism belonging to the Tetrapoda Superclass (with four limbs), Amphibia Class (amphibians) or Reptilia Class (reptiles), or any of its parts (Vernon and Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon and Jackson carried out a study on the Leopard frog (Rana pipiens), in which their skin, tongue, spleen, and liver naturally dries with a water loss of between 43-81% of the water content total.
Un órgano aislado o un tejido biológico aislado (incluida la sangre) pueden conservarse mediante la composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de criopreservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540). An isolated organ or an isolated biological tissue (including blood) can be preserved by the composition of the present invention. In Serrato et al. (2009) results of cryopreservation protocols of biological tissues can be observed (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).
Una realización más preferida se refiere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término “molécula con actividad biológica” tal como se entiende en la presente invención se refiere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término “derivados” se refiere a moléculas obtenidas por la modificación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término “análogos” se refiere a moléculas que presentan una función similar a la molécula con actividad biológica. A more preferred embodiment refers to the use of the composition of the invention, where the biological material is a molecule with biological activity. The term "molecule with biological activity" as understood in the present invention refers to a biological molecule whose origin is a living organism or that has been alive, or derivatives or analogs of said molecule. The term "derivatives" refers to molecules obtained by modifying a molecule with biological activity, which have similar functionality. On the other hand, the term "analogs" refers to molecules that have a function similar to the molecule with biological activity.
Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC (Enzyme Commission numbers) que comprende las hidrolasas de éster carboxílico (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa), EC 3.1.1.2 (Arilesterasa), EC 3.1.1.3 (Triacilglicerol lipasa), EC 3.1.1.4 (Fosfolipasa A(2)), EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa), EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa), EC 3.1.1.24 (3oxoadipato enol-lactonasa), EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa), EC 3.1.1.26 (Galactolipasa), EC 3.1.1.32 (Fosfolipasa A(1)), EC 3.1.1.33 (6-acetilglucosa deacetilasa), EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblemente la enzima lipasa tiene actividad Triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3). According to another even more preferred embodiment of the composition of the present invention the molecule with biological activity is an enzyme. An even more preferred embodiment of the present invention refers to the use of the composition of the invention, where the enzyme is an enzyme with lipase activity. The enzyme with lipase activity is selected from the list of enzymes with EC numbers (Enzyme Commission numbers) comprising carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxylesterase), EC 3.1.1.2 (Arilesterase), EC 3.1.1.3 (Triacylglycerol lipase), EC 3.1.1.4 (Phospholipase A (2)), EC 3.1.1.5 (Lysophospholipase), EC 3.1.1.23 (Acylglycerol lipase), EC 3.1.1.24 (3oxoadipate enol-lactonase), EC 3.1 .1.25 (1,4-lactonase), EC 3.1.1.26 (Galactolipase), EC 3.1.1.32 (Phospholipase A (1)), EC 3.1.1.33 (6-acetylglucose deacetylase), EC 3.1.1.34 (Lipoprotein lipase). Preferably the enzyme lipase has Triacylglycerol lipase activity (EC 3.1.1.3).
Otro aspecto de la presente invención se refiere al método para la conservación de material biológico que comprende: Another aspect of the present invention relates to the method for the conservation of biological material comprising:
a) mezclar la composición de la invención con una muestra de material biológico aislado, y a) mixing the composition of the invention with a sample of isolated biological material, and
b) deshidratar el producto obtenido en el paso (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%. b) dehydrate the product obtained in step (a) to a residual humidity equal to or less than 10%.
Una realización preferida se refiere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. A preferred embodiment refers to the method for the conservation of biological material, where the biological material of step (a) is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue or a cell.
Otra realización preferida se refiere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Another preferred embodiment refers to the method for the conservation of biological material, where the biological material is a molecule with biological activity.
Una realización más preferida de la presente invención se refiere al método, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Según una realización más preferida de la presente invención la enzima es una lipasa. A more preferred embodiment of the present invention refers to the method, where the molecule with biological activity is an enzyme. According to a more preferred embodiment of the present invention the enzyme is a lipase.
Otra realización aún más preferida se refiere a cualquiera de los métodos para la conservación de material biológico, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Another even more preferred embodiment refers to any of the methods for the conservation of biological material, where dehydration of the mixture of the xeroprotective composition and the biological material according to step (b) is carried out by means of a hypertonic solution or through a stream of air.
Cualquier método para la conservación de material biológico de la presente invención permite el empleo de dicho material en procesos de manufacturación en los cuales el material biológico sería demasiado inestable si no estuviera conservado mediante el uso de la composición de la presente invención. La invención incluye extrusiones o moldes en los que se incluye el material conservado por cualquier método de la presente invención. Un método de producción de una moldura que contenga biomaterial activo mediante estabilizadores puede incluir soluciones de materiales plásticos. Por ejemplo una moldura de material plástico con biomaterial activo encapsulado puede ser útil como componentes de biosensores. Por ejemplo un biosensor puede incluir bacterias que sean capaces de detectar sustancias tóxicas, patógenos o toxicidad en general. Any method for the conservation of biological material of the present invention allows the use of said material in manufacturing processes in which the biological material would be too unstable if it were not conserved through the use of the composition of the present invention. The invention includes extrusions or molds in which the material conserved by any method of the present invention is included. A method of producing a molding containing active biomaterial by stabilizers may include solutions of plastic materials. For example, a molding of plastic material with encapsulated active biomaterial can be useful as components of biosensors. For example, a biosensor can include bacteria that are capable of detecting toxic substances, pathogens or toxicity in general.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and characteristics of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Descripción de las figuras Description of the fi gures
Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras: With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping to better understand the characteristics of the invention, according to some examples made, the following figures are shown here, for illustrative and non-limiting purposes. :
Fig. 1. Muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v). Fig. 1. Shows the lipase activity (in percentage relative to 100% positive control activity) after drying of the lipase enzyme in the presence of the different components of 10% bacterial milking products (w / v).
El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo (-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA (Producto de Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubación al Aire) extraídos de la cepa 4J27 mediante tratamiento de secado y posterior hidratación, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención. The positive control is trehalose at 10%. The negative control (-) corresponds to the absence of any compound as an additive prior to the drying of the enzyme. 4J27 is the value of lipase activity recorded after stabilization by drying and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POB extracted from strain 4J27 by hyper / hypoosmotic shock respectively. 4J27D is the lipase activity recorded after drying stabilization and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POBSIA (Bacterial Milking Product extracted by Air Drying) extracted from strain 4J27 by drying and subsequent hydration treatment, which comprises same components as the synthetic composition object of this invention.
Fig. 2. Muestra el porcentaje de estabilización de la actividad de la enzima lipasa por medio de algunas mezclas de solutos contra la desecación, respecto de la estabilización por trehalosa (100%). Fig. 2. Shows the percentage of stabilization of the activity of the lipase enzyme by means of some mixtures of solutes against desiccation, with respect to stabilization by trehalose (100%).
Fig. 3. Muestra la evolución de la supervivencia de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB), los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs), así como de la composición sintética objeto de la invención. Fig. 3. It shows the evolution of the survival of Escherichia coli MC4100 against desiccation through the use of the bacterial milking product (POB), those extracted by Air Drying (POBSIAs), as well as the synthetic composition object of the invention.
4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención. 4J27 is the value of lipase activity recorded after stabilization by drying and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POB extracted from strain 4J27 by hyper / hypoosmotic shock respectively. 4J27D is the lipase activity recorded after drying stabilization and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POBSIA, which comprises the same components as the synthetic composition object of this invention.
PVP indica que además se ha adicionado 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP). PVP indicates that 1.5% polyvinylpyrrolidone (PVP) has also been added.
SIN es sintético. SIN is synthetic.
T es trehalosa. T is trehal.
Ejemplos Examples
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante que muestran la capacidad xeroprotectora de la composición objeto de esta invención así como del método de xeroprotección descrito. The invention will now be illustrated by means of illustrative and non-limiting tests showing the xeroprotective capacity of the composition object of this invention as well as the described xeroprotection method.
En la tabla 1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D). Table 1 shows the compositions of the bacterial milking products of strain 4J27 after extraction by drying by air incubation (4J27D).
Asimismo, en la Fig. 2 se muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de glucosa y glutamina, compuestos químicos presentes en la composición sintética objeto de la invención. Las mezclas descritas se combinaron en la misma relación descrita en la mezcla de la presente invención y de esa mezcla se tomaron 10gyse disolvieron en 100 ml de agua. El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo se corresponde con la ausencia de compuestos como aditivo previo a la desecación de la enzima (agua). Likewise, in Fig. 2 the lipase activity (in percentage relative to 100% positive control activity) is shown after drying of the lipase enzyme in the presence of glucose and glutamine, chemical compounds present in the synthetic composition object of the invention . The described mixtures were combined in the same ratio described in the mixture of the present invention and from that mixture 10g were taken and dissolved in 100 ml of water. The positive control is trehalose at 10%. The negative control corresponds to the absence of compounds as an additive prior to the drying of the enzyme (water).
Tal como puede observarse en dicha Fig. 2, la combinación de los compuestos glucosa+glutamina, no presenta un efecto de conservación de la actividad de la enzima ni siquiera similar al que se muestra en la Fig. 1. En dicha Fig. 1 se muestra cómo las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J2A2D), presentan un efecto de protección de la enzima lipasa frente a la desecación mayor que en el caso de composiciones de conocida capacidad xeroprotectora. As can be seen in said Fig. 2, the combination of the glucose + glutamine compounds does not have a conservation effect of the enzyme activity even similar to that shown in Fig. 1. In said Fig. 1 shows how the compositions of the bacterial milking products of strain 4J27 after extraction by drying by air incubation (4J2A2D), have a protective effect of the enzyme lipase against desiccation greater than in the case of compositions of known capacity Xeroprotector.
TABLA 1 TABLE 1
Composición del producto de ordeñado bacteriano (POB) de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire Composition of the bacterial milking product (POB) of strain 4J27 after extraction by drying by air incubation
Ejemplo 1 Example 1
Ensayo de xeroprotección de enzimas Enzyme Xeroprotection Assay
El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frente a la desecación. Para ello se utilizó la enzima lipasa. Partiendo de 1 μl que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 μl de la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 μl de una solución al 10% de trehalosa a 1 μl (0,00554 U) de solución de lipasa y como control negativo se añadió 15 μl de agua a 1 μl (0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 μl con lipasa se depositaron en un microtubo de 2 ml de capacidad y se secaron a 50ºC durante 120 minutos. Una vez secas se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. Finalmente fueron almacenadas en un desecador a temperatura ambiente durante 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, las reacciones se resuspendieron en 50 μl de una solución de TrisHCl (50 mM) y se transfirieron a un microtubo junto con 950 μl de Tris HCl (50 mM) pH8 y 1 ml de Solución de Sustrato. La determinación de la capacidad xeroprotectora de cada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa. The objective of this test was to determine the ability of the bacterial milking product fraction to protect enzymes from drying out. For this, the enzyme lipase was used. Starting from 1 μl containing 0.00554 units of Burkholderia cepacia lipase (Sigma-Aldrich 62309-100 mg), 15 μl of the product fraction of the bacterial milking to be studied were added. As a positive control, 15 µl of a 10% solution of trehalose was added to 1 µl (0.00554 U) of lipase solution and as a negative control 15 µl of water was added to 1 µl (0.00554 U) of a solution of lipase The 16 µl mixtures with lipase were deposited in a 2 ml capacity microtube and dried at 50 ° C for 120 minutes. Once dried, they were incubated at 100 ° C for 5 minutes. They were finally stored in a desiccator at room temperature for 24 hours. After the incubation time, the reactions were resuspended in 50 μl of a solution of TrisHCl (50 mM) and transferred to a microtube together with 950 μl of Tris HCl (50 mM) pH8 and 1 ml of Substrate Solution. The xeroprotective capacity determination of each bacterial milking product fraction (POB) was determined by the lipase activity measurement test.
Para la medida de la actividad lipasa se utilizó una variación del método descrito por Gupta y colaboradores (2002) consistente en la cuantificación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) a partir del sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). Para ello se utilizó 1 ml de medio libre de células (985 μl de Tris-HCl 0,05 M junto a15 μl de POB obtenido por el método del “ordeñado bacteriano”) mezclado con 1 ml de solución sustrato de un cultivo en fase estacionaria. Esta mezcla de ensayo se incubó a 30ºC durante 30 minutos en microtubos estériles de 2 ml. La reacción se paró mediante incubación a 100ºC durante 4 minutos en termobloque y 2 minutos a -20ºC. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro Hitachi U-2000 a una longitud de onda de 410 nm. La solución sustrato (SS) se preparó mezclando 10 ml de solución A (30 mg de pNPP en 10 ml de isopropanol) con 90 ml de solución B (0,1 g de goma arábiga y 0,4 ml de Tritón X-100 en 90 ml tampón Tris-HCl 50 mM pH8). La mezcla de solución A y B se agitó suavemente hasta su total disolución. La Fig. 1 muestra los valores de protección de la enzima lipasa al secado generados por los POBs y POBSIAs producidos por la cepa que comprenden los mismos componentes que la composición sintética objeto de la invención. For the measurement of lipase activity, a variation of the method described by Gupta et al. (2002) was used, consisting of the spectrophotometric quantification of p-nitrophenol released by the lipase enzyme from Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) from p-nitrophenol palmitate (pNPP) substrate (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). For this, 1 ml of cell-free medium (985 μl of 0.05 M Tris-HCl was used together with 15 μl of POB obtained by the method of “bacterial milking”) mixed with 1 ml of substrate solution of a stationary phase culture . This test mixture was incubated at 30 ° C for 30 minutes in sterile 2 ml microtubes. The reaction was stopped by incubation at 100 ° C for 4 minutes in thermoblock and 2 minutes at -20 ° C. The absorbance was measured on a Hitachi U-2000 spectrophotometer at a wavelength of 410 nm. The substrate solution (SS) was prepared by mixing 10 ml of solution A (30 mg of pNPP in 10 ml of isopropanol) with 90 ml of solution B (0.1 g of gum arabic and 0.4 ml of Triton X-100 in 90 ml 50 mM Tris-HCl buffer pH8). The mixture of solution A and B was gently stirred until completely dissolved. Fig. 1 shows the protection values of the enzyme lipase on drying generated by the POBs and POBSIAs produced by the strain comprising the same components as the synthetic composition object of the invention.
Ejemplo 2 Example 2
Ensayo de xeroprotección de microorganismos Xeroprotection test of microorganisms
El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad para proteger células vivas de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB) así como los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs) de diversas cepas xerotolerantes de forma análoga a la descrita por Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). Para ello se utilizó un preinóculo de E. coli, a partir del cual se inoculó medio mínimo más glucosa como fuente de carbono adicionados de 0,6 M de NaCl hasta alcanzar una densidad óptica inicial de 0,05. Tras 12 horas de incubación a 37ºC en agitación, se centrifugaron alícuotas de 1ml del cultivo crecido. Las células de E. coli se resuspendieron en una solución al 10% de los POBs o POBSIAs extraídos de las células xerotolerantes (extraídos según se describe anteriormente) y además, 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP). Igualmente se realizó la misma experiencia mediante la combinación y mezcla de sustratos comerciales identificados en POBs y POBSIAs en iguales proporciones, a los que se llamaron POB sintético o POBSIA sintético en contraposición al directamente extraído de células que llamamos natural.Enel caso de los POB/POBSIA sintéticos la mezcla se realizó en una solución al 34,2%. La suspensión de células en las distintas soluciones se sometieron a condiciones de desecación por vacío sin congelación, en un congelador-desecador modificado (Dura -Stop μ P; FTS Systems, Stone Ridge, NY) a 30ºC de temperatura media y 100 mTorr (2Pa; 2x10−5 atmósferas) durante 20 segundos, con una rampa de temperatura de 2,5ºC/min con 15 minutos de pausa después de cada incremento de 2ºC, hasta llegar a la temperatura máxima de 40ºC. The objective of this test was to determine the ability to protect live cells of Escherichia coli MC4100 against desiccation by using the bacterial milking product (POB) as well as those extracted by Air Drying (POBSIAs) of various xerotolerant strains analogous to that described by Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). For this, a pre-circle of E. coli was used, from which a minimum medium plus glucose was inoculated as an added carbon source of 0.6 M NaCl until an initial optical density of 0.05 was reached. After 12 hours of incubation at 37 ° C under stirring, 1 ml aliquots of the grown culture were centrifuged. E. coli cells were resuspended in a 10% solution of the POBs or POBSIAs extracted from the xerotolerant cells (extracted as described above) and in addition, 1.5% polyvinylpyrrolidone (PVP). The same experience was also carried out by combining and mixing commercial substrates identified in POBs and POBSIAs in equal proportions, which were called synthetic POB or synthetic POBSIA as opposed to directly extracted from cells we call natural. In the case of POB / POBSIA synthetic the mixture was performed in a 34.2% solution. The cell suspension in the different solutions was subjected to vacuum drying conditions without freezing, in a modified freezer-desiccator (Dura -Stop μP; FTS Systems, Stone Ridge, NY) at 30 ° C medium temperature and 100 mTorr (2Pa ; 2x10-5 atmospheres) for 20 seconds, with a temperature ramp of 2.5ºC / min with 15 minutes of pause after each increase of 2ºC, until reaching the maximum temperature of 40ºC.
Las muestras se sellaron al vacío y se almacenaron a 30ºC hasta su ensayo de viabilidad a tiempo 1, 15 y 30 días. Pasado este tiempo las muestras se resuspendieron en 1 ml de LB y se realizaron ensayos de viabilidad mediante siembra en placa de LB sólido que se incubaron 24 horas a 37ºC, para el conteo de UFC y comparación con las UFC antes del secado, para de esta forma poder calcular la supervivencia de las muestras. The samples were sealed under vacuum and stored at 30 until their viability test at time 1, 15 and 30 days. After this time the samples were resuspended in 1 ml of LB and viability tests were carried out by planting in solid LB plate that were incubated 24 hours at 37 ° C, for the CFU count and comparison with the CFUs before drying, for this purpose. way to calculate the survival of the samples.
En la Fig. 3 se observa cómo las composiciones sintéticas POBs y POBSIAs de la cepa 4J27 produjeron un aumento de la supervivencia de los microorganismos respecto de la supervivencia experimentada por dichos microorganismos mediante una solución de trehalosa, cuando las soluciones estaban al 34,2% de dichos compuestos xeroprotectores y durante el primer día de conservación. Se observa que la aportación del PVP 1,5% a la supervivencia es nula. In Fig. 3 it is observed how the synthetic compositions POBs and POBSIAs of strain 4J27 produced an increase in the survival of the microorganisms with respect to the survival experienced by said microorganisms by means of a trehalose solution, when the solutions were at 34.2% of said xeroprotective compounds and during the first day of conservation. It is observed that the contribution of PVP 1.5% to survival is zero.
Claims (17)
- 2. 2.
- Composición según reivindicación 1 que comprende una proporción de glutamina:glucosa:trehalosa, de entre (0,5 y 1,5):(2 y 4):(4 y 8), respectivamente. Composition according to claim 1 comprising a ratio of glutamine: glucose: trehalose, between (0.5 and 1.5) :( 2 and 4) :( 4 and 8), respectively.
- 3. 3.
- Composición según la reivindicación 2, donde la proporción de glutamina:glucosa:trehalosa es de entre (0,7 y 1,3):(2,5 y 3,5):(5 y 7), respectivamente. Composition according to claim 2, wherein the ratio of glutamine: glucose: trehalose is between (0.7 and 1.3) :( 2.5 and 3.5) :( 5 and 7), respectively.
- 4. Four.
- Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%. Use of the composition according to any of claims 1 to 3 for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%.
- 6. 6.
- Uso según la reivindicación 4, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado. Use according to claim 4, wherein the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, an isolated organ or an isolated biological tissue.
- 7. 7.
- Uso según la reivindicación 4, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Use according to claim 4, wherein the biological material is a molecule with biological activity.
- 8. 8.
- Uso según la reivindicación 7, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Use according to claim 7, wherein the molecule with biological activity is an enzyme.
- 9. 9.
- Uso según la reivindicación 8, donde la enzima es una lipasa. Use according to claim 8, wherein the enzyme is a lipase.
- 10. 10.
- Método para la conservación de material biológico que comprende: a) mezclar la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones1a3con una muestra de Method for the conservation of biological material comprising: a) mixing the xeroprotective composition according to any of claims 1 to 3 with a sample of
- 11. eleven.
- Método según la reivindicación 10, donde el material biológico es un microorganismo o una célula. Method according to claim 10, wherein the biological material is a microorganism or a cell.
- 12. 12.
- Método según la reivindicación 10, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado. Method according to claim 10, wherein the biological material of step (a) is an invertebrate organism, a seed, a seedling, an isolated organ or an isolated biological tissue.
- 13. 13.
- Método según la reivindicación 10, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Method according to claim 10, wherein the biological material is a molecule with biological activity.
- 14. 14.
- Método según la reivindicación 13, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Method according to claim 13, wherein the molecule with biological activity is an enzyme.
- 15. fifteen.
- Método según la reivindicación 14, donde la enzima es una lipasa. Method according to claim 14, wherein the enzyme is a lipase.
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Legal Events
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