ES2381289A1 - Bacterial strain cect7623, uses thereof and xeroprotectant product produced from same - Google Patents
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Abstract
Description
Composición sintética con efecto xeroprotector.Synthetic composition with effect Xeroprotector.
La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.The present invention relates to a synthetic xeroprotective composition, similar to that which can be obtained from the microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with accession number CECT7623, which comprises glutamine, glucose and trehalose.
La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se refiere a un método para la conservación de dicho material biológico.The present invention also relates to the use of the xeroprotective composition for material conservation biological with a residual moisture content equal to or less than 10%, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, a isolated biological tissue, a cell or a molecule with activity biological such as an enzyme with lipase activity. Further, The present invention relates to a method for the conservation of said biological material.
La conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural, produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad vital. La liofilización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas.The conservation of biological materials through dehydration and osmoconcentration is a technology known. When the task of conserving sensitive biomolecules is made necessary, the simple drying by dehydration failed, since the structural water was eliminated, producing the subsequent denaturation and loss of vital activity. The Freeze drying has become the most accepted method for long-term conservation of sensitive biomolecules, used by widely used example for vaccine preservation live attenuated.
Los métodos actuales de conservación requieren de gran costo en energía y generalmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la liofilización producen reducciones significativas en la actividad/viabilidad del material conservado.Current conservation methods require of great cost in energy and generally need storage at low temperatures. Sometimes, after its preservation, the biological material has an activity and / or viability that does not Reach satisfactory levels. Conservation methods, such as drying at room temperature, formulations in liquid, frozen with cryoprotectants or lyophilization produce significant reductions in the activity / viability of preserved material
Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la liofilización confiere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto final, y se requiere aún refrigeración para reducir el deterioro durante el almacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la "cadena de frío" es difícil, pueden conducir finalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible.The processes currently used are slow and They imply high energy consumption. In addition, lyophilization confers only a modest level of thermotolerance in the product final, and cooling is still required to reduce deterioration during storage This is a particular problem for live vaccines intended for use in tropical climates, since these they lose activity, with the unfortunate result that vaccination programs carried out in the field in tropical countries, where control of the "cold chain" is difficult, they can finally lead to vaccination of patients with lower vaccine to the standard or, in some cases, unusable.
Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de microorganismos, plantas y animales adquirieron la notable y elegante capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la "planta de la resurrección" Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, la levadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa (\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido).During evolutionary natural selection, certain species of microorganisms, plants and animals acquired the remarkable and elegant ability to tolerate extreme dehydration, remaining dormant in hostile environments for very long periods of time and still capable of acquiring a complete vital activity once hydrated again. . Examples include the "resurrection plant" Selaginella lepidophyla , Artemia salina sea shrimp , Saccharomyces cerevisiae yeast or Macrobiotus hufelandi tardigrade. These organisms are called cryptiobiotics and the procedure by which they survive is known as anhydrobiosis. All species of animals and plants that have this capacity contain protective molecules that form amorphous crystals, such as trehalose disaccharide (? -D-glucopyranosyl-? -D-glucopyranoside).
La formación y uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4-O-\alpha-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS (\alpha-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol) y GPM (\alpha-D-glucopiranosil-1-6-manitol)] y sus componentes individuales GPS y GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, rafinosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina.The formation and use of amorphous crystals is well documented (Manzanera et al ., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Some of the preservatives that form these crystals are suitable for this type of preservation and include non-reducing carbohydrates such as trehalose, hydroxyectoin, maltitol, lactitol (4-O-? -D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [ mixture of GPS (α-D-glucopyranosyl-1-6-sorbitol) and GPM (α-D-glucopyranosyl-1-6-mannitol)] and its individual components GPS and GPM. Non-reducing glycosides of polyhydroxy compounds such as neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosyl trehalose, sucrose, lactose sucrose, raffinose, etc. Other amorphous crystal-forming preservatives include amino acids such as hydroxyectoin.
La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suficientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa.The presence of water in the dry state is generally less than 0.2 g / g dry cell weight in most of the cryptobionts. These water levels are sufficient for these invertebrate organisms or microorganisms resist the extreme dehydration, high temperatures, radiation ionizing or also, in some species of tardigrades, pressures up to 600 MPa.
La presente invención se refiere a una composición sintética con efecto xeroprotector que comprende glutamina, glucosa y trehalosa, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, según se describe en la patente P200931116.The present invention relates to a synthetic composition with an xeroprotective effect comprising glutamine, glucose and trehalose, similar to that obtainable from the microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7623, as described in patent P200931116.
La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa.The present invention also relates to the use of the xeroprotective composition for material conservation biological with a residual moisture content equal to or less than 10%, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, a isolated biological tissue, a cell or a molecule with activity biological such as an enzyme with lipase activity.
La capacidad para conservar material biológico sensible por períodos de tiempo indefinido en forma activa o viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionar la conservación de material biológico que presenta dificultades para su estabilización. El material biológico preservado con la composición es estable por períodos largos de tiempo.The ability to conserve biological material sensitive for indefinite periods in an active or viable way It is of importance in applications for the medical sectors, Agricultural and industrial In the present invention they are offered tools to solve the conservation of biological material which presents difficulties for its stabilization. The material Biological preserved with the composition is stable for periods long time
Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir, la suma del efecto en la conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene glutamina, glucosa o trehalosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico.As shown in the examples of the present invention, the use of a composition each containing of the components separately for the conservation of the activity of a lipase enzyme, that is, the sum of the effect on the conservation of the enzymatic activity of a composition that Contains glutamine, glucose or trehalose, is less than the effect of conservation that produces a composition that contains all components, that is, the xeroprotective composition has an effect synergistic in its ability to conserve biological material.
En adelante se podrá hacer referencia al
microorganismo CECT7623, depositado en la colección española de
cultivos tipo (CECT) el 10 de noviembre de 2009 al que le
correspondió el nº de depósito CECT7623, con el término "4J27",
o como "microorganismo de la presente invención" o el
"microorganismo de la invención". La dirección de dicha
Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de
Valencia/Edificio de investigación/Campus de
Burjassot/46100
Burjassot (Valencia).From now on, reference may be made to the microorganism CECT7623, deposited in the Spanish type crop collection (CECT) on November 10, 2009, to which the deposit number CECT7623 corresponded, with the term "4J27", or as "microorganism of the present invention "or the" microorganism of the invention ". The address of said International Deposit Authority is: University of Valencia / Research building / Campus of
Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia).
La composición sintética objeto de esta invención es equivalentes a la que conforman los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D), según se describe en la patente P20093116.The synthetic composition object of this invention is equivalent to that which make up the products of Bacterial milking of strain 4J27 after extraction by drying by air incubation (4J27D), as described in the P20093116 patent.
El término "composición xeroprotectora" tal como se entiende en la presente invención, se refiere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético.The term "xeroprotective composition" such as understood in the present invention, it refers to a composition that prevents the adverse effects of desiccation total or partial material of biological origin or material of origin synthetic.
El material biológico se refiere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas, virus, partículas virales o cualquier molécula que comprenda cualquiera de los elementos anteriores o cualquier molécula orgánica que tenga un efecto farmacológico, inmunogénico y/o fisiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes anti-infectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; antiartríticos, antiasmáticos, antiinflamatorios, antioplásticos, antipruríticos, antipsicóticos, antipiréticos, antiespasmódicos, preparaciones cardiovasculares (incluyendo bloqueantes de canales de calcio, bloqueadores beta, o antiarrítmicos), agentes contra la hipertensión, diuréticos, vasodilatadores, estimuladores del sistema nervioso central, antitusivos, preparaciones anti resfriados, descongestionantes, agentes de diagnóstico, hormonas, estimuladores del crecimiento óseo, inhibidores de la resorción de la médula ósea, inmunosupresores, relajantes musculares, psicoestimulantes, sedantes, tranquilizantes, proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos (tanto naturales, como sintéticos, como productos recombinantes), moléculas de ácidos nucleicos (tanto en forma polimérica de dos o más nucleótidos de ADN o ARN, incluyendo tanto moléculas de cadena doble como de cadena sencilla, construcciones genéticas, vectores de expresión, ARN antisentido, sentido o moléculas ARNi) o nucleótidos (como por ejemplo, pero sin limitarse, el dATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP, de utilidad en la técnica de PCR, secuenciación, etc).The biological material refers to any compound produced directly by a living organism in any state of development, in any cell compartment, whatever be the nature, composition or structure of it, or that comes of an organism that is no longer alive. Said biological material may be, for example, but not limited to, a cell, nucleic acid, protein, enzyme, polysaccharide, lipid, phospholipid, liposomes, viruses, viral particles or any molecule that you understand any of the above elements or any organic molecule having a pharmacological, immunogenic and / or physiological effect of local and / or systemic action. The biological material can comprise therapeutic agents; anti-infective agents such as antibiotics, antivirals; painkillers or combinations of analgesics; anti-arthritic, anti-asthmatic, anti-inflammatory, antioplastics, antipruritics, antipsychotics, antipyretics, antispasmodics, cardiovascular preparations (including calcium channel blockers, beta blockers, or antiarrhythmic agents), anti-hypertension agents, diuretics, vasodilators, central nervous system stimulators, antitussives, anti-cold preparations, decongestants, diagnostic agents, hormones, growth stimulators bone, bone marrow resorption inhibitors, immunosuppressants, muscle relaxants, psychostimulants, sedatives, tranquilizers, proteins, peptides or fragments of themselves (both natural and synthetic, as products recombinants), nucleic acid molecules (both in form polymeric of two or more DNA or RNA nucleotides, including both double chain molecules as single chain, constructions genetics, expression vectors, antisense RNA, sense or RNAi molecules) or nucleotides (such as, but not limited to, dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP, useful in the PCR technique, sequencing, etc.)
El material de origen sintético se refiere a un tipo de material que no ha sido producido o sintetizado por un organismo vivo directamente sino que ha sido creado por el ser humano como por ejemplo, pero sin limitarse, una secuencia de ADN amplificada por PCR, o una proteína o enzima modificada intencionadamente o no. Asimismo, el material biológico se refiere también a un organismo invertebrado, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido aislado o una célula.Material of synthetic origin refers to a type of material that has not been produced or synthesized by a living organism directly but it has been created by the being human as for example, but not limited to, a DNA sequence PCR amplified, or a modified protein or enzyme intentionally or not. Also, the biological material refers also to an invertebrate organism, a microorganism, an organ isolated, an isolated tissue or a cell.
Así, la presente invención se refiere a la una composición xeroprotectora sintética, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.Thus, the present invention relates to the one synthetic xeroprotective composition, which comprises glutamine, glucose and trehalose
Una realización más preferida se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención o a la composición xeroprotectora sintética que comprende una proporción de entre 0,5 y 1,5 de glutamina, 2 y 4 de glucosa, y 4 y 8 de trehalosa. Es decir, una proporción (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (0,5 a 1,5):(2 a 4):(4 a 8), respectivamente. Una realización aún más preferida se refiere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), es de (0,7 y 1,3):(2,5 y 3,5):(5 y 7), respectivamente. Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (glutamina):(glucosa):(trehalosa), de (1):(2,8):(5,8), respectivamente.A more preferred embodiment refers to the xeroprotective composition produced by the microorganism of the invention or to the synthetic xeroprotective composition comprising a ratio of between 0.5 and 1.5 of glutamine, 2 and 4 of glucose, and 4 and 8 trehalose. That is, a proportion (glutamine) :( glucose) :( trehalose), from (0.5 to 1.5) :( 2 to 4) :( 4 to 8), respectively. An even more preferred embodiment refers to the xeroprotective composition where the proportion of (glutamine) :( glucose) :( trehalose), is (0.7 and 1.3) :( 2.5 and 3.5) :( 5 and 7), respectively. Preferably the xeroprotective composition has a ratio of (glutamine) :( glucose) :( trehalose), of (1) :( 2.8) :( 5.8), respectively.
El término "proporción" tal como se entiende en la presente invención se refiere a la correspondencia debida de los elementos de la composición (\beta-hidroxibutirato, ácido glucurónico, ácido glutámico, glutamina y glucosa; o glutamina, glucosa y trehalosa) relacionados entre sí. Es decir, se refiere a una relación matemática que vincula los elementos de la composición.The term "proportion" as understood in the present invention refers to correspondence due from the elements of the composition (β-hydroxybutyrate, glucuronic acid, acid glutamic, glutamine and glucose; or glutamine, glucose and trehalose) related to each other. That is, it refers to a relationship Mathematics that links the elements of the composition.
En adelante se podrá hacer referencia a cualquier composición descrita en los párrafos anteriores como "composición de la presente invención" o "composición de la invención".Hereinafter reference may be made to any composition described in the preceding paragraphs as "composition of the present invention" or "composition of the invention".
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Otro aspecto de la presente invención es el uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico con un contenido en humedad residual igual o inferior al 10%. El contenido de humedad residual del material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión "material biológico en estado seco". En estas condiciones, el conservante o estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo, y sólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas. De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador.Another aspect of the present invention is the use of the composition of the invention for the conservation of material biological with a residual moisture content equal to or less than 10% The residual moisture content of the biological material can be equal to or less than 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1% humidity residual. The preservation of said material can be carried out by stabilizing it. In the present invention, for refer to this type of biological material you can use the expression "biological material in dry state". In these conditions, the coalesce preservative or stabilizer to achieve a non-crystalline, vitreous, and solid state (by example an amorphous crystal). The organic crystal particles that they are formed by drying the biological material with the stabilizer are covered by the stabilizer that produces a high stability by drastically reducing chemical reactions. From this way the dry biological material is embedded in the crystal amorphous formed by the stabilizer.
El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido.Dry biological material in the presence of stabilizer that forms amorphous glass is resistant to plastics in a liquid state, while the material that is not dry in presence of these stabilizers is not resistant to plastics in liquid state.
El material biológico seco en estas formas puede encontrarse en estado no particulado y puede suministrarse en formas por ejemplo, pero sin limitarse, molduras o sólidos en 3 dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches, hojas, bolas, o pepitas de material biológico seco.Dry biological material in these forms can be in a non-particulate state and can be supplied in forms for example, but not limited to moldings or solids in 3 dimensions such as, but not limited to, blocks, pills, patches, leaves, balls, or nuggets of dry biological material.
El término "humedad residual" tal como se emplea en la presente invención se refiere a la cantidad de humedad que contiene un producto después de pasado por algún tipo de proceso capaz de eliminar agua del mismo. La humedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del total de la masa. Es decir un valor de humedad residual de un producto igual a un 10% significa que 10 g de cada 100 g del producto corresponden a agua. La humedad residual puede ser medida mediante métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico.The term "residual moisture" as it is used in the present invention refers to the amount of moisture that contains a product after going through some kind of process capable of removing water from it. The residual humidity is the percentage of product mass corresponding to water with respect to Total mass. That is a residual moisture value of a product equal to 10% means that 10 g of every 100 g of the Product correspond to water. Residual humidity can be measured. by methods known in the state of the art as per example, but not limited, by the titrimetric method, the azeotropic method or gravimetric method.
El término "conservación de material biológico" hace referencia al mantenimiento o cuidado de la permanencia de las características intrínsecas del material biológico.The term "material conservation biological "refers to the maintenance or care of the permanence of the intrinsic characteristics of the material biological.
Una realización preferida se refiere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. La célula puede ser procariota o eucariota. La célula puede ser una célula de un microorganismo en cualquier estado de desarrollo. La célula puede ser somática o germinal, vegetal o animal. Dicha célula puede proceder de cualquier organismo o microorganismo y puede presentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo, pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El microorganismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse Escherichia coli, Salmonella. typhimurium, Pseudomonas putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. o Bifidobacterium spp.. El microorganismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo.A preferred embodiment relates to the use of the composition of the invention for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue or a cell. The cell can be prokaryotic or eukaryotic. The cell can be a cell of a microorganism in any state of development. The cell can be somatic or germinal, plant or animal. Said cell can come from any organism or microorganism and can occur in any state of differentiation, such as, but not limited to, from a culture of a cellular tissue or organs, sperm, ovules or embryos. The cell can be a totipotent, multipotent or unipotent stem cell. The microorganism can be unicellular or multicellular. The unicellular microorganism is selected from the list comprising, but not limited to Escherichia coli , Salmonella. typhimurium , Pseudomonas putida ., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. or Bifidobacterium spp .. The multicellular microorganism can be, for example, but not limited to, a nematode.
La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicación y división celular. Por otra parte la célula puede haber sido tratada, manipulada o mutada antes de su conservación. Por ejemplo, pero sin limitarse, una célula puede haberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las células que se conservan pueden formar una población homogénea o heterogénea, por ejemplo, pero sin limitarse, una librería de células en la que cada una contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes.The cell conserved by the composition of the The present invention is a viable cell, that is, it is capable of perform normal cell functions including the replication and cell division. On the other hand the cell may have been treated, manipulated or mutated before preservation. By example, but not limited, a cell may have been made competent for transformations or transfections, or may contain recombinant nucleic acids. The cells that are preserved can form a homogeneous or heterogeneous population, for example, but without limited, a library of cells in which each one contains a variation of some nucleic acid. Preferably the cells are non-anhydrobotic cells (drying sensitive cells) as per example, but not limited to, cells from microorganisms non-anhydrobial prokaryotes that are generally not sporulants
La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse, en condiciones de alta osmolaridad (alta concentración de sales) que estimulen la producción intracelular de trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos.The conservation of the microorganism can be improved by cultivation under conditions that increase the intracellular concentration of trehalose or other stabilizers amorphous crystal formers. For example, but not limited to, in conditions of high osmolarity (high concentration of salts) that stimulate the intracellular production of trehalose or others stabilizers forming amorphous crystals.
El organismo invertebrado es pero sin limitarse, una larva de insecto o un crustáceo. Dichos organismos invertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrolla.The invertebrate organism is but not limited to, an insect larva or a crustacean. Such invertebrate organisms they can be preserved under drying conditions, allowing the vital activity thereof, so that, when rehydrated, said organisms have the ability to move. The seedling is a plant in its early stages of development, since it germinates Until it develops.
La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo vertebrado perteneciente a la Superclase Tetrapoda (con cuatro extremidades), Clase Amphibia (anfibios) o Clase Reptilia (reptiles), o cualquiera de sus partes (Vernon y Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon y Jackson llevaron a cabo un estudio sobre la rana Leopardo (Rana pipiens), en el que de forma natural se seca su piel, lengua, bazo, e hígado con una pérdida de agua de entre un 43-81% del contenido de agua total.The composition of the invention can be used for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is a vertebrate organism belonging to the Tetrapoda Superclass (with four limbs), Amphibia Class (amphibians) or Reptilia Class (reptiles), or any of its parts (Vernon and Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon and Jackson carried out a study on the Leopard frog ( Rana pipiens ), in which their skin, tongue, spleen, and liver naturally dries with a water loss of between 43-81% of the water content total.
Un órgano aislado o un tejido biológico aislado (incluida la sangre) pueden conservarse mediante la composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de criopreservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).An isolated organ or an isolated biological tissue (including blood) can be preserved by the composition of the present invention. In Serrato et al . (2009) results of cryopreservation protocols of biological tissues can be observed (Serrato et al ., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).
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Una realización más preferida se refiere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término "molécula con actividad biológica" tal como se entiende en la presente invención se refiere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término "derivados" se refiere a moléculas obtenidas por la modificación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término "análogos" se refiere a moléculas que presentan una función similar a la molécula con actividad biológica.A more preferred embodiment refers to the use of the composition of the invention, where the biological material is A molecule with biological activity. The term "molecule with biological activity "as understood herein invention refers to a biological molecule whose origin is a living organism or that has been alive, or derivatives or analogues of said molecule. The term "derivatives" refers to molecules obtained by modifying a molecule with activity biological, which have similar functionality. On the other hand, the term "analogues" refers to molecules that have a function similar to the molecule with biological activity.
Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC (Enzyme Commission numbers) que comprende las hidrolasas de éster carboxílico (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa), EC 3.1.1.2 (Arilesterasa), EC 3.1.1.3 (Triacilglicerol lipasa), EC 3.1.1.4 (Fosfolipasa A(2)), EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa), EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa), EC 3.1.1.24 (3-oxoadipato enol-lactonasa), EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa), EC 3.1.1.26 (Galactolipasa), EC 3.1.1.32 (Fosfolipasa A(1)), EC 3.1.1.33 (6-acetilglucosa deacetilasa), EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblemente la enzima lipasa tiene actividad Triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3).According to another even more preferred embodiment of the composition of the present invention the molecule with biological activity is an enzyme. An even more preferred embodiment of the present invention relates to the use of the composition of the invention, where the enzyme is an enzyme with lipase activity. The enzyme with lipase activity is selected from the list of enzymes with EC numbers ( Enzyme Commission numbers ) comprising carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxylesterase), EC 3.1.1.2 (Arilesterase), EC 3.1.1.3 (Triacylglycerol lipase), EC 3.1.1.4 (Phospholipase A (2)), EC 3.1.1.5 (Lysophospholipase), EC 3.1.1.23 (Acylglycerol lipase), EC 3.1.1.24 (3-oxoadipate enol-lactonase), EC 3.1.1.25 (1,4-lactonase), EC 3.1.1.26 (Galactolipase), EC 3.1.1.32 (Phospholipase A (1)), EC 3.1.1.33 (6-acetylglucose deacetylase), EC 3.1.1.34 (Lipoprotein lipase ). Preferably the enzyme lipase has Triacylglycerol lipase activity (EC 3.1.1.3).
Otro aspecto de la presente invención se refiere al método para la conservación de material biológico que comprende:Another aspect of the present invention relates to to the method for the conservation of biological material that understands:
a) mezclar la composición de la invención con una muestra de material biológico aislado, ya) mixing the composition of the invention with a sample of isolated biological material, and
b) deshidratar el producto obtenido en el paso (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.b) dehydrate the product obtained in step (a) up to a residual humidity equal to or less than 10%.
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Una realización preferida se refiere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula.A preferred embodiment refers to the method for the conservation of biological material, where the material The biological step (a) is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, a tissue Isolated biological or a cell.
Otra realización preferida se refiere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.Another preferred embodiment refers to the method for the conservation of biological material, where the material Biological is a molecule with biological activity.
Una realización más preferida de la presente invención se refiere al método, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Según una realización más preferida de la presente invención la enzima es una lipasa.A more preferred embodiment of the present invention refers to the method, where the molecule with activity Biological is an enzyme. According to a more preferred embodiment of the Present invention the enzyme is a lipase.
Otra realización aún más preferida se refiere a cualquiera de los métodos para la conservación de material biológico, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.Another even more preferred embodiment relates to any of the methods for material conservation biological, where dehydration of the composition mixture Xeroprotectora and biological material according to step (b) is carried carried out by means of a hypertonic solution or by means of a air stream.
Cualquier método para la conservación de material biológico de la presente invención permite el empleo de dicho material en procesos de manufacturación en los cuales el material biológico sería demasiado inestable si no estuviera conservado mediante el uso de la composición de la presente invención. La invención incluye extrusiones o moldes en los que se incluye el material conservado por cualquier método de la presente invención. Un método de producción de una moldura que contenga biomaterial activo mediante estabilizadores puede incluir soluciones de materiales plásticos. Por ejemplo una moldura de material plástico con biomaterial activo encapsulado puede ser útil como componentes de biosensores. Por ejemplo un biosensor puede incluir bacterias que sean capaces de detectar sustancias tóxicas, patógenos o toxicidad en general.Any method for the conservation of Biological material of the present invention allows the use of said material in manufacturing processes in which the biological material would be too unstable if it were not preserved by using the composition of the present invention. The invention includes extrusions or molds in which includes material conserved by any method herein invention. A method of producing a molding containing active biomaterial by stabilizers may include plastic materials solutions. For example a molding of plastic material with encapsulated active biomaterial may be useful as components of biosensors. For example a biosensor can include bacteria that are capable of detecting toxic substances, pathogens or toxicity in general.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping a better understanding of the features of the invention, in accordance with some examples made, are shown here, with character Illustrative and not limiting, the following figures:
Fig. 1. Muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v).Fig. 1. Shows the lipase activity (in percentage relative to 100% positive control activity) after drying of the lipase enzyme in the presence of the different components of 10% bacterial milking products (w / v) .
El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo (-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA (Producto de Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubación al Aire) extraídos de la cepa 4J27 mediante tratamiento de secado y posterior hidratación, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención.The positive control is trehalose at 10%. He negative control (-) corresponds to the absence of compound some as an additive prior to the drying of the enzyme. 4J27 is the Lipase activity value recorded after stabilization by drying and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POB extracted from strain 4J27 by hyper / hypoosmotic shock respectively. 4J27D is the lipase activity recorded after the drying stabilization and subsequent enzyme reconstitution in the presence of POBSIA (Bacterial Milking Product extracted by Air Drying) incubated from strain 4J27 by drying treatment and subsequent hydration, which it comprises the same components as the synthetic composition object of this invention.
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Fig. 2. Muestra el porcentaje de estabilización de la actividad de la enzima lipasa por medio de algunas mezclas de solutos contra la desecación, respecto de la estabilización por trehalosa (100%).Fig. 2. Shows the percentage of stabilization of the activity of the lipase enzyme by means of some mixtures of solutes against desiccation, with respect to stabilization by trehalose (100%) .
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Fig. 3. Muestra la evolución de la supervivencia de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB), los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs), así como de la composición sintética objeto de la invención.Fig. 3. It shows the evolution of the survival of Escherichia coli MC4100 against desiccation through the use of the bacterial milking product (POB), those extracted by Air Drying (POBSIAs), as well as the synthetic composition object of the invention
4J27 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J27 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J27D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención.4J27 is the registered lipase activity value after drying stabilization and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POB extracted from strain 4J27 by shock hyper / hypoosmotic respectively. 4J27D is the lipase activity recorded after drying and subsequent stabilization reconstitution of the enzyme in the presence of POBSIA, which comprises the same components as the synthetic composition object of this invention.
PVP indica que además se ha adicionado 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP).PVP indicates that 1.5% of polyvinylpyrrolidone (PVP).
SIN es sintético.SIN is synthetic.
T es trehalosa.T is trehal.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante que muestran la capacidad xeroprotectora de la composición objeto de esta invención así como del método de xeroprotección descrito.The invention will be illustrated below through illustrative and non-limiting tests that show the xeroprotective capacity of the composition object of this invention as well as the described xeroprotection method.
En la tabla 1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D).Table 1 shows the compositions of the bacterial milking products of the strain 4J27 after extraction by drying by air incubation (4J27D).
Asimismo, en la Fig. 2 se muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de glucosa y glutamina, compuestos químicos presentes en la composición sintética objeto de la invención. Las mezclas descritas se combinaron en la misma relación descrita en la mezcla de la presente invención y de esa mezcla se tomaron 10 g y se disolvieron en 100 ml de agua. El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo se corresponde con la ausencia de compuestos como aditivo previo a la desecación de la enzima (agua).Also, in Fig. 2 the activity is shown lipase (in percentage relative to 100% control activity positive) after drying of the lipase enzyme in the presence of glucose and glutamine, chemical compounds present in the synthetic composition object of the invention. The mixtures described were combined in the same ratio described in the mixture of the present invention and of that mixture was taken 10 g and dissolved in 100 ml of water. He Positive control is 10% trehalose. The negative control is corresponds to the absence of compounds as an additive prior to desiccation of the enzyme (water).
Tal como puede observarse en dicha Fig. 2, la combinación de los compuestos glucosa+glutamina, no presenta un efecto de conservación de la actividad de la enzima ni siquiera similar al que se muestra en la Fig. 1. En dicha Fig. 1 se muestra cómo las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J2A2D), presentan un efecto de protección de la enzima lipasa frente a la desecación mayor que en el caso de composiciones de conocida capacidad xeroprotectora.As can be seen in said Fig. 2, the combination of the glucose + glutamine compounds, does not present a conservation effect of enzyme activity not even similar to that shown in Fig. 1. In said Fig. 1 it is shown how the compositions of the bacterial milking products of the strain 4J27 after extraction by drying by air incubation (4J2A2D), have a protective effect of the enzyme lipase against drying out greater than in the case of compositions of known xeroprotective capacity.
El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frente a la desecación. Para ello se utilizó la enzima lipasa. Partiendo de 1 \mul que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 \mul de la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 \mul de una solución al 10% de trehalosa a 1 \mul (0,00554 U) de solución de lipasa y como control negativo se añadió 15 \mul de agua a 1 \mul (0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 \mul con lipasa se depositaron en un microtubo de 2 ml de capacidad y se secaron a 50ºC durante 120 minutos. Una vez secas se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. Finalmente fueron almacenadas en un desecador a temperatura ambiente durante 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, las reacciones se resuspendieron en 50 \mul de una solución de TrisHCl (50 mM) y se transfirieron a un microtubo junto con 950 \mul de Tris HCl (50 mM) pH8 y 1 ml de Solución de Sustrato. La determinación de la capacidad xeroprotectora de cada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa.The objective of this test was to determine the ability of the bacterial milking product fraction to protect enzymes from drying out. For this, the enzyme lipase was used. Starting from 1 µl containing 0.00554 units of Burkholderia cepacia lipase (Sigma-Aldrich 62309-100 mg), 15 µl of the product fraction of the bacterial milking to be studied were added. As a positive control, 15 µl of a 10% solution of trehalose was added to 1 µl (0.00554 U) of lipase solution and as a negative control 15 µl of water was added to 1 µl (0.00554 U ) of lipase solution. The 16 µl mixtures with lipase were deposited in a 2 ml capacity microtube and dried at 50 ° C for 120 minutes. Once dried, they were incubated at 100 ° C for 5 minutes. They were finally stored in a desiccator at room temperature for 24 hours. After the incubation time, the reactions were resuspended in 50 µl of a solution of TrisHCl (50 mM) and transferred to a microtube together with 950 µl of Tris HCl (50 mM) pH8 and 1 ml of Substrate Solution. The xeroprotective capacity determination of each bacterial milking product fraction (POB) was determined by the lipase activity measurement test.
Para la medida de la actividad lipasa se utilizó una variación del método descrito por Gupta y colaboradores (2002) consistente en la cuantificación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) a partir del sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). Para ello se utilizó 1 ml de medio libre de células (985 \mul de Tris-HCl 0,05 M junto a 15 \mul de POB obtenido por el método del "ordeñado bacteriano") mezclado con 1 ml de solución sustrato de un cultivo en fase estacionaria. Esta mezcla de ensayo se incubó a 30ºC durante 30 minutos en microtubos estériles de 2 ml. La reacción se paró mediante incubación a 100ºC durante 4 minutos en termobloque y 2 minutos a -20ºC. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro Hitachi U-2000 a una longitud de onda de 410 nm. La solución sustrato (SS) se preparó mezclando 10 ml de solución A (30 mg de pNPP en 10 ml de isopropanol) con 90 ml de solución B (0,1 g de goma arábiga y 0,4 ml de Tritón X-100 en 90 ml tampón Tris-HCl 50 mM pH8). La mezcla de solución A y B se agitó suavemente hasta su total disolución. La Fig. 1 muestra los valores de protección de la enzima lipasa al secado generados por los POBs y POBSIAs producidos por la cepa que comprenden los mismos componentes que la composición sintética objeto de la invención.For the measurement of lipase activity, a variation of the method described by Gupta et al. (2002) was used, consisting of the spectrophotometric quantification of p - nitrophenol released by the lipase enzyme of Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) from p - nitrophenol palmitate (pNPP) substrate (Gupta et al ., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). For this, 1 ml of cell-free medium (985 µl of 0.05 M Tris-HCl was used together with 15 µl of POB obtained by the "bacterial milking" method) mixed with 1 ml of substrate solution from a culture in stationary phase. This test mixture was incubated at 30 ° C for 30 minutes in sterile 2 ml microtubes. The reaction was stopped by incubation at 100 ° C for 4 minutes in thermoblock and 2 minutes at -20 ° C. The absorbance was measured on a Hitachi U-2000 spectrophotometer at a wavelength of 410 nm. The substrate solution (SS) was prepared by mixing 10 ml of solution A (30 mg of pNPP in 10 ml of isopropanol) with 90 ml of solution B (0.1 g of gum arabic and 0.4 ml of Triton X-100 in 90 ml 50 mM Tris-HCl buffer pH8). The mixture of solution A and B was gently stirred until completely dissolved. Fig. 1 shows the protection values of the enzyme lipase on drying generated by the POBs and POBSIAs produced by the strain comprising the same components as the synthetic composition object of the invention.
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El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad para proteger células vivas de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo del producto de ordeñado bacteriano (POB) así como los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs) de diversas cepas xerotolerantes de forma análoga a la descrita por Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). Para ello se utilizó un preinóculo de E. coli, a partir del cual se inoculó medio mínimo más glucosa como fuente de carbono adicionados de 0,6 M de NaCl hasta alcanzar una densidad óptica inicial de 0,05. Tras 12 horas de incubación a 37ºC en agitación, se centrifugaron alícuotas de 1ml del cultivo crecido. Las células de E. coli se resuspendieron en una solución al 10% de los POBs o POBSIAs extraídos de las células xerotolerantes (extraídos según se describe anteriormente) y además, 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP). Igualmente se realizó la misma experiencia mediante la combinación y mezcla de sustratos comerciales identificados en POBs y POBSIAs en iguales proporciones, a los que se llamaron POB sintético o POBSIA sintético en contraposición al directamente extraído de células que llamamos natural. En el caso de los POB/POBSIA sintéticos la mezcla se realizó en una solución al 34,2%. La suspensión de células en las distintas soluciones se sometieron a condiciones de desecación por vacío sin congelación, en un congelador-desecador modificado (Dura - Stop \mu P; FTS Systems, Stone Ridge, NY) a 30ºC de temperatura media y 100 mTorr (2Pa; 2x10^{-5} atmósferas) durante 20 segundos, con una rampa de temperatura de 2,5ºC/min con 15 minutos de pausa después de cada incremento de 2ºC, hasta llegar a la temperatura máxima de 40ºC.The objective of this test was to determine the ability to protect live cells of Escherichia coli MC4100 against desiccation by using the bacterial milking product (POB) as well as those extracted by Air Drying (POBSIAs) of various xerotolerant strains in a way analogous to that described by Manzanera et al ., (2002) (Manzanera et al ., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). For this, a pre-circle of E. coli was used , from which a minimum medium plus glucose was inoculated as an added carbon source of 0.6 M NaCl until an initial optical density of 0.05 was reached. After 12 hours of incubation at 37 ° C under stirring, 1 ml aliquots of the grown culture were centrifuged. E. coli cells were resuspended in a 10% solution of the POBs or POBSIAs extracted from the xerotolerant cells (extracted as described above) and in addition, 1.5% polyvinylpyrrolidone (PVP). The same experience was also carried out by combining and mixing commercial substrates identified in POBs and POBSIAs in equal proportions, which were called synthetic POB or synthetic POBSIA as opposed to directly extracted from cells we call natural . In the case of synthetic POB / POBSIA, the mixing was performed in a 34.2% solution. The cell suspension in the various solutions was subjected to vacuum drying conditions without freezing, in a modified freezer-desiccator (Dura-Stop µF; FTS Systems, Stone Ridge, NY) at 30 ° C medium temperature and 100 mTorr ( 2Pa; 2x10-5 atmospheres) for 20 seconds, with a temperature ramp of 2.5ºC / min with 15 minutes of pause after each increase of 2ºC, until reaching the maximum temperature of 40ºC.
Las muestras se sellaron al vacío y se almacenaron a 30ºC hasta su ensayo de viabilidad a tiempo 1, 15 y 30 días. Pasado este tiempo las muestras se resuspendieron en 1 ml de LB y se realizaron ensayos de viabilidad mediante siembra en placa de LB sólido que se incubaron 24 horas a 37ºC, para el conteo de UFC y comparación con las UFC antes del secado, para de esta forma poder calcular la supervivencia de las muestras.The samples were sealed under vacuum and stored at 30 ° C until its feasibility test at time 1, 15 and 30 days. After this time the samples were resuspended in 1 ml of LB and feasibility tests were carried out by plating of solid LB that were incubated 24 hours at 37 ° C, for CFU counting and comparison with the CFU before drying, so that it can Calculate the survival of the samples.
En la Fig. 3 se observa cómo las composiciones sintéticas POBs y POBSIAs de la cepa 4J27 produjeron un aumento de la supervivencia de los microorganismos respecto de la supervivencia experimentada por dichos microorganismos mediante una solución de trehalosa, cuando las soluciones estaban al 34,2% de dichos compuestos xeroprotectores y durante el primer día de conservación. Se observa que la aportación del PVP 1,5% a la supervivencia es nula.In Fig. 3 it is observed how the compositions Synthetic POBs and POBSIAs of strain 4J27 produced an increase in the survival of microorganisms with respect to survival experienced by these microorganisms through a solution of Trehalose, when the solutions were at 34.2% of those Xeroprotective compounds and during the first day of conservation. It is observed that the contribution of PVP 1.5% to survival is void
Claims (16)
- a)to)
- mezclar la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con una muestra de material biológico aislado, ymix the xeroprotective composition according to any of claims 1 to 3 with a sample of biological material isolated, and
- b)b)
- deshidratar el producto obtenido en el apartado (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.dehydrate the product obtained in the section (a) to a residual humidity equal to or less than 10%
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