ES2389367B2 - SYNTHETIC COMPOSITION WITH XEROPROTECTOR EFFECT. - Google Patents

SYNTHETIC COMPOSITION WITH XEROPROTECTOR EFFECT. Download PDF

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Abstract

Composición sintética con efecto xeroprotector.#La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625, que comprende acetato, lactato, ácido glutámico, {be}-hidroxibutirato y fructosa. La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.Synthetic composition with xeroprotective effect. # The present invention relates to a synthetic xeroprotective composition, similar to that obtainable from the bacterial species Rhodococcus sp. with accession number CECT7625, which comprises acetate, lactate, glutamic acid, {be} -hydroxybutyrate and fructose. The present invention also relates to the use of the xeroprotective composition for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%.

Description

Composición sintética con efecto xeroprotector Synthetic composition with xeroprotector effect

La presente invención se refiere a una compos1c1on xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625, que comprende acetato, lactato, ácido glutámico, ~-hidroxibutirato y fructosa. The present invention relates to a synthetic xeroprotective composition, similar to that which can be obtained from the bacterial species Rhodococcus sp. with accession number CECT7625, which comprises acetate, lactate, glutamic acid, ~ -hydroxybutyrate and fructose.

La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 1 0%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se refiere a un método para la conservación de dicho material biológico. The present invention also relates to the use of the xeroprotective composition for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 1.0%, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue, a cell or a molecule with biological activity such as an enzyme with lipase activity. In addition, the present invention relates to a method for the conservation of said biological material.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR STATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE


La conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural, produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad vital. La liofilización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas.
The conservation of biological materials by dehydration and osmoconcentration is a known technology. When the task of conserving sensitive biomolecules became necessary, simple drying by dehydration failed, since the structural water was eliminated, producing subsequent denaturation and loss of vital activity. Lyophilization has become the most accepted method for the long-term preservation of sensitive biomolecules, for example widely used for the conservation of live attenuated vaccines.

Los métodos actuales de conservación requieren de gran costo en energía y generalmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la liofilización producen reducciones significativas en la actividad/viabilidad del material conservado. Current conservation methods require high energy costs and generally need storage at low temperatures. Sometimes, after its conservation, the biological material has an activity and / or viability that does not reach satisfactory levels. Conservation methods, such as drying at room temperature, liquid formulations, freezing with cryoprotectants or lyophilization produce significant reductions in the activity / viability of the conserved material.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la liofilización confiere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto final, y se requiere aún refrigeración para reducir el deterioro durante el almacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la quot;cadena de fríoquot; es difícil, pueden conducir finalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible. The processes currently used are slow and involve high energy consumption. In addition, lyophilization confers only a modest level of thermotolerance in the final product, and cooling is still required to reduce deterioration during storage. This is a particular problem for live vaccines intended for use in tropical climates, since they lose activity, with the unfortunate result of vaccination programs carried out in the countryside in tropical countries, where the control of the "cold chain"; It is difficult, they can eventually lead to vaccination of patients with a lower than standard vaccine or, in some cases, unusable.

Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de microorganismos, plantas y animales adquirieron la notable y elegante capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la quot;planta de la resurrecciónquot; Selaginel/a lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, la levadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa (a-0-glucopiranosil-a-Dglucopiranósido). During evolutionary natural selection, certain species of microorganisms, plants and animals acquired the remarkable and elegant ability to tolerate extreme dehydration, remaining dormant in hostile environments for very long periods of time and still capable of acquiring a complete vital activity once hydrated again. . Examples include the quot; resurrection plantquot; Selaginel / a lepidophyla, Artemia salina sea shrimp, Saccharomyces cerevisiae yeast or Macrobiotus hufelandi tardigrade. These organisms are called cryptiobiotics and the procedure by which they survive is known as anhydrobiosis. All species of animals and plants that have this capacity, contain protective molecules that form amorphous crystals such as trehalose disaccharide (a-0-glucopyranosyl-a-Dglucopyranoside).

La formación y uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Enviran Microbio!, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4-0-a-D-glucopyranosyi-Dglucitol), palatinit [mezcla de GPS (a-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol) y GPM (a-D-glucopiranosil-1-6-manitol)] y sus componentes individuales GPS y GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, rafinosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina. The formation and use of amorphous crystals is well documented (Manzanera et al., 2002. Appl Enviran Microbio !, 68: 4328-4333). Some of the preservatives that form these crystals are suitable for this type of conservation and include non-reducing carbohydrates such as trehalose, hydroxyectoin, maltitol, lactitol (4-0-aD-glucopyranosyi-Dglucitol), palatinit [GPS mixture (aD -glucopyranosyl-1-6-sorbitol) and GPM (aD-glucopyranosyl-1-6-mannitol)] and its individual components GPS and GPM. Non-reducing glycosides of polyhydroxy compounds such as neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosyl trehalose, sucrose, lactose sucrose, raffinose, etc. Other amorphous crystal-forming preservatives include amino acids such as hydroxyectoin.

La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suficientes para que estos microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa. The presence of water in the dry state is generally less than 0.2 g / g dry cell weight in most cryptobionts. These water levels are sufficient for these microorganisms to resist extreme dehydration, high temperatures, ionizing radiation or, in some species of tardigrades, pressures of up to 600 MPa.


Es conocido que las biopelículas (Subaerial biofilms), formadas por bacterias del género Rhodococcus sp entre otras, son capaces de producir compuestos osmoprotectores, es decir, sustancias extracelulares poliméricas (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9(7): 1613-1631 ). Asimismo, Ortega-Morales et al. (2007) (Ortega-Morales et al. 2007. Journal of Applied Microbiology, 102: 254-264), describen bacterias de las biopelículas de las zonas intermareales tropicales, donde se han aislado bacterias que pertenecen al género Microbacterium sp. como fuente de nuevos exopolímeros protectores de las células contra la desecación. Por otra parte, LeBianc (2008) (LeBianc, 2008. Applied and environmental microbiology, 74(9): 2627-2636), se refiere al microorganismo Rhodococcus jostii RHA 1 , un actinomiceto con capacidades metabólicas favorables para la biorremediación de suelos contaminados, capaz de secretar los osmoprotectores ectoina y trehalosa.
It is known that biofilms (Subaerial biofilms), formed by bacteria of the genus Rhodococcus sp among others, are capable of producing osmoprotective compounds, that is, polymeric extracellular substances (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9 (7): 1613 -1631). Likewise, Ortega-Morales et al. (2007) (Ortega-Morales et al. 2007. Journal of Applied Microbiology, 102: 254-264), describe bacteria from biofilms in tropical intertidal zones, where bacteria belonging to the genus Microbacterium sp. as a source of new protective exopolymers of cells against desiccation. On the other hand, LeBianc (2008) (LeBianc, 2008. Applied and environmental microbiology, 74 (9): 2627-2636), refers to the microorganism Rhodococcus jostii RHA 1, an actinomycete with favorable metabolic capacities for bioremediation of contaminated soils, capable of secreting the ectoin and trehalose osmoprotectors.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN EXPLANATION OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a una composición sintética con efecto xeroprotector que comprende acetato, lactato, ácido glutámico, 13hidroxibutirato y fructosa, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Rhodococcus sp. con número de acceso CECT7625. La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula, o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se refiere un método para la conservación de dicho material biológico. The present invention relates to a synthetic composition with an xeroprotective effect comprising acetate, lactate, glutamic acid, 13-hydroxybutyrate and fructose, similar to that which can be obtained from the microorganism of the bacterial species Rhodococcus sp. with access number CECT7625. The present invention also relates to the use of the xeroprotective composition for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, a isolated organ, an isolated biological tissue or a cell, or a molecule with biological activity such as an enzyme with lipase activity. Furthermore, the present invention relates to a method for the conservation of said biological material.


La capacidad para conservar material biológico sensible por periodos de tiempo indefinido en forma activa o viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionar la conservación de material biológico que presenta dificultades para su estabilización. El material biológico preservado con la composición xeroprotectora es estable por periodos largos de tiempo. Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir, la suma del efecto en la
The ability to conserve sensitive biological material for indefinite periods in an active or viable way is of importance in applications for the medical, agricultural and industrial sectors. In the present invention tools are offered to solve the conservation of biological material that presents difficulties for its stabilization. The biological material preserved with the xeroprotective composition is stable for long periods of time. As shown in the examples of the present invention, the use of a composition containing each of the components separately for the conservation of the activity of a lipase enzyme, that is, the sum of the effect on the

conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene conservation of the enzymatic activity of a composition containing

acetato, o lactato, o ácido glutámico, o 13-hidroxibutirato o fructosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico. acetate, or lactate, or glutamic acid, or 13-hydroxybutyrate or fructose, is less than the preservation effect produced by a composition that contains all the components, that is, the xeroprotective composition has a synergistic effect on its ability to conserve biological material .

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo CECT7625, depositado en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 1 O de noviembre de 2009 al que le correspondió el n° de depósito CECT7625, con el término quot;4J2A2quot;, o como quot;microorganismo de la presente invenciónquot; From now on, reference may be made to the microorganism CECT7625, deposited in the Spanish type crop collection (CECT) on November 1, 2009, which corresponded with the deposit number CECT7625, with the term quot; 4J2A2quot ;, or as quot ; microorganism of the present invention

o el quot;microorganismo de la invenciónquot;. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia 1 Edificio de investigación 1Campus de Burjassot 146100 Burjassot (Valencia). or the "microorganism of the invention". The address of said International Deposit Authority is: University of Valencia 1 Research building 1Campus de Burjassot 146100 Burjassot (Valencia).

El término quot;composición xeroprotectoraquot; tal como se entiende en la presente invención, se refiere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético. El material biológico se refiere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas, virus, partículas virales o cualquier molécula que comprenda cualquiera de los elementos anteriores, The term quot; xeroprotectoraquot composition; as understood in the present invention, it refers to a composition that prevents the adverse effects of total or partial drying of material of biological origin or material of synthetic origin. Biological material refers to any compound produced directly by a living organism in any state of development, in any cellular compartment, whatever the nature, composition or structure thereof, or that comes from an organism that is no longer alive. Said biological material can be, for example, but not limited to, a cell, nucleic acid, protein, enzyme, polysaccharide, lipid, phospholipid, liposomes, viruses, viral particles or any molecule comprising any of the above elements,


o cualquier molécula orgánica que tenga un efecto farmacológico, inmunogénico y/o fisiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes anti-infectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; agentes antiartríticos, antiasmáticos, antiinflamatorios, antioplásticos, antipruríticos, antipsicóticos, antipiréticos, antiespasmódicos, preparaciones cardiovasculares (incluyendo bloqueantes de canales de calcio, bloqueadores beta, o antiarrítmicos), agentes contra la hipertensión, diuréticos, vasodilatadores, estimuladores del sistema nervioso central, antitusivos, preparaciones anti resfriados, descongestionantes, agentes de diagnóstico, hormonas, estimuladores del crecimiento óseo, inhibidores de la resorción de la médula ósea, inmunosupresores, relajantes musculares, psicoestimulantes, sedantes, tranquilizantes, proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos (tanto naturales, como sintéticos, como productos recombinantes), moléculas de ácidos nucleicos (tanto en forma polimérica de dos o más nucleótidos de ADN o ARN, incluyendo tanto moléculas de cadena doble como de cadena sencilla, construcciones genéticas, vectores de expresión, ARN antisentido, sentido o moléculas ARNi) o nucleótidos (como por ejemplo, pero sin limitarse, el dATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP, de utilidad en la técnica de PCR, secuenciación, etc). El material de origen sintético se refiere a un tipo de material que no ha sido producido o sintetizado por un organismo vivo directamente sino que ha sido creado por el ser humano como por ejemplo, pero sin limitarse, una secuencia de ADN amplificada por PCR, o una proteína o enzima modificada intencionadamente o no.
or any organic molecule that has a pharmacological, immunogenic and / or physiological effect of local and / or systemic action. The biological material may comprise therapeutic agents; anti-infective agents such as antibiotics, antivirals; analgesics or combinations of analgesics; antiarthritic, anti-asthmatic, anti-inflammatory, antioplastic, antipruritic, antipsychotic, antipyretic, antispasmodic, cardiovascular preparations (including calcium channel blockers, beta blockers, or antiarrhythmic agents), anti-hypertension agents, diuretics, vasodilators, central nervous system stimulants, central nervous system stimulants , anti-cold preparations, decongestants, diagnostic agents, hormones, bone growth stimulators, bone marrow resorption inhibitors, immunosuppressants, muscle relaxants, psychostimulants, sedatives, tranquilizers, proteins, peptides or fragments thereof (both natural, as synthetic, as recombinant products), nucleic acid molecules (both in polymeric form of two or more DNA or RNA nucleotides, including both double chain and single chain molecules, genetic constructs, expression vectors, antisense RNA, sent gone or RNAi molecules) or nucleotides (such as, but not limited to, dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP, useful in the technique of PCR, sequencing, etc.). Material of synthetic origin refers to a type of material that has not been produced or synthesized directly by a living organism but has been created by humans, for example, but not limited to, a DNA sequence amplified by PCR, or a protein or enzyme modified intentionally or not.

Así, la presente invención se refiere a la composición xeroprotectora sintética, que comprende fructosa, ácido glutámico, 13-hidroxibutirato, acetato y lactato. Thus, the present invention relates to the synthetic xeroprotective composition, which comprises fructose, glutamic acid, 13-hydroxybutyrate, acetate and lactate.


El término quot;acetatoquot; se refiere al anión acetato presente en una solución, es decir el anión acetato (C2H30 2r. es un carboxilato y es base conjugada del ácido acético. El término quot;lactatoquot; se refiere al anión lactato presente en una solución, es decir el anión lactato (C3Hso3r. es un carboxilato y es base conjugada del ácido láctico. El glutamato, forma ionizada del ácido glutámico, se refiere a uno de los 20 aminoácidos esenciales que forman parte de las proteínas. El ~-hidroxibutirato (o beta-hidroxibutirato) es el anión que deriva de la disolución del ácido 3-hidroxibutírico. La fructosa (o levulosa) es una cetohexosa (6 átomos de carbono) con formula química C6H1206, monosacárido con la misma fórmula empírica que la glucosa pero con diferente estructura.
The term quot; acetatequot; refers to the acetate anion present in a solution, that is to say the acetate anion (C2H30 2r. is a carboxylate and is a conjugate base of acetic acid. The term "lactatoquot" refers to the lactate anion present in a solution, i.e. the anion Lactate (C3Hso3r. is a carboxylate and is a conjugate base of lactic acid. Glutamate, an ionized form of glutamic acid, refers to one of the 20 essential amino acids that are part of proteins. ~ -hydroxybutyrate (or beta-hydroxybutyrate) is the anion that derives from the dissolution of 3-hydroxybutyric acid Fructose (or levulose) is a ketohexose (6 carbon atoms) with chemical formula C6H1206, monosaccharide with the same empirical formula as glucose but with different structure.

Una realización más preferida se refiere a la composición xeroprotectora sintética, que comprende una proporción de entre 35 y 45 de fructosa: 1 ,4 y 3,4 de ácido glutámico: 0,5 y 1,5 de acetato. Es decir, una proporción (fructosa):(ácido glutámico):(acetato) de (35 a 45): (1 ,4 a 3,4): (0,5 a 1 ,5), respectivamente. Una realización aún más preferida se refiere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(acetato) es de (38 a 44): (2 a 3): (0,7 a 1 ,3), respectivamente. Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(acetato) de (41 ):(2,4):(1 ), respectivamente. A more preferred embodiment relates to the synthetic xeroprotective composition, which comprises a ratio of between 35 and 45 of fructose: 1, 4 and 3.4 of glutamic acid: 0.5 and 1.5 of acetate. That is, a ratio (fructose) :( glutamic acid) :( acetate) of (35 to 45): (1, 4 to 3.4): (0.5 to 1, 5), respectively. An even more preferred embodiment relates to the xeroprotective composition where the ratio of (fructose) :( glutamic acid) :( acetate) is (38 to 44): (2 to 3): (0.7 to 1, 3) respectively. Preferably the xeroprotective composition has a ratio of (fructose) :( glutamic acid) :( acetate) of (41) :( 2,4) :( 1), respectively.

Una realización más preferida se refiere a la composición xeroprotectora sintética, que comprende una proporción de entre 14 y 18 de fructosa: 3 y 5 de ácido glutámico: 0,6 y 1 de ~-hidroxibutirato: 0,5 y 1,5 de acetato: 1 y 2 de lactato. Es decir, una proporción (fructosa):(ácido glutámico):(~hidroxibutirato):(acetato):(lactato) de (14 a 18):(3 a 5):(0,6 a 1):(0,5 a 1 ,5):(1 a 2). Una realización aún más preferida se refiere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(~hidroxibutirato):(acetato):(lactato) es de (15 a 17):(3,5 a 4,5):(0,7 a 0,9):(0,7 a 1 ,2):(1 ,2 a 1 ,6). Preferiblemente la composición xeroprotectora A more preferred embodiment relates to the synthetic xeroprotective composition, which comprises a ratio of between 14 and 18 of fructose: 3 and 5 of glutamic acid: 0.6 and 1 of ~ -hydroxybutyrate: 0.5 and 1.5 of acetate : 1 and 2 lactate. That is, a ratio (fructose) :( glutamic acid) :( ~ hydroxybutyrate) :( acetate) :( lactate) of (14 to 18) :( 3 to 5) :( 0.6 to 1) :( 0, 5 to 1, 5) :( 1 to 2). An even more preferred embodiment relates to the xeroprotective composition where the ratio of (fructose) :( glutamic acid) :( ~ hydroxybutyrate) :( acetate) :( lactate) is (15 to 17) :( 3.5 to 4 , 5) :( 0.7 to 0.9) :( 0.7 to 1, 2) :( 1, 2 to 1, 6). Preferably the xeroprotective composition

tiene have
una proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(~ a proportion from (fructose) :( acid glutamic) :( ~

hidroxibutirato ):(acetato ):(lactato) hydroxybutyrate) :( acetate) :( lactate)
de ( 16):( 4 ):(0,8):( 1 ):( 1 ,4), from (16) :( 4) :( 0.8) :( 1) :( 1, 4),

respectivamente. respectively.


El término quot;proporciónquot; tal como se entiende en la presente invención se refiere a la correspondencia debida de los elementos de la composición
The term quot; proportionquot; as understood in the present invention refers to the due correspondence of the elements of the composition

(fructosa, ácido glutámico, 13-hidroxibutirato, acetato y lactato) relacionados entre sí. Es decir, se refiere a una relación matemática que vincula los elementos de la composición. Para que sirva de ejemplo, la composición xeroprotectora que tiene una proporción de (fructosa):(ácido glutámico):(l3hidroxibutirato ):(acetato ):(lactato) de ( 16):( 4 ):(0,8):(1 ):(1 ,4 ), respectivamente, puede tener por ejemplo, concentraciones de (32):(8):(1 ,6):(2):(2,8) mg de cada elemento respectivamente/mi. (related fructose, glutamic acid, 13-hydroxybutyrate, acetate and lactate). That is, it refers to a mathematical relationship that links the elements of the composition. For example, the xeroprotective composition that has a ratio of (fructose) :( glutamic acid) :( l3hydroxybutyrate) :( acetate) :( lactate) of (16) :( 4) :( 0.8) :( 1) :( 1, 4), respectively, may have, for example, concentrations of (32) :( 8) :( 1, 6) :( 2) :( 2.8) mg of each element respectively / mi.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquiera de las composiciones anteriores como la quot;composición de la presente invenciónquot; o quot;composición de la invenciónquot;. Hereinafter, reference may be made to any of the above compositions as the "composition of the present invention"; or "composition of the invention".

Otro aspecto de la presente invención es el uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico con un contenido en humedad residual igual o inferior al 1 0%. El contenido de humedad residual del material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión quot;material biológico en estado secoquot;. En estas condiciones, el conservante o estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo, y sólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas. De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador. Another aspect of the present invention is the use of the composition of the invention for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 1.0%. The residual moisture content of the biological material may be equal to or less than 9, 8, 7, 6 5, 4, 3, 2 or 1% residual moisture. The preservation of said material can be carried out by stabilizing it. In the present invention, to refer to this type of biological material, the expression "biological material in the dry state" can be used. Under these conditions, the preservative or stabilizer coalesces to reach a non-crystalline, vitreous, and solid state (for example an amorphous crystal). The organic crystal particles that are formed by drying the biological material with the stabilizer are covered by the stabilizer that produces high stability by drastically reducing chemical reactions. In this way the dried biological material is embedded in the amorphous crystal formed by the stabilizer.


El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el
The dry biological material in the presence of the stabilizer that forms the amorphous crystal is resistant to plastics in a liquid state, while the

material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es material that is not dry in the presence of these stabilizers is not

resistente a plásticos en estado líquido. resistant to plastics in liquid state.

El material biológico seco en estas formas puede encontrarse en estado no particulado y puede suministrarse en formas por ejemplo, pero sin limitarse, molduras o sólidos en 3 dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches, hojas, bolas, o pepitas de material biológico seco. The dry biological material in these forms can be in a non-particulate state and can be supplied in forms, for example, but not limited to moldings or solids in 3 dimensions such as, but not limited to, blocks, pads, patches, sheets, balls, or seeds of dry biological material.

El término quot;humedad residualquot; tal como se emplea en la presente invención se refiere a la cantidad de humedad que contiene un producto después de pasado por algún tipo de proceso capaz de eliminar agua del mismo. La humedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del total de la masa. Es decir, un valor de humedad residual de un producto igual a un 10% significa que 1 O g de cada 100 g del producto corresponden a agua. La humedad residual puede ser medida mediante métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico. The term "residual moisture"; As used in the present invention, it refers to the amount of moisture a product contains after it has gone through some type of process capable of removing water from it. Residual humidity is the mass percentage of the product that corresponds to water with respect to the total mass. That is, a residual moisture value of a product equal to 10% means that 1 O g of every 100 g of the product correspond to water. Residual humidity can be measured by methods known in the state of the art such as, but not limited to, by the titrimetric method, the azeotropic method or the gravimetric method.

El término quot;conservación de material biológicoquot; hace referencia al mantenimiento o cuidado de la permanencia de las características intrínsecas del material biológico. The term quot; conservation of biological materialquot; It refers to the maintenance or care of the permanence of the intrinsic characteristics of the biological material.

Una realización preferida se refiere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado A preferred embodiment relates to the use of the composition of the invention for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue.


o una célula. La célula puede ser procariota o eucariota. La célula puede ser una célula de un microorganismo en cualquier estado de desarrollo. La célula puede ser somática o germinal, vegetal o animal. Dicha célula puede proceder de cualquier organismo o microorganismo y puede presentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo, pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El organismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Escherichia coli, Salmonella. typhimurium, Pseudomonas putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. o Bifidobacterium spp. El organismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo.
or a cell The cell can be prokaryotic or eukaryotic. The cell can be a cell of a microorganism in any state of development. The cell can be somatic or germinal, plant or animal. Said cell can come from any organism or microorganism and can occur in any state of differentiation, such as, but not limited to, from a culture of a cellular tissue or organs, sperm, ovules or embryos. The cell can be a totipotent, multipotent or unipotent stem cell. The microorganism can be unicellular or multicellular. The unicellular organism is selected from the list comprising, but not limited to, Escherichia coli, Salmonella. typhimurium, Pseudomonas putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. or Bifidobacterium spp. The multicellular organism can be, for example, but not limited to, a nematode.

La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicación y división celular. Por otra parte la célula puede haber sido tratada, manipulada o mutada antes de su conservación. Por ejemplo, pero sin limitarse, una célula puede haberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las células que se conservan pueden formar una población homogénea o heterogénea, por ejemplo, pero sin limitarse, una librería de células en la que cada una contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente, las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes. The cell conserved by the composition of the present invention is a viable cell that is, it is capable of performing the normal functions of the cell including cell replication and division. On the other hand, the cell may have been treated, manipulated or mutated before preservation. For example, but not limited to, a cell may have become competent for transformations or transfections, or it may contain recombinant nucleic acids. The cells that are conserved can form a homogeneous or heterogeneous population, for example, but not limited to, a library of cells in which each one contains a variation of some nucleic acid. Preferably, the cells are non-anhydrobotic cells (desiccation sensitive cells) such as, but not limited to, cells from non-anhydrobial prokaryotic microorganisms that are generally not sporulant.

La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa The conservation of the microorganism can be improved by culture under conditions that increase the intracellular concentration of trehalose


o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse, en condiciones de alta osmolaridad (alta concentración
or other amorphous crystal forming stabilizers. For example, but not limited, in conditions of high osmolarity (high concentration

de sales) que estimulen la producción intracelular de trehalosa o de otros of salts) that stimulate the intracellular production of trehalose or others

estabilizantes formadores de cristales amorfos. stabilizers forming amorphous crystals.

El organismo invertebrado es pero sin limitarse, una larva de insecto o un crustáceo. Dichos organismos invertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrollan las primeras hojas verdaderas. The invertebrate organism is, but is not limited to, an insect larva or a crustacean. Said invertebrate organisms can be preserved under drying conditions, allowing the vital activity thereof, so that, when rehydrated, said organisms have the ability to move. The seedling is a plant in its early stages of development, from germinating until the first true leaves develop.

La compos1c1on de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo vertebrado perteneciente a la Superclase Tetrapoda (con cuatro extremidades), Clase Amphibia (anfibios) o Clase Reptilia (reptiles), o cualquiera de sus partes (Vernon y Jackson, 1931. The biological bulletin, The composition of the invention can be used for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is a vertebrate organism belonging to the Tetrapoda Superclass (with four limbs), Amphibia Class (amphibians) or Reptilia Class (reptiles), or any of its parts (Vernon and Jackson, 1931. The biological bulletin,

60: 80-93). Vernon y Jackson llevaron a cabo un estudio sobre la rana Leopardo (Rana pipiens), en el que de forma natural se seca su piel, lengua, bazo, e hígado con una pérdida de agua de entre un 43-81% del contenido de agua total. 60: 80-93). Vernon and Jackson carried out a study on the Leopard frog (Rana pipiens), in which their skin, tongue, spleen, and liver naturally dries with a water loss of between 43-81% of the water content total.

Un órgano aislado, o un tejido biológico aislado (incluida la sangre) pueden conservarse mediante la composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de criopreservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540). An isolated organ, or an isolated biological tissue (including blood) can be preserved by the composition of the present invention. In Serrato et al. (2009) results of cryopreservation protocols of biological tissues can be observed (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).


Una realización más preferida se refiere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término quot;molécula con actividad biológicaquot; tal como se entiende en la presente invención se refiere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término quot;derivadosquot; se refiere a moléculas obtenidas por la modificación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término quot;análogosquot; se refiere a moléculas que presentan una función similar a la molécula con actividad biológica.
A more preferred embodiment relates to the use of the composition of the invention, where the biological material is a molecule with biological activity. The term "molecule with biological activity"; as it is understood in the present invention it refers to a biological molecule whose origin is a living organism or that has been alive, or derivatives or analogs of said molecule. The term quot; derivativesquot; It refers to molecules obtained by modifying a molecule with biological activity, which have similar functionality. On the other hand, the term quot; analoguesquot; It refers to molecules that have a function similar to the molecule with biological activity.

Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC (Enzyme Commission numbers) que comprende las hidrolasas de éster carboxílico (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa), EC 3.1.1.2 (Arilesterasa), EC 3.1.1.3 (Triacilglicerol lipasa), EC 3.1.1.4 (Fosfolipasa A(2)), EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa), EC According to another even more preferred embodiment of the composition of the present invention the molecule with biological activity is an enzyme. An even more preferred embodiment of the present invention relates to the use of the composition of the invention, where the enzyme is an enzyme with lipase activity. The enzyme with lipase activity is selected from the list of enzymes with EC numbers (Enzyme Commission numbers) comprising carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxylesterase), EC 3.1.1.2 (Arilesterase), EC 3.1.1.3 (Triacylglycerol lipase), EC 3.1.1.4 (Phospholipase A (2)), EC 3.1.1.5 (Lysophospholipase), EC

3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa), EC 3.1.1.24 (3-oxoadipato enol-lactonasa), EC 3.1.1.25 (1 ,4-lactonasa), EC 3.1.1.26 (Galactolipasa), EC 3.1.1.32 (Fosfolipasa A(1 )), EC 3.1.1.33 (6-acetilglucosa deacetilasa), EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblemente la enzima lipasa tiene actividad Triacilglicerollipasa (EC 3.1.1.3). 3.1.1.23 (Acylglycerol lipase), EC 3.1.1.24 (3-oxoadipate enol-lactonase), EC 3.1.1.25 (1, 4-lactonase), EC 3.1.1.26 (Galactolipase), EC 3.1.1.32 (Phospholipase A (1 )), EC 3.1.1.33 (6-acetylglucose deacetylase), EC 3.1.1.34 (Lipoprotein lipase). Preferably the enzyme lipase has Triacylglycerollipase activity (EC 3.1.1.3).

Otro aspecto de la presente invención se refiere al método para la conservación de material biológico que comprende: Another aspect of the present invention relates to the method for the conservation of biological material comprising:


a) mezclar la composición de la invención con una muestra de material biológico, y b) deshidratar el producto obtenido en el paso (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 1 0%.
a) mixing the composition of the invention with a sample of biological material, and b) dehydrating the product obtained in step (a) to a residual humidity equal to or less than 1.0%.

Una realización preferida se refiere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. A preferred embodiment refers to the method for the conservation of biological material, where the biological material of step (a) is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue or a cell.

Otra realización preferida se refiere al método para la conservación de material biológico, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Another preferred embodiment relates to the method for the conservation of biological material, where the biological material is a molecule with biological activity.

Una realización más preferida de la presente invención se refiere al método, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Según una realización más preferida de la presente invención la enzima es una lipasa. A more preferred embodiment of the present invention relates to the method, where the molecule with biological activity is an enzyme. According to a more preferred embodiment of the present invention the enzyme is a lipase.

Otra realización aún más preferida se refiere a cualquiera de los métodos para la conservación de material biológico, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Another even more preferred embodiment relates to any of the methods for the conservation of biological material, where dehydration of the mixture of the xeroprotective composition and the biological material according to step (b) is carried out by means of a hypertonic solution or through a stream of air.


Cualquier método para la conservación de material biológico de la presente invención permite el empleo de dicho material en procesos de manufacturación en los cuales el material biológico sería demasiado inestable si no estuviera conservado mediante el uso de la composición de la presente invención. La invención incluye extrusiones o moldes en los que se incluye el material conservado por cualquier método de la presente invención. Un método de producción de una moldura que contenga biomaterial activo mediante estabilizadores puede incluir soluciones de materiales plásticos. Por ejemplo una moldura de material plástico con biomaterial activo encapsulado puede ser útil como componentes de biosensores. Por ejemplo un biosensor puede incluir bacterias que sean capaces de detectar sustancias tóxicas, patógenos o toxicidad en general.
Any method for the conservation of biological material of the present invention allows the use of said material in manufacturing processes in which the biological material would be too unstable if it were not conserved through the use of the composition of the present invention. The invention includes extrusions or molds in which the material conserved by any method of the present invention is included. A method of producing a molding containing active biomaterial by stabilizers may include solutions of plastic materials. For example, a molding of plastic material with encapsulated active biomaterial can be useful as components of biosensors. For example, a biosensor can include bacteria that are capable of detecting toxic substances, pathogens or toxicity in general.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word quot; comprehequot; and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF THE FIGURES

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras: With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping to better understand the characteristics of the invention, according to some examples made, the following figures are shown here, for illustrative and non-limiting purposes :

FIG. 1. Muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v). FIG. 1. Shows the lipase activity (in percentage relative to 100% positive control activity) after drying of the lipase enzyme in the presence of the different components of 10% bacterial milking products (w / v).


El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo (-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J2A2 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 4J2A2 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J2A2D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA (Producto de Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubación al Aire) extraídos de la cepa 4J2A2 mediante tratamiento de secado y posterior hidratación, que comprende los mismos componentes que la composición sintética objeto de esta invención.
The positive control is trehalose at 10%. The negative control (-) corresponds to the absence of any compound as an additive prior to the drying of the enzyme. 4J2A2 is the value of lipase activity recorded after drying stabilization and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POB extracted from strain 4J2A2 by hyper / hypoosmotic shock respectively. 4J2A2D is the lipase activity recorded after stabilization by drying and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POBSIA (Bacterial Milking Product extracted by Drying by Air Incubation) extracted from strain 4J2A2 by drying and subsequent hydration treatment, comprising the same components as the synthetic composition object of this invention.

FIG. 2. Muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos compuestos químicos (fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato y lactato al 1 0%). FIG. 2. Shows the lipase activity (in percentage relative to 100% positive control activity) after drying of the lipase enzyme in the presence of the different chemical compounds (fructose, glutamic acid, beta-hydroxybutyrate, acetate and 1% lactate ).

El control positivo (C+) es trehalosa al 10%. El control negativo (C-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J2A2D sintético es la mezcla de fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato y lactato al 10% en la misma proporción encontrada en el POBSIA de la cepa 4J2A2 mediante tratamiento de secado y posterior hidratación siendo la proporción de 16:4:0,8:1:1,4 respectivamente. The positive control (C +) is trehalose at 10%. The negative control (C-) corresponds to the absence of any compound as an additive prior to the drying of the enzyme. Synthetic 4J2A2D is the mixture of fructose, glutamic acid, beta-hydroxybutyrate, acetate and 10% lactate in the same proportion found in the POBSIA of strain 4J2A2 by drying treatment and subsequent hydration being the ratio of 16: 4: 0, 8: 1: 1.4 respectively.

FIG. 3. Muestra la evolución de la supervivencia de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo de los productos de ordeñado bacteriano (POB), de los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs), así como de la composición sintética objeto de la invención. FIG. 3. It shows the evolution of the survival of Escherichia coli MC4100 against desiccation through the use of bacterial milking products (POB), those extracted by Air Drying (POBSIAs), as well as the synthetic composition object of the invention.


4J2A2 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de mezclas de solutos en base a la composición de los POB extraídos de la cepa 4J2A2 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 4J2A2D es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de mezclas de solutos en base a
4J2A2 is the value of lipase activity recorded after drying stabilization and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of solute mixtures based on the composition of the POB extracted from strain 4J2A2 by hyper / hypoosmotic shock respectively. 4J2A2D is the lipase activity recorded after drying stabilization and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of solute mixtures based on

la composición de los POBSIA, que comprende los mismos componentes the composition of the POBSIA, which comprises the same components

que la composición sintética objeto de esta invención PVP indica que además se ha adicionado 1 ,5% de polivinilpirrolidona (PVP). that the synthetic composition object of this invention PVP indicates that 1.5% polyvinylpyrrolidone (PVP) has also been added.

5 SIN es sintético. T es trehalosa. 5 SIN is synthetic. T is trehal.

EJEMPLO EXAMPLE

10 A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen la capacidad xeroprotección de la composición sintética objeto de la invención. The invention will now be illustrated by means of illustrative and non-limiting tests carried out by the inventors describing the xeroprotection capacity of the synthetic composition object of the invention.

15 En la tabla 1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J2A2 tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico (4J2A2), o tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J2A2D), según se describe en la patente P200931117. 15 Table 1 shows the compositions of the bacterial milking products of strain 4J2A2 after extraction by hyper / hypoosmotic shock (4J2A2), or after extraction by drying by air incubation (4J2A2D), as described in P200931117.

20 Tabla 1. Composición del los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J2A2 tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico (4J2A2), o tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J2A2D). 20 Table 1. Composition of the bacterial milking products of strain 4J2A2 after extraction by hyper / hypoosmotic shock (4J2A2), or after extraction by drying by air incubation (4J2A2D).

4J2A2 4J2A2
4J2A2D 4J2A2D

Fructosa Fructose
41,3 Fructosa 16,59 41.3  Fructose 16.59

Acetato Acetate
1 Acetato 1 one  Acetate one

Ac. glutámico Ac. glutamic
2,38 Ac. glutámico 4,25 2.38  Ac. glutamic 4.25

8-hidroxibutirato 8-hydroxybutyrate
0,84 0.84

Lactato 1,41 Lactate 1.41

En la FIG. 2 se muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 1 00% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos compuestos químicos de la composición 4J2A2D sintética (fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato y lactato al 10%). El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo se corresponde con la ausencia de compuestos como aditivo previo a la desecación de la enzima. 4J2A2D sintético es la mezcla de fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato y lactato al 10% en la misma proporción encontrada en el POBSIA de la cepa 4J2A2 mediante tratamiento de secado por incubación al aire y posterior hidratación siendo la proporción de fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato y lactato, de 16:4:0,8:1:1,4 respectivamente. In FIG. 2 shows lipase activity (in percentage relative to 1 00% positive control activity) after drying of the lipase enzyme in the presence of the various chemical compounds of the synthetic 4J2A2D composition (fructose, glutamic acid, beta-hydroxybutyrate, acetate and 10% lactate). The positive control is trehalose at 10%. The negative control corresponds to the absence of compounds as an additive prior to the drying of the enzyme. Synthetic 4J2A2D is the mixture of fructose, glutamic acid, beta-hydroxybutyrate, acetate and 10% lactate in the same proportion found in the POBSIA of strain 4J2A2 by air-drying treatment and subsequent hydration being the proportion of fructose, glutamic acid, beta-hydroxybutyrate, acetate and lactate, 16: 4: 0.8: 1: 1.4 respectively.

Tal como puede observarse en dicha FIG. 2, la combinación de los compuestos fructosa, ácido glutámico, beta-hidroxibutirato, acetato y lactato (en igual proporción que la mostrada en la tabla 1 (4J2A2D) presenta un efecto sinérgico en la conservación de la actividad lipasa ya que la suma de la actividad lipasa mostrada por composiciones que contienen los compuestos de forma aislada es menor que el resultado obtenido con dicha mezcla. As can be seen in said FIG. 2, the combination of the compounds fructose, glutamic acid, beta-hydroxybutyrate, acetate and lactate (in the same proportion as shown in Table 1 (4J2A2D) has a synergistic effect on the conservation of lipase activity since the sum of the Lipase activity shown by compositions containing the compounds in isolation is less than the result obtained with said mixture.

Ejemplo 1. Ensayo de xeroprotección de enzimas. Example 1. Enzyme xeroprotection assay.


El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frente a la desecación. Para ello se utilizó la enzima lipasa. Partiendo de 1 IJI que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (SigmaAidrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 IJI de la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 IJI de una solución al 10% de trehalosa a 1 IJI (0,00554 U) de solución de lipasa y como control negativo se añadió 15 IJI de agua a 1 !JI (0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 !JI con lipasa se depositaron en un microtubo de 2ml de capacidad y se secaron a 50°C durante 120 minutos. Una vez secas se incubaron a 1 00°C durante 5 minutos. Finalmente fueron almacenadas en un desecador a temperatura ambiente durante 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, las reacciones se resuspendieron en 50 !JI de una solución de TrisHCI (50 mM) y se transfirieron a un microtubo junto con 950 !JI de Tris HCI (50 mM) pH8 y 1 mi de Solución de Sustrato. La determinación de la capacidad xeroprotectora de cada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa.
The objective of this test was to determine the ability of the bacterial milking product fraction to protect enzymes from drying out. For this, the enzyme lipase was used. Starting with 1 IJI containing 0.00554 units of Burkholderia cepacia lipase (SigmaAidrich 62309-100 mg), 15 IJI of the product fraction of the bacterial milking to study were added. As a positive control, 15 IJI of a 10% solution of trehalose was added to 1 IJI (0.00554 U) of lipase solution and as a negative control 15 IJI of water was added to 1! JI (0.00554 U) of solution of lipase Mixtures of 16! JI with lipase were deposited in a 2 ml capacity microtube and dried at 50 ° C for 120 minutes. Once dried, they were incubated at 1 ° C for 5 minutes. They were finally stored in a desiccator at room temperature for 24 hours. After the incubation time, the reactions were resuspended in 50 µJ of a TrisHCI solution (50 mM) and transferred to a microtube together with 950 µJ Tris HCI (50 mM) pH8 and 1 mL of Substrate Solution. The xeroprotective capacity determination of each bacterial milking product fraction (POB) was determined by the lipase activity measurement test.

Para la medida de la actividad lipasa se utilizó una variación del método descrito por Gupta y colaboradores (2002) consistente en la cuantificación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aidrich 62309-100 mg) a partir del sustrato pnitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, For the measurement of lipase activity, a variation of the method described by Gupta et al. (2002) consisting of the spectrophotometric quantification of p-nitrophenol released by the enzyme lipase from Burkholderia cepacia (Sigma-Aidrich 62309-100 mg) from the pnitrophenol palmitate substrate (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry,

311: 98-99). Para ello se utilizó 1 mi de medio libre de células (985 !JI de Tris-HCI 0,05M junto a 15 !JI de POB obtenido por el método del quot;ordeñado bacterianoquot;) mezclado con 1 mi de solución sustrato de un cultivo en fase estacionaria. Esta mezcla de ensayo se incubó a 30°C durante 30 minutos en microtubos estériles de 2 mi. La reacción se paró mediante incubación a 1 00°C durante 4 minutos en termobloque y 2 minutos a -20°C. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro Hitachi U-2000 a una longitud de onda de 41 O nm. La solución sustrato (SS) se preparó mezclando 1 O mi de solución A (30 mg de pNPP en 1 O mi de isopropanol) con 90 mi de solución B (0,1g de goma arábiga y 0,4 mi de Tritón X-100 en 90 mi tampón Tris-HCI 50mM pH8). La mezcla de solución A y B se agitó suavemente hasta su total disolución. La FIG. 2 muestra los valores de tolerancia de las cepas aisladas. 311: 98-99). For this, 1 ml of cell-free medium was used (985! JI of Tris-HCI 0.05M together with 15! JI of POB obtained by the method of "milked bacterial";) mixed with 1 ml of substrate solution of a culture in stationary phase. This test mixture was incubated at 30 ° C for 30 minutes in sterile 2 ml microtubes. The reaction was stopped by incubation at 1 00 ° C for 4 minutes in thermoblock and 2 minutes at -20 ° C. The absorbance was measured on a Hitachi U-2000 spectrophotometer at a wavelength of 41 O nm. The substrate solution (SS) was prepared by mixing 1 O ml of solution A (30 mg of pNPP in 1 O mi of isopropanol) with 90 ml of solution B (0.1 g of gum arabic and 0.4 ml of Triton X-100 in 90 my 50mM Tris-HCI buffer pH8). The mixture of solution A and B was gently stirred until completely dissolved. FIG. 2 shows the tolerance values of the isolated strains.


Ensayo de xeroprotección de microorganismos.
Xeroprotection test of microorganisms.

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad para proteger células vivas de Escherichia coli MC4100 frente a desecación mediante el empleo de mezclas sintéticas de productos químicos basados en los análisis procedentes del producto de ordeñado bacteriano (POB) así como de los extraídos por Secado mediante Incubación al Aire (POBSIAs) de diversas cepas xerotolerantes de forma análoga a la descrita por Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). Para ello se utilizó un preinóculo de E. coli, a partir del cual se inoculó medio mínimo más glucosa como fuente de carbono adicionados de 0,6 M de NaCI hasta alcanzar una densidad óptica inicial de 0,05. Tras 12 horas de incubación a 37°C en agitación, se centrifugaron alícuotas de 1 mi del cultivo crecido. Las células de E. coli se resuspendieron en una solución al 10% de los POBs o POBSIAs extraídos de las células xerotolerantes (extraídos según se describe anteriormente) y además, 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP). Igualmente se realizó la misma experiencia mediante la combinación y mezcla de sustratos comerciales identificados en POBs y POBSIAs en iguales proporciones, a los que se llamaron POB sintético o POBSIA sintético en contraposición al directamente extraído de células que llamamos natural. En el caso de los POB/POBSIA sintéticos la mezcla se realizó en una solución al 34,2%. La suspensión de células en las distintas soluciones se sometieron a condiciones de desecación por vacío sin congelación, en un congelador-desecador modificado (Dura -Stop !l P; FTS Systems, Stone Ridge, NY) a 30°C de temperatura media y 100 mTorr (2Pa; 2x1 o-5 atmósferas) durante 20 segundos, con una rampa de temperatura de 2,5°C/min con 15 minutos de pausa después de cada incremento de 2°C, hasta llegar a la temperatura máxima de 40°C. The objective of this test was to determine the ability to protect live cells of Escherichia coli MC4100 against desiccation through the use of synthetic mixtures of chemical products based on analyzes from the bacterial milking product (POB) as well as those extracted by Drying by Air incubation (POBSIAs) of various xerotolerant strains analogously to that described by Manzanera et al., (2002) (Manzanera et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4328-33). For this, a pre-circle of E. coli was used, from which a minimum medium plus glucose was inoculated as an added carbon source of 0.6 M NaCl until an initial optical density of 0.05 was reached. After 12 hours of incubation at 37 ° C while stirring, 1 ml aliquots of the grown culture were centrifuged. E. coli cells were resuspended in a 10% solution of the POBs or POBSIAs extracted from the xerotolerant cells (extracted as described above) and in addition, 1.5% polyvinylpyrrolidone (PVP). The same experience was also carried out by combining and mixing commercial substrates identified in POBs and POBSIAs in equal proportions, which were called synthetic POB or synthetic POBSIA as opposed to directly extracted from cells we call natural. In the case of synthetic POB / POBSIA, the mixing was performed in a 34.2% solution. The cell suspension in the different solutions was subjected to vacuum drying conditions without freezing, in a modified freezer-desiccator (Dura -Stop! L P; FTS Systems, Stone Ridge, NY) at 30 ° C medium temperature and 100 mTorr (2Pa; 2x1 or -5 atmospheres) for 20 seconds, with a temperature ramp of 2.5 ° C / min with 15 minutes of pause after each increase of 2 ° C, until reaching the maximum temperature of 40 ° C.


Las muestras se sellaron al vacío y se almacenaron a 30°C hasta su ensayo de viabilidad a tiempo 1, 15 y 30 días. Pasado este tiempo las muestras se resuspendieron en 1mi de LB y se realizaron ensayos de viabilidad mediante siembra en placa de LB sólido que se incubaron 24 horas a 37°C, para el conteo de UFC y comparación con las UFC antes del secado, para de esta forma poder calcular la supervivencia de las
The samples were sealed under vacuum and stored at 30 ° C until their viability test was carried out at time 1, 15 and 30 days. After this time the samples were resuspended in 1mi of LB and viability tests were carried out by planting in solid LB plate that were incubated 24 hours at 37 ° C, for CFU counting and comparison with CFUs before drying, for this way to calculate the survival of

5 muestras. 5 samples

En la FIG. 3 se observa cómo las composiciones sintéticas POBs y POBSIAs de la cepa 4J2A2 produjeron un aumento de la supervivencia de los microorganismos respecto de la supervivencia experimentada por In FIG. 3 it is observed how the synthetic compositions POBs and POBSIAs of strain 4J2A2 produced an increase in the survival of the microorganisms with respect to the survival experienced by

10 dichos microorganismos mediante una solución de trehalosa, cuando las soluciones estaban al 34,2 % de dichos compuestos xeroprotectores y durante el primer día de conservación así como a las dos semanas. Se observa que la aportación del PVP 1 ,5% a la supervivencia es nula. 10 said microorganisms by means of a trehalose solution, when the solutions were at 34.2% of said xeroprotective compounds and during the first day of conservation as well as at two weeks. It is observed that the contribution of PVP 1.5% to survival is nil.


15
fifteen

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. one.
Composición xeroprotectora sintética que comprende fructosa, ácido glutámico, ~-hidroxibutirato, acetato y lactato. Synthetic xeroprotective composition comprising fructose, glutamic acid, ~ -hydroxybutyrate, acetate and lactate.
2. 2.
Composición según reivindicación 1, que comprende una proporción de fructosa: ácido glutámico: acetato, de entre (35 y 45): (1 ,4 y 3,4): (0,5 y 1 ,5) respectivamente. Composition according to claim 1, comprising a proportion of fructose: glutamic acid: acetate, between (35 and 45): (1, 4 and 3.4): (0.5 and 1, 5) respectively.
3. 3.
Composición según la reivindicación 2, donde la proporción de fructosa :ácido glutámico : acetato es de entre (38 y 44): (2 y 3): (0,7 y 1 ,3), respectivamente. Composition according to claim 2, wherein the proportion of fructose: glutamic acid: acetate is between (38 and 44): (2 and 3): (0.7 and 1, 3), respectively.
4. Four.
Composición según reivindicación 1, que comprende una proporción de fructosa : ácido glutámico : ~-hidroxibutirato : acetato : lactato, de entre (14 y 18) : (3 y 5) : (0,6 y 1) : (0,5 y 1 ,5) : (1 y 2), respectivamente. Composition according to claim 1, comprising a proportion of fructose: glutamic acid: ~ -hydroxybutyrate: acetate: lactate, between (14 and 18): (3 and 5): (0.6 and 1): (0.5 and 1, 5): (1 and 2), respectively.
5. 5.
Composición según la reivindicación 4, donde la proporción de fructosa: ácido glutámico: ~-hidroxibutirato: acetato: lactato es de entre (15 y 17): (3,5 y 4,5): (0,7 y 0,9): (0,7 y 1,2): (1,2 y 1,6), respectivamente. Composition according to claim 4, wherein the proportion of fructose: glutamic acid: ~ -hydroxybutyrate: acetate: lactate is between (15 and 17): (3.5 and 4.5): (0.7 and 0.9) : (0.7 and 1.2): (1.2 and 1.6), respectively.
6. 6.
Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%. Use of the composition according to any one of claims 1 to 5 for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%.
7. 7.
Uso de la composición según la reivindicación 6, donde el material biológico es un microorganismo o una célula. Use of the composition according to claim 6, wherein the biological material is a microorganism or a cell.
8. 8.
Uso de la composición según la reivindicación 6, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado. Use of the composition according to claim 6, wherein the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, an isolated organ or an isolated biological tissue.
9. 9.
Uso de la composición según la reivindicación 6, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Use of the composition according to claim 6, wherein the biological material is a molecule with biological activity.
1O. Uso de la composición según la reivindicación 9, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. 1O. Use of the composition according to claim 9, wherein the molecule with biological activity is an enzyme.
11. eleven.
Uso de la composición según la reivindicación 1 O, donde la enzima es una lipasa. Use of the composition according to claim 1 O, wherein the enzyme is a lipase.
12. 12.
Método para la conservación de material biológico que comprende: Method for the conservation of biological material comprising:
a) mezclar la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con una muestra de material biológico, y5 a) mixing the xeroprotective composition according to any one of claims 1 to 5 with a sample of biological material, and 5 b) deshidratar el producto obtenido en el apartado (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%. b) dehydrate the product obtained in section (a) to a residual humidity equal to or less than 10%.
13. 13.
Método según la reivindicación 12, donde el material biológico es un microorganismo o una célula. Method according to claim 12, wherein the biological material is a microorganism or a cell.
14. 14.
Método según la reivindicación 12, donde el material biológico del paso Method according to claim 12, wherein the biological material of the passage
(a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado. (a) it is an invertebrate organism, a seed, a seedling, an isolated organ or an isolated biological tissue.
15. fifteen.
Método según la reivindicación 12, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Method according to claim 12, wherein the biological material is a molecule with biological activity.
16. 16.
Método según la reivindicación 15, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Method according to claim 15, wherein the molecule with biological activity is an enzyme.
17. 17.
Método según la reivindicación 16, donde la enzima es una lipasa. Method according to claim 16, wherein the enzyme is a lipase.
18. 18.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Method according to any of claims 12 to 17, wherein the dehydration of the mixture of the xeroprotective composition and the biological material according to step (b) is carried out by means of a hypertonic solution or by means of an air current.
--
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