ES2361316B1

ES2361316B1 - Bacterial strain CECT7626, uses and xeroprotector product produced by it.

Info

Publication number: ES2361316B1
Application number: ES200931118A
Authority: ES
Inventors: Maximino Manzanera Ruiz; Jesús Juan Gonz�?Lez López; Juan Jesús Narv�?Ez Reinaldo; Lucia Santa Cruz Calvo; Juan Ignacio Vilchez Morillas
Original assignee: Universidad de Granada
Current assignee: Universidad de Granada
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2012-04-20
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: WO2011067442A2; ES2361316A1; WO2011067442A3

Abstract

Cepa bacteriana CECT7626, usos y producto xeroprotector producido por la misma.#Microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7626. La presente invención también se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para aumentar el crecimiento de una planta en condiciones óptimas de contenido hídrico de dicha planta. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende glucosa, acetato, lactato y valina. Y, la presente invención también se refiere al método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para producir la composición xeroproctectora de la presente invención.Bacterial strain CECT7626, uses and xeroprotective product produced by it. # Microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7626. The present invention also relates to the use of said microorganism or a population thereof to increase the tolerance to water stress of a plant or to increase the growth of a plant under optimal conditions of water content of said plant. Furthermore, the present invention relates to the use of said microorganism or a population thereof for the production of an xeroprotective composition, wherein said composition comprises glucose, acetate, lactate and valine. And, the present invention also relates to the method for increasing the water stress tolerance of a plant or for producing the xeroproctector composition of the present invention.

Description

Cepa bacteriana CECT7626, usos y producto xeroprotector producido por la misma. Bacterial strain CECT7626, uses and xeroprotector product produced by it.

La presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7626. Asimismo la presente invención se reﬁere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para aumentar el crecimiento de una planta en condiciones óptimas de contenido hídrico de dicha planta. Además, la presente invención se reﬁere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende glucosa, acetato, lactato y valina. La presente invención también se reﬁere al método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para producir la composición xeroproctectora de la presente invención. The present invention relates to a microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7626. Likewise, the present invention refers to the use of said microorganism or a population thereof to increase the tolerance to water stress of a plant or to increase the growth of a plant under optimum conditions of water content of said plant. Furthermore, the present invention relates to the use of said microorganism or a population thereof for the production of an xeroprotective composition, wherein said composition comprises glucose, acetate, lactate and valine. The present invention also refers to the method for increasing the tolerance to water stress of a plant or for producing the xeroproctector composition of the present invention.

Estado de la técnica anterior Prior art

La búsqueda de mejores fenotipos y genotipos de plantas de cultivo para aumentar la producción, mejoras nutricionales, calidad en el fruto y planta, es de gran interés para la comunidad cientíﬁca. La selección de fenotipos ha mostrado buenos resultados en la obtención de mejores variedades, sin embargo, el papel de la biotecnología tiene especial importancia ya que la utilización de microorganismos a las raíces de las plantas ha propiciado que se logren grandes avances en la comprensión del efecto de los microorganismos de la rizosfera en la regulación metabólica y genética del las plantas como por ejemplo, la utilización de Agrobacterium para la obtención de plantas transgénicas, The search for better phenotypes and genotypes of crop plants to increase production, nutritional improvements, quality in the fruit and plant, is of great interest to the scientific community. The selection of phenotypes has shown good results in obtaining better varieties, however, the role of biotechnology is especially important since the use of microorganisms to plant roots has led to great progress in understanding the effect of rhizosphere microorganisms in the metabolic and genetic regulation of plants such as the use of Agrobacterium for obtaining transgenic plants,

o el empleo de bacterias ﬁjadoras de nitrógeno asociadas a las plantas leguminosas. or the use of nitrogen fixing bacteria associated with leguminous plants.

En las plantas de cultivo, la rizosfera constituye una de las principales fuentes de materia orgánica en los suelos. Dicha rizosfera estimula la actividad microbiana. En la rizosfera se dan complejas interacciones entre los microorganismos y las raíces de las plantas. El potencial hídrico de la rizosfera es un aspecto clave que determina la biodisponibilidad de agua, oxígeno y sustratos de plantas y microorganismos. Los exudados de determinados microorganismos pueden proteger a bacterias del estrés hídrico. En la agricultura mediterránea, el estrés hídrico es uno de los principales factores que limitan la producción de los cultivos. In crop plants, the rhizosphere is one of the main sources of organic matter in soils. This rhizosphere stimulates microbial activity. Complex interactions between microorganisms and plant roots occur in the rhizosphere. The water potential of the rhizosphere is a key aspect that determines the bioavailability of water, oxygen and substrates of plants and microorganisms. Exudates of certain microorganisms can protect bacteria from water stress. In Mediterranean agriculture, water stress is one of the main factors that limit crop production.

Es conocido que los hongos micorrízicos colonizan las raíces de la mayoría de las plantas. Estos hongos son simbiontes obligados y reciben compuestos carbonados en forma de energía de las plantas hospedantes; durante esta asociación les transﬁeren nutrientes, generalmente fósforo y cinc (Ryan y Angus, 2003. Plant and Soil, 250(2): 225-239). Los hongos micorrízicos aumentan signiﬁcativamente la superﬁcie de absorción del sistema radical de las plantas, mejorando la habilidad de las mismas para absorber agua y nutrientes, mantener la estructura del suelo e incrementar la resistencia a estreses y enfermedades. Hay evidencias que indican la inﬂuencia de estos hongos en las relaciones hídricas de las plantas hospedantes y el incremento a la resistencia a sequía de las mismas. Se ha sugerido que los hongos podrían tener efectos positivos sobre las plantas hospedantes en condiciones de campo durante períodos de estrés para las mismas como es el estrés hídrico (Allen y Allen, 1986. New Phytologist, 104: 559-71; Fitter, 1986. New Phytologist, 103: 767-776). It is known that mycorrhizal fungi colonize the roots of most plants. These fungi are obligate symbionts and receive carbon compounds in the form of energy from host plants; during this association they transfer nutrients, usually phosphorus and zinc (Ryan and Angus, 2003. Plant and Soil, 250 (2): 225-239). Mycorrhizal fungi significantly increase the absorption surface of the radical system of plants, improving their ability to absorb water and nutrients, maintain soil structure and increase resistance to stresses and diseases. There is evidence that indicates the influence of these fungi on the water relations of the host plants and the increase in drought resistance of them. It has been suggested that fungi could have positive effects on host plants in field conditions during periods of stress for them such as water stress (Allen and Allen, 1986. New Phytologist, 104: 559-71; Fitter, 1986. New Phytologist, 103: 767-776).

Está demostrado que algunas cepas bacterianas no patógenas son capaces de estimular el metabolismo defensivo de la planta de tal forma que cuando existe el ataque de un patógeno, las plantas se encuentran protegidas y pueden sobrevivir con una mortalidad mucho menor que si no estuvieran tratadas con la bacteria. En algunos casos, el efecto es muy especíﬁco, y solo es efectivo frente a determinados patógenos, mientras que en otros, el efecto es mucho más amplio, siendo incluso efectivo frente a factores abióticos como puede ser el estrés salino o hídrico. It is shown that some non-pathogenic bacterial strains are capable of stimulating the defensive metabolism of the plant so that when there is a pathogen attack, the plants are protected and can survive with a much lower mortality than if they were not treated with the bacterium. In some cases, the effect is very specific, and it is only effective against certain pathogens, while in others, the effect is much broader, even being effective against abiotic factors such as saline or water stress.

En este sentido, la aplicación de bacterias en ciertos cultivos resulta una alternativa biotecnológica respetuosa con el medioambiente ya que la bacteria produciría un doble efecto beneﬁcioso, por una parte, estimula las defensas de planta frente a un patógeno, disminuyendo por tanto el uso de sustancias químicas, y por otra, permite obtener mejores rendimientos bajo determinadas condiciones de estrés. Sin embargo, la selección de dicho microorganismo es un aspecto complejo que requiere el ensayo y caracterización de numerosas especies y cepas para lograr obtener un microorganismo capaz de producir beneﬁcios de importancia a las plantas. In this sense, the application of bacteria in certain crops is a biotechnological alternative that respects the environment since the bacteria would produce a double beneficial effect, on the one hand, it stimulates plant defenses against a pathogen, thus reducing the use of substances chemical, and on the other, it allows to obtain better yields under certain stress conditions. However, the selection of said microorganism is a complex aspect that requires the testing and characterization of numerous species and strains to obtain a microorganism capable of producing significant benefits to plants.

Por otra parte, la conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida. Sin embargo, los métodos actuales de conservación requieren de gran costo en energía y generalmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación, el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la lioﬁlización producen reducciones signiﬁcativas en la actividad/viabilidad del material conservado. On the other hand, the conservation of biological materials by dehydration and osmoconcentration is a known technology. However, current conservation methods require high energy costs and generally need storage at low temperatures. Sometimes, after its conservation, the biological material has an activity and / or viability that does not reach satisfactory levels. Conservation methods, such as drying at room temperature, liquid formulations, freezing with cryoprotectants, or lyophilization produce significant reductions in the activity / viability of the conserved material.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la lioﬁlización conﬁere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto ﬁnal, y se requiere aún refrigeración para reducir el deterioro durante el almacenamiento. The processes currently used are slow and involve high energy consumption. In addition, lyophilization confers only a modest level of thermotolerance in the final product, and cooling is still required to reduce deterioration during storage.

Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de plantas y animales adquirieron la notable capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, la levadura Saccharomyces cerevisiae During evolutionary natural selection, certain species of plants and animals acquired the remarkable ability to tolerate extreme dehydration, remaining dormant in hostile environments for very long periods of time and still capable of acquiring a complete vital activity once hydrated again. Examples include the "resurrection plant" Selaginella lepidophyla, Artemia salina sea shrimp, Saccharomyces cerevisiae yeast

o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa (α-D-glucopiranosil-αD-glucopiranósido). or the tardigrade Macrobiotus hufelandi. These organisms are called cryptiobiotics and the procedure by which they survive is known as anhydrobiosis. All species of animals and plants that have this capacity contain protective molecules that form amorphous crystals, such as trehalose disaccharide (α-D-glucopyranosyl-αD-glucopyranoside).

La formación y uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS (α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol) y GPM (α-D-glucopiranosil-1-6-manitol)] y sus componentes individuales GPS y GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados pueden ser neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, raﬁnosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina. The formation and use of amorphous crystals is well documented (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Some of the preservatives that form these crystals are suitable for this type of preservation and include non-reducing carbohydrates such as trehalose, hydroxyectoin, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [GPS mixture (α-D-glucopyranosyl-1-6-sorbitol) and GPM (α-D-glucopyranosyl-1-6-mannitol)] and its individual GPS and GPM components. The non-reducing glycosides of polyhydroxy compounds can be neotrehalose, laconeotrehalose, galactosyl trehalose, sucrose, lactose sucrose, raffinose, etc. Other amorphous crystal-forming preservatives include amino acids such as hydroxyectoin.

La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suﬁcientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa. The presence of water in the dry state is generally less than 0.2 g / g dry cell weight in most cryptobionts. These water levels are sufficient for these invertebrate organisms or microorganisms to resist extreme dehydration, high temperatures, ionizing radiation or also, in some species of tardigrades, pressures of up to 600 MPa.

Es conocido que las biopelículas (subaerial bioﬁlms), formadas por bacterias del género Rhodococcus sp entre otras, son capaces de producir compuestos osmoprotectores, es decir, sustancias extracelulares poliméricas (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9(7): 1613-1631). Asimismo, Ortega-Morales et al. (2007) (Ortega-Morales et al. 2007. Journal of Applied Microbiology, 102: 254-264), describen bacterias de las biopelículas de las zonas intermareales tropicales, donde se han aislado bacterias que pertenecen al género Microbacterium sp. como fuente de nuevos exopolímeros protectores de las células contra la desecación. Por otra parte, LeBlanc (2008) (LeBlanc, 2008. Applied and environmental microbiology, 74(9): 2627-2636), se reﬁere al microorganismo Rhodococcus jostii RHA1, un actinomiceto con capacidades metabólicas favorables para la biorremediación de suelos contaminados, capaz de secretar los osmoprotectores ectoina y trehalosa. It is known that biofilms (subaerial bio ﬁ lms), formed by bacteria of the genus Rhodococcus sp among others, are capable of producing osmoprotective compounds, that is, polymeric extracellular substances (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9 (7): 1613 -1631). Likewise, Ortega-Morales et al. (2007) (Ortega-Morales et al. 2007. Journal of Applied Microbiology, 102: 254-264), describe bacteria from biofilms in tropical intertidal zones, where bacteria belonging to the genus Microbacterium sp. as a source of new protective exopolymers of cells against desiccation. On the other hand, LeBlanc (2008) (LeBlanc, 2008. Applied and environmental microbiology, 74 (9): 2627-2636), refers to the microorganism Rhodococcus jostii RHA1, an actinomycete with favorable metabolic capacities for bioremediation of contaminated soils, capable of secreting the ectoin and trehalose osmoprotectors.

Explicación de la invención Explanation of the invention.

La capacidad para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta es de importancia en el sector agrícola para la obtención de frutos en condiciones de bajo contenido de agua en los suelos o en otras condiciones que limiten la capacidad de absorción de agua de dichas plantas. En la presente invención se ofrecen herramientas para prevenir The ability to increase the tolerance to water stress of a plant is of importance in the agricultural sector to obtain fruits in conditions of low water content in soils or in other conditions that limit the water absorption capacity of these plants. In the present invention tools are provided to prevent

o combatir los efectos negativos que padecen las plantas sometidas a condiciones de estrés hídrico. Además, en la presente invención se ofrece tanto el contenido como la proporción de varias composiciones xeroprotectoras obtenidas de cultivos de la cepa CECT7626. or combat the negative effects suffered by plants under conditions of water stress. In addition, both the content and the proportion of various xeroprotective compositions obtained from cultures of strain CECT7626 are offered in the present invention.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se reﬁere a un microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7626. Dicho microorganismo es tolerante a la desecación. Dicha cepa ha sido depositada en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 10 de noviembre de 2009 y le correspondió el nº de depósito CECT7626. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia/Ediﬁcio de investigación/Campus de Burjassot/46100 Burjassot (Valencia). Therefore, one aspect of the present invention refers to a microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7626. Said microorganism is tolerant to desiccation. This strain has been deposited in the Spanish collection of type crops (CECT) on November 10, 2009 and corresponded with deposit number CECT7626. The address of said International Deposit Authority is: University of Valencia / Research building / Campus of Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia).

La clasiﬁcación cientíﬁca de la cepa CECT7626 de la presente invención es: Reino: Bacteria / Filo: Actinobacteria / Orden: Actinomycetales / Familia: Micrococcineae / Género: Arthrobacter. The scientific classification of strain CECT7626 of the present invention is: Kingdom: Bacteria / Phylum: Actinobacteria / Order: Actinomycetales / Family: Micrococcineae / Genus: Arthrobacter.

Las características de dicha cepa son: The characteristics of said strain are:

--: Los sustratos que la bacteria CECT7626 oxida o fermenta son: Tween 40, tween 80, D-arabitol, D-celobiosa, Dfructosa, D-galactosa, gentiobiosa, α-D-glucosa, α-D-lactosa, lactulosa, maltosa, maltotriosa, D-manitol, D-manosa, 3-metil glucosa, D-psicosa, D-ribosa, salicina, D-sorbitol, estaquiosa, sacarosa, D-trehalosa, turanosa, xilitol, D-xilosa, ácido acético, ácido α-hidroxibutírico, ácido acético p-hidroxifenil, α-cetoglutárico, lactamida, ácido L-láctico, ácido pirúvico, glicerol, adenosina, 2’-deoxiadenosina, inosina, timidina, uridina, timidina-5’-monofosfato, D-L-α-glicerol fosfato. The substrates that the CECT7626 bacteria oxidize or ferment are: Tween 40, tween 80, D-arabitol, D-cellobiose, Dfructose, D-galactose, gentiobiosa, α-D-glucose, α-D-lactose, lactulose, maltose, maltotriose , D-mannitol, D-mannose, 3-methyl glucose, D-psychosa, D-ribose, salicin, D-sorbitol, stachyose, sucrose, D-trehalose, turanosa, xylitol, D-xylose, acetic acid, α- acid hydroxybutyric acid, p-hydroxyphenyl acetic acid, α-ketoglutaric acid, lactamide, L-lactic acid, pyruvic acid, glycerol, adenosine, 2'-deoxyadenosine, inosine, thymidine, uridine, thymidine-5'-monophosphate, DL-α-glycerol phosphate .

--: La temperatura máxima tolerada para el crecimiento de esta cepa está entre 40ºC y 45ºC. La temperatura mínima para detectar crecimiento se encontró entre 10ºC y 15ºC, mientras que su temperatura óptima de crecimiento fue de entorno a 40ºC. Fue incapaz de crecer a pH por encima de 13 aunque si a pH 12. Igualmente fue incapaz de proliferar a pH por debajo de 5 aunque si creció a pH 7. La máxima velocidad de crecimiento se alcanzó a pH 12. The maximum temperature tolerated for the growth of this strain is between 40ºC and 45ºC. The minimum temperature to detect growth was between 10ºC and 15ºC, while its optimum growth temperature was around 40ºC. It was unable to grow at pH above 13 although at pH 12. It was also unable to proliferate at pH below 5 although it grew at pH 7. The maximum growth rate was reached at pH 12.

--: Igualmente fue incapaz de proliferar en medio LB con una concentración de NaCl igual o superior a 1,2 M, quedando la concentración máxima tolerada entre 0,8 M y 1,2 M de NaCl. Esta cepa mostró un crecimiento óptimo a una concentración de 0,8 M de NaCl. It was also unable to proliferate in LB medium with a concentration of NaCl equal to or greater than 1.2 M, with the maximum concentration tolerated between 0.8 M and 1.2 M NaCl. This strain showed optimal growth at a concentration of 0.8 M NaCl.

--: Ensayos de sensibilidad a antibióticos mostraron halos de inhibición del crecimiento en los cinco antibióticos ensayados en disco: rifampicina30 (3,07 cm); estreptomicina25 (1,83 cm); tetraciclina20 (1,57 cm); cloramfenicol50 (3,88 cm); kanamicina30 (1,47 cm). Antibiotic sensitivity trials showed growth inhibition halos in the five antibiotics tested on disk: rifampin 30 (3.07 cm); streptomycin25 (1.83 cm); tetracycline20 (1.57 cm); chloramphenicol50 (3.88 cm); Kanamycin 30 (1.47 cm).

Asimismo, la presente invención también se reﬁere a un microorganismo derivado del microorganismo depositado con nº de acceso CECT7626. El microorganismo derivado puede producirse de forma intencionada, por métodos mutagénicos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, el crecimiento de dicho microorganismo original en exposición con conocidos agentes capaces de forzar mutagénesis. Likewise, the present invention also refers to a microorganism derived from the microorganism deposited with accession number CECT7626. The derived microorganism can be produced intentionally, by mutagenic methods known in the state of the art such as, for example, the growth of said original microorganism on exposure with known agents capable of forcing mutagenesis.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a una población bacteriana que comprende el microorganismo depositado con nº de acceso CECT7626. La población bacteriana puede estar formada por otras cepas de microorganismos de cualquier especie. La población bacteriana es un conjunto de células de microorganismos donde al menos hay una célula de dicho microorganismo depositado con nº de acceso CECT7626, en cualquier fase del estado de desarrollo y en cualquier fase de crecimiento, estacional o estacionaria, independientemente de la morfología que presente, en forma de coco, bacilo o morfologías intermediarias de las anteriores. Another aspect of the present invention relates to a bacterial population comprising the microorganism deposited with accession number CECT7626. The bacterial population can be formed by other strains of microorganisms of any species. The bacterial population is a set of microorganism cells where there is at least one cell of said microorganism deposited with access number CECT7626, at any stage of the development state and at any stage of growth, seasonal or stationary, regardless of the morphology that it presents , in the form of coconut, bacillus or intermediate morphologies of the above.

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo o a la población bacteriana como el “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”. Hereinafter, the microorganism or the bacterial population may be referred to as the "microorganism of the present invention" or the "microorganism of the invention".

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere al uso del microorganismo de la presente invención para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta, respecto de un control. Another aspect of the present invention refers to the use of the microorganism of the present invention to increase the tolerance to water stress of a plant, with respect to a control.

En la presente invención, el control hace referencia a una planta de la misma especie, subespecie o variedad que la planta anterior, que no ha sido expuesta a dicho microorganismo o a una planta que ha sido expuesta a la rizobacteria In the present invention, the control refers to a plant of the same species, subspecies or variety as the previous plant, which has not been exposed to said microorganism or to a plant that has been exposed to the rhizobacterium

P. putida KT2440. P. putida KT2440.

El término “estrés hídrico” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a la reducción del contenido de agua en los tejidos vegetales que provoca alteraciones en los procesos metabólicos, originando efectos negativos en el crecimiento y desarrollo de las plantas. La magnitud de dichas alteraciones en los procesos metabólicos involucrados dependen de la especie, momento del ciclo de desarrollo de la planta afectada, de la intensidad y duración de la situación que provoca dicho estrés, entre otros factores. Las técnicas para estimar el estrés hídrico en una planta son conocidas por el experto en la materia como por ejemplo, pero sin limitarse, medida de la expansión de las hojas, medida del cierre estomático, medida de la muerte foliar. The term "water stress" as understood in the present invention refers to the reduction of water content in plant tissues that causes alterations in metabolic processes, causing negative effects on plant growth and development. The magnitude of these alterations in the metabolic processes involved depends on the species, moment of the development cycle of the affected plant, the intensity and duration of the situation that causes said stress, among other factors. The techniques for estimating water stress in a plant are known by the person skilled in the art, for example, but not limited to, measure of leaf expansion, measure of stomatic closure, measure of leaf death.

El estrés hídrico puede ser provocado por diversas causas, entre las que se encuentra el estrés salino, ya que es conocido que la concentración de sales solubles en el suelo eleva la presión osmótica de la solución de dicho suelo. Puesto que el agua tiende a pasar de las soluciones menos concentradas a las más concentradas, igualando las presiones osmóticas de ambas, cuando la concentración salina de la solución del suelo es superior a la de las células de la planta, el agua tenderá a salir de éstas últimas hacia la solución del suelo. Por tanto, en medios salinos, aunque exista agua disponible suﬁciente, la planta sufre estrés hídrico. Water stress can be caused by various causes, including saline stress, since it is known that the concentration of soluble salts in the soil raises the osmotic pressure of the solution of said soil. Since water tends to pass from less concentrated to more concentrated solutions, equalizing the osmotic pressures of both, when the saline concentration of the soil solution is higher than that of the plant cells, the water will tend to leave the latter towards soil solution. Therefore, in saline environments, although there is sufficient available water, the plant suffers water stress.

Las características de una planta que pueden aumentar su tolerancia al estrés hídrico pueden ser, entre otras, pero si limitarse, el mantenimiento de la turgencia de los tejidos mediante el aumento del índice de retención de agua o, el mantenimiento o aumento de la absorción de agua. The characteristics of a plant that can increase its tolerance to water stress can be, among others, but if limited, the maintenance of tissue turgidity by increasing the water retention index or, maintaining or increasing the absorption of Water.

Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al uso del microorganismo de la invención para aumentar la cantidad de agua absorbida (recuperada) por una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. En la presente invención se mide la cantidad de agua recuperada por una planta por medio de (ver en ejemplos de realización de la invención): Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the microorganism of the invention to increase the amount of water absorbed (recovered) by a plant, with respect to a control, under conditions of water stress. In the present invention the amount of water recovered by a plant is measured by means of (see in embodiments of the invention):

--: La medida del peso de la planta totalmente túrgida. The measure of the weight of the totally turgid plant.

--: La medida del potencial de recuperación de agua o índice de recuperación de agua, que consiste en calcular la diferencia entre el agua recuperada por la planta y su peso fresco. The measure of the water recovery potential or water recovery index, which consists in calculating the difference between the water recovered by the plant and its fresh weight.

--: La medida del contenido relativo de agua. Este dato indica la relación entre el agua presente en las plantas en el momento de la extracción respecto del agua total. De esta forma, el valor máximo de 1 se daría en la situación teórica en que por su buen estado hídrico, la planta no pudiera o no necesitara recuperar agua en su estado totalmente túrgido con respecto al peso fresco. The measure of relative water content. This data indicates the relationship between the water present in the plants at the time of extraction with respect to the total water. In this way, the maximum value of 1 would be given in the theoretical situation in which, due to its good water state, the plant could not or would not need to recover water in its totally turgid state with respect to the fresh weight.

Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al uso del microorganismo de la invención para aumentar el índice de retención de agua de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. El índice de retención de agua en una planta es la diferencia entre el peso fresco y el peso seco de dicha planta. Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the microorganism of the invention to increase the water retention rate of a plant, with respect to a control, under conditions of water stress. The water retention rate in a plant is the difference between the fresh weight and the dry weight of that plant.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere al uso del microorganismo de la invención para aumentar la biomasa de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. En la presente invención, el aumento de la biomasa se determina fundamentalmente mediante el cálculo del peso seco de la planta, así como por la medida de la longitud de tallo y raíces en condiciones de estrés hídrico. A preferred embodiment of the present invention refers to the use of the microorganism of the invention to increase the biomass of a plant, with respect to a control, under conditions of water stress. In the present invention, the increase in biomass is determined primarily by calculating the dry weight of the plant, as well as by measuring the length of the stem and roots under conditions of water stress.

La cantidad de agua recuperada por una planta, el índice de retención de agua o el aumento de la biomasa de dicha planta pueden ser determinados por medio de la medida de otros parámetros diferentes a los que se especiﬁca anteriormente y en el apartado de ejemplos de realización. The amount of water recovered by a plant, the water retention index or the increase of the biomass of said plant can be determined by means of the measurement of other parameters different from those specified above and in the section of examples of embodiment .

El término “planta” engloba cada una de las partes de la misma, que pueden ser conservadas o cultivadas de forma aislada o en combinación, así como el germoplasma. El germoplasma queda deﬁnido por aquel material biológico que contiene la variabilidad genética intraespecíﬁca o a los materiales genéticos que pueden perpetuar una especie o una población de un organismo. Así pues germoplasma es la semilla, tejido de cualquier parte de la planta o plantas establecidas en colecciones ex situ, sin excluir cualquier otro material que entre en esta deﬁnición. The term "plant" encompasses each part of it, which can be preserved or cultivated in isolation or in combination, as well as the germplasm. Germplasm is defined by that biological material that contains intraspecific genetic variability or genetic materials that can perpetuate a species or population of an organism. Thus, germplasm is the seed, tissue of any part of the plant or plants established in ex situ collections, without excluding any other material that enters this definition.

La planta de la presente invención puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, cualquier planta destinada al consumo humano o animal, plantas cuyo fruto tenga interés para su consumo fresco o procesado industrial, plantas que se utilicen en la generación de productos beneﬁciosos para la salud humana, como por ejemplo fármacos (biofarms), plantas que se utilicen para la generación de biomasa para fabricar biodiesel, plantas utilizadas en la biorremediación de diferentes tipos de sustratos (ﬁtorremediación). En este sentido, la planta se puede seleccionar de la lista que comprende, pero sin limitarse, del género Solanum, Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Capsicum, Brasica, Nicotiana, Citrullus o Lactuca. The plant of the present invention can be, for example, but not limited to, any plant intended for human or animal consumption, plants whose fruit has an interest for its fresh or industrial processed consumption, plants that are used in the generation of products beneficial for the human health, such as drugs (biofarms), plants that are used for the generation of biomass to manufacture biodiesel, plants used in the bioremediation of different types of substrates (ﬁ remediation). In this sense, the plant can be selected from the list that includes, but is not limited to, the genus Solanum, Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Capsicum, Brasica, Nicotiana, Citrullus or Lactuca.

Otra realización preferida se reﬁere al uso del microorganismo de la invención para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta respecto de un control, o al uso del microorganismo de la invención para aumentar el crecimiento de una planta respecto de un control, donde la planta es del género Capsicum. La especie de planta del género Capsicum se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Capsicum angulosum, Capsicum annuum, Capsicum pendulum, Capsicum minimum, Capsicum baccatum, Capsicum abbreviatum, Capsicum anomalum, Capsicum breviﬂorum, Capsicum buforum, Capsicum brasilianum, Capsicum campylopodium, Capsicum cardenasii, Capsicum chacoense, Capsicum chinense, Capsicum chlorocladium, Capsicum ciliatum, Capsicum coccineum, Capsicum cordiforme, Capsicum cornutum, Capsicum dimorphum, Capsicum dusenii, Capsicum exile, Capsicum eximium, Capsicum fasciculatum, Capsicum fastigiatum, Capsicum frutescens, Capsicum ﬂexuosum, Capsicum galapagoensis, Capsicum geminifolum, Capsicum hookerianum, Capsicum lanceolatum, Capsicum leptopodum, Capsicum luteum, Capsicum microcarpum, Capsicum minutiﬂorum, Capsicum mirabile, Capsicum parvifolium, Capsicum praetermissum, Capsicum pubescens, Capsicum schottianum, Capsicum scolnikianum, Capsicum stramonifolium, Capsicum tetragonum, Capsicum tovarii, Capsicum villosum o Capsicum violaceum. Según una realización más preferida, la planta es de la especie Capsicum annuum. Another preferred embodiment refers to the use of the microorganism of the invention to increase the tolerance to water stress of a plant with respect to a control, or to the use of the microorganism of the invention to increase the growth of a plant with respect to a control, where the plant It is of the genus Capsicum. The plant species of the genus Capsicum is selected from the list comprising, but not limited to, Capsicum angulosum, Capsicum annuum, Capsicum pendulum, Capsicum minimum, Capsicum baccatum, Capsicum abbreviatum, Capsicum anomalum, Capsicum brevi ﬂ orum, Capsicum buforum, Capsicum brasilianum, Capsicum brasilianum, Capsicum brasilianum, Capsicum brasilianum, Capsicum brasilianum campylopodium, Capsicum cardenasii, Capsicum chacoense, chinense Capsicum, Capsicum chlorocladium, Capsicum ciliatum, Capsicum coccineum, Capsicum cordiforme, Capsicum cornutum, Capsicum dimorphum, Capsicum dusenii, Capsicum exile, Capsicum eximium, Capsicum fasciculatum, Capsicum fastigiatum, Capsicum frutescens, Capsicum fl exuosum, Capsicum galapagoensis, Capsicum geminifolum, Capsicum hookerianum, Capsicum lanceolatum, Capsicum leptopodum, Capsicum luteum, Capsicum microcarpum, Capsicum minuti fl orum, Capsicum mirabile, Capsicum parvifolium, Capsicum praetermissum, Capsicum pubescens, Capsicum schottianum, Capsicum scolnikianum, Capsicum stramonifolium, Capsicum tetragonum, Caps icum tovarii, Capsicum villosum or Capsicum violaceum. According to a more preferred embodiment, the plant is of the species Capsicum annuum.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a un método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta respecto de un control, que comprende inocular el microorganismo de la invención a una célula vegetal, cualquier parte de una planta o a una semilla. Mediante este método se aumenta el crecimiento de una planta que no está en condiciones de estrés hídrico, respecto del control. Another aspect of the present invention relates to a method for increasing the tolerance to water stress of a plant with respect to a control, which comprises inoculating the microorganism of the invention to a plant cell, any part of a plant or a seed. This method increases the growth of a plant that is not in conditions of water stress, with respect to control.

El término “inocular” tal como se emplea en la presente invención se reﬁere a introducir el microorganismo de la invención en una planta mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarse, a través de una solución en hidroponía, a través de una solución aplicada al suelo, por medio de la aplicación del microorganismo de la invención por pulverización de cualquier parte aérea de la planta, mediante la germinación de semillas de la planta en presencia de dicho microorganismo, mediante cultivo de material vegetal in vitro en contacto con el microorganismo de la invención o mediante microinyección del microorganismo de la invención en al menos una célula vegetal o protoplasto. The term "inocular" as used in the present invention refers to introducing the microorganism of the invention into a plant by any technique known in the state of the art, such as, but not limited to, through a solution in hydroponics, through a solution applied to the soil, through the application of the microorganism of the invention by spraying any aerial part of the plant, by germinating the seeds of the plant in the presence of said microorganism, by cultivating plant material in vitro in contact with the microorganism of the invention or by microinjection of the microorganism of the invention in at least one plant cell or protoplast.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere al método descrito en los párrafos anteriores, que comprende poner en contacto el microorganismo de la invención con al menos una raíz de dicha planta. Una realización más preferida se reﬁere al método donde dicho microorganismo o población bacteriana se ponen en contacto con al menos una raíz por medio de una solución acuosa. A preferred embodiment of the present invention refers to the method described in the preceding paragraphs, which comprises contacting the microorganism of the invention with at least one root of said plant. A more preferred embodiment refers to the method where said microorganism or bacterial population is contacted with at least one root by means of an aqueous solution.

Otra realización preferida se reﬁere a cualquier método descrito en párrafos anteriores, para aumentar el crecimiento de una planta respecto de un control, donde la planta es del género Capsicum. Según una realización más preferida, la planta es de la especie Capsicum annuum. Another preferred embodiment refers to any method described in previous paragraphs, to increase the growth of a plant with respect to a control, where the plant is of the genus Capsicum. According to a more preferred embodiment, the plant is of the species Capsicum annuum.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere al uso del microorganismo de la invención para la producción de una composición xeroprotectora. Another aspect of the present invention relates to the use of the microorganism of the invention for the production of an xeroprotective composition.

Otro aspecto más de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención. Another aspect of the present invention relates to the xeroprotective composition produced by the microorganism of the invention.

Para referirse a la composición xeroprotectora de la presente invención se puede emplear el término Producto de Ordeñado Bacteriano (POB). El término “composición xeroprotectora” tal como se entiende en la presente invención, se reﬁere a una composición que previene los efectos adversos del estrés hídrico, que disminuye los efectos de dicho estrés hídrico en una planta o que promueve el crecimiento de una planta. To refer to the xeroprotective composition of the present invention, the term Bacterial Milking Product (POB) can be used. The term "xeroprotective composition" as understood in the present invention refers to a composition that prevents the adverse effects of water stress, that diminishes the effects of said water stress in a plant or that promotes the growth of a plant.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención, o a una composición xeroprotectora sintética, que comprende glucosa, acetato, lactato y valina. A preferred embodiment of the present invention relates to the xeroprotective composition produced by the microorganism of the invention, or to a synthetic xeroprotective composition, comprising glucose, acetate, lactate and valine.

Una realización más preferida de la presente invención se reﬁere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención, o a una composición xeroprotectora sintética, que comprende una proporción de entre 0,5 y 1,5 de glucosa: 0,05 y 0,35 de acetato: 0,1 y 0,4 de lactato: 0,02 y 0,6 de valina. Es decir, una proporción (glucosa): (acetato): (lactato): (valina), de (0,5 a 1,5): (0,05 a 0,35): (0,1 a 0,4): (0,02 a 0,6), respectivamente. Una realización aún más preferida se reﬁere a la composición xeroprotectora donde la proporción de (glucosa): (acetato): (lactato): (valina), es de (0,7 a 1,3): (0,07 a 0,30): (0,12 a 0,35) (0,04 a 0,5), respectivamente. Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (glucosa): (acetato): (lactato): (valina), de (1): (0,1): (0,25): (0,37), respectivamente o, de (1): (0,3): (0,12): (0,04), respectivamente. A more preferred embodiment of the present invention relates to the xeroprotective composition produced by the microorganism of the invention, or to a synthetic xeroprotective composition, which comprises a proportion of between 0.5 and 1.5 glucose: 0.05 and 0, 35 acetate: 0.1 and 0.4 lactate: 0.02 and 0.6 valine. That is, a ratio (glucose): (acetate): (lactate): (valine), of (0.5 to 1.5): (0.05 to 0.35): (0.1 to 0.4 ): (0.02 to 0.6), respectively. An even more preferred embodiment refers to the xeroprotective composition where the ratio of (glucose): (acetate): (lactate): (valine) is (0.7 to 1.3): (0.07 to 0, 30): (0.12 to 0.35) (0.04 to 0.5), respectively. Preferably the xeroprotective composition has a ratio of (glucose): (acetate): (lactate): (valine), of (1): (0.1): (0.25): (0.37), respectively or, of (1): (0.3): (0.12): (0.04), respectively.

El término “proporción” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a la correspondencia debida de los elementos de la composición (glucosa, acetato, lactato y valina) relacionados entre sí. Es decir, se reﬁere a una relación matemática que vincula los elementos de la composición. Para que sirva de ejemplo, la composición xeroprotectora que tiene una proporción de (glucosa): (acetato): (lactato): (valina), de (1): (0,1): (0,25): (0,37), respectivamente, puede tener por ejemplo, concentraciones de (2):(0,2):(0,5):(0,74) mg de cada elemento respectivamente/ml. The term "proportion" as understood in the present invention refers to the corresponding correspondence of the related elements of the composition (glucose, acetate, lactate and valine). That is, it refers to a mathematical relationship that links the elements of the composition. To serve as an example, the xeroprotective composition having a proportion of (glucose): (acetate): (lactate): (valine), of (1): (0.1): (0.25): (0, 37), respectively, may have, for example, concentrations of (2) :( 0.2) :( 0.5) :( 0.74) mg of each element respectively / ml.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquier composición descrita en los párrafos anteriores como “composición de la presente invención” o “composición de la invención”. Hereinafter reference may be made to any composition described in the preceding paragraphs as "composition of the present invention" or "composition of the invention".

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%. El contenido de humedad residual del material biológico puede ser igual o inferior al 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1% de humedad residual. La conservación de dicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión “material biológico en estado seco”. En estas condiciones, el conservante o estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo, y sólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador, están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamente las reacciones químicas. De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador. Another aspect of the present invention refers to the use of the composition of the invention for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%. The residual moisture content of the biological material may be equal to or less than 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1% residual moisture. The preservation of said material can be carried out by stabilizing it. In the present invention, the term "dry material biological material" can be used to refer to this type of biological material. Under these conditions, the preservative or stabilizer coalesces to reach a non-crystalline, vitreous, and solid state (for example an amorphous crystal). The organic crystal particles that are formed by drying the biological material with the stabilizer, are covered by the stabilizer that produces high stability by drastically reducing chemical reactions. In this way the dried biological material is embedded in the amorphous crystal formed by the stabilizer.

El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido. The dry biological material in the presence of the stabilizer that forms the amorphous crystal is resistant to plastics in the liquid state, while the material that is not dry in the presence of these stabilizers is not resistant to plastics in the liquid state.

El material biológico seco en estas formas puede encontrarse en estado no particulado y puede suministrarse en formas por ejemplo, pero sin limitarse, molduras o sólidos en 3 dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches, hojas, bolas, o pepitas de material biológico seco. The dry biological material in these forms can be in a non-particulate state and can be supplied in forms, for example, but not limited to, moldings or solids in 3 dimensions such as, but not limited to, blocks, pads, patches, sheets, balls, or seeds of dry biological material.

El término “humedad residual” tal como se emplea en la presente invención se reﬁere a la cantidad de humedad que contiene un producto después de pasado por algún tipo de proceso capaz de eliminar agua del mismo. La humedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del total de la masa. Es decir un valor de humedad residual de un producto igual a un 10% signiﬁca que 10 g de cada 100 g del producto corresponden a agua. La humedad residual puede ser medida mediante métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico. The term "residual moisture" as used in the present invention refers to the amount of moisture a product contains after it has passed through some type of process capable of removing water from it. Residual humidity is the mass percentage of the product that corresponds to water with respect to the total mass. In other words, a residual moisture value of a product equal to 10% means that 10 g of every 100 g of the product correspond to water. Residual humidity can be measured by methods known in the state of the art such as, but not limited to, by the titrimetric method, the azeotropic method or the gravimetric method.

El término “conservación de material biológico” hace referencia al mantenimiento o cuidado de la permanencia de las características intrínsecas del material biológico. The term "conservation of biological material" refers to the maintenance or care of the permanence of the intrinsic characteristics of the biological material.

Una realización preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. La célula puede ser procariota o eucariota. La célula puede ser una célula de un microorganismo en cualquier estado de desarrollo. La célula puede ser somática o germinal, vegetal o animal. Dicha célula puede proceder de cualquier organismo o microorganismo y puede presentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo, pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente A preferred embodiment refers to the use of the composition of the invention for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue or a cell. The cell can be prokaryotic or eukaryotic. The cell can be a cell of a microorganism in any state of development. The cell can be somatic or germinal, plant or animal. Said cell can come from any organism or microorganism and can occur in any state of differentiation, such as, but not limited to, from a culture of a cellular tissue or organs, sperm, ovules or embryos. The cell can be a totipotent, multipotent stem cell

o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El microorganismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, E. coli, S. typhimurium, P. putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. o Biﬁdobacterium spp. El microorganismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo. or unipotent. The microorganism can be unicellular or multicellular. The unicellular microorganism is selected from the list comprising, but not limited to, E. coli, S. typhimurium, P. putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp. or Bi ﬁ dobacterium spp. The multicellular microorganism can be, for example, but not limited to, a nematode.

La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicación y división celular. Por otra parte la célula puede haber sido tratada, manipulada o mutada antes de su conservación. Por ejemplo, pero sin limitarse, una célula puede haberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las células que se conservan pueden formar una población homogénea o heterogénea, por ejemplo, pero sin limitarse, una librería de células en la que cada célula contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes. The cell conserved by the composition of the present invention is a viable cell that is, it is capable of performing the normal functions of the cell including cell replication and division. On the other hand, the cell may have been treated, manipulated or mutated before preservation. For example, but not limited to, a cell may have become competent for transformations or transfections, or it may contain recombinant nucleic acids. The cells that are conserved can form a homogeneous or heterogeneous population, for example, but not limited to, a cell library in which each cell contains a variation of some nucleic acid. Preferably the cells are non-anhydrobotic cells (desiccation sensitive cells) such as, but not limited to, cells from non-anhydrobial prokaryotic microorganisms that are generally not sporulant.

La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse, en condiciones de alta osmolaridad (alta concentración de sales) que estimulen la producción intracelular de trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos. The conservation of the microorganism can be improved by culture under conditions that increase the intracellular concentration of trehalose or other amorphous crystal-forming stabilizers. For example, but not limited, under conditions of high osmolarity (high concentration of salts) that stimulate the intracellular production of trehalose or other amorphous crystal-forming stabilizers.

El organismo invertebrado es pero sin limitarse, una larva de insecto o un crustáceo. Dichos organismos invertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrolla. The invertebrate organism is, but is not limited to, an insect larva or a crustacean. Said invertebrate organisms can be preserved under drying conditions, allowing the vital activity thereof, so that, when rehydrated, said organisms have the ability to move. The seedling is a plant in its early stages of development, from germinating until it develops.

La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo vertebrado perteneciente a la Superclase Tetrapoda (con cuatro extremidades), Clase Amphibia (anﬁbios) o Clase Reptilia (reptiles), o cualquiera de sus partes (Vernon y Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon y Jackson llevaron a cabo un estudio sobre la rana Leopardo (Rana pipiens), en el que de forma natural se seca su piel, lengua, bazo, e hígado con una pérdida de agua de entre un 43-81% del contenido de agua total. The composition of the invention can be used for the conservation of biological material in the dry state, where the biological material is a vertebrate organism belonging to the Tetrapoda Superclass (with four limbs), Amphibia Class (amphibians) or Reptilia Class (reptiles), or any of its parts (Vernon and Jackson, 1931. The biological bulletin, 60: 80-93). Vernon and Jackson carried out a study on the Leopard frog (Rana pipiens), in which their skin, tongue, spleen, and liver naturally dries with a water loss of between 43-81% of the water content total.

Un órgano aislado, o un tejido biológico aislado (incluida la sangre) pueden conservarse mediante la composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de crioperservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540). An isolated organ, or an isolated biological tissue (including blood) can be preserved by the composition of the present invention. In Serrato et al. (2009) results of cryopreservation protocols of biological tissues can be observed (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).

Una realización más preferida se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término “molécula con actividad biológica” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término “derivados” se reﬁere a moléculas obtenidas por la modiﬁcación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte, el término “análogos” se reﬁere a moléculas que presentan una función similar a la molécula con actividad biológica. A more preferred embodiment refers to the use of the composition of the invention, where the biological material is a molecule with biological activity. The term "molecule with biological activity" as understood in the present invention refers to a biological molecule whose origin is a living organism or that has been alive, or derivatives or analogs of said molecule. The term "derivatives" refers to molecules obtained by modifying a molecule with biological activity, which have similar functionality. On the other hand, the term "analogs" refers to molecules that have a function similar to the molecule with biological activity.

Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se reﬁere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC (Enzyme Commission numbers) que comprende las hidrolasas de éster carboxílico (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa), EC 3.1.1.2 (Arilesterasa), EC 3.1.1.3 (Triacilglicerol lipasa), EC 3.1.1.4 (Fosfolipasa A(2)), EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa), EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa), EC 3.1.1.24 (3oxoadipato enol-lactonasa), EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa), EC 3.1.1.26 (Galactolipasa), EC 3.1.1.32 (Fosfolipasa A(1)), EC 3.1.1.33 (6-acetilglucosa deacetilasa), EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblemente la enzima lipasa tiene actividad Triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3). According to another even more preferred embodiment of the composition of the present invention the molecule with biological activity is an enzyme. An even more preferred embodiment of the present invention refers to the use of the composition of the invention, where the enzyme is an enzyme with lipase activity. The enzyme with lipase activity is selected from the list of enzymes with EC numbers (Enzyme Commission numbers) comprising carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) EC 3.1.1.1 (Carboxylesterase), EC 3.1.1.2 (Arilesterase), EC 3.1.1.3 (Triacylglycerol lipase), EC 3.1.1.4 (Phospholipase A (2)), EC 3.1.1.5 (Lysophospholipase), EC 3.1.1.23 (Acylglycerol lipase), EC 3.1.1.24 (3oxoadipate enol-lactonase), EC 3.1 .1.25 (1,4-lactonase), EC 3.1.1.26 (Galactolipase), EC 3.1.1.32 (Phospholipase A (1)), EC 3.1.1.33 (6-acetylglucose deacetylase), EC 3.1.1.34 (Lipoprotein lipase). Preferably the enzyme lipase has Triacylglycerol lipase activity (EC 3.1.1.3).

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a un método de obtención de la composición xeroprotectora de la invención que comprende: Another aspect of the present invention relates to a method of obtaining the xeroprotective composition of the invention comprising:

a) cultivar el microorganismo de la invención en un medio de cultivo con glucosa como fuente de carbono, a) culturing the microorganism of the invention in a culture medium with glucose as a carbon source,

b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%, b) dehydrate the microorganisms obtained in the culture of step (a) until they have a residual humidity equal to or less than 10%,

c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónico y c) rehydrate the dehydrated microorganisms of step (b) in a hypotonic medium and

d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en el paso (c) que comprende la composición xeroprotectora. d) select the liquid fraction of the product obtained in step (c) comprising the xeroprotective composition.

El medio de cultivo es cualquier medio de cultivo conocido en el estado de la técnica para el crecimiento de un microorganismo de la presente invención, por ejemplo pero sin limitarse, el medio mineral M9. Medios ricos como el medio Luria Bertani (LB) en los que hay presentes xeroprotectores, u osmolitos naturales no sirven, porque la bacteria preferiría tomarlos del exterior a sintentizarlos. The culture medium is any culture medium known in the state of the art for the growth of a microorganism of the present invention, for example but not limited to, the M9 mineral medium. Rich media such as Luria Bertani (LB) medium in which xeroprotectors, or natural osmolytes are not present, because the bacteria would prefer to take them from outside to synthesize them.

Una realización preferida de la presente invención se reﬁere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde el medio de cultivo del paso (a) es sólido. El término “sólido” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a un medio de cultivo geliﬁcado en mayor o menor grado, es decir, que comprende agar para facilitar su geliﬁcación o cualquier compuesto geliﬁcante. A preferred embodiment of the present invention refers to the method of obtaining the xeroprotective composition, where the culture medium of step (a) is solid. The term "solid" as understood in the present invention refers to a medium of geli ﬁ cated culture to a greater or lesser degree, that is, comprising agar to facilitate its gelation or any gelling compound.

La deshidratación de los microorganismos del paso (b) se lleva a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al método, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Preferiblemente la solución hipertónica o la corriente de aire tienen condiciones de esterilidad. La solución hipertónica es una solución que tiene mayor concentración de soluto en el medio externo que en el citoplasma de la células del microorganismo de la presente invención, por tanto, la célula libera agua, es decir, se deshidrata. Dehydration of the microorganisms in step (b) is carried out by means of any technique known in the state of the art. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method, where the dehydration of the microorganisms according to step (b) is carried out by means of a hypertonic solution or by means of an air current. Preferably the hypertonic solution or the air stream have sterility conditions. The hypertonic solution is a solution that has a higher concentration of solute in the external environment than in the cytoplasm of the cells of the microorganism of the present invention, therefore, the cell releases water, that is, it is dehydrated.

La rehidratación de los microorganismos, descrita en el paso (c), se lleva a cabo en un medio hipotónico. El medio hipotónico o solución hipotónica es una solución que tiene menor concentración de soluto en el medio externo que en el citoplasma de la célula del microorganismo de la presente invención, por tanto, la célula recupera agua, es decir, se rehidrata. Una realización preferida más se reﬁere al método, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según el paso (c) es agua, parcial o totalmente destilada, parcial o totalmente desionizada o parcial The rehydration of the microorganisms, described in step (c), is carried out in a hypotonic medium. The hypotonic medium or hypotonic solution is a solution that has a lower concentration of solute in the external medium than in the cytoplasm of the cell of the microorganism of the present invention, therefore, the cell recovers water, that is, it is rehydrated. A further preferred embodiment refers to the method, where the hypotonic means for rehydration of the microorganisms according to step (c) is water, partially or totally distilled, partially or totally deionized or partial

o totalmente desmineralizada. or totally demineralized.

Las células y el medio hipotónico han de estar en contacto al menos 5 minutos. Preferiblemente estarán en contacto al menos 20 minutos en agitación. La obtención del medio que contiene las sustancias estabilizantes se realizará por cualquier método que garantice la separación de células del contenido líquido, preferiblemente mediante centrifugado suave, seguido de un paso de ﬁltración. Preferiblemente se utilizarán ﬁltros de 0,4 micrómetros de diámetro de poro. The cells and the hypotonic medium must be in contact for at least 5 minutes. Preferably they will be in contact for at least 20 minutes with stirring. Obtaining the medium containing the stabilizing substances will be carried out by any method that guarantees the separation of cells from the liquid content, preferably by gentle centrifugation, followed by a filtration step. Preferably, ﬁ lters of 0.4 micrometer in pore diameter will be used.

Otra realización preferida se reﬁere al método, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%. Another preferred embodiment refers to the method, where in addition, the liquid fraction of step (d) is dehydrated until the xeroprotective product has a residual humidity equal to or less than 10%.

El producto xeroprotector de la invención se puede separar del medio de cultivo por cualquier método de concentración. Preferiblemente se utilizarán secadores de tipo lioﬁlizador que produzcan el estabilizador en estado seco. Las moléculas estabilizadoras se podrán disolver o dispersar en una proporción de entre el 10 y el 30%. Esta disolución o dispersión se añade al material biológico que se desee conservar y se someterá a desecación. The xeroprotector product of the invention can be separated from the culture medium by any method of concentration. Preferably, lyophilizer-type dryers that produce the stabilizer in the dry state will be used. The stabilizing molecules may be dissolved or dispersed in a proportion of between 10 and 30%. This solution or dispersion is added to the biological material that is to be preserved and will be dried.

Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method of obtaining the xeroprotective composition, where the dehydration of the microorganisms according to step (b) is carried out by means of a hypertonic solution or by means of an air current.

Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según el paso (c) es agua parcial o totalmente destilada, desionizada o desmineralizada. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method of obtaining the xeroprotective composition, where the hypotonic means for rehydration of the microorganisms according to step (c) is partially or totally distilled, deionized or demineralized water.

Otra realización preferida de la presente invención se reﬁere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%. Another preferred embodiment of the present invention refers to the method of obtaining the xeroprotective composition, where in addition, the liquid fraction of step (d) is dehydrated until the xeroprotector product has a residual humidity equal to or less than 10%.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes ﬁguras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

Descripción de las ﬁguras Description of the ﬁ gures

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes ﬁguras: With the intention of complementing the description that has been carried out, as well as helping to better understand the characteristics of the invention, according to some examples made, the following figures are shown here, for illustrative and non-limiting purposes. :

Fig. 1. Muestra la viabilidad de los distintos aislados bacterianos seleccionados mediante exposición a cloroformo tras 24 horas de secado al aire. Fig. 1. Shows the viability of the different bacterial isolates selected by exposure to chloroform after 24 hours of air drying.

Las barras de error muestran la desviación estándar de al menos tres réplicas. Error bars show the standard deviation of at least three replicas.

Las cepas de microorganismos representadas en esta ﬁgura son: The strains of microorganisms represented in this figure are:

1J3A, 1J14, 2J2, 2J8A, 2J12B, 2J15B, 2J16A, 2J30, 3J18, 6J30, Acitenobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida, además de la cepa Arthrobacter sp. 5J12A. 1J3A, 1J14, 2J2, 2J8A, 2J12B, 2J15B, 2J16A, 2J30, 3J18, 6J30, Acitenobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida, in addition to the strain Arthrobacter sp. 5J12A.

Fig. 2. Muestra la actividad lipasa (en porcentaje relativo a un 100% de actividad del control positivo) tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v). Fig. 2. Shows the lipase activity (in percentage relative to 100% positive control activity) after drying of the lipase enzyme in the presence of the different components of 10% bacterial milking products (w / v).

El control positivo es trehalosa al 10%. El control negativo (-) se corresponde con la ausencia de compuesto alguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 5J12A es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POB extraídos de la cepa 5J12A mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente. 5J12AD es la actividad lipasa registrada tras la estabilización por secado y posterior reconstitución de la enzima en presencia de POBSIA (Producto de Ordeñado Bacteriano extraído por Secado mediante Incubación al Aire) extraídos de la cepa 5J12A mediante tratamiento de secado y posterior hidratación. The positive control is trehalose at 10%. The negative control (-) corresponds to the absence of any compound as an additive prior to the drying of the enzyme. 5J12A is the value of lipase activity recorded after stabilization by drying and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POB extracted from strain 5J12A by hyper / hypoosmotic shock respectively. 5J12AD is the lipase activity recorded after stabilization by drying and subsequent reconstitution of the enzyme in the presence of POBSIA (Bacterial Milking Product extracted by Drying by Air Incubation) extracted from strain 5J12A by drying and subsequent hydration treatment.

Fig. 3. Muestra el estado de las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A, P. putida KT2440 y de las plantas sin inocular al día 33 del experimento en ausencia de riego. Fig. 3. Shows the state of the plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A, P. putida KT2440 and non-inoculated plants on day 33 of the experiment in the absence of irrigation.

Se muestran dos plantas de cada tipo de muestra en el último punto de muestreo que incluyen plantas no inoculadas (Agua); inoculadas con P. putida e inoculadas con 5J12A. Two plants of each type of sample are shown at the last sampling point that include non-inoculated plants (Water); inoculated with P. putida and inoculated with 5J12A.

Fig. 4. Muestra el Peso Fresco de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo en ausencia de riego. Fig. 4. Shows the Fresh Weight of the plants inoculated with each of the strains at the different times of the test in the absence of irrigation.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día 7 de muestreo, el gris claro, al día 14 el gris oscuro al 20 y el negro al día 33. In ordinates the weight in mg of the plants is shown. In abscissa the inoculums used are indicated. The colors of the bars refer to the sample time, with the white corresponding to day 7 of sampling, light gray, at day 14, dark gray at 20 and black at day 33.

Fig. 5. Muestra el Peso Seco de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo en ausencia de riego. Fig. 5. Shows the Dry Weight of the plants inoculated with each of the strains at the different times of the test in the absence of irrigation.

Fig. 6. Muestra el Peso Totalmente Túrgido de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo en ausencia de riego. Fig. 6. It shows the Totally Turbid Weight of the plants inoculated with each of the strains at the different times of the test in the absence of irrigation.

Fig. 7. Muestra el Contenido Relativo de Agua en plantas inoculadas con las distintas cepas a los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego. Fig. 7. Shows the Relative Content of Water in plants inoculated with the different strains at the different times of the test after the cessation of irrigation.

En ordenadas se muestran los valores adimensionales de CRA. En abscisas se indican los tiempos de muestreo. Cime values are shown in ordinates. In abscissa the sampling times are indicated.

Fig. 8. Muestra el índice de Retención de Agua (IRA) de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego. Fig. 8. Shows the Water Retention Index (ARI) of the plants inoculated with each of the strains at the different times of the test after the cessation of irrigation.

En ordenadas se muestra el agua retenida estructuralmente por las plantas en mg. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día 7 de muestreo, el gris claro, al día 14 el gris oscuro al 20 y el negro al día 33. In ordinates the water structurally retained by the plants in mg is shown. In abscissa the inoculums used are indicated. The colors of the bars refer to the sample time, with the white corresponding to day 7 of sampling, light gray, at day 14, dark gray at 20 and black at day 33.

Fig. 9. Muestra la altura tallo de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego. Fig. 9. Shows the stem height of the plants inoculated with each of the strains at the different times of the test after the cessation of irrigation.

En ordenadas se muestra la altura en cm de la planta. En abscisas se indican los inóculos utilizados. La escala de grises de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día 7 de muestreo, el gris claro, al día 14 el gris oscuro al 20 y el negro al día 33. In ordinates the height in cm of the plant is shown. In abscissa the inoculums used are indicated. The grayscale of the bars refers to the sample time, with the target corresponding to day 7 of sampling, light gray, day 14 being dark gray at 20 and black at day 33.

Fig. 10. Muestra la longitud de la raíz de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego. Fig. 10. Shows the root length of the plants inoculated with each of the strains at the different times of the test after the cessation of irrigation.

En ordenadas se muestra la altura en cm de la planta. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día 7 de muestreo, el gris claro, al día 14 el gris oscuro al 20 y el negro al día 33. In ordinates the height in cm of the plant is shown. In abscissa the inoculums used are indicated. The colors of the bars refer to the sample time, with the white corresponding to day 7 of sampling, light gray, at day 14, dark gray at 20 and black at day 33.

Fig. 11. Muestra el Potencial de Recuperación de Agua (PRA) de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo en condiciones de humedad. Fig. 11. It shows the Water Recovery Potential (PRA) of the plants inoculated with each of the strains at different test times in humid conditions.

En ordenadas se muestra el agua recuperada por las plantas en mg. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día 7 de muestreo, el gris claro, al día 14 el gris oscuro al 20 y el negro al día 33. In ordinates the water recovered by the plants in mg is shown. In abscissa the inoculums used are indicated. The colors of the bars refer to the sample time, with the white corresponding to day 7 of sampling, light gray, at day 14, dark gray at 20 and black at day 33.

Ejemplos Examples

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el aislamiento de la cepa de la presente invención así como sus usos. The invention will now be illustrated by illustrative and non-limiting tests carried out by the inventors who describe the isolation of the strain of the present invention as well as its uses.

Ejemplo 1 Example 1

Aislamiento del microorganismo perteneciente a la cepa 5J12A, extracción de POB (Productos del Ordeñado Bacteriano) Isolation of the microorganism belonging to strain 5J12A, extraction of POB (Bacterial Milking Products)

1.2. Isolation of strain 5J12A (CECT7626)

Se homogeneizó 1 g de suelo seco, procedente de Granada (37.182 Latitud N y 3.624 Longitud O), no expuesto a lluvia, ni riego, por un periodo superior a tres meses. El suelo se tomó del área circundante a raíces de adelfa (Nerium oleander). Las muestras fueron homogeneizadas para obtener un grano de tierra ﬁno que garantizara su contacto con el cloroformo. La tierra se depositó en viales de vidrio a los que se les añadió 3 ml de cloroformo puro. Tras la adición del cloroformo se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación esporádica para maximizar el contacto de la muestra con el disolvente. Para eliminar el cloroformo de las muestras una vez transcurrido el tiempo de contacto, las muestras de suelo fueron depositadas en placa petri de vidrio estéril sin tapadera hasta completar la evaporación del cloroformo. Una vez secas las muestras de suelo se resuspendieron en 10 ml de TSB. Con las suspensiones de suelo se realizaron diluciones seriadas y se sembraron en placas de TSA que se incubaron 48 horas a 30ºC. Trascurrido este tiempo se cuantiﬁcó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de cada muestra. Así, se detectaron 2·105 UFC/g de suelo en las muestras sin tratar, mientras que estas se redujeron a 1,3·105 UFC/g de suelo tras 30 minutos de tratamiento. 1 g of dry soil was homogenized, from Granada (37,182 Latitude N and 3,624 Longitude O), not exposed to rain or irrigation, for a period exceeding three months. The soil was taken from the area surrounding oleander roots (Nerium oleander). The samples were homogenized to obtain a fine ground grain that would guarantee their contact with the chloroform. The earth was deposited in glass vials to which 3 ml of pure chloroform was added. After the addition of the chloroform, they were incubated at room temperature for 30 minutes with sporadic agitation to maximize contact of the sample with the solvent. To remove the chloroform from the samples after the contact time had elapsed, the soil samples were deposited in a sterile glass petri dish without a lid until the evaporation of the chloroform was completed. Once the soil samples were dried, they were resuspended in 10 ml of TSB. Serial dilutions were made with the soil suspensions and seeded in TSA plates that were incubated 48 hours at 30 ° C. After this time, the number of colony forming units (CFU) per milliliter of each sample was quantified. Thus, 2 · 105 CFU / g of soil was detected in the untreated samples, while these were reduced to 1.3 · 105 CFU / g of soil after 30 minutes of treatment.

Se seleccionaron aleatoriamente 36 cepas y para identiﬁcar las cepas que producían esporas se realizó un ensayo basado en la diferente sensibilidad de las células vegetativas con respecto a las esporas al tratamiento con calor y en base al método descrito por Vilchez y colaboradores (Vilchez et al., 2008. Extremophiles, 12: 297-299). De esta forma se tomaron colonias independientes procedentes de placas de TSA de al menos 24 horas de crecimiento. Estas colonias se resuspendieron en 1 ml de solución M9 en microtubos estériles de 1,5 ml. Seguidamente se sembraron 10 μl de esta suspensión en TSA. Acto seguido se incubó el resto de la suspensión en termobloque Mixing Block MB-102 a 72ºC durante 30 minutos. Nuevamente se tomaron 10 μl de cada muestra y se sembraron en placa de TSA. Aquellas cepas con capacidad para tolerar el tratamiento con calor se consideraron como esporulantes, mientras que aquellas que no toleraron el tratamiento por calor se consideraron no esporulantes. Como controles positivos y negativos se utilizaron colonias de Bacillus pumilus yde Burkholderia cepacia respectivamente. La proporción de cepas esporulantes pasó de niveles inferiores al 40% para muestras no tratadas a niveles superiores al 50% tras 30 min de exposición de las muestras de suelo al cloroformo. 36 strains were randomly selected and to identify the strains that produced spores, an assay was conducted based on the different sensitivity of the vegetative cells with respect to the spores to heat treatment and based on the method described by Vilchez et al. (Vilchez et al. , 2008. Extremophiles, 12: 297-299). In this way independent colonies from TSA plates of at least 24 hours of growth were taken. These colonies were resuspended in 1 ml of M9 solution in sterile 1.5 ml microtubes. Then 10 µl of this suspension was seeded in TSA. The rest of the suspension was then incubated in Mixing Block MB-102 thermoblock at 72 ° C for 30 minutes. Again, 10 μl of each sample was taken and seeded on TSA plate. Those strains capable of tolerating heat treatment were considered sporulants, while those that did not tolerate heat treatment were considered non-sporulants. As positive and negative controls colonies of Bacillus pumilus and Burkholderia cepacia were used respectively. The proportion of sporulant strains went from levels below 40% for untreated samples to levels above 50% after 30 min of exposure of soil samples to chloroform.

Con el ﬁn de analizar la capacidad de tolerar la desecación de las cepas aisladas no esporulantes se realizó un estudio de desecación al aire. En este ensayo se incluyó una cepa de Acinetobacter calcoaceticus (PADD68) aislada del desierto de Tabernas (Almería) identiﬁcada como tolerante a la desecación en un estudio previo y que se utilizó como control positivo. Además también se incluyó en el estudio células de Pseudomonas putida KT2440 que se utilizaron como controles negativos al ser una cepa sensible a la desecación (Antheunisse et al., 1981. Antonie Leeuwnhoek, 47: 539-545; Manzanera et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68: 4328-4333). Para este ensayo se utilizaron colonias independientes de las 17 cepas identiﬁcadas como no esporulantes aisladas en el estudio anterior y procedentes de placas de TSA de 72 horas para calcular su nivel de tolerancia a la desecación tal y como se indica a continuación. In order to analyze the ability to tolerate desiccation of isolated non-sporulant strains, an air drying study was conducted. In this trial, a strain of Acinetobacter calcoaceticus (PADD68) isolated from the Tabernas desert (Almería) identified as tolerant to desiccation was included in a previous study and was used as a positive control. In addition, Pseudomonas putida KT2440 cells were also included in the study, which were used as negative controls as a strain sensitive to desiccation (Antheunisse et al., 1981. Antonie Leeuwnhoek, 47: 539-545; Manzanera et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68: 4328-4333). For this test, independent colonies of the 17 strains identified as non-sporulants isolated in the previous study and from 72-hour TSA plates were used to calculate their level of desiccation tolerance as indicated below.

Para calcular la tolerancia a la desecación se partió de colonias aisladas procedentes de placas de TSA de 48 horas de crecimiento. Utilizando un asa estéril se tomó una única colonia que se resuspendió en 1 ml de solución M9 estéril. Partiendo de esta suspensión celular se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placas de TSA con objeto de identiﬁcar el número de UFC/ml de partida. Por otra parte se tomaron 100 μl de cada suspensión y se depositaron en gotas de 5-10 μl sobre microplacas de petri estériles sin medio. Las microplacas se situaron bajo una corriente de aire estéril en una campana de ﬂujo laminar durante 24 horas. Las placas quedaron secas tras 2-3 horas de incubación. Transcurridas 24 horas de incubación se resuspendieron en 1 ml de solución M9 estéril. Partiendo de esta solución se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placas de TSA. Del recuento de UFC/ml de esta segunda siembra se calcularon las proporciones de supervivencia en referencia al primer conteo. Estos ensayos se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como la media de los tres ensayos en porcentaje, tomando como referencia del 100% los datos húmedos. La desviación estándar a la media permitió el cálculo de la T de student para estudiar si las diferencias en supervivencia fueron signiﬁcativas. Se aislaron 17 cepas en estas condiciones con niveles de tolerancia signiﬁcativamente superiores a los del control positivo Acinetobacter calcoaceticus (PADD68). Una de las cepas aisladas se nombró como 5J12A y pertenece al género Arthrobacter sp. Esta cepa se caracterizó mediante secuenciación del ADNr 16S y comparación de la secuencia con los presentes en la bases de datos, así como mediante estudios metabólicos BIOLOG e hibridación del ADN-ADN con la especie más cercana. La Fig. 1 muestra los valores de tolerancia de las cepas aisladas. To calculate the tolerance to desiccation, we started from isolated colonies from TSA plates with 48 hours of growth. Using a sterile handle, a single colony was taken and resuspended in 1 ml of sterile M9 solution. Starting from this cell suspension, serial dilutions were made that were seeded on TSA plates in order to identify the starting CFU / ml number. On the other hand, 100 μl of each suspension was taken and deposited in 5-10 μl drops on sterile petri dishes without medium. The microplates were placed under a stream of sterile air in a laminar flow hood for 24 hours. The plates remained dry after 2-3 hours of incubation. After 24 hours of incubation, they were resuspended in 1 ml of sterile M9 solution. Starting from this solution, serial dilutions were made and seeded on TSA plates. From the CFU / ml count of this second sowing, survival rates were calculated in reference to the first count. These tests were performed in triplicate. The results were expressed as the average of the three trials in percentage, using the wet data as a reference of 100%. The standard deviation to the mean allowed the calculation of the student's T to study if the differences in survival were significant. 17 strains were isolated under these conditions with tolerance levels significantly higher than those of the positive control Acinetobacter calcoaceticus (PADD68). One of the isolated strains was named as 5J12A and belongs to the genus Arthrobacter sp. This strain was characterized by sequencing the 16S rDNA and comparing the sequence with those present in the databases, as well as by BIOLOG metabolic studies and DNA-DNA hybridization with the nearest species. Fig. 1 shows the tolerance values of the isolated strains.

1.2. Extraction of products from bacterial milking

Para la extracción de los productos del ordeñado bacteriano y con el ﬁn de identiﬁcar las moléculas acumuladas con capacidad para proteger biomoléculas sensibles a la desecación se recurrió a una estrategia basada en tres pasos. En un primer paso se realizó una extracción de las moléculas acumuladas mediante una variación de la técnica conocida como “ordeñado bacteriano” generada por los inventores. En un segundo paso se realizó un ensayo de xeroprotección con las sustancias obtenidas para identiﬁcar la capacidad de las mismas para proteger enzimas frente a la desecación. For the extraction of the products from the bacterial milking and in order to identify the accumulated molecules with the capacity to protect biomolecules sensitive to desiccation, a three-step strategy was used. In a first step an extraction of the accumulated molecules was carried out by means of a variation of the technique known as "bacterial milking" generated by the inventors. In a second step, an xeroprotection test was carried out with the substances obtained to identify their capacity to protect enzymes against desiccation.

Dado que la producción y acúmulo de sustancias xeroprotectoras se realizó en medio con minerales, se procedió a identiﬁcar las fuentes de carbono más apropiadas para el cultivo de las cepas en medio mineral M9. Para la obtención de sustancias con capacidad xeroprotectora se cultivaron en medio mineral con la fuente de carbono apropiada (glucosa) las células de dicha cepa hasta la obtención de una biomasa suﬁciente. Tras este acúmulo, las células se depositaron sobre placas del mismo medio con agar para la producción de medio sólido. Entre las células y el medio se depositó un ﬁltro estéril de 0,4 micras para permitir el paso de nutrientes a las células y su posterior recogida y manipulación. Las placas con ﬁltros y células se sometieron a un secado por corriente de aire estéril durante 24 horas. Como control positivo se incluyó Halomononas elongata, dado que es una cepa reconocida como halotolerante (Sauer y Galinski, 1998. Biotechnol. Bioeng., 57: 306-313) ya P. putida KT2440 como cepa halosensible (De Castro et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol., 66:4142-4144). Since the production and accumulation of xeroprotective substances was carried out in a medium with minerals, we proceeded to identify the most appropriate carbon sources for the cultivation of the strains in M9 mineral medium. To obtain substances with xeroprotective capacity, the cells of said strain were cultured in a mineral medium with the appropriate carbon source (glucose) until obtaining a sufficient biomass. After this accumulation, the cells were deposited on plates of the same medium with agar for the production of solid medium. A sterile 0.4 micron filter was deposited between the cells and the medium to allow the passage of nutrients to the cells and their subsequent collection and handling. The ﬁ lter plates and cells were subjected to sterile air drying for 24 hours. Halomononas elongata was included as a positive control, since it is a strain recognized as a halotolerant (Sauer and Galinski, 1998. Biotechnol. Bioeng., 57: 306-313) and P. putida KT2440 as a halosensitive strain (De Castro et al., 2000 Appl. Environ. Microbiol., 66: 4142-4144).

Con este ﬁn se inoculó la cepa seleccionada (5J12A), hipertolerante a desecación. Además se incluyó a H. elongata como control positivo dado que ya había sido empleada por Sauer y Galinski para la obtención de hidroxiectoína, y como control negativo se incluyó E. coli como ejemplo de cepa halo y xerosensible. Dichos inóculos se incubaron en agitación durante 48 horas. A continuación, se centrifugaron las muestras durante 10 minutos a 10.000 rpm en una centrifuga Beckman Avanti-J25 y se retiró la fracción sobrenadante, resuspendiendo el sedimento bacteriano en 20 ml de solución M9 estéril y se depositaron sobre ﬁltros. Tras 24 horas, los ﬁltros, sometidos a desecación mediante una corriente de aire estéril, se separaron del medio y se depositaron en tubos con agua destilada estéril dejando incubar 20 minutos a 30ºC y 150 rpm. Consecutivamente se repitió el mismo proceso de centrifugado, se desechó el precipitado bacteriano y se ﬁltró el sobrenadante (utilizando un ﬁltro de 0,22 μm). El producto ﬁltrado de cada muestra se dividió en dos fracciones, una de las cuales se utilizó para determinar la actividad xeroprotectora del sobrenadante (fracción de ordeñado) y la otra para la identiﬁcación y caracterización de los compuestos presentes en esta fracción. Ambas fracciones se sometieron a un proceso de secado utilizando un lioﬁlizador (Labconco Freezone 6) durante 48 horas obteniéndose un sedimento que fue resuspendido en 100 μl de agua milliQ estéril. Una vez lioﬁlizado, el Producto de Ordeñado Bacteriano (POB), éste se solubilizó en 100 microlitros de agua. Estas soluciones de POBs se utilizaron en estudios de xeroprotección. For this purpose, the selected strain (5J12A), hypertolerant upon drying, was inoculated. In addition, H. elongata was included as a positive control since it had already been used by Sauer and Galinski to obtain hydroxyectoin, and as a negative control, E. coli was included as an example of a halo and xerosensitive strain. Said inoculums were incubated with shaking for 48 hours. The samples were then centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm in a Beckman Avanti-J25 centrifuge and the supernatant fraction was removed, the bacterial sediment was resuspended in 20 ml of sterile M9 solution and deposited on ﬁ lters. After 24 hours, the filters, subjected to desiccation by a stream of sterile air, were separated from the medium and deposited in tubes with sterile distilled water, allowing to incubate 20 minutes at 30 ° C and 150 rpm. Consecutively the same centrifugation process was repeated, the bacterial precipitate was discarded and the supernatant was filtered (using a 0.22 μm filter). The filtrate of each sample was divided into two fractions, one of which was used to determine the xeroprotective activity of the supernatant (milking fraction) and the other for the identification and characterization of the compounds present in this fraction. Both fractions were subjected to a drying process using a lyophilizer (Labconco Freezone 6) for 48 hours to obtain a sediment that was resuspended in 100 µl of sterile milliQ water. Once lyophilized, the Bacterial Milking Product (POB), it was solubilized in 100 microliters of water. These POB solutions were used in xeroprotection studies.

En la tabla 1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 5J12A tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico (5J12A), o tras su extracción por secado mediante incubación al aire (5J12AD). Table 1 shows the compositions of the bacterial milking products of strain 5J12A after extraction by hyper / hypoosmotic shock (5J12A), or after extraction by drying by air incubation (5J12AD).

TABLA 1 TABLE 1

Composición del producto de ordeñado bacteriano (POB) de la cepa 4J27 Composition of the bacterial milking product (POB) of strain 4J27

5J12A es la composición del POB de dicha cepa tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico. 5J12AD es la composición del POB de dicha cepa tras su extracción por secado mediante incubación al aire. 5J12A is the composition of the POB of said strain after its extraction by hyper / hypoosmotic shock. 5J12AD is the composition of the POB of said strain after extraction by drying by incubation in air.

Ejemplo 2 Example 2

Ensayo de xeroprotección de enzimas Enzyme Xeroprotection Assay

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frente a la desecación. Para ello se utilizó la enzima lipasa. Partiendo de 1 μl que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 μl de la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 μl de una solución al 10% de trehalosa a 1 μl (0,00554 U) de solución de lipasa y como control negativo se añadió 15 μl de agua a 1 μl (0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 μl con lipasa se depositaron en un microtubo de 2 ml de capacidad y se secaron a 50ºC durante 120 minutos. Una vez secas se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. Finalmente fueron almacenadas en un desecador a temperatura ambiente durante 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, las reacciones se resuspendieron en 50 μl de una solución de TrisHCl (50 mM) y se transﬁrieron a un microtubo junto con 950 μl de Tris HCl (50 mM) pH8 y 1 ml de Solución de Sustrato. La determinación de la capacidad xeroprotectora de cada fracción producto de ordeñado bacteriano (POB) se determinó por el ensayo de medición de la actividad lipasa. The objective of this test was to determine the ability of the bacterial milking product fraction to protect enzymes from drying out. For this, the enzyme lipase was used. Starting from 1 μl containing 0.00554 units of Burkholderia cepacia lipase (Sigma-Aldrich 62309-100 mg), 15 μl of the product fraction of the bacterial milking to be studied were added. As a positive control, 15 µl of a 10% solution of trehalose was added to 1 µl (0.00554 U) of lipase solution and as a negative control 15 µl of water was added to 1 µl (0.00554 U) of a solution of lipase The 16 µl mixtures with lipase were deposited in a 2 ml capacity microtube and dried at 50 ° C for 120 minutes. Once dried, they were incubated at 100 ° C for 5 minutes. They were finally stored in a desiccator at room temperature for 24 hours. After the incubation time, the reactions were resuspended in 50 μl of a solution of TrisHCl (50 mM) and transferred to a microtube together with 950 μl of Tris HCl (50 mM) pH8 and 1 ml of Substrate Solution. The xeroprotective capacity determination of each bacterial milking product fraction (POB) was determined by the lipase activity measurement test.

Para la medida de la actividad lipasa se utilizó una variación del método descrito por Gupta y colaboradores (2002) consistente en la cuantiﬁcación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzima lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) a partir del sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). Para ello se utilizó 1 ml de medio libre de células (985 μl de Tris-HCl 0,05 M junto a15 μl de POB obtenido por el método del “ordeñado bacteriano”) mezclado con 1 ml de solución sustrato de un cultivo en fase estacionaria. Esta mezcla de ensayo se incubó a 30ºC durante 30 minutos en microtubos estériles de 2 ml. La reacción se paró mediante incubación a 100ºC durante 4 minutos en termobloque y 2 minutos a -20ºC. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro Hitachi U-2000 a una longitud de onda de 410 nm. La solución sustrato (SS) se preparó mezclando 10 ml de solución A (30 mg de pNPP en 10 ml de isopropanol) con 90 ml de solución B (0,1 g de goma arábiga y 0,4 ml de Tritón X-100 en 90 ml tampón Tris-HCl 50 mM pH8). La mezcla de solución A y B se agitó suavemente hasta su total disolución. La Fig. 2 muestra los valores de protección de la enzima lipasa al secado generados por los POBs y POBSIAs producidos por la cepa. For the measurement of lipase activity, a variation of the method described by Gupta et al. (2002) was used, consisting of the spectrophotometric quantification of p-nitrophenol released by the lipase enzyme from Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) from p-nitrophenol palmitate (pNPP) substrate (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311: 98-99). For this, 1 ml of cell-free medium (985 μl of 0.05 M Tris-HCl was used together with 15 μl of POB obtained by the method of “bacterial milking”) mixed with 1 ml of substrate solution of a stationary phase culture . This test mixture was incubated at 30 ° C for 30 minutes in sterile 2 ml microtubes. The reaction was stopped by incubation at 100 ° C for 4 minutes in thermoblock and 2 minutes at -20 ° C. The absorbance was measured on a Hitachi U-2000 spectrophotometer at a wavelength of 410 nm. The substrate solution (SS) was prepared by mixing 10 ml of solution A (30 mg of pNPP in 10 ml of isopropanol) with 90 ml of solution B (0.1 g of gum arabic and 0.4 ml of Triton X-100 in 90 ml 50 mM Tris-HCl buffer pH8). The mixture of solution A and B was gently stirred until completely dissolved. Fig. 2 shows the protection values of the lipase enzyme on drying generated by the POBs and POBSIAs produced by the strain.

Ejemplo 3 Example 3

Ensayo del aumento de la tolerancia al estrés hídrico de plantas Test of increased tolerance to plant water stress

Se estudió la capacidad que tenía la cepa 5J12A sobre las plantas para protegerlas frente a condiciones de sequía y/o de promocionar el crecimiento de las mismas. En esta primera fase de experimentación, se utilizaron plantas de pimiento dulce (Capsicum annuum). The capacity of strain 5J12A on plants to protect them against drought conditions and / or promote their growth was studied. In this first phase of experimentation, sweet pepper plants (Capsicum annuum) were used.

14 días después de la germinación de las semillas de dichas plantas, se cesó el riego de todas las macetas para comenzar a provocar condiciones de estrés por sequía en las plantas considerando este momento como el tiempo 0. A partir de este momento se tomaron muestras a los 7, 14, 20 y 33 días, mediante la toma de tres plantas inoculadas con la cepa bacteriana Arthrobacter sp. 5J12A. Como control positivo se utilizaron plantas inoculadas con la rizobacteria 14 days after the germination of the seeds of these plants, the irrigation of all the pots was stopped to begin to cause drought stress conditions in the plants considering this moment as time 0. From this moment samples were taken at 7, 14, 20 and 33 days, by taking three plants inoculated with the bacterial strain Arthrobacter sp. 5J12A. As a positive control, plants inoculated with rhizobacteria were used

P. putida KT2440 y como control negativo se utilizaron plantas a las que se añadió el volumen equivalente de inoculo en forma de agua y por tanto, no inoculadas. En cada extracción se procedió a la toma de parámetros de Peso Fresco (PF) como el peso de la planta recién extraída; Peso Totalmente Túrgido (PTT) como el peso de la planta después de 48 horas incubada en oscuridad y a una humedad del 100% justo después de su extracción; Peso Seco (PS) como el peso después de incubar la planta durante 48 horas a 75-80ºC y el Contenido Relativo de Agua (CRA) deﬁnido a través de la ecuación CRA=(PF-PS)/(PTT-PS). Los datos obtenidos se desglosan a continuación. En general, transcurridos 33 días en ausencia de riego las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A toleraron mejor la sequía mostrando una mejor apariencia y tamaño que las plantas inoculadas con P. putida KT2440 o que las plantas no inoculadas como se puede observar en la Fig. 3. P. putida KT2440 and as a negative control plants were used to which the equivalent volume of inoculum was added in the form of water and therefore, not inoculated. In each extraction the Fresh Weight (PF) parameters were taken as the weight of the newly extracted plant; Totally Turbid Weight (PTT) as the weight of the plant after 48 hours incubated in darkness and at a humidity of 100% right after its extraction; Dry Weight (PS) as the weight after incubating the plant for 48 hours at 75-80 ° C and the Relative Water Content (CRA) defined through the equation CRA = (PF-PS) / (PTT-PS). The data obtained are broken down below. In general, after 33 days in the absence of irrigation the plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A tolerated drought better by showing a better appearance and size than plants inoculated with P. putida KT2440 or than non-inoculated plants as can be seen in Fig. 3.

Así, el Contenido Relativo de Agua (CRA) de las plantas de estudio, fue el valor numérico que indicó el grado de resistencia al estrés por sequía que tienen las plantas con sus respectivos tratamientos. Aunque también se llevaron a cabo otros cálculos con los parámetros tomados inicialmente para estudiar todos los aspectos que reﬂejaron de los efectos de la escasez de agua para las plantas. Así, se obtuvo el índice de Retención de Agua (IRA) determinado como la diferencia entre el Peso Fresco (PF) y el Peso Seco (PS) así como el Potencial de Recuperación de Agua (PRA) por las plantas dada por la diferencia entre el Peso Totalmente Túrgido (PTT) y el Peso Fresco (PF). Thus, the Relative Water Content (ARC) of the study plants was the numerical value that indicated the degree of resistance to drought stress that the plants have with their respective treatments. Although other calculations were also carried out with the parameters initially taken to study all aspects that reflected the effects of water scarcity for plants. Thus, the Water Retention Index (IRA) determined as the difference between the Fresh Weight (PF) and Dry Weight (PS) as well as the Water Recovery Potential (PRA) for the plants given by the difference between Totally Turgid Weight (PTT) and Fresh Weight (PF).

Como se puede observar en la Fig. 4 el Peso Fresco (PF) de las plantas inoculadas con cada una de las cepas, sufrió un incremento regular en todas las condiciones durante los primeros puntos de muestreo correspondientes a los días 7 y 20. En las muestras tomadas el día 33 únicamente las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A mostraron un peso fresco superior al registrado el día 20. Así, en las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A, sus valores de PF fueron tres veces mayores de los obtenidos en las plantas inoculadas con P. putida KT2440 y a los de las plantas no inoculadas. As can be seen in Fig. 4, the Fresh Weight (PF) of the plants inoculated with each of the strains, underwent a regular increase in all conditions during the first sampling points corresponding to days 7 and 20. In the samples taken on day 33 only plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A showed a fresh weight greater than that recorded on day 20. Thus, in plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A, its PF values were three times higher than those obtained in plants inoculated with P. putida KT2440 and those of non-inoculated plants.

Análogamente se midió el Peso Seco (PS) de las plantas a los días 7, 14, 20 y 33 después de cesar el riego. El PS de las distintas plantas fue muy inferior al PF, con valores siempre por debajo de 12 mg. Como se observa en la Fig. 5, el peso seco de las distintas plantas inoculadas aumentó ligeramente de forma más o menos regular en todas las condiciones durante los primeros puntos de muestreo. Nuevamente las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A mostraron los valores, en el día 33, sensiblemente superiores a los de las plantas inoculadas con P. putida y llegaron casi a doblar a los de las plantas no inoculadas. Similarly, the Dry Weight (PS) of the plants was measured on days 7, 14, 20 and 33 after the irrigation ceased. The PS of the different plants was much lower than the PF, with values always below 12 mg. As observed in Fig. 5, the dry weight of the different inoculated plants increased slightly more or less regularly in all conditions during the first sampling points. Again the plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A showed the values, on day 33, significantly higher than those of plants inoculated with P. putida and almost doubled those of non-inoculated plants.

Un dato más representativo para conocer el estado de estrés hídrico de las plantas es el Contenido Relativo de Agua (CRA), dado que indica la relación entre el agua presente en las plantas en el momento de la extracción respecto del agua total. De esta forma, el valor máximo de 1 se daría en la situación teórica en que por su buen estado hídrico, la planta no pudiera o no necesitara recuperar agua en su estado totalmente túrgido (PTT) con respecto al Peso Fresco (PF). A more representative data to know the state of water stress of plants is the Relative Water Content (CRA), since it indicates the relationship between the water present in the plants at the time of extraction with respect to the total water. In this way, the maximum value of 1 would be given in the theoretical situation where, due to its good water state, the plant could not or would not need to recover water in its totally turgid state (PTT) with respect to the Fresh Weight (PF).

En general se observa que para el punto de muestreo del día 14, en todas las plantas inoculadas, salvo en las no inoculadas, el parámetro CRA descendió aunque de manera leve respecto al valor que se registró en el día 7 aunque este parámetro volvió a aumentar entre los días 14 y 20. Respecto a las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A, el valor de CRA entre el día 7 y el 14 se redujo muy levemente, siendo proporcional su aumento entre los días 14 y In general, it is observed that for the sampling point on day 14, in all the inoculated plants, except for those not inoculated, the CRA parameter decreased although slightly compared to the value recorded on day 7 although this parameter increased again between days 14 and 20. Regarding plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A, the value of CRA between day 7 and 14 was reduced very slightly, its increase being proportional between days 14 and

20. Para las plantas inoculadas con P. putida KT2440, el valor de CRA se redujo levemente entre los días 14 y 20 (menos del 5%) y aumentó algo más del 5% entre los días 20 y 33. Para las plantas no inoculadas, el valor de CRA se redujo en torno muy levemente entre los días 14 y 20, y se mantuvo prácticamente estable entre los días 20 y 33. Sin embargo al día 33, el valor de CRA en las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A mostró una tendencia a seguir aumentando, aunque muy levemente con valores en torno a 0,95. Los resultados pueden observarse en la Fig. 7. 20. For plants inoculated with P. putida KT2440, the CRA value was slightly reduced between days 14 and 20 (less than 5%) and increased slightly more than 5% between days 20 and 33. For non-inoculated plants , the value of CRA decreased around very slightly between days 14 and 20, and remained practically stable between days 20 and 33. However, at day 33, the value of CRA in plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A showed a tendency to continue increasing, although very slightly with values around 0.95. The results can be seen in Fig. 7.

Para poder cuantiﬁcar el índice de retención de agua estructural (IRA) en las distintas plantas, se calculó la diferencia entre PF y PS, aunque este valor no sea tan representativo como el CRA, también permite conocer el estado hídrico de las plantas. Así, como puede observarse en la Fig. 8, los valores más altos se dieron en las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A. Para las plantas inoculadas con P. putida KT2440 y las plantas no inoculadas, también se observó un marcado descenso tras el día 20, llegando a tener el día 33 cerca de la mitad del valor que tenían en el día In order to quantify the structural water retention index (ARI) in the different plants, the difference between PF and PS was calculated, although this value is not as representative as the CRA, it also allows to know the water status of the plants. Thus, as can be seen in Fig. 8, the highest values were in plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A. For the plants inoculated with P. putida KT2440 and the non-inoculated plants, a marked decrease was also observed after day 20, having on day 33 about half of the value they had on the day

20. twenty.

De esta forma, los valores de IRA de las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A en el día 33 de muestreo llegaron a cuadruplicar a los de las plantas inoculadas con P. putida, así como el de las plantas no inoculadas. In this way, the ARI values of the plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A on day 33 of sampling they quadrupled those of the plants inoculated with P. putida, as well as that of the non-inoculated plants.

Ejemplo 4 Example 4

Ensayo del aumento de la biomasa de las plantas inoculadas con Arthrobacter sp 5J12A en condiciones de estrés hídrico Test of the increase in biomass of plants inoculated with Arthrobacter sp 5J12A under conditions of water stress

Con objeto de identiﬁcar si la cepa bacteriana 5J12A tenía algún tipo de efecto promotor de crecimiento sobre las plantas en condiciones de estrés hídrico, se decidió cuantiﬁcar la longitud de las plantas y de sus raíces. In order to identify whether the bacterial strain 5J12A had some kind of growth promoting effect on plants under conditions of water stress, it was decided to quantify the length of the plants and their roots.

Así, para los datos de altura se tomó como medida la longitud en cm desde la base blanquecina de tallo o el punto donde se encontraran las primeras raíces, hasta el plano horizontal formado por el primer par de hojas (hojas seminales). Para las raíces se tomó como medida la longitud en cm desde la base blanquecina de tallo o el punto donde se encontraran las primeras raíces, hasta la punta del ápice radical más largo sin forzar el estiramiento del mismo. Thus, for the height data, the length in cm was taken from the whitish stem base or the point where the first roots were found, to the horizontal plane formed by the first pair of leaves (seminal leaves). For the roots, the length in cm was taken from the whitish stem base or the point where the first roots were found, to the tip of the longest radical apex without forcing the same.

Para el tratamiento de los datos de altura de las plantas, se optó por calcular la diferencia de altura respecto a un punto inicial (tiempo 0). Estos aumentos de altura de las plantas se realizaron en cada punto de muestreo en el momento de la extracción de las mismas a la vez que se tomaba el peso fresco y comparando la altura en ese punto de muestreo con la altura inicial de la planta. For the treatment of plant height data, we chose to calculate the difference in height from an initial point (time 0). These increases in plant height were made at each sampling point at the time of their extraction at the same time as the fresh weight was taken and comparing the height at that sampling point with the initial height of the plant.

En la Fig. 9 se puede observar cómo, en las condiciones de déﬁcit hídrico, las plantas inoculadas alcanzaron mayor altura que las plantas no inoculadas. Las plantas inoculadas con Arthrobacter sp 5J12A crecieron de forma sostenida incluso hasta 33 días tras iniciar el proceso de déﬁcit hídrico, caso que no se observó en las plantas inoculadas con In Fig. 9 it can be seen how, under the conditions of water deficit, the inoculated plants reached a greater height than the non-inoculated plants. Plants inoculated with Arthrobacter sp 5J12A grew steadily even up to 33 days after starting the water deficit process, which was not observed in plants inoculated with

P. putida así como en las plantas no inoculadas. En estos últimos casos se pudo observar que tanto en las plantas inoculadas con P. putida KT2440 como en las plantas no inoculadas el crecimiento fue muy reducido e incluso se redujo en el último punto de muestreo (día 33). P. putida as well as in non-inoculated plants. In the latter cases, it was observed that in both the plants inoculated with P. putida KT2440 and in the non-inoculated plants the growth was very reduced and even reduced at the last sampling point (day 33).

Para el tratamiento de los datos de longitud de las raíces, se optó por la medida de las longitudes de las raíces de cada planta inoculada en los puntos de muestreo de los días 7, 14, 20 y 33. La medida se realizó como en el caso de la altura de las plantas en el momento de la extracción de las plantas para la medida del peso fresco. Los datos obtenidos se muestran en la Fig. 10. La longitud de las raíces de las plantas inoculadas con Arthrobacter sp 5J12A aumentó hasta el último punto (día 33), mientras que en las plantas inoculadas con la cepa P. putida y en las plantas no inoculadas, el crecimiento incluso se redujo en este mismo punto de muestreo. For the treatment of root length data, we chose the measurement of the root lengths of each plant inoculated at the sampling points on days 7, 14, 20 and 33. The measurement was performed as in the case of the height of the plants at the time of the extraction of the plants for the measurement of the fresh weight. The data obtained are shown in Fig. 10. The root length of the plants inoculated with Arthrobacter sp 5J12A increased to the last point (day 33), while in the plants inoculated with the P. putida strain and in the plants not inoculated, growth even declined at this same sampling point.

Ejemplo 5 Example 5

Ensayo del aumento del potencial de recuperación de agua de las plantas inoculadas con Arthrobacter sp 5J12A en condiciones hídricas óptimas Test of the increased water recovery potential of plants inoculated with Arthrobacter sp 5J12A under optimal water conditions

En este ensayo se aplicó la misma metodología empleada con los anteriores con la excepción de que el riego se mantuvo periódicamente (40 ml cada 48-72 horas) desde t=0, en el cual se dejaba de regar para provocar condiciones de estrés hídrico. A partir de este momento se tomaron muestras a los 7, 14, 20 y 33 días, mediante la toma de tres plantas inoculadas con la cepa bacteriana Arthrobacter sp 5J12A. Como control positivo se utilizaron plantas inoculadas con la rizobacteria P. putida KT2440 y como control negativo se utilizaron plantas a las que se añadió el volumen equivalente de inoculo en forma de agua y por tanto, no inoculadas. In this trial the same methodology used with the previous ones was applied with the exception that irrigation was maintained periodically (40 ml every 48-72 hours) from t = 0, in which it was stopped watering to cause water stress conditions. From this moment, samples were taken at 7, 14, 20 and 33 days, by taking three plants inoculated with the bacterial strain Arthrobacter sp 5J12A. As a positive control, plants inoculated with the rhizobacterium P. putida KT2440 were used and as a negative control plants were used to which the equivalent volume of inoculum was added as water and therefore not inoculated.

Para conocer si el aumento de PTT (el agua recuperada por las plantas) en las plantas fue equivalente en todas To know if the increase in PTT (water recovered by plants) in plants was equivalent in all

o si se presentaron diferencias dependiendo de con qué cepa fueran inoculadas, decidimos estudiar el potencial de recuperación de agua (PRA) como la diferencia entre PTT y PF. or if there were differences depending on which strain they were inoculated with, we decided to study the water recovery potential (PRA) as the difference between PTT and PF.

Los resultados indicados en la Fig. 11 muestran que en el día 33 del ensayo el PRA era mayor para las plantas inoculadas con P. putida y para las plantas no inoculadas, que para las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A. Sin embargo se ha de destacar que el valor más alto para el día 7 correspondió a las plantas inoculadas con Arthrobacter sp. 5J12A, a partir del cual comenzó a reducirse hasta el día 33; el resto de las plantas mantuvieron sus valores muy próximos entre los días 7 y 20, para reducirse torno a la mitad en el día 33, salvo en el caso de las plantas no inoculadas en las que se redujo en torno a 1,5 veces. The results indicated in Fig. 11 show that on day 33 of the test the PRA was higher for plants inoculated with P. putida and for non-inoculated plants, than for plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A. However, it should be noted that the highest value for day 7 corresponded to the plants inoculated with Arthrobacter sp. 5J12A, from which it began to reduce until day 33; the rest of the plants kept their values very close between days 7 and 20, to be reduced by about half on day 33, except in the case of non-inoculated plants in which it was reduced by around 1.5 times.

Claims

1. one.: Microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7626. Microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7626.

2. 2.: Población bacteriana que comprende el microorganismo según la reivindicación 1. Bacterial population comprising the microorganism according to claim 1.

3. 3.: Uso del microorganismo según la reivindicación1odela población bacteriana según la reivindicación 2 para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta, respecto de un control. Use of the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 to increase the tolerance to water stress of a plant, with respect to a control.

4. Four.: Uso del microorganismo según la reivindicación1odela población bacteriana según la reivindicación 2 para aumentar la biomasa de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. Use of the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 to increase the biomass of a plant, with respect to a control, under conditions of water stress.

5. 5.: Uso del microorganismo según la reivindicación1odela población bacteriana según la reivindicación 2 para aumentar la cantidad de agua absorbida por una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. Use of the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 to increase the amount of water absorbed by a plant, with respect to a control, under conditions of water stress.

6. 6.: Uso del microorganismo según la reivindicación1odela población bacteriana según la reivindicación 2 para aumentar índice de retención de agua de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. Use of the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 to increase the water retention rate of a plant, with respect to a control, under conditions of water stress.

7. 7.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones3a6, donde la planta es del género Capsicum. Use according to any of claims 3 to 6, wherein the plant is of the genus Capsicum.

8. 8.: Uso según la reivindicación 7, donde la planta es de la especie Capsicum anriuum. Use according to claim 7, wherein the plant is of the species Capsicum anriuum.

9. 9.: Método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta respecto de un control, que comprende inocular el microorganismo según la reivindicación 1 o la población bacteriana según la reivindicación 2 a una célula vegetal, a cualquier parte de una planta o a una semilla. Method for increasing the tolerance to water stress of a plant with respect to a control, which comprises inoculating the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 to a plant cell, to any part of a plant or to a seed.

10. 10.: Método según la reivindicación 9, donde el microorganismo según la reivindicación1ola población bacteriana según la reivindicación 2 se pone en contacto con al menos una raíz de dicha planta. Method according to claim 9, wherein the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 is contacted with at least one root of said plant.

11. eleven.: Método según la reivindicación 10, donde dicho microorganismo o población bacteriana se ponen en contacto con al menos una raíz por medio de una solución acuosa. Method according to claim 10, wherein said microorganism or bacterial population is contacted with at least one root by means of an aqueous solution.

12. 12.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde la planta es del género Capsicum. Method according to any of claims 9 to 11, wherein the plant is of the genus Capsicum.

13. 13.: Método según la reivindicación 12, donde la planta es de la especie Capsicum annuum. Method according to claim 12, wherein the plant is of the Capsicum annuum species.

14. 14.: Uso del microorganismo según la reivindicación 1 o de la población bacteriana según la reivindicación 2 para la producción de una composición xeroprotectora. Use of the microorganism according to claim 1 or the bacterial population according to claim 2 for the production of an xeroprotective composition.

15. fifteen.: Composición xeroprotectora producida por el microorganismo según la reivindicación 1 o por la población bacteriana según la reivindicación 2. Xeroprotective composition produced by the microorganism according to claim 1 or by the bacterial population according to claim 2.

16. Composition according to claim 15 comprising glucose, acetate, lactate and valine.

17. 17.: Composición según la reivindicación 16 que comprende una proporción de glucosa: acetato: lactato: valina, de entre (0,5 y 1,5): (0,05 y 0,35): (0,1 y 0,4): (0,02 y 0,6), respectivamente. Composition according to claim 16 comprising a proportion of glucose: acetate: lactate: valine, between (0.5 and 1.5): (0.05 and 0.35): (0.1 and 0.4): (0.02 and 0.6), respectively.

18. 18.: Composición según la reivindicación 17, donde la proporción de glucosa: acetato: lactato: valina, es de entre (0,7 y 1,3): (0,07 y 0,30): (0,12 y 0,35): (0,04 y 0,5), respectivamente. Composition according to claim 17, wherein the ratio of glucose: acetate: lactate: valine, is between (0.7 and 1.3): (0.07 and 0.30): (0.12 and 0.35) : (0,04 and 0,5), respectively.

19. 19.: Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%. Use of the composition according to any of claims 15 to 18 for the conservation of biological material with a residual moisture content equal to or less than 10%.

20. twenty.: Uso según la reivindicación 19, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula. Use according to claim 19, wherein the biological material is an invertebrate organism, a seed, a seedling, a microorganism, an isolated organ, an isolated biological tissue or a cell.

21. twenty-one.: Uso según la reivindicación 19, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. Use according to claim 19, wherein the biological material is a molecule with biological activity.

22. 22: Uso según la reivindicación 21, donde la molécula con actividad biológica es una enzima. Use according to claim 21, wherein the molecule with biological activity is an enzyme.

23. 2. 3.: Uso según la reivindicación 22, donde la enzima es una lipasa. Use according to claim 22, wherein the enzyme is a lipase.

24. Method for obtaining the xeroprotective composition according to any of claims 15 to 18 comprising:

a) culturing the microorganism of claim 1 or the population of claim 2 in a mineral medium with glucose as a carbon source,

b) dehydrate the microorganisms obtained in the culture of step (a) until they have a residual humidity equal to or less than 10%,

c) rehydrate the dehydrated microorganisms of step (b) in a hypotonic medium, and

d) select the liquid fraction of the product obtained in step (c) comprising the xeroprotective composition.

25. 25.: Método según la reivindicación 24, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Method according to claim 24, wherein the dehydration of the microorganisms according to step (b) is carried out by means of a hypertonic solution or by means of an air current.

26. 26.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según el paso (c) es agua parcial o totalmente destilada, desionizada o desmineralizada. Method according to any of claims 24 or 25, wherein the hypotonic means for rehydration of the microorganisms according to step (c) is water partially or totally distilled, deionized or demineralized.

27. 27.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%. Method according to any of claims 24 to 26, wherein, in addition, the liquid fraction of step (d) is dehydrated until the xeroprotector product has a residual humidity equal to or less than 10%.

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

Application no .: 200931118

SPAIN

Date of submission of the application: 04.12.2009

Priority Date:

REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

51 Int. Cl.: C12N1 / 20 (2006.01) C12R1 / 06 (2006.01)

RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: Documentos citados Reivindicaciones afectadas Documents cited Claims Affected

A TO: BOYLEN, C.W. Survival of Arthrobacter crystallopoietes during prolonged periods of extreme desiccation. 1973. Journal of Bacteriology. Vol. 113, No. 1, páginas 33-37. 1-27 BOYLEN, C.W. Survival of Arthrobacter crystallopoietes during prolonged periods of extreme desiccation. 1973. Journal of Bacteriology. Vol. 113, No. 1, pages 33-37. 1-27

A TO: MONGODIN, E.F. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1. 2006. Plos Genetics. Vol. 2, No. 12, páginas 2094-2106. 1-27 MONGODIN, E.F. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1. 2006. Plos Genetics. Vol. 2, No. 12, pages 2094-2106. 1-27

A TO: OVERHAGE, J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate. 2005. Microbiology. Vol. 151, páginas 491-500. 1-27 OVERHAGE, J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate. 2005. Microbiology. Vol. 151, pages 491-500. 1-27

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 23.05.2011 Date of realization of the report 23.05.2011: Examinador I. Rueda Molins Página 1/4 Examiner I. Rueda Molins Page 1/4

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 200931118

Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols) C12N, C12R Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, terms of

search used) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

State of the Art Report Page 2/4

WRITTEN OPINION

Application number: 200931118

Date of Completion of Written Opinion: 05.23.2011

Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 1-27 SI NO Claims Claims 1-27 IF NOT

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 1-27 SI NO Claims Claims 1-27 IF NOT

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

State of the Art Report Page 3/4

WRITTEN OPINION

Application number: 200931118

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: BOYLEN, C.W. Survival of Arthrobacter crystallopoietes during prolonged periods of extreme desiccation. Journal of Bacteriology. Vol. 113, No. 1, páginas 33-37. 1973 BOYLEN, C.W. Survival of Arthrobacter crystallopoietes during prolonged periods of extreme desiccation. Journal of Bacteriology. Vol. 113, No. 1, pages 33-37. 1973

D02 D02: MONGODIN, E.F. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1.Plos Genetics.Vol.2, No. 12, páginas 2094-2106. 2006 MONGODIN, E.F. Secrets of soil survival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1.Plos Genetics. Vol. 2, No. 12, pages 2094-2106. 2006

D03 D03: OVERHAGE, J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate.Microbiology. Vol. 151, páginas 491-500. 2005 OVERHAGE, J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate.Microbiology. Vol. 151, pages 491-500. 2005

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

The patent application discloses a microorganism of the bacterial species Arthrobacter sp. with access number CECT7626 that is tolerant to desiccation.

Documents D01, D02 and D03 disclose species of the genus Arthrobacter sp. that show tolerance against drying conditions.

None of the cited documents reflects in detail the characteristics of the bacterial species Arthrobacter sp. used, therefore, it cannot be said that these have similar characteristics to those presented by Arthrobacter sp. with access number CECT7626. Therefore, claims 1-27 present novelty and inventive activity as set forth in Articles 6 and 8 LP11 / 1986.

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