ES2381109T3 - Ratón transgénico que tiene un fenotipo de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, usos experimentales y aplicaciones - Google Patents

Ratón transgénico que tiene un fenotipo de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, usos experimentales y aplicaciones Download PDF

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Abstract

Ratón transgénico que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y de H2 clase II, que comprende un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, en el que dicho transgén de HLA-A2 es una monocadena que comprende la beta 2 microglobulina humana enlazada covalentemente a la cadena pesada de HLA-A

Description

Ratón transgénico que tiene un fenotipo de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, usos experimentales y aplicaciones.
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud se basa en y reivindica los derechos de la Solicitud Provisional US nº 60/490.945, presentada el 30 de julio de 2003 (número de expediente 03495.6093), sobre la que se basa toda la descripción.
Antecedentes de la invención
Actualmente se están desarrollando muchas vacunas para inmunoterapia contra el cáncer humano y para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tales como malaria, SIDA, virus de la hepatitis C, y SARS. Dada la rapidez con la que pueden aparecer nuevos patógenos emergentes, es importante mejorar modelos de animales que se pudiesen usar para evaluar rápidamente y de forma fiable las estrategias de vacunación y la capacidad protectora de diferentes epítopos. Además, ya se necesitan estudios in vivo para evaluar variables cruciales del comportamiento de las vacunas que no se evalúan fácilmente o son imposibles de medir in vitro, tales como la inmunogenicidad de las vacunas, la formulación de las vacunas, la vía de administración, la distribución tisular, y la implicación de órganos linfoides primarios y secundarios. Debido a su simplicidad y flexibilidad, los pequeños animales, tales como los ratones, representan una alternativa atractiva a sistemas de modelos más farragosos y caros, tales como primates no humanos, al menos para estudios de desarrollo de vacunas iniciales.
La eficacia moderada observada en varios ensayos clínicos de vacunas, que se encontró que eran protectoras en estudios de animales de tipo salvaje (McMichael, A.J. y Hanke, T. Nat Med 9, 874-880 (2003)), se puede explicar parcialmente por la diferente influencia que el MHC humano y animal tiene sobre el resultado de la respuesta inmunitaria, puesto que las moléculas de MHC animal y HLA humano no presentan los mismos epítopos óptimos (Rotzschke, O. et al. Nature 348, 252-254 (1990)). De este modo, a pesar de algunas limitaciones, los ratones transgénicos que expresan HLA humano deberían representar una mejora útil con respecto a ratones de tipo salvaje como un modelo preclínico para ensayar candidatos de vacunas, evaluar el riesgo potencial de que las vacunas puedan inducir trastornos autoinmunitarios, y diseñar mejores estrategias terapéuticas basándose en el elemento de restricción humano.
Células T citotóxicas
Las células T citotóxicas (CTL) desempeñan un papel crucial en la erradicación de enfermedades infecciosas y, en algunos casos, cáncer (P. Aichele, H. Hengartner, R.M. Zinkernagel y M. Schulz, J Exp Med 171 (1990), p. 1815; L. BenMohamed, H. Gras-Masse, A. Tartar, P. Daubersies, K Brahimi, M. Bossus, A. Thomas y P. Druhile, Eur J Immunol 27 (1997), p. 1242; D.J. Diamond, J. York, J. Sun, C.L. Wright y S.J. Forman, Blood 90 (1997), p. 1751). Las vacunas de proteínas recombinantes no inducen respuestas de CTL de forma fiable (Habeshaw JA, Dalgleish AG, Bountiff L, Newell AL, Wilks, D, Walker LC, Manca F. 1990 noviembre; 11(11): 418-25; Miller SB, Tse H, Rosenspire AJ, King SR. Virology. 1992 diciembre; 191 (2):9 73-7). El uso de vacunas de otro modo inmunógenas, que consisten en patógenos atenuados, en seres humanos, está impedido en varias enfermedades importantes, por problemas de seguridad primordiales. En los últimos años recientes, se han propuesto enfoques a base de epítopos como una posible estrategia para desarrollar nuevas vacunas profilácticas e inmunoterapéuticas (Melief CJ, Offringa R, Toes RE, Kast WM. Curr Opin Immunol. 1996 Oct, 8(5):651-7; Chesnut RW, Design testing of peptide based cytotoxic T-cell mediated immunotherapeutic to treat infiction disease, cancer, en Ppowell, MF, Newman, MJ (eds.): Vaccine Design: The Subunit, Adjuvant Approach, Plenum Press, Nueva York 1995, 847). Este enfoque ofrece varias ventajas, incluyendo la selección de epítopos procesados de forma natural, que fuerza al sistema inmunitario a enfocarse en epítopos de un patógeno muy conservados e inmunodominantes (R.G. van der Most, A. Sette, C. Oseroff, J. Alexander, K. Murali-Krishna, L.L. Lau, S, Southwood, J. Sidney, R.W. Chesnut, M. Matioubian y R. Ahmed, J Immunol 157 (1996), p. 5543) y la inducción de respuestas multiepitópicas para evitar el escape mediante mutación, tal como se observa en infecciones por VIH, virus de la hepatitis B (HBV) y virus de la hepatitis C (HCV). Esto permite la eliminación de determinantes de células T supresoras, que pueden provocar preferentemente una respuesta TH2, en condiciones en las que es deseable una respuesta TH1, o viceversa (Pfeiffer C, Murray J, Madri J, Bottomly K. Immunol Rev. 1991 octubre;123:65-84; P Chaturvedi, Q Yu, S Southwood, A Sette, y B Singh Int Immunol 1996 8: 745-755). Finalmente, proporciona la posibilidad de librarse de determinantes de células T autoinmunes en antígenos, lo que puede inducir enfermedades autoinmunitarias indeseables. La inmunidad antiviral
o antitumoral protectora usando péptidos de epítopos de CTL se ha logrado en varios modelos experimentales (D.J. Diamond, J. York, J. Sun, C.L. Wright y S.J. Forman, Blood 90 1997, p. 1751; J.E.J. Blaney, E. Nobusawa, M.A. Brehm, R.H. Bonneau, L.M. Mylin, T.M. Fu, Y. Kawaoka y S.S. Tevethia, J Virol 72 (1998), p. 9567).
La definición de epítopo de CTL basándose en el uso de linfocitos humanos puede ser engañosa debido a heterogeneidad medioambiental y genética que conduce a resultados incompletos, y debido a dificultades técnicas en el aislamiento de clones de CTL. Los ratones transgénicos de HLA clase I o clase II descritos hasta la fecha han demostrado ser una herramienta valiosa para superar estas limitaciones, como se ilustra mediante la identificación
con tales modelos de animales de nuevos epítopos de CTL y T auxiliares (Hill AV. Annu Rev Immunol. 1998;16:593617; Carmon L, EI-Shami KM, Paz A., Pascolo S, Tzehoval E, Tirosb B, Koren R, Feldman M, Fridkin M, Lemonnier FA, Eisenbach L. Int J Cancer, 1 febrero de 2000;85(3):391-7). Estos ratones también se han usado para demostrar: i) una buena correlación entre la afinidad de unión de HLA peptídico y la inmunogenicidad (Lustgarten J, Theobald M, Labadie C, LaFace D, Peterson P, Disis ML, Cheaver MA, Sherman LA. Hum Immunol. 1997 febrero;52(2):10918; Bakker AB, van der Burg SH, Huijbens RJ, DRijfhout JW, Melief CJ, Adema GJ, Figdor CG. Int J Cancer. 27 de enero de 1997;70(3):302-9), ii) el solapamiento significativo entre el sistema de CTL murino y humano al nivel de procesamiento antigénico (se generan los mismos epítopos), y iii) la movilización comparable frente a la mayoría de los antígenos de los repertorios de CTL en ratones transgénicos de HLA y humanos (Wentworth, P. A., A. Vifiello, J. Sidney, E. Keogh, P, W. Chesnut, H. Grey, A. Sette. 1996. Eur. J. Immunol. 26:97; Alexander, J., C. Oserof, J. Sidney, P. Wentworth, E. Keogh, G. Hermanson, F. V. Chisari R. T, Kubo, H. M, Grey, A, Sette, 1997. J.Immunol. 159:4753).
Hasta la fecha, se han desarrollado vacunas sintéticas de epítopos de CTL a base de péptidos como agentes inmunoterapéuticos frente a un número de enfermedades humanas [18-20]. Sin embargo, sólo se observó una eficacia moderada en varios ensayos clínicos (21). Esto se puede explicar en parte por el fracaso de estas vacunas para inducir respuestas de CTL suficientemente potentes. De hecho, informes recientes sugieren la necesidad de la ayuda de células T CD4+ para obtener una respuesta de CTL máxima (A.J. Zajac, K. Murali-Krishna, J.N. Blattman y
R. Ahmed, Curr Opin Immunol 10 (1998), p. 444; Firat H, Garcia-Pons F, Tourdot S, Pascolo S, Scardino A, Garcia Z, Michel ML, Jack RW, Jung 0, Kosmatopoulos K, Mateo L, Suhrbier A, Lemonnier FA, Langlade-Dernoyen P Eur J Irmnunol 29, 3112, 1999).
CTL son componentes críticos de la inmunidad protectora frente a infecciones víricas, pero no se comprenden completamente los requisitos para el cebado in vivo de CTL. Ahora se acepta que las células Th son normalmente esenciales para el cebado de CTL con péptidos sintéticos. Con respecto a péptidos epitópicos de CTL sintéticos, varios estudios señalan una necesidad imperiosa de la estimulación de linfocitos Th para inducir respuestas de CTL óptimas (C. Fayolle, E. Deriaud y C. Leclerc, J Immunol 147 (1991), p, 4069; C. Widmann, P. Romero, J.L. Maryanski, G. Corradin y D. Valmori, J Immunol Meth 155 (1992), p. 95; M. Shirai, C.D. Pendkton, J. Ahlers, T. Takeshita, M. Newman y J.A. Berzofsky, J Immunol 152 (1994), p. 549; J.P. Sauet, H. Gras-Masse, J.G. Guillet y E. Gomard, Int Immunol 8 (1996). p. 457). Varios de estos estudios mostraron que la activación de una célula T CD8+ requiere la interacción simultánea de una célula auxiliar T CD4+ y una célula T CD8+ con la misma célula presentadora de antígeno que presenta sus epítopos cognatos (Ridge JP, Di Rosa F, Matzinger P. Nature. 4 de junio de 1998;3 93 (6684):474-8). La importancia de esta interacción de tres células para el cebado de los CTL se confirma mediante estudios con epítopos víricos, y modelos de animales, puesto que la inducción in vivo de los CTL fue la más eficaz cuando se enlazaron físicamente epítopos de CTL y Th en lugar de ser administrados como una mezcla sin enlazar (Shirai M, Pendleton CD, Ahlers J, Takeshita T, Newman M, Berzohky JA. J Immunol. 15 de enero 1994;152(2): 549-56; Oseroff C, Sette A, Wentworth P, Celis E, Maewal A, Dahlberg C, Fikes J, Kubo RT, Chesnut RW, Grey BX Alexander J. Vaccine. mayo de 1998;16(8): 823-33). La capacidad de los péptidos antigénicos de CTL y Th para inducir eficazmente respuestas de CTL se ha demostrado tanto en modelos experimentales (C. Fayolle, E. Deriaud y C. Leclerc, J Immunol 147 (1991), p, 4069; C. Widmann, P. Romero, J.L. Maryanski, G. Corradin y D. Valmori, J Immunol Meth 155 (1992), p. 95) como en seres humanos (A. Vitiello, G. Ishioka, H.M. Grey, R. Rose, P. Famess, R. LaFond, L. Yuan, F.V. Chisari, J. Furze y R. Bartholomeuz, J Clin Invest 95 (1995), p. 341; B. Livingston, C. Crimi, H. Grey, G. Ishioka, F.V. Chisari, J. Fikes, H.M. Grey, R. Chesnut y A. Sette, J Immunol 159 (1997), p. 1383). Además, una respuesta de Th potente desempeña un papel importante no sólo para la inducción óptima de respuestas de CTL, sino también para el mantenimiento de la memoria de CTL
(E.A. Walter, P.D. Greenberg, M.J. Gilbert, R.J. Finch, K-S. Watanabe, E.D. Tbomas y S.R. Riddell, N Engl J Med 333 (1995), p. 1038; Riddell SR, Greenberg PD, en Thomas ED, Blume KG, Forman SJ (eds): Hematopoietic Cell Transplantation, 2ª ed. Malden, MA: Blackwell Science Inc., 1999). Finalmente, se ha documentado desde hace tiempo que las células “auxiliares” T CD4+ son cruciales a la hora de coordinar respuestas inmunitarias celulares y humorales frente a antígenos exógenos.
Recientemente, se estableció un ratón transgénico (Tg) que expresa tanto las moléculas de HLA-A*0201 clase I como HLA-DR1 clase II (BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum, Immunol. agosto de 2000;61 (8):764-79). Los autores dieron a conocer que ambos transgenes HLA-A*0201 y HLA-DR1 son funcionales in vivo, que ambas moléculas de MHC clase I y clase II se utilizaron como elementos de restricción, y que el producto del transgén de HLA-DR1 potencia las respuestas de CTL específicas de antígeno restringidas a HLA-A*0201 (BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum, Immunol. agosto 2000;61(8):764-79).
También, el documento WO 03/006639 describe un modelo de ratón humanizado transgénico que comprende un gen murino deficaz de H2 clase I y II, y un gen humano funcional de HLA clase I y/o clase II.
El documento WO 02/059263 describe un modelo de ratón humanizado transgénico en el que los genes murinos del receptor de células T, del receptor de MHC y CD4 y CD8 se han sustituido por sus equivalentes humanos.
Es digno de destacar que estos ratones Tg HLA-A*0201/DR1 expresaron sus propias moléculas de MHC H-2 clase I
y clase II. Debido a que los ratones transgénicos de HLA clase I que expresan genes de ratón endógenos de MHC clase I desarrollan preferentemente y a menudo exclusivamente respuesta de CTL restringida a H-2 (C Barra, H Gournier, Z Garcia, PN Marche, E Jouvin-Marche, P Briand, P Fillipi, y FA Lemonnier J Immunol 1993 150: 36813689; Epstein H, Hardy F., May JS, Johnson MH, Holmes N. Eur J Immunol. septiembre 1989;19(9):1575-83; Le AX; EJ Bemhard, MJ Holterman, S Strub, P Parham, E Lacy, y VH Engelhard J Immunol 1989 142: 13 66-1371; Vitiello A, Marchesini D, Furze J, Sherman LA, Chesnut RW., J Exp Med. 1 de abril 1991;173(4):100715), y a que los ratones transgénicos de HLA clase II que expresan genes de ratón endógenos de MHC clase II no inducen respuestas fiables específicas de antígeno restringidas a HLA clase II (Nishimura Y, Iwanaga T, Inamitsu T, Yanagawa Y, Yasunami M, Kimura A, Hirokawa K, Sasazuki T., J Immunol 1 de julio de 1990;145(I):353-60), estos ratones Tg HLA-A*0201/DR1 son de utilidad limitada para evaluar las respuestas específicas de seres humanos frente a antígenos.
Sin embargo, en ratones nuligénicos de H-2 clase I y transgénicos de HLA clase I, o ratones nuligénicos de H-2 clase II y transgénicos de HLA clase II, sólo se producen respuestas inmunitarias de CTL restringidas a HLA (Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Peramau, B., J Exp Med. 16 de junio de 1997;185(12).2043-51; Madsen L, Labrecque N, Engberg J, Dierich A, Svejgaard A, Benoist C, Mathis D, Fugger L.,Proc Natl Acad Sci U S A 31 de agosto de 1999;96(18):10338-43). De hecho, los ratones nuligénicos (KO) de H-2 clase I y transgénicos de HLA-A2.1 presentan la capacidad para montar respuestas mejoradas restringidas a HLA
2.1 en comparación con ratones transgénicos de HLA-A2.1, que todavía expresan las moléculas murinas endógenas de H-2 clase I (Pascolo, S. et al. J Exp Med 185, 2043-2051 (1997); Ureta-Vidal, A., Firat, H., Perarnau, B. y Lemonnier, F.A. J Immunol 163, 2555-2560 (1999); Firat, H. et al., Int Immunol 14, 925-934 (2002); Rohrlich, P.S. et al., Int Immunol 15, 765-772 (2003)). Se han hecho observaciones similares con ratones transgénicos de HLA-DR1, dependiendo de si son deficaces o no en moléculas de H-2 clase II (A. Pajot, resultados no publicados). Además, en ausencia de competición de moléculas de MHC murino, los ratones KO de H-2 clase I y transgénicos de HLA-A2.1 o KO de H-2 clase II y transgénicos de HLA-DR1 generan solamente respuestas inmunitarias restringidas a HLA (Pascolo, S. et al. J Exp Med 185, 2043-2051 (1997)) (A. Pajot, resultados no publicados), facilitando la monitorización de respuestas de células T CD8+ y CD4+ restringidas a HLA. Sin embargo, las respuestas inmunitarias protectoras frente a patógenos, que a menudo requieren la colaboración entre células T auxiliares y células T CD8+ citotóxicas, no se puede estudiar en los ratones monotransgénicos de HLA clase I o HLA clase II, que no permiten la evaluación simultánea de respuestas humanas de HLA clase I y II en el mismo ratón.
En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de un sistema de modelo de animal conveniente para evaluar la inmunogenicidad de candidatos de vacunas humanas que comprenden constructos que contienen epítopos de CTL humanos y, en algunos casos, con la inclusión de epítopos de Th CD4+ (linfocito T auxiliar) de potencia elevada para sostener la actividad de células T CD8+ antivírica y antitumoral (A.J. Zajac, K. Murali-Krishna, J.N. Blattman y
R. Ahmed, Curr Opin Immunol 10 (1998), p. 444; Firat H, Garcia-Pons F, Tourdot S, Pascolo S, Scardino A, Garcia Z, Michel ML, Jack RW, Jung 0, Kosmatopoulos K, Mateo L, Suhrbier A, Lemonnier FA, Langlade-Dernoyen P, Eur J Irmnunol 29,3112, 1999). Existe también una necesidad de un sistema que permita la evaluación simultánea de la coordinación mutua entre una respuesta de CTL, una respuesta de TH (en particular, respuesta de TH1 o TH2), y, opcionalmente, una respuesta humoral.
Sumario de la invención
Se ha satisfecho esta necesidad y más proporcionando ratones transgénicos tanto para moléculas de HLA-A2.1 como HLA-DR1, en un contexto que es deficaz para moléculas de H-2 tanto de clase I como de clase II. La materia objeto de la presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 18. Específicamente, la invención proporciona ratones que comprenden (1) moléculas no funcionales de H-2 clase I y clase II; y (2) que expresan moléculas transgénicas de HLA clase I, o moléculas transgénicas de HLA clase II, o moléculas transgénicas de HLA clase I y moléculas transgénicas de HLA clase II. Estos ratones proporcionan un modelo útil en el desarrollo y optimización de constructos de vacunas con inmunogenicidad in vivo máxima para uso humano. Específicamente, tales ratones permiten un análisis completo de los tres componentes de la respuesta adaptativa inmunitaria (anticuerpo, auxiliar y citolítica) en un único animal, así como una evaluación de la protección conferida específicamente mediante la vacunación frente a una exposición antigénica.
Los ratones de la invención, que comprenden una supresión tanto para moléculas de H-2 clase I como clase II, y que expresan moléculas transgénicas de HLA clase I y moléculas transgénicas de HLA clase II, representan un ratón experimental completamente humanizado que se puede usar para detectar simultáneamente la presencia de anticuerpos específicos de antígenos, una respuesta de célula T, restringida a HLA-DRI específica de antígenos, y una respuesta de célula T restringida a HLA-A2 específica de antígenos. Estos ratones serán útiles para estudiar cómo la coordinación mutua funciona entre una respuesta de CTL, una respuesta de TH (en particular una respuesta de TH1 o TH2, y, opcionalmente, una respuesta humoral. Estos ratones representan una herramienta optimizada para estudios de vacunología básica y aplicada.
Se describe en la presente memoria un ratón transgénico que comprende un gen de H2 clase I interrumpido, un gen de H2 clase II interrumpido, y un transgén funcional de HLA clase I o clase II.
También se describe un ratón transgénico que comprende un gen de H2 clase I interrumpido, un gen de H2 clase II interrumpido, un transgén de HLA clase I funcional, y un transgén de HLA clase II funcional.
En estos casos, el transgén de HLA clase I puede ser un transgén de HLA-A2, y el transgén de HLA clase II puede ser un transgén de HLA-DR1. De forma más precisa, el transgén de HLA-A2 puede comprender la secuencia de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias, y el transgén de HLA-DL1 puede comprender la secuencia de HLA-DR1 provista en el listado de secuencias.
Una forma de realización de la invención proporciona un ratón transgénico que tiene moléculas endógenas no funcionales de H2 clase I y clase II, que comprende un transgén funcional de HLA clase I y un transgén funcional de HLA clase II. En una forma de realización, el ratón tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, en el que el transgén de HLA-A2 comprenden la secuencia proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende las secuencias proporcionadas en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y 3.
Otra forma de realización de la invención proporciona un método para identificar simultáneamente la presencia de uno o más epítopos en un antígeno o grupo de antígenos candidato, en el que el uno o más epítopos provocan una respuesta humoral específica, una respuesta de TH restringida a HLA-DR1, y /o una respuesta de CTRL restringida a HLA-A2. El método comprende administrar el antígeno o grupo de antígenos candidatos a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°; evaluar una respuesta humoral específica en el ratón contra el antígeno; evaluar una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno; y evaluar una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el ratón frente al antígeno. La observación de una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta humoral en el antígeno. La observación de una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el antígeno. La observación de una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el antígeno.
En algunas formas de realización, el método incluye evaluar una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno, y evaluar una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno. En este caso, la observación de una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno; y la observación de una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno.
Se describe en la presente memoria un método para identificar la presencia de un epítopo de T auxiliar restringido a HLA DR1 en un antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos, comprendiendo el método administrar el antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-2 y un transgén funcional de HLA-DR1, y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°; y evaluar para una respuesta de epítopo de T auxiliar restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno. La observación de una respuesta de epítopo de T auxiliar restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta de epítopo de T auxiliar restringida a HLA-DR1 de TH en el antígeno.
Además, se describe en la presente memoria un antígeno aislado que comprende un epítopo de T auxiliar restringido a HLA DR1 identificado mediante el método del párrafo anterior. Este antígeno aislado puede incluir un epítopo que provoca una respuesta mural y/o un epítopo que provoca una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL. El antígeno que comprende un epítopo de T auxiliar restringido a HLA DR1 puede comprender un polipéptido. El antígeno que comprende un epítopo de T auxiliar restringido a HLA DR1 puede comprender un polinucleótido. Eventualmente, el antígeno que comprende un epítopo de T restringido a HLA DR1 puede comprender ADN, ARN, o ADN y ARN.
También se describe en la presente memoria un método para identificar la presencia de un epítopo de linfocito T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 en un antígeno candidato o un grupo de antígenos candidatos, comprendiendo el método a administrar el antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ; y ensayar para una respuesta de T citotóxico (CTL) restringida a HLA-A2 en el ratón al antígeno o grupo de antígenos. La observación de una respuesta de T citotóxico (CTL) restringida a HLA-A2 en el ratón frente al antígeno o grupo de antígenos identifica un epítopo que provoca una respuesta de T citotóxico (CTL) restringida a HLA-A2 en el antígeno o grupo de antígenos.
Un antígeno aislado que comprende un epítopo de T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 se puede identificar mediante el método del párrafo anterior. Este antígeno puede comprender además un epítopo que provoca una respuesta humoral y/o un epítopo que provoca una respuesta de epítopo de T auxiliar restringida a HLA-DR1 de TH. El antígeno que comprende un epítopo de T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 puede comprender un polipéptido. El antígeno que comprende un epítopo de T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 puede comprender un
polinucleótido. El antígeno que comprende un epítopo de T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 puede comprender ADN, ARN, o ADN y ARN.
También se describe un método para comparar la eficacia de una respuesta de célula T auxiliar inducida por dos o más vacunas. Este método comprende administrar una primera vacuna candidata a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1, y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de célula T auxiliar inducida en el ratón por la primera vacuna candidata; administrar una segunda vacuna candidata a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de célula T auxiliar inducida en el ratón por la segunda vacuna candidata; administrar cada vacuna candidata adicional a comparar a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, y un transgén funcional de HLA-A2, un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de célula T auxiliar inducida en el ratón por la vacuna candidata adicional, y determinar la eficacia de cada vacuna candidata para inducir una respuesta de célula T comparando las respuestas de T auxiliares a cada una de las vacunas a comparar entre sí. La respuesta de célula T auxiliar puede ser una respuesta restringida a HLA-DR1.
Además, también se describe un método para comprar la eficacia de respuestas de células T citotóxicas inducidas por dos o más vacunas. El método incluye administrar una primera vacuna candidata a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de célula T citotóxica inducida en el ratón por la primera vacuna candidata; administrar una segunda vacuna candidata a un ratón de un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de célula T citotóxica inducida en el ratón por la segunda vacuna candidata; administrar cada vacuna candidata adicional a comparar a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de célula T citotóxica inducida en el ratón por la vacuna candidata adicional; y determinar la eficacia de cada vacuna candidata para inducir una respuesta de célula T citotóxica comparando las respuestas de célula T citotóxica a cada una de las vacunas a comparar entre sí. La respuesta de célula T citotóxica puede ser una respuesta restringida a HLA-A2.
Además, se describe en la presente memoria un método para comparar simultáneamente la eficacia de la respuesta de célula T auxiliar y la respuesta de célula T citotóxica, inducidas por dos o más vacunas. El método comprende administrar una primera vacuna candidata a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, y medir la respuesta de T auxiliar y la respuesta de célula T citotóxica inducidas en el ratón por la primera vacuna candidata, administrar una segunda vacuna candidata a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase 2, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβº, y medir la respuesta de la célula T auxiliar y la respuesta de la célula T citotóxica inducidas en el ratón por la segunda vacuna candidata; administrar cada vacuna candidata adicional a comparar a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, y medir la respuesta de célula T auxiliar y la respuesta de célula T citotóxica inducidas en el ratón por cada vacuna candidata adicional; y determinar la eficacia de cada vacuna candidata para inducir una respuesta de célula T auxiliar y una respuesta de célula T citotóxica comparando la respuesta de célula T auxiliar y la respuesta de célula T citotóxica a cada una de las vacunas a comparar entre sí. La respuesta de célula T auxiliar puede ser una respuesta restringida a HLA-DR1, y la respuesta de célula T citotóxica puede ser una respuesta restringida a HLA-A2.
La presente invención también proporciona un método para determinar simultáneamente la respuesta humoral, la respuesta de célula T auxiliar, y la respuesta de célula T citotóxica de un ratón tras su inmunización con un antígeno
o una vacuna que comprende uno o más antígenos. El método comprende administrar el antígeno o la vacuna que comprende uno o más antígenos a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, y ensayar para determinar una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos, ensayar para determinar una respuesta de célula T auxiliar en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos, y ensayar para determinar una respuesta de célula T citotóxica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos. En algunas formas de realización, la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH. En algunas formas de realización, la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL.
La presente invención también proporciona un método para optimizar dos o más composiciones de vacunas
candidatas para la administración a un ser humano, basándose en criterios preseleccionados. El método incluye determinar simultáneamente la respuesta humoral, la respuesta de célula T auxiliar, y la respuesta de célula T citotóxica de un ratón tras su inmunización con las dos o más composiciones de vacunas candidatas, usando un método que comprende administrar el antígeno o la vacuna que comprende uno o más antígenos a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, ensayando para determinar una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos, ensayando para determinar una respuesta de célula auxiliar T en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos, ensayando para determinar una respuesta de célula T citotóxica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos, y seleccionar una vacuna optimizada aplicando criterios preseleccionados a los resultados. En algunas formas de realización, las dos o más vacunas candidatas difieren solo en la relación de antígeno a adyuvante presente en la vacuna. En algunas formas de realización, las dos o más vacunas candidatas difieren sólo en el tipo de adyuvante presente en la vacuna.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar si una vacuna presenta un riesgo de inducción de una enfermedad autoinmunitaria cuando se administra a un ser humano. El método comprende administrar la vacuna a un ratón transgénico que comprende un gen no funcional de H2 clase I, un gen no funcional de H2 clase II, un transgén funcional de HLA-A2, y un transgén funcional de HLA-DR1 y que tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, y ensayar para determinar una respuesta autoinmunitaria en el ratón, en el que la observación de una respuesta autoinmunitaria en el ratón indica que la vacuna presenta un riesgo de inducción de una enfermedad autoinmunitaria cuando se administra a un ser humano.
También se describe una célula de ratón transgénico aislada que comprende un gen interrumpido de H2 clase I, un gen interrumpido de H2 clase II, y un transgén funcional de HLA clase I o clase II.
Además, se describe una célula de ratón transgénico aislada que comprende un gen interrumpido de H2 clase I, un gen interrumpido de H2 clase II, un transgén funcional de HLA clase I y un transgén funcional de HLA clase II.
El transgén de HLA clase I puede ser un transgén de HLA-A2, y el transgén de HLA clase II puede ser un transgén de HLA-DR1. El transgén de HLA-A2 puede comprender la secuencia de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias, y el transgén de HLA-DR1 puede comprender la secuencia de HLA-DR1 proporcionada en el listado de secuencias.
Además, la presente invención proporciona una célula de ratón transgénico aislada que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y clase II, en la que la célula de ratón transgénico comprende un transgén funcional de HLA clase I y un transgén funcional de HLA clase II. En algunas formas de realización, la célula de ratón transgénico tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, en el que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende las secuencias proporcionadas en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y 3.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describirá de forma más completa con referencia a los dibujos, en los que:
La figura 1 muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión de la superficie celular de las moléculas transgénicas indicadas (a) Se tiñeron esplenocitos de ratones KO de H-2 clase II transgénicos de HLA-DR1 (DR1+ CII-, panel izquierdo), KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 (A2+DR1+CI-CII-, panel central), y KO de H-2 clase I transgénicos de HLA-A2.1 (A2+CI-, panel derecho) con m.Ab W6/32 marcado con FITC (anti-HLA-ABC, en abscisas) o 28-8-6S biotinilado (anti-H-2Kb/Db en ordenadas), revelando este último con anti-IgG de ratón marcado con BE. (b) Se tiñeron linfocitos B del bazo B220+ de la misma raza de ratones con m.Ab L243 marcado con FITC (anti-HLA-DR1, paneles superiores) y AF6-120.1 marcado con PE (anti-H-2IAβb paneles inferiores).
La figura 2 muestra los números de células T esplénicas CD8+ y CD4+ y el uso del segmento BV (basándose en análisis inmunoscópico) en ratones de los genotipos indicados. (a) Se tiñeron esplenocitos procedentes de ratones KO de H-2 clase II transgénicos de HLA-DR1 (DR1+ CII-, panel izquierdo), KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 (A2+ DR1+ Cl-CII-, panel central), y KO de H-2 clase I transgénicos de HLA-A2.1 (A2+ Cl-, panel derecho) con m.Ab CT-CD4 marcado con PE (anti-CD4 de ratón, en ordenadas) y 53-6.7 marcado con FITC (anti-CD8 de ratón en abscisas). Los números corresponden a los porcentajes de células T CD4+ (cuadrado izquierdo superior) o CD8+ (cuadrado derecho inferior) en esplenocitos totales. (b y c) Análisis inmunoscópico de RT-PCR de células T esplénicas purificadas CD8+ (b) y CD4+ (c) para el uso de la familia del segmento BV (1-20) usando cebadores BC específicos e inversos de la familia BV directos (1-20). Un perfil típico para una familia de segmento BV reordenada productivamente incluye una serie de picos con una distribución de tipo Gausiano que difiere en longitud en 3 nucleótidos. La figura ilustra los resultados obtenidos con un ratón representativo KO de H-2 clase I/clase II transgénico de HLA-A2.1/HLA-DR1.
La figura 3 muestra respuestas citolítica, proliferativa y de anticuerpos, específicas de HBs. Los ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 se inmunizaron o no mediante inyección intramuscular de AD plasmídico que codifica HBsAg, y después se ensayaron individualmente. (a) Respuesta humoral (panel superior), citolítica (panel central) y proliferativa (panel inferior), y controles específicos de un ratón representativo inmunizado con ADN que codifica HBsAg. El título de anticuerpos (IgG) frente a las partículas de HBsAg que contienen proteínas de cubierta de HBV tanto medias como pequeñas y frente al péptido preS2109-134 se determinaron en el ensayo ELISA. La actividad citolítica a diferentes relaciones efector/diana (E/T) se evaluó usando células diana RMAS-HHD pulsadas con péptido relevante (HBsAg348-357, restringido a HLA-A2.1+) o de control (HBsAg371-378, restringido a H-2 Kb�, y MAGE-3271-279, restringido a HLA-A2.1[]). Las respuestas proliferativas se detectaron usando péptido relevante (HBsAg180-195, restringido a HLA-DR1) o de control (HBsAg126-138, restringido a H-2 IAb y HIV 1 Gag263-278, restringido a HLA-DR1). (b) Evaluación similar de las respuestas de anticuerpos (IgG, panel superior), citolítica (panel central) y proliferativa (panel inferior) de 6 ratones inmunizados con ADN que codifica HBsAg (1-6), según se compara a respuestas medias de 6 ratones sin tratamiento (0). La actividad citolítica a una relación de E/T 30/1 se evaluó en células diana RMAS-HHD pulsadas con péptido HBsAg348-357, inmunodominante (barras en negro) o HBsAg335-343, subdominante (barras en gris).
La figura 4 muestra resultados de ensayos de protección. Ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 se inmunizaron o no dos veces con ADN plasmídico que codifica HBsAg. Quince días después de la última inmunización, se expusieron intraperitonealmente a 107 PFU de rVV que expresa HBsAg o la proteína HBx. Cuatro días después, los animales se ensayaron individualmente para determinar los títulos víricos en los ovarios. Los resultados (rVV PFU/ovario en log10) se dan para los ratones inmunizados con ADN que codifica HBsAg expuestos a rVV-HBsAg (I, n=10), ratones sin tratar expuestos a rVVHBsAg (N, n=6), ratones inmunes a HBsAg expuestos a rVV-HBx (Ix, n=6) y ratones sin tratar expuestos a rVV-HBsAg (I, n=10).
La figura 5 muestra la respuesta AC anti-Pre S2 en ratones HLA-A2+DR1+CI-CII tras una inmunización con pcmv S2/S.
La figura 6 muestra la respuesta proliferativa de T CD4 a epítopos restringidos a HLA-DR1 tras la inmunización de ratones HLA-A2+DR1+CI-CII con pcmv S2-S.
La figura 7 muestra a respuesta citotóxica T CD8 frente al péptido HBS (348-357) restringido a HLA-A2 tras una inmunización de ratones HLA-A2+DR1+CI-CII con pcmv S2/S.
Secuencias
SEC ID nº:1 contiene las siguientes subpartes: Los nucleótidos 1-1205 comprenden el promotor de HLA-A2; los nucleótidos 1206-1265 la secuencia líder de HLA-A2; los nucleótidos 1266-1565 el ADNc de microglobulina β2 humana; los nucleótidos 1566-1610 un ligador (Gly4Ser)3; los nucleótidos 1611-2440 un segmento que contiene el exón 2 y parte del intrón 3 de HLA-A2; y los nucleótidos 2441-4547 un segmento que contiene parte del intrón 3, los exones 4 a 8, y parte de la región no codificante de 3’ del gen de H2 Db.
SEC ID nº:2 es la secuencia nucleotídica del gen DRA*0101. Los nucleótidos 1-15279 son el promotor localizado 5’ al gen HLA-DR alfa, los nucleótidos 15280-15425 son el exón 1, los nucleótidos 15344-15346 son el codón de partida ATG, los nucleótidos 17838-18083 son el exón 2, los nucleótidos 18575-18866 son el exón 3, los nucleótidos 19146-19311 son el exón 4, y los nucleótidos 20008-20340 son el exón 5.
SEC ID nº:3 es la secuencia nucleotídica del gen de DRB1*010101. Los nucleótidos 7391-7552 son el exón 1, los nucleótidos 7453-7455 son el codón de partida ATG, los nucleótidos 15809-16079 son el exón 2, los nucleótidos 19536-19817 son el exón 3, los nucleótidos 20515-20624 son el exón 4, los nucleótidos 21097-21121 son el exón 5, y los nucleótidos 21750-22085 son el exón 6.
Descripción detallada de la invención
La materia objeto de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas 1 a 18.
La práctica de la presente invención empleará, excepto que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la pericia de la técnica. Tales técnicas se explican de forma completa en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente US nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B.
D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M.
P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV
(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Se describen en la presente memoria ratones que comprenden (1) moléculas mutadas de H2 clase I y clase II; y (2) que expresan moléculas transgénicas de HLA clase I o moléculas transgénicas de HLA clase II, o moléculas transgénicas de HLA clase I y moléculas transgénicas de HLA clase II. Otros ratones comprenden una supresión de ambas moléculas e H-2 clase I y clase II, y expresan moléculas transgénicas de HLA clase I y moléculas transgénicas de HLA clase II, y representan un ratón experimental completamente humanizado que se puede usar para detectar simultáneamente la presencia de anticuerpos específicos de antígenos, una respuesta de célula T restringida a HLA-DR1 específica de antígeno, y una respuesta de célula T restringida a HLA-A2 específica de antígeno. Estos ratones son útiles para estudiar cómo la coordinación mutua opera entre una respuesta de CTL, una respuesta de TH (en particular, una respuesta de TH1 o TH2), y, opcionalmente, una respuesta humoral. Estos ratones representan una herramienta optimizada para estudios de vacunología básica y aplicada.
De forma más precisa, se describe un ratón transgénico que tiene genes no funcionales endógenos de H2 clase I y H2 clase II, y que comprende un transgén funcional de HLA clase I o clase II.
Se puede afirmar que tal ratón es un ratón experimental completamente humanizado, debido a que se puede usar para detectar simultáneamente la presencia de anticuerpos específicos de antígenos, una respuesta de célula T restringida a HLA-DR1 específica de antígeno, y una respuesta de célula T restringida a HLA-A2 específica de antígeno.
Como se muestra en parte en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria, y como está generalmente claro para un experto en la materia a partir de la descripción, los ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.7/HM-DR7 tienen la capacidad para desarrollar respuestas de anticuerpos específicos de HBsAg, de célula T auxiliar CD4+ y de célula T citolítica CD8+ tras la inmunización con ADN. Estas respuestas, observadas en cada ratón individual ensayado, se dirigieron a los mismos epítopos inmunodominantes como las respuestas humanas, y confirieron a los animales inmunizados una protección específica frente al virus de la vacuna recombinante de HBsAg.
Las células auxiliares T son esenciales para la maduración completa de las respuestas de anticuerpos (Katz, D.H. y Benacerraf, B., Adv Immunol 15, 1-94 (1972)), el cebado de CTL frente a muchos epítopos (von Boehmer, H. y Haas, W., J Exp Med 150, 1134-1142 (1979); Keene, J.A. y Forman, J., J Exp Med 155, 768-782 (1982)) y el mantenimiento a largo plazo de CTL (Matloubian, M., Concepcion, R.J. y Ahmed, R., J Virol 68, 8056-8063 (1994)). Tanto los anticuerpos (Lefrancois, L., J Virol 51, 208-214 (1984)) como CTL (Zinkernagel, R.M. y Welsh, R.M., J Immunol 117, 1495-1502 (1976)) son componentes críticos de la inmunidad protectora frente a infecciones víricas. De hecho, se observaron respuestas potentes de anticuerpo específico de HBsAg y de CTL en ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos dobles de HLA-A2.1-/HLA-DR1, pero no en ratones KO de H-2 clase I/clase II monotransgénicos de HLA-A2.1. De este modo, el auxilio de la célula T CD4+ específica de HBsAg es esencial para generar respuestas de CTL y de anticuerpos específicos de HBsAg eficaces. Estos resultados son consistentes con estudios sobre ratones inmunizados con HBsAg (Milich, D.R., Semin Liver Dis 11, 93-112(1991)) y seres humanos vacunados con HBsAg (Celis, E., Kung, P.C. y Chang, T.W., J Immunol 132, 1511-1516 (1984)), lo que sugiere que la producción de una respuesta de anticuerpo anti-HBs depende de células T CD4+.
Ya se han obtenido ratones transgénicos que expresan tanto moléculas de HLA-A2.1 clase I como de HLA-DR1 clase II (BenMohamed, L. et al. Hum Immunol 61, 764-779 (2000)). Los autores dieron a conocer que tanto las moléculas de HLA-A2.1 como de HLA-DR1 son elementos de restricción funcionales in vivo, y que el producto del transgén de HLA-DR1 potencia las respuestas de CTL específicas de antígeno restringidas a HLA-A2.1. Sin embargo, la importancia humana de las respuestas inmunitarias en estos ratones se hace pequeña proyecto el hecho de que todavía expresan sus propias moléculas de H-2 clase I y clase II, que se usan habitualmente de forma preferente y a menudo de forma exclusiva como elementos de restricción en respuesta a antígenos (Ureta-Vidal, A., Firat, H., Perarnau, B. y Lemonnier, F.A., J Immunol 163, 2555-2560 (1999); Rohrlich, P.S. et al., Int Immunol 15, 765-772 (2003)) (A. Pajot, resultados no publicados). La invención descrita en la presente memoria supera esta limitación proporcionando ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1.
Como se describe en la presente memoria después, los ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-D1 expresan, en un contexto de KO de β2m, una monocadena de HLA-A2.1 en la que la β2m humana está enlazada covalentemente mediante un brazo peptídico a la cadena pesada de HLA-A2.1. Carecen además de la expresión de superficie celular de moléculas convencionales de H-2 IA y IE clase II como resultado de la inactivación del gen H-2 IAβb , puesto que H-2 IEα es un pseudogen en el haplotipo H-2b. Los resultados proporcionados en la presente memoria demuestran que tales ratones están privados de la expresión de superficie celular de moléculas de H-2 clase I y clase II. Sin embargo, se dio a conocer en un caso que puede existir una cadena pesada de clase I libre, en particular H-2 Db, sobre la superficie de un ratón KO de β2b, y podría inducir una respuesta de alorreactividad. Si esto es así, debido a que tales ratones están vacíos de péptidos, no deberían
interferir en la respuesta inmunitaria específica de antígeno (Bix, M. y Raulet, D., J Exp Med 176, 829-834 (1992)). Esto está soportado por el informe de Allen et al (Allen, H., Fraser, J., Flyer, D., Calvin, S. y Flavell, R., Proc Natl Acad Sci U S A 83, 7447-7451 (1986)), en el que confirmaron que H-2 Db es expresada en la superficie celular incluso cuando no hay β2m en la célula, pero que tal antígeno Db no es reconocido por linfocitos Db citotóxicos aloespecíficos para Db o restringidos a Db. Además, los antígenos de Db no son reconocidos por la mayoría de los anticuerpos monoclonales del Db nativo.
No obstante, en ratones monotransgénicos de HLA-DR1, se dio a conocer que se pueden expresar en cierto grado sobre la superficie celular complejos híbridos de HLA-DRα/H-2 IEβb no convencionales, al menos en ausencia de la cadena de HLA-DRβ (Lawrance, S.K. et al., Cell 58, 583-594 (1989)). A pesar de esta observación, estas moléculas no convencionales no se detectaron serológicamente sobre superficies celulares en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA A2.1 /HLA-DR1, incluso con mAb (17-3-3S), que se sabe que reacciona con tales moléculas híbridas (Ozato, K., Mayer, N. y Sachs, D.H., J Immunol 124, 533-540 (1980)) (figura 1a y datos no mostrados). Además, los resultados obtenidos al estudiar respuestas de células T específicas de HBsAg y específicas de HIV 1-Gag de estos ratones fueron todos indicativos del uso exclusivo de las moléculas de HLA-A2.1 y HLA-DR1 como elementos de restricción. Esto argumenta que los híbridos de HLA-DRα/H-2 IEβb no convencionales fueron probablemente inestables en comparación con las moléculas convencionales de HLA-DRα/HLA-DRβ, y que sólo pueden existir en ausencia de la cadena de HLA-DRβ. Las razas de ratón en las que toda la región de H-2 (H-2 IAβb, IAαb, IEβb) se ha suprimido (Madsen, L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 10338-10343 (1999)), así como el gen de H-2 Db , están siendo analizadas para excluir completamente esta posibilidad. Los análisis preliminares de esplenocitos obtenidos de los primeros animales revelaron una restauración de conjunto de células T CD4+ similar a la observada en ratones KO de H-2 clase II (Iapb°) transgénicos de HLA-DR1, sugiriendo que las respuestas de células T CD4+ restringidas a HLA-DR1 de estos nuevos ratones deberían ser equivalentes a las de los ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1.
Los linfocitos CD8+ periféricos de ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, en comparación con los ratones de KO de H-2 clase I transgénicos de HLA-A2.1 progenitores, son cuantitativa y cualitativamente similares con la completa diversificación, al menos en términos del uso el segmento BV del repertorio de TCR. La restauración parcial comparada con animales de tipo salvaje, especialmente del conjunto de células T CD8+, ha sido una observación constante en los ratones monotransgénicos de HLA que expresan una molécula de HLA-A2.1 quimérica (dominio α3 de origen murino) (Pascolo, S. et al., J Exp Med 185, 2043-2051 (1997)). Independientemente de la sustitución del dominio α3, la interacción sigue siendo subóptima entre moléculas CD8 y HLA-A2.1 de ratón, puesto que el análisis de co-cristal ha documentado que CD8 humano también contacta con el dominio α2 de la cadena pesada de HLA-A2.1 (Gao, G.F. et al., Nature 387, 630-634 (1997)). La cooperación subóptima también se puede producir en el retículo endoplásmico, en el que muchas moléculas (TAP, tapasina, ERp 57) ayudan a la biosíntesis de la molécula de MHC clase I. Sin embargo, en esta etapa, la única diferencia funcional documentada entre estas moléculas del retículo endoplásmico de ratones y de seres humanos, a saber, el transporte eficaz por TAP humano pero no de ratón de péptidos citosólicos cargados positivamente del término COOH (Momburg, F., Neefjes, J.J. y Hammerling, G.J., Curr Opin Immunol 6, 32-37 (1994)), no es relevante para moléculas de HLA-A2.1 que une péptidos con un término C hidrófobo, puesto que estos péptidos son transportado eficazmente por TAP de ratón y humano. Incluso aunque el número de linfocitos T CD8+ es menor tanto en ratones KO de H-2 clase I monotransgénicos de HLA-A2.1 como en ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, responden eficazmente frente a HBsAg y, de forma importante, estos últimos ratones desarrollan respuestas de anticuerpo, de células auxiliares y de células citolíticas similares a seres humanos.
Una de las dificultades que impiden el diseño de vacunas a base de epítopos T dirigidas a linfocitos T es el polimorfismo de las moléculas de HLA clase I/clase II. Las moléculas de HLA-A2.1 y HLA-DR1 son expresadas por una proporción significativa de individuos en poblaciones humanas (30 a 50% para HLA-A2.1, 6 a 18% para HLA-DR1). Incluso aunque el agrupamiento funcional de moléculas de HLA clase I en superfamilias se basa en la redundancia significativas de los conjuntos presentados de péptidos34, sigue siendo deseable el análisis individual de las respuestas provocadas por cada variante isotípica o alélica de HLA clase I para identificar los epítopos óptimos que presentan. Esto es particularmente importante para idear un nuevo reactivo, tal como un tetrámero (HLA clase I
o HLA clase II) para monitorizar la respuesta inmunitaria. Por la misma razón, sería de ayuda obtener razas de ratones que coexpresen moléculas de HLA-A2.1 con otras moléculas de HLA clase II, incluso si la unión de los péptidos a las moléculas de HLA clase II es menos restrictiva que a las moléculas de clase I. Basándose en la presente descripción, para estos y otros fines se pueden construir ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA clase I/clase II, adicionales.
Mientras que los ratones KO de H-2 transgénicos de HLA permiten un análisis detallado y una optimización de la inmunogenicidad de péptidos antigénicos con excelente transposabilidad a seres humanos (Rohrlich, P.S. et al., Int Immunol 15, 765-772 (2003); Loirat, D., Lemonnier, F.A. y Michel, M.L., J Immunol 165, 4748-4755 (2000); Scardino,
A. et al., Eur J Immunol 3I, 3261-3270 (2001)), esto es menos evidente para estudios de formulación de adyuvantes de vacunas. Esto podría ser debido a diferencias entre las dos especies en los diversos efectores que se movilizan tempranamente en respuesta a una exposición antigénica. El incremento del conocimiento fundamental de la inmunidad innata puede conducir, en el futuro, a una humanización más completa del sistema inmunitario del ratón.
En conclusión, la presente descripción describe un modelo de ratón transgénico humanizado, optimizado, cuyos genes de H-2 clase I (β2m de ratón) y de clase II (H-2 IAβb) se han suprimido y sustituido por genes humanos equivalentes HHD (HLA-A*0201), HLA-DR.4*0101 y HLA-DRB1*0101. La inmunidad celular en los ratones de KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 está completamente restringida por las moléculas de HLA humano, con una ausencia completa de respuestas inmunitarias restringidas por las moléculas de MHC murino. La ausencia de competición entre respuestas inmunitarias de MHC murino y HLA (transgénico) humano permite usar estos ratones para caracterizar epítopos en vacunas humanas que requieren la colaboración entre células T auxiliares CD4+ restringidas a HLA y células T citolíticas CD8+ restringidas a HLA.
“HLA” es el completo de MHC humano, y “H-2” es el complejo de MHC de ratón. El complejo humano comprende tres genes de cadena α de clase I, HLA-A, HLA-B, y HLA-C, y tres pares de genes de cadenas α y β de MHC clase II, HLA-DR, -DP, y -DQ. En muchos haplotipos, el agrupamiento de HLA-DR contiene un gen de cadena β extra cuyo producto puede emparejarse con la cadena de DRα, y, de este modo, los tres conjuntos de genes dan lugar a cuatro tipos de moléculas de MHC clase II. En el ratón, los tres genes de cadena α de clase I son H-2-L, H-2-D, y H-2-K. Los genes de MHC de clase II de ratón son H-2-A y H-2-E.
Es sabido en la técnica que existe diversidad genética entre los genes de HLA de diferentes individuos como resultado tanto de antígenos de HLA polimórficos como de alelos de HLA distintos. En consecuencia, las formas de realización de la invención descritas en la presente memoria, pueden sustituir un antígeno de HLA polimórfico por otro, o un alelo de HLA por otro. Los ejemplos de polimorfismos y alelos de HLA se pueden encontrar, por ejemplo, en http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/data.html y http://www.ebi.ac.uk/im-gt/hla, y en Genetic diversity of HLA: Functional and Medical Implication, Dominique Charon (Ed.), EDK Medical and Scientific International Publisher, y The HLA FactsBook, Steven G.E. Marsh, Peter Parham y Linda Barber, AP Academic Press, 2000.
Un gen “interrumpido” es el que se ha mutado usando recombinación homóloga u otros enfoques conocidos en la técnica. Un gen interrumpido puede ser un alelo hipomórfico del gen, o un alelo nulo del gen. Un experto en la materia reconocerá que el tipo de alelo a usar se puede seleccionar para cualquier contexto particular. En muchas formas de realización de la invención, se prefiere un alelo nulo.
“Recombinación homóloga” es un enfoque general para dirigir mutaciones a una secuencia génica deseada, preseleccionada, de una célula, a fin de producir un animal transgénico (Mansour, S. L. et al., Nature 336:348-352 (1988); Capecchi, M. R., Trends Genet. 5:70-76 (1989); Capecchi, M. R., Science 244:1288-1292 (1989); Capecchi,
M. R. et al., In: Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), pp. 45-52; Frohman, M. A. et al., Cell 56:145-147 (1989)).
Ahora es factible alterar deliberadamente cualquier gen en un ratón (Capecchi, M. R., Trends Genet. 5:70-76 (1989); Frohman, M. A. et al., Cell 56:145-147 (1989)). La selección de dianas génicas implica el uso de técnicas de ADN recombinante estándar para introducir una mutación deseada en una secuencia de ADN clonada de un locus escogido. Esa mutación se transfiere entonces mediante recombinación homóloga al genoma de una célula madre derivada de embrión (ES), pluripotente. Las células madre alteradas se microinyectan en blastocitos de ratón y se incorporan en el embrión de ratón en desarrollo para desarrollarse finalmente en animales quiméricos. En algunos casos, las células de la extirpe germinal de los animales quiméricos derivarán de las células ES genéticamente alteradas, y los genotipos mutantes se pueden transmitir a través de la reproducción.
La selección de dianas génicas se ha usado para producir ratones quiméricos y transgénicos en los que se ha insertado un gen nptII en el locus de la β2-microglobulina (Koller, B. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 86:89328935 (1989); Zijlstra, M. et al., Nature 342:435-438 (1989); Zijlstra, M. et al., Nature 344:742-746 (1989); DeChiaba et al., Nature 345:78-80 (1990)). Experimentos similares han permitido la producción de animales quiméricos y transgénicos que tienen un gen c-abI que se ha interrumpido mediante la inserción de un gen nptII (Schwartzberg, P.
L. et al., Science 246:799-803 (1989)). La técnica se ha usado para producir ratones quiméricos en los que el gen en-2 se ha interrumpido por la inserción de un gen nptII (Joyner, A. L. et al., Nature 338:153-155 (1989)).
A fin de utilizar el método de “selección de dianas génicas”, el gen de interés se ha debido de clonar previamente, y se han debido de determinar las fronteras de intrón-exón. El método da como resultado la inserción de un gen marcador (por ejemplo un gen nptII) en una región traducida de un gen particular de interés. De este modo, el uso del método de selección de dianas génicas da como resultado la destrucción masiva del gen de interés.
De forma significativa, el uso de la selección de dianas génicas para alterar un gen de una célula da como resultado la formación de una alteración masiva en la secuencia de ese gen. La eficacia de la selección de dianas génicas depende de un número de variables, y es diferente de un constructo a otro.
Las células del animal quimérico o transgénico de la presente invención se preparar introduciendo una o más moléculas de ADN en una célula, que puede ser una célula pluripotente precursora, tal como una célula ES, o equivalente (Robertson, E. J., In: Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), pp. 39-44). El término “precursora” pretende significar solamente que la célula pluripotente es un precursor para la célula pluripotente deseada (“cortada transversalmente”), que se prepara según las enseñanzas de la presente invención. La célula pluripotente (precursora o transfectada) se puede cultivar in vivo de una manera conocida en la técnica (Evans, M. J. et al., Nature 292:154-156 (1981)) para formar un animal quimérico o transgénico.
Se puede usar cualquier célula ES según la presente invención. Sin embargo, se prefiere aislar aislados primarios de células ES. Tales aislados se pueden obtener directamente de embriones, tales como la extirpe celular CCE descrita por Robertson, E. J., en: Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), p. 39-44), o del aislamiento clonal de células ES de la extirpe celular CCE (Schwartzberg, P. A. et al., Science 246:799-803 (1989), cuya referencia se incorpora en la presente memoria como referencia). Tal aislamiento clonal se puede lograr según el método de E. J. Robertson (En: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (E. J. Robertson, Ed.), IRL Press, Oxford, 1987), cuya referencia y método se incorporan en la presente memoria como referencia. El fin de tal propagación clonal es obtener células ES, que tienen una mayor eficacia para diferenciarse en un animal. Las células ES seleccionadas de forma clonal son aproximadamente 10 veces más eficaces produciendo animales transgénicos que la extirpe celular progenitora CCE. Para los fines de los métodos de recombinación de la presente invención, la selección clonal no proporciona ninguna ventaja.
Un ejemplo de extirpes celulares ES, que se han derivado de forma clonal a partir de embriones, son las extirpes celulares ES AB1 (hprt+) o AB2.1 (hprt -). Las células ES se cultivan preferentemente en células estrómicas (tales como células STO (especialmente células SNC4 STO) y/o células de fibroblastos embriónicas primarias) como se describe por E. J. Robertson (En: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (E. J. Robertson, Ed., IRL Press, Oxford, 1987, p. 71-112), cuya referencia se incorpora en la presente memoria como referencia. Los métodos para la producción y análisis de ratones quiméricos están descritos por Bradley, A. (En: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (E. J. Robertson, Ed.), IRL Press, Oxford, 1987,
p. 113-151), cuya referencia se incorpora en la presente memoria como referencia. Las células estrómicas (y/o de fibroblastos) sirven para eliminar el sobrecrecimiento clonal de células ES anormales. Lo más preferible, las células se cultivan en presencia del factor inhibidor de leucocitos (“lif”) (Gough, N. M. et al., Reprod. Fertil. Dev. 1:281-288 (1989); Yamamori, Y. et al., Science 246:1412-1416 (1989), las cuáles se incorporan en la presente memoria como referencia. Puesto que el gen que codifica lif se ha clonado (Gough, N. M. et al., Reprod. Fertil. Dev. 1:281-288 (1989)), se prefiere especialmente para transformar células estrómicas con este gen, por medios conocidos en la técnica, y después cultivar las células ES en células estrómicas transformadas que segregan lif en el medio de cultivo.
Como se usa en la presente memoria, el término “transgén” se refiere a una secuencia de ácido nucleico, que es parcial o completamente heteróloga, es decir, extraña, al animal transgénico o célula en el que se introduce, o es homóloga a un gen endógeno del animal transgénico o célula en el que se introduce, pero que se diseña para ser insertada, o es insertada, en el genoma del animal de tal manera para alterar el genoma de la célula en el que se inserta (por ejemplo), se inserta en una localización que difiere de la del gen natural, o su inserción da como resultado un desactivación). Un transgén se puede enlazar operablemente a una o más secuencias reguladoras transcripcionales y a cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones, que pueda ser necesario para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado. Los transgenes ejemplares de la presente invención codifican por ejemplo un polipéptido de H-2. Otros transgenes ejemplares están dirigidos a interrumpir uno o más genes de HLA mediante recombinación homóloga con secuencias genómicas de un gen de HLA.
Un “transgén funcional” es el que produce un transcrito de ARNm, que a su vez produce una proteína procesada apropiadamente en al menos una célula del ratón que comprende el transgén. Un experto notará que el conjunto diverso de elementos y secuencias reguladores transcripcionales conocidos que dirigen el procesamiento posttranscripcional proporciona una librería de opciones a partir de la cuál dirigir la expresión de un transgén en un ratón hospedante. En muchas formas de realización de la invención, se puede preferir la expresión de un transgén de HLA bajo el control de un elemento regulador el gen de H-2.
En algunas formas de realización, el transgén de HLA clase I es un transgén de HLA-A2, y el transgén de HLA clase II es un transgén de HLA-DR1. Un ejemplo de un transgén de HLA-A2 es el que comprende la secuencia de HLA-A2 proporcionada en SEC ID nº.1 del listado de secuencias. Un ejemplo de un transgén de HLA-DR1 es el que comprende las secuencias de HLA-DR1 proporcionadas en SEC ID nº 2 y 3 del listado de secuencias.
En una forma de realización, la invención proporciona un ratón transgénico que tiene genes endógenos no funcional de H2 clase I y clase II, en el que el ratón transgénico comprende un transgén funcional de HLA clase I y un transgén funcional de HLA clase II. En otras formas de realización, el ratón tiene el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, en el que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende las secuencias proporcionadas en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y 3.
Se describen en la presente memoria células de ratón transgénico aisladas. En algunos casos, la célula comprende
un gen interrumpido de H2 clase I, un gen interrumpido de H2 clase II, y un transgén funcional de HLA clase I o clase II. En otros, la célula comprende un gen interrumpido de H2 clase I, un gen interrumpido de H2 clase II, un transgén funcional HLA clase I, y un transgén funcional de HLA clase II. El transgén de HLA clase I puede ser un transgén de HLA-A2, y el transgén de HLA clase II puede ser un transgén de HLA- DR1. En algunos casos, el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias, y el transgén de HLA-DR1 comprende la secuencia de HLA-DR1 proporcionada en el listado de secuencias.
En una forma de realización, la invención proporciona una célula de ratón transgénico aislada que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y clase II, en la que la célula de ratón transgénico comprende un transgén funcional de HLA clase I y un transgén funcional de HLA clase II. Las células de ratón transgénico aisladas pueden tener el genotipo HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, en el que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende las secuencias de HLA-DR1 proporcionadas en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y 3.
Las células de ratón transgénico aisladas de la invención pueden tener el genotipo de cualquier ratón de la invención. Sin embargo, el conjunto de genotipos de las células de ratón transgénico aisladas de la invención, y el conjunto de genotipos de los ratones de la invención no necesariamente solapan de manera total.
Las células de ratón aisladas de la invención se pueden obtener a partir de un ratón o un embrión de ratón. En una forma de realización, el ratón o embrión de ratón tiene el mismo genotipo que la célula a obtener. En otra forma de realización, el ratón o embrión de ratón tiene un genotipo diferente de la célula a obtener. Después de que la célula se obtiene del ratón o embrión de ratón, un gen de la célula se puede interrumpir, por ejemplo, mediante recombinación homóloga. Adicionalmente, se puede introducir un transgén funcional en el genoma de la célula, por ejemplo mediante transfección. Un experto en la materia reconocerá que se puede aplicar cualquier método adecuado conocido en la técnica para modificar el genoma de la célula para obtener de ese modo una célula de ratón aislada que tiene el genotipo deseado.
Las células T desempeñan un papel central en muchos aspectos de inmunidad adquirida, llevando a cabo una variedad de funciones reguladoras y defensivas. Cuando algunas células T encuentran una célula infectada o cancerosa, la reconocen como extraña y responden actuando como células asesinas, exterminando las propias células del hospedante como parte de la respuesta inmunitaria mediada por células. Otras células T, denominadas células T auxiliares, responden a antígenos extraños percibidos estimulando a las células B para producir anticuerpos, o suprimiendo ciertos aspectos de la respuesta inmunitaria humoral o celular.
Las células T auxiliares (Th) orquestan mucha de la respuesta inmunitaria vía la producción de citocinas. Aunque generalmente identificables como portadoras del marcador de superficie celular CD4, estas células se dividen funcionalmente en subpoblaciones Th1 o Th2, según el perfil de citocinas que producen y su efecto sobre otras células del sistema inmunitario.
Las células Th1 detectan patógenos invasores o células hospedantes cancerosas mediante un sistema de reconocimiento denominado como el receptor de antígenos de células T. Denominado inmunidad celular, los procesos relacionados con Th1 implican generalmente la activación de células no B, y se caracterizan frecuentemente por la producción de IFN-γ. No obstante, aunque el sistema de Th1 es principalmente independiente de la producción de anticuerpos humorales, las citocinas de Th1 promueven el intercambio de clases de inmunoglobulinas al isotipo IgG2a.
Al detectar un antígeno extraño, la mayoría de las células Th1 maduras dirigen la liberación de IL-2, IL-3, IFN-γ, TNF-β, GM-CSF, niveles elevados de TNF-α, MIP-1α, MIP-1β, y RANTES. Estas citocinas promueven la hipersensibilidad de tipo retrasada y la inmunidad mediada por células general. Por ejemplo, IL-2 es un factor de crecimiento de células T que promueve la producción de un clon de células T adicionales sensibles al antígeno particular que se detectó inicialmente. Las células T sensibilizadas se unen y atacan a células o patógenos que contienen el antígeno.
Por el contrario, las células Th2 maduras tienden a promover la secreción de IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF, y niveles bajos de TNF-α. Además, la respuesta de Th2 promueve la inmunidad humoral activando células B, estimulando la producción y secreción de anticuerpos, e induciendo el intercambio de clases a los isotipos IgA, IgG1 e IgE.
Como se usa en la presente memoria, un “antígeno” comprende: 1) al menos un epítopo de HTL, o 2) al menos un epítopo de CTL, o 3) al menos un epítopo de célula B, o 4) al menos un epítopo de HTL y al menos un epítopo de CTL, o 5) al menos un epítopo de HTL y al menos un epítopo de célula B, o 6) al menos un epítopo de CTL y al menos un epítopo de célula B, o 7) al menos un epítopo de HTL y al menos un epítopo de CTL y al menos un epítopo de célula B. Un “antígeno candidato” es una molécula que está bajo investigación para determinar si funciona como un antígeno.
Una “respuesta inmunitaria humoral” es una inmunidad específica mediada por anticuerpos.
Un “epítopo” es un sitio en un antígeno que es reconocido por el sistema inmunitario. Un epítopo de anticuerpo en un sitio en un antígeno reconocido por un anticuerpo. Un epítopo de célula T es un sitio en un antígeno que se une a una molécula de MHC. Un epítopo de TH es el que se une a una molécula de MHC clase II. Un epítopo de CTL es el que se une a una molécula de MHC clase I.
El antígeno puede comprender una secuencia polipeptídica o una secuencia polinucleotídica, que puede comprender ARN, ADN, o ambos. En una forma de realización, el antígeno comprende al menos una secuencia polinucleotídica que codifica operacionalmente uno o más polipéptidos antigénicos. Usado en este contexto, la palabra “comprende” pretende que se proporcione al menos un polipéptido antigénico mediante el aparato de transcripción y/o traducción de una célula hospedante que actúa sobre un polinucleótido exógeno que codifica al menos un polipéptido antigénico, como se describe, por ejemplo, en la patente US nº 6.194.389 y 6.214.808.
Los antígenos de la invención pueden ser cualquier molécula antigénica. Las moléculas antigénicas incluyen: proteínas, lipoproteínas, y glucoproteínas, incluyendo proteínas víricas, bacterianas, parasitarias, de animal, y fúngicas, tales como albúminas, toxoide del tétano, toxoide de la difteria, toxoide de pertussis, proteínas de la membrana externa bacteriana (incluyendo proteína de la membrana externa meningocócica), proteína RSV-F, péptido derivado de la malaria, B-lactoglobulina B, aprotinina, ovoalbúmina, lisozima, y antígenos asociados a tumores, tales como antígeno carcinoembriónico (CEA), CA 15-3, CA 125, CA 19-9, antígeno específico de la próstata (PSA), y los complejos de TAA de la patente US nº 5.478.556, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad; hidratos de carbono, incluyendo polisacáridos de origen natural y sintéticos, y otros polímeros tales como ficoll, dextrano, carboximetilcelulosa, agarosa, poliacrilamida y otras resinas acrílicas, poli(lactida-co-glucolida), polialcohol vinílico, poliacetato de vinilo parcialmente hidrolizado, polivinilpirrolidona, polisacáridos capsulares estreptocócicos y neumocónicos del Grupo B (incluyendo tipo III), mucoexopolisacárido de pseudomonas aeruginosa, y polisacáridos capsulares (incluyendo fisher tipo I), y polisacáridos de Haemophilus influenzae (incluyendo PRP); haptenos, y otros restos que comprenden moléculas de bajo peso molecular, tales como TNP, sacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, péptidos, toxinas, fármacos, productos químicos, y alergenos; y haptenos y antígenos derivados de bacterias, rickettsiae, hongos, virus, parásitos, incluyendo difteria, pertssis, tétano, H. influenzae, S. pneumoniae, E. Coli, Klebsiella, S. aureus, S. epidermidis, N. meningiditis, polio, sarampión, varicela, rubeola, virus sincitial respiratorio, rabia, Ébola, carbunco, listeria, hepatitis A, B, C, virus de inmunodeficacia humano I y II, herpes simple tipos I y II, CMV, EBV, varicela Zóster, malaria, tuberculosis, Candida albicans, y otras cándidas, Pneumocystis carinii, micoplasma, virus de la gripe A y B, adenovirus, estreptococo del Grupo A, estreptococo del Grupo B, Pseudomonas aeruginosa, rinovirus, leishmania, parainfluenza, tipos 1, 2 y 3, coronavirus, Salmonella, Shigella, Rotavirus, Toxoplasma, Enterovirus, y Chlamydia trachomatis y pneumoniae.
Como se usa en la presente memoria, una composición farmacéutica o vacuna comprende al menos una composición inmunológica, que se puede disolver, suspender o de otro modo asociar con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Para la administración de la composición se puede emplear cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición (A. Gennaro, ed., 1990), que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad. Los vehículos pueden ser líquidos estériles, tales como agua, polietilenglicol, dimetilsulfóxido (DMSO), aceites, incluyendo aceite de petróleo, aceite animal, aceite vegetal, aceite de cacahuete, aceite de haba de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Los vehículos pueden estar en forma de neblinas, pulverizaciones, polvos, ceras, cremas, supositorios, implantes, bálsamos, ungüentos, parches, cataplasmas, películas o preparaciones cosméticas.
La formulación apropiada de la composición farmacéutica o vacuna depende de la vía de administración escogida. Por ejemplo, con administración intravenosa mediante inyección de bolo o infusión continua, las composiciones son preferentemente solubles en agua, y la disolución salina es el vehículo preferido. Para la administración transcutánea, intranasal, oral, gástrica, intravaginal, intrarrectal, u otra administración transmucosal, se pueden incluir en la formulación agentes penetrantes apropiados a la barrera a permear, y son conocidos en la técnica. Para la administración oral, el ingrediente activo se puede combinar con vehículos adecuados para la inclusión en comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones, y similares. También son aplicables los sistemas de suministro sensibles al tiempo para la administración de las composiciones de la invención. Los sistemas representativos incluyen sistemas a base de polímeros, tales como poli(lactida-glucósido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, poliácido hidroxibutírico y polianhídridos. Estos y polímeros similares se pueden formular en microcápsulas según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se enseña en la patente US nº 5.075.109. Los sistemas de suministro alternativos apropiados para la administración de los compuestos inmunoestimulares descritos de la invención incluyen los descritos en las patentes US no 6.194.389, nº 6.024.983, nº 5.817.637, nº 6.228.621, nº 5.804.212, nº 5.709.879, nº 5.703.055, nº 5.643.605, nº 5.643.574, nº 5.580.563, nº 5.239.660, nº 5.204.253, nº 4.748.043, nº 4.667.014, nº 4.452.775, nº 3.854.480, y nº 3.832.252.
También se pueden emplear como vehículos líquidos las disoluciones acuosas de dextrosa y de glicerol, particularmente para disoluciones inyectables o de aerosol. Para la administración mediante aerosol, así como
mediante pulverización o nebulizador a presión, se pueden añadir propelentes adecuados como lo entienden los expertos en la materia. La composición inmunológica también se puede formular con agentes solubilizantes; emulsionantes; estabilizantes; dispersantes; saborizantes; adyuvantes; vehículos; anestésicos típicos, tales como lidocaína, xilocaína, y similares; antibióticos; y compuestos antivíricos, antifúngicos, antiparasitarios, o antitumorales conocidos o sospechosos.
Un “adyuvante” es una composición que promueve o potencia una respuesta inmunitaria frente a un antígeno diana. El experto en la materia puede seleccionar un adyuvante apropiado para uso en la práctica de la presente invención a la vista de la presente descripción.
Se describen en la presente memoria métodos para tratar a un paciente que necesita de estimulación inmunitaria administrando una composición que comprende uno o más antígenos como se describe en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, el tratamiento engloba métodos correctivos, de restauración, de mejora, y preventivos, relacionados con cualquier enfermedad, afección, anormalidad o síntoma. El tratamiento engloba además la provocación o supresión de una respuesta inmunitaria en un animal experimental o ex vivo.
De este modo, el tratamiento comprende administrar una cantidad inmunoestimulante de cualquiera de las composiciones inmunoestimulantes de la invención mediante cualquier método habitual para los expertos en la materia, incluyendo habitualmente vías orales e intranasales, e inyecciones intravenosas, intramusculares, y subcutáneas, pero englobando también la administración intraperitoneal, intracorpórea, intraarticular, intraventricular, intratecal, tópica, tonsiliar, mucosal, transdérmica, intravaginal, y mediante sonda nasogástrica.
Como reconoce el experto, la elección de un método de administración apropiado puede contribuir a la eficacia de un tratamiento, y para algunas aplicaciones se puede preferir la administración local. Las vías aceptables de administración local incluyen la inyección subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intravítrea, la inhalación o la sonda nasogástrica, la administración oral, intranasal, y la inyección directa en un tejido, órgano, articulación, tumor, o masa celular predeterminado. Por ejemplo, la aplicación mucosal o inyección en ganglios linfáticos mucosales o parches de Peyer puede promover una respuesta inmunitaria humoral con un intercambio de clase de IgA sustancial. Como alternativa, la inyección dirigida en una lesión, foco, o sitio corporal afectado, puede ser aplicable para el tratamiento de tumores sólidos, infecciones localizadas, u otros sitios que requieran la estimulación inmunitaria.
Como alternativa, las células del sistema inmunitario (por ejemplo, células T, células B, células NK, u oligodendrocitos) se pueden retirar de un hospedante y se pueden tratar in vitro. Las células tratadas se pueden cultivar después o reintroducir en un paciente (o a un hospedante heterólogo) para proporcionar estimulación inmunitaria al paciente u hospedante. Por ejemplo, se pueden aspirar células de médula ósea de un paciente y se pueden tratar con un HDR para estimular la inmunidad global o específica. Entonces se puede usar radiación de dosis alta, o tratamientos comparables, para destruir las células inmunitarias que quedan en el paciente. Con el reimplante, las células estimuladas autólogas restaurarán la función inmunitaria normal en el paciente. Como alternativa, las células NK y /o T aisladas de un paciente que padece cáncer se pueden exponer in vitro a uno o más antígenos específicos para el cáncer del paciente. Con el reimplante en el paciente, las células estimuladas mediante el antígeno presentarán una respuesta inmunitaria celular vigorosa frente a las células cancerosas.
Una cantidad inmunoestimulante (eficaz) se refiere a la cantidad de vacuna que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria en un paciente, que es suficiente para prevenir, mejorar o de otro modo tratar una exposición patógena, alergia, o anormalidad o afección inmunológica. Una cantidad inmunoestimulante es la cantidad que proporciona un incremento medible en una respuesta inmunitaria humoral o celular frente a al menos un epítopo del antígeno en comparación con la respuesta obtenida si el antígeno se administra al paciente sin tratamiento previo con la vacuna. De este modo, por ejemplo, una cantidad inmunoestimulante se refiere a la cantidad de una composición que contiene antígeno que es capaz de promover la producción de anticuerpos dirigidos contra un epítopo antigénico de interés, o estimular un efecto protector detectable frente a una exposición patogénica o alergénica, o promover una respuesta de CTL protectora frente a un epítopo antigénico de interés.
El tratamiento con una cantidad inmunoestimulante de una composición que contiene antígeno comprende efectuar cualquier incremento directa, indirecta o estadísticamente observable o medible, u otro cambio deseado en la respuesta inmunitaria en un hospedante, que incluye específicamente un hospedante de cultivo tisular ex vivo que comprende al menos una célula del sistema inmunitario o extirpe celular derivada de ella. Las células hospedantes pueden derivar de sangre periférica humana o animal, ganglios linfáticos o similares. Los hospedantes de cultivo tisular preferidos incluyen células T recientemente aisladas, células B, macrófagos, oligodendrocitos, células NK, y monocitos, cada uno de los cuáles se puede aislar o purificar usando técnicas estándar. Las respuestas observables
o medibles incluyen proliferación o actividad de células B o T; secreción aumentada de anticuerpos; intercambio isotípico, liberación incrementada de citocinas, particularmente la liberación incrementada de uno o más de IL-1, IL2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, o RANTES; título o avidez incrementada de anticuerpos frente a un antígeno específico; tasas de morbimortalidad reducidas asociadas con una infección patógena; promoción, inducción, mantenimiento o refuerzo de la latencia vírica; supresión o de otro modo mejora del crecimiento, metástasis, o efectos de tumores malignos y no malignos; y
provisión de protección profiláctica de una enfermedad o los efectos de una enfermedad.
Cuando se desea la supresión de una respuesta inmunológica, por ejemplo en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria o alergia, una cantidad eficaz también engloba la cantidad suficiente para efectuar una disminución medible u observable en una respuesta asociada con la afección o patología a tratar.
La cantidad de una composición que contiene antígeno a administrar, y la frecuencia de administración, se puede determinar empíricamente, y tendrá en cuenta la edad y tamaño del paciente a tratar, y la afección o enfermedad a resolver. Una dosis apropiada está en el intervalo de 0,01 μg a 100 μg por inóculo, pero también están indicadas cantidades más elevadas y más bajas. Se pueden administrar inmunizaciones de recuerdo secundarias, a intervalos que oscilan desde una semana hasta muchos meses más tarde.
Ejemplos
Las siguientes técnicas y reactivos experimentales se usaron para demostrar ciertas formas de realización no limitantes de la invención.
Ratones transgénicos
Los ratones KO de H-2 clase II (IA βb°) transgénicos de HLA-DR1 se obtuvieron en el Institut Pasteur de Lille cruzando ratones transgénicos de HLA-DR1 (Altmann, D.M. et al., J Exp Med 181, 867-875 (1995)) con ratones KO de H-2 clase II (IAβb°) (Rohrlich, P.S. et al., Int Immunol 15, 765-772 (2003)). Se crearon ratones transgénicos de HLA-A2.1, que expresan una monocadena quimérica (molécula de HHD: dominio α1-α2 de HLA-A2.1, dominio α3 a dominios citoplásmicos de H-2 Db, enlazados en su término N al término C de β2n humana por un ligador peptídico de 15 aminoácidos) (Pascolo, S. et al., J Exp Med 185, 2043-2051 (1997)). Se intercruzaron ratones de KO de H-2 clase I transgénicos de HLA-A2.1 (HHD) y KO de H-2 clase II (IAβb°) transgénicos de HLA-DR1, y las progenies se seleccionaron hasta que se obtuvieron animales KO de H-2 clase I (β2m0/clase II (IAβ0) doblemente transgénicos de HLA-A2.1+/-/HLA-DR1+/-, y se usaron para los experimentos descritos en la presente memoria. Como controles en los ensayos de protección, se usaron ratones KO de H-2 clase I (β2Mº/clase II (IAβº) monotransgénicos de HLA-A2.1+/-. Los ratones se criaron en las instalaciones de animales en el Institut Pasteur, Paris; todos los protocolos se revisaron por la autoridad competente del Institut Pasteur, para el cumplimiento con las regulaciones francesas y europeas sobre bienestar animal y con las recomendaciones del Servicio Público de Salud.
Genotipado
Los transgenes de HLA-DRB1*0101, HLA-DRA*0101 y HLA-A*0201 se detectaron mediante PCR. El tail-DNA se extrajo tras la incubación durante toda la noche a 56ºC en NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,2, EDTA 100 mM, 1% de SDS y 0,5 mg/ml de proteinasa K, seguido de la adición de 250 μl de disolución saturada de NaCl y precipitación con isopropanol. Las muestras se lavaron (3x) en etanol al 70% y se resuspendieron en 150 μl de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8. Las condiciones de PCR fueron: 1,5 mM de MgCl2, 1,25 U de Taq polimerasa, tampón suministrado por el fabricante (InVitrogen, Carlsbad, CA), 1 ciclo (7 min, 94ºC), 40 ciclos (30 segundos, 94ºC; 30 segundos, 60ºC; 1 min, 72ºC), 1 ciclo (4 min, 72ºC), usando como cebadores directos e inversos, para HHD: 5’ CAT TGA GAC AGA GCG CTT GGC ACA GAA GCA G 3’ y 5’ GGA TGA CGT GAG TAA ACC TGA ATC TTT GGA GTA CGC 3’, para HLA-DR81*0101: 5’ TTC TTC AAC GGG ACG GAG CGG GTG 3’ y 5’ CTG CAC TGT GAA GCT CTC ACC AAC 3’, y para HLA-DRA*0101: 5’ CTC CAA GCC CTC TCC CAG AG 3’ y 5’ ATG TGC CTT ACA GAG GCC CC 3’.
Análisis de FACS
Se llevaron a cabo estudios de citofluorimetría sobre esplenocitos purificados mediante Lympholyte M (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, Francia), sin glóbulos rojos, usando m.Ab W6/32 conjugado con FITC (anti-HLA-ABC, Sigma, St Louis, MO) y anti-28-8-6S biotinilado (anti-H-2 Kb/Db, BD Biosciences, San Diego, CA). Los linfocitos T CD4+ y CD8+ se tiñeron usando m.Ab anti-CD4 de ratón CT-CD4 marcado con PE (CALTAG, South San Francisco, CA) y anti-CD8 de ratón 53-6.7 marcado con FITC (BD Biosciences). El análisis de la expresión de las moléculas de MHC clase II se llevó a cabo en linfocitos B B220+ seleccionados positivamente en columnas de MS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Tras la saturación de los receptores Fc con m.Ab 2.4G2, se analizó la expresión de HLA-DR1 y H-2 IAb usando m.Ab L243 marcado con FIT (anti-HLA-DR) y AF6-120.1 marcado con PE (anti-H-2 IAβb) (BD Biosciences). Las células fijadas en paraformaldehído se analizaron con un aparato FACSCalibur (Becton Dickinson, Bedford, MA).
Análisis inmunoscópicos
Las células T CD4+ y CD8+ de ratones sin tratamiento se seleccionaron positivamente en Auto-Macs (Miltenyi Biotec), el ARN se preparó usando el RNA Easy Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), y se usó para la síntesis de ADNc. El ADNc se amplificó mediante PCR usando cebadores directos específicos para cada familia de segmentos BV, y
un cebador inverso compartido por los dos segmentos de BC. Los productos de la PCR se sometieron a un alargamiento de recorrido con un cebador marcado con BC FAM interno. Los productos del alargamiento se cargaron en un gel de 6% de acrilamida/urea 8M para la separación (7h, 35W) con un secuenciador 373A DNA (Perkin Elmer Applied Biosystem, Foster City, CA). Los datos se analizaron usando software inmunoscópico (Pannetier, C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4319-4323 (1993)).
Péptidos
Los péptidos de unión a HLA-A2 HBsAg348-357 GLSPTVWLSV y HBsAg335-343 WLSLLVPFV, el péptido de unión a H2 Kb HBsAg371-378 ILSPFLPL, el péptido de unión a HLA-DR1 HBsAg180-195 QAGFFLLTRILTIPQS, el péptido de unión a H-2 IAb HBsAg126-138 RGLYFPAGGSSSG y el péptido HBsAg109-134 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYF- PAGG, se sintetizaron mediante Neosystem (Strasbourg, Francia), y se disolvieron en PBS-10% de DMSO a una concentración de 1 mg/ml. La numeración de la secuencia de aminoácidos de los péptidos comienza desde la primera metionina del dominio preS1 del subtipo ayw de HBV.
Inmunización con ADN que codifica las proteínas S2-S de HBV
El vector plasmídico pCMV-S2.S (Michel, M.L, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5307-5311 (1995)), que codifica los antígenos de superficie preS2 y S HBV expresados bajo el control del promotor génico temprano inmediato de CMV humano, se purificó en columnas de Plasmid Giga Kit en condiciones libres de endotoxina (Qiagen). Los ratones anestesiados se inyectaron (50 μg en cada lado) en los músculos de la tibia anterior que se regeneran, como se describe previamente (Davis, H.L., Michel, M.L. y Whalen, R.G., Hum Mol Genet 2, 1847-1851 (1993)).
Ensayo de proliferación de células T
Doce días después de la última inmunización, los esplenocitos purificados con Ficoll, sin glóbulos rojos (5.106 células/matraz de cultivo 25 cm2 (Techno Plastic Products (TPP), Trasadingen, Suiza)) se cultivaron con blastos de LPS pulsados con péptidos (20 μg/ml), irradiados con γ (180Gy) (5.106 células/matra de cultivo) en medio RPMI suplementado con 10% de FCS, 10 mM de HEPES, 1 mM de pirovato de sodio, 5 x 10-5 M de 2-mercaptoetanol, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg de estreptomicina como se describe (Loirat, D., Lemonnier, F.A. y Michel, M.L., J Immunol 165, 4748-4755 (2000)). En el séptimo día, para los ensayos de proliferación, las células se colocaron en placas (5 x 105 células/pocillo de microplacas de 96 pocillos de fondo plano, (TPP)) con blastos de LPS irradiados pulsados con péptido (2 x 105 células/pocillo) durante 72 h en medio RPMI completo suplementado con 3% de FCS. Las células expulsaron durante las 16 h finales con 1 μCi de (3H)-timidina por pocillo antes de ser cosechadas en filtros con un colector TOMTEC (Perkin Elmer Applied Biosystem), y la radioactividad incorporada se midió en un contador micro-β (Perkin Elmer Applied Biosystem). Los resultados se dan como índice de estimulación (SI) = cpm con péptido específico/cpm con péptido irrelevante.
Medida de la actividad de CTL
Los ensayos de citotoxocidad se llevaron a cabo en las mismas poblaciones de esplenocitos inmunes como los ensayos de proliferación. Las células respondedoras (5.106 células/matraz de cultivo de 25 cm2, TPP) y los blastos de LPS pulsados con péptido estimuladores (20 μg/ml), irradiados con γ (180 Gy) (5.106 células/matraz de cultivo) se cocultivaron durante 7 días en el mismo medio RPMI suplementado que para los ensayos de proliferación. La actividad citolítica se ensayó en un ensayo estándar de 4 h con 51Cr frente a células diana de RMA-S HHD pulsadas con 10 μg/ml de los péptidos experimentales o de control. La lisis específica en %, se calculó en duplicados, según: [liberación experimental-espontánea]/[liberación máxima-espontánea] x 100, restando la lisis no específica observada con el péptido de control.
Medida de la producción de anticuerpos in vivo
En diversos momentos antes y después de la inyección de ADN, se recogió sangre de los ratones mediante punción retrobulbar con pipetas de vidrio heparinizadas, y los sueros recuperados mediante centrifugación se ensayaron para determinar anti-HBs y anti-preS2 mediante ELISA específico. Como fase sólida, se usaron partículas recombinantes purificadas que contienen proteína S pequeña de HBV (1 ug/ml) o péptido sintético preS2 (120-145) (1 ug/ml). Después del bloqueo con PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) suplementado con 10% de FCS, se añadieron diluciones en serie. Después del intenso lavado, los anticuerpos unidos se detectaron con anti-IgG de ratón (IgG total) marcado con peroxidasa de rábano picante (Amersham, Little Chalfont, UK). Los títulos de anticuerpos se determinaron mediante el método de dilución de punto final en serie. Los sueros de ratón se ensayaron individualmente, y los títulos fueron la media de al menos tres determinaciones. Las diluciones séricas por debajo de 1/100 se consideraron negativas.
Titulación de anticuerpos
Los sueros de ratones inmunizados se ensayaron individualmente mediante ELISA (Michel, M.L. et al., Proc Natl
Acad Sci U S A 92, 5307-5311 (1995)) en proteínas medias y pequeñas de HBV purificadas o péptido HBs109-134 sintético preS2. Después de bloquear con PBS 1x suplementado con 0,1% de Tween 20, 10% de FCS y lavados (x 3), los anticuerpos unidos se detectaron con anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Amersham, Little Chalfont, UK). Los títulos de anticuerpos (medias de al menos 3 determinaciones) se determinaron mediante el método de dilución de punto final en serie. Los títulos por debajo de 1/100 se consideraron negativos.
Exposición a las vacunas y ensayo de placas
Los ratones inyectados con ADN se expusieron intraperitonealmente 12 días después de la última inyección con 107 PFU de virus de la vacuna recombinante (cepa Western Reserve) que expresa HbsAg (Smith, G.L., Mackett, M. y Moss, B., Nature 302, 490-495 (1983)) o la proteína HBx (Schek, N., Bartenschlager, R., Kuhn, C. y Schaller, H., Oncogene 6, 1735-1744. (1991)) proporcionados amablemente, de forma respectiva, por Dr B. Moss y Dr H.Schaller. Cuatro días más tarde, los ovarios se ensayaron para determinar los títulos de rVV mediante ensayo de placas en células BHK 21 (Buller, R.M. y Wallace, G.D., Lab Anim Sci 35, 473-476 (1985).
Ejemplo 1: Expresión de superficie celular de moléculas de MHC
La expresión de superficie celular de las moléculas de HLA-A2.1, H-2 Kb/Db, HLA-DR1, y H-2 IAb se evaluó en esplenocitos mediante citometría de flujo. Como se ilustra en la figura 1a, se observó un nivel similar de expresión de HLA-A2.1 en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 y ratones KO de H-2 clase I, transgénicos de HLA-A2.1, mientras que HLA-A2.1 estaba ausente, y H-2 Kb/Db se expresó exclusivamente en ratones KO de H-2 clase II, transgénicos de HLA-DR1. La expresión de superficie celular de HLA-DR1 y H-2 IAb se midió en células B enriquecidas con B220+. Como se muestra en la figura 1b, se observó un nivel similar de expresión de HLA-DR1 en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, y en ratones KO de H-2 clase II, transgénicos de HLA-DR1, mientras que no se detectó ninguna expresión en ratones KO de H-2 clase I, transgénicos de HLA-A2.1. La expresión de superficie celular de las moléculas trangénicas (especialmente HLA-DR1) fue sin embargo menor que la expresión de las moléculas endógenas de H2 clase I y clase II.
Ejemplo 2: Células T CD4+ y CD8+ periféricas
Los números de células T esplénicas CD4+ y CD8+ se determinaron mediante inmunotinción y análisis de citometría de flujo como se ilustra en la figura 2a.
Las células T CD4+ representaron el 13-14% de la población de esplenocitos tanto en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, como en ratones KO de H-2 clase II transgénicos de HLA-DR1. Por el contrario, sólo el 2-3% de las células fueron CD4+ en ratones KO de H-2 clase II (datos no mostrados), de acuerdo con el informe inicial sobre ratones que carecen de moléculas de MHC clase II (Cosgrove, D. et al., Cell 66, 10511066 (1991)). Como era de esperar, la expresión de las moléculas de HLA-A2.1 transgénicas condujo a un incremento en el tamaño de la población de células T CD8+ periféricas, que alcanzó 2-3% de los esplenocitos totales tanto en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, como en ratones KO de H-2 clase I, transgénicos de HLA-A2.1, en comparación con 0,6-1% en los ratones deficaces en MHC clase I KO de β2 microglobulina (β2m) (Pascolo, S. et al., J Exp Med 185, 2043-2051 (1997)).
Los resultados presentados en los Ejemplos 1 y 2 muestran que:
(1)
En los ratones HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, la expresión de moléculas de HLA-A2, la ausencia de expresión de moléculas H2-Kb, el número de linfocitos T periféricos CD8+ y la diversidad del repertorio T CD8+ son generalmente comparables al ratón HLA-A2+β2m°;
(2)
En el ratón HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°, la expresión de moléculas de HLA-DR1, la ausencia de expresión de moléculas H2-IAb, el número de linfocitos T CD4+, y la diversidad del repertorio de CT4+ son generalmente comparables al ratón HLA-DR1+IAβ°; y
(3)
El ratón HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ° tiene todas las ventajas características encontradas en ratones HLAA2+β2m°, y los ratones HLA-DR1+IAβ°.
Ejemplo 3: Uso del segmento de BV TCR
Puesto que la presencia de una única molécula de MHC clase I y una única molécula de MHC clase II podría disminuir el tamaño y diversidad del repertorio de TCR, se estudió la expresión de las diversas familias de BV y la diversidad de la longitud de CDR3 como se describe previamente (Cochet, M. et al., Eur J Immunol 22, 2639-2647 (1992)) mediante la técnica inmunoscópica a base de RT-PCR, en células T CD4+ o CD8+ esplénicas purificadas. Se observaron picos de magnitud significativa con una distribución parecida a la Gausiana para la mayoría de las familias de BV (15 de las 20 analizadas) tanto en poblaciones de CD8+ (figura 2b) como CD4+ (figura 2c) de células
T. Tales perfiles observados en linfocitos T periféricos son típicos de segmentos de BV reordenados funcionalmente
con una variación de longitud de tres nucleótidos de las subregiones de CDR3 desde un pico al siguiente (Cochet,
M. et al., Eur J Immunol 22, 2639-2647 (1992)).
La ausencia de expansión (o perfil profundamente alterado) como se observa para BV 5.3 y 17 fue esperada puesto que estos dos segmentos de BV son pseudogenes en ratones C57BL/6 (Wade, T., Bill, J., Marrack, P.C., Palmer, E. y Kappler, J.W., J Immunol 141, 2165-2167 (1988)); Chou, H.S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84, 1992-1996 (1987). Sin embargo, los perfiles alterados observados para los segmentos de BV 5.1, 5.2 y 11 fueron debidos a una pequeña subpoblación de células T que expresan BV correspondientes (representan menos de 5% en ratones C57BU6, y alrededor de 2% en ratones KO de H-2 clase II transgénicos de HLA-DR1) (datos no mostrados). Excepto en estos casos, las células T tanto CD4+ como CD8+ en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DRf1, presentan, respectivamente, un patrón de uso de la cadena de BV de TCR y una diversidad de CDR3 que es similar a la de los ratones C57BL/6 no transgénicos.
Ejemplo 4: Caracterización funcional
Se analizaron ratones HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ° inmunizados con Ag HBs (proteína de cubierta de hepatitis B). La figura 5 muestra la respuesta humoral específica, como se indica mediante la producción de anticuerpos de HBs S2. La figura 6 muestra la respuesta de proliferación de CD4+ restringida a DR1 específica de HBs348-357. y la figura 7 muestra la respuesta de T citolítica CD8+ restringida a HLA-A2 específica de la HBs348-357 o HBs335-343.
Estos resultados muestran que el ratón HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ° permite el análisis simultáneo de la respuesta humoral específica, de la respuesta restringida a HLA-DR1 específica de Ag de células T auxiliares CD4+, y de la respuesta citolítica de células T CD8+ restringidas a HLA-A2 específicas de Ag en un individuo inmunizado.
En las siguientes Tablas 1-3 se proporcionan datos adicionales obtenidos de estos ratones.
Tabla 1. Respuestas proliferativas de T CD4+ frente a epítopos de HLA-DR1 de la cubierta del virus HBV a partir de ratones transgénicos de HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII inyectados con PCMV S2-S.
posición Secuencia de aminoácidos Ratón respondedor/ensayado Índice de estimulación
109-134 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG (12/12) 3-4
200-214 TSLNFLGGTTVCLGQ (6/12) 3-4
16/31 QAGFFLLTRILTIPQS (12/12) 3-6
337/357 SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV (5/12) 4-5
Tabla 2. Respuesta citolítica a ratones transgénicos de HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII inyectados con pcmv S2-S
posición Secuencia de aminoácidos Ratón respondedor/ensayado Lisis máxima 348-357 GLSPTVWLS (12/12) 20-70% 335-343 WLSLLVPVF (4/12) 30%
Tabla 3. Respuesta de anticuerpos anti-PreS2 de ratones transgénicos de HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII inyectados con pcmv S2-S
posición Secuencia de aminoácidos Ratón respondedor/ensayado
preS2 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG (9/12)
Ejemplo 5: Respuesta inmunitaria a la vacuna de HbsAg-ADN
Para evaluar el potencial inmunológico de ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1-/HLA-DR1, y comparar sus respuestas humorales, de células CD4+ y CD8+ con las de humanos, se inmunizaron ratones con un plásmido de HbsAg-ADN. Este plásmido codifica dos proteínas de cubierta del virus de la hepatitis B (preS2/S media y S/pequeña) que se autoensamblan en partículas que poseen el antígeno de superficie de la hepatitis B. La vacuna usada actualmente frente a la hepatitis B comprende estas dos proteínas.
Como se ilustra en la figura 3a para un ratón representativo, los anticuerpos específicos de HBsAg se detectaron por primera vez en el día 12 tras la inyección de la vacuna de HBsAg-ADN (figura 3a, panel superior), y el título de estos anticuerpos aumentó hasta el día 24 (12 días después de la segunda inmunización de ADN; datos no mostrados). Esta respuesta de anticuerpos temprana fue específica para el epítopo de células preS2-B (HBs109-134) portado por la proteína de cubierta de HBV media, y para partículas de HBsAg, de acuerdo con una respuesta similar dada a conocer en ratones inmunizados con HBsAg-ADN (Michel, M.L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5307-5311 (1995)) y en seres humanos vacunados con HBsAg (Moulia-Pelat, J.P. et al., Vaccine 12, 499-502 (1994)).
La respuesta de CTL y CD8+ frente a HBsAg se examinó si las células y CD8+ en la periferia de los ratones de KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR9, estaban funcionalmente restringidas por las moléculas de clase I humanas transgénicas. En seres humanos HLA-A2.1+ infectados con HBV, la respuesta de CTL específica
de HBsAg restringida a HLA-A2.1 inmunodominante está dirigida al HBsAg348-357 (Maini, M.K. et al., Gastroenterology 117, 1386-1396 (1999)) y al HBsAg335-343 (Nayersina, R. et al., J Immunol 150, 4659-4671 (1993)) (es decir, se observa una respuesta multiepitópica). En ratones C57BU6, la respuesta de CTL específica de HBsAg restringida a H-2 Kb está dirigida al péptido HBsAg371-378 (Schirmbeck, R., Wild, J. y Reimann, J., Eur J Immunol 28, 4149-4161 (1998)). Para evaluar si el ratón humanizado puede responder como seres humanos, se volvieron a estimular células T esplénicas durante 7 días, como se describe en la presente memoria, con el péptido relevante (HBsAg348-357, HLA-A2.1) o de control (HBsAg371-378, restringido a H-2 Kb; MAGE-3271-279, restringido a HLA-A2.1). La figura 3a (panel central) muestra que la inmunización con HBsAg-ADN provocó una potente respuesta de CTL específica de HBsAg348-357, pero ninguna respuesta al péptido HBsAg371-378 o el péptido MAGE-3271-279.
Para determinar si las células T CD4+ en la periferia de este ratón de KO de H-2 clase I/clase II, transgénico de HLA-A2.1/HLA-DR1 pueden estar funcionalmente restringidas por las moléculas de clase II humanas transgénicas, se examinó la respuestas de células T CD4+ a la proteína HBsAg. En seres humanos HLA-DR1+ vacunados con HBsAg
o infectados con HBV, una respuesta de célula T CD4+ específica de HBsAg restringida a HLA-DR1 inmunodominante está dirigida al péptido HBsAg180-195 (Mm, W.P. et al., Hum Immunol 46, 93-99 (1996)). En ratones C57BU6, la respuesta de célula T CD4+ restringida a H-2 IAb específica de HbsAg está dirigida al péptido HBsAg126138 (Milich, D.R., Semin Liver Dis 11, 93-112(1991)). Para comparar el ratón humanizado con los ratones de tipo salvaje y con seres humanos, se volvieron a estimular in vitro células T esplénicas o los péptidos relevantes (HBsAg180-195, restringido a HLA-DR1) o de control (HBsAg126-138, restringido a H-2 IAb; HIV 1 Gag263-278, restringido a HLA-DR1). La figura 3a (panel inferior) muestra una fuerte respuesta proliferativa dirigida contra el péptido HBsAg180195 restringido a HLA-DR1, mientras que el péptido restringido a H-2 IAb no fue eficaz estimulando una respuesta, como era de esperar. De forma similar no se indujo ninguna respuesta por el péptido HIV 1 Gag263-278. Además, un recuerdo in vitro adicional con el péptido HBsAg180-195 aumentó varias veces el índice proliferativo específico (datos no mostrados).
Habiendo documentado en un primer ratón KO de H-2 clase I/clase II transgénico de HLA-A2.1/HLA-DR1 inmunizado con HBsAg-DNA el desarrollo y la especificidad de las respuestas de anticuerpos específicos de HBsAg, de células T proliferativas y citolíticas, también se ensayaron individualmente para las mismas tres respuestas 6 ratones KO de H-2 clase I/clase II transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1 inmunizados con HBsAg-DNA adicionales y 6 ratones de control sin tratamiento. Como se ilustra en la figura 3b, las tres respuestas se documentaron simultáneamente en los 6 animales inmunizados ensayados, y no en los ratones sin tratamiento del control. De forma interesante, dos ratones inmunizados fueron capaces de desarrollar respuestas de CTL frente a los péptidos restringidos a HLA-A2.1 tanto de HBsAg348-357 como HBsAg335-343 (figura 3b, panel central).
Ejemplo 6: Ensayos de protección
Los ejemplos anteriores documentan la inducción de respuestas humorales específicas de HbsAg y respuestas de células T CD4+ y CD8+ en ratones KO de H-2 clase I/clase II, transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, y muestran que están dirigidos a los mismos epítopos inmunodominantes como los de los seres humanos infectados de forma natural o vacunados con HBsAg. Este ejemplo ensayó si estas respuestas conferían protección a animales vacunados. Puesto que los ratones no son permisivos a HBV, para estos experimentos se usó un virus de la vacuna recombinante de HBsAg (rVV-HBsAg). Los ratones se inmunizaron dos veces intramuscularmente con 100 μg de HBsAg-DNA. Doce días después de la última inmunización, los ratones se expusieron intraperitonealmente a 107 PFU de rVV-HBsAg. Cuatro días más tarde, se determinaron los títulos del virus según los métodos publicados, y se registraron como rVV PFU/ovario (Buller, R.M. y Wallace, G.D., Lab Anim Sci 35, 473-476 (1985)).
Los resultados se ilustran en la figura 4. Los animales sin tratamiento que no habían sido inmunizados con HBsAg-DNA mostraron signos de replicación de rVV-HBsAg después de la exposición. Por el contrario, los títulos del virus en ratones inmunizados con HBsAg-DNA fueron más de 4 órdenes de magnitud inferiores. Estos resultados sugieren fuertemente que la vacunación con HBsAg-DNA indujo respuestas inmunitarias específicas de HBsAg protectoras que controlaron la infección con rVV-HBsAg.
La especificidad de la protección conferida mediante la vacunación con HBsAg-DNA se documentó exponiendo a ratones inmunizados con HBsAg- DNA con otra VV recombinante de HBx (que codifica la proteína de la hepatitis B x). No se observó reducción de la replicación de rVV-HBx en ratones inmunizados con HBsAg-DNA en comparación con controles no inmunizados.
Ejemplo 7: Las células T CD4+ restringidas a HLA-DR1 son críticas para respuestas de anticuerpos y de CTL, y para la protección frente a infección vírica.
Para evaluar si los linfocitos T auxiliares restringidos a HLA-DR1 contribuyen a las respuestas de anticuerpos y de CTL en los ratones inmunizados, se comparó la respuesta inmunitaria y la eficacia de la infección vírica en ratones KO de H-2 clase I/clase II, monotransgénicos (HLA-A2.1) y bitransgénicos (HLA-A2.1/HLA-DR1). Como se muestra en la Tabla 4, se observó una respuesta de CTL específica de HBsAg348-357 potente en ratones KO de H-2 clase I/clase II, doblemente transgénicos de HLA-A2.1/HLA-DR1, pero no en ratones de KO de H-2 clase I/clase II monotransgénicos de HLA-A2.1. Además, no se pudieron detectar anticuerpos anti-HBs en ratones de KO de H-2 clase I/clase II monotransgénicos de HLA-A2.1 vacunados con HBsAg-DNA. Como consecuencia, los ratones KO de H-2 clase I/clase II monotransgénicos de HLA-A2.1 inmunizados con HBsAg-DNA no se protegieron frente a la infección por rVV-HBsAg.
Tabla 4. Respuestas de anticuerpos, citolítica y proliferativa de ratones inmunizados con HBsAg-DNA, y protección frente a la exposición a rVV-HBsAg
Ratón Lisis específica (%) Proliferación (SI) 179-194 Título de anticuerpos rVV-HBsAg 348-357 335-343
PFU/ovario (log10)
A 1 0 0 1 0 2,5.108 2 0 0 1 0 2,5.108 3 0 0 1 0 108 4 0 0 1 0 2,5.108 5 0 0 1 0 108 6 0 0 1 0 1,5.108
B 1 30 15 4,7 2000 104 2 14 0 3,9 3000 3.103 3 30 11 4 7500 4.113 4 5 0 2,5 6500 7,5.103 5 50 30 6,3 13000 7,5.102 6 40 18 4 16000 5.102 7 6 7 2,9 1500 2.104 8 5 5 3 2500 1,5.104 9 24 36 4,5 3000 <102 10 23 14 5 15000 5.103
C 1 0 0 1 0 108 2 0 0 1 0 2.108 3 0 0 1 0 1,5.108 4 0 0 1 0 108 5 0 0 1 0 2,5.108 6 0 0 1 0 108
Ratones KO de H-2 clase I/clase II doblemente transgénicos de HLA-A2.1-/HLA-DR1 sin tratamiento (A 1-6), ratones
10 KO de H-2 clase I/clase II doblemente transgénicos de HLA-A2.9/HLA-DR1 inmunizados con HBsAg-DNA (B 1-10) y ratones KO de H-2 clase I/clase II monotransgénicos de HLA-A2.1 inmunizados con HBsAg-DNA (C 1-6) se sometieron a exposición intraperitoneal con 107 PFU de rVV-HBsAg. Cuatro días más tarde, se evaluaron individualmente las respuestas de células T esplénicas citolíticas y proliferativas y títulos de anticuerpos séricos, PFU por ovario, usando células diana de RMAS-HHD cargadas con péptidos restringidos a HLA-A2.1, HBsAg348-357,
15 (inmunodominantes) o HBsAg335-343 (subdominante), (relación E/T 30/1) para ensayos citolíticos, péptido restringido a HLA-DR1 HBsAg179-194 para ensayos de proliferación, y péptido preS2109-134 para la determinación de títulos de anticuerpos (IgG).
Listado de secuencias
<110> Instituto Pasteur
<120> RATÓN TRANSGÉNICO QUE TIENE UN FENOTIPO DE COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD
(MHC) HUMANO, USOS EXPERIMENTALES Y APLICACIONES
<130> 346381-D22368
10 <140> PCT/IB2004/002374
<141>
<150> 60/490,945
<151> 15
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 3.2
20 <210> 1
<211> 4547
<212> ADN
<213> Homo sapiens
25 <220>
<221> promotor
<222> (1)..(1205)
<223> promotor del gen HLA-A2
30 <220>
<221> característica diversa
<222> (1206)..(1265)
<223> secuencia líder HLA-A2
35 <220>
<221> característica diversa
<222> (1266)..(1565)
<223> ADNc de beta 2 microglobulina humana
40 <220>
<221> característica diversa
<222> (1566)..(1610)
<223> ligador de GlySer
45 <220>
<221> característica diversa
<222> (1611)..(2440)
<223> exón 2 e intrón 3 parcial del gen HLA-A2
50 <220>
<221> característica diversa
<222> (2441)..(4547)
<223> intrón 3 parcial-exón 4-exón 8-gen no codificante 3’
55 <400> 1
<210>2
<211> 29133 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
promotor 10 <222> (1)..(15279)
<223> promotor 5’ del gen HLA-DR alfa (gen HLA-DRA)
<220>
<221>
gen 15 <222> (1)..(29133)
<223> gen HLA-DR alfa (gen HLA-DRA)
<220>
<221>
característica diversa 20 <222> (15280)..(15425)
<223> exón 1
<220>
<221>
característica diversa 25 <222> (15344)..(15346)
<223> partida ATG
<220>
<221>
característica diversa 30 <222> (17838)..(18083)
<223> exón 2
<220>
<221>
característica diversa 35 <222> (18575)..(18866)
<223> exón 3
<220>
<221>
característica diversa 40 <222> (19146)..(19311)
<223> exón 4
<220>
<221>
característica diversa 45 <222> (20008)..(20340)
<223> exón 5
<400> 2
<210>3
<211> 22485
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gen
<222> (1)..(22485)
<223> gen HLA-DRB1*010101
5
<220>
<221> característica diversa
<222> (7391)..(7552)
<223> exón 1 - gen HLA-DRB1*010101
10
<220>
<221> característica diversa
<222> (7453)..(7455)
<223> codón de partida ATG
15
<220>
<221> característica diversa
<222> (15809)..(16079)
<223> exón 2 - gen HLA-DRB1*010101
20
<220>
<221> característica diversa
<222> (19536)..(19817)
<223> exón 3 - gen HLA-DRB1*010101
25
<220>
<221> característica diversa
<222> (20515)..(20624)
<223> exón 4 - gen HLA-DRB1*010101
30
<220>
<221> característica diversa
<222> (21097)..(21121)
<223> exón 5 - gen HLA-DRB1*010101
35
<220>
<221> característica diversa
<222> (21750)..(22085)
<223> exón 6 - gen HLA-DRB1*010101
40
<400> 3
<210>4
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Ligador Sintético Gly-Ser
5
<210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 5
15
cattgagaca gagcgcctgg cacagaagca g 31
20
<210> 6 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
25
<400> 6
ggatgacgtg agtaaacctg aatctttgga gtacgc
36
30
<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 7
40 45
ttcttcaacg ggacggagcg ggtg <210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético 24
50
<400> 8 ctgcactgtg aagctctcac caac 24
55
<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
60
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400>9
ctccaagccc tctcccagag
20
5
<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
10
<400> 10 atgtgcctta cagaggcccc 20
15
<210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<210> 12 25 <211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
35 <210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<210> 16
<211> 26
<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<210> 17
<211> 15 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 30
<210> 18 35 <211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 40 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Ratón transgénico que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y de H2 clase II, que comprende un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, en el que dicho transgén de HLA-A2 es una
    5 monocadena que comprende la beta 2 microglobulina humana enlazada covalentemente a la cadena pesada de HLA-A2.
  2. 2. Ratón transgénico según la reivindicación 1, en el que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia de HLA-A2
    proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende la secuencia de 10 HLA-DR1 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3.
  3. 3. Método para identificar simultáneamente la presencia de uno o más epítopos en un antígeno o grupo de antígenos candidatos, en el que el epítopo provoca una respuesta humoral específica, una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH, y/o una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL, comprendiendo el método:
    15 a) administrar el antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos al ratón de la reivindicación 1 o 2; b) analizar una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno; c) analizar una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno; y d) analizar una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el ratón frente al antígeno;
    20 en el que
    la observación de una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta humoral en el antígeno;
    25 la observación de una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta restringida a HLA-DR1 de TH en el antígeno; y
    la observación de una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo 30 que provoca una respuesta restringida a HLA-A2 de CTRL en el antígeno.
  4. 4. Método según la reivindicación 3, que comprende además analizar una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno y analizar una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno; en el que
    35 la observación de una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta específica de Th1 en el ratón frente al antígeno; y
    la observación de una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno identifica un epítopo que provoca una respuesta específica de Th2 en el ratón frente al antígeno. 40
  5. 5. Método para identificar la presencia de un epítopo en un antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos, comprendiendo el método:
    a) administrar el antígeno candidato o grupo de antígenos candidatos al ratón de la reivindicación 1 o 2; y 45 b) analizar la respuesta epitópica en el ratón frente al antígeno; en el que
    la observación de una respuesta epitópica T auxiliar restringida a HLA-DR1 de TH identifica un epítopo T auxiliar restringido a HLA-DR1 en el antígeno, y
    50 la observación de una respuesta epitópica T citotóxica (CTL) restringida a HLA-A2 identifica un epítopo T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A2 en el antígeno.
  6. 6. Método para comparar la eficacia de una respuesta inducida por dos o más vacunas, comprendiendo el método:
    55 a) administrar una primera vacuna candidata a un ratón de la reivindicación 1 o 2 y medir la respuesta inducida en el ratón por la primera vacuna candidata;
    b) administrar una segunda vacuna candidata a un ratón de la reivindicación 1 o 2 y medir la respuesta inducida en el ratón por la segunda vacuna candidata; 60 c) administrar cada vacuna candidata adicional a comparar a un ratón de la reivindicación 1 o 2 y medir la respuesta inducida en el ratón por cada vacuna candidata adicional a comparar; y
    d) determinar la eficacia de cada vacuna candidata para inducir una respuesta comparando las respuestas con 65 cada una de las vacunas a comparar entre sí, en el que dicha respuesta es una respuesta de célula T auxiliar, una respuesta de célula citotóxica o ambas.
  7. 7. Método según la reivindicación 6, en el que la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA-
    DR1. 5
  8. 8. Método según la reivindicación 6, en el que la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2.
  9. 9. Método según la reivindicación 6, en el que la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA10 DR1, y en el que la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2.
  10. 10. Método para determinar simultáneamente la respuesta humoral, la respuesta de célula T auxiliar y la respuesta de célula T citotóxica de un ratón tras su inmunización con un antígeno o una vacuna que comprende uno o más antígenos, comprendiendo el método:
    15 a) administrar el antígeno o la vacuna que comprende uno o más antígenos a un ratón de la reivindicación 1 o 2;
    b) analizar una respuesta humoral específica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos; 20 c) analizar una respuesta de célula T auxiliar en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más antígenos; y
    d) analizar una respuesta de célula T citotóxica en el ratón frente al antígeno o vacuna que comprende uno o más 25 antígenos.
  11. 11. Método según la reivindicación 10, en el que la respuesta de célula T auxiliar es una respuesta restringida a HLA-DR1, de TH.
    30 12. Método según la reivindicación 10, en el que la respuesta de célula T citotóxica es una respuesta restringida a HLA-A2, de CTRL.
  12. 13. Método para optimizar dos o más composiciones de vacunas candidatas para la administración a un ser humano, basándose en criterios preseleccionados, comprendiendo el método: determinar simultáneamente la 35 respuesta humoral, la respuesta de célula T auxiliar, y la respuesta de célula T citotóxica de un ratón tras su inmunización con las dos o más composiciones de vacunas candidatas, usando un método que comprende administrar dichas composiciones de vacuna que comprenden uno o más antígenos al ratón transgénico de las reivindicaciones 1 o 2, analizar una respuesta humoral específica en dicho ratón frente a dichas composiciones de vacuna, analizar una respuesta de célula T auxiliar en dicho ratón frente a dichas composiciones de vacuna, analizar
    40 una respuesta de célula T citotóxica en dicho ratón frente a dichas composiciones de vacuna, y seleccionar una vacuna optimizada aplicando a los resultados criterios preseleccionados.
  13. 14. Método según la reivindicación 13, en el que las dos o más vacunas candidatas difieren sólo en la proporción
    entre el antígeno y el adyuvante presente en la vacuna. 45
  14. 15. Método según la reivindicación 13, en el que las dos o más vacunas candidatas difieren sólo en el tipo de adyuvante presente en la vacuna.
  15. 16. Método para determinar si una vacuna presenta un riesgo de inducción de una enfermedad autoinmunitaria 50 cuando se administra a un ser humano, comprendiendo el método:
    a) administrar la vacuna a un ratón de la reivindicación 1 o 2; y b) analizar una respuesta autoinmunitaria en el ratón; en el que
    55 la observación de una respuesta autoinmunitaria en el ratón indica que la vacuna presenta un riesgo de inducción de una enfermedad autoinmunitaria cuando se administra a un ser humano.
  16. 17. Célula de ratón transgénico aislada que tiene genes endógenos no funcionales de H2 clase I y H2 clase II, y que comprende un transgén funcional de HLA-A2 y un transgén funcional de HLA-DR1, en la que dicho transgén de
    60 HLA-A2 es una monocadena que comprende la beta 2 microglobulina humana enlazada covalentemente a la cadena pesada de HLA-A2.
  17. 18. Célula de ratón transgénico según la reivindicación 17, en la que el transgén de HLA-A2 comprende la secuencia
    de HLA-A2 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 1, y el transgén de HLA-DR1 comprende la 65 secuencia de HLA-DR1 proporcionada en el listado de secuencias en SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3.
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