ES2380651T3

ES2380651T3 - Biomarcadores y procedimientos para determinar la sensibilidad a moduladores de recpetor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular

Info

Publication number: ES2380651T3
Application number: ES10151105T
Authority: ES
Inventors: Mark David Ayers
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2005-09-01
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2012-05-17
Anticipated expiration: 2026-08-30
Also published as: CA2621303A1; WO2007028005A8; EP1937314A4; EP2182078B1; JP4994379B2; WO2007028005A2; EP2182078A1; JP2009507226A; US8067189B2; US20090098584A1; EP1937314A2; WO2007028005A3; ATE543914T1

Abstract

Un procedimiento in vitro para identificar un mamífero que responderá terapéuticamente a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar un modulador de VEGFR-2, en el que el procedimiento comprende: (a) medir en al menos una muestra biológica de mamífero obtenida a partir del mamífero, el nivel de al menos un biomarcador que se escoge entre los biomarcadores de la Tabla 1 (b) seguir la exposición del mamífero al modulador de VEGFR-2, midiendo en al menos una muestra biológica de mamífero obtenida a partir del mamífero, el nivel de al menos un biomarcador, en el que la diferencia de nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (b) en comparación con el nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a) indica que el mamífero responderá terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer y en el que al menos un biomarcador es colágeno IV.

Description

Biomarcadores y procedimientos para determinar la sensibilidad a moduladores del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular

Campo técnico

La presente invención se refiere de manera general al campo de la fármaco-genómica, y de manera más específica, a procedimientos usados para controlar la respuesta o para determinar la sensibilidad en pacientes con el fin de permitir la identificación de perfiles genéticos individualizados que contribuyan al tratamiento de enfermedades y trastornos.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una enfermedad con amplia heterogeneidad histoclínica. Aunque algunas características clínicas e histológicas convencionales se han correlacionado con los pronósticos, el mismo tipo pronóstico aparente de tumores varía ampliamente en su respuesta a la terapia y posterior supervivencia del paciente.

Se necesitan nuevos marcadores pronósticos y predictivos, que faciliten una individualización de la terapia para cada paciente, con el fin de predecir de manera precisa la respuesta en la clínica del paciente a los tratamientos, tales como moléculas de pequeño tamaño o fármacos de moléculas biológicas,. El problema se puede resolver mediante la identificación de nuevos parámetros que puedan predecir mejor la sensibilidad del paciente al tratamiento. La clasificación de las muestras del paciente es un aspecto crucial para el diagnóstico del cáncer y el tratamiento. La asociación de la respuesta del paciente con un tratamiento con marcadores moleculares y genéticos puede abrir nuevas oportunidades para el desarrollo del tratamiento en pacientes que no desarrollan respuesta, o diferenciar una indicación de tratamiento entre otras elecciones de tratamiento de mayor confianza en cuanto a su eficacia. Además, las pre-selección de pacientes con probabilidad de respuesta positiva a un medicamento, fármaco

o terapia de combinación puede reducir el número de pacientes necesario en un estudio clínico o acelerar el tiempo que se requiere para completar el programa de desarrollo clínico (M. Cockett et al, Current Opinion in Biotechnology,

11: 602-609 (2000)).

La capacidad para determinar que pacientes están respondiendo a las terapias de anti-angiogenésis (tales como moduladores de VEGFR-2) o predecir la sensibilidad de fármacos en pacientes es particularmente problemática debido a que las respuestas de los fármacos reflejan no solo las propiedades intrínsecas con respecto a las células diana, sino también las propiedades metabólicas del anfitrión. Los esfuerzos para usar la información genética con el fin de predecir o controlar la respuesta a fármacos se han centrado principalmente en los genes individuales que presentan amplios efectos, tales como genes de resistencia a multi-fármacos mdrl y mrpl (P. Sonneveld, J. Intern. Med., 247:521-534 (2000)).

El desarrollo de tecnologías de micromatrices para la caracterización a gran escala del patrón de expresión de ARNm del ge ha hecho posible la búsqueda sistemática de marcadores moleculares y la clasificación de los cánceres en distintos grupos que no resultan evidentes mediante procedimientos histo-patológicos tradicionales (J. Khan et al., Cancer. Res., 58:5009-5013 (1998); A. A. Alizadeh et al. Nature, 403:503-511 (2000); M Brittner et al., Nature, 406:536-540 (2000); J. Khan et al., Nature Medicine, 7(6): 673-679 (2001); y T. R. Golub et al., Science, 286:531-537 (1999); U . Alon et al., P. N. A. S. EE.UU., 96:6745-6750 (1999)). Dichas tecnologías y herramientas moleculares han hecho posible controlar el nivel de expresión de un gran número de transcripciones dentro de una población celular en un tiempo dado (véase, por ejemplo, Schena et al., Science, 270:467-470 (1995); Lochart et al., Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchard et al, Nature Biotechnology, 14:1649 (1996); patente de EE.UU. Nº. 5.569.588 de Ashby et al.).

Estudios recientes demuestran que la información sobre la expresión génica generadas por el análisis de micromatrices de tumores humanos puede predecir el desenlace clínico (L. J. van´t Veer et al., Nature, 415:530-536 (2002); M. Ship et al., Nature Medicine, 8(1): 68-74 (2002); G. Glinsky et al., The Journal of Clin. Invest. 113(6):913923 (2004)). Esto descubrimientos aportan la esperanza de mejorar en gran medida el tratamiento del cáncer mediante la predicción y control de la respuesta de tumores individuales frente a la terapia.

Se requieren procedimientos nuevos y alternativos y procedimientos para determinar la sensibilidad del fármaco o para controlar la respuesta en pacientes con el fin de permitir el desarrollo de diagnósticos individualizados que son necesarios para tratar enfermedades y trastornos basados en la respuesta del paciente a nivel molecular.

El biomarcador estanocalcina y su uso para el control de la eficacia del tratamiento del cáncer por medio del inhibidor VEGFR-2 han sido descritos en el documento WO 2005/059179.

Sumario de la invención

Se proporcionan procedimientos para determinar la sensibilidad del paciente o controlar la respuesta a nivel molecular frente a uno o más moduladores del receptor 2 (VEGFR-2) del factor de crecimiento endotelial vascular. También se proporcionan procedimientos para determinar o predecir si un individuo que requiere terapia para un

estado de enfermedad tal como cáncer responde o no al tratamiento, antes de la administración del tratamiento, en el que el tratamiento comprende la administración de uno o más moduladores de VEGFR-2. El uno o más moduladores de VEGFR-2 son compuestos que se pueden escoger entre, por ejemplo, uno o más ligandos específicos VEGFR-2, una o más inhibidores de VEGFR-2 de molécula pequeña o uno o más anticuerpos monoclonales de unión de VEGFR-2.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para identificar un mamífero que responde terapéuticamente a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar una modulador VEGFR-2, en el que el procedimiento comprende: (a) medir el nivel de al menos un biomarcador escogido entre el biomarcador de la Tabla 1 en el mamífero; (b) seguir la exposición del mamífero al modulador VEGFR-2, medir el nivel de al menos un biomarcador en dicha muestra biológica, en el que la diferencia del nivel de al menos un biomarcador medida en la etapa (b) en comparación con la diferencia de nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a) indica que el mamífero responde terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que el menos un biomarcador es colágeno IV.

Una diferencia de nivel de biomarcador que sea suficiente para indicar si el mamífero responde o no terapéuticamente al procedimiento de tratamiento del cáncer la puede determinar de forma sencilla un experto usando técnicas conocidas. El aumento o disminución del nivel del biomarcador se puede correlacionar para determinar si la diferencia es suficiente para identificar un mamífero que responde terapéuticamente. En un primer aspecto, se puede determinar la diferencia del nivel del biomarcador que sea suficiente antes de determinar si el mamífero responde terapéuticamente al tratamiento. En un aspecto, la diferencia en el nivel del biomarcador es una diferencia en el nivel de ARNm (medida, por ejemplo, por medio de RT-PCR o un micromatriz), tal como una diferencia de al menos dos veces, una diferencia de al menos tres veces o una diferencia de al menos cuatro veces en el nivel de expresión. En otro aspecto, la diferencia en el nivel de expresión del biomarcador viene determinada por IHC. En otro aspecto, la diferencia en el nivel del biomarcador se refiere a un valor p < 0,05 en el análisis de Anova. En otro aspecto, la diferencia viene determinada en un ensayo de ELISA.

Según se usa en el presente documento, responder terapéuticamente se refiere al alivio o mitigación del cáncer. Esto significa que se aumenta la esperanza de vida del individuo afectado por el cáncer o que se pueden reducir o mejorar uno o más de los síntomas del cáncer. El término engloba la reducción de la proliferación de células cancerígenas o el volumen del tumor. Se puede medir si el mamífero responde terapéuticamente por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como formación de imágenes de PET.

El mamífero puede ser, por ejemplo, un humano, rata, ratón, perro, conejo, cerdo, oveja, vaca, caballo, gato, primate

o mono.

La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, al menos uno de suero, sangre fresca, células mononucleares de sangre periférica, sangre congelada, plasma fresco, plasma congelado, orina, saliva, piel, folículo capilar, médula ósea o tejido tumoral.

El nivel de al menos un biomarcador puede ser, por ejemplo, el nivel de proteína y/o de transcripción de ARNm del(de los) biomarcador(es).

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para identificar a un mamífero que responde terapéuticamente a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar un modulador VEGFR-2, en el que el procedimiento comprende: (a) seguir la exposición del mamífero al modulador de VEGFR-2, medir el nivel de al menos un modulador escogido entre los moduladores de la Tabla 1 en dicha muestra biológica, en el que la diferencia en el nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a), en comparación con el nivel del biomarcador en el mamífero que no ha sido expuesto a dicho modulador VEGFR-2, indica que el mamífero responde terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer, y en el que al menos un biomarcador es colágeno IV.

Además, se describe un procedimiento para someter a ensayo o predecir si el mamífero responde terapéuticamente al procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar el modulador VEGFR-2 que se describe en el presente documento, en el que el procedimiento comprende: (a) medir en el mamífero el nivel de al menos un biomarcador que se escoge entre los biomarcadores de la Tabla 1; (b) exponer el mamífero al modulador VEGFR-2;

(c) seguir la exposición de la etapa (b), medir el nivel de al menos un biomarcador en el mamífero, en el que la diferencia de nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (c) en comparación con el nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a) indica que el mamífero responde terapéuticamente a dicho procedimiento para el tratamiento del cáncer.

El hecho de que un compuesto inhiba la actividad de VEGFR-2 se puede determinar por medio de un procedimiento que comprende: (a) exponer el mamífero al compuesto; y (b) seguir la etapa de exposición (a), medir el nivel de al menos un biomarcador escogido entre los biomarcadores de la Tabla 1 en el mamífero, en el que la diferencia de nivel de dicho biomarcador medido en la etapa (b), en comparación con el nivel del biomarcador en el mamífero que no ha sido expuesto a dicho compuesto, indica que el compuesto inhibe la actividad de VEGFR-2 en el mamífero.

El hecho de que un mamífero haya sido expuesto a un compuesto que inhibe la actividad de VEGFR-2 se puede

determinar por medio de un procedimiento que comprende (a) exponer el mamífero al compuesto; y (b) seguir la exposición de la etapa (a), medir el nivel de al menos un biomarcador escogido entre los biomarcadores de la Tabla 1 en el mamífero, en el que la diferencia de nivel de dicho biomarcador medido en la etapa (b), en comparación con el nivel del biomarcador en un mamífero que no ha sido expuesto a dicho compuesto, indica que el mamífero ha sido expuesto a un compuesto que inhibe la actividad de VEGFR-2.

El hecho de que el mamífero responde a un compuesto que inhibe la actividad de VEGFR-2 se puede determinar por medio de un procedimiento que comprende (a) exponer el mamífero al compuesto; y (b) seguir la exposición de la etapa (a), medir el nivel de al menos un biomarcador escogido entre los biomarcadores de la Tabla 1 en el mamífero, en el que la diferencia del nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (b), en comparación con el nivel de al menos un biomarcador en un mamífero que no ha sido expuesto a dicho compuesto, indica que el mamífero está respondiendo al compuesto que inhibe la actividad de VEGFR-2.

Según se emplea en el presente documento, "responder" engloba responder por medio de una respuesta biológica y celular, así como también una respuesta clínica (tal como síntomas mejorados, un efecto terapéutico o un efecto adverso), en un mamífero.

También se describen en el presente documento un biomarcador aislado que se escoge entre los biomarcadores de la Tabla 1 así como un biomarcador que comprende dos o más biomarcadores escogidos entre los biomarcadores de la Tabla 1. Los biomarcadores de la invención comprenden secuencias escogidas entre las secuencias de nucleótido y amino ácido de la Tabla 1 y el Listado de Secuencias, así como los fragmentos y sus variantes.

Se pueden usar kit para determinar o predecir si un paciente es susceptible o resistente al tratamiento que comprende uno o más moduladores de VEGFR-2. El paciente puede presentar un tumor cancerígeno tal como, por ejemplo, cáncer de colon o tumor.

El kit puede comprender un recipiente apropiado que comprende una o más micromatrices especializadas de la invención, uno o más moduladores de VEGFR-2 para su uso en células de ensayo a partir de muestras de ensayo de tejidos de paciente o muestras de paciente e instrucciones de uso. El estucho puede comprender reactivos o materiales para el control de la expresión del biomarcador establecido a nivel de ARNm o proteína.

El kit puede comprender dos o más biomarcadores escogidos entre los biomarcadores de la Tabla 1.

El kit puede comprender al menos uno de un anticuerpo o un ácido nucleico para detectar la presencia de al menos uno de los biomarcadores escogidos entre los biomarcadores de la Tabla 1. El kit puede además comprender instrucciones para determinar si el mamífero responde o no terapéuticamente a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar un compuesto que inhibe la actividad de VEGFR-2. Las instrucciones pueden comprender las etapas de (a) medir el nivel de al menos un biomarcador escogido entre los biomarcadores de la Tabla 1 en el mamífero, (b) exponer el mamífero al compuesto, (c) seguir la exposición de la etapa (b), medir el nivel de al menos un biomarcador en el mamífero, en el que la diferencia de nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (c) comparado con el nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a) indica que el mamífero responde terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer.

Se pueden usar ensayos de reconocimiento para determinar si el paciente es susceptible o resistente al tratamiento con uno o más moduladores de VEGFR-2.

Además, el presente documento describe un procedimiento para el control del tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad, en el que dicha enfermedad se trata por medio de un procedimiento que comprende administrar uno o más moduladores de VEGFR-2.

En el presente documento, también se describen perfiles genéticos individualizados que son necesarios para tratar enfermedades y trastornos basados en la respuesta del paciente a nivel molecular.

También se describen en el presente documento micromatrices especializadas, por ejemplo, micromatrices de oligonucleótidos o micromatrices de cDNA, que comprenden uno o más biomarcadores que presentan perfiles de expresión que correlacionan bien la sensibilidad o bien la resistencia a uno o más moduladores de VEGFR-2.

En el presente documento se describen anticuerpos, incluyendo los monoclonales y los policlonales, dirigidos contra uno o más biomarcadores de la invención.

La invención se comprende mejor tras la lectura de la memoria descriptiva detallada de la misma tomando en consideración las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra el procedimiento usado para el descubrimiento y validación de genes co-expresados con VEGFR-2 en perfiles de expresión de genes tumorales en humanos. La Figura 2 ilustra el grupo jerárquiico de 94 genes de VEGFR-2 co-expresados en cáncer de colon en humanos y la identificación de dos sub-grupos de pacientes distintos

La Figura 3 ilustra los datos de perfil de expresión génica (niveles de ARNm). La Figura 4 ilustra la validación de los datos de expresión génica por medio de IHC. La Figura 5 ilustra la validación de los datos de expresión génica por medio de ELISA. La Figura 6 ilustra los resultados de ELISA de colágeno de tipo IV (3 pacientes por cohorte medida la diferencia

5 entre el día 0 & 26). La Figura 7 ilustra los resultados de ELISA nivel de colágeno de tipo IV en sangre de pacientes. La Figura 8 ilustra los resultados de comparación de supervivencia libre de la enfermedad basados en los Niveles de Expresión de ARNm (COL4A1) de colágeno de tipo IV en tumores colorectales primarios. La Figura 9 ilustra el ejemplo de la eficacia del inhibidor de VEGFR-2 en un modelo de xenotrasplante de tumor

10 L2987.

Descripción detallada de la invención

La identificación de biomarcadores que proporcionan lecturas rápidas y accesibles de eficacia, exposición a fármaco

o respuesta clínica se está volviendo cada vez más importante en el desarrollo clínico de posibles fármacos. Las realizaciones de la invención incluyen la medición de cambios en los niveles de proteínas segregadas, o

15 biomarcadores en plasma, que representan una categoría de biomarcador. En un aspecto, las muestras de plasma, que representan una fuente fácilmente accesible de material, sirven como tejido sustituto para el análisis del biomarcador.

Se describen los biomarcadores que responden a la modulación de un mecanismo específico de transducción de señal y también se correlacionan con la resistencia o la sensibilidad del modulador de VEGFR-2 en el presente

20 documento. Las Tablas 1 y 2 y el Listado de Secuencias proporcionan biomarcadores útiles en los procedimientos de la invención, incluyendo las secuencias tanto de polinucleótidos como de polipéptidos. En los procedimientos de la invención se mide el nivel del menos colágeno de tipo IV.

Tabla 1- Biomarcadores de VEGFR-2 (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

Título unigen y Nº. Id. Secuencia: Descripción de Affymetrix Conjunto de exploración de affimetrix

KDR: receptor de dominio de inserto de quinasa (un receptor de tirosina quinasa de tipo III) (LOC3791) Nos. Id. Sec.: 1 (ADN) y 95 (amino ácido): gb: NM_002253/DEF = receptor de dominio de inserto de quinasa de Homo sapiens (un receptor de tirosina quinasa de tipo III) (KDR), ARNm. /FEA=ARNm/GEN=KDR /PROD=receptor de dominio de inserto de quinasa (un receptor de tirosina quinasa de tipo III)/DB_XREF=gi:11321596/UG=Hs. receptor de dominio de inerto de quinasa12337 (un receptor de tirosina quinasa de tipo III)/FL=gb;NM_002253.1. gb AF035121.1 gb:AF063658.1 203934_at

GJAP4: proteína de inyección de hueco, alfa 4, 37 kDa (conexina 37) (LOC2701) Nos. Id. Sec.: 2 (ADN) y 96 (amino ácido): Grupo Incl. M96789: conexina 37 de Homo sapiens (GJA4) ARNm, cds completos/cds=(64.1065)/gb=M96789/ gi=18322/len=1591 40687_at

CIQR1: componente de complemento 1, subcomponente q, receptor 1 (LOC22918) Nos. Id. Sec.: 3 (ADN) y 97 (amino ácido): gb:NM_012072.2/DEF= receptor C1q de componente de complemento de Homo sapiens (C1 QR), ARNm. /FEA =ARNm/GEN=C1QR/PROD= receptor C1q de componente de complemento /DB_XREF= gi:11496985/UG=Hs.97199 receptor C1q de componente de complemento /FL=gb:NM_012072.2 gb:U94333.1 202878_s_at

CDH5: caderina 5, tipo 2, VEcaderina (epitelio vascular) (LOC1003) Nos. Id. Sec.: 4 (ADN) y 98 (amino ácido): gb:NM_001795/DEF= caderina 5 de Homo sapiens, tipo 2, VE-caderina (epitelio vascular) (CDH5), ARNm./FEA=ARNm /GEN=CDH5/PROD =caderina 5, tipo 2, caderina-VE (epitelio vascular)/DB XREF = gi;4502726 /UG=Hs.76206 caderina 5, tipo 2, caderina-VE (epitelio vascular) /FL = gb:U84722.1 gb:NM 001795.1 gb:AB035304.1 204677_at

GPR116: receptor 116 acoplado a: Consenso incluye gb: BF941499 212950_at

proteína (LOC221395): /FEA=EST/DB XREF= gi:12358819/DB_

XREF = est:nac74e09.x1

Nos. Id. Sec. 5 (ADN) y 99 (amino: /CLONE=IMAGE:3439985/UG=Hs.22039

ácido): proteína K1AA0758

CALCRL: receptor de tipo calcitonina (LOC10203) Nos. Id. Sec.: 6 (ADN) y 100 (amino ácido): gb:NM_005795.1/DEF = receptor de tipo calcitonina de Homo sapiens (CALCRL), ARNm, /FEA=ARNm/GEN=CALCRL /PROD = receptor de tipo calcitonina /DB_XREF = gi:5031620/UG=Hs.receptor de tipo calcitonina152175 /FL=gb:L76380.1.gb: NM 005795.1 206331_at

AGTRL1: receptor de tipo I de angiotensina II (LOC187) Nos. Id. Sec.: 7 (ADN) y 101 (amino ácido): Consenso incluye gb: X89271.1 /DEF= ARNm H. sapiens para receptor HG11 orphan. /FEA= ARNm /GEN = HG11 /PROD = HG11 receptor de orphan/DB_XREF=gi:6911643 /UG= Hs. Receptor de tipo I de angiotensina /FL= gb: NM 005161.1 213592_at

MMRN2: multimcrina 2 (LOC79812) Nos. Id. Sec.: 8 (ADN) y 102 (amino ácido): gb: NM_024756.1 /DEF= proteína FLJ 13465 (FLJ 13465) hipotética de Homo sapiens, ARNm./FEA= ARNm /G EN= FLJ 13465 /PROD= proteína hipotética HLJ13465/DB_ XREF=gi. 13376090/UG= Hs. 127216 Proteína hipotética FLJ 13465/FL = gb.NM 024756.1 219091_s_at

ELTD I: EGF, latrofilina y dominio de siete transmembranas que contiene 1 (LOC64123) Nos. Id. Sec.: 9 (ADN) y 103 (amino ácido): gb: NM_022159.1 /DEF = proteína ETL de Homo sapiens (ETL), ARNm. /FEA = ARMm /GEN=ETL /PROD= proteína ETL/DB_ XREF= gi: 11545907 /UG=Hs.57958 EGF-TM7-proteína relacionada con latrofilina /FL=gb:AF192403.a gb:NM 022159.1 219134_at

CCL11: ligando 11 de quemoquina (motif C-C) (LOC6356) Nos. Id. Sec.: 10 (ADN) y 104 (amino ácido): gb: D49372.1 /DEF= ARNm humano para eotaxina, cds. completo. /FEA= ARNm /PROD =eotaxina/DB_XREF=gi. 1552240/UG = Hs.54460 subfamilia A de citoquina inducible pequeña (Cis-Cis), miembro 11 (eotaxina) /FL= gb:U46573.1 bo:D49372.1 gb:NM 002986.1 210133_at

EDG1: diferenciación endotelial, receptor acoplado a proteínaesfingolípico G, 1 (LOC1901) Nos. Id. Sec.: 11 (ADN) y 105 (amino ácido): gb: N_001400.2 /DEF = diferenciación endotelial de Homo sapiens, receptor acoplado a proteínas-esfingolípico G (EDG1), ARNm, /FEA=ARNm/GEN=EDG1 /PROD = diferenciación endotelial, receptor acoplado a proteínaesfingolípido G, 1 /DB_XREF= gi: 13027635/UG = Hs.154210 diferenciación endotelial, receptor acoplado a proteínaesfingolípido G, I/FL=gb:NM_001400.2. gb:M31210.1. gb:AF233365.1 204642_at

C1QR1: componente 1 de complemento, subcomponente q, receptor 1 (LOC22918): Consenso incluye gb:W72082/FEA=EST /DB_XREF= gi: 1382588 /DB XREF= est: zd70c06.s1 202877_s_at

Nos. Id.Sec: 12 (ADN) y 106 (amino ácido): /CLONE=IMAGE: 345994 / UG= Hs.97199 receptor C1q del componente de complemento /FL= gb:NM_012072.2 gb:U94333.1

LPHN2: latrofilina 2 (LOC23266) Nos. Id. Sec.: 13 (ADN) y 107 (amino ácido): gb:NM_012302.1 /DEF= latrofilina de Homo sapiens (KIAA0786), ARNm. /FEA = ARNm /GEN = KIAA0786 /PROD= latrofilina /DB_XREF= gi:6912463 /UG=Hs.24212 latrofilina/FL=gb.AF 04939.1 gb:NM 012302.a 206953_s_at

COL15A1: colágeno, tipo XV, alfa 1 (LOC1306) Nos. Id. Sec.: 14 (ADN) y 108 (amino ácido): gb: NM-001855.1/DEF = colágeno de Homo sapiens, tipo XV, alfa (COL1SA1), ARNm, /FEA= ARNm/GEN=COL15A1 /PROD = colágeno, tipo XV, alfa 1, /DB_ XREF= gi:4502940/UG= Hs.83164 colágeno, tipo XV, alfa 1/FL = gb:NM_001855.1 gb: L25286.1 203477_at

TNC: tenascina C (hexabraquion) (LOC3371) Nos. Id. Sec.: 15 (ADN) y 109 (amino ácido): gb: NM_002160.1 /DEF = hexabraquion de Homo sapiens (tenascina C, citotactina) (HXB), ARNm./FEA = ARNm /GEN = HXB /PROD = hexabraquion (tenascina C, citotactina) /DB_XREF= gi: 4504548 /UG=Hs. 289114 hexabraquion (tenascina C, citotactina) /FL = gb: M55618.1 gb:NM 002160.1 201645_at

-: Secuencias transcritas (LOC---) Nos. Id. Sec.: 16 (ADN): Consenso incluye gb: AW973834 /FEA=EST/DB XREF= gi: 8165022 /DB XREF= est:EST385936 /UG = Hs. 1105884 ESTs 222326_at

TEK: TEK tirosina quinasa, endotelial (malformaciones venosas, cutáneas múltiples y mucosales) (LOC7010) Nos. Id. Sec.: 17 (ADN) y 110 (amino ácido): gb: NM_000459.1 /DEF= TEK tirosina quinasa de Homo sapiens, endotelial (malformaciones venosas, cutáneas múltiples y mucosales), (TEK), ARMm. /FEA=ARNm /GEN=TEK/PROD=TEK tirosina quinasa, endotelial /DB XREF=gi. 4557868 /UG=Hs.89460 TEK tirosina quinasa, endotelial (malformaciones venosas, cutáneas múltiples y mucosales) /FL= gb: L06139.1 gb: NM 000459.1 206702_at

CCL2: ligando 2 de quemoquina (motif C-C) (LOC6347) Nos. Id. Sec.: 18 (ADN) y 111 (amino ácido): Consenso incluye gb: S69738.1 /DEF=MCP-1= proteína quimiotáctica de monocito, células endoteliales aórticas humanas, ARNm, 661 nt. /FEA=ARMm /GEN=MCP-1/PROD=MCP1 /DB_XREF = gi:545464 / UG= Hs.303649 citoquina A2 inducible pequeña (proteína quimiotáctica de monocito 1, homólogo de ratón Sig-je) 216598_s_at

KCNJ8: conducto de rectificación hacia el interior de potasio, subfamilia J, miembro 8 (LOC3764) Nos. Id. Sec.: 19 (ADN) y 112 (amino ácido): gb: NM_004982.1 /DEF= conducto de rectificación hacia el interior de potasio de Homo sapiens, subfamilia J, miembro 8 (KCNJ8), ARNm, /FEA=ARNm /GEN = KCHJ8 /PROD = conducto de rectificación hacia el interior de potasio, subfamilia J, miembro 8 /DB_XREF= gi: 4826801 / UG= Hs. 102308 conducto de rectificación hacia el interior de potasio, subfamilia J, miembro 8 /FL= gb: D50312.1 gb 205304_s_at

GNG11: proteína de unión a nucleótido de guanina (proteína G), gamma 111 (LOC2791) Nos. Id. Sec.: 20 (ADN) y 113 (amino ácido): gb: NM_004126.1 /DEF = proteína 11 de unión a nucleótido de guanina de Homo sapiens (GNG11), ARNm. /FEA= ARNm /GEN=GNG11/PROD = proteína 11 de unión a nucleótido de guanina/ DB-XREF = gi: 4758447 /UG = Hs. 83381 proteína 11 de unión a nucleótido de guanina, /FL= gb:NM_004126.2 gb:U31384.1 204115_at

PCDH17: protocaderina 17 (LOC27253) Nos. Id. Sec.: 21 (ADN) y 114 (amino ácido): gb: NM-014469.1 /DEF= protocaderina 17 de Homo sapiens (PCDH 17), ARNm, /FEA= ARNm /GEN= PCDH17 /PROD = protocaderina 17/DE_XREF= gi: 7657446 /UG= Hs. 106511 protocaderina 17 /FL = gb:AF029343.1 gb:NM_014459.1 205656_at

PECAM1: molécula de adhesión a célula endotelial/trombocito (antígeno CD31) (LOC5175) Nos. Id. Sec.: 22 (ADN) y 115 (amino ácido): Consenso incluye bg: AW574504 /FEA=EST /DB_XREF = gi: 7246055/DB_ XREF= est:UI-HF-BK0-aab-h-05-0-U1.s1 /CLONE=IMAGE:3053409 /UG=Hs. 78146 molécula de adhesión a célula endotelial trombocito (antígeno CD31) /FL= gb: M37780.1 gb: M28526.1 gb:NM 000442.1 208982_at

PPAP2B: fosfatasa de tipo de 2B de ácido fosfatídico (LOC8613) Nos. Id. Sec.: 23 (ADN) y 116 (amino ácido): gb:AB000889.1 /DEF= ARNm de Homo sapiens para fosfatasa 2b de ácido fosfatídico, cds. completos. /FEA= ARNm /PROD = fosfatasa 2b de ácido fosfatídico /DBZXREF= gi: 2467299 /UG= Hs. 331371 fosfatasa de tipo 2 B de ácido fosfatídico /FL = gb: U79294.1. gb: AB000889.1 gb:AFA017786.1 209355_s_at

PECAM 1: trombocito / molécula de adhesión a célula endotelial (antígeno CD31) (LOC5175) Nos. Id. Sec.: 24 (ADN) y 117 (amino ácido): Consenso incluye gb: AA702701 /FEA= EST/DB_XREF= gi: 2705814/DB_ XREF=est:zi90h02.s1/ CLONE = IMAGE: 448083/UG=HS.78146 molécula de adhesión a célula endotelial de trombocito (antígeno CD31) /FL=gb: M37780.1 gb:M28526.1 gb:NM 00442.1 208981_at

COL16A1: colágeno, tipo XVI, alfa I (LOC1307) Nos. Id. Sec.: 25 (ADN) y 118 (amino ácido): gb: NM_001856.1 /DEF= colágeno de Homo sapiens, tipo XVI, alfa I (COL16A1), ARNm. /FEA = ARNm /GEN=COL16A1 /PROD = colágeno, tipo XVI, alfa 1/DB_ XREF = gi: 1386158/UG=Hs. 26208 colágeno, tipo XVI, alfa 1/FL = gb. NM001856.1 gb: M92642.1 204345_at

NR3C1: receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro 1 (receptor de glucocorticoide) (LOC2908) Nos. Id. Sec.: 26 (ADN) y 119 (amino ácido): Consenso incluye gb: X03348.1 /DEF = ARNm humano para receptor de beta-glucocorticoide (clon OB 10). /FEA= ARNm /PROD = receptor de beta-glucocorticoide /DB_XREF = gi.31681 /UG = Hs. 75772 receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro I 216321_s_at

PECAM1: trombocito/molécula de adhesión celular endotelial (antígeno CD31) (LOC5175) Nos. Id. Sec.: 27 (ADN) y 120 (amino ácido): gb: M37780.1 / DEF= ARNm de proteína superficial de leucocito humano (CD31), cds completos, /FEA= ARNm /GEN= CD31 /PROD = proteína superficial humana/DB_ XREF= gi:187239 /UG = Hs. 78146 molécula de adhesión endotelial de trombocito (antígeno CD31) /FL=gb: M37780.1 gb:M28526.1 gb:NM 000442.1 208983-s_at

RAMP3: proteína 3 que modifica la actividad del receptor (calcitonina) (LOC 10268) Nos. Id. Sec.: 28 (ADN) y 121 (amino ácido): gb:NM_005856.1 / DEF= proteína 3 que modifica la actividad del receptor (calcitonina) de Homo sapiens (RAMP3), ARNm./FEA= ARNm /GEN = RAMP3/PROD = precursor de proteína 3 que modifica la actividad del receptor (calcitonina) /DB_XREF = gi:5032022 /UG=Hs.25691 proteína 3 que modifica la actividad del receptor (calcitonina) /FL = gb:NM 005856.1 205326_at

MACM: molécula de adhesión a célula de melanoma Nos. Id. Sec.: 29 (ADN) y 122 (amino ácido): gb:AF 089868.1 /DEF= precursor de glucoproteína de P1H12 de la superficie celular de Homo sapiens, ARNm, cds. completos/FEA= ARNm /PROD = precursor de glucoproteína P1H12 de superficie celular /DB_XREF = gi: 4336423 /UG= Hs. 211579 molécula de adhesión a melanoma /FL= gb:AF089868.1 gb:NM 006500.1 209087_x_at

TCF4: factor de transcripción 4 (LOC6925) Nos. Id. Sec.: 30 (ADN) y 123 (amino ácido): gb ;NM_003199.1 /DEF= factor de transcripción de Homo sapiens (TCF4), ARNm. /FEA = ARNm/GEN=TCF4 /PROD= factor de transcripción 4, isoforma b/ DB-XREF= gi:4507398 /UG=Hs. 326198 factor de transcripción 4 /FL=gb: M74719.1 gb:NM 003199.1 203753_at_4

MCAM: molécula de adhesión a: gb:M29277.1, /DEF = glucoproteína 18 210869_s_at ARNm

célula de melanoma (LOC4162): (variante 3) de aislado humano, cds. completos, /FEA=ARNm/PROD= glucoproteína MUC18

Nos. Id. Sec.: 31 (ADN) y 124 (amino ácido): /DB_XREF=gi:530047(UG=Hs. molécula de adhesión a melanoma 211579 /FL = gb: M29277.1

CPE: carboxipeptidasa E (LOC1363) Nos. Id. Sec.: 32 (ADN) y 125 (amino ácido): gb: NM_001873.1 /DEF= carboxipeptidasa E de Homo sapiens (CPE), ARNm, /FEA=ARNm/GEN=CPE /PROD= carboxipeptidasa E precursor /DB_XREF0 gi: 4503008/UG=Hs. 75630 carboxipeptidasa E/FL=gb: AN001873.1 201117_s_at

PLVAP: proteína asociada a vesícula de plasmalema: gb:AF326591.1 /DEF= ARNm de proteína de estructura unida a endotelio - fenestrada de Homo sapiens (FELS), cds completos, /FEA=ARNm /GEN=FELS 221529_s_at

Nos. Id. Sec.: 33 (ADN) y 126 (amino ácido): /PROD = proteína de estructura unida a endotelio-fenestrada /DB_XREF= gi: 12963352 /UG= Hs.107125 ARNm de proteína PV1 (PLVAP) de Homo sapiens, cds completos /FL= gb: AF326591.1 gb:AF348827.1

COL4A1: colágeno, tipo IV, alfa 1 (LOC1282) Nos. Id. Sec.: 34 (ADN) y 127 (amino ácido): Consenso incluye gb: A1922605 /FEA=EST /DB_XREF=gi 5658569/DB_XREF= est: wm90c05x1 /CLONE =IMAGE:2443208/UG=Hs.119129 colágeno, tipo IV, alfa I/FL=gb;NM 001845.1 211980_at

PRND: proteína 2 de prión (doblete) LOC23627) Nos. Id. Sec.: 35 (ADN) y 128 (amino ácido): Consenso incluye gb: Al133396 /DEF= Secuencia de ADN humano de RP51068H6 sobre cromosoma 20q11.1-11.23 Contiene un seudógeno similar a IDI1 (isopentenil-difosfato delta isomerasa), el gen para la proteína de prion similar a la proteína de doppel, el gen PRNP para la proteína de prion (p27-30) (Cr.../FEA=ARNm_1/DB_XREF=g gi_6562003 /UG=Hs. 121281 complejo de gen de prion, aguas abajo /FL = gb:NM 012409.1 222106_at

MCAM: molécula de adhesión a: gb: M28882.1 /DEF= ARNm de 211340_s_at

célula de melanoma (LOC4162): glucoproteína MUC18 humano, cds. completos, /FEA= ARNm

Nos. Id. Sec.: 36 (ADN) y 129: /PROD= glucoproteína MUC 18 /DB_

(amino ácido): XREF= gi: 529723

/UG = Hs211579 molécula de adhesión a

melanoma /FL= gb: M28882.1

EMCN: endomucina (LOC51705) Nos. Id. Sec.: 37 (ADN) y 130 (amino ácido): gb:NM_016242.1 /DEF= endomucina-2 de Homo sapiens (LOC51705), ARNm, /FEA=ARNm /GEN = LOC51705 /PROD = endomucina-2 /DB_XREF=gi: 7706452 /UG = Hs.41135 endomucina-2 /FL=gb:AB034695.1 gb:NM 016242.1 gb: AF205940.1 219436_s_at

PPAP2A: fosfatasa de tipo de 2A de ácido fosfatídico (LOC8611) Nos. Id. Sec.: 38 (ADN) y 131 (amino ácido): gb:AF0014403.1 /DEF= ARNm de fosfatasa alfa-a fosfatídica de tipo 2 (PAP2A) de Homo sapiens, cds. completos. /FEA= ARNm /GEND = PAP2-a2 /PROD= fosfatasa alfa-2 de ácido fosfatídico de tipo 2 /DB_XREF= gi: 3123849 /UG= Hs. 41569 fosfatasa de tipo 2A de ácido fosfatídico /FL = gb: AF0 14403.1 210946_at ácido

D2S448: gen asociado a melanoma (LOC7837) Nos. Id. Sec.: 39 (ADN) y 132 (amino ácido): Consenso incluye gb:BF342851 /FEA=EST /DB_XREF =gi: 11289878/DB_ XREF= est:602015135F1 /CLONE=IMAGE:415066 /UG=Hs. 118893 Gen asociado a melanoma 212012_at

VWF: factor de von Willebrand (LOC7450): gb:NM_000552.2 /DEF= factor de von Willebrand de Homo sapiens (VWF), ARNm. /FEA=ARNm /GEN = VWF /PROD= precursor de factor de von Willebrand /DB_XREF = gi: 9257255 /UG=Hs. 110802 factor de von Willebrand/ FL= gb: NM 000552.2 202112_at

IL6R: receptor 6 de interleucina (LOC3570) Nos. Id. Sec.: 41 (ADN) y 134 (amino ácido): gb: NM 000565.1 /DEF = receptor 6 de interleucina de Homo sapiens (IL6R), ARNm, /FEA = ARNm /GEN = IL6R /PROD = receptor 6 de interleucina /DB_XREF = gi.4504672 (UG = Hs. 193400 receptor 6 de interleucina /FL = gb:NM 000565.1 205945_at

TNFA1P6: factor de necrosis tumoral, proteína 6 alfa-inducida (LOC7130) Nos. Id. Sec.: 42 (ADN) y 135 (amino ácido): Consenso incluye gb: AW 188198 /FEA =EST /DB_XREF = gi: 6462634 /DB_XREF = est:xj93f03.x1 /CLONE=IMAGE: 2664797 /UG=Hs. 29352 factor de necrosis tumoral, proteína 6 alfa-inducida/FL 0= gb:NM 007115.1 206025_s_at

KIAA0960: proteína KIAA0960: Consenso incluye gb: BF447246 /FEA=EST 213894_at

(LoC23249): /DB_XREF= gi: 11512384/DB_ XREF= est.:

7p46g06.x1

Nos. Id. Sec.: 43 (ADN) y 136: /CLONE-IMAGE:3648970 /UG= HS. 29900

(amino ácido): proteína KIAA0960

LAMA4: laminina, alfa-4 (LOC3910) Nos. Id. Sec.: 44 (ADN) y 137 (amino ácido): gb: NM_002290.2 /DEF= lamina de Homo sapiens, alfa-4 (LAMA4), ARNm, /FEA = ARNm /GEN= LAMA4 /PROD= precursor de laminina alfa 4 /DB-XREF=gi: 9845494 /UG= Hs.78672 laminina, alfa 4/FL) gb:NM 002290.2 202202_s_at

ENG: endoglina (síndrome 1 de Osler-Rendu-Weber) (LOC2022) Nos. Id. Sec.: 45 (ADN) y 138 (amino ácido): gb: NM_000118.1 /DEF = endoglina de Homo sapiens (síndrome 1 de Osler-Rendu-Weber) (ENG), ARNm, /FEA=ARNm /GEN=ENG /PROD = precursor de endoglina /DB_XREF=go 4557554 /UG = Hs 76753 endoglina (síndrome 1 de Osler-Rendu-Weber) /FL = gb:NM 000118.1 201809_s_at

CXCL6: ligando 6 de quemoquina (C-X-C motif) (proteína 2 quimiotáctica de granulocito) (LOC6372) Nos. Id. Sec.: 46 (ADN) y 139 (amino ácido): gb:NM_002993.1 /DEF = citoquina inducible pequeña de Homo sapiens subfamilia B (Cis-X-Cis), miembro 6 (proteína 2 quimiotáctica de granulocito) (SCYB6), ARNm, /FEA = ARNm /GEN = SCHYB6 /PROD = citoquina inducible pequeña de Homo sapiens subfamilia B (Cis-X-Cis), miembro 6 (proteína 2 quimiotáctica de granulocito) / DB_XREF = gi: 4506850 / UG= Hs. 164021 citoquina inducible pequeña de Homo sapiens subfamilia B (Cis-X-Cis), miembro 6 (proteína 2 quimiotáctica de granulocito) /FL = gb: U81234.1 gb:NM 002993.1 206336_at

FLJ10134: proteína FLJ10134 hipotética (LOC55076) Nos. Id. Sec.: 47 (ADN) y 140 (amino ácido): gb:NM 018001.1 /DEF = proteína FLJ10134 hipotética de Homo Sapiens, ARNm, /FEA = ARNm /GEN= FLJ 10134 /PROD = proteína FLJ10134 hipotética /DB_XREF = gi:8922242/UG = Hs. 104800 proteína hipotética FLJ10134 /FL = gb. NM 018004.1 219410_at

PPAP2B: fosfatasa de tipo de 2B de ácido fosfatídico (LOC8613) Nos. Id. Sec.: 48 (ADN) y 141 (amino ácido): Consenso incluye gb:AA628586 /FEA= EST /DB_XREF= gi:2540973 /DB_XREF=est:af39f12.s1 /CLONE=IMAGE:1034063 /UG= Hs. 173717 fosfatasa de tipo 2 B de ácido fosfatídico de Homo Sapiens (PPAP2B), ARNm 212226_s_at

PPAP2A: fosfatasa de tipo de 2A de ácido fosfatídico (LOC8611) Nos. Id. Sec.: 49 (ADN) y 142 (amino ácido): gb:AB000888 /DEF= ARNm de fosfatasa a fosfatasa 2a de ácido fosfatídico, cds. completos. /FEA= ARNm /PROD= fosfatasa 2a de ácido fosfatídico de tipo 2 /DB_XREF= gi: 2467297 /UG= Hs. 41569 fosfatasa de tipo 2A de ácido fosfatídico /FL = gb: AB000888.1 gb.AF017116.1 gb:AF014402.1 gb:NM 003711.1 209147_s_ at

HEG: homólogo HEG (LOC57493) Nos. Id. Sec.: 50 (ADN): Consenso incluye gb: A1148659 /FEA= EST /DB_XREF= gi: 3677128/DB_XREF= est:qc69c01x1 /CLONE=IMAGE:1714848/UG=HS.296326 ESTs 213069_at

PTGS2: prostaglandinaendoperóxido sintasa 2 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa) (LOC5743) Nos. Id. Sec.: 51 (ADN) y 143 (amino ácido): gb: NM_000963.1 /DEF = prostaglandinaendoperóxido sintasa 2 (prostaglandina GH sintasa y ciclooxigenasa) (PTGS2), ARNm /FEA= ARNm /GEN=PTGS2 /PROD= prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (prostaglandina GH sintasa y ciclooxigenasa) /DB XREF= gi: 4506264 /UG= Hs. 196384 prostaglandinaendoperóxido sintasa 2 (prostaglandina GH sintasa y ciclooxigenasa) /FL= gb: M90100.1 gb: L15326.1 gb:NM 000963.1 204748_at

GPR116: receptor 116 acoplado a proteína G (LOC221395) Nos. Id. Sec.: 52 (ADN) y 144 (amino ácido): Consenso incluye gb: N95226 /FEA= EST/DB_XREF = gi: 1267507 /DB_XREF= est: zb53f09.s1 /CLONE= IMAGE:307337 /UG= Hs. 22039 K1AA0758 proteína 212951_at

PPAP2B: fosfatasa de tipo de 2B de ácido fosfatídico (LOC8613) Nos. Id. Sec.: 53 (ADN) y 145 (amino ácido): Consenso incluye gb:AV725654 /FEA= EST /DB_XREF=gi:10831279/DB_XREF=est:AV725664.s1 /CLONE=HTCAOD7/UG= Hs. 173717 fosfatasa de tipo 2B de ácido fosfatídico de Homo Sapiens (PPAP2B), ARNm 212230_at

NR3C1: receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro 1 (receptor de glucocorticoide) (LOC2908) Nos. Id. Sec.: 54 (ADN) y 146 (amino ácido): gb: U01351.1 /DEF = ARNm receptor alfa-2 de glucocorticoide humano, cds completos. /FEA = ARNm /PROD= receptor alfa-2 de glucocorticoide /DB-XREF= gi: 458656 /FL = gb: U01351.1 211671_s_at

CSF3: factor 3 estimulador de colonia (LOC1440) Nos. Id. Sec.: 55 (ADN) y 147 (amino ácido): gb: NM_000759.1 /DEF = factor estimulador de colonia de Homo sapiens (granulocito) (CSF3), ARNm, /FEA= ARNm /GEN = CSF3 / PROD = factor 3 estimulador de colonia (granulocito) /DB_XREF = gi: 4503078 /UG = Hs. 2233 factor 3 estimulador de colonia (granulocito) /FL =gb: M17706.1 gb:NM 000759.1 207442_at 3

PDEIA: fosfodiesterasa 1A, dependiente de calmodulina (LOC5136) Nos. Id. Sec.: 52 (ADN) y 144 (amino ácido): gb: NM_000759.1 /DEF = fosfodiesterasa 1A de Homo sapiens, dependiendo de calmodulina (PDE1a), ARNm, /FEA = ARNm /GEN= PDE1A /PROD = fosfodiesterasa 1A, dependiendo de calmodulina /DB_XREF= gi: 4826891 /UG= Hs. 41717 fosfodiesterasa 1A, dependiendo de calmodulina /FL = gb: U40370.1 gb:NM 005019.1 208396_s_at

CPE: carboxipeptidasa E (LOC1363) Nos. Id. Sec.: 57 (ADN) y 149 (amino ácido): Consenso incluye gb: A1922855 /FEA =EST /DB_XREF= gi: 5658819 /10B_XREF = est:wo 14h05.x1 /CLONE = IMAGE:24455353 /UG = HS. 75360 carboxipeptidasa E /FL = gb: NM_001873.1 201116_s_at

ENTPD1: ectonucleosido trifosfato difosfohidrolasa 1 (LOC953) Nos. Id. Sec.: 58 (ADN) y 150 (amino ácido): gb: NM_001776.1 /DEF =ectonucleosido trifosfato difosfohidrolasa 1 de Homo sapiens (ENTPD1), ARNm, /FEA= ARNm /GEN = ENTPD1 /PROD= ectonucleosido trifosfato difosfohidrolasa 1 /DB_XREF= gi: 4502666 /UG = Hs. 205353 ectonucleosido trifosfato difosfohidrolasa 1 /FL= gb: NM 001776.1 207691_x_at

NID2: nidogen 2 (osteonidogen): gb: NM_007361.1 /DEF = nidogen 2 de Homo 204114_at

(LOC22795): sapiens (NID2), ARNm. /FEA= ARNm /GEN= NID2

/PROD= nidogen 2

Nos. Id. Sec.: 59 (ADN) y 151: /DB_XREF = gi: 6679055 /UG = Hs. 82733 nidogen s

(amino ácido): /FL = gb:D86425.1 gb: NM 007361.1

LOC221981: proteína hipotética: Consenso incluye gb: R33964 /FEA= EST /DB_XREF 214920_at

LOC221981 (LOC221981): = gi: 789822 /DB_XREF = est: yh74c03.r1/CLONE=IMAGE: 135460 /UG=

Nos. Id. Sec.: 60 (ADN): HS.2888681 cADN FLJ11022 fis de Homo sapiens, clon PLACE 1003771

IGFBP7: proteína 7 de unión de factor de de tipo insulina Nos. Id. Sec.: 61 (ADN) y 152 (amino ácido): gb: NM_001553.1 / DEF= proteína 7 de unión de factor de de tipo insulina de Homo sapiens (IGFBP7), ARNm. /FEA= ARNm /GEN = IGFBP7 /PROD= proteína 7 de unión de factor de de tipo insulina /DB_XREF = gi: 4504618 /UG= Hs. 119206 proteína 7 de unión de factor de de tipo insulina /FL= gb: L19182.1 gb: NM 001553.1 201163_s_at

CSRP2: proteína 2 rica en: gb: U46006 /DEF = proteína LIM de músculo liso LIM 211126_s_at

cisteína y glicina (LOC1466): (h-SmLIM /PROD = proteína de músculo liso LIM/DB_XREF = gi: 1314358 / UG= Hs. 10526 proteína 2 rica en glicina y cisteína /FL = gb: U46006.1

EBAF: factor asociado al sangrado endotelial (determinación izquierdaderecha, factor A; superfamilia de factor beta de de transformación (LOC7044) Nos. Id. Sec.: 63 (ADN) y 154 (amino ácido): gb: NM_003240.1 /DEF = factor asociado al sangrado endometrial de Homo sapiens (determinación izquierda-derecha, factor A; superfamilia de factor beta de de transformación) (EBAF), ARNm, /FEA= ARNm /GEN= EBAF /PROD= factor de de transformación, beta 4 /DB_XREF = gi: 4503440 /UG = Hs. 25195 factor asociado al sangrado endometrial (determinación izquierda-derecha, factor A; superfamilia de factor beta de de transformación) / FL= gb: U81523.1 gb:NM 003240.1 gb: AF081513.1 206012_at

TIA-2: glucoproteína asociada a membrana celular de tipo I de pulmón Nos. Id. Sec.: 64 (ADN) y 155 (amino ácido): Consenso incluye gb: AU154455 /FEA =EST /DB_XREF = gi: 11015976 /DB_XREF= est: AU154455 /CLONE =NT2RP4001145 /UG= Hs. 135150 glucoproteína asociada a membrana celular de tipo I de pulmón 221898_at

GUCY1B3: guanilato ciclasa 1,: Consenso incluye gb: W93728 /FEA =EST /DB_XREF 203817_at

soluble, beta 3 (LOC2983): = gi: 1422918/DB_XREF = est: zd96a11.s1 /CLONE=

Nos. Id. Sec.: 65 (ADN) y 156: IMAGE: 357308 /UG = Hs 77890 guanilato ciclasa 1,

(amino ácido): soluble, beta 3 / FL= gb: NM 000857.1

FLJ46603: proteína FLJ46603 (LOC374826) Nos. Id. Sec.: 66 (ADN) y 157 (amino ácido): Consenso incluye gb: BF968134 /FEA =EST /DB_XREF= gi: 12335349 /DB_XREF = est: 602269121 F1 /CLONE= IMAGE:4357349 /UG = Hs. 250723 FK506 proteína de unión 12 - proteína 1 asociada a rapamicina 212509_s_at

TNFAIP6: factor de necrosis: gb: NM 007115.1 /DEF = Factor de necrosis tumoral 206026_s_at

tumoral, proteína 6 alfa: de Homo sapiens, proteína 6 alfa-inducida (TNFAIP6)

inducida (LOC7130): ARNm. /FEA= ARNm /GEN =TNFAlP6

/PROD = factor de necrosis tumoral, proteína 6 alfa

Nos. Id. Sec.: 67 (ADN) y 158: inducida /DB_XREF = gi: 6005905

(amino ácido): /UG = Hs. 29352 factor de necrosis tumoral, proteína

6 alfa inducida / FL= gb: NM007115.1

PIGB: fosfatidilinositol glucano, clase B (LOC9488): Consenso incluye gb: AU 144243 /FEA=EST /DB_XREF = gi: 11005764 /DB_XREF = est: AU144243 /CLONE= HEMBA1001328 /UG= Hs. 247118 fosfatidilinositol glucano, clase B 214151_s_at

ENTPD1: ectonucleosido trifosfato difosfohidrolasa 1 (LOC953): Consenso incluye gb: AV717590 /FEA= EST/DB_XREF=gi:10814742 /DB XREF=est:AV717590 /CLONE = DCBCFE01 /UG = Hs. 205353 ectonucleosido trifosfato difosfohidrolasa 1 /FL = gb: U87967.a 209473_at

LDB2: unión 2 de dominio de LIM (LOC9079) Nos. Id. Sec.: 70 (ADN) y 161 (amino ácido): gb: NM_001290.1 /DEF= Unión de dominio de LIM de Homo sapiens (LDB2), ARNm, /FEA = ARNm /GEN = LDB2 /PROd= unión 2 de dominio de LIM /DB_XREF = gi:4504970 /UG = Hs. 4980 LIM unión 2 de dominio /FL = gb: AF047337.1 gb: AF064492.1 gb: AF068651.1 gb: NM 001290.1 206481_s_at

SAMSN1: dominio SAM, dominio SH3 y señales de localización nuclear, 1 (LOC64092) Nos. Id. Sec.: 71 (ADN) y 162 (amino ácido): gb: NM_022136.1 /DEF = dominio SAM de Homo sapiens, dominio SH3 y señales de localización nuclear, 1 (SAMSN1), ARNm. /FEA =ARNm /GEN=SAMSN1 /PROD =dominio SAM, dominio SH3 y señales de localización nuclear, 1 /DB_XREF = gi: 11545870 (UG = Hs. 24633 dominio SAM, dominio SH3 y señales de localización nuclear 1/FL = gb: AF222927.1 gb:NM 022136.1 220330_s_at

CLDN5: claudina 5 (proteína de membrana borrada en el síndrome velocardiofacial) (LOC7122) Nos. Id. Sec.: 72 (ADN) y 163 (amino ácido): gb: NM 003277.1 /DEF = claudina 5 de Homo sapiens (proteína de transmembrana borrada en el síndrome velocardiofacial) (CLDN5), ARNm /FEA =ARNm /GEN = CLDN5 /PROD= proteína claudina de transmembrana /DB_XREF = gi: 4502878 /UG= Hs. 110903 claudina 5 (proteína de transmembrana borrada en el síndrome velocardiofacial) /FL = gb: BC002404.1 gb:AF000959.1 gb: NM_003277.1 204482 at

CAV1: caveolina 1, proteína de: gb: NM_001753.2 /DEF = caveolina 1 de Homo 203065_s_at

caveolae, 22 kDa (LOC857): sapiens, proteína de caveolae, 22 kD (CAV1), ARNm,

/FEA = ARNm /GEN = CAV1

Nos. Id. Sec.: 73 (ADN) y 164: /PROD = caveolina 1 /DB _XREF = gi: 4580417

(amino ácido): /UG = Hs. 323469 caveolina 1, proteína caveolae, 22

kD /FL = gb:NM_001753.2

PKIG: inhibidor gamma de proteína quinasa (dependiente de cAMP, catalítico) (LOC11142) Nos. Id. Sec.: 74 (ADN) y 165 (amino ácido): gb: NM_007066.1/DEF = inhibidor gamma de proteína quinasa de Homo sapiens (dependiente de cAMP, catalítico) (PIKG), ARNm /FEA = ARNm /GEN = PKIG /PROD = inhibidor gamma de proteína quinasa (dependiente de cAMP, catalítico) /DB_XREF = gi:5902019 /UG = Hs. 3407 inhibidor gamma de proteína quinasa (dependiente de cAMP, catalítico) /FL = gb:AB019517.1 gb: AF182032.1 gb: NM 007066.1 202732_at

COL4A2: colágeno, tipo IV, alfa: Consenso incluye gb: X05610.1 /DEF= ARNm de 211964_at

2 (LOC1284): humano para cadena colágeno alfa (2) de tipo IV.

/FEA = ARNm /PROD = cadena alfa (2) /DB_XREF =

Nos. Id. Sec.: 75 (ADN) y 166 (amino ácido): gi:29550 /UG = Hs. 75617 colágeno, tipo IV, alfa 2

S100A8: proteína A8 que se une a calcio S100 (LOC6279) Nos. Id. Sec.: 76 (ADN) y 167 (amino ácido): gb: NM_ 002964.2 /DEF= proteína A8 de unión a calcio S100 de Homo sapiens (calgranulina A) (S100A8), ARNm, /FEA= ARNm /GEN = S100A8 /PROD = S100 proteína A8 que se une a calcio /DB_XREF = gi: 9845519 /UG = Hs. 100000 S 100 proteína A8 que se une a calcio (calgranulina A)/FL = gb: NM_002964.2 202917_s_at

MGC5618: proteína hipotética: Consenso incluye gb: BF575213 /FEA =EST 221477_s_at

MGC5618 (LOC79099): /DB_XREF= gi: 11648925 /DB_XREF = est:602133624F1 /CLONE= IMAGE: 4288756

Nos. Id. Sec.: 77 (ADN): /UG= Hs. 177781 clon MGC de Homo sapiens: 5618, ARNm, cds completos /FL=gb: BC001980.1

PRG1: proteglucano 1, gránulo secretor (LOC5552) Nos. Id. Sec.: 78 (ADN) y 168 (amino ácido): gb: J03223.1 /DEF= ARNm nuclear de péptido de proteglucano de gránulo secretor de humano, cds completos. /FEA= ARNm /GEN= PRG1 /DB_XREF= gi: 190419 /UG= Hs.1908 proteoglucano 1, gránulo secretor /FL=gb: J03223.1 NM 002727.1 201858_s_at

SCHIP1: proteína I que interactúa con schwanomina (LOC29970) Nos. Id. Sec.: 79 (ADN) y 169 (amino ácido): gb: NM_014575.1 /DEF= proteína 1 que interactúa con schwanomina de Homo sapiens (SCHIP-1), ARNm, /FEA= ARNm /GEN=SCHIP-1/ PROD= proteína I que interactúa con schwanomina /DB_XREF = gi: 7657539 /UG= Hs. 61490 proteína 1 que interactúa con schwanomina /FL= gb: AF145713.1 gb:NN 014575.1 204030_s_at

PRG1: proteglucano 1, gránulo: gb: NM_ 002727.1 /DEF= proteglucano 1 de Homo 201859_at

secretor (LOC5552): sapiens, gránulo secretor (PRG1), ARNm. FEA=

ARNm /GEN= PRG1 /DB_XREF= gi: 4506044 /UG=

Nos. Id. Sec.: 80 (ADN) y 170: Hs.1908 proteoglucano 1, gránulo secretor /FL=gb:

(amino ácido): J03223.1 NM 002727.1

MSN: moesina (LOC4478) Nos. Id. Sec.: 81 (ADN) y 171 (amino ácido): gb; NM_002444.1 /DEF= moesina de Homo sapiens (MSN), ARNm /FEA= ARNm /GEN=MSN /PROD = moesina /DB_XREF = gi: 4505256 /UG = Hs. 170328 moesina /FL = gb: M69066.1 gb:NM 002444.1 200600_at

NR3C 1: subfamilia 3 del receptor nuclear, grupo C, miembro I (receptor de glucocorticoide) (LOC2908) Nos. Id. Sec.: 80 (ADN) y 170 (amino ácido): Consenso incluye gb: A1432196 /FEA= EST/DB_XREF = gi: 4308490 /DB_ XREF= est: tg77g05.x1 /CLONE= IMAGE: 2114840 /UG = Hs. 75772 receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro 1, /FL = gb: M10901.1 gb:NM 000176.1 201865 x at

BCL6: célula B CLL/linfoma 6 (proteína 51 de dedo de cinc) (LOC604) Nos. Id. Sec.: 83 (ADN) y 173 (amino ácido): gb: NM_001706.1 /DEF= linfoma de CLL de célula B de Homo sapiens (proteína 51 de dedo de cinc) (BCL6), ARNm. /FEA = ARNm/ GEN=BCL6 /PROD = célula B linfoma 6 de CLL (proteína 51 de dedo de cinc)/DB_ XREF= gi: 4502382 /UG = Hs. 155024 linfoma 6 de CLL de célula-B 155024 (proteína 51 de dedo de cinc) /FL= gb: U00115.1 gb: NM 001706.1 203140_a t6

HLX1: homeo caja 1 de tipo H2.0 (Drosófila) (LOC3142) Nos. Id. Sec.: 84 (ADN) y 174 (amino ácido): Consenso incluye gb: M60721.1 /DEF = gen de homeocaja humano, cds. completos. /FEA = ARNm /DB_XREF = gi: 183789 /UG= Hs. 74870 H2.0 Homeo caja 1 de tipo (Drosófila) /FL= gb: NM_021958.1 gb: M60721.1 214438_at

CALD1: caldesmona 1 (LOC800) Nos. Id. Sec.: 85 (ADN) y 175 (amino ácido): Consenso incluye gb: AL583520 /FEA = EST /DB_XREF = gi: 12952562 /DB_XREF = est: AL 583520 /CLONE= CS0DC024YE13 (5 prima) /UG= Hs. 182183. ARNm de Homo sapiens para caldesmona, 3 UTR 212077_at

PLEKHC1: miembro I, familia C: Consenso incluye gb: A1928241 214212_x_at

(con dominio FERM) que: /FEA =EST/DB_XREF = gi: 5664205 /DB_XREF =

contiene dominio de homología: est: wo95g11.x1 /CLONE= IMAGE: 2463140 /UG=

de plecstrina (LOC 10979) Nos. Id. Sec.: 86 (ADN) y 176 (amino ácido): HSS. 75260 mitógeno inducible 2

SYNCOILIN: sincoilina de proteína de filamento intermedia (LOC81493) Nos. Id. Sec.: 87 (ADN) y 177 (amino ácido): gb: NM_030786.1 /DEF = sincoilina de proteína de filamento intermedio de Homo sapiens (SYNCOILIN), ARNm. /FEA= ARNm /GEN= SYNCOILIN /PROD = sincoilina de proteína de filamento intermedio /DB_XREF = gi: 13540560 /FL = gb: NM_030786.1 221276_s_at

NID: nidgen (enactina): Consenso incluye gb: BF940043 202007_at

(LOC4811): /FEA =EST /DB_XREF = gi: 12357363 /DB_XREF =

est: nac66f12.x1

Nos. Id. Sec.: 88 (ADN) y 178: /CLONE= IMAGE:3439271 / UG=Hs. 62041 nidogen

(amino ácido): (enactina) /FL = gb: M30269.1 gb:NM 002508.1

FCGR3A: fragmento de FC de IgG, baja afinidad IIIa, receptor para (CD16) (LOC2214) Nos. Id. Sec.: 89 (ADN) y 179 (amino ácido): gb: J04162.1 /DEF= ARNm de receptor leucocito IgG de humano (Fc-gamma-R), cds completos, /FEA= ARNm /DB_XREF = gi: 183036 /UG= Hs. 176663 fragmento Fc de IgG, baja afinidad IIIb, receptor para (CD 16) /FL= gb:NM_000570.1 gb:J04162.1 gb: M24854.1 gb: AB025256.1 204007_at

TCF4: factor de transcripción 4: Consenso incluye gb: Al927067 213891_s_at

(LOC6925): /FEA =EST /DB_XREF =gi: 5663031 /DB_XREF =

est:wo87f01.x1

Nos. Id. Sec.: 90 (ADN) y 180: /CLONE = IMAGE ¡:2462329/UG= HS.289068

(amino ácido): CADN FLJ 11918 fis de Homo Sapiens, clon HEMBB

1000272

TFPI2: inhibidor 2 de: Consenso incluye gb: AL574096 209277_at

mecanismo de factor de tejido: /FEA=EST /DB_XREF = gi: 12933969 /DB_XREF =

(LOC7980): est: AL574096

/CLONE = CS0D1040Y117 (3 prima)

Nos. Id. Sec.: 91 (ADN) y: /UG = Hs. 295944 inhibidor 2 de mecanismo de factor

181(amino ácido): de tejido /FL = gb: BC005330.1 gb: L27624.1 gB:

D29992.1 gb: NM 0065281

TIE: tirosina quinasa con inmunoglobulina y dominios de homología de factor de epidérmico (LOC7075) Nos. Id. Sec.: 920 (ADN) y 182 (amino ácido): gb: NM_005424.1 /DEF = tirosina quinasa de Homo Sapiens con inmunoglobulina y dominios de homología de factor de epidérmico (TIE), ARNm. /FEA= ARNm /GEN= TIE /PROD= tirosina quinasa con inmunoglobulina y dominios de homología de factor de epidérmico /DB_XREF= gi: 4885630 /UG= Hs. 78824 tirosina quinasa con inmunoglobulina y dominios de homología de factor de epidérmico /FL= gb: NM 005424.1 204468_s_at

ANGPT2: angiopeptina 2 (LOC285) Nos. Id. Sec.: 93(ADN) y 183 (amino ácido): gb: NM_001147.1 /DEF= angiopeptina 2 de Homo Sapiens (ANGPT2) ARNm /FEA =ARNm, /GEN= ANGPT2 /PROD = angiopeptina 2 /DB_XREF= gi: 4557314 /UG = Hs. 115181 angiopeptina 2 /FL = gb:AF004327.1 gb: NM 001147.1 gb: AB009865.1 205572_at

OAZ2: ornitina descarboxilasa anti-enzima 2 (LOC4947) Nos. Id. Sec.: 94 (ADN) y 184 (amino ácido): gb: AF242521.1 /DEF= ARNm de anti-enzima ornitina descarboxilada de Homo sapiens, cds. completos, /FEA = ARNm /PROD = anti-enzima ornitina descarboxilasa /DB_XREF = gi: 9802039 /UG = Hs. 74563 antienzima ornitina descarboxilasa 2 /FL= gb: AF057297.1 gb: AF242521.1 gb:NM 002537.1 201364_s_at

Los biomarcadores que se recogen en la Tabla I se co-expresan de forma intensa con VEGFR-2 en los perfiles de expresión de genes tumorales. El biomarcadores sirven como herramientas moleculares de utilidad para predecir y 5 controlar la respuesta a moduladores de VEGFR-2 que tienen un efecto sobre la actividad de VEGFR-2 o sobre le mecanismo de transducción de la señal de VEGFR-2.

Los biomarcadores que se recogen en la Tabla 2 son un subgrupo de los biomarcadores que se recogen en la Tabla I para los cuales se identificó que eran susceptibles de modulación importante mediante tratamiento con el "modulador VEGFR-2 del ejemplo" como se define en los Ejemplos.

Tabla 2: Biomarcadores co-expresados con VEGFR-2 identificados como susceptible de modulación mediante tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo

Clasificación: Humano U133; Sonda_ID A NM_ID Hs_ID humano; gilD Hs_ID humano gi-ID humano Gen humano (símbolo) Homólogo 430A de ratón sonda_ID NM_ID ratón; Nm-ID ratón; gi_ID ratón Gen de ratón (símbolo) ensayo-t (P<0,05) Nº. de vecescambio abajo= disminución niveles de ARNm; sin cambio = sin aumento o disminución de los niveles de ARNm; aumento = aumento de los niveles de ARNm

1: 20287_s_at NM_01 2072; Hs.971 99; gi: 1149 6985 receptor C1q de componente de complemento (CIQR1) 1419589_at NM_010740; Mm.681; gi 67545 77 componente I de complemento (Ly68), subcomponente q, receptor 1 (Clqrl) 0,000005 5 abajo

2: 211980_at NM_00 1845; Hs.119 129; gi: 5658) 569 colágeno, tipo IV, alfa 1 (COL4A1 14279 86_at Mn desconocido. 738; gi 71791 07 procolágeno, tipo IV, alfa 1 5col4a1) 0,000014 4 abajo

3: 211980_at NM_01 2072; Hs.971 99; gi: 1149 6985 colágeno, tipo IV, alfa 1 (COL4A1 14520 35_at Mn desconocido. 738; gi 11038 725 procolágeno, tipo IV, alfa 1 (Col4a1) 0,000018 6 abajo

4: 203065_s_at NM_00 1753; Hs.323 469; gi: 4580 417 caveolina 1 (CAV1) 14491 45_at NM_007 616; Mm.282 78; gi 67059 76 caveolina, proteína 1 de caveolae (Cav1) 2,72030 E-04 1 sin cambio

5: 213592_at NM_005161; Hs.930 5; gi: 6911643 1 como receptor de angiotensina (AGTRL1) 14230 37_at NM_011 784; Mm.293 68; gi 16446 226 1 de tipo receptor de angiotensina (Agtr11) 5,54812 E-04 4 abajo

6: 20446 8_s_at NM_00 5424; Hs.788 24; gi: 485630 (TIE) tirosina quinasa con inmunoglobulina y homología de factor de epidérmico (TIE) 14162 38_at NM_011 587; Mm.434 5; gi 67557 84 receptor 1 (tiel) de tirosina quinasa tirosina (Tiel) 0,00103 262 11 abajo

18 (continuación)

7: 204677_at NM_00 1795; Hs.762 06; ein: 4502 726 VE-caderina (CDH5) 14339 56_at Mn desconocido. 135 114; ein: 71861 15 VE-caderina (Cdh5) 0,001154369 2 abajo

8: 204115_at NM_00 4126; Hs.833 81; gi: 4758 447 proteína 11 que se une a nucleótido de guanina (GNG 11) 14489 42_at NM_025 331; Mm.255 47; gi 13384 697 proteína que se une a nucleótido de guanina (proteína G), gamma 11 (Gng 11) 0,001326667 2 abajo

9: 204345_at NM_00 1856; Hs.262 08; gi: 1138 6158 colágeno, tipo XVI, alfa 1 (COL16A 1) 14279 86_a_;at Mn desconocido. 418 60; gi 16194 279 procolágeno, tipo XVI, alfa I (Col16a1) 0,014896833 1 sin cambio

10: 219134_at NM_02 2159; Hs.579 58; gi: 1154 5907 EGF-TM7- proteína relacionada con latrofilina (ELTD1) 14180 59_at NM_133 222; Mm.272442; gi 16877 797 EGF, dominio que contiene 1 de siete membranas de latrofilina (Eltd1) 0,018655985 2 abajo

11: 20180 9_s_at NM_00 0118; Hs.767 53; gi: 4557 554 endoglina (ENG) 14172 71_a_at NM_007 932; Mm.485 1; gi 66796 48 endoglina (Eng) 0,021873085 2 abajo

12: 20411 4_at NM_00 7361; Hs.82733; gi: 6679 055 nidógen 2 (NID2) 14235 16_a_at NM_134 085; Mm.203 48; gi 16942 135 nidogen 2 (Nid2) 0,024126268 3 abajo

19 (continuación)

13: 208396_s_at NM_00 05019; Hs.417 17; gi: 4826 891 fosdodiesterasa 1A, dependiente de calmodulina (PDE1A) 14492 98_a_at NM_016 744; Mm.40678; gi 79491 06 fosfodiesterasa 1A, independiente de calmodul (Pde1a) 0,025570996 1 sin cambio

14: 213592_at NM_00 5161; Hs.930 5; gi: 691 643 1 de tipo receptor de angiotensina (AGTRL) 14386 51_a_at NM_011 784; Mm.293 68; gi 94009 66 1 de tipo receptor de angiotensina (Agtrl1) 0,026038828 2 abajo

15: 208396_s_at NM_00 a 7066; Hs.340 7; gi: 5902 019 inhibidor de proteína quinasa (catalítico dependiente de cAMP) (PKIG) 14348 20_s_at desconocido Mm. 10091; gi; 61505 57 inhibidor de proteína quinasa, gamma (Pkig) 0,032286798 1 sin cambio

16: 201859_at NM_00 2727; Hs.190 8; gi: 4506 044 proteglucano 1, gránulo secretor (PRG1) 14174 26_at NM_01 157; Mm.221 94; gi 69972 42 proteoglucano 1, gránulo secretor (Prg1) 0,034821585 2 aumento

17: 202917_s_a 2964:t NM_00; Hs.100 000; at: 9845 519 proteína A8 que se une a calcio S100 (SIOOA8) 14193 94_s_at NM_013 650; Mm.215 67; gi 73054 52 proteína A8 que se une a calcio S100 (calgranulina A) (S100a8) 0,0408517487 sin cambio

18: 20670 2_at NM_00 0459; Hs.896 40; g; 4557 868 tirosina quinasa TEK, endotelial (TEK) 1418788_at NM_013690; Mm. 143 13; gi; 85674 11 (tek) receptor específico endotelial de tirosina quinasa (Tek) 0,047098006 1 sin cambio

Moduladores VEGFR-2

Según se usa en el presente documento, la expresión "modulador de VEGFR-2" indica un compuesto o fármaco que es una molécula biológica o una molécula de pequeño tamaño que modula directa indirectamente la actividad de VEGFR-2 o el mecanismo de transducción de señal de VEGFR-2. De este modo, los compuestos o fármacos según se usan en el presente documento incluyen tanto moléculas de pequeño tamaño como moléculas biológicas. La modulación directa o indirecta incluye la activación o la inhibición de la actividad de VEGFR-2 o del mecanismo de transducción de señal de VEGFR-2. En un aspecto, la inhibición se refiere a la inhibición de la unión de VEGFR-2 con un ligando de VEGFR-2 tal como, por ejemplo, VEGF. En otro aspecto, la inhibición se refiere a la inhibición de la actividad de quinasa de VEGFR-2.

Los moduladores de VEGFR-2 incluyen, por ejemplo, ligandos específicos de VEGFR-2, inhibidores de VEGFR-2 de molécula de pequeño tamaño y anticuerpos monoclonales de VEGFR-2. En un aspecto, el modulador de VEGFR-2 inhibe la actividad de VEGFR-2 y/o inhibe el mecanismo de transducción de señal de VEGFR-2. En otro aspecto, el modulador de VEGFR-2 es un anticuerpo monoclonal de VEGFR2 que inhibe la actividad de VEGFR-2 y/o inhibe el mecanismo de señal de transducción de VEGFR-2.

Los moduladores de VEGFR-2 incluyen moléculas biológicas y moléculas de pequeño tamaño.

Las moléculas biológicas incluyen todos los lípidos y polímeros de monosacáridos, amino ácidos y nucleótidos que presentan un peso molecular mayor que 450. De este modo, las moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, oligosacáridos y polisacáridos; oligopéptidos, polipéptidos, péptidos y proteínas; y oligonucleótidos y polinucleótidos. Los oligonucleótidos y polinucleótidos incluyen, por ejemplo, ADN y ARN.

Las moléculas biológicas además incluyen derivados de cualesquiera de las moléculas descritas anteriormente. Por ejemplo, derivados de moléculas biológicas incluyen derivados de lípidos y derivados de glucosilación de oligopéptidos, polipéptidos, péptidos y proteínas.

Derivados de moléculas biológicas además incluyen derivados de lípidos de oligosacáridos y polisacáridos, por ejemplo, lipopolisacáridos. De la manera más típica, las moléculas biológicas con anticuerpos, o equivalentes funcionales de anticuerpos. Los equivalentes funcionales de anticuerpos presentan características de unión comparables a las de los anticuerpos e inhiben la proliferación de células de expresan VEGFR-2. Dichos equivalentes funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos quimerizados, humanizados y de cadena sencilla así como también sus fragmentos.

Equivalentes funcionales de anticuerpos también incluyen polipéptidos con secuencias de amino ácido que son considerablemente las mismas que la secuencia de amino ácido de las zonas variables o hipervariables de los anticuerpos. Una secuencia de amino ácido que sea considerablemente la misma que otra secuencia, pero que difiera de la otra secuencia en una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones, es considerada como una secuencia equivalente. Preferentemente, menos que 50 %, más preferentemente menos que 25 % e incluso más preferentemente menos que 10 % del número de residuos de amino ácido de la secuencia se encuentra sustituido, se encuentra añadido a o se encuentra eliminado de la proteína.

Preferentemente, el equivalente funcional de un anticuerpo es un anticuerpo quimerizado o humanizado. El anticuerpo quimerizado comprende la zona variable de un anticuerpo no humano y la zona constante de un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado comprende la zona hipervariable (CDRs) de un anticuerpo no humano. La zona variable distinta de la zona hipervariable, por ejemplo, la zona variable del armazón, y la zona constante del anticuerpo humanizado son las de un anticuerpo humano.

Las zonas variables e hipervariables apropiadas de anticuerpos no humanos pueden proceder de anticuerpos producidos por cualquier mamífero no humano en el que se producen anticuerpos monoclonales. Dichos ejemplos de mamíferos distintos de los humanos incluyen, por ejemplo, conejos, ratas, ratones, caballos, cabras o monos.

Los equivalentes funcionales además incluyen fragmentos de anticuerpos que presentan características de unión que son iguales que, o comparables con, las de todo el anticuerpo. Los fragmentos apropiados del anticuerpo incluyen cualquier fragmento que comprenda una parte de la zona hipervariable (es decir, que determine la naturaleza complementaria) para unirse de manera específica, y con suficiente afinidad, a tirosina quinasa de VEGFR-2 con el fin de inhibir la proliferación de células que expresan dichos receptores.

Por ejemplo, dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos de Fab o el fragmento 2 F(ab´). Preferentemente, los anticuerpos de fragmentos contienen todos las seis zonas que determinan la naturaleza complementaria de todo el anticuerpo, aunque también se incluyen fragmentos funcionales que contienen menos que todas las citadas zonas, tal como tres, cuatro o cinco CDRs.

En un aspecto, los fragmentos son anticuerpos de cadena sencilla, o fragmentos Fv. Los anticuerpos de cadena sencilla son polipéptidos que comprenden al menos la zona variable de la cadena pesada del anticuerpo unido a la zona variable de la cadena ligera, con o sin engarce de interconexión. De este modo, el fragmento Fv comprende el sitio de combinación con el anticuerpo entero. Estas cadenas se

5 pueden producir en bacterias o en células eucariotas.

Los anticuerpos y los equivalentes funcionales pueden ser miembros de cualquier clase de inmunoglobulinas, tal como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE y de sus subclases.

En un aspecto, los anticuerpos con miembros de la subclase IgG I. Los equivalentes funcionales también pueden ser equivalentes de combinaciones de cualquiera de las clases anteriores y subclases.

10 En un aspecto, el anticuerpo de VEGFR-2 es CDP-791 (UCB). En otro aspecto, el anticuerpo de VEGFR2 es IMC-1121b (ImClone Systems). En otro aspecto, el modulador de VEGFR-2 es AVE-005 (VEGF trap, Regeron Pharmaceuticals).

Además de las moléculas biológicas comentadas anteriormente, los modulares de VEGFR-2 que presentan utilidad en la invención pueden ser moléculas de pequeño tamaño. En el presente documento, 15 cualquier molécula que no sea una molécula biológica es considerada una molécula de pequeño tamaño. Algunos ejemplos de moléculas de pequeño tamaño incluyen compuestos orgánicos, compuestos organometálicos, sales de compuestos orgánicos y organometálicos, sacarinas, amino ácidos y nucleótidos. Otras moléculas de pequeño tamaño incluyen moléculas que, de otro modo, podrían ser consideradas moléculas biológicas, exceptuando que su peso molecular no sea mayor que 450. De este

20 modo, las moléculas pequeñas pueden ser lípidos, oligosacáridos, oligopéptidos y oligonucleótidos y sus derivados, que presenten un peso molecular de 450 o menos.

Se enfatiza que las moléculas de pequeño tamaño pueden presentar cualquier peso molecular. Simplemente se denominan moléculas de pequeño tamaño debido a que, normalmente, presentan pesos moleculares menores que 450. Las moléculas pequeñas incluyen compuestos que se encuentran en la 25 naturaleza así como también compuestos sintéticos. En una realización, el modulador de VEGFR-2 es una molécula de pequeño tamaño que inhibe la proliferación de células tumorales que expresan VEGFR

2. En otra realización, el modulador de VEGFR-2 es una molécula de pequeño tamaño que inhibe la proliferación de células tumorales refractarias que expresan VEGFR-2.

Se han descrito numerosas moléculas de pequeño tamaño como útiles para inhibir VEGFR-2.

30 En un aspecto, el modulador de VEGFR-2 es éster 2-[4-(4-fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-5metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-iloxi]-1-metiletílico de ácido [(1R), 2S]-2-aminopropiónico que presenta la estructura:

De manera alternativa, se puede escoger el modulador de VEGFR-2 entre los compuestos descritos en la

35 patente de EE.UU. Nº. 6.869.952, o entre los compuestos descritos en la publicación PCT Nº. WO 00/71129 o WO 2004/009601.

También se puede escoger el modulador de VEGFR-2 entre CHIR-258 (Chiron), AZD-2171 (AstraZeneca), GW786034 (GlaxoSmithKline), AMG 706 (Amgen), BIBF 1120 (Boehringer Ingelheim), AE788 (Novartis), ZD6474 (AstraZeneca), BAY 43-9006 (Sorafenib, Bayer) y SU11248 (Sutent, Pfizer).

40 Biomarcadores y conjuntos de biomarcadores

En el presente documento se describen biomarcadores individuales y conjuntos de biomarcadores que presentan por un lado valor diagnóstico y por otro valor pronóstico en zonas de enfermedad en las que la obtención de señales de VEGFR-2 o el mecanismo de VEGFR-2 resulta de importancia, por ejemplo, en cánceres o tumores, en trastornos de tipo inmunológico, enfermedades o disfunciones o en estados de 45 enfermedad en los que la formación de señales celulares y/o los controles de proliferación celular son anormales o aberrantes. Los conjuntos de biomarcadores comprenden una pluralidad de biomarcadores tales como, por ejemplo, una pluralidad de los biomarcadores proporcionados en la Tabla 1 que se

encuentran altamente correlacionados con la resistencia o la sensibilidad a uno o más moduladores de VEGFR-2.

Estos biomarcadores y conjuntos de biomarcadores permiten predecir o pronosticar de forma razonable el probable efecto de uno o más moduladores de VEGFR-2 en diferentes sistemas biológicos o para respuestas celulares. Los biomarcadores, y los conjuntos de biomarcadores se pueden usar en ensayos in vitro de la respuesta de modulador VEGFR-2 por parte de células de ensayo para predecir el resultado in vivo. De acuerdo con la invención, se pueden usar los diferentes biomarcadores y conjuntos de biomarcadores descritos en el presente documento, o la combinación de estos conjuntos de biomarcadores con otros biomarcadores o marcadores, por ejemplo, para predecir y controlar el modo en el que los pacientes con cáncer pueden responder a la intervención terapéutica con uno o más moduladores de VEGFR-2.

Un biomarcador o conjunto de biomarcadores de patrones de expresión génica celular que se correlaciona con la sensibilidad o la resistencia de células tras la exposición de las células a uno o más moduladores de VEGFR-2, proporciona una herramienta útil para la evaluación de una o más muestras de tumores antes del tratamiento con el modulador de VEGFR-2. La evaluación permite una predicción de las células de una muestra tumoral expuesta a uno o más moduladores de VEGFR-2, basada en los resultados de expresión del biomarcador o del conjunto de biomarcadores, tanto si el tumor, y por ende el paciente que alberga el tumor, responde al tratamiento con modulador de VEGFR-2 como si no lo hace.

El biomarcador o conjunto de biomarcadores también se pueden usar como se ha descrito en el presente documento para controlar la evolución del tratamiento de la enfermedad o terapia en aquellos pacientes que experimentan dicho tratamiento para una enfermedad que implica un modulador de VEGFR-2.

Los biomarcadores también sirven como objetivos para el desarrollo de terapias para el tratamiento de enfermedades. Dichos objetivos pueden resultar particularmente aplicables al tratamiento del cáncer, tales como, por ejemplo, carcinoma hepatocelular, cáncer colorectal (CRC), NSCLC y cáncer de pecho con metástasis.

De hecho, debido a que estos biomarcadores se expresan de manera diferencial en células sensibles y en células resistentes, sus patrones de expresión se encuentran correlacionados con la sensibilidad intrínseca relativa de las células frente al tratamiento con moduladores de VEGFR-2. Por consiguiente, los biomarcadores que se expresan de manera elevada en células resistentes pueden servir como objetivos para el desarrollo de nuevas terapias para los tumores que con resistentes a los moduladores de VEGFR2, en particular para los inhibidores de VEGFR-2. El nivel de proteína de biomarcador y/o de ARNm se puede determinar usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la cuantificación de la proteína por medio del uso de procedimientos tales como ELISA, SDS PAGE bi-dimensional, transferencia de western, inmuno-precipitación, inmunohisoquímica, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o citometría de flujo. Se puede llevar a cabo la cuantificación de ARNm usando procedimientos tales como PCR, hibridación de matrices, transferencia de Nothern, hibridación in situ, transferencia puntual, Taqman o ensayo de protección de ARNasa.

Micromatrices

Además, en el presente documento, se describen micromatrices especializadas, por ejemplo, micromatrices de oligonucleótidos o micromatrices de cADN, que comprenden uno o más biomarcadores, que muestran perfiles de expresión que se correlacionan bien con la sensibilidad o bien con la resistencia a uno o más moduladores de VEGFR-2. Dichas micromatrices se pueden emplear en ensayos in vitro para la evaluación del nivel de expresión de los biomarcadores en las células de ensayo a partir de biopsias tumorales, y determinar si existe probabilidad de que estas células de ensayo sean resistentes o sensibles a los moduladores de VEGFR-2. Por ejemplo, se puede preparar una micromatriz especializada usando todos los biomarcadores, o sus sub-grupos, como se describe en el presente documento y se muestra en la Tabla 1. Se pueden aislar las células a partir de biopsia de un tejido u órgano y se pueden exponer a uno o más moduladores de VEGFR-2. Por ejemplo, tras la aplicación de ácidos nucleicos aislados a partir de células tratadas y no tratadas a una o más micromatrices especializadas, es posible determinar el patrón de expresión génica de las células sometidas a ensayo y se puede comparar con el patrón del biomarcador procedente de un panel de control de células usadas para crear el conjunto de biomarcadores sobre la micromatriz. En base a los resultados de patrón de expresión génica de las células que experimentan el ensayo, se puede determinar si las células muestran un perfil de resistencia o de sensibilidad de la expresión génica. Posteriormente, es posible determinar si las células sometidas a ensayo a partir de una biopsia de tejido u órgano responden o no a uno o más de los moduladores de VEGFR-2 así como se puede evaluar la evolución del tratamiento en base a la información obtenida a partir de los resultados del análisis de micromatrices especializadas.

Anticuerpos

En el presente documento, se describen otros anticuerpos, incluyendo los monoclonales y los policlonales, dirigidos contra uno o más de los biomarcadores de polipéptido. Dichos anticuerpos se pueden usar de varias formas, por ejemplo, para purificar, detectar y dirigir los biomarcadores descritos en el presente documento, incluyendo el diagnóstico, la detección, la evaluación, tanto in vivo como in vitro, y/o procedimientos terapéuticos.

Kits

5 Se pueden usar kits para determinar o predecir si el paciente es susceptible o resistente a un tratamiento que comprende uno o más moduladores de VEGFR-2. El paciente puede presentar un cáncer o tumor tal como, por ejemplo, un cáncer o tumor de pecho. Dichos kits presentan utilidad en el diseño clínico para su uso en ensayos de tumores sometidos a biopsia o muestras de cáncer en pacientes, por ejemplo, para determinar o predecir si el tumor o el cáncer del paciente es resistente o sensible a un tratamiento dado o terapia con un modulador de VEGFR-2. El kit comprende un recipiente apropiado que comprende: una o más micromatrices, por ejemplo, micromatrices de oligonucleótidos o micromatrices de ADNc, que comprenden esos biomarcadores que se correlacionan con resistencia o sensibilidad a los moduladores de VEGFR-2, en particular a inhibidores de VEGFR-2; uno o más moduladores de VEGFR-2 para su uso en células de ensayo a partir de muestras de tejido de paciente o muestras de paciente; e instrucciones

15 para su uso. Además, los kits contemplados por la invención pueden además incluir, por ejemplo, reactivos o materiales para el control de la expresión de biomarcadores de la invención a nivel de ARNm

o proteína, usando otras técnicas y sistemas practicados en la técnica tales como, por ejemplo, ensayos de RT-PCR, que emplean cebadores diseñados sobre la base de uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento, inmunoensayos, tales como ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISAs), inmuno-transferencia, por ejemplo, transferencias de western, o hibridación in situ, y similares, como se describe más en el presente documento.

Aplicación de biomarcadores y conjuntos de biomarcadores:

Se pueden usar biomarcadores y conjuntos de biomarcadores en diferentes aplicaciones. Los conjuntos de biomarcadores se pueden construir a partir de cualquier combinación de biomarcadores recogida en el

25 listado de las Tablas 1 y 2 para llevar a cabo predicciones sobre el posible efecto de cualquier modulador de VEGFR-2 en los diferentes sistemas biológicos. Se pueden usar los diferentes biomarcadores y conjuntos de biomarcadores descritos en el presente documento, por ejemplo, como indicadores de diagnóstico o de pronóstico en la gestión de enfermedades, para predecir el modo en el que el paciente con cáncer puede responder a la intervención terapéutica con compuestos que modulan el VEGFR-2, y predecir el modo en el que los pacientes pueden responder a la intervención terapéutica que modula la formación de señales a través de todo el mecanismo regulador de VEGFR-2.

Al tiempo que se generaron los datos descritos en el presente documento en estirpes celulares que se usan de forma rutinaria para evaluar e identificar compuestos que presentan utilidad potencial en la terapia contra el cáncer, los biomarcadores presentan valor tanto diagnóstico como pronóstico en otras

35 áreas de enfermedad en las que la formación de señales a través de VEGFR-2 o el mecanismo de VEGFR-2 es importante, por ejemplo, en inmunología, o en cánceres o tumores en los que la formación de señales celulares y/o los controles de proliferación han fracasado.

De acuerdo con la invención, se pueden someter a ensayo las células de una muestra de tejido del paciente, por ejemplo una biopsia de cáncer o tumor, para determinar el patrón de expresión de uno o más biomarcadores antes del tratamiento con uno o más moduladores de VEGFR-2. Se puede determinar el éxito o el fracaso de un tratamiento en base a la expresión del patrón del biomarcador de las células a partir del tejido de ensayo (células de ensayo), por ejemplo, una biopsia de cáncer o tumor, de manera que resulte relativamente similar o diferente del patrón de expresión de un conjunto de control de uno o más biomarcadores. De este modo, si las células de ensayo muestran un perfil de expresión de

45 biomarcador que corresponde a la de los biomarcadores del panel de control de las células que son sensibles al modulador de VEGFR-2, resulta altamente probable o predecible que el cáncer o tumor del individuo responda favorablemente al tratamiento con el modulador de VEGFR-2. Por el contrario, si las células de ensayo muestran un patrón de expresión del biomarcador que corresponde al de los biomarcadores del panel de control de células que son resistentes al modulador de VEGFR-2, resulta altamente probable o predecible que el cáncer o tumor del individuo no responda al tratamiento con el modulador de VEGFR-2.

Además, en el presente documento se describe un procedimiento para el control del tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad susceptibles de ser tratada por uno o más moduladores de VEGFR-2. Las células de ensayo aisladas a partir de la muestra de tejido del paciente, por ejemplo, una 55 biopsia de tumor o una muestra de sangre, se pueden someter a ensayo para determinar el patrón de expresión de uno o más biomarcadores antes y después de la exposición a un modulador de VEGFR-2 en el que, preferentemente, el modulador de VEGFR-2 es un inhibidor de VEGFR-2. Se compara el perfil de expresión del biomarcador resultante de las células de ensayo antes y después del tratamiento con el de uno o más biomarcadores como los que se describen y muestran en el presente documento que son altamente expresados en el panel de control de células que son bien resistentes o bien sensibles al modulador de VEGFR-2. De este modo, si la respuesta del paciente es sensible al tratamiento por parte

de un modulador de VEGFR-2, basado en la correlación del perfil de expresión de uno de los biomarcadores, se puede calificar el pronóstico de tratamiento del paciente como favorable y el tratamiento puede continuar. De igual modo, si, tras el tratamiento con el modulador de VEGFR-2, las células de ensayo no muestran un cambio en el perfil de expresión del biomarcador correspondiente al

5 panel de control de células que son sensibles al modulador de VEGFR-2, puede servir como indicador de que es preciso modificar, cambiar o incluso interrumpir el actual tratamiento. Este procedimiento de control puede indicar el éxito o fracaso del tratamiento del paciente con un modulador de VEGFR-2 y se pueden repetir dichos procedimientos de control tanto como sea necesario o tanto como se desee.

Se pueden usar los biomarcadores descritos en el presente documento para predecir un resultado antes

10 de disponer de cualquier conocimiento acerca de un sistema biológico. De manera esencial, se puede considerar que el biomarcador constituye una herramienta estadística. Los biomarcadores son útiles principalmente para predecir el fenotipo que se usa para clasificar el sistema biológico. En una realización de la invención, el objetivo de la predicción es clasificar las células cancerígenas en función de que presenten un mecanismo activo o inactivo de VEGFR-2. Las células cancerígenas con un mecanismo

15 activo de VEGFR-2 pueden ser consideradas como resistentes al tratamiento con un inhibidor de VEGFR-2.

Ejemplos

Procedimientos y muestras

En los siguientes ejemplos, se usó el compuesto de éster 2-[4-(4-fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-520 metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-iloxi]-1-metiletílico de ácido [(1R), 2S]-2-aminopropiónico:

Este compuesto es denominado en el presente documento "inhibidor de VEGFR-2 de ejemplo".

Muestras de tumor canceroso humano

El uso de estas muestras fue aprobado por el Local Ethics Committee y se obtuvo el consentimiento

25 informado por parte de todos los pacientes antes de la cirugía. La población de estudio consistió en 26 pacientes con 30 metástasis de hígado colorectales y 118 pacientes (intervalo de edad, 27-91 años; media 69 ± 13,67 años) con tumores colorectales primarios operados en el Royal London Hospital entre diciembre de 1997 y marzo de 2003. 92 pacientes experimentaron una cirugía potencialmente curativa y 24 pacientes experimentaron una cirugía paliativa o no curativa. Se registraron los siguientes parámetros

30 para todos los pacientes con CRC principal: edad; localización del cáncer (lado derecho o lado izquierdo); tipo de intervención quirúrgica (curativa o no curativa); estado de la estabilidad de tumor-nódulosmetástasis (estable o inestable, tal como se evalúa por medio de análisis de repetición de mononucleótido BAT26 como se ha informado previamente; Ref. 15); terapias recibidas pre- y pos-quirúrgicas; recaídas; y tiempo de supervivencia tras la intervención quirúrgica.

35 Muestras de sangre de cáncer humano:

Se obtuvieron muestras de sangre (plasma) para el análisis de ELISA a partir de un estudio clínico patrocinado CA182-002 de Bristol-Myers Squibb Co., que es un estudio de aumento de la dosis de fase 1 para determinar la seguridad, características farmacocinéticas y farmacodinámicas del inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo en pacientes con tumores sólidos avanzados o con metástasis. Se tomaron

40 muestras de sangre de los pacientes en la evaluación, antes de la dosificación y después de la dosificación a las 4 horas, Dia I, Día 8, Día 26 y final del tratamiento. Se recogieron aproximadamente 60 ml de sangre para la toma de muestra específica del protocolo. El manual de laboratorio CA182-002 proporciona instrucciones detalladas en cuanto a la recogida, procesado, etiquetado, manipulación, almacenamiento y transporte de las muestras.

45 Modelos de tumor de xenotrasplante de ratón:

Se propagaron los tumores en ratones atímicos como trasplantes subcutáneos (sc) usando estirpes celulares de cáncer L2987 y HCT-116. La aparición del tumor tuvo lugar aproximadamente cada dos a cuatro semanas. Posteriormente, se dejaron proliferar los tumores hasta alcanzar la ventana de tamaño pre-determinada (100-200 mm3, se excluyeron los tumores que se encontraban fuera del intervalo) y se distribuyeron los animales de manera uniforme con respecto a diferentes tratamientos y grupos de control. Se trataron los animales con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo (100 mg/kg 1qd x 14 días). Se comprobó diariamente el tratamiento relacionado con la toxicidad/mortalidad de los animales tratados. Se pesó cada grupo de animales antes del inicio del tratamiento (Wt1) y posteriormente de nuevo tras la última dosificación de tratamiento (Wt2). La diferencia de peso corporal (Wt2-Wt1) proporcionó una medida de la toxicidad relacionada con el tratamiento. Se determinó la respuesta tumoral por medio de la medición de tumores con un calibre dos veces a la semana, hasta que los tumores alcanzaron un tamaño objetivo predeterminado. De manera eventual, se sacrificaron los animales distribuidos en varios grupos de tratamiento y de control durante el estudio con el fin de obtener muestras tumorales y de sangre para el análisis genómico y de proteínas.

Muestras de sangre de xenotrasplante de ratón:

Se obtuvieron aproximadamente 100-200 microlitros de sangre a partir de los modelos tumorales de xenotrasplante tratados con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo y los no tratados. La sangre recogida se transfirió a frasquitos de 2 ml que contenían 5 μl de una mezcla de inhibidor de proteasa y se mezclaron varias veces por medio de inversión. Se centrifugaron los frasquitos a 10.000 rpm durante 10 minutos en una micro centrífuga de mesa superior. Tras la centrifugación, se formaron dos fases distintas de sangre, una fase superior y una fase inferior. Se retiró con precaución la fase superior del frasquito y se colocó en el interior de un frasquito de 2 ml, posteriormente se almacenó a -80 oC para su uso en el análisis de ELISA. Se descartó la fase inferior.

Aislamiento de ARN

Se congelaron de forma ultrarápida muestras de tumor de colon obtenidas de pacientes con cáncer en nitrógeno líquido tras 20 minutos de la intervención quirúrgica y se almacenaron posteriormente a -80 oC. Las muestras de tumor de xenotrasplante de ratón se dividieron en dos mitades. Una mitad se mezcló en un frasquito de formalina de 10 % para su uso en IHC y la otra mitad se mezcló en 1,0 ml de reactivo de estabilización de ARN RNAlaterTM (Ambion, Inc., Austin, Texas) mantenido a temperatura ambiente durante 30 minutos y posteriormente se almacenó a -80 oC. Se sometió a extracción el ARN total a partir de muestras tumorales usando el Kit RNeasyTM (Qiagen, Valencia CA). Se precisó al menos 1 μg de ARN total con una proporción de 260/280 ≥ 1,8 por medio de espectroscopia (DU640 UV, Beckman Coulter, Fullerton, California) para la formación del perfil de transcripción. Brevemente, se homogeneizaron las muestras tumorales en una solución de lisis-unión suministrada por Qiagen. Se mezcló un volumen igual en cada muestra, se hizo pasar la muestra a través de cartuchos filtrantes y se siguió el resto del protocolo de extracción (Ambion). Se evaluaron el rendimiento de ARN y la calidad en un gel de agarosa estándar de 1 %. La proporción de ARN 28s/18s dentro del intervalo de 1,5 a 2,5 indicó un ARN de alta calidad que se encontraba libre de degradación. Se almacenaron las muestras de ARN a -80 oC.

Perfil de expresión génica:

Se llevó a cabo la formación de perfil de transcripción sobre el ARN obtenido a partir de las muestras tumorales. Se usó el sistema Affymetrix GeneChip (Affymtrix, Santa Clara, California) para la hibridación y la evaluación de las matrices 430A de ratón y U133A de humano. Se pre-procesaron los datos usando un soporte lógico MAS 5,0. La generación de ARNc siguió un protocolo de amplificación T7 estándar. Se transcribió de forma inversa el ARN con SuperScript II (Gibco, Carlsbad, California) en presencia de un cebador de T7-(dT)24 para generar una primera hebra de ADNc. La síntesis de la segunda hebra de ADNc se llevó a cabo en presencia de ADN polimerasa I, ADN ligasa y ARNasa H (Gibco). El ADNc de hebra doble resultante se sometió a terminación redondeada usando ADN T4 polimerasa. Posteriormente se transcribió este ADNc de doble hebra para dar lugar a ARNc en presencia de biotina-ribonucléotidos usando un kit de marcaje de transcripción de ARN de alto rendimiento de bio-matriz (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nueva York). Se purificó el ARNc marcado con biotina amplificado usando columnas Qiagen RNeasy (Qiagen Sciences), se cuantificó y se fragmentó a 94 oC durante 35 minutos en presencia de un tampón de fragmentación (1X). Se sometió a hibridación el ARNc fragmentado para obtener las matrices Affymetrix U I13A y 430A durante la noche a 12 oC. A continuación, se colocaron las matrices en estaciones para fluido para tinción y lavado como se recomienda por parte de los protocolos de Affymetrix. Se exploraron las microplacas y se generaron los valores de intensidad bruta para cada sonda de las matrices. Se estableció una gradación de la intensidad media adaptada para cada matriz hasta

1.500 para tener en cuenta las diferencias pequeñas en cuanto a la intensidad global de la microplaca de manera que el nivel de expresión total para cada muestra resultara comparable.

Análisis de datos para la formación del perfil de transcripción:

Para la identificación de genes co-expresados con VEGFR-2 en cáncer en humanos, se usó una métrica de correlación de Pearson para comparar los valores de expresión para cada grupo de sondas sobre la microplaca de ge U133A con el grupo de sondas de VEGFR-2 (ID de sonda = 203934_at). Se clasificaron todos los grupos de sondas incluidos en los datos de microplaca de gen de H-U133A, siguiendo un orden decreciente de sus valores de Pearson, para establecer la correlación con VEGFR-2 (203934_at). Se consideró que los grupos de sondas que presentaron correlación con VEGFR-2 ≥ 0,55 (resultados de correlación de Pearson) experimentaron una intensa co-expresión con VEGFR-2. Se identificó que los marcadores de la Tabla 1 experimentaron una intensa co-expresión con VEGFR-2 (ID de sonda = 203934_at) a partir de 59 perfiles de expresión génica tumoral de colon.

Se usaron los 94 genes de VEGFR-2 co-expresados identificados a partir de cáncer en humanos con perfiles sobre matrices de U133A para identificar sus homólogos correspondientes en ratón a partir de tumores de xenotrasplante de ratón con perfiles sobre matrices de 430A de ratón. Se llevó a cabo un ensayo-T sobre los datos de perfil de expresión génica generados a partir de los tumores de xenotrasplante tratados con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo y no tratados, que se sometieron a formación de perfil sobre matrices de 430A. Se identificó un total de 18 marcadores (sondas), a partir del litado de los 94 genes de VEGFR-2 co-expresados estudiados, que modificaron de manera importante la abundancia de ARNm después del tratamiento con un modulador e VEGFR-2 (valor de p < 0,05; resultados de ensayo-T; Tabla 2). Se escogieron siete marcadores-candidato a partir del listado de 18, en base al número de veces de cambio y a las puntuaciones del ensayo-T (C1QR1, COL4A1, CAV I, AGTRL1, TIE, CDH5, NID2) para posterior análisis al nivel de proteína por medio de ensayos basados en IHC y en ELISA.

Inmunoquímica:

Se fijaron muestras de tejido recogidas para IHC mediante el uso de formalina de 10 %. Tras la fijación, se descartó el fijador químico y se sumergieron las muestras en etanol de 70 % antes de proceder al intercalado en bloques de parafina. Se cortaron secciones de tejido de cinco micras a partir de cada bloque y se colocaron en portaobjetos para microscopio con carga positiva. Se sometieron a tratamiento de des-parafinado los portaobjetos tisulares por medio de inmersión en xileno. Se re-hidrataron los portaobjetos en etanol de 100 %, etanol de 95 % y etanol de 70 %. Tras la re-hidratación, se lavaron los portaobjetos varias veces con agua desionizada a temperatura ambiente. Se sometieron a ensayo múltiples condiciones de recuperación de antígeno (Citra, Citra Plus y AR10) mediante el uso de un microondas de recuperación-EZ BioGenex para determinas las mejores condiciones. Se llevó a cabo la optimización de la tinción en un sistema IHC de BioGenex i6000 automatizado para cada uno de los anticuerpos de marcadores-candidato de forma independiente. Se sometieron a tinción los xenotrasplantes tratados y los no tratados en el mismo ensayo para minimizar las variaciones de portaobjetos a portaobjetos. Como control, se usó IgG de conejo o ratón en lugar del anticuerpo primario para el marcador-candidato objeto de estudio. Ninguno de los controles negativos dio lugar a tinción en los xenotrasplantes.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA):

Se describe un procedimiento de ELISA para la detección y la medición de colágeno de tipo IV y VEcaderina en plasma humano o cualquier muestra biológica en la que se deben detectar y medir proteínas. Para ELISA de colágeno de tipo IV, se proporcionó el kit por parte de la compañía biomédica Kamiya (nº. cat. KT-035) y el procedimiento de ensayo principal, ELISA de tipo sándwich de una etapa en fase sólida, fue como se muestra a continuación. Se unió de forma simultánea el colágeno de tipo IV de la muestra por parte de un anticuerpo monoclonal en fase sólida y un conjugado de anticuerpo-enzima monoclonal, cada uno dirigido a un sitio antigénico diferente. Esto dio lugar a una molécula de colágeno de tipo IV que se encontraba intercalada entre la fase sólida y los anticuerpos marcados con enzima. Tras retirar el anticuerpo marcado con enzima no ligado y las muestras, se incubó la placa con el substrato de enzima 3,3´,5,5´-tetrametilhilbencidina (TMB). El desarrollo de color resultante fue directamente proporcional a la cantidad de colágeno IV de la muestra. Se terminó la reacción mediante la adición de ácido y se midió la absorbancia a 450 nm. Se preparó la curva estándar a partir de diluciones estándar de colágeno de tipo IV y se determinó la concentración de las muestras de colágeno de tipo IV. Para ELISA de VE-caderina, se usó el kit proporcionado por Bender Medsystems (nº. cat. BMS253) y el procedimiento principal de ensayo fue como se muestra a continuación. Se adsorbió un anticuerpo de revestimiento anti-VE-caderina sobre los micropocillos. La adsorbió la VE-caderina presente en la muestra unida a los anticuerpos sobre los micropocillos; se añadió un anticuerpo de anti-VE-caderina conjugado con biotina y se unió a VEcaderina capturada por el primer anticuerpo. Tras la incubación, se retiró la anti-VE-caderina conjugada con biotina no unida durante la etapa de lavado. Se añadió estreptavidina-HRP y se unió a la anti-VEcaderina conjugada con biotina. Tras la incubación, se retiró la estreptavidina-HRP durante la etapa de lavado y se añadió una solución de substrato reactivo con HRP a los pocillos. Se formó un producto coloreado en proporción con la cantidad de VE-caderina presente en la muestra. Se terminó la reacción mediante adición de ácido y se midió la absorbancia a 450 nm. Se preparó una curva estándar a partir de las diluciones de VE-caderina y se determinó la concentración de las muestras de VE-caderina.

Ejemplo I - Identificación y Uso de los Biomarcadores

Se llevaron a cabo tres experimentos sobre muestras de cáncer humano y tumores de xenotrasplante de ratón obtenidas por medio de procedimientos experimentales rutinarios. Se examinó la expresión de los genes conocidos en humanos y ratón con microplacas Affymetrix U133 A y 430A (Affymetrix, Santa Clara, California) tras los procedimientos de extracción de ARN estándar e hibridación. Se usó un total de 118 perfiles de expresión génica de cáncer de colon para descubrir y validar la expresión de los genes coexpresados con el receptor 2 de factor de endotelial vascular (VEGFR-2). Se sometieron las muestras a aleatorización y posteriormente se dividieron en dos grupos separados cada uno formado por 59 muestras. Se identificaron noventa y cuatro genes por medio de métrica de Pearson, con el fin de ser coexpresados con VEGFR-2 en 59 perfiles de expresión génica de cáncer de colon en humanos (Tabla 1) y se usaron los 59 perfiles de expresión génica de cáncer de colon en humanos como conjunto de validación independiente para ver se el patrón de expresión inicial resulta reproducible (FIG. 1). Los resultados demuestran que el perfil transcripcional presenta el potencial para identificar una firma de expresión génica de VEGFR-2 en cáncer de colon que define dos sub-grupos de pacientes (FIG.2). Un subgrupo de pacientes sobre expresó los 94 genes co-expresados por VEGFR-2 (es decir, mostró niveles elevados de ARNm de expresión según quedó indicado por el signo "+") y el otro subgrupo mostró niveles más bajos de ARNm (tal y como quedó indicado por el signo "-"). Previamente, se ha informado de que la mayoría de los 94 genes identificados objeto de co-expresión con VEGFR-2 son expresados por células endoteliales, vasos sanguíneos y estroma.

Se estudiaron más los 94 genes identificados objeto de co-expresión con VEGFR-2 en cáncer humano mediante el uso de modelos pre-clínicos para determinar si algunos de los genes se moduló mediante el tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo.

Se identificaron diez y ocho marcadores-candidato del listado de 94 genes de VEGFR-2 co-expresados por medio de estadística-t de dos muestras de varianza desigual sobre la clasificaciones de los datos de expresión génica para presentar diferencias importantes en los niveles expresados de ARNm entre los tumores no tratados y los tumores tratados con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo (Tabla 2). Se generaron ambos diagramas a partir de los datos de perfil de expresión génica durante para cinco de los biomarcadores superiores recogidos en el listado de la Tabla 2. Los datos del gráfico de caja muestran de manera gráfica la diferencia en los niveles de expresión de ARNm antes y después del tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo (Fig. 3). Se identificó que más que 50 % de los marcadores que eran modulados por el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo presentaron niveles de expresión de ARNm reducidos o rebajados. Esta información indica que es más probable que los pacientes que sobreexpresan los marcadores co-expresados con VEGFR-2 presenten niveles reducidos por medio del tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Esta información resulta útil a la hora de escoger la población de pacientes que, de manera más probable, se pueda beneficiar de la terapia con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo.

Se escogieron siete marcadores-candidato a partir del listado de 18 en base al número de cambios y a las puntuaciones del ensayo de T para validación posterior al nivel de proteína en las muestras pre-clínicas y clínicas que se trataron con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo.

Los resultados de IHC pre-clínicos para los genes-candidato de colágeno de tipo IV (COL4A1), componente de complemento I, subcomponente q, receptor 1 (C1qR1) y receptor de tipo 1 de angiotensina (AGTRL 1) mostraron una tinción positiva alrededor de los vasos sanguíneos ubicados en el interior de la carga del tumor antes de cualquier tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Tras el tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo, las muestras de tumor mostraron tinción negativa o menor grado de tinción con respecto a los tumores no tratados que presentaron más vasos sanguíneos tumorales (FIG. 4). Esos resultados indican que el colágeno de tipo IV, C1qR1, y el receptor de tipo 1 de angiotensina son expresado de forma predominante alrededor de los vasos sanguíneos tumorales y los marcadores son modulados al nivel del proteína por medio del tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. El alcance hasta el cual son afectados estos marcadores por parte del tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo podría ser el reflejo de la cantidad de pérdida o interrupción de vasos sanguíneos tumorales.

Se obtuvieron dos kits de ELISA disponibles comercialmente para dos de los diez y ocho marcadores (Colágeno de tipo IV y VE-caderina) identificados por medio de la formación de perfiles de expresión génica objeto de modulación por parte del inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Los ensayos de ELISA se llevaron a cabo con muestras de sangre recogidas a partir de ratones con tumores tratados y no tratados con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. También se tomaron muestras de sangre a partir de ratones que no tenían tumores como control. Los resultados mostraron que los niveles de Colágeno tipo IV y VEcaderina fueron elevados en las muestras de sangre obtenidas a partir de ratones con tumores con respecto a los ratones sanos que no presentaban tumores. Estos datos sugieren que, probablemente, el aumento de los niveles de Colágeno de tipo IV y VE-caderina detectados en la sangre obtenida a partir ratones con tumores se debe a un mayor número de vasos sanguíneos tumorales en los organismos con tumor, ya que, por otra parte, tanto los ratones con tumor como los sanos son genéticamente similares. Se trataron los ratones con tumor con niveles sanguíneos elevados de Colágeno de tipo IV y VE-caderina con el inhibidor de VEGFR-2 de ejemplo (100 mg/kg 1qd x 14 días). Tras el tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo, disminuyó la cantidad de proteínas de Colágeno de tipo IV y de VE-caderina detectadas en sangre, hasta los niveles observados en los ratones sanos que no presentaban tumores.

De este modo, los resultados de ELISA muestran que los niveles sanguíneos de Colágeno de tipo IV y VE-caderina son elevados en ratones con tumor con respecto a los ratones normales sin tumor y, tras el tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo, se reducen o se rebajan los niveles sanguíneos detectados en los ratones con tumor hasta los niveles observados en ratones normales. Esta reducción de los niveles sanguíneos de Colágeno de tipo IV y VE-caderina puede ser el reflejo del alcance hasta el que el crecimiento de vasos sanguíneos tumorales queda inhibido o interrumpido.

En base a estudios pre-clínicos, se examinó el kit de ELISA de Colágeno de tipo IV como ensayo molecular potencial para evaluar la respuesta validar su expresión sobre muestras obtenidas a partir de pacientes con cáncer que recibieron el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Se examinaron las muestras biológicas de doce pacientes con cáncer tratados con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo en el protocolo CA182002, que es un estudio de aumento de la dosis con agente sencillo, con tres pacientes cada uno a 180 mg/día, 320 mg/día, 600 mg/día y 800 mg/día. Se determinaron los niveles sanguíneos de Colágeno de Tipo IV por medio de un ensayo basado en ELISA para cada paciente en el Día 0 (antes de la terapia) y en el Día 26 (después del tratamiento). Los niveles de colágeno de tipo IV aumentaron de media 24 % en el Día 26 en la cohorte de 180 mg/día; aumentaron de media únicamente 7 % en el Día 26 en la cohorte de 320 mg/día. En la cohorte de 600 mg/día, se redujo de medio en 26 % en el día 26. En la cohorte de 800 mg/día, se redujo únicamente de forma marginal, en comparación con la cohorte de 600 mg/día, en 29 % en el Día 26. Estos datos mostraron que el aumento de la cantidad de inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo dio lugar a una reducción de los niveles de colágeno de tipo IV detectados en la sangre de manera dependiente de la dosis (FIG. 6). Esta información avala los datos pre-clínicos y proporciona la información necesaria para mostrar que el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo es capaz de reducir la cantidad de colágeno de tipo IV detectada en la sangre obtenida a partir de los sujetos clínicos actuales que fueron tratados con el inhibidor de VEGFR-2. Esto resultados indica que el nivel sanguíneo de colágeno de tipo IV sirve como biomarcador farmacodinámico útil (PD) para el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo, así como otros moduladores de VEGFR-2.

También se examinaron los ensayos de ELISA de colágeno de tipo IV para ver si el colágeno de tipo IV fue útil como biomarcador para la respuesta clínica frente al inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Los resultados de un paciente al cual se le diagnosticó carcinoma de ampolla de Vater y se trató con 600 mg/día (este paciente también presentó los niveles más elevados de colágeno de tipo IV detectados entre los doce pacientes sometidos a ensayo) mostraron la reducción importante de los niveles sanguíneos de colágeno de tipo IV de pre-tratamiento (P= 0,006; > 50 %) entre el Día 0 y el Día 26 (FIG. 7). La reducción de los niveles sanguíneos de colágeno de tipo IV se correlacionó con la evidencia clínica de actividad antitumoral. Este paciente presentó una respuesta parcial al inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo que se definió como una disminución de 50 % o más en la suma de todas las zonas de lesión objetivo en comparación con la suma de la línea base, sin progresión inequívoca de lesiones existentes no objetivo y sin aparición de nuevas lesiones Los datos se seguimiento adicionales mostraron que este paciente permaneció con la terapia de inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo durante un período de tiempo extendido (un total de 126 días). Los resultados para el otro paciente que se trató con el mismo nivel de dosificación (600 mg/día) no presentaron reducción importante de los niveles de colágeno de tipo IV (P= 0,632) entre el Día 0 y el Día 26. Este paciente no consiguió una respuesta clínica al inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Los datos de seguimiento adicionales mostraron que el paciente permaneció con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo durante un período de tiempo más corto (un total de 32 días) lo que indicó además que este paciente presentó una probabilidad mayor de no beneficiarse de la terapia con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Sobre todo, los resultados clínicos a partir de estos dos pacientes objeto de evaluación confirman los datos pre-clínicos e indican que el ensayo de ELISA con colágeno de tipo IV es un procedimiento clínicamente útil para controlas la respuesta a un(unos) modulador(es) de VEGFR-2, tal como el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo.

Los niveles sanguíneos de colágeno de tipo IV, determinados por medio de un ensayo basado en ELISA o mediante la formación de perfiles de expresión génica e IHC del tumor, sirven como biomarcador sustituto que es el reflejo del alcance al cual se ha inhibido la proliferación del cáncer o de los vasos sanguíneos tumorales mediante el uso del inhibidor de VEGFR-2. El grado hasta el cual se reduce el colágeno de tipo IV por parte del modulador de VEGFR-2 (por ejemplo, el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo) puede conducir a un beneficio clínico positivo y a un resultado mejorado para pacientes a los que se ha diagnosticado cáncer u otras enfermedades relacionadas con VEGFR-2.

También se proporcionan datos adicionales sobre el colágeno de tipo IV (COL4A1) como marcador de pronóstico potencial en el cáncer. Los resultados muestra que los pacientes con cáncer de colon que presentan niveles más elevados de COL4A1 también presentan una menor supervivencia libre a la enfermedad, en comparación con pacientes con niveles de expresión más bajos de COL4A1 (FIG. 8).

De este modo, los datos acoplados con los estudios clínicos y pre-clínicos sugieren que los pacientes que expresan colágeno de tipo IV con niveles más elevados puede ser capaces de mejorar su resultado mediante el tratamiento con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo, lo que puede reducir los niveles de colágeno de tipo IV en forma de inhibición de la proliferación tumoral. Se puede usar el colágeno de tipo IV como marcador pronóstico y como marcador predictivo para escoger pacientes que son más susceptibles de beneficiarse de la terapia con el modulador de VEGFR-2.

El colágeno de tipo IV es el componente principal que constituye la membrana basal de las células. La membrana basal está formada por dos subunidades de Colágeno de tipo IV. Una subunidad es colágeno de tipo IV alfa I (COL4A1) y la otra subunidad es colágeno de tipo IV alfa 2 (COL4A2). Cuando se hace referencia a los efectos que el modulador de VEGFR-2 del ejemplo presenta sobre el colágeno de tipo IV, es más probable que se produzca el efecto sobre ambas subunidades ya que las dos proteínas actúan juntas para constituir la membrana basal.

Ejemplo 2 - Xenotrasplantes y eficacia del inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo

En este ejemplo, se identificaron los biomarcadores de la Tabla 2 usando modelos tumorales de xenotrasplante en ratones que fueron tratados con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo. Esto proporcionó los datos de eficacia para el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo en el modelo de tumor de xenotrasplante en ratón usado (L2987) que presenta un respuesta elevada frente al inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo (FIG. 9).

Ensayo antitumoral in vivo:

Se propagaron tumores en ratones atímicos en forma de trasplantes subcutáneos (sc) usando fragmentos tumorales obtenidos a partir de ratones donantes. La aparición del tumor tuvo lugar aproximadamente cada dos a cuatro semanas. Posteriormente, se dejaron proliferar los tumores hasta alcanzar la ventana de tamaño pre-determinada (normalmente entre 100-200 mg, se excluyeron los tumores fuera del intervalo) y se distribuyeron los animales de manera uniforme con respecto a diferentes tratamientos y grupos de control. Se trataron los animales con el inhibidor de VEGFR-2 del ejemplo (100 mg/kg 1qd x 26). Se comprobó diariamente el tratamiento relacionado con la toxicidad/mortalidad de los animales tratados. Se pesó cada grupo de animales antes del inicio del tratamiento (Wt1) y posteriormente de nuevo tras la última dosificación de tratamiento (Wt2). La diferencia de peso corporal (Wt2-Wt1) proporcionó una medida de la toxicidad relacionada con el tratamiento. Se determinó la respuesta tumoral por medio de la medición de tumores con un calibre dos veces a la semana, hasta que los tumores alcanzaron un tamaño objetivo predeterminado de 1 gm o se volvieron necróticos. Se estimaron los pesos de los tumores (mg) a partir de la fórmula:

Peso del tumor = (longitud x anchura2)/2

Se determinó la actividad antitumoral en términos de inhibición de la proliferación del tumor primario. Se determinó de dos formas: (i) calculando el peso mediando relativo del tumor (MTW) del ratón tratado (T) y del ratón de control (C) en varios momentos de tiempo (se expresaron los efectos como % de TC); y (ii) calculando el retardo de la proliferación tumoral (valor T-C), definido como la diferencia en tiempo (días) necesario para que los tumores tratados (T) alcanzaran un tamaño objetivo predeterminado en comparación con los del grupo de control (C). Se llevaron a cabo las evaluaciones estadísticas usando el ensayo de Wilcoxon generalizado de Gehan para las comparaciones de tiempo con el fin de alcanzar el tamaño objetivo del tumor. Se declaró la importancia estadística a p < 0,05. Se definió la actividad antitumoral como % de T/C de MTW continua ≤ 50 % para al menos un tiempo de doblaje del volumen tumoral I (TVDT), en cualquier momento después del comienzo del tratamiento, en el que TVDT (tiempo de doblaje del volumen tumoral) = tiempo medio (días) para el control de los tumores para alcanzar el tamaño deseado - tiempo medio (días) para el control de los tumores para alcanzar la mitad del tamaño objetivo. Además, los grupos de tratamiento tenían que ir acompañados de un retardo de la proliferación tumoral (valor T-C) estadísticamente significativo (p < 0,05) para ser denominado como activo.

Se comprobaron diariamente los animales tratados en cuanto al tratamiento relacionado con la mortalidad/toxicidad. Cuando ocurrió la muerte, se registró el día de la muerte. Se consideró que los ratones tratados que morían antes de que sus tumores presentaran el tamaño objetivo, lo hacían debido a la toxicidad del fármaco. Ninguno de los ratones de control murió presentando tumores de tamaño menor que el tamaño objetivo. Se consideró que los grupos de tratamiento con más de una muerte causada por la toxicidad del tratamiento presentaron tratamientos excesivamente tóxicos y sus datos no fueron incluidos en la evaluación de la eficacia antitumoral del compuesto.

Ejemplo 3 - Producción de anticuerpos frente a los biomarcadores:

Se pueden preparar anticuerpos frente a los biomarcadores por medio de una variedad de procedimientos. Por ejemplo, se pueden administrar células que expresan un polipéptidos de biomarcador a un animal con el fin e inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales dirigidos a los polipéptidos expresados. En un aspecto, se prepara la proteína de biomarcador y se aísla o, de lo contrario, se purifica para dar lugar a la misma considerablemente libre de contaminantes naturales, empleando técnicas comúnmente practicadas en la técnica. Posteriormente, se introduce dicha preparación en el interior de un animal con el fin de producir anti-sueros policlonales de mayor actividad específica para el polipéptido expresado y aislado.

En un aspecto, los anticuerpos de la invención son anticuerpos policlonales (o sus fragmentos que se unen a proteínas). Se pueden llevar a cabo cultivos de células que expresan el polipéptido de biomarcador en cualquier medio de cultivo tisular apropiado, no obstante, es preferible llevar a cabo cultivos de células en un medio de Eagle modificado con Earle complementado de manera que contenga 10 % de suero bovino fetal (inactivado a aproximadamente 56 oC) y complementado de manera que contenga aproximadamente 10 g/l de amino ácidos no esenciales, aproximadamente 1,00 U/ml de penicilina y aproximadamente 100 μg/ml de estreptomicina.

Se pueden someter a extracción los esplenocitos de ratón inmunizado (y reforzados) y se pueden fusionar con una estirpe celular de mieloma apropiada. Se pueden emplear cualquier estirpe celular de mieloma apropiada de acuerdo con la invención, no obstante, es preferible emplear una estirpe celular de mieloma parental (SP2/0) disponible en ATCC. Tras la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen en un medio de HAT, y posteriormente se someten a clonado por medio de dilución limitante como se describe en Wands et al. (1981, Gastroenterology, 80:225-232). Las células de hidridoma obtenidas por medio de dicho arco de selección se someten posteriormente a ensayo para identificar aquellas células que segregan anticuerpos capaces de unirse al inmunogen de polipéptido o a una de sus partes.

De manera alternativa, se pueden producir anticuerpos adicionales capaces de unirse al polipéptido de biomarcador por medio de un procedimiento de dos etapas usando anticuerpos anti-idotípicos. Dicho procedimiento hace uso del hecho de que los anticuerpos son antígenos por sí mismos, por tanto, es posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este procedimiento, se pueden usar los anticuerpos específicos de proteína para inmunizar un animal, preferentemente un ratón. Posteriormente, se usan los esplenocitos de dicho animal inmunizado para producir células de hibridoma, y las células de hibridoma se someten a evaluación para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de proteína puede ser bloqueada por el polipéptido. Dichos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos para el anticuerpo específico de proteína y se pueden usar para inmunizar un animal con el fin de inducir la formación de otros anticuerpos específicos de proteína.

Ejemplo 4 - Ensayos de inmunofluorescencia:

Se puede usar el siguiente protocolo de inmunofluorescencia, por ejemplo, para verificar la expresión de la proteína de biomarcador de VEGFR-2 sobre células, por ejemplo, con el fin de evaluar la presencia de uno o más anticuerpos que se unen a biomarcadores de VEGFR-2 expresados sobre la superficie de las células. Brevemente, los portaobjetos de cámara de Lab-Tek II se revisten durante la noche a 4 oC con 10 microgramos/mililitro (μg/ml) de colágeno bovino de tipo II en DPBS que contenía calcio y magnesio (DPBS++). Posteriormente, se lavaron dos veces los portaobjetos con DPBS++ frío y se sembraron con células CHO-CCR5 8000 o CHO pC4 trans-infectadas en un volumen total de 125 μl y se incubó a 37 oC en presencia de oxígeno 95 %/dióxido de carbono 5 %.

Se retiró de forma suave el medio de cultivo mediante aspiración y se lavaron las células adherentes dos veces con DPBS++ a temperatura ambiente. Se bloquearon los portaobjetos con DPBS++ que contenía BSA de 0,2 % (agente de bloqueo) a 0-4 oC durante una hora. Se retira de forma suave la solución de bloqueo mediante aspiración, y 125 ul de solución que contiene anticuerpo (una solución que contiene anticuerpo puede ser, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo de hibridoma que normalmente se usa en forma no diluida, o suero/plasma que normalmente se usa diluido, por ejemplo, con una dilución de aproximadamente 1/100). Los arcos de portaobjeto se incuban durante I hora a 0-4 oC. Posteriormente, se retiran de forma suave las soluciones de anticuerpo mediante aspiración y se lavan los arcos celulares cinco veces con 400ul de solución de bloqueo enfriada en hielo. A continuación, se añaden 125 μl de anticuerpo secundario marcado con rodamina de I μg/l (por ejemplo, un anti-IgG de humano) en la solución de agente de bloqueo a las células. De nuevo, se incuban las células durante 1 hora a 0-4 oC.

Posteriormente se retira de forma suave la solución de anticuerpo secundario mediante aspiración y se lavan las células tres veces con 400 μl de solución de bloqueo enfriada en hielo, y cinco veces con DPBS++ frío. A continuación, se fijan las células con 125 μl de formaldehído de 3,7 % en DPBS++ durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se laven las células cinco veces con 400 μl de DPBS++ a temperatura ambiente. Finalmente, se montan las células en glicerol acuoso de 50 % y se observan al microscopio de fluorescencia usando filtros de rodamina.

LISTADO DE SENCUENCIAS

<110> Bristol-Myers Squibb Co. Ayers, Mark <120> BIOMARCADORES Y PROCEDIMIENTOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A MODULADORES DE RECEPTOR-2 DE FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR

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<150> US 60/713.583

<151>

10 <160> 184

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 5830 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2 5 <211> 1647

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2 10

<210> 3

<211> 6699

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 4098 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4 10

<210> 5

<211> 5514

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 2984

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 3609

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 581 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature 10 <222> (509) .. (509)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>: misc_feature 15 <222> (537) .. (537)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (564) .. (564)

<223> n es a, c, g o t

<400> 12

<210> 13 10 <211> 5723

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13 15

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<211> 5222

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 16

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<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 17

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 18

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<212> ADN

<213> Homo sapiens 10

<400> 19

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<211> 884

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<210> 22

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<212> ADN

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 5480

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 3791

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<211> 3189

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

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<400> 182

<210> 183

<211> 496

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183

<210> 184

<211> 189

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 184

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para identificar un mamífero que responderá terapéuticamente a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar un modulador de VEGFR-2, en el que el procedimiento comprende:

(a)

medir en al menos una muestra biológica de mamífero obtenida a partir del mamífero, el nivel de al menos un biomarcador que se escoge entre los biomarcadores de la Tabla 1

(b)

seguir la exposición del mamífero al modulador de VEGFR-2, midiendo en al menos una muestra biológica de mamífero obtenida a partir del mamífero, el nivel de al menos un biomarcador,

en el que la diferencia de nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (b) en comparación con el nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a) indica que el mamífero responderá terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer y en el que al menos un biomarcador es colágeno IV.
2. Un procedimiento in vitro para identificar un mamífero que responderá terapéuticamente a un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar un modulador de VEGR-2, en el que el procedimiento comprende:

(a) seguir la exposición del mamífero al modulador de VEGFR-2, midiendo, en al menos una muestra biológica de mamífero obtenida a partir del mamífero, el nivel de al menos un biomarcador que se escoge entre los biomarcadores de la Tabla 1,

en el que la diferencia de nivel de al menos un biomarcador medido en la etapa (a), en comparación con el nivel del biomarcador en un mamífero que no ha sido expuesto a dicho modulador de VEGFR-2 indica que el mamífero responderá terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer y en el que al menos un biomarcador es colágeno IV.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que el modulador de VEGFR-2 es éster 2-[4-(4-fluoro2-metil-1H-indol-5-iloxi)-5-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-iloxi]-1-metiletílico de ácido [(1R), 2S]-2aminopropiónico que tiene la estructura

génica

Paciente 308