ES2377868T3 - Clonación de genes que codifican citocromo p450 a partir de Nicotiana - Google Patents
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Abstract
Una molécula aislada de ácido nucleico de Nicotiana en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 356.
Description
Clonacion de genes que codifican citocromo p450 a partir de Nicotiana
La presente invencion se relaciona con secuencias de acido nucleico que codifican enzimas citocromo p450 (de ahora en delante denominadas como enzimas p450 y p450) en plantas de Nicotiana y con metodos para utilizar aquellas secuencias de acido nucleico para alterar fenotipos de plantas.
Antecedentes
Las reacciones enzimaticas que catalizan los citocromos p450 para un rango diverso de sustratos quimicamente disimiles que incluyen el metabolismo oxidativo, peroxidativo y reductivo de sustratos endogenos a xenobioticos. En las plantas, las p450 participan en rutas bioquimicas que incluyen la sintesis de productos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lipidos, glicosidos cianogenicos, y glucosinolatos (Chappel, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bi ol. 198, 49: 311 - 343). Los citocromos p450, tambien conocidos como proteinas hemotiolato p450, usualmente actuan como oxidasas terminales en cadenas multicomponentes de transferencia de electrones, llamados sistemas de monooxigenasa que contienen p450. Reacciones especificas catalizadas incluyen desmetilacion, hidroxilacion, epoxidacion, N-oxidacion, sulfooxidacion, N-, S-, y O-desalquilaciones, desulfatacion, desaminacion, y reduccion de grupos azo, nitro, y N-oxido.
El papel diverso de las enzimas p450 de la planta de Nicotiana ha sido implicado en la elaboracion de una variedad de metabolitos de la planta tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lipidos, glicosidos cianogenicos, glucosinolatos y un huesped de otras entidades quimicas. Durante los ultimos anos, se ha hecho evidente que algunas enzimas p450 pueden impactar la composicion de metabolitos vegetales en las plantas. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y el aroma de ciertas plantas por medio de la alteracion de su perfil de acidos grasos seleccionados a traves de fitomejoramiento; sin embarg o se sabe mu y poco acerca de lo s mecanismos involucrados en el control de los n iveles de estos constituyentes de la hoja. La reduccion de la expresion de enzimas p450 asociadas con la modificacion de acidos grasos puede facilitar la acumulacion de acidos grasos deseados que proporcionan cualidades fenotipicas mas preferidas de la h oja. La funcion de las enzimas p450 y su ampliacion de funciones en los constituyentes de la planta esta aun por descubrirse. Por ejemplo, se encontro una clase especial de enzimas p450 para catalizar el rompimiento del acido graso en aldehidos y alcoholes volatiles C6 y C9 que son los principales contribuyentes del olor a "verde fresco" de frutas y vegetales. El nivel de otras nuevas p450 objetivo puede ser alterado para mejorar las cualidades de los constituyentes de la hoja por medio de la modificacion de la composicion de los lipidos y metabolitos rotos relacionados en la hoja de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la h oja son afec tados por se nectud que estimula la maduracion de las propiedades de calidad de la hoja. Incluso otros reportes han mostrado que las enzimas p450 desempenan un papel funcional en la alteracion de acidos grasos que estan involucrados en interacciones planta-patogeno y de resistencia a enfermedades.
En otros casos, se ha sugerido que las enzimas p450 estan involucradas en biosintesis de alcaloides. La nornicotina es un alcaloide menor encontrado en Nicotiana tabaceum. Se ha postulado que es producida por la desmetilacion mediada por p450 de nicotina seguida por acilacion y nitrosacion en la posicion N produciendo asi una serie de Nacilnonicotinas y N-nitrosonornicotinas. Se piensa que la N-desmetilacion, catalizada por una desmetilasa putativa p450, es una fuente primaria de biosintesis de nornic otina en Nicotiana. Aunque se cree que la enzima e s microsomal, hasta el momento no se ha purificado exitosamente una enzima nicotina desmetilasa, ni se han aislado los genes involucrados.
Ademas, se h a formulado la hipotesis pero no se h a probado que la activida d de las enz imas p450 esta geneticamente controlada y tambien fuertemente influenciada por factores ambientales. Por ejemplo, se piensa que la desmetilacion de la nicotina en Nicotiana se incrementa sustancialmente cuando las plantas alcanzan una etapa madura. Ademas, se ha formula do la hipotesis aun no probada de que el gen para la desmetilasa contiene un elemento transponible que puede inhibir la traduccion del ARN cuando esta presente.
La gran multiplicidad de formas de la enzima p450, su estructura y funcion diferente ha hecho muy dificil la investigacion sobre enzimas p450 Nicotiana antes de la presente invencion. Ademas, la clonacion de enzimas p450 se ha visto obstaculizada al menos en parte debido a que estas proteinas localizadas en la membrana estan tipicamente presentes en baja cantidad y a menudo inestable para purificacion. Por lo tanto, existe la necesidad por la identificacion de enzimas p450 en plantas y las secuencias de acido nucleico asociadas con esas enzimas p450. En particular, unicamente se han reporta do una pocas proteinas citocromo p450 en Nicotiana. Las invenciones descritas aqui implican el descubrimiento de un nume ro sustancial de fragmentos de citocromo p450 que corresponden a diferentes grupos de especies de p450 con base en su identidad de secuencia.
Resumen
La presente invencion esta dirigida a una molecula aislada de acido nucleico, a una planta transgenica de tabaco y a metodos que las involucran, como se describe en las reivindicaciones. La presente invencion esta dirigida ademas a enzimas p450 vegetales de Nicotiana. La presente invencion tambien esta dirigida a enzimas p450 en plantas cuya expresion es inducida p or etileno y/o s enectud de la pl anta. La p resente invencion esta i ncluso d irigida adicionalmente a secue ncias de acid o nucleico en plantas que tie nen actividad enzimatica, por ej emplo, siendo categorizadas como oxigenasa, desmetilasa y similares,u otras y el uso de aquellas secuencias para reducir o silenciar la expresion o sobreexpresion de estas enzimas. La invencion tambien se relaciona con enzimas p450 encontradas en plantas que contienen niveles mas altos de nornicotina que las plantas que exhiben niveles menores de nornicotina.
En un aspecto, la divulgacion esta dirigida a secuencias de acido nucleico como se expone en las SEQ. ID. Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313 y 315.
En un segu ndo aspecto rel acionado, aqu ellos fragm entos que conti enen un a ide ntidad ma yor al 75% en la secuencia de acid o n ucleico fuero n co locados e n g rupos dependiendo de su ide ntidad e n una reg ion correspondiente al primer acido nucleico despues del motivo GXRXCX(G/A) del citocromo p450 hasta el codon de detencion. Los grupos representativos de acido nucleico y las especies respectivas se muestran en la Tabla I.
En un tercer aspecto, la divulgacion esta dirigida a secuencias de aminoacidos como las expuestas en las SEQ. ID. Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314 y 316.
En un cuarto aspecto relacionado, aquellos fragmentos que contienen una identidad mayor al 71% en la secuencia de acido nucleico fueron colocados en grupos dependiendo de su identidad con respecto a los otros e n una region correspondiente al primer aminoacido seguido del motivo GXRXCX(G/A) del citocromo p450 hasta el codon de detencion. Los grupos representativos de aminoacidos y las especies respectivas se muestran en la Tabla II.
En un quinto aspecto, la divulgacion esta dirigida a secuencias de aminoacidos de genes de longitud completa como se expone en las SEQ. ID. Nos. 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314 y 316.
En un sexto aspecto relacionado, aquellos genes de longitud completa que contienen una identidad del 85% superior en la secuencia de aminoacidos fueron colocados en grupos dependiendo de la identidad con respecto a los otros. Los grupos representativos de aminoacidos y las especies respectivas se muestran en la Tabla III.
En un septimo aspecto, la divulgacion esta dirigida a secuencias de aminoacidos de los fragmentos expuestos en las SEQ. ID. Nos. 299 - 357.
En un octavo aspecto relacionado, aquellos fragmentos que contienen una identidad del 90% o superior en la secuencia de aminoacidos fueron colocados en grupos dependiendo de su identidad con respecto a los otros en una region correspondiente al primer domini o del citocromo p 450, UXXRXXZ, hacia el tercer domini o del citocromo, GXRXO, donde U es E o K, X es c ualquier aminoacido y Z es R, T, S o M. Los gr upos representativos de aminoacidos y las especies respectivas se muestran en la Tabla IV.
En un noveno aspecto relacionado, la reduccion o eliminacion o sobreexpresion de enzimas p450 en plantas de Nicotiana se puede lograr transitoriamente utilizando sistemas virales de ARN.
Las plantas que resultan transformadas o infectadas se evaluan por los cambios fenotipicos incluyendo, pero sin limitarse a, analisis de transcriptos endogenos de ARN para p450, peptido expresado como p450, y concentraciones de metabolitos de planta utilizando tecnicas comunmente disponibles para aquellos ordinariamente capacitados en el arte.
En un decimo asp ecto im portante, l a presente divulgacion esta ta mbien diri gida a la g eneracion de lin eas transgenicas de Nicotiana que expresan los niveles de actividad de la enzima p450. De acuerdo con la divulgacion, estas lineas transg enicas in cluyen secue ncias de acid o nucleico que son efectivas para reducir o silenc iar o incrementar la expresion de cierta enzima resultando por lo tanto en efectos fenotipicos dentro de Nicotiana. Tales secuencias de acido nucleico incluyen a las SEQ. ID. Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109,111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313 y 315.
En un undecimo aspecto muy importante de la divulgacion, las variedades cultivadas de plantas que incluyen acidos nucleicos de la presente invencion en una capacidad reducida de expresion utilizando ya sea genes de longitud completa o fragmentos de los mismos o en una capacidad de sobreexpresion utilizando genes de longitud completa tendran perfiles alterados de metabolitos con relacion a las plantas de control.
En un duodecimo aspecto de la divulgacion, las variedades cultivadas de plantas que incluyen acidos nucleicos de la presente invencion que utilizan ya sea genes de longitud completa o fragmentos de los mismos en la modificacion de la biosintesis o el rompimiento de metabolitos derivadosde la planta o externos a las plantas, tendran uso en la toleracion de ciertos compuestos quimicos exogenos o plagas de la p lanta. Tales secuencias de acido nucleico incluyen las SEQ ID. Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313 y 315.
En un decimotercer aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a la seleccion de plantas, mas preferiblemente de Nicotiana, que contienen genes que tienen identidad sustancial de acidos nucleicos con la secuencia ensenada de acidos nucleicos. El uso de ladivulgacion seria ventajoso para identificar y seleccionar plantas que contienen una secuencia de acido nucleico con una identidad exacta o sustancial donde tales plantas forman parte de un programa de fitomejoramiento para variedades transgenicas o tradicionales, un programa de mutagenesis, o poblaciones de plantas diversas de origen natural. La seleccion de plantas para una identidad sustancial de acidos nucleicos se puede lograr por medio de la evaluacion de materiales de acido nucleico de la planta utilizando una sonda de acido nucleico junto con protocolos de deteccion de acido nucleico que incluyen, pero no se limitan a, hibridacion de acido nucleico y analisis por PCR. La sonda de acido nucleico puede consistir de la secuencia ensenada de acido nucleico
o fragmento de la misma correspondiente a las SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313 y 315.
En un decimocuarto aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a la identificacion de genes de la planta, mas preferiblemente de Nic otiana, que com parten una identidad sust ancial de am inoacidos corr espondiente a la secuencia ensenada de acido nucleico. La identificacion de los genes de la planta incluye tanto clones de ADNc como genomicos, esos clones de ADNc y genomicos, mas preferiblemente de Nicotiana pueden ser logrados por medio de seleccion de bibliotecas de ADNc de la planta utilizando una sonda de acido nucleico junto con protocolos de deteccion de acido nucleico que incluyen, pero no se limitan a, hibridacion de acido nucleico y analisis por PCR. La son da d e acido n ucleico pue de co ntener u na s ecuencia d e acid o nucl eico o fragmento de la mism a correspondiente a las SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 143, 145 y 147.
En un decimoquinto aspecto, se pueden seleccionar las bibliotecas de expresion de ADNc que expresan peptidos utilizando anticuerpos dirigidos a parte o a toda la secuencia ensenada de aminoacidos. Tales secuencias de aminoacidos incluyen las SEQ ID 2, 4, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46,
48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 96, 98, 100, 102, 104, 106,
108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 144, 146, 148. En un decimosexto aspecto importante, la presente divulgacion esta tambien dirigida a la generacion de lineas transgenicas de Nicotiana que tienen sobreexpresion de niveles de actividad de la enzima p450. De acuerdo con la divulgacion, estas lineas transgenicas incluyen todas las secuencias de acido nucleico que codifican las secuencias de aminoacidos de los genes de longitud completa que son efectivos para incrementar la expresion de cierta enzima que resulta en consecuencia en efectos fenotipicos dentro de Nicotiana. Tales secuencias de aminoacidos incluyen las SEQ. ID. 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 , 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 18 8, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298. 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314 y 316.
Se provee tambien un producto de tabaco que incluye hoja de tabaco (lamina y/o tallo) que tiene cantidades reducidas de nornicotina. El producto de tabaco incluyetabaco (hoja de tabaco que incluye lamina y/o tallo) de una planta que incluye las secuencias descritas aqui o do nde los genes que codifican nitrosaminas especificas del tabaco ha n sido elimi nados o suprimidos . La eliminac ion o supresi on de genes que cod ifican nitrosamin as especificas del tabaco es ef ectiva para reducir nitrosaminas especificas del tabaco en los pr oductos de tabaco aproximadamente de 5 hasta apro ximadamente 10%, en otro aspecto aproximadamente de 10 a 20%, en otro aspecto aproximadamente 2 0 a 30 %, y en otro asp ecto mas del 30%, compara do con pro ductos del tab aco elaborados a partir de plantas de tabaco donde los genes que codifican para nitrosaminas especificas del tabaco no han sido eliminados o suprimidos. Como se utiliza aqui, el producto de tabaco puede incluir cigarrillos, cigarros, tabaco de pipa, tabaco de mascar, productos mezclados con el producto de tabaco, y mezclas de los mismos.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 1 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 2.
La Figura 2 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 3 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 4.
La Figura 3 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 5 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 6.
La Figura 4 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 7 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 8.
La Figura 5 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 9 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 10.
La Figura 6 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 11 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 12.
La Figura 7 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 13 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 14.
La Figura 8 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 15 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 16.
La Figura 9 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 17 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 18.
La Figura 10 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 19 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 20.
La Figura 11 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 21 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 22.
La Figura 12 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 23 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 24.
La Figura 13 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 25 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 26.
La Figura 14 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 27 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 28.
La Figura 15 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 29 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 30.
La Figura 16 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 31 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 32.
La Figura 17 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 33 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 34.
La Figura 18 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 35 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 36.
La Figura 19 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 37 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 38. La Figura 20 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 39 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 40. La Figura 21 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 41 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 42. La Figura 22 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 43 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 44. La Figura 23 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 45 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 46. La Figura 24 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 47 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 48. La Figura 25 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 49 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 50. La Figura 26 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 51 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 52. La Figura 27 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 53 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 54. La Figura 28 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 55 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 56. La Figura 29 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 57 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 58. La Figura 30 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 59 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 60. La Figura 31 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 61 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 62. La Figura 32 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 63 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 64. La Figura 33 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 65 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 66. La Figura 34 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 67 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 68. La Figura 35 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 69 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 70. La Figura 36 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 71 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 72. La Figura 37 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 73 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 74. La Figura 38 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 75 y el aminoacido de la SEQ. ID. Not.:76. La Figura 39 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 77 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 78. La Figura 40 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 79 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 80. La Figura 41 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 81 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 82. La Figura 42 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 83 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 84. La Figura 43 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 85 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 86. La Figura 44 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 87 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 88. La Figura 45 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 89 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 90. La Figura 46 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 91 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 92. La Figura 48 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 95 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 96. La Figura 49 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 97 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 98.
La Figura 50 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 99 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 100. La Figura 51 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 101 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 102. La Figura 52 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 103 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 104. La Figura 53 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 105 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 106. La Figura 54 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 107 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 108. La Figura 55 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 109 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 110. La Figura 56 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 111 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 112. La Figura 57 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 113 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 114. La Figura 58 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 115 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 116. La Figura 59 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 117 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 118. La Figura 60 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 119 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 120. La Figura 61 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 121 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 122. La Figura 62 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 123 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 124. La Figura 63 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 125 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 126. La Figura 64 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 127 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 128. La Figura 65 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 129 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 130. La Figura 66 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 131 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 132. La Figura 67 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 133 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 134. La Figura 68 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 135 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 136. La Figura 69 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 137 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 138. La Figura 70 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 139 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 140. La Figura 72 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 143 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 144. La Figura 73 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 145 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 146. La Figura 74 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID. No.: 147 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 148. La Figura 75 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 149 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 150. La Figura 76 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 151 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 152. La Figura 77 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 153 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 154. La Figura 78 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 155 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 156. La Figura 79 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 157 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 158. La Figura 80 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 159 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 160.
La Figura 81 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 161 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 162. La Figura 82 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 163 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 164. La Figura 83 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 165 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 166. La Figura 84 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 167 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 168. La Figura 85 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 169 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 170. La Figura 86 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 171 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 172. La Figura 87 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 173 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 174. La Figura 88 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 175 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 176. La Figura 89 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 177 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 178. La Figura 90 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 179 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 180. La Figura 91 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 181 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 182. La Figura 92 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 183 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 184. La Figura 93 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 185 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 186. La Figura 94 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 187 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 188. La Figura 95 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 189 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 190. La Figura 96 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 191 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 192. La Figura 97 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 193 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 194. La Figura 98 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 195 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 196. La Figura 99 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 197 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 198. La Figura 100 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 199 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 200. La Figura 101 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 201 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 202. La Figura 102 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 203 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 204. La Figura 103 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 205 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 206. La Figura 104 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 207 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 208. La Figura 105 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 209 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 210. La Figura 106 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 211 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 212. La Figura 107 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 213 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 214. La Figura 108 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 215 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 216. La Figura 109 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 217 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 218. La Figura 110 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 219 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 220.
La Figura 111 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 221 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 222. La Figura 112 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 223 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 224. La Figura 113 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 225 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 226. La Figura 114 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 227 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 228. La Figura 115 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 229 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 230. La Figura 116 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 231 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 232. La Figura 117 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 233 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 234. La Figura 118 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 235 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 236. La Figura 119 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 237 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 238. La Figura 120 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 239 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 240. La Figura 121 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 241 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 242. La Figura 122 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 243 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 244. La Figura 123 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 245 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 246. La Figura 124 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 247 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 248. La Figura 125 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 249 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 250. La Figura 126 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 251 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 252. La Figura 127 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 253 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 254. La Figura 128 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 255 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 256. La Figura 129 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 257 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 258. La Figura 130 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 259 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 260. La Figura 131 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 261 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 262. La Figura 132 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 263 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 264. La Figura 133 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 265 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 266. La Figura 134 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 267 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 268. La Figura 135 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 269 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 270. La Figura 136 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 271 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 272. La Figura 137 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 273 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 274. La Figura 138 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 275 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 276. La Figura 139 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 277 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 278. La Figura 140 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 279 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 280.
La Figura 141 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 281 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 282.
La Figura 142 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 283 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 284.
La Figura 143 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 285 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 286.
La Figura 144 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 287 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 288.
La Figura 145 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 289 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 290.
La Figura 146 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 291 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 292.
La Figura 147 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 293 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 294.
La Figura 148 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 295 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 296.
La Figura 149 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 297 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 298.
La Figura 151 muestra una comparacion de Grupos de Secuencia.
La Figura 152 ilustra la alineacion de clones de longitud completa.
La Figura 153 muestra un procedimiento utilizado para clonacion de fragmentos de ADNc para citocromo p450 por
medio de PCR
La Figura 154 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 299 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 300.
La Figura 155 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 301 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 302.
La Figura 156 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 303 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 304.
La Figura 157 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 305 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 306.
La Figura 158 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 307 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 308.
La Figura 159 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 309 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 310.
La Figura 160 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 311 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 312.
La Figura 161 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 313 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 314.
La Figura 162 muestra el acido nucleico de la SEQ. ID No.: 315 y el aminoacido de la SEQ. ID. No.: 316.
La Figura 163 muestra las secuencias el grupo de sondas de todos los clones sobre GeneChip.
Descripcion detallada
Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados aqui tienen el mismo significado
como comunmente lo entiende alguien ordinariamente capacitado en el arte a la cua l pertenece esta invencion.
Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edition, John Wiley and Sons (New
York) le proporcionan a alguien capacitado un diccionariogeneral de muchos de los terminos uti lizados en esta
invencion.
Para los propositos de la presente invencion, a continuacion se definen los siguientes terminos. "Actividad enzimatica" se entiende que incluye desmetilacion, hidroxilacion, epoxidacion, N-oxidacion, sulfoxidacion, N-, S-, y O-desalquilaciones, desulfatacion, desaminacion, y reduccion de grupos azo, nitro, y N-oxido. El termino "acido nucleico" se refiere a un polimero desoxirribonucleotido o ribonucleotido ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria, o sentido o antisentido, y a menos que se lo limite, abarca analogos conocidos de nucleotidos naturales
que hibridan con acidos nucleicos en una forma similar a los nucleotidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia particular de acido nucleico incluye la secuencia complementaria del mismo. Los terminos "operativamente enlazado", "en combi nacion operativa", y "en disp osicion operativa" se refieren al e nlazamiento funcional entre una secuencia de control de la expresion el acido nucleico (tal como un promotor, una secuencia que sirve de senal, o disposicion de los sitios d e enlazamiento del factor de transcripcio n) y una segunda secuencia de acido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresion afecta la transcripcion y/o la traduccion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
El termino "recombinante" cuando se lo utiliza con referencia a una celula indica que la celula replica un acido nucleico heterologo, expresa dicho acido nucleico o expresa un peptido, un peptido heterologo, o proteina codificada por un acido nucleico heterologo. Las celulas recombinantes pueden expresar genes o fragmentos de genes ya sea en la forma sentido o antisentido que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la celula. Las celulas recombinantes pueden expresar tambien genes que se encuentran en la forma nativa de la celula, pero en donde los genes son modificados e introducidos nuevamente en la celula por un medio artificial.
Un "gen estructural" es aquella porcion de un gen que contiene un segmento de ADN que codifica una proteina, un polipeptido o una porcion de los mismos, y que excluye la secuencia 5' que dirige el inicio de la transcripcion. El gen estructural puede codificar alternativamente un producto que no puede ser traducido. El gen estructural puede ser uno que normalmente se encuentra en la celula o uno que normalmente no se encu entra en la cel ula o en un a localizacion celular en donde se lo introd uce, en cuyo caso es llamado un "gen heterologo". Un gen heterologo puede derivarse en su totalidad o en parte de cualquier fuente conocida en el arte, incluido un genoma bacteriano o episoma, ADN de eucariota, nuclear o de plasmi do, ADNc, ADN viral o ADN sintetizado quimicamente. Un gen estructural puede contener una o mas modificaciones que podrian afectar la actividad biologica o sus caracteristicas, la actividad biologica o la estructura quimica del producto de expresion, la tasa de expresion o la forma de controlar la e xpresion. T ales modificacio nes inc luyen, pero n o se limitan a, mutacion es, inserci ones, supres iones y sustituciones de un o o ma s nucle otidos. El gen estru ctural pu ede constituir u na secuenc ia d e codific acion ininterrumpida o puede incluir uno o mas intrones, enlazados por las uniones de empalme apropiadas. El gen estructural puede ser traducible o no traducible, incluida en una orientacion antisentido. El gen estructural puede ser una composicion de segmentos derivados de una pluralidad de fuentes y de una pluralidad de secuencias genicas (de origen natural o sintetico, donde sintetico se refiere a un ADN que es quimicamente sintetizado).
"Derivado de" se utiliza para indicar tomado, obtenido, recibido, trazado, replicado o que desciende de una fuente (quimica y/o biol ogica). Un deriva do pu ede ser pr oducido por me dio d e mani pulacion q uimica o biol ogica (incluyendo, p ero sin limitar se a, su stitucion, adici on, in sercion, supre sion, e xtraccion, aislami ento, mutacion y replicacion) de la fuente original.
"Sintetizado quimicamente", en relacion con una secuencia de ADN, significa que se ensamblaron porciones de los nucleotidos componentes in vitro. La sintesis quimica manual del ADN se puede lograr utilizando procedimientos bien establec idos (Caruth ers, Methodolo gy of DNA and RNA Sequ encing, (198 3), Weissman (ed.), Praeger Publishers, New York, Capitulo 1); la sintesis quimica automatizada se puede llevar a cabo utilizando una entre una cantidad de maquinas que se encuentran comercialmente disponibles.
La alineacion optima de secuencias para comparacion se puede llevar a cabo por medio del algoritmo de homologia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (198 1), por medio del algoritmo de alineacion de homologia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por medio del metodo de busqueda por similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), por medio de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por medio de inspeccion.
La Herramienta de Busqueda de Alineacion Local Basica del NCBI (BLAST) (Altschul et al., 1990) se encu entra disponible a traves de diversas fuentes, incluido el National Center for Biological Information (NCBI, Bethesda, Md.) y en la Internet, para uso en cone xion con los programas de analisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Pued e acceders e a ellos a trave s de http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Una d escripcion d e como determinar u na ide ntidad de secue ncia util izando este pro grama se encu entra di sponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
Los terminos "identidad sustancial de aminoacidos" o "identidad sustancial de secuencia de aminoacidos" como se aplica a las secuencias de aminoacidos y como se utiliza aqui denota una caracteristica de un polipeptido, en donde el peptido contiene una secuencia que tiene al menos 70 porciento de identidad de secuencia, preferiblemente 80 por ciento de identidad de secuencia de aminoacidos, mas preferiblemente 90 por ciento de identidad de secuencia de aminoacidos, y lo mas preferible al menos 99 a 100 por ciento identidad de secuencia comparado con un grupo de referenc ia sobre la reg ion correspo ndiente al primer aminoac ido s eguido p or el motivo GXR XCX (G/A) de l citocromo p450 hasta el codon de detencion del peptido traducido.
Los terminos "identidad sustancial de acidos nucleicos" o "identidad sustancial de la secuencia de acidos nucleicos" como se aplican a las secu encias de acido nucleico y como se utilizan aqui denotan una caracteristica de una secuencia de polinucleotidos, en donde el polinucleotido incluye una secuencia que tiene al menos 75 por ciento de identidad de secue ncia, pr eferiblemente 81 por ciento de identid ad de secue ncia de ami noacidos, mas preferiblemente al menos 91 por ciento identidad de secuencia, y lo mas preferible al menos 99 a 100 por ciento de identidad de secuencia comparado con un grupo de referencia sobre la region correspondiente al primer acido nucleico despues del motivo GXRXCX(G/A) del citocromo p450 hasta el codon de detencion del peptido traducido.
Otra indicacion de que las secuencias de nucleotidos son sustancialmente identicas es si dos m oleculas hibridan entre si bajo condiciones e strictas. Las cond iciones est rictas depe nden de la secue ncia y sera n difere ntes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para ser aproximadamente de 5°C hasta aproximadamente 20°C, usualmente aproximadamente de 10°C hasta aproximadamente 15°C, inferiores al punto de fusion termico (Tm) para la secuencia especifica con una fuerza ionica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica y un pH definidos) a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida con una sonda emparejada. T ipicamente, cond iciones e strictas seran aquel las en la cuales la concentrac ion sali na es aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura esal menos aproximadamente de 60°C. Por ejemplo en un procedimiento estandar de hibridacion tipo Southern, las condiciones estrictas incluiran un lavado inicial en 6xSSC a 42 °C seguido por uno o mas lavados adicionales en 0,2 x SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 55°C, tipicamente aproximadamente 60°C y a menudo aproximadamente 65°C.
Las secuencias de nucleotidos son tambien sustancialmente identicas para los propositos de esta invencion cuando los pol ipeptidos y/o prot einas que ellas c odifican son sustancialmente identicas. En consecue ncia, donde un a secuencia de acido nucleico codifica esencialmente al mismo polipeptido que una segunda secuencia de acido nucleico, las dos secuencias de acido nuc leico son sustancialmente identicas, incluso si ellas no hibridan bajo condiciones estrictas debido a la degeneracion permitida por el codigo genetico (ver, Darnell et al. (1990) Molecular Cell Bi ology, Second Editio n Scientific American Books W . H. F reeman and Co mpany Ne w York para un a explicacion de la degeneracion del codon y del codigo genetico). La pureza u homogeneidad de la proteina pueden ser indicadas por medio de una cantidad de medios bien conocidos en el arte, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una mu estra de proteina, seguido por la visualizacion despues de la coloracion. Para ciertos propositos se puede requerir de alta definicion y se puede utilizar HPLC o un medio similar para purificacion.
Como se utiliza aqui, el termino "vector" se utiliza con relacion a moleculas de acido nucleico que transfieren un segmento(s) de ADN en una c elula. U n vector pu ede ac tuar par a repl icar AD N y s e pu ede repro ducir independientemente e n u na cel ula huesped. El ter mino "v ehiculo" es utilizado al gunas ve ces en form a intercambiable con "vector". El termino "vector de expresion" como se utiliza aqui se refiere a una molecula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificacion deseada y secuencias apropiadas de acido nucleico necesarias para la expresion de la secuencia de codificacion operativamente enlazada en un organismo huesped particular. Las secuencias de acido nucleico necesarias para la expresion en procariotas usualmente incluyen un promotor, un operador (opcional), y un sitio de enlazamiento de ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las celulas eucariotas utilizan promotores, reforzadores, y senales de terminacion y de poliadenilacion.
Para el proposito de la regeneracion completa de plantas modificadas por ingenieria genetica con raices, se puede insertar un acido nucleico en celulas vegetales, por ejemplo, por medio de cualquier tecnica tal como inoculacion in vivo o por medio de cualquiera de las tecnicas conocidas de cultivo de tejidos in vitro para producir celulas vegetales transformadas que pueden ser regeneradas en plantas completas. En consecuencia, por ejemplo, la insercion en celulas vegetales puede ser por medio de inoculacion in vitro por A. Tumefaciens patogeno o no patogeno. Tambien se pueden emplear otras de tales tecnicas de cultivo de tejidos.
"Tejido de una planta" incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, raices, tallos, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diferentes formas de celulas en cultivo, tales como celul as individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo. El tejido vegetal puede ser en una planta o en un organo, tejido o cultivo celular.
"Celula vegetal" como se usa aqui incluye celulas vegetales in planta y celulas vegetales y protoplastos en cultivo. "ADNc" o "ADN complementario" generalmente se refiere a una molecula de ADN monocatenario con una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una molecula de ARN. El ADNc se forma por la accion de la enzima transcriptasa inversa sobre una plantilla de ARN.
Estrategias para obtener secuencias de acido nucleico
De acu erdo c on la pres ente divul gacion, se extraj o el ARN de teji do de Nic otiana de lin eas de Nicoti ana convertidoras y no co nvertidoras. El ARN extraido fu e lue go util izado para crear A DNc. Se gen eraron lu ego secuencias de acido nucleico de la presente divulgacion utilizando dos estrategias.
En la primera estrategia, se extrajo el ARN enriquecido en poli A del tejido de la planta y se elaboro ADNc por medio de PCR de t ranscripcion in versa. Se util izo lue go el ADNc mon ocatenario par a c rear po blaciones de PC R especificas de p450 utilizando iniciadores degenerados mas un iniciador inverso oligo d(T). El diseno del iniciador se baso en motivos altamente conservados de p450. Los ejemplos de iniciadores degenerados especificos se exponen en la Figura 1. Se analizaron adicionalmente los fragmentos de la secuencia de plasmidos que contienen insertos de tamano a propiado. Estos i nsertos de taman o tip icamente en el rango de a proximadamente 300 hasta aproximadamente 800 nucleotidos dependiendo de cuales iniciadores fueron utilizados.
En una segunda estrategia, se construyo inicialmente una biblioteca de ADNc. Se utilizo el ADNc en los plasmidos para crear poblaciones de PCR especificas de p450 utilizando iniciadores degenerados mas iniciador T7 sobre el plasmido com o inici ador inv erso. Como e n la prim era estrategia, se anal izaron a dicionalmente fragmentos d e secuencia de plasmidos que contienen insertos de tamano apropiado.
Se pued en ut ilizar line as d e plantas de Nicotiana qu e se sabe que produce n niv eles altos de nornicoti na (convertidor) y lineas de plantas que tienen niveles indetectables de nornicotina como materiales de partida.
Se pueden remover luego las hojas de las plantas y tratarlas con etileno para activar las actividades enzimaticas de p450 definidas aqui. Se extrae el ARN total utilizando tecnicas conocidas en el arte. Se pueden generar luego fragmentos de ADNc utilizando PCR (RT-PCR) con los iniciadores oligo d(T) como se describe en la Figura 153. Se puede construir luego la biblioteca de ADNc mas completamente descrita aqui en los ejemplos.
La region conservada de enzimas tipo p450 puede ser utilizada como una plantilla para iniciadores degenerados (Figura 75). Utilizando iniciadores degenerados, se pu eden amplificar bandas especificas de p 450 por PCR. Las bandas indicativas para enzimas como p450 pueden ser identificadas por medio de secuenciacion de ADN. Los fragmentos PCR se pueden caracterizar utilizando busqueda por BLAST, alineacion u otras herramie ntas para identificar candidatos apropiados.
La informacion de la secuencia de fragmentos identificados puede ser utilizada para desarrollar iniciadores por PCR. Estos iniciadores en combinacion de iniciadores de plasmidos en una biblioteca de ADNc fueron utilizados para clonar genes de longitud completa para p450. Se llevo a cabo un analisis inverso Tipo Southern a gran escala para examinar la expresion diferencial para todos fragmentos de clones obtenidos y en algunos casos clones de longitud completa. En este aspecto de la invencion, estos ensayos tipo Southern inverso a gran escala pueden ser realizados utilizando los ADNc totales marcad os de diferentes tejidos como una sonda par a hibridar con fragmentos de ADN clonados con el proposito de seleccionar todos los insertos clonados.
Se utilizaron tambien ensayos de transfe rencias tipo No rthern radiactivas (P32) y no r adioactivas para caracterizar fragmentos de clones p450 y clones de longitud completa.
Se elab oraron anticuerp os especificos de peptido contr a diferentes cl ones de lo ngitud compl eta deriv ando su secuencia de aminoacidos y seleccionando regiones del peptido que eran antigenicas y unicas con relacion a otros clones. Se elaboraron anticuerpos de conejo para peptidos sinteticos conjugados con una proteina portadora. Se llevaron a cabo analisis de transferencias tipo Western u otros metodos inmunologicos sobre tejido vegetal utilizando estos anticuerpos.
Las secuencias de acido nucleico identificadas como se describio anteriormente pueden ser examinadas por medio del uso de tecnologia de silenciamiento de genes inducida por virus (VIGS, Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology, 1999, 2: 109 - 113).
Se elab oraron anticuerp os especificos de peptido par a di ferentes clones de lo ngitud completa derivando su secuencia de aminoacidos y seleccionando regiones del peptido que eran potencialmente antigenicas y eran unicas con relacion a otros clones. Se elaborar on anticuerpos de conejo para peptidos sinteticos conjugados con una proteina portadora. Se llevaron a cabo analisis de transferencias tipo Western utilizando estos anticuerpos
En otro aspe cto de la invenci on, se utiliza tecno logia de ARN de inte rferencia (ARNi) para caracteriza r adicionalmente las actividades enzimaticas del citocromo p450 en plantas de Nicotiana de la presente invencion. Las siguientes referencias que describen esta tecnologia se incorporan aqui como referencia, Smith et al., Nature, 2000,
407: 319 - 320; Fire et al., Nature, 1998, 391: 306 - 311; Waterhouse et al., PNAS, 1998, 95: 13959 - 13964; Stalberg et al., Plant Molec ular Biology, 1993, 23: 671 - 683; Baul combe, Current Opinions in P lant Biology, 1999, 2: 109 - 113; y Brigneti et al., EMBO Journal, 1998, 17(22): 6739 - 6746. Las plantas pueden ser transformadas utilizando tecnicas de ARNi, tecnicas antisentido, o una variedad de otros metodos descritos.
Existen diferentes tecnicas para introducir material genetico foraneo en celulas de plantas, y para obtener plantas que mantienen en forma estable y expresan al gen introducido. Tales tecnicas incluyen la aceleracion de material
genetico recubierto sobre microparticulas directamente dentro de las celulas (patentes de los Estados Unidos No.
- 4.945.050
- par a Corne ll y N o. 5.141.13 1 para Do wElanco). Las plant as pued en se r transformadas utiliza ndo tecnologia de Agrobacterium, ver la patente de los Estados Unidos No. 5.177.010 para la Universidad de Toledo, la No. 5.104.310 para Texas A&M, la solicitud de pate nte europea No. 0131624B1, las solicitudes de patente europea Nos. 120516, 159418B1, las solicitudes de patente europea Nos. 120516, 15941881 y 176.112 para Schilperoot, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 para Schilperoot, las solicitudes de patente europea Nos. 116718, 290799, 320500 todas para MaxPlanck, las sol icitudes de p atente europea Nos. 604662 y 627752 para Japan Nicotiana, las solicitudes de patente europea Nos. 0267159, y 0292435 y la patente de los Estados Unidos No. 5.231.019 todas para Ciba Geigy, las patentes de los Estados Unidos Nos.
- 5.463.174
- y 4. 762.785 ambas para Calgene, y las pate ntes de los Estados Uni dos Nos. 5.004.863 y 5.159.135 ambas para Agracetus. Otra tecnologia de transformacion incluye tecnologia de bigotes, ver las patentes e los Estados U nidos Nos. 5. 302.523 y 5.464.765 ambas para Z eneca. Tambien s e ha uti lizado tecnol ogia de electroporacion para transformar plantas, ver WO 87/06614 para el Boyce Thompson Institute, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.472.869 y 5.384.253 ambas para Dekalb, WO9209696 y WO9321335 ambas para PGS. Todas estas patentes y publicaciones de transformacion se incorporan como referencia. Ademas de las numerosas tecnologias para transformacion de plantas, el tipo de tejido que es puesto en contacto con los genes foraneos puede variar tambien. Tales tejidos incluirian, pero no se limitarian a, tejido embriogenico, tejido de callo tipo I y II, hipocotiledones, meristemo, y simi lares. Casi tod os lo s tejidos de p lantas p ueden ser transformados d urante desdiferenciacion utilizando tecnicas apropiadas conocidas por la persona capacitada.
El materia l g enetico foran eo introd ucido dentro d e un a pla nta pu ede incl uir u n marcad or sele ccionable. L a preferencia por un marcador particular se encuentra a discrecion de la persona calificada, pero se puede utilizar cualquiera de lo siguientes marcadores seleccionables junto con cualquier otro gen no enlistado aqui que pudiera actuar como un marcador seleccionable. Tales marcadores seleccionables incluyen pero no se limitan al gen para la aminoglicosido fosfotransferasa de transposon Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibioticos kanamicina, neomicina y G418, asi como aquellos genes que codifican para resistencia o tolerancia a los herbicidas glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotri cina ( bar); imid azolinonas, sulfon ilureas y tri azolopirimidina, tales como clorosulfurona; bromoxinilo, dalapon y similares.
Ademas de un marcador seleccionable, puede ser deseable utilizar un gen reportero. En algunos casos se puede utilizar un gen reportero sin un marcador seleccionable. Los genes reporteros son genes que no estan tipicamente presentes o expresados en el organismo o tejido receptor. El gen reportero tipicamente codifica para una proteina que proporciona algun cambio fenotipico o propiedad enzimatica. Los ejemplos de tales genes se suministran en K. Weising et al. Ann. Rev. Ge netics, 22, 421 (1988), que se incorpora aqui como referencia. Los genes reporteros preferidos incluyen sin limitacion al gen de la glucuronidasa (GUS) y a los genes de GFP.
Una vez introducido dentro del tejido de la planta, se puede analizar la expresion del gen estructural por cualquier medio conocido en el arte, y se puede medir la expresion como ARNm transcrito, proteina sintetizada, o la cantidad de silenciamiento el gen que se presenta (ver la patente de los Estados Unidos No. 5.583.021). Se conocen tecnicas para el cultivo in vitro de tejido vegetal, y en muchos casos, para regeneracion en plantas completas (Solicitud EP No. 88810309.0). Los procedimientos para transferir el co mplejo de expresion introducido a variedades cultivadas comercialmente utiles son conocidos por aquellos capacitados en el arte.
Una vez que se obtienen celulas de la planta que expresan el nivel deseado de enzima p450, se pueden regenerar tejidos de la planta y plantas completas a partir de ellas utilizando metodos y tecnicas bien conocidas en el arte. Las plantas reg eneradas son luego r eproducidas p or med ios conv encionales y l os g enes i ntroducidos pu eden se r transferidos a otras cepas y variedades cultivadas por medio d tecnicas convencionales de fitomejoramiento.
Los siguientes ejemplos ilustran metodos para llevar a cabo la invencion y debe entenderse que son solamente ilustrativos, pero no limitantes, del alcance de la invencion que se define en las reivindicaciones anexas.
EJEMPLOS
Crecimiento de la planta
Se sembraron las plantas en macetas y se desarrollaron en un invernadero durante 4 semanas. Las plantulas de 4 semanas de edad fueron trasplantadas en macetas individuales y se desarrollaron en el invernadero durante 2 meses. Las plantas fueron regadas 2 veces al dia con agua que contiene 150 ppm de fertilizante NPK durante el desarrollo. Las hojas verdes expandidas fueron separadas de las plantas para realizar el tratamiento con etileno que se describe mas adelante.
Linea celular 78379
La linea de tabaco 78379, que es una linea de tabaco Burley puesta en circulacion por la Universidad de Kentucky fue utilizada como fuente de material vegetal. Se cultivaron cien plantas como estandar en el arte d el cultivo del tabaco y se trasplantaron y marcaron con un numero distintivo (1 - 100). La fertilizacion y manejo del campo se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones.
Tres cuartas partes de las 10 0 plantas convirtieron entre 20 y 100% de la nicotina en nornicotina. Una cuarta parte de las 100 pl antas convirtieron menos del 5% de la nico tina en nornicotina. La planta numero 87 tuvo la menor conversion (2%) mientras que la planta numero 21 tuvo 100% de conversion. Las plantas que convirtieron menos del 3% fueron clasificadas como no convertidoras. Se elaboro semilla autopolinizada de la planta numero 87 y la planta numero 21, asi como semillas cruzadas (21 x 87 y 87 x 21) para estudiar diferencias geneticas y fenotipicas. Las plantas de la 21 aut ofecundadas fuero n convertid oras, y 99 % de l as autofec undadas de l a 8 7 fuero n n o convertidoras. El otro 1% de l as p lantas de l a 8 7 m ostraron m enor convers ion (5 - 15 %). La s pla ntas d e cruzamientos reciprocos fueron todas convertidoras.
Linea celular 4407
La linea de Nicotiana 4407, que es una linea Burley fue utilizada como fuente de material vegetal. Se seleccionaron plantas uniformes y representativas (100) y marcadas. De las 100 plantas 97 fueron no convertidoras y tres fueron convertidoras. La planta numero 56 tuvo la menor conversion (1,2%) y la planta numero 58 tuvo el nivel mas alto de conversion (96%). Se elaboraron semillas autopolinizadas y semillas cruzadas con estas plantas.
Las plantas a partir de la 58 autop olinizada segregaron con una proporcion de 3:1 de convertidoras con respecto a las no convertidoras. Las plantas 58 - 33 y 58 - 25, fu eron identificadas como lineas de plantas convertidoras homocigotas y no convertidoras, respectivamente. La conversion estable de 58 - 33 fue confirmada por el analisis de sus progenies de la siguiente generacion.
Linea celular PBLB01
PBLB01 es una linea Burley desarrollada por ProfiGen, Inc. Y fue utilizada como una fuente de material vegetal. La planta convertidora fue seleccionada a partir de las semillas base de PBLB01.
Procedimientos de tratamiento con etileno
Se desprendieron hojas verdes de plantas cultivadas en invernadero de 2 - 3 meses y se as rocio con una solucion de etileno al 0,3% (Prep brand Ethephon (Rhone-Poulenc)). Cada hoja rociada fue colgada en un estante de curado equipado con un humificadory se lo cu brio con plastico. Durante el tratamiento, las hojas de la muestra fueron periodicamente rociadas con la solucion de etileno. Aproximadamente 24 - 48 hora despues del tratamiento con etileno, se recolectaron las hojas para la extraccion del ARN. Se tomo otra submues tra para un an alisis de los constituyentes metabolicos para determinar la concentracion de metabolitos de la hoj a y los constituyentes mas especificos de interes tales como una variedad de alcaloides.
Como ejemplo, el analisis de alcaloides se puede realizar de la siguiente manera. Se agitaron muestras (0,1 g) a 150 rpm con 0,5 ml de NaOH 2 N, y 5 ml de una solucion de extraccion que contenia quinolina como estandar interno y metil t-butil eter. Se analiz aron las muestras en un GC HP 6890 equipado con un detector FID. Se utilizo una temperatura de 250°C para el detector y el inyector. Se utilizo una columna HP (30 m - 0,32 nm - 1·m) que consistia de silice fundida entrecruzada con 5% de fenol y 95% de metil silicio con un gradiente de temperatura de 110 - 185 °C a 10°C por minuto. La columna fue operada a 100°C con una velocidad de flujo de 1,7 cm3min-1 con una relacion de division de 40:1 con un volumen de inyeccion de 2·1 utilizando helio como gas portador.
EJEMPLO 2: Aislamiento del ARN
Para las extracciones de ARN, se trataron hojas de la mitad de plantas cultivadas en invernadero de 2 meses de edad con etileno como se describio. Se utilizaron las muestras de 0 y 24 - 48 horas para extraccion del ARN. En algunos casos, se tomaron muestras de hojas bajo en proceso de senescencia de las plantas 10 dias despues de la remocion de la cabezuela. Estas muestras fueron utilizadas tambien para extraccion. Se aislo el ARN total utilizando Rneasy Plant Mini Kit® (Qiagen, Inc., Valencia, California) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La muestra de tejido fue molida bajo nitrogeno liquido hasta un polvo fino utilizando un mortero y pistilo tratados con DEPC. Aproximadamente 100 miligramos de tejido molido fueron transferidos a un tubo eppendorf esteril de 1,5 ml. Se coloco este tubo con la muestra en nitrogeno liquido hasta que todas las muestras fueron recolectadas. Luego, se anadieron 450 !l del Amortiguador RLT como el suministrado en el kit (con la adicion de Mercaptoetanol) a cada tubo individual. Se sometio la muestra a una agitacion vigorosa tipo vortice y se incubo a 56° C durante 3 minutos. El lisado fue luego aplicado a la columna d e giro QIAshredder™ asentado en un tub o de recoleccion de 2 ml, y centrifugado durante 2 min utos a maxima velocid ad. Se re colecto el flujo q ue la atr aveso y se a nadieron 0,5 volumenes de etanol al lis ado clarificado. Se mezcla bien la muestra y se la transf iere a una co lumna de giro Rneasy® mini asentada en un tubo de recoleccion de 2 ml. La muestra fue centrifugada durante 1 minuto a 10.000 rpm. A continuacion, se pipetearon 700 1l del amortiguador RW1 sobre la columna Rneasy® y se centrifugo durante 1 minuto a 10.000 rpm. Se pipeteo el amortiguador RPE sobre la columna Rneasy® en un tubo de recoleccion diferente y se centrifugo durante 1 minuto a 10.000 rpm. Se anadio nuevamente amortiguador RPE a la columna de giro Rn easy® y se centrifu go dur ante 2 minutos a ve locidad ma xima para sec ar la membra na. Para elimi nar cualquier etanol transportado, se coloco la membrana en un tubo de recoleccion separado y se centrifugo durante 1 minuto adicional a maxima velocidad. Se transfirio la columna Rneasy® a otro tubo de recoleccion de 1,5 ml, y se pipetearon 40 1l de agua libre de ARNasa directamente sobre la membrana Rneasy®. Este tubo final de eluato fue centrifugado durante 1 minuto a 10.000 rpm. Se analizo cualitativa y cuantitativamente el ARN total por medio de gel de formaldehido desnaturalizado y espectrofotometro.
Se aislo poli(A)ARN utilizando el kit de p urificacion poli A + ARN Oligote x™ (Qiagen Inc.) de acuerd o con el protocolo del fabricante. Se utilizaron aproximadamente 200 1g de ARN total en un volum en total de 250 1l. Se anadio un volumen de 250 1l de Amortiguador OBB y 15 1l de suspension de Oligotex™ a los 250 1l de ARN total. Los contenidos fueron mezclados completamente por medio de pipeteo e incubados durante 3 minutos a 70°C sobre un bloque caliente. Las mu estras fueron colocadas luego a temper atura ambiente aproximadamente durante 20 minutos. Se precipito el complejo oligotex:ARNm por centrifugacion durante 2 minut os a velocidad maxima. Se removieron casi 50 1l del sobrenadante del tubo de la microcentrifuga. Se trato la muestra adicionalmente por medio del amortiguador OBB. Se resuspendio el precipitado de oligotex:ARNm en 400 1l del Amortiguador OW2 por medio de agitacion tipo vortice. Se transfirio esta mezcla sobre una columna de giro pequena colocada en un tubo nuevo y se centrifugo durante 1 minuto a maxima velocidad. Se transfirio la columna de giro a u nuevo tubo y se anadieron 400 1l adicionales del Amortiguador OW2 a la columna. Se centrifugo luego el tubo durante 1 minuto a maxima velocidad. Se transfirio la columna de giro a un tubo final de microcentrifuga de 1,5 ml. Se eluyo la muestra con 60 ul del Amorti guador OEB cali ente (70° C). Se ana lizo e l producto Po li A por medio de gel es de formalde hido desnaturalizados y analisis espectrofotometrico.
EJEMPLO 3: Transcripción inversa-PCR
Se produjo la primera cadena de ADNc utilizando transcriptasa inversa SuperScript de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, California). La mezcla d e iniciador oligo dT/ARN enriquecido con poli A+ consistio de menos de 5 1g de ARN total, 1 1l de la mezcla dNT P 10 mM, 1 1l de Oligo d(T)12 - 18 (0,5 1g/1l), y hasta 10 1l de agua tratada con DEPC. Cada muestra fue incubada a 65°C durante 5 minutos, luego colocada sobre hielo durante al menos 1 minuto. Se preparo una mezcla de reaccion anadiendo cada uno de los siguientes componentes en orden: 2 1l de amortiguador RT 10X, 4 1l de MgCl2 25 mM, 2 1l de DTT 0,1 M, y 1 1 l de RNase OUT Recombinant RNase Inhi bitor. Se pi peteo una adicion de 9 1l de m ezcla de re accion para c ada mezcl a de ARN/iniciador y se mezclo suavemente. Se incubo a 42°C durante 2 minutos y se anadio 1 1l de Super Script II™ RT a cada tubo. Se incubo el tubo durante 50 minutos a 42°C. Se termino la reaccion a 70° C durante 15 minutos y se enfrio sobre hielo. Se recogio la muestra por medio de centrifugacion y se anadio 1 1l de ARNasa H a cada tubo y se incubo durante 20 minutos a 37°C. Se llevo a cabo la se gunda PCR con 200 pmoles de iniciador hacia adelante (iniciadores degenerados como en la Figura 75, SEQ ID Nos. 149 - 156) y 100 pmoles de iniciador inverso (mezcla de 18nt oligo d(T) seguido por 1 base al azar).
Las condiciones de reaccion fueron 94°C durante 2 minutos y luego se llevaron a cabo 40 ciclos de PCR a 94°C durante 1 minuto, 45° a 60°C durante 2 minutos, 72°C durante 3 minutos con una extension a 72°C durante 10 min adicionales.
Se analizaron diez microlitros de la muestra amplificada por medio de electroforesis utilizando gel de agarosa al 1%. Se purificaron los fragmentos de tamano correcto a partir del gel de agarosa.
EJEMPLO 4: Generación de poblaciones de fragmentos de PCR
Se ligaron los fragmentos de la PCR del Ejempl o 3 dentro de un Vector pGEM-T® Easy (Promega, Madison, Wisconsin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transformo el producto ligado en celulas competentes JM109 y se sembraron en placa sobre placas con medio LB para seleccion de azules/blancas. Se seleccionaron las colonias y se cultivaron en una placa de 96 pozos con 1,2 ml de medio LB durante la noche a 37°C. Se genero una provision congelada para todas las colonias seleccionadas. Se purifico el ADN del pl asmido de las placas utilizando robotica de miniprep Beckman's Biomeck 2000 con el kit Wizard SV Miniprep® (Promega). Se eluyo el ADN del plasmido con 100 1l de agua y almaceno en una placa de 96 pozos. Se digirieron los plasmidos por medio de EcoR1 y se los analizo utilizando gel de agarosa al 1% para confirmar la cantidad y el tamano del ADN de los insertos. Se secuenciaron l os plasmi dos que co ntenian un inserto de 400 - 600 p b utiliz ando u n secue nciador CEQ 2000 (Beckman, Fullerton, California). Se alinearon las secuencias con la base de datos del GenBank por medio de una busqueda co n BLAST . Se identificaron l os fragme ntos relaci onados con p 450 y anal izaron a dicionalmente. Alternativamente, se aislaron los fragmentos de p450 de las bibliotecas de sustraccion. Estos fragmentos fuero n tambien analizados como se describio anteriormente.
EJEMPLO 5: Construcción de una biblioteca de ADNc
Se construyo una biblioteca de ADNc por medio de la preparacion de ARN total a partir de hojas tratadas con etileno de la siguiente manera. Primero, se extrajo ARN total de hojas tratadas con etileno de la linea de tabaco 58 - 33 utilizando un feno l acido mo dificado y un protocolo de e xtraccion con cloroform o. Se modifico el protocol o para utilizar un gramo de tejido que fue molido y posteriormente sometido a agitacion tipo vortice en 5 ml de amortiguador de extraccion (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5; NaCl 200 mM; EDTA 10 mM; SDS al 0,5%) al cual se se anadio 5 ml de fenol (pH 5,5) y 5 ml de cloroformo. Se centrifugo la muestra extraida y se recupero el sobrenadante. Se repitio esta etapa de extraccion 2 - 3 veces mas hasta qu el so brenadante aparecio claro. Se anadieron aproximadamente 5 ml de cloroformo para remover cantidades en trazas de fenol. Se precipito el ARN a partir de las fracciones combinadas de sobrenadante por medio de la adicion de 3 veces el volumen de ET OH y 1/10 de volumen de NaOAc 3 M (pH 5,2) y almacenando a - 20°C durante 1 hora. Despues de transferir a un contenedor de vidrio a Corex se centrifugo la fraccion de ARN a 9.0 00 RPM durante 45 minutos at 4°C. Se lavo el precipitado con etanol al 70% y centrifugo durante 5 minutos a 9.000 RPM a 4°C. Despues de secar el precipitado, se disolvio el ARN que precipito en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. Se disolvio el ARN que precipito en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. Se analizo la calidad y c antidad del AR N total por me dio de g el de f ormaldehido d esnaturalizado y un espectrofotometro, respectivamente.
El ARN total resultante fue aislado por poli A+ ARN utilizando un protocolo de celulosa Oligo(dT) (Invitrogen) y columnas ara centrifugaci on en una microcentrifuga (Invitrogen) por medio del sigui ente protocolo . Aproximadamente veinte mg de ARN total fueron sometidos a purificacion doble para obtener poli A+ ARN de alta calidad. Se analizo el producto poli A+ ARN a traves de gel de formaldehido desnaturalizado y posterior RT-PCR de genes conocidos de longitud completa para garantizar alta calidad de ARNm.
A continuacion, se utilizo poli A+ ARN como plantilla para producir una biblioteca de ADNc empleando un kit de sintesis de ADNc, un kit de sintesis ZA PcDNA ®, y un kit de clonacion dora do ZAP-cDNA® Gigapack® III (Stratagene, La Jolla, California). El metodo se realizo de acuerdo con el protocolo del fabricante como se especifico. Se utilizaron aproximadamente 8 1g de po li A+ ARN para construir una biblioteca de ADNc. El analis is de la biblioteca primaria revelo aproximadamente 2,5 x 106 - 1 x 107 pfu. Se completo una prueba de calidad de fondo de la biblioteca por medio de e nsayos de complementacionutilizando IPTG y x-gal, donde se expresaron plaquetas recombinantes mas de 100 veces por encima de la reaccion de fondo.
Un analisis mas cuantitativo de la biblioteca por medio de PCR al azar mostro que el tamano promedio del inserto de ADNc era aproximadamente de 1,2 kb. El metodo utilizo una PCR en dos etapas como el siguiente. Para la primera etapa, se dis enaron in iciadores inv ersos con base e n la informacion de la sec uencia prel iminar obten ida de fragmentos de p450. Los iniciadores inversos disenados y los iniciadores T3 (hacia adelante) fueron utilizados para amplificar a l os corresp ondientes g enes de la bi blioteca ADNc. La s reaccion es PCR fuero n sometid as a electroforesis en agarosa y fueron cortadas, purificadas, clonadas y secuenciadas las correspondientes bandas de alto peso molecular. En la segunda etapa, se utilizaron nuevos iniciadores disenados a partir de 5'UTR o el inicio de la region de codificacion de p450 como los iniciadores hacia adelante junto con los iniciadores inversos (disenados a partir de 3'UTR de p450) en la PCR posterior para obtener clones de p450 de longitud completa.
Se generaron los fragmentos de p450 por medio de amplificacion por PCR de la biblioteca construida de ADNc como se describe en el Ejemplo 3 con la e xcepcion del iniciador inverso. El iniciador T7 localizado sobre el plasmido secuencia debajo de insertos de ADNc (v er la Figura 75) fue utilizado como un iniciador inverso. Se aislaron, clonaron y secuenciaron los fragmentos de la PCR como se describe en el Ejemplo 4.
Se aislaron los genes de longitud completa para p450 por medio del metodo de PCR a partir de la biblioteca construida de ADNc. Se utilizaron iniciadores inversos especificos del gen (disenados a partir de la secuencia hacia abajo de los fragmentos de p450) y un iniciador hacia adelante (T3 sobre un plasmido de biblioteca) para clonar los genes de longitud completa. Se aislaron, clonaron y secuenciaron fragmentos de la PCR. Si fuera necesario, se aplico u na se gunda eta pa de la P CR. E n la se gunda etapa, se uti lizaron n uevos inici adores h acia a delante disenados a partir de 5'UTR de las p450 clonadas junto con los iniciadores inversos disenados a partir de 3'UTR de los clones de p450 en las reacciones PCR posteriores para obtener clones de longitud completa de p450. Los clones fueron posteriormente secuenciados.
EJEMPLO 6: Caracterización de fragmentos clonados - Análisis de transferencias tipo Southern inversas
Se llevaron a cabo ensayos de transferencias tipo Southern inversas no radiactivas a gran escala sobre todos los clones de p450 identificados en los ejem plos anteriores para detectar la expresion diferencial. Se observo que el nivel de expresion entre diferentes agrupaciones de p450era muy diferente. Se llevo a cabo adicionalmente una deteccion en tiempo real sobre aquellas con expresion alta.
Se llevaron a cabo procedimientos no radioactivos de transferencias tipo Southern de la siguiente manera.
1) Se e xtrajo el ARN total a partir de ho jas convertidoras tratadas y no tratadas con eti leno (5 8 - 33) y no convertidoras (58 - 25) utilizando el kit Rnaeasy de Qiagen como se describe en el Ejemplo 2.
2) Se produjo una sonda por medio de marcacion con una cola de biotina de un ADNc monocatenario derivado de ARN enriquecido con poli A+ generado en la etapa anterior. Este ADNc monocatenario marcado fue generado por medio de RT-PCR del ARN total convertidor y no convertidor (Invitrogen) como se describe en el Ejemplo 3 con la excepcion del uso de o ligo dT biotinila do como inic iador (Promeg a). Estos fueron utiliza dos co mo sond a par a hibridar con ADN clonado.
3) Se digirio el ADN del plasmido con enzima de restriccion EcoR1 y se lo corrio sobre geles de agarosa. Se secaron y transfirieron simultaneamente los geles a dos membranas de nylon (Biodyne B®). Una membrana fue hibridada con sond a co nvertidora y l a otra con sonda no co nvertidora. Las membra nas fuer on entrecruz adas con UV (composicion de autocruzamiento, 254 nm, Stratagene, Stratalinker) antes de hibridacion.
Alternativamente, los insertos f ueron amplificados por PCR a partir de cada plasmido utilizando las secuencias localizadas sobre ambos brazos del plasmido p-GEM, T3 y SP6, como iniciadores. Los productos PCR fueron analizados por medio de un corrimiento sobre geles de agarosa listos para ser usados de 96 pozos. Los insertos confirmados fu eron esparcidos sobr e dos membranas d e n ylon. Un a membrana fue hibri dada co n una so nda convertidora y la otra con una sonda no convertidora.
4) Las membranas fueron hibridadas y lavadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la modificacion del ri gor del lavado (kit En zo Ma xSence™, Enzo Dia gnostics, Inc, F armingdale, N Y). Las memb ranas fu eron previamente hibridadas con amorti guador de hi bridacion (formamid a amortigu ada con 2 x SSC, que c ontenia detergente y reforzadores de hibridacion) a 42°C durante 30 min e hibridadas con 10 1l de sonda desnaturalizada durante la noche a 42°C. Las membranas fueron luego lavadas en amortiguador de lavado de hibridacion 1X 1 vez a temperatura ambiente durante 10 min y 4 veces a 68°C durante 15 min. Las membranas estaban listas para la deteccion.
5) Las membranas lavadas fueron detectadas por medio de marcacion con fosfatasa alcalina seguido por NBT/BCIP deteccion colorimetrica como se describ e en el procedimiento de deteccion del fabricante (Enzo Diagnostics, Inc.). Las membranas fueron bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente con solucion de bloqueo 1x, lavadas 3 veces con reactivos de deteccion 1Xdurante 10 min, la vadas 2 veces con amortiguador de desarrollo previo 1x durante 5 min y luego desarrolladas las transferencias en solucion desarrolladora durante 30 - 45 min hasta que aparecen los puntos. Todos los reactivos fueron suministrados por el fabricante (Enzo Diagnostics, Inc). Ademas, el ensayo tipo Southern inverso a gran escala fue tambien llevado a cabo utilizando hibridacion tipo Southern KPL y un kit de deteccion™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KPL, Gaithersburg, Maryland).
EJEMPLO 7: Caracterización de clones - Análisis de transferencias tipo Northern
En forma alternativa al analisis de transferencias tipo Southern, algunas membranas fueron hibridadas y detectadas como se describe en el ejemplo de ensayos de transferencias tipo Northern. Se utilizo la hibridacion tipo Northern para detectar el ARNm expresado en forma diferencial en Nicotiana de la siguiente manera.
Se utiliz o un metodo d e ce bado ale atorio para pre parar sondas a p artir de p45 0 cl onada (Meg aprime™ DNA Labelling Systems, Amersham Biosciences).
Se mezclaron los siguientes componentes: 25 ng de plantilla de ADN desnaturalizada; 4 ul de cada dTTP, dGTP y dCTP no marcados; 5 ul de amortiguador de reaccion; dATP marcado con P33 y 2 ul de Klenow I; y H2O, para llevar la reaccion hasta 50 1l. Se incubo la mezcla a 37°C durante1 - 4 horas, luego se la detuvo con 2 1l de EDTA 0,5 M. Se desnaturalizo la sonda por medio de incubacion a 95°C durante 5 minutos antes de usarla.
Se prepararon muestras de ARN a partir d e hojas frescas tratadas y no tratadas con etileno de varios pares de lineas de tabaco. En algunos casos se utilizo ARN enriquecido con poli A+. Aproximadamente 15 1g de ARN total o
1.8 1g de ARNm (metodos de extraccion de ARN y ARNm como se describe en el Ejemplo 5) fueron llevados hasta un volumen igual con DEPC H2O (5 - 10 1l). Se anadieron el mismo volumen de amortiguador de carga (1 x MOPS; 18,5 % de Formaldehido; 50 % de Formamida; 4 % de F ico11400; Bromophenolblue) y 0,5 1l de EtBr (0,5 1g/1l). Las muestras fueron p osteriormente desnaturalizadas en preparacion para la separacion del ARN por medi o de
electroforesis.
Las muestr as fueron s ometidas a e lectroforesis so bre un gel de form aldehido (1 % de Agar osa, 1 x MOPS, Formaldehido 0,6 M) con amortiguador 1XMOP (acido M orfolinopropanosulfonico 0,4 M; acetato-3 de Na 0,1 M x H2O; EDTA 10 mM; ajustado a pH 7,2 con NaOH). Se transfirio el ARN a una membrana Hybond-N+ (Nylon, Amersham Pharmacia Biotech) por medio de un metodo capilar en amortiguador SSC 10 X (NaCl 1,5 M; citrato de Na 0,15 M) durante 24 horas. Las membranas con muestras de ARN fueron entrecruzadas con UV (composicion de autocruzamiento, 254 nm, Stratagene, Stratalinker) antes de la hibridacion.
La membrana fue previamente hibridada durante 1 - 4 horas a 42°C con 5-10 ml de amortiguador de hibridacion previa (5 x SSC; 50 % de Formamida; solucion de Denhardt 5 x; 1 % de SDS; 100 1g/ml de ADN no homologo cortado y desnaturalizado por calor). Se d escarto el amortiguador viejo de hibridacion previa, y se anadieron un nuevo amortiguador de hibridacion previa y sonda. La hibridacion se llevo a cabo durante la noche a 42°C. Se lavo la membrana durante 15 minutos con 2 x SSC a temperatura ambiente, seguido por un lavado con 2 x SSC.
Un aspecto importante de la divulgacion fue el descubrimiento de nuevos genes que pueden ser inducidos como resultado del tratamiento co n etilen o o que jue gan un papel clav e en la cali dad de la hoj a de tabaco y los constituyentes. Como se ilustra en la tabla mas abajo, las transferencias tipo Northern y las transferencias tipo Southern inversas fueron utiles en la determinacion de cuales genes fueron inducidos por tratamiento con etileno con relacion a las plantas no induc idas. En forma muy interesante, no todos los fragment os fueron afectados en forma similar en el convertidor y el no convertidor. Los fragmentos de citocromo p450 de interes fueron parcialmente secuenciados para determinar su relacion estructural. Esta informacion fue utilizada para aislar posteriormente y caracterizar los clones de genes de longitud completa de interes.
- Fragmentos
- Expresion de ARNm inducida por tratamiento con etileno
- Convertidor
- D56-AC7 (SEQ ID No: 35)
- +
- D56-AG11 (SEQ ID No: 31)
- +
- D56-AC12 (SEQ ID No: 45)
- +
- D70A-AB5 (SEQ ID No: 95)
- +
- D73-AC9 (SEQ ID No: 43)
- +
- D70A-AA12 (SEQ ID No: 131)
- +
- D73A-AG3 (SEQ ID No: 129)
- +
- D34-52 (SEQ ID No: 61)
- +
- D56-AG6 (SEQ ID No: 51)
- +
Se llevo a cabo un analisis tipo Northern utilizando clones de longitud completa sobre tejido de tabaco obtenido a partir de line as Burle y c onvertidoras y no convertid oras que fuero n induc idas p or tr atamiento co n etile no. E l proposito fu e ide ntificar a quellos cl ones de l ongitud compl eta que mostraron e xpresion elevada en linea s convertidoras inducidas con etileno con relacion a lineas Burley no convertidoras inducidas con etileno. Al hacerlo asi, se puede determinar la relacion de funcionalidad de clones de longitud completa comparando las diferencias bioquimicas en los constituyentes de la hoja entre las lineas convertidoras y no convertidoras. Como se muestra en la tabla mas abajo, seis clones mostraron expresion significativamente mas alta, como se denota por ++ y +++, en tejido convertidor tratado con etileno que aquella del tejido tratado no convertidor, denotado por +. Todos estos clones mostraron poca o ninguna expresion en lineas convertidoras y no convertidoras que no fueron tratadas con etileno.
- Clones de longitud completa
- Convertidores No convertidores
- D101-BA2
- ++ +
- D207-AA5
- ++ +
- D208-AC8
- +++ +
- D237-AD1
- ++ +
- D89-AB1
- ++ +
- D90A-BB3
- ++ +
Se seleccionaron regiones del peptido correspondientes a 20 - 22 aminoacidos de longitud de tres clone de p450 para 1) que tengan poca o ninguna homologia con otros clones y 2) que tengan buena hidrofilicidad y antigenicidad. Las secuencias de aminoacidos de las regiones del peptido seleccionadas a partir de los clones respectivos de p450 se enlistan mas abajo. Los peptidos sintetizados fueron conjugados con KHL y luego inyectados en conejos. Se recolectaron antisueros 2 y 4 semanas despues de la 4a inyeccion (Alpha Diagnostic Intl. Inc. San Antonio, TX).
D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG
D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY
D89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY
Se examinaron los antisueros por reactividad cruzada con proteinas objetivo de tejido de plantas de tabaco por medio de analisis de transferencias tipo Western. Se obtuvieron extractos de proteina cruda de hojas de la parte media tratadas con etileno (0 a 40 horas) de lineas convertidoras y no convertidoras. Las concentraciones de proteina de los extractos se determinaron utilizando el RC DC Protein Assay Kit (BIO-RAD) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Se cargaron dos microgramos de proteina sobre cada carril y se separaron las proteinas sobre geles con un gradiente del 10% - 20% utilizando el sistema SDS-PAGE de Laemmli. Se transfectaron las proteinas de los geles a membranas de transferencia de nitrocelulosa PROTRAN® (Schleicher & Schuell) con la celda semiseca Trans-Blot® (BIO-RAD). Se detectaron y visualizaron las proteinas objetivo p450 con el kit de deteccion de transferencias tipo Western ECL Advanc e™ (Amersham Bios ciences). Se ela boraron a nticuerpos prim arios contra los conju gados sinteticos de KLH en conejos. Se adquirio anticuerpo secundario contra IgG de conejo, acoplado con peroxidasa, de Sigma. Tanto los anticuerpo primario como secundario se utilizaron en diluciones 1:1000. Los anticuerpos mostraron fuerte reactividad con una unica banda sobre las trans ferencias tipo Western indicado que los anti sueros eran monoespecificos con el peptido obj etivo de interes. Losantisueros reaccionaron tambien en forma cruzada con peptidos sinteticos conjugados con KLH.
EJEMPLO 9: Identidad de ácidos nucleicos y relación estructural de fragmentos aislados de ácido nucleico
Se secuenciaron mas de 100 fragmentos clonados de p450 junto con el analisis de transferencias tipo Northern para determinar su relacion estructural. El enfoque usado utilizo iniciadores hacia adelante con base en cualquiera de los dos motivos comunes de p450 localizados cerca del terminal carboxilo de los genes para p450. Los iniciadores hacia adelante correspondian a los motivos FXPERF o GRRXCP(A/G) del citocromo p450 como se denota en la Figura 1. Los iniciadores inversos utilizaron iniciadores estandar ya sea del plasmido SP6 o del T7 localizados en ambos brazos del plasmido pGEM™, o una cola de poli A. El protocolo utilizado se describe mas adelante.
Se utiliz o esp ectrofotometria para estimar la conce ntracion d e ADN b icatenario d e partid a de ac uerdo con e l protocolo del fabricante (Beckman Coulter). Se diluyo la plantilla con agua hasta la concentracion apropiada, se la desnaturalizo calentando a 95° C durante 2 minutos, y posteriormente se la coloco sobre hielo. Se preparo la reaccion de secuenciacion sobre hielo utilizando de 0,5 a 10 1l del molde de ADN desnaturalizado, 2 1l de 1, 6
pmoles del iniciador hacia adelante, 8 1l de la mezcla DTCS Quick Start Master y se completo hasta un volumen total de 20 1l con agua. El programa de termociclado consistio de 30 ciclos del ciclo siguiente: 96° C durante 20 segundos, 50° C durante 20 segundos, y 60° C durante 4 minutos seguido por mantenimiento a 4° C.
Se detuvo la secuencia por medio de la adicion 5 1l de amortiguador de detencion (un volumen igual de NaOAc 3 M y EDTA 100 mM y 1 1l de 20 mg/ml de glicogeno). Se precipito la muestra con 60 1l de etanol frio al 95% y se centrifugo a 6000 g durante 6 minutos. Se descarto el etanol. Se lavo el precipitado 2 veces con 200 1l de etanol frio al 70%. Despues de secar el precipitado, se anadieron 40 1l de solucion de SLS y se resuspendio el precipitado. Se coloco encima una capa de aceite mineral. Se coloco luego la muestra sobre el secuenciador automatizado CEQ 8000 para analisis adicionales.
Con el proposito de verificar las secuencias de acido nucleico, se secuencio nuevamente la secuencia de acido nucleico en ambas direcciones utilizando iniciadores hacia adelante hacia la region FXPERF o GRRXCP(A/G) del gen para p450 o iniciadores inversos ya sea hacia el plasmido o la cola de poli A. Toda la secuenciacion se realizo al menos dos veces en ambas direcciones.
Se compar aron la secu encias de aci do nucleico d e fragm entos de citocromo p 450 entre si de la regi on d e codificacion correspondiente al primer acido nucleico despues de la reg ion que codifica al motivo GRRXCP(A/G) a traves de l co don d e d etencion. Esta reg ion fue se leccionada como u n in dicador de diversi dad g enetica entre proteinas p450. Un gran n umero de genes geneticamente distintos para p450, por encima de 70 genes, fueron observados, similar a aquel de otras especies de plantas. Por comparacion de secuencias de acido nucleico, se encontro que los genes podrian ser coloc ados en d iferentes grupos d e secuencias con base e n su ide ntidad de secuencia. Se encontro que la mejor agrupacion unica de miembros p450 era el de a quellas secuencias con una identidad de acidos nucleicos del 75% o superior (mostrada en la Tabla I). La reduccion del porcentaje de identidad resulto en grupos significativamente mayores. Se observo una agru pacion preferida para aquellas secuencias con identidad de acidos nucleicos del 81% o superior, una agrupacion mas preferida con identidad de acidos nucleicos del 91% o superior, y una agrupacion mas preferida para aquellas secuencias con identidad de acidos nucleicos del 99% o s uperior. La ma yoria de l os gru pos conte nian al men os dos miembros y frecuentemente tres o mas miembros. Otros no fueron d escubiertos en forma repetida sugiriendo que el enfoque seguido fue capaz de aislar tanto ARNm que se expresa en forma tanto alta como baja en el tejido utilizado.
Con base en una identidad de acidos nucleicos del 75% o superior, se encontro que dos grupos de citocromo p450 contenian una identidad de secuencias de acido nucleico con los genes previos para el citocromo del tabaco que era geneticamente distinta de aquella dentro del grupo. El grupo 23, mostro una identidad de acidos nucleicos, dentro de los parametros utilizados para la Tabla I, con las secuencias anteriores del GenBank de GI:1171579 (CAA64635) y GI:14423327 (o AAK62346) por Czernic et al y Ralston et al, respectivam ente. GI:1171579 tenia una identidad de acidos nucleicos con los miembros del Grupo 23 en el rango de 96,9% a 99,5% con los miembros del Grupo 23 mientras que GI:14423327 en el rango de identidad del 95,4% a 96,9% con este grupo. Los miembros del Grupo 31 tenian una identidad de acidos nucleicos en el rango de 76,7% a 97,8% con la secuencia reportada en el GenBank de GI:14423319 (AAK62342) por Ralston e t al. Ninguno de los otros grupos de identidad de p450 de la T abla 1 contenia una identidad de parametros, como la utilizada en la Tabla 1, con los genes para las p450 de Nicotiana reportada por Ralston et al, Czernic et al., Wang et al o LaRosa y Smigocki.
Como se mu estra en la F igura 76, se p odria deriv ar para el gru po la secuenci a de consens o con sondas degeneradas apropiadas de acido nucleico para identificar preferencialmente y aislar miembros adicionales de cada grupo de plantas de Nicotiana.
Tabla I. Grupos con identidad de secuencia de acidos nucleicos para p450 de Nicotiana
GRUPO FRAGMENTOS D144-AE2 (SEQ ID No.: 29)
- 1
- D58-BG7 (SEQ ID No.: 1), D58-AB1 (SEQ ID No.: 3); D58-BE4 (SEQ ID No.: 7)
- 2
- D56-AH7 (SEQ ID No.: 9); D13a-5 (SEQ ID No.: 11)
- 3
- D56-AG10 (SEQ ID No.: 13); D35-33 (SEQ ID No.: 15); D34-62 (SEQ ID No.: 17)
- 4
- D56-AA7 (SEQ ID No.: 19); D56-AE1 (SEQ ID No.: 21); 185-BD3 (SEQ ID No.: 143)
- 5
- D35-BB7 (SEQ ID No.: 23); D177-BA7 (SEQ ID No.: 25); D56A-AB6 (SEQ ID No.: 27);
- 21
6 D56-AG11 (SEQ ID No.: 31); D179-AA1 (SEQ ID No.: 33)
7 D56-AC7 (SEQ ID No.: 35); D144-AD1 (SEQ ID No.: 37)
8 D144-AB5 (SEQ ID No.: 39)
9 D181-AB5 (SEQ ID No.: 41); D73-Ac9 (SEQ ID No.: 43)
11 D58-AB9 (SEQ ID No.: 47); D56-AG9 (SEQ ID No.: 49); D56-AG6 (SEQ ID No.: 51); D35-BG11 (SEQ ID No.: 53); D35-42 (SEQ ID No.: 55); D35-BA3 (SEQ ID No.: 57); D34-57 (SEQ ID No.: 59); D34-52 (SEQ ID No.: 61); D34-25 (SEQ ID No.: 63)
13 56-AA11 (SEQ ID No.: 67)
15 D56A-AG10 (SEQ ID No.: 71); D58-BC5 (SEQ ID No.: 73); D58-AD12 (SEQ ID No.: 75)
16 D56-AC11 (SEQ ID No.: 77); D35-39 (SEQ ID No.: 79); D58-BH4 (SEQ ID No.: 81); D56-AD6 (SEQ ID No.: 87)
17 D73A-AD6 (SEQ ID No.: 89); D70A-BA11 (SEQ ID No.: 91)
18 D70A-AB5 (SEQ ID No.: 95); D70A-AA8 (SEQ ID No.: 97)
19 D70A-AB8 (SEQ ID No.: 99); D70A-BH2 (SEQ ID No.: 101); D70A-AA4 (SEQ ID No.: 103)
20 D70A-BA1 (SEQ ID No.: 105); D70A-BA9 (SEQ ID No.: 107)
21 D70A-BD4 (SEQ ID No.: 109)
22 D181-AC5 (SEQ ID No.: 111); D144-AH1 (SEQ ID No.: 113); D34-65 (SEQ ID No.: 115)
23 D35-BG2 (SEQ ID No.: 117)
25 D58-AA1 (SEQ ID No.: 121); D185-BC1 (SEQ ID No.: 133); D185-BG2 (SEQ ID No.: 135)
27 D56-AC12 (SEQ ID No.: 125)
28 D177-BF7 (SEQ ID No.: 127); D185-BE1 (SEQ ID No.: 137); D185-BD2 (SEQ ID No.: 139)
29 D73A-AG3 (SEQ ID No.: 129)
30 D70A-AA12 (SEQ ID No.: 131); D176-BF2 (SEQ ID No.: 85)
31 D176-BC3 (SEQ ID No.: 145)
32 D176-BB3 (SEQ ID No.: 147)
33 D186-AH4 (SEQ ID No.: 5)
EJEMPLO 10: Identidad de secuencias de aminoácidos relacionados de fragmentos aislados de ácido nucleico
Se dedujeron las secuencias de aminoacidos de las sec uencias de acido nucleico obtenidas para fragmentos de citocromo p450 del Ejemplo 8. La region deducida correspondio al aminoacido inmediatamente despues del motivo de la secuencia GXRXCP(A/G) hacia el e xtremo del terminal carboxilo, o codon d e detencion. Despues de la comparacion de la identidad de secuencia de los fragm entos, se observo una agrupacion unica para aquellas secuencias c on una i dentidad de ami noacidos de l 70 % o superior. Se observo u na agrupacion pr eferida par a aquellas secuencias con unaidentidad de aminoacidos del 80% o superior, mas preferiblemente con una identidad de aminoacidos del 90% o superior, y una agrupacion mas preferida para aquellas secuencias con una identidad de aminoacidos del 99% o superior. Los grupos y las correspondientes secuencias de aminoacidos de miembros del grupo se muestran en la Figura 2. Se encontro que varias de las secuencias unicas de acido nucleico tienen identidad completa de aminoacidos con otros fragmentos y por lo tanto unicamente se reporto u n miembro con aminoacidos identicos.
La identidad de aminoacidos para el Grup o 19 de la T abla II correspondio con tres grupos d iferentes con base e n sus secuencias de acido nucleico. Las secuencias de aminoacidos de cada miembro del grupo y su identidad se muestra en la Figura 77. Las diferencias de aminoacidos estan apropiadamente marcadas.
Al menos un miembro de cada grupo de identidad de aminoacidos fue seleccionado por clonacion genica y estudios funcionales utiliza ndo pla ntas. Ademas, se selecci onaron los miembros de l grup o que s on afectad os diferencialmente por tratamiento con etileno u otras diferencias biologicas de acuerdo a lo evaluado por medio de analisis tipo Northern y Southern por clonacion genica y estudios funcionales. Para ayudar en la clonacion genica, los estudios de expresion y evaluaciones en plantas enteras, se prepararan anticuerpos especificos del peptido en identidad de secuencia y secuencia diferencial.
Tabla II. Grupos con identidad de secuencia de acidos nucleicos para p450 de Nicotiana
GRUPO FRAGMENTOS
- 1
- D58-BG7 (SEQ ID No.: 2), D58-AB1 (SEQ ID No.: 4)
- 2
- D58-BE4 (SEQ ID No.: 8)
- 3
- D56-AH7 (SEQ ID No.: 10); D13a-5 (SEQ ID No.: 12)
- 4
- D56-AG10 (SEQ ID No.: 14); D34-62 (SEQ ID No.: 18)
- 5
- D56-AA7 (SEQ ID No.: 20); D56-AE1 (SEQ ID No.: 22); 185-BD3 (SEQ ID No.: 144)
- 6
- D35-BB7 (SEQ ID No.: 24); D177-BA7 (SEQ ID No.: 26); D56A-AB6 (SEQ ID No.: 28); D144-AE2 (SEQ
- ID No.: 30)
- 7
- D56-AGL1 (SEQ ID No.: 32); D179-AA1 (SEQ ID No.: 34)
- 8
- D56-AC7 (SEQ ID No.: 36); D144-AD1 (SEQ ID No.: 38)
- 9
- D144-AB5 (SEQ ID No.: 40)
- 10
- D181-AB5 (SEQ ID No.: 42); D73-Ac9 (SEQ ID No.: 44)
- 11
- D56-AC12 (SEQ ID No.: 46)
- 12
- D58-AB9 (SEQ ID No.: 48); D56-AG9 (SEQ ID No.: 50); D56-AG6 (SEQ ID No.: 52); D35-BG11 (SEQ ID
No.: 54); D35-42 (SEQ ID No.: 56); D35-BA3 (SEQ ID No.: 58); D34-57 (SEQ ID No.: 60); D34-52 (SEQ ID No.: 62) 13 D56AD10 (SEQ ID No.: 66) 56-AA11 (SEQ ID No.: 68) 14 D177-BD5 (SEQ ID No.: 70); D177-BD7 (SEQ ID No.: 84) 15 D56A-AG10 (SEQ ID No.: 72); D58-BC5 (SEQ ID No.: 74); D58-AD12 (SEQ ID No.: 76) 16 D56-AC11 (SEQ ID No.: 78); D56-AD6 (SEQ ID No.: 88) 17 D73A-AD6 (SEQ ID No.90:) 18 D70A-AB5 (SEQ ID No.: 96); D70A-AB8 (SEQ ID No.: 100); D70A-BH2 (SEQ ID No.: 102); 19 D70A-AA4 (SEQ ID No.: 104); D70A-BA1 (SEQ ID No.: 106); D70A-BA9 (SEQ ID No.: 108) D70A-BD4 (SEQ ID No.: 110) 20 D181-AC5 (SEQ ID No.: 112); D144-AH1 (SEQ ID No.: 114); D34-65 (SEQ ID No.: 116) 21 D35-BG2 (SEQ ID No.: 118) 22 D73A-AH7 (SEQ ID No.: 120) 23 D58-AA1 (SEQ ID No.: 122); D185-BC1 (SEQ ID No.: 134); D185-BG2 (SEQ ID No.: 136) 24 D73-AE10 (SEQ ID No.: 124) 25 D56-AC12 (SEQ ID No.: 126) 26 D177-BF7 (SEQ ID No.: 128); 185-BD2 (SEQ ID No.: 140) 27 D73A-AG3 (SEQ ID No.: 130) 28 D70A-AA12 (SEQ ID No.: 132); D176-BF2 (SEQ ID No.: 86) 29 D176-BC3 (SEQ ID No.: 146) 30 D176-BB3 (SEQ ID No.: 148) 31 D186-AH4 (SEQ ID No.: 6) 32
EJEMPLO 11: Identidad de secuencias de aminoácidos relacionados de clones de longitud completa
La secuencia de acido nucleico de genes de Nicotiana de longitud completa clonados en el Ejemplo 5 fue deducida para su secuencia completa de aminoacidos. Se identificaron los genes para el citocromo p450 por la presencia de tres motivos conservados del dominio de p450, que correspondian a UXXRXXZ, PXRFXF o GXRXC en el terminal 5 carboxilo donde U es E o K, X es cualquier aminoacido y Z es P, T, S o M. Se observo tambien que dos de los clones aparecieron casi completos pero sin embargo carecian del codon de detencion apropiado, D130-AA1 y D101-BA2, pero ambos contenian los tres dominios del citocromo p450. Todos los genes para p450 fueron caracterizados por la id entidad de los ami noacidos util izando u n programa BLAST que compar a su s secuenc ias de lo ngitud completa entre si y con genes conocidos de tabaco. El programa utilizo la herramienta especial BLAST de NCBI 10 (Alineacion d e dos secu encias (b1 2seq), httn:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html). Se al inearon dos secuencias bajo BLASTN sin filtrar las secuencias de acido nucleico y BLASTP para las secuencias de aminoacidos. Con base en su porcentaje de identidad de aminoacidos, se agrupo cada secuencia en grupos de identidad donde la
agrupacion contenia miembros que compartian al menos 85% de identidad con otro miembro. Se observo una agrupacion preferida para aquellas secuencias con identidad de aminoacidos del 90% o superior, una agrupacion mas preferida tenia una identidad de aminoacidos del 95% o superior, y una agrupacion mas preferida tenia aquellas secuencias con una identidad de aminoacidos del 99% o superior. Utilizando estos criterios, se identificaron 25 5 grupos unicos y se describen en la Tabla III. Dentro de los parametros utilizados para la Tabla III para la identidad deaminoacidos, se encontraron tres grupos que contenian una identidad del 85% o superior con genes conocidos de tabaco. Los miembros del Grupo 5 tenian una identidad de aminoacidos hasta del 9 6% para secuencias de longitud completa con secuencias anteriores del GenBank de GI:14423327 (o AAK62346) por Ralston et al. El Grupo 23 teni a una identidad de aminoacidos hasta 10 del 93 % con GI:14423 328 ( o AAK623 47) por Ralsto n et al . y el Grup o 24 tenia un a identi dad del 92% co n GI:14423318 (o AAK62343) por Ralston et al. Tabla III: Grupos de identidad de secuencia de aminoacidos de genes de longitud completa para p450 de Nicotiana 1 D208-AD9 (SEQ. ID. No. 224); D120-AH4 (SEQ. ID. No. 180); D121-AA8 (SEQ. ID. No. 182), D122-AF10 (SEQ. ID. No. 184); D103-AH3 (SEQ. ID. No. 222); D208-AC8 (SEQ. ID. No. 218); D-235-ABI (SEQ. ID. No. 246) 2 D244-AD4 (SEQ. ID. No. 250); D244-AB6 (SEQ. ID. No. 274) ; D285-AA8; D285-AB9; D268-AE2 (SEQ. ID. No. 270) 3 D100A-AC3 (SEQ. ID. No. 168); D100A-BE2 4 D205-BE9 (SEQ. ID. No. 276); D205-BG9 (SEQ. ID. No. 202); D205-AH4 (SEQ. ID. No. 294) 5 D259-AB9 (SEQ. ID. No. 260) ; D257-AE4 (SEQ. ID. No. 268); D147-AD3 (SEQ. ID. No. 194) 6 D249-AE8 (SEQ. ID. No. 256); D-248-AA6 (SEQ. ID. No. 254) 7 D233-AG7 (SEQ. ID. No. 266; D224-BD11 (SEQ. ID. No. 240); DAF10 8 D105-AD6 (SEQ. ID. No. 172); D215-AB5 (SEQ. ID. No. 220); D135-AE1 (SEQ. ID. No. 190) 9 D87A-AF3 (SEQ. ID. No. 216), D210-BD4 (SEQ. ID. No. 262) 10 D89-AB1 (SEQ. ID. No. 150); D89-AD2 (SEQ. ID. No. 152); 163-AG11 (SEQ. ID. No. 198); 163-AF12 (SEQ. ID. No. 196) 11 D267-AF10 (SEQ. ID. No. 296); D96-AC2 (SEQ. ID. No. 160); D96-AB6 (SEQ. ID. No. 158); D207-AA5 (SEQ. ID. No. 204); D207-AB4 (SEQ. ID. No. 206); D207-AC4 (SEQ. ID. No. 208) 12 D98-AG1 (SEQ. ID. No. 164); D98-AA1 (SEQ. ID. No. 162) 13 D209-AA12 (SEQ. ID. No. 212); D209-AA11; D209-AH10 (SEQ. ID. No. 214); D209-AH12 (SEQ. ID. No. 232); D90a-BB3 (SEQ. ID. No. 154) 14 D129-AD10 (SEQ. ID. No. 188); D104A-AE8 (SEQ. ID. No. 170) 15 D228-AH8 (SEQ. ID. No. 244); D228-AD7 (SEQ. ID. No. 241), D250-AC11 (SEQ. ID. No. 258); D247-AH1 (SEQ. ID. No. 252) 16 D128-AB7 (SEQ. ID. No. 186) ; D243-AA2 (SEQ. ID. No. 248); D125-AF11 (SEQ. ID. No. 228)
17 D284-AH5 (SEQ. ID. No. 298); D110-AF12 (SEQ. ID. No. 176)
18 D221-BB8 (SEQ. ID. No. 234)
19 D222-BH4 (SEQ. ID. No. 236)
20 D134-AE11 (SEQ. ID. No. 230)
21 D109-AH8 (SEQ. ID. No. 174)
22 D136-AF4 (SEQ. ID. No. 278)
23 D237-AD1 (SEQ. ID. No. 226)
24 D112-AA5 (SEQ. ID. No. 178)
25 D283-AC1 (SEQ. ID. No. 272)
Los ge nes de longitu d com pleta fuer on a grupados a dicionalmente co n base en l a homo logia d e aminoac idos altamente conservada entre el dominio de p450 UXXRXXZ y el dominio de p450 GXRXC cerca del extremo del terminal carboxilo. Como se muestra en la Figura 3, se alinearon clones individuales por su homologia de secuencia entre los dominios conservados relacionados entre si y colocados en diferentes grupos de identidad. En varios casos, aunque la secuencia de acido nucleico del clon era unica, la sec uencia de aminoacidos para la regi on era identica. El agrupamiento preferido se observo para aquellas secuencias con una identidad de aminoacidos del 90%
o superior, un grupo mas preferido tenia una identidad de aminoacidos del 95% o superior, y un agrupamiento mas preferido tenia aquella identidad de secuencias de aminoacidos del 99% o superior. El agrupamiento final era similar a aquel con base en el porcentaje de identidad para la secuencia completa de aminoacidos de los clones excepto por el Grupo 17 (de la Tabla III) que fue dividida en dos grupos distintos.
Dentro de los parametros utilizados para la identidad de aminoacidos en la Tabla IV, se encontraron tres grupos que contenian 90% o mas de identidad con genes conocidos del tabaco. Los miembros del Grupo 5 tenian una identidad de aminoacidos hasta del 93,4% para secuencias de longitud completa con secuencias anteriores del GenBank de GI:14423326 (AAK62346) por Ralston et al. El Grupo 23 t enia una identidad de aminoacidos hasta del 91,8% con GI:14423328 (o AAK62347) por Ralston etal. y el Grupo 24 tenia una iden tidad del 98,8% con GI:14423318 (o AAK62342) por Ralston et al.
Tabla IV: Grupos de identidad de secuencia de aminoacidos de regiones entre dominios conservados de genes para p450 de Nicotiana
1 D208-AD9 (SEQ. ID. No. 224); D120-AH4 (SEQ. ID. No. 180); D121-AA8 (SEQ. ID. No. 182), D122-AF10
(SEQ. ID. No. 184); D103-AH3 (SEQ. ID. No. 222); D208-AC8 (SEQ. ID. No. 218); D-235-ABI (SEQ. ID.
No. 246)
2 D244-AD4 (SEQ. ID. No. 250); D244-AB6 (SEQ. ID. No. 274) ; D285-AA8; D285-AB9; D268-AE2 (SEQ.
ID. No. 270)
3 D100A-AC3 (SEQ. ID. No. 168); D100A-BE2
4 D205-BE9 (SEQ. ID. No. 276); D205-BG9 (SEQ. ID. No. 202); D205-AH4 (SEQ. ID. No. 294)
D259-AB9 (SEQ. ID. No. 260) ; D257-AE4 (SEQ. ID. No. 268); D147-AD3 (SEQ. ID. No. 194)
6 D249-AEQ (SEQ. ID. No. 256); D-248-AA6 (SEQ. ID. No. 254)
7 D233-AG7 (SEQ. ID. No. 266; D224-BD11 (SEQ. ID. No. 240); DAF10 8 D105-AD6 (SEQ. ID. No. 172); D215-AB5 (SEQ. ID. No. 220); D135-AE1 (SEQ. ID. No. 190)
9 D87A-AF3 (SEQ. ID. No. 216), D210-BD4 (SEQ. ID. No. 262) 10 D89-AB1 (SEQ. ID. No. 150); D89-AD2 (SEQ. ID. No. 152); 163-AG11 (SEQ. ID. No. 198); 163-AF12 (SEQ. ID. No. 196) 11 D267-AF10 (SEQ. ID. No. 296); D96-AC2 (SEQ. ID. No. 160); D96-AB6 (SEQ. ID. No. 158); D207-AA5
(SEQ. ID. No. 204); D207-AB4 (SEQ. ID. No. 206); D207-AC4 (SEQ. ID. No. 208) 12 D98-AG1 (SEQ. ID. No. 164); D98-AA1 (SEQ. ID. No. 162) 13 D209-AA12 (SEQ. ID. No. 212); D209-AA11; D209-AH10 (SEQ. ID. No. 214); D209-AH12 (SEQ. ID. No.
232); D90a-BB3 (SEQ. ID. No. 154) 14 D129-AD10 (SEQ. ID. No. 188); D104A-AE8 (SEQ. ID. No. 170) 15 D228-AH8 (SEQ. ID. No. 244); D228-AD7 (SEQ. ID. No. 241), D250-AC11 (SEQ. ID. No. 258); D247-AH1
(SEQ. ID. No. 252) 16 D128-AB7 (SEQ. ID. No. 186) ; D243-AA2 (SEQ. ID. No. 248); D125-AF11 (SEQ. ID. No. 228) 17 D284-AH5 (SEQ. ID. No. 298); D110-AF12 (SEQ. ID. No. 176) 18 D221-BB8 (SEQ. ID. No. 234) 19 D222-BH4 (SEQ. ID. No. 236) 20 D134-AE11 (SEQ. ID. No. 230) 21 D109-AH8 (SEQ. ID. No. 174) 22 D136-AF4 (SEQ. ID. No. 278) 23 D237-AD1 (SEQ. ID. No. 226) 24 D112-AA5 (SEQ. ID. No. 178) 25 D283-AC1 (SEQ. ID. No. 272) 26 D110-AF12 (SEQ. ID. No. 176)
EJEMPLO 12: Clones de citocromo p450 de Nicotiana que carecen de uno o más de los dominios específicos del citocromo p450 de tabaco
Cuatro clones tenian alta homologia de acidos nucleicos, en el rango de homologia de acidos nucleicos del 90% al 99%, con otros genes para el citocromo del tabaco reportados en la Tabla III. Los cuatro clones incluian D136-AD5,
5 D138-AD12, D243-AB3 y D250-AC11. Sin embargo, debido a un cambio de marco del nucleotido estos genes no contenian uno o mas de tre s dominios del citocromo p450 del terminal C y fueron excluidos de los grupos de identidad presentados en la Tabla III o en la Tabla IV.
La identidad de aminoacidos de un clon, D95-AG1, no contenia el tercer dominio, GXRXC, utilizado para agrupar los genes del tabaco para p450 en la Tabla III o en la Tabla IV. La homologia de acidos nucleicos de este clon tenia 10 baja homologia con otros genes para el citocromo de tabaco. Este clon representa un grupo nuevo y diferente de genes para citocromo p450 en Nicotiana.
EJEMPLO 13: Uso de fragmentos de citocromo p450 de Nicotiana y clones en la regulación alterada de propiedades del tabaco
El uso de fragmentos de acido nucleico para p450 de tabaco o de genes completos es util en la identificacion y seleccion de aquellas p lantas qu e tie nen fenotip os d e t abaco alterados o c onstituyentes del tabac o y, m as importante, metabolitos alterados. Las plantas de tabaco transgenico se generan por medio de una variedad de sistemas de transformac ion que inc orporan fragme ntos de acid o n ucleico o ge nes de lo ngitud compl eta, seleccionados a partir de a quellos reportados aqui, en orie ntaciones ya sea para reducir la expresion, por ejemplo orientacion an tisentido, o so breexpresion por ej emplo, orie ntacion se ntido. Par a so breexpresion con g enes de longitud completa, se desea que cualquier secuencia de acido nucleico que codifique la secuencia completa o una parte funcional o secuencia de aminoacidos de los genes de longitud completa descritos en esta invencion que sean efectivos para incrementar la expresion de una cierta enzima y que resultan por lo tanto en un efecto fenotipico en Nicotiana. Las lineas de Nic otiana qu e sean line as homoc igotas se obtien en a traves de una seri e de retrocruzamientos y se eva luan los camb ios fenotipicos incluyendo, p ero sin limitar se a, el anali sis de ARN endogeno para p450, transcriptos, peptidos expresados de p450 y concentraciones de metabolitos de la plant a utilizando tecn icas comu nmente disp onibles para al guien ordi nariamente capac itado en el arte. Los cambi os exhibidos en las pla ntas d e tabaco pr oporcionan info rmacion so bre el pap el fun cional de l ge n de inter es seleccionado o son de utilidad como una especie de planta preferida de Nicotiana.
EJEMPLO 14. Identificación de genes inducidos en líneas convertidoras tratadas con etileno
La tecnologia de arreglos de oligonucleotidos de alta de nsidad, el arreglo Affymetrix GeneChip® (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA), fue utilizado para mediciones cuantitativas y altamente paralelas de expresion genica. En el uso de esta tecnologia, se fabricaron arreglos de acido nucleico por medio de sintesis directa de oligonucleotidos sobre una superficie solida. Esta quimica en fase solida es capaz de producir arreglos que contienen cientos de miles de de so ndas de olig onucleotidos emp acadas con d ensidades e xtremadamente a ltas s obre un ch ip denominado GeneChip®. Miles de genes pueden ser simultaneamente seleccionados a partir de una sola hibridacion. Cada gen esta tipicamente representado por un conjunto de 11 - 25 pares de sondas dependiendo del tamano. Las sondas se disenan para maximizar la sensibilidad, especificidad, y reproducibilidad, permitiendo una discriminacion consistente entre senales especificas y de fondo, y entre secuencias objetivo estrechamente relacionadas.
Los experimentos de hibridacion con el GeneChip Affymetrix involucran las siguientes etapas: el diseno y produccion de arreglos, la preparacion del objetivo marcado en forma fluorescente del ARN aislado a partir de los especimenes biologicos, la hibridacion del objetivo marcado con el GeneChip, la seleccion del arreglo, y el analisis de la imagen escaneada y la generacion de los perfiles de expresion del gen.
A. Diseno y elaboracion por encargo del GeneChip de Affymetrix
Un GeneChip CustomExpress Advantage Array fue elaborado por encargo por Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA). El tamano del chip era de 18 micras y el formato de la disposicion era de 100 - 2187 que puede acomodar 528 grupos de son das (1 1.628 so ndas). Excepto por las secuenc ias de acid o n ucleico deriv adas del Gen Bank, todas las secuencias fueron seleccionadas a partir de nuestros clones de tabaco previamente identificados y todas las sondas fueron disenadas por encargo. Se seleccionaron un total de 400 genes de tabaco o fragmentos para ser incluidos sobre el GeneChip. Las secuencias de oligonucleotidos seleccionadas se basaron en regiones unicas del extremo 3' del gen. Las secuencias seleccionadas de acido nucleico consistian de 56 genes para p450 de longitud completa y 71 fragmentos de p450 que fueron clonados del tabaco, descritas en (las solicitudes de patente). Otras secuencia de tabaco incluian 270 EST de tabaco que fueron generadas a partir de una biblioteca de sustraccion de la supresion utilizando el kit SSH de Clontech (BD Biosciences, Palo Alto, CA). Entre estos gen es, se seleccionaron algunas secuencias de oligonucleotidos de los genes para el citocromo P450 enlistados en el GenBank. Se utilizaron hasta 25 sondas para cada gen de longitud completa y 11 sondas para cada fragmento. Se utilizaron un numero reducido de sondas para algunos clones debido a la falta de sondas unicas de alta calidad. Se incluyeron tambien secuencias de control apropiadas sobre el GeneChip®.
Los arreglos de la sonda eran de oligonucleotidos de 25 mer que fueron directamentesintetizados sobre una oblea de vidrio por medio de una combinacion de fotolitografia basada en el semiconductor y tecnologias de sintesis quimica en fase solida. Cada arreglo contenia hasta 10 0.000 sondas de oligonucleotidos diferentes. Ya que las sondas d e ol igonucleotidos se sintetiz an en p osiciones conocidas s obre e l arre glo, se pu eden i nterpretar los patrones de hibridacion y las intensidades de senal en terminos de identidad de genes y niveles de expresion relativos por medio del programa Affymetrix Microarray Suite®. Cada par de sondas consiste de un oligonucleotido de corres pondencia perfecta y un oligonucleotido d e fal ta de corres pondencia. La sonda de corr espondencia perfecta tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y por lo tanto mide la expresion del gen. La sonda de falta de correspondencia se diferencia de la sonda de correspondencia perfecta por la sustitucion de una sola base en la posicion de la base del centro, que perturba el enlazamiento del transcripto del gen objetivo. La falta de correspondencia produce una senal de hibridacion no especifica o senal de fondo que fue comparada con la senal medida para el oligonucleotido de correspondencia perfecta.
B. Preparacion de la muestra
Los experimentos de hibridacion fueron realizados por Genome Explorations, Inc. (Memphis, TN). Las muestras de ARN utilizadas en hibridacion consistian de seis pares de lineas is ogenicas convertidoras/no convertidoras que fueron inducidas por tratamientos con etileno. Las muestras incluian un par de muestras de tabaco Burley no tratadas 4407-25/4407-33, tres pares de muestras 4407-25/4407-33 tratadas con etileno, un par de tabaco oscur o NL Madole/181 tratado con etileno y un par de la variedad Burley PBLB01/178 tratada con etileno. El tratamiento con etileno fue descrito en el Ejemplo 1.
Se extrajo el ARN total de l as hojas mencionadas anteriormente tratadas y no tratadas con etileno utilizando un protocolo modificado de extraccion con fenol acido y cloroformo. El protocolo fue modificado para utilizar un gramo de tejido que fue molido y posteriormente sometido a agitacion tipo vortice en 5 ml de amortiguador de extraccion (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5; NaCl 200 mM; EDTA 10 mM; SDS al 0,5%) al cual se le anadieron 5 ml de fenol (pH 5,5) y 5 ml de cloroformo. Se centrifugo la muestra extraida y se recupero el sobrenadante. Se repitio esta etapa de extraccion 2 - 3 veces mas hasta qu e el sobrenadante aparecio claro. Se anadieron aproximadamente 5 ml de cloroformo para remover cantidades en trazas de fenol. Se precipito el ARN de las fracciones combinadas de sobrenadante por medio de la adicion 3 veces de un volumen de ETOH y 1/10 de volumen de NaOAc 3 M (pH 5,2) y almacenando a -20 ºC durante 1 hora. Desp ues de transferir a un cont enedor de vidrio Core x se centrifugo l a fraccion de ARN a 9.000 RPM durante 4 5 minutos a 4°C. Se lavo el precipit ado con etano al 7 0% y centrifugo durante 5 minutos a 9.000 RPM a 4°C. Despues de secar el precipitado, se disolvio el ARN precipitado en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. Se disolvio el ARN precipitado en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. Se analizo la calidad y cantidad del ARN total por medio de gel de formaldehido desnaturalizado y un espectrofotometro, respectivamente. Las muestras de ARN total con 3 - 5 1g/ul fueron enviadas a Genome Explorations, Inc. para hacer la hibridacion.
C. Hibridacion, deteccion y salida de datos
La preparacion de material de ARNc marcado se realiz o de la siguiente manera. Se sint etizaron la primera y la segunda hebras de ADNc a partir de 5 - 15 1g d e ARN total utilizando el kit de si ntesis de ADNc bicatenario SuperScript (Gibco Life Technologies) y el iniciador oligo-dT24-T7 (5'-GGC CAG TGA ATT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGG CGG-3') de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se sintetizo y marco al mismos tiempo el ARNc con UTP y CTP biotinilados por medio de transcripcion in vitro utilizando el ADNc bicatenario acoplado al promotor T7 como plantilla y el kit para marcacion de transcriptos de ARN T7 (ENZO Diagnostics Inc.). En resumen, se lavo dos veces el ADNc bicatenario sintetizado a partir de las etapas previas con etanol al 70% y resuspendio en 22 1l de H 2O libre de ARNasa. Se incubo el ADNc con 4 1l de cada amortiguador de reaccion 10X, ribonucleotidos marcados con biotina, DTT, mezcla inhibidora de ARNasa y 2 1l de ARN polimerasa T7 20X durante 5 h a 37°C. Se separo el ARN marcado de los ribonucleotidos no incorporados pasandolos a traves de una columna CHROMA SPIN-100 (Clontech) y precipitando a -20°C durante 1 h durante la noche.
La hibridacion y el analisis del arreglo de oligonucleotidos se realizaron de la siguiente manera. Se resuspendio el precipitado de ARNc en 10 1l de H2O libre de ARNasa y se fragmentaron 10,0 1g por medio de hidrolisis mediada por iones y por calor a 95°C durante 35 min en Tris-acetato 200 mM, pH 8,1, KOAc 50 0 mM, MgOAc 150 mM. S e hibrido el ARNc fragmentado durante 16 h a 45°C con arreglos de oligonucleotidos HG U95Av2 (Affymetrix) que contenian -12.500 genes anotados de longitud completa junto con juegos adicionales de sondas disenados para representar secuencias EST. Se lavaron los arreglos a 25°C con SSPE 6 X (NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM + Tween 20 al 0,01%) seguido por un lavado en condiciones estrictas a 50°C con MES 100 mM, [Na+] 0,1 M, Tween 20 al 0,01%. Se colorearon los arreglos con estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Molecular Probes) y se determinaron l as intens idades de fluor escencia uti lizando un esca ner c onfocal de l aser (He wlett-Packard). Las imagenes escaneadas fueron analizadas utilizando un programa de Microarreglos (Affymetrix). Se estandarizaron la carga de la muestra y las variaciones en la coloracion escalando el promedio de las intensidades de fluorescencia de todos los genes sobre un arreglo hasta una intensidad objetivo constante (250) para todos los arreglos utilizados. Se llevo a cabo el analisis de los datos utilizando el Microarray Suite 5.0 (Affymetrix) de acuerdo con la guia del usuario. Se calculo la intensidad de la senal para cada gen como la diferencia promedio de intensidad, representada por [I(PM - MM)/(numero de pares de sondas)], donde PM y MM denotan sondas de correspondencia perfecta y sondas de falta de correspondencia.
D. Analisis de datos y resultados
Doce grupos de hibridaciones fueron exitosas como se evidencia por medio del Reporte de Expresion generado utilizando instrumentos de deteccion de Genome Explorations. Los parametros principales sobre el reporte incluian Ruido, factor de la Escala, fondo, grupos totales de sondas, numero y porcentaje de grupos de sondas presentes y
ausentes, intensidad de la señal de controles de mantenimiento. Los datos fueron posteriormente analizados y presentados utilizando el programa GCOS junto con otro programa de Microsoft. Se analizó la comparación de la señal entre pares de tratamiento. Se compilaron todos los datos para todas las sondas respectivas correspondientes a los genes y a los fragmentos de cada tratamiento diferente incluidas las replicaciones y se analizaron los datos de expresión compilados tales como la recopilación de los cambios y de los cambios de relación de la señal log 2.
Una aplicación típica de la tecnología GeneChip es hallar genes que sean diferencialmente expresados en diferentes tejidos. En la presente solicitud, las variaciones de la expresión genética provocadas por tratamiento con etileno fueron determinadas para pares de líneas de tabaco convertidoras y no convertidoras que incluían una variedad Burley 4407-25/4407-33, una variedad Burley PBLB01/178, y una variedad oscura NL Madole/181. Estos análisis detectaron únicamente aquellos genes cuya expresión es significativamente alterada debido a variación biológica. Estos análisis emplearon el cambio Fold (relación de señal) como criterio principal para identificar genes inducidos. Otros parámetros, tales como intensidad de señal, recopilación presente/ausente, fueron tenidos en cuenta también.
Después de analizar los datos por las diferencias de expresión en pares convertidores y no convertidores de muestras para aproximadamente 400 genes, los resultados con base en las intensidades de señal mostraron que únicamente dos genes, D121-AA8 y D120-AH4, tenían inducción reproducible en líneas convertidoras tratadas con etileno versus líneas no convertidoras. Para ilustrar la expresión diferencial de estos genes, se representaron los datos de la siguiente manera. Como se muestra en la Tabla V, se determinó la señal de un gen en una línea convertidora, por ejemplo, una variedad de tabaco Burley, 4407-33, como la relación con la señal de una línea isogénica no convertidora relacionada, 4407-25. Sin tratamiento con etileno, la relación de señales convertidoras con respecto a las señales no convertidoras para todos los genes se acercó a 1,00. Después de tratamiento con etileno, dos genes, D121-AA8 y D120-AH4, fueron inducidos en líneas convertidoras con relación a líneas no convertidoras como se determinó por medio de tres análisis independientes utilizando líneas isogénicas Burley. Estos genes tienen una homología muy alta entre sí, aproximadamente una homología de secuencias de ácido nucleico del 99,8% o superior. Como se describe en la Tabla V, sus señales de hibridación relativa en variedades convertidoras están en el rango aproximadamente de 2 a 12 veces mayor en líneas convertidoras que las señales en sus contrapartes no convertidoras. En comparación, se encontró que dos clones de control tipo actina, controles internos, no eran inducidos en líneas convertidoras con base en sus relaciones normalizadas. Además, un fragmento (D35-BG11), cuya secuencia en la región de codificación está completamente contenida tanto en genes D121-AA8 como D120-AH4, era altamente inducido en las mismas muestras de líneas isogénicas pareadas convertidoras y no convertidoras. Otro par isogénico de variedades de tabaco Burley, PBLB01 y 178, se demostró que tenían los mismos genes, D121-AA8 y D120-AH4, inducidos en muestras convertidoras bajo inducción con etileno. Además, los genes D121-AA8 y D120-AH4 fueron inducidos preferencialmente en líneas convertidoras de pares de tabaco isogénico oscuro, NL Madole y 181, demostrando que la inducción con etileno de estos genes en líneas convertidoras no estaba limitada a variedades de tabaco Burley. En todos los casos, el fragmento D35-BG11 era el más altamente inducido en líneas pareadas convertidoras con relación a no convertidoras.
Tabla V: Una comparación de indución en clones en líneas convertidoras y no convertidoras tratadas con etileno
- Clones
- Sin Tratamiento Exp. 1 de Burley tratada con etileno Exp. 2 de Burley tratada con etileno Exp. 3 de Burley tratada con etileno Oscuro tratado con etileno
- Inducido
- Relación 33:25 Relación 33:25 Relación Et:No Relación 33:25 Relación Et:No Relación 33:25 Relación Et:No Relación 181:NL Relación Et:No
- D121-AA8 D120-AH4
- 1,03 1,44 2,20 2,14 2,74 1,90 13,25 12,90 18,33 12,74 5,31 5,15 4,13 2,87 17,06 16,60 11,76 8,17
(continuación)
- Clones
- Sin Tratamiento Exp. 1 de Burley tratada con etileno Exp. 2 de Burley tratada con etileno Exp. 3 de Burley tratada con etileno Oscuro tratado con etileno
- Control
- Actina tipo I Actina tipo I
- 1,18 1,09 1,17 0,991,23 1,12 0,88 0,74 0,89 0,81 0,88 0,73 1,18 0,11 1,20 1,02 1,02 0,93
EJEMPLO 15: Clonación relacionada con genes de longitud completa D35-BG11
La hibridación con GeneChip se basó en transcripción inversa 3’ (ARNc). Las sondas que fueron sintetizadas sobre Gene-Chip fueron escogidas del extremo 3’ de los genes (en la región del nucleótido 1000 secuencia abajo). Por lo tanto, con el propósito de obtener todas las variaciones posibles de clones D121-AA8 y D120-AH4, se llevó a cabo una clonación adicional a partir de la biblioteca de ADNc de tabaco utilizando secuencias 5’.
Los genes de longitud completa fueron clonados a partir de la biblioteca de ADNc construida a partir del tejido tratado con etileno 4407-33 como se describe en el Ejemplo 5. Se utilizó el método de Reacción en Cadena de la Polimerasa de la siguiente manera. Se diseñaron los iniciadores inversos con base en la secuencia 3’ (incluyendo parte de la región no traducida) del gen D121-AA8. El iniciador de D121-p2 5’-AGC AAG ATG ATC TTA GGT TTT AA-3’ y D121-R-2 5’-can GCA AGA TGA TCT TAG GTT TTA ATA AAG CTC AGG T-3’. El iniciador T3 (5’ CAA TTA ACC CTC ACT AAA GGG 3’), localizado secuencia arriba de los insertos en el plásmido, fue utilizado como iniciador hacia delante. Los productos PCR generados fueron sometidos a electroforesis de agarosa y se cortaron, purificaron, clonaron y secuenciaron las bandas correspondientes de alto peso molecular. Los métodos para clonación y secuenciación fueron descritos en el Ejemplo 4. Se secuenciaron nueve nuevos clones e identificaron como D425-AB10, D425-AB11, D425-AC9, D425-AC10, D425-AC11, D425-AG11, D425-AH7, D425-AH11, y D427-AA5. Se observó que cada uno de los clones tiene una homología de secuencia de ácidos nucleicos del 99% o superior con clones D121-AA8 y D120-AH4.
EJEMPLO 16: Inducción con etileno de desmetilasa de nicotina microsomal en líneas convertidoras de tabaco
El análisis bioquímico de la actividad enzimática de la desmetilasa en fracciones microsomales enriquecidas de pares tratados y no tratados con etileno de líneas de tabaco convertidoras y no convertidoras fue llevado a cabo de la siguiente forma.
A. Preparación de microsomas
Se aislaron los microsomas a 4°C. Se extrajeron las hojas de tabaco en un amortiguador que consistía de ácido N(2-hidrooxietil)piperazina-N’-(2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 7.5, DL-Ditiotreitol (DTT) 3 mM y Coctel Inhibidor de Proteasa (Roche) a razón de 1 tableta/50 ml. Se filtró el extracto crudo a través de cuatro capas de estopilla para remover el tejido no roto, y se centrifugó el filtrado durante 20 min a 20.000 x g para remover restos celulares. El sobrenadante fue sometido a ultracentrifugación a 100.000 x g durante 60 min y el precipitado resultante contenía la fracción microsomal. La fracción microsomal fue suspendida en el amortiguador de extracción y aplicada a una etapa de ultracentrifugación donde se utilizó un gradiente discontinuo de sacarosa de 0.5 M en el amortiguador de extracción. Los microsomas purificados fueron resuspendidos en el amortiguador de extracción suplementado con glicerol al 10% (p/v) como crioprotector. Se almacenaron las preparaciones microsomales en un congelador de nitrógeno líquido hasta su uso.
B. Determinación de la concentración de proteína
Se precipitaron las proteínas microsomales con �?cido Tricloroacético al 10% (TCA) (p/v) en acetona, y se determinaron las concentraciones de proteína de los microsomas utilizando el kit para ensayo de proteína RC DC
(BIO-RAD) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Ensayo de actividad de la desmetilasa de nicotina
Se obtuv o l a DL-Nicotina (P irrolidina-2-14C) de Mor avek Biochemicals y te nia u na actividad es pecifica de 54 mCi/mmol. La clorpromazina (CPZ) y el citocromo c oxidado (cit. C), ambos inhibidores de P450, fueron adquiridos de Sigm a. La forma reduci da de l nic otinamida ad enina dinucleotido fosfato (NADPH) es el do nante tipic o d e electrones para el citocromo P450 a traves de la NADPH:citocromo P450 reductasa. El NADPH fue omitido para la incubacion de control. El ensayo enzimatico de rutina consistio de proteinas microsomales (alrededor de 2 mg/ml), NADPH 6 mM, 55 1M de nicotina marcada con 14C. La concentracion de CPZ y de Cit. C, cuando se utilizan, fue de 1 mM y 100 1M, respectivamente. La reaccion fue llevada a cabo a 25°C durante 1 hora y fue detenida con la adicion de 300 1l de metanol a cada 25 1l de mezcla de reaccion. Despues de centrifugacion, se separaron 20 1l del extracto de metanol con un sistema de Cromatografia Liquida de Alto Rendimiento (HPLC) en fase reversa (Agilent) utilizando una columna de 3 1 Inertsil ODS-3 (150 x 4,6 mm) de Varian. La fase movil isocratica fue la mezcla d e metanol y amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.25, con una relacion de 60:40 (v/v) y la velocidad de flujo fue de 1 ml/min. El pico de nornic otina, como se determino por medio de la comparacion con nornicotina autentica no marcada, fue recolectado y sometido a un Contador de Centelleo Liquido 2900 tri-carb (LSC) (Perkin Elmer) para la cuantificacion. La actividad de la desmetilasa de nicotina se calcula con base en la produccion de nornicotina marcada con 14C durante 1 hora de incubacion.
Las muestras fueron obtenidas de pares de lineas de tabaco Burley convertidoras (linea 4407-33) y no convertidoras (linea 4407-25) que fueron trat adas con etileno o no. Ninguna de las muestras no tratadas tenia alg una actividad detectable de desmetilasa de nicotina microsomal. Por el contrario, se encontro que las muestras microsomales obtenidas a partir de lineas convertidor as tratadas con etileno c ontenian nive les signific ativos de actividad de desmetilasa de la nicotina. Se observo que la actividad de desmetilasa de la nicotina era inhibida por inhibidores especificos de P450 demostrando que la actividad de desmetilasa era consistente con una enzima microsomal derivada de P 450. U n gru po tipico d e re sultados d e e nsayo de l a e nzima obtenidos par a la linea d e tab aco convertidora Burley es mostrado en la Tabla VI. Por el contrario, la muestra derivada de tabaco no convertidor tratado con etileno no contenia ninguna actividad de desmetilasa de la nicotina. Estos resultados demostraron que la actividad de desmetilasa de la nicotina fue inducida despues del tratamiento con etileno en lineas convertidoras pero no en la linea no convertidora isogenica correspondiente. Se obtuvieron resultados similares para un para de la variedad isogenica de tabaco oscuro, donde la actividad de desmetilasa microsomal de la nicotina fue inducida en lineas convertidoras y no fue detectable en lineas pareadas no convertidoras. Ambos experimentos demostraron que la actividad de desmetilasa microsomal de la nicotina es inducida despues del tratamiento con etileno en lineas convertidoras mientras que no en lineas no convertidoras isogenicas pareadas. Estos genes que son genes que se derivan de P450 y son inducidos preferencialmente en lineas convertidoras con relacion a lineas no convertidoras pareadas son genes candidatos para codificar la enzima desmetilasa de la nicotina.
Tabla VI: Actividad de la desmetilasa en microsomas de lineas convertidoras y no convertidoras Burley inducidas con etileno
- Muestra
- microsomas Microsomas + clorpromazina 1 mM Microsomas + con citocromo C 100 1M Microsomas -NADPH
- Convertidora
- 0,6 ± 0,05 pkat / mg 0,01 ± 0,01 pkat / mg 0,03 ± 0,05 pkat / mg 0,03 ± 0,04 pkat / mg
- No convertidora
- No se detecto No se detecto No se detecto No se detecto
Claims (20)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una molecula aislada de acido nucleico de Nicotiana en donde dicha molecula de acido nucleico comprende la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 356.
-
- 2.
- Una planta transgenica de tabaco, en donde dicha planta transgenica de tabaco comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1.
-
- 3.
- La plata transgenica de tabaco de la reivindicacion 2, en donde dicha planta transgenica de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.
-
- 4.
- Un metodo para producir una planta transgenica de tabaco, en donde dicho metodo comprende las etapas de:
- (i)
- enlazar operativamente la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 con un promotor funcional en dicha planta de tabaco para crear un vector de transformacion de la planta;
- (ii)
- transformar dicha planta de tabaco con dicho vector para transformacion de la planta de la etapa (i);
(iii) seleccionar una celula vegetal transformada con dicho vector de transformacion; y(iv) regenerar una planta transgenica de tabaco a partir de dicha celula vegetal transformada. -
- 5.
- El metodo de la reivindicacion 4, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion antisentido.
-
- 6.
- El metodo de la reivindicacion 4, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion sentido.
-
- 7.
- El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicha molecula de acido nucleico se expresa como una molecula de ARN bicatenario.
-
- 8.
- El metodo de la reivindicacion 7, en donde dicha molecula de acido nucleico tiene aproximadamente de 15 a 25 nucleotidos de longitud.
-
- 9.
- El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde dicha planta transgenica de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.
-
- 10.
- Un metodo para seleccionar una planta de tabaco que contiene una molecula de acido nucleico, en donde dicha planta de tabaco se analiza por la presencia de la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 356.
-
- 11.
- El metodo para sel eccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 10, en don de dicha planta se analiza por hibridacion de ADN.
-
- 12.
- El metodo para seleccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 11, en donde dicha hibridacion de ADN es un analisis de transferencias tipo Southern.
-
- 13.
- El metodo para seleccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 11, en donde dicha hibridacion de ADN es un analisis de transferencias tipo Northern.
-
- 14.
- El metodo para sel eccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 10, en donde dicha planta de tabaco se analiza por medio de deteccion por PCR.
-
- 15.
- El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde dicha planta de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.
-
- 16.
- Un metodo para disminuir los niveles de nornicotina en una planta de tabaco, en donde dicho metodo comprende las etapas de:
- (i)
- enlazar operativamente la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 con un promotor fun cional en una planta de tabaco para crear un vector para transformacion de la planta;
- (ii)
- transformar dicha planta de tabaco con dicho vector para transformacion de la planta de la etapa (i);
(iii) seleccionar una celula vegetal transformada con dicho vector de transformacion; y(iv) regenerar una planta transgenica de tabaco a partir de dicha celula vegetal transformada. -
- 17.
- El metodo de la reivindicacion 16, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion antisentido.
-
- 18.
- El metodo de la reivindicacion 16, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion sentido.
-
- 19.
- El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde dicha molecula de acido nucleico se expresa como una molecula de ARN bicatenario.
-
- 20.
- El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde dicha planta transgenica de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.
NOMBRE D89-AB1 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 149NOMBRE D100-BE2 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 165NOMBRE D120-AH4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 179NOMBRE D209-AA10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 209NOMBRE D215-AB5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 219NOMBRE D222-BH14 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 235NOMBRE D257-AE4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 267NOMBRE D138-AD12 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 285NOMBRE D284-AH5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 295El porcentaje de identidad entre la mayor parte de los pares relacionados se expresa en (0,0 %). Cada grupo tenía al menos 70% de identidad con otros miembros del grupo. El Grupo 19 contenía el porcentaje de identidad más bajo de 70,0%.FIG. 153NOMBRE D425-AB10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 356145FIG. 154NOMBRE D425-AB11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 358146FIG. 155NOMBRE D425-AC9 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 360147FIG. 156NOMBRE D425-AC10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 362148FIG. 157NOMBRE D425-AC11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 364149FIG. 158NOMBRE D425-AG11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 366150FIG. 159NOMBRE D425-AH7 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 368151FIG. 160NOMBRE D425-AH11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 370152FIG. 161NOMBRE D427-AA5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUMSEQ ID 372153
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