ES2384243T3 - Uso de un gen para el citocromo P450 de nicotiana - Google Patents

Abstract

El uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 para reducir o silenciar laexpresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco o en un tejido de la misma, o en un producto de tabacoelaborado a partir de dicha planta de tabaco o tejido de la misma.

Description

Uso de un gen para el citocromo p450 de Nicotiana

La presente invención se relaciona en general con secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas de citocromo p450 (en lo sucesivo denominadas como enzimas p450 y p450) en plantas de Nicotiana y con métodos para la utilización de dichas secuencias de ácido nucleico para alterar fenotipos de las plantas.

Antecedentes

Los citocromos p450 catalizan las reacciones enzimáticas para una amplia gama de sustratos químicamente diferentes que incluyen el metabolismo oxidativo, peroxidativo y reductivo de sustratos endógenos y xenobióticos. En las plantas, los p450 participan en las rutas bioquímicas que incluyen la síntesis de productos vegetales, tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glucósidos cianogénicos y glucosinolatos (Chappel, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 198, 49: 311 - 343). Los citocromos p450, también conocidos como proteínas hemotiolato p450, por lo general actúan como oxidasas terminales en las cadenas de transferencia de electrones de múltiples componentes, llamados sistemas monooxigenasa que contienen p450. Las reacciones específicas catalizadas incluyen desmetilación, hidroxilación, epoxidación, N-oxidación, sulfoxidación, N, S, y Odesalquilaciones, desulfatación, desaminación, y reducción de grupos azo, nitro y N-óxido.

El papel diverso de las enzimas p450 de la planta Nicotiana ha sido implicado en la elaboración de una variedad de metabolitos de plantas tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glucósidos cianogénicos, glucosinolatos y una gran cantidad de otras entidades químicas. Durante los últimos años, se ha hecho evidente que algunas enzimas p450 puede afectar a la composición de metabolitos vegetales en las plantas. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y el aroma de ciertas plantas mediante la alteración de su perfil de ácidos grasos seleccionados a través de fitomejoramiento; sin embargo, se conoce muy poco acerca de los mecanismos implicados en el control de los niveles de estos constituyentes de la hoja. La reducción de la expresión de las enzimas p450 asociadas con la modificación de ácidos grasos puede facilitar la acumulación de ácidos grasos deseados que proporcionan cualidades fenotípicas de la hoja más preferida. Se siguen descubriendo la función de las enzimas p450 y su ampliación de funciones en los constituyentes de las plantas. Por ejemplo, se encontró que una clase especial de enzimas p450 catalizan la degradación de ácidos grasos en alcoholes y aldehídos C6 y C9 que son los principales contribuyentes del olor "verde fresco" de frutas y verduras. El nivel de otras nuevas p450 objetivo puede ser alterado para mejorar las cualidades de los componentes de la hoja mediante la modificación de la composición lipídica y de los metabolitos degradados relacionados en la hoja de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la hoja se ven afectados por la senectud, que estimula la maduración de las propiedades de calidad de la hoja. Incluso otros reportes han mostrado que las enzimas p450 juegan un papel funcional en la alteración de los ácidos grasos que están involucrados en las interacciones planta-patógeno y en la resistencia a las enfermedades.

En otros casos, se ha sugerido que las enzimas p450 están involucradas en la biosíntesis de alcaloides. La nornicotina es un alcaloide menor que se encuentra en Nicotiana tabaceum. Se ha postulado que es producido por la desmetilación mediada por p450 de la nicotina seguido por acilación y nitrosación en la posición N produciendo con ello una serie de N-acilnonicotinas y N-nitrosonornicotinas. La N-desmetilación, catalizada por una desmetilasa p450 putativa, se piensa que es una fuente primaria de la biosíntesis de nornicotina en Nicotiana. Aunque se cree que la enzima es microsomal, hasta ahora no se ha purificado con éxito una enzima nicotina desmetilasa, ni se han aislado los genes involucrados.

Además, se ha formulado la hipótesis pero no se ha comprobado, que la actividad de las enzimas p450 está controlada genéticamente y también fuertemente influenciada por factores ambientales. Por ejemplo, la desmetilación de la nicotina en Nicotiana se cree que incrementa considerablemente cuando las plantas alcanzan una etapa de madurez. Además, se ha formulado la hipótesis aún no demostrada que el gen para la desmetilasa contiene un elemento transponible que puede inhibir la traducción del ARN cuando está presente.

La gran multiplicidad de formas de la enzima p450, sus diferentes estructuras y funciones han hecho que las investigaciones sobre las enzimas p450 de Nicotiana sean muy difíciles antes de la presente invención. Además, la clonación de enzimas p450 se ha visto obstaculizada al menos en parte debido a que estas proteínas localizadas en la membrana están típicamente presentes en baja cantidad y con frecuencia son inestables para la purificación. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar las enzimas p450 en las plantas y las secuencias de ácido nucleico que están relacionadas con esas enzimas p450. En particular, sólo unas pocas proteínas del citocromo p450 han sido reportadas en Nicotiana. La presente divulgación implica el descubrimiento de un número sustancial de fragmentos de citocromo p450 que corresponden a diferentes grupos de especies de p450 con base en su identidad de secuencia.

En un primer aspecto, la presente invención está dirigida al uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 para reducir o silenciar la expresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco o en un tejido de la misma, o en un producto de tabaco elaborado a partir de dicha planta de tabaco o tejido de la misma, como se define en las reivindicaciones.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para generar una planta transgénica de Nicotiana que tiene una expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa, como se define en las reivindicaciones.

En aún otro aspecto, la invención se relaciona con un método para reducir o silenciar la expresión de nicotina desmetilasa en una planta de Nicotiana, como se define en las reivindicaciones.

Finalmente, la invención se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID No.: 181 para identificar y seleccionar plantas de Nicotiana que tienen expresión alterada de nicotina desmetilasa, como se define en las reivindicaciones.

Las plantas resultantes transformadas se evalúan con respecto a los cambios fenotípicos incluyendo, pero sin limitarse a, análisis de transcripciones de ARN endógeno para p450, péptidos expresados de p450, y concentraciones de metabolitos de la planta utilizando técnicas que se encuentran comúnmente disponibles para alguien normalmente capacitado en el arte.

En un décimo aspecto importante, la presente invención está dirigida también a la generación de líneas transgénicas de Nicotiana que tienen niveles alterados de actividad de la enzima p450. De acuerdo con la invención, estas líneas transgénicas incluyen una secuencia de ácido nucleico que es efectiva para reducir o silenciar o incrementar la expresión de nicotina desmetilasa resultando así en efectos fenotípicos en Nicotiana. La secuencia de ácido nucleico es SEQ. ID. NOS.

En un onceavo aspecto muy importante de la divulgación, las variedades cultivadas de la planta incluyen ácidos nucleicos de la presente divulgación en una capacidad reducida utilizando ya sea genes completos o fragmentos de los mismos o en una capacidad de sobreexpresión utilizando genes completos que tendrán perfiles alterados de metabolitos con relación a las plantas de control.

Se provee también un producto de tabaco que incluye hoja de tabaco (lámina y/o tallo) que tiene cantidades reducidas de nornicotina. El producto de tabaco incluye tabaco (hoja de tabaco incluyendo lámina y/o tallo) de una planta que incluye las secuencias descritas aquí o en donde los genes que codifican nitrosaminas específicas del tabaco han sido eliminados o suprimidos. La eliminación o supresión de genes que codifican nitrosaminas específicas del tabaco es efectiva para reducir las nitrosaminas específicas del tabaco en los productos de tabaco aproximadamente del 5 hasta aproximadamente el 10%, en otro aspecto aproximadamente del 10 al 20%, en otro aspecto aproximadamente del 20 al 30%, y en otro aspecto más del 30%, en comparación con los productos del tabaco elaborados a partir de plantas de tabaco en donde los genes que codifican para las nitrosaminas específicas del tabaco no han sido eliminados o suprimidos. Como se usa aquí, el producto de tabaco puede incluir cigarrillos, cigarros, tabaco de pipa, tabaco de mascar, productos mezclados con el producto de tabaco y sus mezclas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la SEQ. ID. No.: 1 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 2 del aminoácido.

La Figura 2 muestra la SEQ. ID. No.: 3 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 4 del aminoácido.

La Figura 3 muestra la SEQ. ID. No.: 5 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 6 del aminoácido.

La Figura 4 muestra la SEQ. ID. No.: 7 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 8 del aminoácido.

La Figura 5 muestra la SEQ. ID. No.: 9 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 10 del aminoácido.

La Figura 6 muestra la SEQ. ID. No.: 11 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 12 del aminoácido.

La Figura 7 muestra la SEQ. ID. No.: 13 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 14 del aminoácido.

La Figura 8 muestra la SEQ. ID. No.: 15 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 16 del aminoácido.

La Figura 9 muestra la SEQ. ID. No.: 17 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 18 del aminoácido.

La Figura 11 muestra la SEQ. ID. No.: 21 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 22 del aminoácido. La Figura 12 muestra la SEQ. ID. No.: 23 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 24 del aminoácido. La Figura 13 muestra la SEQ. ID. No.: 25 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 26 del aminoácido. La Figura 14 muestra la SEQ. ID. No.: 27 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 28 del aminoácido. La Figura 15 muestra la SEQ. ID. No.: 29 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 30 del aminoácido. La Figura 16 muestra la SEQ. ID. No.: 31 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 32 del aminoácido. La Figura 17 muestra la SEQ. ID. No.: 33 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 34 del aminoácido. La Figura 18 muestra la SEQ. ID. No.: 35 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 36 del aminoácido. La Figura 19 muestra la SEQ. ID. No.: 37 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 38 del aminoácido. La Figura 20 muestra la SEQ. ID. No.: 39 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 40 del aminoácido. La Figura 21 muestra la SEQ. ID. No.: 41 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 42 del aminoácido. La Figura 22 muestra la SEQ. ID. No.: 43 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 44 del aminoácido. La Figura 23 muestra la SEQ. ID. No.: 45 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 46 del aminoácido. La Figura 24 muestra la SEQ. ID. No.: 47 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 48 del aminoácido. La Figura 25 muestra la SEQ. ID. No.: 49 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 50 del aminoácido. La Figura 26 muestra la SEQ. ID. No.: 51 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 52 del aminoácido. La Figura 27 muestra la SEQ. ID. No.: 53 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 54 del aminoácido. La Figura 28 muestra la SEQ. ID. No.: 55 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 56 del aminoácido. La Figura 29 muestra la SEQ. ID. No.: 57 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 58 del aminoácido. La Figura 30 muestra la SEQ. ID. No.: 59 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 60 del aminoácido. La Figura 31 muestra la SEQ. ID. No.: 61 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 62 del aminoácido. La Figura 32 muestra la SEQ. ID. No.: 63 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 64 del aminoácido. La Figura 33 muestra la SEQ. ID. No.: 65 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 66 del aminoácido.

La Figura 34 muestra la SEQ. ID. No.: 67 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 68 del aminoácido. La Figura 35 muestra la SEQ. ID. No.: 69 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 70 del aminoácido. La Figura 36 muestra la SEQ. ID. No.: 71 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 72 del aminoácido. La Figura 37 muestra la SEQ. ID. No.: 73 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 74 del aminoácido. La Figura 38 muestra la SEQ. ID. No.: 75 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 76 del aminoácido. La Figura 39 muestra la SEQ. ID. No.: 77 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 78 del aminoácido.

La Figura 41 muestra la SEQ. ID. No.: 81 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 82 del aminoácido. La Figura 42 muestra la SEQ. ID. No.: 83 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 84 del aminoácido. La Figura 43 muestra la SEQ. ID. No.: 85 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 86 del aminoácido. La Figura 44 muestra la SEQ. ID. No.: 87 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 88 del aminoácido. La Figura 45 muestra la SEQ. ID. No.: 89 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 90 del aminoácido. La Figura 46 muestra la SEQ. ID. No.: 91 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 92 del aminoácido. La Figura 48 muestra la SEQ. ID. No.: 95 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 96 del aminoácido. La Figura 49 muestra la SEQ. ID. No.: 97 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 98 del aminoácido. La Figura 50 muestra la SEQ. ID. No.: 99 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 100 del aminoácido. La Figura 51 muestra la SEQ. ID. No.: 101 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 102 del aminoácido. La Figura 52 muestra la SEQ. ID. No.: 103 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 104 del aminoácido. La Figura 53 muestra la SEQ. ID. No.: 105 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 106 del aminoácido. La Figura 54 muestra la SEQ. ID. No.: 107 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 108 del aminoácido. La Figura 55 muestra la SEQ. ID. No.: 109 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 110 del aminoácido. La Figura 56 muestra la SEQ. ID. No.: 111 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 112 del aminoácido. La Figura 57 muestra la SEQ. ID. No.: 113 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 114 del aminoácido. La Figura 58 muestra la SEQ. ID. No.: 115 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 116 del aminoácido. La Figura 59 muestra la SEQ. ID. No.: 117 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 118 del aminoácido. La Figura 60 muestra la SEQ. ID. No.: 119 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 120 del aminoácido. La Figura 61 muestra la SEQ. ID. No.: 121 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 122 del aminoácido. La Figura 62 muestra la SEQ. ID. No.: 123 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 124 del aminoácido. La Figura 63 muestra la SEQ. ID. No.: 125 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 126 del aminoácido. La Figura 64 muestra la SEQ. ID. No.: 127 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 128 del aminoácido. La Figura 65 muestra la SEQ. ID. No.: 129 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 130 del aminoácido. La Figura 66 muestra la SEQ. ID. No.: 131 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 132 del aminoácido. La Figura 67 muestra la SEQ. ID. No.: 133 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 134 del aminoácido. La Figura 68 muestra la SEQ. ID. No.: 135 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 136 del aminoácido. La Figura 69 muestra la SEQ. ID. No.: 137 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 138 del aminoácido. La Figura 70 muestra la SEQ. ID. No.: 139 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 140 del aminoácido.

La Figura 73 muestra la SEQ. ID. No.: 145 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 146 del aminoácido. La Figura 74 muestra la SEQ. ID. No.: 147 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 148 del aminoácido. La Figura 75 muestra la SEQ. ID. No.: 149 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 150 del aminoácido. La Figura 76 muestra la SEQ. ID. No.: 151 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 152 del aminoácido. La Figura 77 muestra la SEQ. ID. No.: 153 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 154 del aminoácido. La Figura 78 muestra la SEQ. ID. No.: 155 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 156 del aminoácido. La Figura 79 muestra la SEQ. ID. No.: 157 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 158 del aminoácido. La Figura 80 muestra la SEQ. ID. No.: 159 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 160 del aminoácido. La Figura 81 muestra la SEQ. ID. No.: 161 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 162 del aminoácido. La Figura 82 muestra la SEQ. ID. No.: 163 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 164 del aminoácido. La Figura 83 muestra la SEQ. ID. No.: 165 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 166 del aminoácido. La Figura 84 muestra la SEQ. ID. No.: 167 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 168 del aminoácido. La Figura 85 muestra la SEQ. ID. No.: 169 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 170 del aminoácido. La Figura 86 muestra la SEQ. ID. No.: 171 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 172 del aminoácido. La Figura 87 muestra la SEQ. ID. No.: 173 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 174 del aminoácido. La Figura 88 muestra la SEQ. ID. No.: 175 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 176 del aminoácido. La Figura 89 muestra la SEQ. ID. No.: 177 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 178 del aminoácido. La Figura 90 muestra la SEQ. ID. No.: 179 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 180 del aminoácido. La Figura 91 muestra la SEQ. ID. No.: 181 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 182 del aminoácido. La Figura 92 muestra la SEQ. ID. No.: 183 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 184 del aminoácido. La Figura 93 muestra la SEQ. ID. No.: 185 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 186 del aminoácido.

La Figura 94 muestra la SEQ. ID. No.: 187 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 188 del aminoácido. La Figura 95 muestra la SEQ. ID. No.: 189 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 190 del aminoácido. La Figura 96 muestra la SEQ. ID. No.: 191 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 192 del aminoácido. La Figura 97 muestra la SEQ. ID. No.: 193 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 194 del aminoácido. La Figura 98 muestra la SEQ. ID. No.: 195 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 196 del aminoácido. La Figura 99 muestra la SEQ. ID. No.: 197 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 198 del aminoácido. La Figura 100 muestra la SEQ. ID. No.: 199 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 200 del aminoácido. La Figura 101 muestra la SEQ. ID. No.: 201 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 202 del aminoácido. La Figura 102 muestra la SEQ. ID. No.: 203 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 204 del aminoácido.

La Figura 104 muestra la SEQ. ID. No.: 207 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 208 del aminoácido. La Figura 105 muestra la SEQ. ID. No.: 209 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 210 del aminoácido. La Figura 106 muestra la SEQ. ID. No.: 211 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 212 del aminoácido. La Figura 107 muestra la SEQ. ID. No.: 213 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 214 del aminoácido. La Figura 108 muestra la SEQ. ID. No.: 215 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 216 del aminoácido. La Figura 109 muestra la SEQ. ID. No.: 217 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 218 del aminoácido. La Figura 110 muestra la SEQ. ID. No.: 219 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 220 del aminoácido. La Figura 111 muestra la SEQ. ID. No.: 221 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 222 del aminoácido. La Figura 112 muestra la SEQ. ID. No.: 223 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 224 del aminoácido. La Figura 113 muestra la SEQ. ID. No.: 225 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 226 del aminoácido. La Figura 114 muestra la SEQ. ID. No.: 227 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 228 del aminoácido. La Figura 115 muestra la SEQ. ID. No.: 229 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 230 del aminoácido. La Figura 116 muestra la SEQ. ID. No.: 231 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 232 del aminoácido. La Figura 117 muestra la SEQ. ID. No.: 233 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 234 del aminoácido. La Figura 118 muestra la SEQ. ID. No.: 235 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 236 del aminoácido. La Figura 119 muestra la SEQ. ID. No.: 237 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 238 del aminoácido. La Figura 120 muestra la SEQ. ID. No.: 239 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 240 del aminoácido. La Figura 121 muestra la SEQ. ID. No.: 241 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 242 del aminoácido. La Figura 122 muestra la SEQ. ID. No.: 243 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 244 del aminoácido. La Figura 123 muestra la SEQ. ID. No.: 245 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 246 del aminoácido. La Figura 124 muestra la SEQ. ID. No.: 247 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 248 del aminoácido. La Figura 125 muestra la SEQ. ID. No.: 249 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 250 del aminoácido. La Figura 126 muestra la SEQ. ID. No.: 251 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 252 del aminoácido. La Figura 127 muestra la SEQ. ID. No.: 253 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 254 del aminoácido. La Figura 128 muestra la SEQ. ID. No.: 255 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 256 del aminoácido. La Figura 129 muestra la SEQ. ID. No.: 257 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 258 del aminoácido. La Figura 130 muestra la SEQ. ID. No.: 259 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 260 del aminoácido. La Figura 131 muestra la SEQ. ID. No.: 261 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 262 del aminoácido. La Figura 132 muestra la SEQ. ID. No.: 263 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 264 del aminoácido.

La Figura 133 muestra la SEQ. ID. No.: 265 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 266 del aminoácido. La Figura 134 muestra la SEQ. ID. No.: 267 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 268 del aminoácido. La Figura 135 muestra la SEQ. ID. No.: 269 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 270 del aminoácido. La Figura 136 muestra la SEQ. ID. No.: 271 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 272 del aminoácido. La Figura 137 muestra la SEQ. ID. No.: 273 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 274 del aminoácido. La Figura 138 muestra la SEQ. ID. No.: 275 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 276 del aminoácido. La Figura 139 muestra la SEQ. ID. No.: 277 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 278 del aminoácido. La Figura 140 muestra la SEQ. ID. No.: 279 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 280 del aminoácido. La Figura 141 muestra la SEQ. ID. No.: 281 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 282 del aminoácido. La Figura 142 muestra la SEQ. ID. No.: 283 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 284 del aminoácido. La Figura 143 muestra la SEQ. ID. No.: 285 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 286 del aminoácido. La Figura 144 muestra la SEQ. ID. No.: 287 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 288 del aminoácido. La Figura 145 muestra la SEQ. ID. No.: 289 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 290 del aminoácido. La Figura 146 muestra la SEQ. ID. No.: 291 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 292 del aminoácido. La Figura 147 muestra la SEQ. ID. No.: 293 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 294 del aminoácido. La Figura 148 muestra la SEQ. ID. No.: 295 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 296 del aminoácido. La Figura 149 muestra la SEQ. ID. No.: 297 del ácido nucleico y la SEQ. ID. No.: 298 del aminoácido. La Figura 151 muestra una comparación de Grupos de Secuencia.

La Figura 152 ilustra la alineación de clones de longitud completa. La Figura 153 muestra un procedimiento utilizado para la clonación de fragmentos de ADNc para el citocromo p450 por medio de PCR

Descripción detallada Definiciones A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado

comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, segunda edición, John Wiley and Sons (Nueva York) le ofrece a alguien capacitado un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta memoria se incorporan aquí por referencia. Para los fines de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

"Actividad enzimática" se entiende que incluye desmetilación, hidroxilación, epoxidación, N-oxidación, sulfoxidación, N, S y O-desalquilaciones, desulfatación, desaminación, y reducción de grupos azo, nitro, y N-óxido. El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria, o sentido o antisentido, y a menos que se lo limite de otra manera, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que hibridan a ácidos nucleicos en una forma similar a nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico incluye la secuencia complementaria del mismo.

Los términos "operativamente enlazado", "en combinación operativa", y "en orden operativo" se refieren al enlazamiento funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, una secuencia señal, o disposición de los sitios de enlazamiento del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresión afecta la transcripción y/o la traducción del ácido El término "recombinante" cuando se utiliza con referencia a una célula indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, expresa dicho ácido nucleico o expresa un péptido, un péptido heterólogo, o una proteína codificada por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden expresar genes o fragmentos de genes, ya sea en forma sentido o antisentido que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden expresar genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, pero en donde los genes son modificados y reintroducidos en la célula por medios artificiales.

Un "gen estructural" es aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que codifica una proteína, un polipéptido o una porción del mismo, y excluyendo la secuencia 5' que dirige la iniciación de la transcripción. El gen estructural puede alternativamente codificar un producto no traducible. El gen estructural puede ser uno que se encuentra normalmente en la célula o uno que no se encuentra normalmente en la celular o en una ubicación celular en donde se introduce, en cuyo caso se denomina un "gen heterólogo". Un gen heterólogo puede derivarse en su totalidad o en parte de cualquier fuente conocida en el arte, incluyendo un genoma bacteriano o episoma, ADN eucariota, nuclear o plasmídico, ADNc, ADN viral o ADN sintetizado químicamente. Un gen estructural puede contener una o más modificaciones que podrían afectar la actividad biológica o sus características, la actividad biológica o la estructura química del producto de expresión, la tasa de expresión o la forma de control de la expresión. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, mutaciones, inserciones, supresiones y sustituciones de uno o más nucleótidos. El gen estructural puede constituir una secuencia de codificación ininterrumpida o puede incluir uno o más intrones, delimitados por las uniones de empalme apropiadas. El gen estructural puede ser traducible o no traducible, incluso en una orientación antisentido. El gen estructural puede ser un compuesto de segmentos derivados de una pluralidad de fuentes y de una pluralidad de secuencias de genes (de origen natural o sintético, donde sintético se refiere al ADN que se sintetiza químicamente).

"Derivado de" se usa para significar tomado, obtenido, recibido, trazado, replicado o que desciende de una fuente (química y/o biológica). Un derivado puede ser producido por manipulación química o biológica (incluyendo, pero sin limitarse a, sustitución, adición, inserción, supresión, extracción, aislamiento, mutación y replicación) de la fuente original.

"Químicamente sintetizado", en relación con una secuencia de ADN, significa que porciones de los nucleótidos componentes fueron ensamblados in vitro. La síntesis química manual del ADN puede lograrse usando procedimientos bien establecidos (Caruthers, Methodology of DNA and RNA Sequencing, (1983), Weissman (ed.), Praeger Publishers, Nueva York, Capítulo 1); la síntesis química automatizada puede realizarse utilizando una entre una cantidad de máquinas comercialmente disponibles.

El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede ser realizado por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por medio del algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por medio de búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 2444 (1988), por medio de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (BPA, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

La NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica del NCBI) (Altschul et al., 1990) está disponible a partir de diferentes fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Información Biológica (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede acceder a ellos en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia utilizando este programa se encuentra disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.

Los términos "identidad sustancial de aminoácidos" o " identidad sustancial de secuencia de aminoácidos" tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos y como se utiliza aquí denota una característica de un polipéptido, en donde el péptido comprende una secuencia que tiene al menos 70 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente 80 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente 90 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 99 a 100 por ciento de identidad de secuencia en comparación con un grupo de referencia sobre la región correspondiente al primer aminoácido después del motivo GXRXCX (G/A) del citocromo p450 para el codón de detención del péptido traducido.

Los términos "identidad sustancial de ácidos nucleicos" o "identidad sustancial de secuencia de ácidos nucleicos" tal como se aplica a las secuencias de ácidos nucleicos y como se utiliza aquí denota una característica de una secuencia de polinucleótidos, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 75 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente 81 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 91 por ciento de identidad de secuencia, y lo más preferible al menos 99 a 100 por ciento de identidad de secuencia, en comparación con un grupo de referencia sobre la región correspondiente al primer ácido nucleico después del motivo GXRXCX (G/A) del citocromo p450 para el codón de detención del péptido traducido.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5º C hasta aproximadamente 20º C, usualmente alrededor de 10º C hasta aproximadamente 15º C, inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (en virtud de la fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda emparejada. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es aproximadamente de 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es aproximadamente al menos de 60º C. Por ejemplo, en un procedimiento de hibridación estándar tipo Southern, las condiciones rigurosas incluirán un lavado inicial en 6xSSC a 42º C seguido por uno o más lavados adicionales en 0,2xSSC a una temperatura de al menos aproximadamente 55º C, típicamente aproximadamente de 60º C y, a menudo aproximadamente de 65º C.

Las secuencias de nucleótidos son también sustancialmente idénticas para los propósitos de esta invención cuando los polipéptidos y/o proteínas que ellas codifican son sustancialmente idénticos. Así pues, cuando una secuencia de ácido nucleico codifica esencialmente al mismo polipéptido que una segunda secuencia de ácido nucleico, las dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas, incluso si no se hibridaran bajo condiciones rigurosas, debido a la degeneración permitida por el código genético (véanse, Darnell et al. (1990) Molecular Cell Biology, segunda edición, Scientific American Books W. H. Freeman and Company de Nueva York para obtener una explicación de la degeneración de codones y del código genético). La pureza de la proteína o la homogeneidad pueden ser indicadas por una cantidad de medios bien conocidos en el arte, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguida por la visualización después de tinción. Para ciertos propósitos puede ser necesaria alta resolución y puede ser utilizada HPLC o un medio similar para la purificación.

Como se usa aquí, el término "vector" se utiliza en referencia a las moléculas de ácido nucleico que transfieren un segmento(s) de ADN en una célula. Un vector puede actuar para replicar el ADN y se puede reproducir de forma independiente en una célula huésped. El término "vehículo" se utiliza algunas veces de manera intercambiable con "vector". El término "vector de expresión" como se usa aquí se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas incluyen generalmente un promotor, un operador (opcional) y un sitio de enlazamiento al ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Las células eucariotas se sabe que utilizan promotores, reforzadores, y señales de terminación y de poliadenilación.

Con el fin de regenerar plantas completas modificadas por ingeniería genética con raíces, se puede insertar un ácido nucleico en células vegetales, por ejemplo, mediante cualquier técnica tal como inoculación in vivo o por medio de cualquiera de las técnicas conocidas de cultivo in vitro de tejidos para producir células vegetales transformadas que pueden ser regeneradas en plantas completas. Así, por ejemplo, la inserción en las células vegetales puede ser por medio de inoculación in vitro a través de A. tumefaciens patógeno o no patógeno. También se pueden emplear otras técnicas de cultivo de tejidos.

"Tejido vegetal" incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, raíces, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diferentes formas de células en cultivo, tales como células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo. El tejido vegetal puede ser in planta o en un órgano, tejido o cultivo celular.

"Célula vegetal" como se usa aquí, incluye células vegetales in planta y las células vegetales y protoplastos en cultivo.

"ADNc" o "ADN complementario" se refieren generalmente a una molécula de ADN monocatenario con una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una molécula de ARN. El ADNc se forma por la acción de la enzima transcriptasa inversa en un molde de ARN.

Estrategias para obtener secuencias de ácido nucleico

De acuerdo con la presente invención, el ARN se extrajo a partir de tejido de Nicotiana de líneas convertidoras y no convertidoras de Nicotiana. Los ARN extraídos se utilizaron luego para crear ADNc. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se generaron a continuación utilizando dos estrategias.

En la primera estrategia, se extrajo el ARN enriquecido con poli A a partir de tejido de la planta y se elaboró el ADNc mediante PCR de transcripción inversa. Se utilizó luego ADNc monocatenario para crear poblaciones de PCR específicas de p450 utilizando cebadores degenerados, además de un cebador inverso oligo d(T). El primer diseño se basó en los motivos altamente conservados de p450. Ejemplos de cebadores degenerados específicos se exponen en la Figura 1. Se analizaron adicionalmente los fragmentos de secuencia de plásmidos que contienen insertos de tamaño adecuado. Estos tamaños de insertos normalmente oscilan desde aproximadamente 300 hasta En una segunda estrategia, se construyó inicialmente una biblioteca de ADNc. El ADNc en los plásmidos se utilizó para crear poblaciones de PCR específicas de PCR utilizando cebadores degenerados más el cebador T7 en el plásmido como cebador inverso. Como en la primera estrategia, se analizaron adicionalmente fragmentos de secuencia de plásmidos que contenían insertos de tamaño adecuado.

Se pueden utilizar como materiales de partida líneas de plantas de Nicotiana que se sabe que producen altos niveles de nornicotina (convertidor) y líneas de plantas que tienen niveles indetectables de nornicotina.

Se pueden remover entonces las hojas de las plantas y tratarlas con etileno para activar las actividades enzimáticas de p450 definidas en este documento. El ARN total se extrae utilizando técnicas conocidas en el arte. Se pueden generar entonces fragmentos de ADNc utilizando PCR (RT-PCR) con el cebador oligo d(T) como se describe en la Figura 153. Se puede construir entonces la biblioteca de ADNc más detalladamente descrita aquí en los ejemplos.

La región conservada de enzimas de tipo p450 se puede utilizar como molde para cebadores degenerados (Figura 75). Utilizando cebadores degenerados, se pueden amplificar bandas específicas de p450 por medio de PCR. Las bandas indicativas de enzimas tipo p450 pueden ser identificadas por medio de secuenciación del ADN. Los fragmentos de PCR se puede caracterizar mediante la búsqueda y alineación con BLAST, o mediante otras herramientas para identificar a los candidatos adecuados.

La información de la secuencia de los fragmentos identificados se pueden utilizar para desarrollar cebadores de PCR. Estos cebadores en combinación de cebadores de plásmido en una biblioteca de ADNc se utilizaron para clonar los genes de longitud completa para p450. Se llevó a cabo el análisis tipo Southern inverso a gran escala para examinar la expresión diferencial para todos los clones de fragmentos obtenidos y, en algunos casos clones de longitud completa. En este aspecto de la invención, estos ensayos a gran escala tipo Southern inverso pueden llevarse a cabo utilizando los ADNc totales marcados de diferentes tejidos como una sonda para hibridar con fragmentos de ADN clonados con el fin de seleccionar todos los insertos clonados.

Se utilizaron también ensayos de transferencias tipo Northern con (32P) radiactivo y no radioactivo para caracterizar clones de fragmentos de p450 y clones de longitud completa.

Se elaboraron anticuerpos específicos de péptidos contra diferentes clones de longitud completa mediante la derivación de su secuencia de aminoácidos y seleccionando regiones peptídicas que eran antigénicas y únicas en relación con otros clones. Se elaboraron anticuerpos de conejo con péptidos sintéticos conjugados con una proteína portadora. Se llevaron a cabo análisis de transferencias tipo Western u otros métodos inmunológicos en tejido vegetal utilizando estos anticuerpos.

Las secuencias de ácido nucleico identificadas como se describió anteriormente pueden ser examinadas mediante el uso de tecnología de silenciamiento de genes inducida por virus (VIGS, Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology, 1999, 2: 109 - 113).

Se elaboraron anticuerpos específicos de péptidos para diferentes clones de longitud completa mediante la derivación de su secuencia de aminoácidos y seleccionando regiones peptídicas que eran potencialmente antigénicas y eran únicas en relación con otros clones. Se elaboraron anticuerpos de conejo con péptidos sintéticos conjugados con una proteína portadora. Se realizaron análisis de transferencias tipo Western utilizando estos anticuerpos.

En otro aspecto de la invención, se utilizó tecnología de ARN de interferencia (ARNi) para caracterizar mejor las actividades enzimáticas del citocromo p450 en plantas de Nicotiana de la presente invención. Las siguientes referencias que describen esta tecnología se incorporan aquí por referencia, Smith et al, Nature, 2000, 407: 319 320; Fire et al., Nature, 1998, 391: 306 - 311; Waterhouse et al., PNAS, 1998, 95: 13959 - 13964; Stalberg et al., Plant Molecular Biology, 1993, 23: 671 - 683; Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology, 1999, 2: 109 - 113; y Brigneti et al., EMBO Journal, 1998, 17 (22): 6739 - 6746. Las plantas pueden ser transformadas mediante técnicas de ARNi, técnicas antisentido, o una variedad de otros métodos descritos.

Existen varias técnicas para introducir material genético extraño en células vegetales, y para la obtención de plantas que mantienen estable y expresan al gen introducido. Tales técnicas incluyen la aceleración de material genético recubierto sobre micropartículas directamente en las células (las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.945.050 para Cornell y 5.141.131 para DowElanco). Las plantas pueden ser transformadas mediante tecnología de Agrobacterium, véase la patente de Los Estados Unidos No. 5.177.010 para la Universidad de Toledo, la 5.104.310 para Texas A & M, la solicitud de patente europea No. 0131624B1, las solicitudes de patente europea Nos. 120516, 159418B1, las solicitudes de patente europea Nos. 120516, 159418B1 y 176.112 para Schilperoot, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 para Schilperoot, las solicitudes de patente europea Nos. 116718 y 290799 y 320500 todos para MaxPlanck, las solicitudes de patente europea Nos.

604662 y 627752 para Japan Nicotiana, las solicitudes de patente europea Nos. 0267159, y 0292435 y la patente de los Estados Unidos Nos. 5.231.019 todos para Ciba Geigy, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.463.174 y

4.762.785 ambas para Calgene, y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.004.863 y 5.159.135 ambas para Agracetus. Otra tecnología de transformación incluye la tecnología de bigotes, véanse las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.302.523 y 5.464.765, ambas para Zeneca. La tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas, véase el documento WO 87/06614 del Boyce Thompson Institute, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.472.869 y 5.384.253 ambas de Dekalb, WO9209696 y WO9321335 ambas para PGS. Todas estas patentes y publicaciones de transformación se incorporan por referencia. Además de numerosas tecnologías para la transformación de plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes foráneos puede variar también. Tal tejido incluiría, pero no se limitaría a tejido embriogénico, tejido de callo tipo I y II, hipocotiledones, meristemo, y similares. Casi todos los tejidos de las plantas pueden ser transformados durante la desdiferenciación utilizando técnicas apropiadas que están dentro de las habilidades de una persona capacitada en el arte.

El material genético foráneo introducido en una planta puede incluir un marcador seleccionable. La preferencia por un marcador particular, queda a discreción de la persona capacitada, pero cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables puede ser utilizado junto con cualquier otro gen no enlistado en este documento que podría funcionar como un marcador seleccionable. Tales marcadores seleccionables incluyen pero no se limitan al gen para aminoglucósido fosfotransferasa del transposón Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, así como aquellos genes que codifican para la resistencia o tolerancia al glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bar); imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas de triazolopirimidina, tales como clorosulfurona; bromoxinilo, dalapon y similares.

Además de un marcador seleccionable, puede ser deseable utilizar un gen reportero. En algunos casos se puede utilizar un gen reportero sin un marcador seleccionable. Los genes reporteros son genes que típicamente no están presentes o expresados en el organismo o tejido receptor. El gen reportero típicamente codifica para una proteína que mantiene algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Ejemplos de tales genes se proporcionan en K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988), que se incorpora aquí por referencia. Los genes reporteros preferidos incluyen sin limitación el gen para la glucuronidasa (GUS) y los genes para la GFP.

Una vez introducido en el tejido de la planta, la expresión del gen estructural puede ser analizada por cualquier medio conocido en el arte, y la expresión se puede medir como ARNm transcrito, proteína sintetizada, o la cantidad de silenciamiento génico que se produce (véase la patente de los Estados Unidos No. 5.583.021 que se incorpora aquí por referencia). Se conocen técnicas para el cultivo in vitro de tejido vegetal, y en una cantidad de casos, para la regeneración en plantas enteras (solicitud EP No. 88810309.0). Los procedimientos para transferir el complejo de expresión con variedades cultivadas comercialmente útiles son conocidos por los expertos en la técnica.

Una vez se obtienen las células de plantas que expresan el nivel deseado de enzima p450, se pueden regenerar tejidos de plantas y plantas completas a partir de las mismas utilizando métodos y técnicas bien conocidas en el arte. Las plantas regeneradas son luego reproducidas por medios convencionales y los genes introducidos pueden ser transferidos a otras cepas y variedades cultivadas mediante técnicas convencionales de fitomejoramiento.

Los siguientes ejemplos ilustran métodos para llevar a cabo la invención y debe entenderse que son ilustrativos, pero no limitantes, del alcance de la invención que se define en las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo I: Desarrollo de tejido vegetal y tratamiento con etileno

Crecimiento de las Plantas

Las plantas fueron sembradas en macetas y crecieron en un invernadero durante 4 semanas. Las plántulas de 4 semanas de edad fueron trasplantadas en macetas individuales y se crecieron en el invernadero durante 2 meses. Las plantas se regaron 2 veces al día con agua que contiene 150 ppm de fertilizante NPK durante el crecimiento. Las hojas verdes desplegadas fueron separadas de las plantas para hacer el tratamiento con etileno descrito a continuación.

Línea Celular 78379

La línea de tabaco 78379, que es una línea de tabaco Burley liberado por la Universidad de Kentucky, fue utilizada como una fuente de material vegetal. Un centenar de plantas fueron cultivadas de forma estándar en el arte del cultivo de tabaco y trasplantadas y etiquetadas con un número distintivo (1 - 100). La fertilización y el manejo de campo se realizaron de acuerdo con las recomendaciones.

Tres cuartas partes de las 100 plantas convirtieron entre el 20 y el 100% de la nicotina en nornicotina. Una cuarta parte de las 100 plantas convirtieron menos del 5% de la nicotina en nornicotina. La planta número 87 tuvo al menos un conversión (2%) mientras que la planta número 21 tuvo un 100% de conversión. Las plantas que convirtieron menos del 3% fueron clasificadas como no convertidoras. Se elaboraron semillas autopolinizadas a partir de la planta número 87 y de la planta número 21, así como semillas cruzadas (21 x 87 y 87 x 21) para estudiar las diferencias genéticas y fenotípicas. Las plantas de la 21 autofecundada fueron convertidoras, y el 99% de las autopolinizadas a partir de 87 eran no convertidoras. El otro 1% de las plantas a partir de la 87 mostraron una conversión baja (5 - 15%). Las plantas provenientes de cruzamientos recíprocos eran todas los convertidoras.

Línea Celular 4407

La línea 4407 de Nicotiana, que es una línea Burley, fue utilizada como una fuente de material vegetal. Se seleccionaron y etiquetaron plantas uniformes y representativas (100). De las 100 plantas 97 eran no convertidoras y tres eran convertidoras. La planta número 56 tenía la menor cantidad de conversión (1,2%) y la planta número 58 tenía el más alto nivel de conversión (96%). Se elaboraron semillas autopolinizadas y semillas cruzadas con estas dos plantas.

Las plantas a partir de la 58 autofecundada segregaron con una relación convertidora con respecto a la no convertidora de 3:1. Las plantas 58 - 33 y 58 - 25, fueron identificadas como líneas de plantas convertidoras y no convertidoras homocigotas, respectivamente. La conversión estable de 58 - 33 fue confirmada por medio del análisis de sus progenies de la siguiente generación.

Línea Celular PBLB01

PBLB01 es una línea Burley desarrollada por ProfiGen, Inc. y fue utilizada como una fuente de material vegetal. La planta convertidora fue seleccionada a partir de semillas de PBLB01.

Procedimientos de tratamiento con etileno

Se desprendieron las hojas verdes de las plantas de 2-3 meses cultivadas en invernadero y fueron rociadas con una solución de etileno al 0,3% (Preparación de la marca Ethephon (Rhone-Poulenc)). Cada hoja rociada fue colgada en un estante de curado equipado con humidificador y cubierto con plástico. Durante el tratamiento, las hojas de muestra fueron rociadas periódicamente con la solución de etileno. Aproximadamente 24 - 48 horas después del tratamiento con etileno, las hojas fueron recolectadas para extracción del ARN. Se tomó otra submuestra para análisis del constituyente metabólico para determinar la concentración de metabolitos de la hoja y constituyentes más específicos de interés, tales como una variedad de alcaloides.

Como ejemplo, el análisis de alcaloides podría llevarse a cabo de la siguiente manera. Las muestras (0,1 g) fueron agitadas a 150 rpm con 0,5 ml de NaOH 2N, y 5 ml de una solución de extracción que contenía quinolina como patrón interno y metil-t-butil éter. Las muestras fueron analizadas en un GC HP 6890 equipado con un detector FID. Se utilizó una temperatura de 250º C para el detector y el inyector. Se utilizó una columna de HP (30 m - 0,32 nm1·m) que consta de sílice fundida entrecruzada con 5% de fenol y 95% de metil silicio con un gradiente de temperatura de 110 - 185º C a razón de 10º C por minuto. La columna fue operada a 100º C con una velocidad de flujo de 1,7 cm3min-1 con una relación de división de 40:1 con un volumen de inyección de 2,1 utilizando helio como gas de arrastre.

Ejemplo 2: Aislamiento de ARN

Para las extracciones de ARN, se trataron hojas del medio de 2 meses de edad de plantas cultivadas en invernadero con etileno como se ha descrito. Se utilizaron muestras de 0 y 24 - 48 horas para la extracción del ARN. En algunos casos, las muestras de hojas bajo el proceso de senescencia fueron tomadas de las plantas 10 días después de la remoción de la cabeza de las flores. Estas muestras fueron utilizadas también para la extracción. Se aisló el ARN total utilizando RNeasy Plant MiniKit® (Qiagen, Inc., Valencia, California) siguiendo el protocolo del fabricante.

La muestra de tejido se molió en nitrógeno líquido para obtener un polvo fino utilizando un mortero y pistilo tratados con DEPC. Aproximadamente 100 miligramos de tejido molido se transfirieron a un tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml. Este tubo con la muestra fue colocado en nitrógeno líquido hasta que se recogieron todas las muestras. Entonces, se añadieron 450 μl de amortiguador RLT como el suministrado en el kit (con la adición de Mercaptoetanol) a cada tubo individual. La muestra se agitó vigorosamente y se incubó a 56º C durante 3 minutos. Se aplicó entonces el lisado, a la columna de centrifugación QIAshredderTM asentada en un tubo de recolección de 2 ml, y se centrifugó durante 2 minutos a velocidad máxima. Se recolectó el flujo que pasó a través de la columna y se añadieron 0,5 volúmenes de etanol al lisado aclarado. La muestra se mezcló bien y se transfirió a una columna de centrifugación mini RNeasy® asentada en un tubo de recolección de 2 ml. Se centrifugó la muestra durante 1 minuto a 10.000 rpm. A continuación, se pipetearon 700 μl de amortiguador RW1 sobre la columna RNeasy® y se centrifugó durante 1 minuto a 10.000 rpm. Se pipeteó el amortiguador RPE sobre la columna RNeasy® en un nuevo tubo de recolección y se centrifugó durante 1 minuto a 10.000 rpm. Se añadió nuevamente amortiguador RPE a la columna de centrifugación RNeasy® y se centrifugó durante 2 minutos a velocidad máxima para secar la membrana. Para eliminar cualquier etanol residual, se colocó la membrana en un tubo de recolección separado y se centrifugó durante un 1 minuto adicional a velocidad máxima. Se transfirió la columna de RNeasy® a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml, y se pipetearon 40 μl de agua libre de ARNasa directamente sobre la membrana RNeasy®. Se centrifugó este tubo de elución final durante 1 minuto a 10.000 rpm. Se analizó la calidad y la cantidad del ARN total por medio de un gel de formaldehído desnaturalizado y un espectrofotómetro.

Se aisló el ARN con colas de poli (A) utilizando un kit de purificación de ARN con poli A + OligotexTM (Qiagen Inc.) siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizaron aproximadamente 200 μg de ARN total en un volumen máximo de 250 μl. Se añadieron un volumen de 250 μl de amortiguador OBB y 15 μl de suspensión OligotexTM a los 250 μl de ARN total. Se mezclaron completamente los contenidos por medio de pipeteo y se incubó durante 3 minutos a 70º C en un bloque de calentamiento. La muestra fue colocada entonces a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se sedimentó por centrifugación el complejo Oligotex:ARNm durante 2 minutos a velocidad máxima. Se removieron casi 50 μl del sobrenadante del tubo de microcentrífuga. La muestra fue tratada adicionalmente por medio del amortiguador OBB. Se resuspendió el sedimento de Oligotex:ARNm en 400 μl de amortiguador OW2 por medio de agitación tipo vórtice. Se transfirió esta mezcla a una columna de centrifugación pequeña colocada en un tubo nuevo y se centrifugó durante 1 minuto a velocidad máxima. Se transfirió la columna de centrifugación a un tubo nuevo y se añadieron 400 μl de amortiguador OW2 a la columna. Se centrifugó luego el tubo durante 1 minuto a velocidad máxima. Se transfirió la columna de centrifugación a un tubo final de microcentrífuga de 1,5 ml. Se eluyó la muestra con 60 μl de amortiguador OEB caliente (70º C). Se analizó el producto poli A mediante geles de formaldehído desnaturalizados y análisis espectrofotométrico.

Ejemplo 3: PCR de transcripción inversa

Se produjo la primera cadena de ADNc mediante la transcriptasa inversa SuperScript de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, California). La mezcla de ARN enriquecido con poli A +/cebador oligo dT constaba de menos de 5 μg de ARN total, 1 μl de mezcla de dNTP 10 mM, 1 μl de Oligo d(T)12-18 (0,5 μg/ μl), y hasta el 10 μl de agua tratada con DEPC. Cada muestra se incubó a 65º C durante 5 minutos, luego se las colocó sobre hielo durante al menos 1 minuto. Se preparó una mezcla de reacción mediante la adición de cada uno de los siguientes componentes en orden: 2 μl de amortiguador RT 10X, 4 μl de MgCl2 10 mM, 2 μl de DTT 0,1 M, y 1 μl de Inhibidor de ARNasa Recombinante RNaseOUT®. Se pipetearon 9 μl adicionales de mezcla de reacción para cada mezcla de ARN / cebador y se mezcló suavemente. Se incubó a 42º C durante 2 minutos y se añadió 1 μl de RT SuperScript IITM a cada tubo. Se incubó el tubo durante 50 minutos a 42º C. Se terminó la reacción a 70º C durante 15 minutos y se enfrió sobre hielo. Se recogió la muestra por medio de centrifugación y se añadió 1 μl de ARNasa H a cada tubo y se incubó durante 20 minutos a 37º C. Se llevó a cabo la segunda PCR con 200 pmoles de cebador hacia adelante (cebadores degenerados como en la Figura 75, SEQ. ID Nos. 149 - 156) y 100 pmoles de cebador inverso (mezcla de oligo d(T) de 18nt, seguido por 1 de base aleatoria ).

Las condiciones de reacción eran de 94º C durante 2 minutos y luego se realizaron 40 ciclos de PCR a 94º C durante 1 minuto, 45’ a 60º C durante 2 minutos, 72º C durante 3 minutos, con una extensión a 72º durante 10 minutos adicionales.

Se analizaron diez microlitros de la muestra amplificada mediante electroforesis utilizando un gel de agarosa al 1%. Se purificaron los fragmentos de tamaño correcto a partir del gel de agarosa.

Ejemplo 4: Generación de poblaciones de fragmentos de la PCR

Los fragmentos de la PCR del Ejemplo 3 se ligaron en un Easy Vector pGEM-T® (Promega, Madison, Wisconsin) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El producto ligado fue transformado en células competentes JM109 y se las sembró en placas con medio LB para selección azul / blanco. Se seleccionaron las colonias y cultivaron en una placa de 96 pozos con 1,2 ml de medio LB durante la noche a 37º C. Se generó un patrón congelado para todas las colonias seleccionadas. El ADN del plásmido de las placas se purificó mediante robótica de miniprep Biomeck 2000 de Beckman con el kit Wizard SV Miniprep® (Promega). Se eluyó el plásmido de ADN con 100 μl de agua y se almacenó en una placa de 96 pozos. Se digirieron los plásmidos por medio de EcoR1 y se analizaron utilizando gel de agarosa al 1% para confirmar la cantidad de ADN y el tamaño de los insertos. Los plásmidos que contienen un inserto de 400 - 600 pb fueron secuenciados utilizando un secuenciador CEQ 2000 (Beckman, Fullerton, California). Las secuencias fueron alineadas con la base de datos GenBank por medio de búsqueda con BLAST. Se identificaron los fragmentos relacionados con p450 y analizaron adicionalmente. Alternativamente, se aislaron los fragmentos de p450 a partir de bibliotecas de sustracción. Estos fragmentos se analizaron también como se describió anteriormente.

Ejemplo 5: Construcción de una biblioteca de ADNc

Se construyó una biblioteca de ADNc mediante la preparación de ARN total a partir de hojas tratadas con etileno e la siguiente manera. En primer lugar, se extrajo el ARN total de hojas de tabaco tratadas con etileno de la línea de tabaco 58-33 utilizando un protocolo de extracción modificado con cloroformo y fenol ácido. Se modificó el protocolo para utilizar un gramo de tejido que se molió y sometió posteriormente a agitación tipo vórtice en 5 ml de amortiguador de extracción (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5; NaCl 200 mM; EDTA 10 mM, SDS al 0,5%) al cual se le añadieron 5 ml de fenol (pH 5,5) y 5 ml de cloroformo. Se centrifugó la muestra extraída y se guardó el sobrenadante. Esta etapa de extracción se repitió 2 - 3 veces más hasta que el sobrenadante apareció claro. Se añadieron aproximadamente 5 ml de cloroformo para eliminar las trazas de fenol. Se precipitó el ARN a partir de las fracciones sobrenadantes combinadas por medio de la adición de un volumen 3 veces mayor de EtOH y 1/10 de volumen de NaOAc 3M (pH 5,2) y almacenó a -20º C durante 1 hora. Después de transferir a un contenedor de vidrio Corex se centrifugó la fracción de ARN a 9.000 rpm durante 45 minutos a 4º C. Se lavó el sedimento con etanol al 70% y se centrifugaron durante 5 minutos a 9.000 rpm a 4º C. Después de secar el precipitado, se disolvió el ARN precipitado en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. Se disolvió el ARN precipitado en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. La calidad y cantidad del ARN total fue analizada por medio de gel de formaldehído desnaturalizado y un espectrofotómetro, respectivamente.

Se aisló el ARN total resultante para el ARN con poli A + utilizando un protocolo de celulosa Oligo d(T) (Invitrogen) y columnas de centrifugación de microcentrífuga (Invitrogen) por medio del siguiente protocolo. Se sometieron aproximadamente veinte mg de ARN total a purificación dos veces para obtener ARN con poli A + de alta calidad. Se analizó el producto de ARN con poli A + mediante la realización de gel de formaldehído desnaturalizado y posterior RT-PCR de genes conocidos de longitud completa para asegurar la alta calidad del ARNm.

A continuación, se utilizó ARN con poli A + como molde para producir una biblioteca de ADNc empleando un kit de síntesis de ADNc, un kit de síntesis ZAP-ADNc®, y un kit de clonación dorado ZAP-ADNc® Gigapack® III (Stratagene, La Jolla, California). Se utilizó el método de acuerdo con el protocolo del fabricante como se especifica. Se utilizaron aproximadamente 8 μg de ARN con poli A + para construir la biblioteca de ADNc. El análisis de la biblioteca principal reveló aproximadamente 2,5 x 106 - 1 x 107 pfu. Una prueba de calidad de fondo de la biblioteca fue complementada mediante ensayos de complementación utilizando IPTG y X-gal, donde las placas recombinantes se expresaron más de 100 veces por encima de la reacción de fondo.

Un análisis más cuantitativo de la biblioteca por medio de PCR al azar mostró que el tamaño promedio del ADNc del inserto era aproximadamente de 1,2 kb. El método consistió en un método por PCR de dos etapas de la siguiente manera. Para la primera etapa, se diseñaron cebadores con base en la información preliminar de la secuencia obtenida a partir de fragmentos de p450. Se utilizaron cebadores inversos diseñados y cebadores T3 (hacia delante) amplificando los genes correspondientes a partir de la biblioteca de ADNc. Se sometieron las reacciones PCR a electroforesis en agarosa y se cortaron las bandas correspondientes de alto peso molecular, se las purificó, clonó y secuenció. En la segunda etapa, se utilizaron nuevos cebadores diseñados a partir de 5'UTR o la región de codificación inicial de p450 como los cebadores hacia adelante junto con los cebadores inversos (diseñados a partir de 3'UTR de p450) en la posterior PCR para obtener clones p450 de longitud completa.

Los fragmentos de p450 se generaron mediante amplificación por PCR a partir de la biblioteca de ADNc construida como se describe en el Ejemplo 3 con la excepción del cebador inverso. El cebador T7 situado en el plásmido secuencia abajo de los insertos de ADNc (véase la Figura 75) fue utilizado como un cebador inverso. Los fragmentos de PCR se aislaron, se clonaron y secuenciaron tal como se describe en el Ejemplo 4.

Se aislaron lo genes para p450 de longitud completa por medio del método de PCR a partir de la biblioteca construida de ADNc. Los iniciadores inversos específicos del gen (diseñados a partir de la secuencia, secuencia abajo de los fragmentos de p450) y un cebador hacia adelante (T3 en el plásmido de la biblioteca) fueron utilizados para clonar los genes de longitud completa. Se aislaron, clonaron y secuenciaron los fragmentos de la PCR. Si fuera necesario, se aplicó una segunda etapa de PCR. En la segunda etapa, se utilizaron los nuevos cebadores hacia adelante diseñados a partir de 5'UTR de los p450 clonados junto con los cebadores inversos diseñados a partir de 3'UTR de clones de p450 en las subsiguientes reacciones PCR para obtener clones de p450 de longitud completa. Los clones se secuenciaron posteriormente.

Ejemplo 6: Caracterización de fragmentos clonados - análisis de transferencias tipo Southern inverso

Los ensayos de transferencias tipo Southern inverso a gran escala no radioactivos fueron realizados sobre todos los clones de p450 identificados en los ejemplos anteriores para detectar la expresión diferencial. Se observó que el nivel de expresión entre diferentes agrupaciones de p450 era muy diferente. Además, se realizó una detección en tiempo real sobre aquellos con alta expresión.

Los procedimientos de transferencias tipo Southern no radioactivas se llevaron a cabo de la siguiente manera.

1) Se extrajo el ARN total a partir de hojas convertidoras (58-33) y no convertidoras (58-25) tratadas y no tratadas con etileno utilizando el kit RNeasy de Qiagen como se describe en el Ejemplo 2.

2) Se produjo la sonda marcando una cola de biotina de un ADNc bicatenario derivado de ARN enriquecido con poli A + generado en el paso anterior. Este ADNc monocatenario marcado fue generado por medio de RT-PCR del ARN total convertidor y no convertidor (Invitrogen), tal como se describe en el Ejemplo 3 con la excepción del uso de oligo dT biotinilado como cebador (Promega). Estos fueron utilizados como sonda para hibridar con el ADN clonado. 3) Se digirió el ADN del plásmido con la enzima de restricción EcoR1 y se lo corrió sobre geles de agarosa. Los geles fueron secados en forma simultánea y transferidos a dos membranas de nylon (Biodyne B®). Se hibridó una membrana con una sonda convertidora y la otra con la sonda no convertidora. Las membranas fueron entrecruzadas con UV (ajuste de autocruzamiento, 254 nm, Stratagene, Stratalinker) antes de la hibridación. Alternativamente, los insertos fueron amplificados por PCR a partir de cada plásmido utilizando las secuencias localizadas en ambos brazos del plásmido p-GEM, T3 y SP6, como cebadores. Los productos de PCR fueron analizados mediante haciendo corrimientos sobre geles de agarosa listos para ser utilizados de 96 pozos. Los insertos confirmados fueron punteados sobre dos membranas de nylon. Una membrana se hibridó con la sonda convertidora y la otra con la sonda no convertidora.

4) Las membranas fueron hibridadas y lavadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la modificación de la rigurosidad del lavado (kit Enzo MaxSenceTM, Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY). Las membranas fueron previamente hibridadas con amortiguador de hibridación (formamida amortiguada con SSC 2x, que contiene detergente y reforzadores de hibridación) a 42º C durante 30 min y se hibridó con 10 μl de sonda desnaturalizada durante la noche a 42º C. Las membranas fueron lavadas luego, en amortiguador de lavado para hibridación 1 vez a temperatura ambiente durante 10 minutos y 4 veces en 68º C durante 15 min. Las membranas estaban listas para la detección.

5) Las membranas lavadas fueron detectadas por medio de marcación con fosfatasa alcalina seguido por detección colorimétrica con NBT/BCIP como se describe en el procedimiento de detección del fabricante (Enzo Diagnostics, Inc.). Las membranas fueron bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente con solución de bloqueo 1x, lavadas 3 veces con reactivos de detección 1X durante 10 min, lavadas 2 veces con amortiguador de reacción de revelado previo 1x durante 5 minutos y luego se desarrollaron las transferencias en solución de revelado durante 30

-

45 min hasta que aparecieran los puntos. Todos los reactivos fueron suministrados por el fabricante (Enzo Diagnostics, Inc.). Además, se llevó a cabo también un ensayo tipo Southern inverso a gran escala utilizando un kit de hibridación y detección tipo Southern KPLTM, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KPL, Gaithersburg, Maryland).

Ejemplo 7: Caracterización de clones - análisis de transferencias tipo Northern

En forma alternativa al análisis de transferencias tipo Southern, algunas membranas fueron hibridadas y detectadas como se describe en el ejemplo de ensayos de transferencias tipo Northern. Se utilizó la hibridación tipo Northern para detectar el ARNm expresado en forma diferencial en Nicotiana de la siguiente manera.

Se utilizó un método de cebado al azar para preparar sondas de p450 clonado (Sistemas de Marcación de ADN MegaprimeTM, Amersham Biosciences).

Se mezclaron los siguientes componentes: plantilla de 25 ng de molde de ADN desnaturalizado; 4 μl de cada dTTP, dGTP y dCTP no marcado, 5 μl de amortiguador de reacción, dATP marcado con 32P y 2 μl de Klenow I; y H2O, para llevar la reacción hasta 50 μl. Se incubó la mezcla a 37º C durante 1 - 4 horas, luego se la detuvo con 2 μl de EDTA 0,5 M. Se desnaturalizó la sonda mediante la incubación a 95º C durante 5 minutos antes de usarla.

Se prepararon muestras de ARN a partir de hojas frescas tratadas y no tratadas con etileno de diferentes pares de líneas de tabaco. En algunos casos se utilizó ARN enriquecido con poli A +. Aproximadamente 15 μg de ARN total o 1,8 μg de ARNm (métodos de extracción de ARN y de ARNm tal como se describe en el Ejemplo 5) fueron llevados a un volumen igual con H2O DEPC (5 - 10 μl). Se añadió el mismo volumen de amortiguador de carga (1 x MOPS, formaldehído al 18,5%; formamida al 50%; Ficoll 400 al 4%; azul de bromofenol) y 0,5 μl de EtBr (0,5 μg / μl). Las muestras se desnaturalizaron posteriormente en preparación para la separación del ARN mediante electroforesis.

Las muestras fueron sometidas a electroforesis en un gel de formaldehído (agarosa al 1%, 1 x MOPS, formaldehído 0,6 M) con amortiguador MOP 1X (ácido morfolino propano sulfónico 0,4 M; acetato de sodio 0,1 M, H2O 3X; EDTA 10 mM; se ajusta el pH en 7,2 con NaOH). Se transfirió el ARN a una membrana Hybond-N+ (nylon, Amersham Pharmacia Biotech) por medio de un método capilar en amortiguador SSC 10X (NaCl 1,5 M; citrato sódico 0,15 M) durante 24 horas. Las membranas con las muestras de ARN fueron entrecruzadas con UV (ajuste de autocruzamiento, 254 nm, Stratagene, Stratalinker) antes de la hibridación.

La membrana fue prehibridada durante 1 - 4 horas a 42º C con 5 - 10 ml de amortiguador de prehibridación (SSC 5x, formamida al 50%, solución de Denhardt 5x; SDS al 1%; 100 μg / ml de ADN no homólogo cortado desnaturalizado con calor). Se descartó el amortiguador de prehibridación viejo, y se añadieron un nuevo amortiguador de prehibridación y sonda. La hibridación se llevó a cabo durante la noche a 42º C. La membrana se lavó durante 15 minutos con SSC 2 x a temperatura ambiente, seguido por un lavado con SSC 2x.

Un aspecto importante de la invención fue el descubrimiento de nuevos genes que pueden ser inducidos como resultado del tratamiento con etileno o que juegan un papel clave en la calidad de la hoja del tabaco y en los constituyentes. Como se ilustra en la siguiente tabla, las transferencias tipo Northern y una transferencia tipo Southern inversa fueron útiles en la determinación de qué genes fueron inducidos por tratamiento con etileno con respecto a las plantas no inducidas. Curiosamente, no todos los fragmentos fueron afectados de manera similar en la convertidora y la no convertidora. Los fragmentos del citocromo p450 de interés fueron parcialmente secuenciados para determinar su relación estructural. Esta información se usó para aislar y caracterizar posteriormente clones de gens de longitud completa de interés.

Fragmentos

Expresión de ARNm inducida por tratamiento con etileno

Convertidora

D56-AC7 (SEQ ID No.: 35)

+

D56-AG11 (SEO ID No: 31)

+

D56-AC12 (SEO ID No.: 45)

+

D70A-AB5 (SEO ID No.: 95)

+

D73-AC9 (SEO ID No.: 43)

+

D70A-AA12 (SEQ ID No.: 131)

+

D73A-AG3 (SEO ID No.: 129)

+

D34-52 (SEO ID No.: 61)

+

D56-AG6 (SEO ID No: 51)

+

10 El análisis tipo Northern se realizó utilizando los clones de longitud completa sobre tejido de tabaco obtenido a partir de las líneas Burley convertidoras y no convertidoras que fueron inducidas por tratamiento con etileno. El propósito fue identificar aquellos clones de longitud completa que mostraron una elevada expresión en las líneas convertidoras inducidas con etileno en relación con las líneas Burley no convertidoras inducidas con etileno. Al hacerlo así, se puede determinar la relación funcionalidad de los clones de longitud completa comparando las diferencias

15 bioquímicas en componentes de la hoja entre líneas convertidoras y líneas no convertidoras. Como se muestra en la tabla a continuación, seis clones mostraron una expresión significativamente más alta, que se denota con ++ y +++, en tejido convertidor tratado con etileno que aquel de tejido tratado no convertidor, denotado por +. Todos estos clones mostraron poca o ninguna expresión en líneas convertidoras y no convertidoras que no fueron tratadas con etileno.

Clones de longitud completa

Convertidora No convertidora

D101-BA2

++ +

D207-AA5

++ +

D208-AC8

+++ +

D237-AD1

++ +

D89-AB1

++ +

D90A-BB3

++ +

Ejemplo 8: Inmunodetección de los p450 codificados por los genes clonados Las regiones del péptido correspondientes a 20 - 22 aminoácidos de longitud de tres clones de p450 fueron 25 seleccionadas para 1) que tengan una homología menor o no tengan con otros clones y 2) que tengan buena 17

hidrofilicidad y antigenicidad. Las secuencias de aminoácidos de las regiones seleccionadas del péptido a partir de los respectivos clones de p450 s se enumeran a continuación. Los péptidos sintetizados se conjugaron con KHL y luego fueron inyectados en conejos. Se recolectaron los antisueros 2 y 4 semanas después de la 4ª inyección (Alpha Diagnostic International Inc., San Antonio, TX).

D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG

D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY

D89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY

Se examinaron los antisueros por reactividad cruzada frente a proteínas objetivo de los tejidos de plantas de tabaco mediante el análisis de transferencias tipo Western. Los extractos de proteína cruda fueron obtenidos a partir de hojas del medio tratadas con etileno (0 a 40 horas) de líneas convertidoras y no convertidoras. Se determinaron las concentraciones de proteína de los extractos usando el kit de ensayo de proteína RC DC (BIO-RAD) siguiendo el protocolo del fabricante.

Se cargaron dos microgramos de proteína en cada carril y se separaron las proteínas sobre geles de gradiente al 10% - 20% utilizando el sistema SDS - PAGE de Laemmli. Las proteínas fueron transferidas desde los geles hasta membranas de transferencia de nitrocelulosa PROTRAN® (Schleicher & Schuell) con la celda semiseca Trans-Blot® (BIO-RAD). Se detectaron proteínas objetivo p450 y visualizaron con el kit de detección de transferencias tipo Western ECL AdvanceTM, (Amersham Biosciences). Se elaboraron anticuerpos primarios contra los conjugados sintéticos KLH en conejos. El anticuerpo secundario contra IgG de conejo, acoplado con peroxidasa, fue adquirido a Sigma. Tanto anticuerpos primarios como secundarios fueron utilizados en diluciones 1:1000. Los anticuerpos mostraron una fuerte reactividad con una sola banda sobre las transferencias tipo Western indicando que los antisueros eran no específicos con el péptido objetivo de interés. Los antisueros eran también de reactividad cruzada con péptidos sintéticos conjugados con KLH.

Ejemplo 9: Identidad ácidos nucleicos y relación estructural de fragmentos de ácido nucleico aislados

Más de 100 fragmentos clonados de p450 fueron secuenciados junto con el análisis de transferencias tipo Northern para determinar su relación estructural. El enfoque utilizado uso cebadores hacia adelante basados en cualquiera de los dos motivos comunes de p450, localizados cerca del terminal carboxilo de los genes para p450. Los cebadores hacia adelante correspondían a los motivos FXPERF o GRRXCP (A / G) del citocromo p450 como se indica en la Figura 1. Los cebadores inversos utilizaron cebadores estándar, ya sea del plásmido SP6 o T7 localizados en ambos brazos del plásmido pGEMTM, o una cola poli A. El protocolo utilizado se describe a continuación.

Se utilizó espectrofotometría para estimar la concentración del ADN bicatenario de partida de acuerdo con el protocolo del fabricante (Beckman Coulter). Se diluyó el molde con agua hasta la concentración apropiada, desnaturalizado por calentamiento a 95º C durante 2 minutos, y posteriormente se lo colocó sobre hielo. Se preparó la reacción de secuenciación sobre hielo utilizando 0,5 a 10 μl de molde de ADN desnaturalizado, 2 μl de 1,6 pmoles del cebador hacia adelante, 8 μl de la mezcla maestra de inicio rápido DTCS y se llevó el volumen total hasta 20 μl con agua. El programa de termociclado consistió en 30 ciclos del ciclo siguiente: 96º C durante 20 segundos, 50º C durante 20 segundos y 60º C durante 4 minutos seguido por sostenimiento a 4º C.

Se detuvo la secuencia mediante la adición de 5 μl de amortiguador de detención (volumen igual de NaOAc 3 M y EDTA 100 mM y 1 μl de 20 mg / ml de glucógeno). Se precipitó la muestra con 60 μl de etanol frío al 95% y se centrifugó a 6000 g durante 6 minutos. Se descartó el etanol. Se lavó 2 veces el precipitado con 200 μl de etanol frío al 70%. Después se secó el precipitado, se añadieron 40 μl de solución de SLS y se resuspendió el precipitado. Se colocó encima una capa de aceite mineral. La muestra fue luego colocada en el secuenciador automatizado CEQ 8000 para su posterior análisis.

Con el fin de verificar las secuencias de ácido nucleico, se secuenció nuevamente la secuencia de ácido nucleico en ambas direcciones utilizando cebadores hacia adelante para la región FXPERF o GRRXCP (A / G) del gen para p450 o cebadores inversos ya sea para el plásmido o la cola de poli A. Toda la secuenciación se realizó por lo menos dos veces en ambas direcciones.

Las secuencias de ácido nucleico de fragmentos de citocromo p450 fueron comparadas entre sí a partir de la región de codificación correspondiente al primer ácido nucleico después de la región que codifica al motivo GRRXCP (A/G) a través del codón de detención. Esta región fue seleccionada como un indicador de diversidad genética entre las proteínas p450. Un gran número de genes genéticamente distintos para p450, superior a 70 genes, fueron observados, similar a aquella de otras especies vegetales. Después de la comparación de las secuencias de ácido nucleico, se encontró que los genes podrían ser colocados en diferentes grupos de secuencias con base en su identidad de secuencia. Se encontró que la única mejor agrupación de miembros de p450 era de aquellas

secuencias con una identidad de ácidos nucleicos del 75% o superior (que se muestra en la Tabla I). La reducción del porcentaje de identidad dio lugar a grupos significativamente más grandes. Se observó una agrupación preferida para aquellas secuencias con una identidad de ácidos nucleicos del 81% o mayor, una agrupación más preferida con una identidad de ácidos nucleicos del 91% o mayor, y una agrupación más preferida para aquellas secuencias con una identidad de ácidos nucleicos del 99% o mayor. La mayoría de los grupos contenían al menos dos miembros y con frecuencia tres o más miembros. Otros no fueron descubiertos en repetidas ocasiones lo que sugiere que el enfoque adoptado fue capaz de aislar tanto ARNm que se expresa en forma baja y alta en el tejido utilizado.

Con base en una identidad de ácidos nucleicos del 75% o superior, se encontró que dos grupos de citocromo p450 contienen una identidad de secuencia de ácidos nucleicos con los genes anteriores para el citocromo de tabaco que es genéticamente distinta de aquella dentro del grupo. El grupo 23, mostró una identidad de ácidos nucleicos, dentro de los parámetros utilizados para la Tabla I, con las secuencias anteriores del GenBank de GI: 1171579 (CAA64635) y GI: 14423327 (o AAK62346) para Czernic et al. y Ralston et al., respectivamente. GI: 1171579 tenía una identidad de ácidos nucleicos con los miembros del Grupo 23 que está en el rango de 96,9% a 99,5% de identidad con los miembros del Grupo 23, mientras que GI: 14423327 estaba en el rango de identidad del 95,4% al 96,9% con este grupo. Los miembros del Grupo 31 tenían una identidad de ácidos nucleicos en el rango que va desde 76,7% a 97,8% de identidad con la secuencia reportada en el GenBank de GI: 14423319 (AAK62342) para Ralston et al. Ninguno de los otros grupos de identidad de p450 de la Tabla 1 tenían identidad de parámetros, tal como se utiliza en la Tabla 1, con los genes para los p450 de Nicotiana reportados por Ralston et al., Czernic et al., Wang et al. o LaRosa y Smigocki.

Como se muestra en la Figura 76, se podría derivar la secuencia de consenso con sondas degeneradas apropiadas de ácido nucleico para el grupo para identificar y aislar preferencialmente miembros adicionales de cada grupo a partir de plantas de Nicotiana.

Tabla I: Grupos de identidad de secuencia de ácidos nucleicos para p450 de Nicotiana

Grupo

Fragmentos

1

D58-BG7 (SEQ ID No.: 1), D58-AB1 (SEQ ID No.: 3); D58-BE4 (SEQ ID No.: 7)

2

D56-AH7 (SEQ ID No.: 9); D13a-5 (SEQ ID No.: 11)

3

D56-AG10 (SEQ ID No: 13), D35-33 (SEQ ID No.: 15), D34-62 (SEQ ID No.: 17)

4

D56-AA 7 (SEQ ID No: 19), D56-AE1 (SEQ ID No.: 21); 185-DB3 (SEQ ID No.: 143)

5

D35-BB7 (SEQ ID No: 23); d177-BA7 (SEQ ID No.: 25); D56A-AB6 (SEQ ID No.: 27);

D144-AE2 (SEQ ID No.: 29)

6

D56-AG11 (SEQ ID No.: 31); D179-AA1 (SEQ ID No.: 33)

7

D56-AC7 (SEQ ID No.: 35); D144-AD1 (SEQ ID No.: 37)

8

D144-AB5 (SEQ ID No.: 39)

9

D181-AB5 (SEQ ID No.: 41), D73-AC9 (SEQ ID No.: 43)

10

D56-AC12 (SEQ ID No.: 45),

11

D58-AB9 (SEQ ID No.: 47), D56-AG9 (SEQ ID No.: 49); D56-AG6 (SEQ ID No.: 51), D35-BG11

(SEQ ID No.: 53), D35- 42 (SEQ ID No.: 55); D35-BA3 (SEQ ID No.: 57), D34-57 (SEQ ID No.:

59), D34-52 (SEQ ID No.: 61); D34-25 ( SEQ ID No.: 63)

12

D56-AD10 (SEQ ID No.: 65)

13

56-AA11 (SEQ ID No.: 67)

14

D177-BD5 (SEQ ID No.: 69); d177-BD7 (SEQ ID No.: 83)

19

15

D56A-AG10 (SEQ ID No.: 71); D58-FC5 (SEQ ID No.: 73), D58-AD12 (SEQ ID No.: 75)

16

D56-AC11 (SEQ ID No.: 77), D35-39 (SEQ ID No.: 79); D58-BH4 (SEQ ID No.: 81),

D56-AD6 (SEQ ID No.: 87)

17

D73A-AD6 (SEQ ID No.: 89); D70A-BA11 (SEQ ID No.: 91)

18

D70A-AB5 (SEQ ID No.: 95); D70A-AA8 (SEQ ID No.: 97)

19

D70A-AB8 (SEQ ID No.: 99); D70A-BH2 (SEQ ID No.: 101); D70A-AA4 (SEQ ID No.: 103)

20

D70A-BA1 (SEQ ID No.: 105); D70A-BA9 (SEQ ID No.: 107)

21

D70A-BD4 (SEQ ID No: 109.)

22

D181-AC5 (SEQ ID No.: 111); D144-AH1 (SEQ ID No.: 113); D34-65 (SEQ ID No.: 115)

23

D35-BG2 (SEQ ID No.: 117)

24

D73A-AH7 (SEQ ID No.: 119)

25

D58-AA1 (SEQ ID No.: 121); D185-BC1 (SEQ ID No.: 133); D185-BG2 (SEQ ID No.: 135)

26

D73-AE10 (SEQ ID No.: 123)

27

D56-AC12 (SEQ ID No.: 125)

28

D177-BF7 (SEQ ID No.: 127); D185-BE1 (SEQ ID No.: 137); D185-BD2 (SEQ ID No.: 139)

29

D73A-AG3 (SEQ ID No.: 129)

30

D70A-AA12 (SEQ ID No.: 131); D176-BF2 (SEQ ID No.: 85)

31

D176-BC3 (SEQ ID No.: 145)

32

D176-BB3 (SEQ ID No.: 147)

33

D186-AH4 (SEQ ID No.: 5)

Ejemplo 10: Identidad secuencia de aminoácidos relacionados de fragmentos aislados de ácido nucleico

Se dedujeron las secuencias de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico obtenidas para fragmentos del citocromo p450 del Ejemplo 8. La región deducida correspondió al aminoácido inmediatamente después del motivo de la secuencia GXRXCP (A / G) hasta el extremo del terminal carboxilo, o el codón de detención. Después de la comparación de la identidad de secuencia de los fragmentos, se observó una única agrupación para aquellas secuencias con una identidad de aminoácidos del 70% o mayor. Se observó una agrupación preferida para aquellas secuencias con una identidad de aminoácidos del 80% o mayor, más preferida con una identidad de aminoácidos del 90% o mayor, y una agrupación más preferida para aquellas secuencias con una identidad de aminoácidos del 99% o mayor. Los grupos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de los miembros del grupo se muestran en la Figura 2. Se encontró que varias de las secuencias únicas de ácido nucleico tenían una identidad completa de aminoácidos con otros fragmentos y por lo tanto, únicamente se reportó un miembro con aminoácidos idénticos.

La identidad de aminoácidos para el Grupo 19 de la Tabla II correspondió a tres grupos distintos con base en sus secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de aminoácidos de cada miembro del grupo y su identidad se muestran en la Figura 77. Las diferencias de aminoácidos están apropiadamente marcadas.

Al menos un miembro de cada grupo de identidad de aminoácidos fue seleccionado para la clonación de genes y los estudios funcionales a partir de plantas. Además, los miembros del grupo que están diferencialmente afectados por tratamiento con etileno u otras diferencias biológicas como evaluó mediante análisis tipo Northern y tipo Southern Tabla II: Grupos de identidad de secuencia de aminoácidos para p450 de Nicotiana

Grupo Fragmentos

1 D58-BG7 (SEQ ID No.: 2), D58-AB1 (SEQ ID No.: 4)

2 D58-BE4 (SEQ ID No.: 8)

3 D56-AH7 (SEQ ID No.: 10); D13a-5 (SEQ ID No.: 12)

4 D56-AG10 (SEQ ID No.: 14), D34-62 (SEQ ID No.: 18)

5 D56-AA 7 (SEQ ID No.: 20); D56-AE1 (SEQ ID No.: 22); 185-DB3 (SEQ ID No.: 144)

6 D35-BB7 (SEQ ID No.: 24); d177-BA7 (SEQ ID No.: 26); D56A-AB6 (SEQ ID No.: 28); D14 4-AE2 (SEQ ID No.: 30)

7 D56-AG11 (SEQ ID No.: 32); D179-AA1 (SEQ ID No.: 34)

8 D56-AC7 (SEQ ID No.: 36); D144-AD1 (SEQ ID No.: 38)

9 D144-AB5 (SEQ ID No.: 40)

10 D181-AB5 (SEQ ID No.: 42) D73-AC9 (SEQ ID No.: 44)

11 D56-AC12 (SEQ ID No.: 46)

12 D58-AB9 (SEQ ID No.: 48); D56-AG9 (SEQ ID No.: 50); D56-AG6 (SEQ ID No.: 52); D35-BG11 (SEQ ID No.: 54), D35- 42 (SEQ ID No.: 56); D35-BA3 (SEQ ID No.: 58), D34-57 (SEQ ID No.: 60), D34-52 (SEQ ID No.: 62)

13 D56AD10 (SEQ ID No.: 66)

14 56-AA11 (SEQ ID No.: 68)

15 D177-BD5 (SEQ ID No.: 7 0); d177-BD7 (SEQ ID No.: 84)

16 D56A-AG10 (SEQ ID No.: 72), D58-FC5 (SEQ ID No.: 74); D58-AD12 (SEQ ID No.: 76)

17 D56-AC11 (SEQ ID No.: 78), D56-AD6 (SEQ ID No.: 88)

18 D73A-AD6 (SEQ ID N º 90:)

19 D70A-AB5 (SEQ ID No.: 96); D70A-AB8 (SEQ ID No.: 100); D70A-BH2 (SEQ ID No.: 102); D70A-AA4 (SEQ ID No.: 104); D70A- BA1 (SEQ ID No.: 106); D70A-BA9 (SEQ ID No.: 108) BA1

20 D70A-BD4 (SEQ ID No.: 110)

21 D181-AC5 (SEQ ID No.: 112); D144-AH1 (SEQ ID No.: 114); D34-65 (SEQ ID No.: 116)

22 D35-BG2 (SEQ ID No.: 118)

23 D73A-AH7 (SEQ ID No.: 120)

24

D58-AA1 (SEQ ID No.: 122), D185, BC1 (SEQ ID No.: 134); D185-BG2 (SEQ ID No.: 136)

25

D73-AE10 (SEQ ID No.: 124)

26

D56-AC12 (SEQ ID No.: 126)

27

D177-BF7 (SEQ ID No.: 128); 185-BD2 (SEQ ID No.: 140)

28

D73A-AG3 (SEQ ID No.: 130)

29

D70A-AA12 (SEQ ID No.:. 132); D176-BF2 (SEQ ID No.: 86)

30

D176-BC3 (SEQ ID No.: 146)

31

D176-BB3 (SEQ ID No.: 148)

32

D186-AH4 (SEQ ID No.: 6)

Ejemplo 11: Identidad de secuencia de aminoácidos relacionada de clones de longitud completa

Se dedujo la secuencia de ácido nucleico de genes de Nicotiana de longitud completa clonados en el Ejemplo 5 por su secuencia entera de aminoácidos. Los genes para el citocromo p450 fueron identificados por la presencia de tres motivos conservados del dominio de p450, que correspondían a UXXRXXZ, PXRFXF o GXRXC en el terminal carboxilo donde U es E o K, X es cualquier aminoácido y Z es P, T, S o M . También se observó que dos de los clones parecían casi completos pero carecían del codón de detención apropiado, D130-AA1 y D101-BA2, sin embargo, pero ambos contenía los tres dominios del citocromo p450. Todos los genes para p450 fueron caracterizados por la identidad de aminoácidos utilizando un programa BLAST comparando sus secuencias de longitud completa entre sí y con genes de tabaco conocidos. El programa utilizó la herramienta BLAST especial de NCBI (Alineación de dos secuencias (b12seq), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seg/b12.html). Se alinearon dos secuencias bajo BLASTN sin filtro para secuencias de ácido nucleico y BLASTP para secuencias de aminoácidos. Con base en su porcentaje de identidad de aminoácidos, se agrupó cada secuencia en donde las agrupaciones contenían miembros que compartían al menos un identidad del 85% con otro miembro. Se observó una agrupación preferida para aquellas secuencias con una identidad de aminoácidos del 90% o mayor, una agrupación más preferida tenía una identidad de aminoácidos del 95% o mayor, y una agrupación más preferida tenía aquellas secuencias con una identidad de aminoácidos del 99% o mayor. Utilizando estos criterios, se identificaron 25 grupos únicos y se representan en la Tabla III.

Dentro de los parámetros utilizados para la Tabla III para la identidad de aminoácidos, se encontraron tres grupos que contenían una identidad mayor al 85% o superior con genes conocidos de tabaco. Los miembros del Grupo 5 tenían una identidad de aminoácidos hasta del 96% para las secuencias de longitud completa con secuencias anteriores del GenBank de GI: 14423327 (o AAK62346) de Ralston et al. El Grupo 23 tenían una identidad de aminoácidos hasta del 93% con GI: 14423328 (o AAK62347) de Ralston et al. y el Grupo 24 tenía una identidad del 92% con GI: 14423318 (o AAK62343) de Ralston et al.

Tabla III: Grupos de identidad d secuencia de aminoácidos de genes de longitud completa para p450 de Nicotiana

1 D208-AD9 (SEQ ID No.: 224); D120-AH4 (. SEQ ID No.: 180); AA8-D121 (SEQ ID No.: 182),

D122-AF10 (SEQ ID No.: 184); D103-AH3 (SEQ ID No.: 222); D208-AC8 (SEQ ID No.: 218); D-

235-ABI (SEQ ID No.: 246).

D244-AD4 (SEQ ID No.: 250); D244-AB6 (SEQ ID No.: 274); D285-AA8, D285-AB9; 2 D268-AE2 (SEQ ID No.: 270)

D100A-AC3 (SEQ ID No.: 168); D100A-BE2 3 D205-BE9 (SEQ ID No.: 276); D205-BG9 (SEQ ID No.: 202); D205-AH4 (SEQ ID No.: 294) 4 D259-AB9 (SEQ ID No.: 260); D257-AE4 (SEQ ID No.: 268); D147-AD3 (SEQ ID No.: 194) 5 D249-AE8 (SEQ ID No.: 256), D-248-AA6 (SEQ ID No.: 254.)

6 D233-GA7 (SEQ ID No.: 266; D224-BD11 (SEQ ID No.: 240); DAF10 7 D105-AD6 (SEQ ID No.: 172); D215-AB5 (SEQ ID No.: 220); D135-AE1 (SEQ ID No.: 190) 8 D87A-AF3 (SEQ ID. No.: 216), D210-BD4 (SEQ ID. No.: 262) 9 D89-AB1 (SEQ ID No.: 150); D89-AD2 (SEQ ID No.: 152); 163-AG11 (SEQ ID No.: 198); 10 AF12-163 (SEQ. ID. No.: 196)

D267-AF10 (SEQ ID No.: 296); D96-AC2 (SEQ ID No.: 160); D96-AB6 (SEQ ID No.: 158); 11 D207-AA5 (SEQ ID No.: 204); D207-AB4 (SEQ ID No.: 206);. D207-CA4 (SEQ ID No.: 208)

D98-AG1 (SEQ ID No.: 164); D98-AA1 (. SEQ ID No.: 162) 12 D209-AA12 (SEQ ID No.: 212); D209-AA11, D209-AH10 (SEQ ID No.: 214); 13 D209-AH12 (SEQ ID No.: 232); D90a-BB3 (SEQ ID. No.: 154)

D129-AD10 (SEQ ID No.: 188); D104A-AE8 (SEQ ID No.: 170) 14 D228-AH8 (SEQ ID No.: 244); D228-AD7 (SEQ ID No.: 241), D250-AC11 (SEQ ID No.: 258); 15 D247-AH1 (SEQ ID No.: 252)

D128-AB7 (SEQ ID No.: 186); D243-AA2 (SEQ ID No.: 248); D125-AF11 (SEQ ID No.: 228) 16 D284-AH5 (SEQ ID No.: 298); D110-AF12 (SEQ ID No.: 176) 17 D221-BB8 (SEQ ID. No.: 234) 18 D222-BH4 (SEQ ID. No.: 236) 19 D134-AE11 (SEQ ID. No.: 230) 20 D109-AH8 (SEQ ID. No.: 174) 21 D136-AF4 (SEQ ID. No.: 278) 22 D237-AD1 (SEQ ID. No.: 226) 23 D112-AA5 (SEQ ID. No.: 178) 24 D283-AC1 (SEQ ID. No.: 272) 25

Los genes de longitud completa fueron agrupados adicionalmente con base en la homología de aminoácidos altamente conservada entre el dominio de p450 UXXRXXZ y el dominio de p450 GXRXC cerca del extremo del terminal carboxilo. Como se muestra en la Figura 3, se alinearon los clones individuales por su homología de 5 secuencia entre los dominios conservados entre sí y se los colocó en distintos grupos de identidad. En varios casos, aunque la secuencia de ácido nucleico del clon era única, la secuencia de aminoácidos para la región era idéntica. Se observó la agrupación preferida para aquellas secuencias con una identidad de aminoácidos del 90% o mayor, un grupo más preferido tenía una identidad de aminoácidos del 95% o mayor, y una agrupación más preferida tenía aquellas secuencias con identidad de aminoácidos del 99% o mayor. La agrupación final era similar a aquella

10 basada en el porcentaje de identidad para la secuencia entera de aminoácidos de los clones excepto para el Grupo 17 (de la Tabla III) que se dividió en dos grupos distintos.

Dentro de los parámetros utilizados para la identidad de aminoácidos en la Tabla IV, se encontró que tres grupos contenían 90% o mayor identidad con genes de tabaco conocidos. Los miembros del Grupo 5 tenían una identidad de aminoácidos hasta del 93,4% para las secuencias de longitud completa con secuencia anteriores del GenBank GI: 14423326 (AAK62346) de Ralston et al. El Grupo 23 tenía una identidad de aminoácidos hasta del 91,8% con GI: 14423328 (o AAK62347) de Ralston et al. y el Grupo 24 tenía una identidad del 98,8% con GI: 14423318 (o

5 AAK62342) de Ralston et al.

Tabla IV: Grupos de identidad de secuencia de aminoácidos de regiones entre los dominios conservados de genes para p450 de Nicotiana 1 D208-AD9 (SEQ ID No.: 224); D120-AH4 (. SEQ ID No.: 180); AA8-D121 (SEQ ID No.: 182),

D122-AF10 (SEQ ID No.: 184. ); D103-AH3 (SEQ ID No.: 222); D208-AC8 (SEQ ID No.: 218); D-235-ABI (SEQ ID No.: 246). 2 D244-AD4 (SEQ ID No.: 250); D244-AB6 (SEQ ID No.: 274); D285-AA8, D285-AB9; D268-AE2 (SEQ ID No.: 270) 3 D100A-AC3 (SEQ ID No.: 168); D100A-BE2 4 D205-BE9 (SEQ ID No.: 276); D205-BG9 (SEQ ID No.: 202); D205-AH4 (SEQ ID No.: 294) 5 D259-AB9 (SEQ ID No.: 260); D257-AE4 (SEQ ID No.: 268); D147-AD3 (SEQ ID No.: 194) 6 D249-AE8 (SEQ ID No.: 256), D-248-AA6 (SEQ ID No.: 254) 7 D233-GA7 (SEQ ID No.: 266;. D224-BD11 (SEQ ID No.: 240); DAF10 8 D105-AD6 (SEQ ID No.: 172); D215-AB5 (SEQ ID No.: 220); D135-AE1 (SEQ ID No.: 190) 9 D87A-AF3 (SEQ ID No.: 216), D210-BD4 (SEQ ID No.: 262) 10 D89-AB1 (SEQ ID No.: 150); D89-AD2 (SEQ ID No.: 152); 163-AG11 (SEQ ID No.: 198); AF12-163 (SEQ ID No.: 196) 11 D267-AF10 (SEQ ID No.: 296); D96-AC2 (SEQ ID No.: 160); D96-AB6 (SEQ ID No.: 158); D207-AA5 (SEQ ID No.: 204 ); D207-AB4 (SEQ ID No.: 206); D207-CA4 (SEQ ID No.: 208) 12 D98-AG1 (SEQ ID No.: 164); D98-AA1 (. SEQ ID No.: 162) 13 D209-AA12 (SEQ ID No.: 212); D209-AA11, D209-AH10 (SEQ ID No.: 214); D209-AH12 (SEQ ID No.: 232); D90a-BB3 (SEQ ID No.: 154) 14 D129-AD10 (SEQ ID No.: 188); D104A-AE8 (SEQ ID No.: 170) 15 D228-AH8 (SEQ ID No.: 244); D228-AD7 (SEQ ID No.: 241), D250-AC11 (SEQ ID No.: 258); D247-AH1 (SEQ ID No.: 252 ) 16 D128-AB7 (SEQ ID No.: 186); D243-AA2 (SEQ ID No.: 248); D125-AF11 (SEQ ID No.: 228) 17 D284-AH5 (SEQ ID No.: 298); D110-AF12 (SEQ ID No.: 176) 18 D221-BB8 (SEQ ID No.: 234) 19 D222-BH4 (SEQ ID No.: 236) 20 D134-AE11 (SEQ ID No.: 230)

21

D109-AH8 (SEQ ID No.: 174)

22

D136-AF4 (SEQ ID No.: 278)

23

D237-AD1 (SEQ ID No.: 226)

24

D112-AA5 (SEQ ID No.: 178)

25

D283-AC1 (SEQ ID No.: 272)

26

D110-AF12 (SEQ ID No.: 176)

Ejemplo 12: Clones de citocromo p450 de Nicotiana que carecen de uno o más de los dominios específicos del citocromo p450 de tabaco

Cuatro clones tenían una alta homología de ácidos nucleicos, que van desde una homología de ácido nucleico de 90% hasta 99%, con otros genes para citocromo del tabaco reportados en la Tabla III. Los cuatro clones incluían D136-AD5, D138-AD12, D243-AB3 y D250-AC11. Sin embargo, debido a un desplazamiento del marco de nucleótidos, estos genes no contenían uno o más de tres dominios de citocromo p450 del terminal C y fueron excluidos de los grupos de identidad presentados en la Tabla III o en la Tabla IV.

La identidad de aminoácidos de un clon, D95-AG1, no contenía el tercer dominio, GXRXC, usado para el grupo de genes de tabaco para p450 en la Tabla III o en la Tabla IV. La homología de ácidos nucleicos de este clon tenía baja homología con otros genes para el citocromo del tabaco. Este clon representa un grupo nuevo y diferente de genes para el citocromo p450 en Nicotiana.

Ejemplo 13: Uso de fragmentos de citocromo p450 de Nicotiana y clones en regulación alterada de las propiedades del tabaco

El uso de fragmentos de ácido nucleico para p450 de tabaco o de genes completos es útil en la identificación y selección de aquellas plantas que tienen fenotipos alterados de tabaco o constituyentes del tabaco y, más importante, metabolitos alterados. Las plantas transgénicas de tabaco son generadas por medio de una variedad de sistemas de transformación que incorporan fragmentos de ácido nucleico o genes de longitud completa, seleccionados de aquellas reportadas aquí, en orientaciones ya sea para cualquier reducción de la expresión, por ejemplo orientación antisentido, o sobreexpresión por ejemplo, orientación sentido. Para sobreexpresión con genes de longitud completa, es deseable que cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique la totalidad o una parte funcional de la secuencia de aminoácidos de los genes de longitud completa descritos en esta invención sea efectiva para aumentar la expresión de una cierta enzima y por lo tanto traiga como resultado un efecto fenotípico dentro de Nicotiana. Las líneas de Nicotiana que sean líneas homocigóticas se obtienen a través de una serie de retrocruzamientos y se evalúan los cambios fenotípicos incluyendo, pero sin limitarse a, el análisis de ARN endógeno para p450, transcripciones, péptidos expresados p450 y concentraciones de metabolitos vegetales usando técnicas comúnmente disponibles para alguien ordinariamente capacitado en la técnica. Los cambios exhibidos en las plantas de tabaco proporcionar información sobre el papel funcional del gen seleccionado de interés

o son de utilidad como una especie preferida de planta de Nicotiana.

Ejemplo 14. Identificación de genes inducidos en líneas convertidoras tratadas con etileno

Se utilizó una tecnología de arreglos de oligonucleótidos de alta densidad, el arreglo GeneChip® de Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA), para la mediciones cuantitativas y altamente paralelas de expresión génica. En el uso de esta tecnología, se fabricaron arreglos de ácido nucleico por medio de síntesis directa de oligonucleótidos sobre una superficie sólida. Esta química en fase sólida es capaz de producir arreglos que contienen cientos de miles de sondas de oligonucleótidos empacadas con densidades extremadamente altas en un chip denominado GeneChip®. Miles de genes pueden ser seleccionados en forma simultánea a partir de una sola hibridación. Cada gen está típicamente representado por un conjunto de 11 - 25 pares de sondas dependiendo del tamaño. Las sondas están diseñadas para maximizar la sensibilidad, la especificidad y la reproducibilidad, lo que permite una discriminación consistente entre señales específicas y de fondo, y entre secuencias objetivo estrechamente relacionadas.

Los experimentos de hibridación con el GeneChip de Affymetrix involucran las siguientes etapas: el diseño y producción de arreglos, la preparación de objetivos marcados en forma fluorescente a partir del ARN aislado de las muestras biológicas, la hibridación del objetivo marcado con el GeneChip, la selección de los arreglos, y el análisis de la imagen escaneada y la generación de perfiles de expresión génica.

A. Diseño y fabricación personalizada del GeneChip de Affymetrix

Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA) elaboró un Arreglo personalizado CustomExpress Advantage de GeneChip. El tamaño del chip era de 18 micras y el formato del arreglo era de 100 - 2187 que puede acomodar 528 conjuntos de sondas (11.628 sondas). Excepto por las secuencias de ácido nucleico derivadas del GenBank, todas las secuencias fueron seleccionados a partir de nuestros clones de tabaco previamente identificados y todas las sondas fueron diseñadas a la medida. Se seleccionaron un total de 400 genes o fragmentos de tabaco para ser incluidos en el GeneChip. Las secuencias seleccionadas de oligonucleótidos se basaron en regiones únicas del extremo 3' del gen. Las secuencias seleccionadas de ácidos nucleicos consistían de 56 genes de longitud completa para p450 y 71 fragmentos de p450 que fueron clonados a partir de tabaco, que se describe en (solicitudes de patente). Otras secuencias de tabaco incluían 270 EST de tabaco que fueron generadas a partir de una biblioteca de sustracción por supresión mediante el kit SSH de Clontech (BD Biosciences, Palo Alto, CA). Entre estos genes, se seleccionaron algunas secuencias de oligonucleótidos a partir de los genes para el citocromo p450 que figuran en el GenBank. Se utilizaron hasta 25 sondas para cada gen de longitud completa y 11 sondas para cada fragmento. Se utilizó un número reducido de sondas para algunos clones debido a la falta de sondas únicas, de alta calidad. Se incluyeron también secuencias de control adecuadas en el GeneChip®.

Los arreglos de sondas eran oligonucleótidos de 25 mer que fueron directamente sintetizados sobre una oblea de vidrio por medio de una combinación de fotolitografías con base en semiconductores y tecnologías de síntesis química en fase sólida. Cada arreglo contenía hasta 100.000 sondas diferentes de oligonucleótidos. Dado que las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en lugares conocidos sobre el arreglo, los patrones de hibridación y las intensidades de señal pueden ser interpretados en términos de identidad genética y de niveles de expresión relativos por parte del software Affymetrix Microarray Suite®. Cada par de sondas consta de un oligonucleótido de correspondencia perfecta y de un oligonucleótido con falta de correspondencia. La sonda con correspondencia perfecta tiene una secuencia exactamente complementaria con el gen particular y por lo tanto mide la expresión del gen. La sonda con falta de correspondencia difiere de la sonda con correspondencia perfecta por una sola sustitución de una base en posición central, que perturba el enlazamiento de la transcripción del gen objetivo. La falta de correspondencia produce una señal de hibridación no específica o una señal de fondo que fue comparada con la señal medida por el oligonucleótido de correspondencia perfecta.

B. Preparación de la muestra

Los experimentos de hibridación fueron llevados a cabo por Genoma Exploraciones, Inc. (Memphis, TN). Las muestras de ARN utilizadas en la hibridación constaban de seis pares de líneas isogénicas convertidoras / no convertidoras que fueron inducidas por tratamientos con etileno. Las muestras incluían un par de muestras de tabaco Burley no tratado 4407 - 25/4407 - 33, tres pares de muestras 4407 - 25/4407 -33 tratadas con etileno, un par de Madole/181 de NL de tabaco oscuro tratado con etileno y un par de la variedad Burley PBLB01/178 tratada con etileno. El tratamiento con etileno se hizo como se describe en el Ejemplo 1.

El ARN total se extrajo a partir de las hojas tratadas y no tratadas con etileno mencionadas anteriormente, usando un protocolo de extracción modificado con fenol ácido y cloroformo. El protocolo fue modificado para utilizar un gramo de tejido que fue molido y posteriormente sometido a agitación tipo vórtice en 5 ml de amortiguador de extracción (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5; NaCl 200 mM; EDTA 10 mM, SDS al 0,5%) al cual se le añadieron 5 ml de fenol (pH 5,5) y 5 ml de cloroformo. La muestra extraída se centrifugó y se guardó el sobrenadante. Se repitió esta etapa de extracción 2 - 3 veces más hasta que el sobrenadante apareció claro. Se añadieron aproximadamente 5 ml de cloroformo para eliminar las trazas de fenol. Se precipitó el ARN a partir de las fracciones combinadas de sobrenadantes mediante la adición de 3 veces el volumen de EtOH y 1/10 del volumen de NaOAc 3M (pH 5,2) y se almacenó a -20º C durante 1 hora. Después de transferir a un contenedor de vidrio Corex se centrifugó la fracción de ARN a 9.000 rpm durante 45 minutos a 4º C. El sedimento fue lavado con etanol al 70% y se centrifugaron durante 5 minutos a 9.000 rpm a 4º C. Después de secar el sedimento, se disolvió el ARN precipitado en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. Se disolvió el ARN precipitado en 0,5 ml de agua libre de ARNasa. La calidad y cantidad del ARN total fue analizado por medio de un gel de formaldehído desnaturalizado y un espectrofotómetro, respectivamente. Las muestras de ARN total con 3 - 5 μg / μl fueron enviados a Genoma Explorations, Inc. para hacer la hibridación.

C. Hibridación, detección y salida de datos

La preparación del material de ARNc marcado se realizó de la siguiente manera. Se sintetizaron la primera y la segunda cadenas de ADNc a partir de 5 - 15 μg de ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc bicatenario SuperScript (Gibco Life Technologies) y el cebador oligo-dT24-T7 (5'-GGC CAG TGA TCA GTA ATA CTC CGA ACT ATA GGG AGG CGG-3 ') de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se sintetizó simultáneamente el ARNc y marcó con UTP y CTP biotinilados por medio de transcripción in vitro utilizando el promotor T7 acoplado a ADNc bicatenario como molde y el kit de Marcación de Transcripciones de ARN T7 (ENZO Diagnostics Inc.). En resumen, el ADNc bicatenario sintetizado a partir de las etapas anteriores fue lavado dos veces con etanol al 70% y se resuspendió en 22 μl de H2O libre de ARNasa. Se incubó el ADNc con 4 μl del La hibridación del arreglo de oligonucleótido y el análisis se realizaron de la siguiente manera. Se resuspendió el sedimento de ARNc en 10 μl de H2O libre de ARNasa y se fragmentaron 10,0 μg por medio de calor e hidrólisis mediada por iones a 95º C durante 35 minutos en Tris-acetato 200 mM, pH 8,1, KOAc 500 mM, MgOAc 150 mM. El ARNc fragmentado fue hibridado durante 16 horas a 45º C con arreglos de oligonucleótidos HG_U95Av2 (Affymetrix) que contenían ~12.500 genes anotados de longitud completa, junto con grupos de sondas adicionales diseñadas para representar secuencias EST. Los arreglos fueron lavados a 25º C con SSPE 6x (NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM + Tween 20 al 0,01%) seguido por un lavado riguroso a 50º C con MES 100 mM, [Na+] 0,1 M, Tween 20 al 0,01%. Los arreglos se tiñeron con estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Molecular Probes) y se determinaron las intensidades de fluorescencia usando un escáner de confocal láser (Hewlett-Packard). Las imágenes escaneadas fueron analizadas utilizando el software Microarray (Affymetrix). La carga de la muestra y las variaciones en la tinción fueron normalizadas por medio del escalamiento de la media de las intensidades de fluorescencia de todos los genes sobre un arreglo para intensidad constante objetivo (250) para todas los arreglos utilizados. El análisis de los datos se realizó utilizando Microarray Suite 5.0 (Affymetrix) siguiendo las directrices para el usuario. La intensidad de la señal para cada gen se calculó como la diferencia de la intensidad promedio, representada por [L (PM - MM) / (número de pares de sondas)], donde PM y MM denotan sondas de correspondencia perfecta y de falta de correspondencia.

D. Análisis de Datos y resultados.

Doce conjuntos de hibridaciones tuvieron éxito como lo demuestra el Reporte sobre la Expresión generado utilizando instrumentos de detección de Genoma Explorations. Los principales parámetros en el reporte incluían el Ruido, el factor de Escala, el fondo, los grupos totales de sondas, el número y porcentaje de grupos de sondas presentes y ausentes, la intensidad de la señal de los controles de mantenimiento. Los datos fueron analizados posteriormente y presentados a través del software SMOC en combinación con otro software de Microsoft. Se analizó la comparación de señales entre los pares de tratamiento. Los datos globales de todas las sondas respectivas correspondientes a los genes y los fragmentos de cada uno de diferentes tratamientos, incluyendo la replicaciones fueron recopilados y se analizaron los datos de expresión compilados tales como la recuperación de los cambios y los cambios de relación de la señal log 2.

Una aplicación típica de la tecnología del GeneChip es encontrar los genes que son expresados diferencialmente en los distintos tejidos. En la presente solicitud, las variaciones de expresión genética causados por el tratamiento con etileno se determinaron por pares de líneas de tabaco convertidoras y no convertidoras que incluían una variedad Burley 4407-25/4407-33, una variedad Burley PBLB01/178, y una variedad oscura Madole/181 de NL. Estos análisis detectaron sólo aquellos genes cuya expresión se altera significativamente debido a una variación biológica. Estos análisis emplearon el Doble cambio (relación de señal) como criterio principal para identificar los genes inducidos. Otros parámetros, tales como la intensidad de la señal, la llamada presente / ausente, también fueron tomados en cuenta.

Después de analizar los datos correspondientes a las diferencias de expresión en pares convertidores y no convertidores de muestras para aproximadamente 400 genes, los resultados con base en las intensidades de señal mostraron que únicamente dos genes, D121-AA8 y D120-AH4 y un fragmento de D35-BG11, que es fragmento parcial de D121-AA8, tenía una inducción reproducible en las líneas convertidoras versus las líneas no convertidoras tratadas con etileno. Para ilustrar la expresión diferencial de estos genes, se representaron los datos de la siguiente manera. Como se muestra en la Tabla V, se determinó la señal de un gen en una línea convertidora, por ejemplo, la variedad de tabaco Burley, 4407-33, como relación con la señal de una línea isogénica no convertidora relacionada, 4407-25. Sin el tratamiento con etileno, la relación de señales convertidoras con respecto a las no convertidoras para todos los genes alcanzó 1,00. Después del tratamiento con etileno, dos genes, D121-AA8 y D120-AH4, fueron inducidos en las líneas convertidoras en relación con la línea no convertidora según lo determinado por tres análisis independientes utilizando líneas isogénicas Burley. Estos genes tienen homología muy alta entre sí, aproximadamente del 99,8% o una homología mayor de la secuencia de ácido nucleico. Como se muestra en la Tabla V, sus señales relativas de hibridación en variedades convertidoras varió desde aproximadamente de 2 hasta 12 veces mayor en las líneas convertidoras que las señales en sus contrapartes no convertidoras. En comparación, dos clones de control tipo actina, controles internos, se encontró que no son inducidos en líneas convertidoras con base de sus relaciones normalizadas. Además, un fragmento (D35-BG11), cuya secuencia en la región de codificación está totalmente contenida tanto en los genes D121-AA8 como D120 AH4, fue altamente inducido en las mismas muestras de líneas convertidoras como no convertidoras isogénicas pareadas. Otro par isogénico de variedades de tabaco Burley, PBLB01 y 178, se demostró que tenían los mismos genes, D121-AA8 y D120-AH4, inducidos en las muestras convertidoras bajo la inducción con etileno. Por otra parte, los genes D121-AA8 y D120-AH4 fueron preferencialmente inducidos en líneas convertidoras de pares de tabaco oscuro isogénico, NL Madole y 181, lo que demuestra que la inducción con etileno de estos genes en líneas convertidoras no estaba limitada a las Tabla V: Una comparación de la inducción de clones en líneas convertidoras y no convertidoras tratadas con etileno

Clon es

Sin tratami ento Burley tratado con etileno Ejemplo 1 Burley tratado con etileno Ejemplo 2 Burley tratado con etileno Ejemplo 3 Burley tratado con etileno Ejemplo 4 Oscura tratada con etileno

Indu cido

Relació n 33:25 Relación 33:25 Relación Et:No* Relación 33:25 Relación Et:No Relación 33:25 Relación Et:No Relación 33:25 Relación Et:No Relación 181:NL Relación Et:No

D12 1-AA8

1,03 2,20 2,14 13,25 12,90 5,31 5,15 12,56 12,19 17,06 16,60

D12 0-AH4

1,44 2,74 1,90 18,33 12,74 4,13 2,87 10,87 7,55 11,76 8,17

Cont rol

Actin a tipo I (5’)

1,18 1,17 0,99 0,88 0,74 0,86 0,73 0,67 0,57 1,20 1,02

Actin a tipo I (3’)

1,09 1,23 1,12 0,89 0,81 1,18 0,11 0,86 0,79 1,02 0,93

* - Relación normalizada

Ejemplo 15: Inducción con etileno de nicotina desmetilasa microsomal en líneas convertidoras de tabaco

Los análisis bioquímicos de la actividad enzimática de la desmetilasa en fracciones microsomales enriquecidas de pares tratados y no tratados con etileno de líneas convertidoras y no convertidoras de tabaco se realizaron de la siguiente manera.

15 A. Preparación de microsomas

Se aislaron los microsomas a 4º C. Se extrajeron hojas de tabaco en un amortiguador consistente en de N-(2hidrooxietil) piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), pH 7,5, DL-ditiotreitol (DTT) 3 mM y el cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) con 1 tableta/50 ml. Se filtró el extracto crudo a través de cuatro capas de estopilla para 20 remover el tejido roto, y se centrifugó el filtrado durante 20 min a 20.000 x g para remover los desechos celulares. El sobrenadante fue sometido a ultracentrifugación a 100.000 x g durante 60 minutos y el sedimento resultante contenía la fracción microsomal. La fracción microsomal fue suspendida en el amortiguador de extracción y aplicada a una etapa de ultracentrifugación donde se utilizó un gradiente discontinuo de sacarosa con sacarosa 0,5 M en el amortiguador de extracción. Los microsomas purificados fueron resuspendidos en el amortiguador de extracción

25 suplementado con glicerol al 10% (p / v) como crioprotector. Las preparaciones microsomales se almacenaron en un congelador de nitrógeno líquido hasta su uso.

B. Determinación de la concentración de proteína

Se precipitaron las proteínas microsomales con ácido tricloroacético al 10% (TCA) (p / v) en acetona, y se determinaron las concentraciones de proteína de los microsomas utilizando el kit de análisis de proteína RC DC (BIO-RAD) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

3) Ensayo de actividad de la nicotina desmetilasa

Se obtuvo la DL-Nicotina (Pirrolidina-2-14C) de Moravek Biochemicals y tenía una actividad específica de 54 mCi / mmol. La clorpromazina (CPZ) y el citocromo c oxidado (cyt. C), ambos inhibidores de p450, se adquirieron de Sigma. La forma reducida de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) es el donante típico de electrones para el citocromo p450 a través de la NADPH: citocromo p450 reductasa. El NADPH fue omitido para la incubación de control. El ensayo enzimático de rutina consistía de proteínas microsomales (alrededor de 2 mg / ml), NADPH 6 mM, nicotina marcada con 14C 55 μM. La concentración de CPZ y de Cyt. C, cuando se usan, era de 1 mM y 100 μM, respectivamente. La reacción se llevó a cabo a 25º C durante 1 hora y fue detenida con la adición de 300 μl de metanol a cada 25 μl de la mezcla de reacción. Después de centrifugación, se separaron 20 μl del extracto en metanol con un sistema de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC) de fase reversa (Agilent) utilizando una columna de 3μ Inertsil ODS-3 (150 x 4,6 mm) de Varian. La fase móvil isocrática era la mezcla de metanol y amortiguador fosfato de potasio 50 mM, pH 6,25, con una relación de 60:40 (v / v) y la velocidad de flujo fue de 1 ml / min. El pico de nornicotina, como se determinó por comparación con nornicotina auténtica no marcada, fue recogido y sometido a un contador de centelleo líquido (LSC) 2900 tri-carb (Perkin Elmer) para la cuantificación. La actividad de la nicotina desmetilasa se calcula con base en la producción de nornicotina marcada con 14C durante 1 hora de incubación.

Las muestras se obtuvieron a partir de pares de líneas de tabaco Burley convertidoras (línea 4407-33) y no convertidoras (línea 4407-25) que fueron tratadas o no con etileno. Ninguna de las muestras no tratadas tenía alguna actividad microsomal detectable de la nicotina desmetilasa. En contraste, se encontró que las muestras microsomales obtenidas a partir de líneas convertidoras tratadas con etileno contenían niveles significativos de actividad de nicotina desmetilasa. Se mostró que la actividad de la nicotina desmetilasa es inhibida por los inhibidores específicos de p450 demostrando que la actividad de la desmetilasa era consistente con una enzima microsomal derivada p450. Un conjunto típico de resultados del ensayo con la enzima obtenidos para la línea de tabaco Burley convertidora es mostrado en la Tabla VI. En contraste, la muestra derivada de tabaco no convertidor tratado con etileno no contenía ninguna actividad de nicotina desmetilasa. Estos resultados demostraron que la actividad de la nicotina desmetilasa fue inducida por el tratamiento con etileno en líneas convertidoras pero no en la correspondiente línea isogénica no convertidora. Se obtuvieron resultados similares para un par de la variedad isogénica de tabaco oscuro, donde se indujo la actividad microsomal de la nicotina desmetilasa en líneas convertidoras y no detectable en líneas pareadas no convertidoras. En conjunto, estos experimentos demostraron que la actividad microsomal de la nicotina desmetilasa es inducida por tratamiento con etileno en líneas convertidoras mientras que no lo es en líneas no convertidoras isogénicas pareadas. Aquellos genes que son genes derivados para p450 y son preferentemente inducidos en líneas convertidoras en relación con líneas no convertidoras pareadas son genes candidatos para codificar la enzima nicotina desmetilasa.

Tabla VI: Actividad de desmetilasa en microsomas de líneas Burley convertidoras y no convertidoras inducidas con etileno

Muestra

Microsomas Microsomas + clorpromazina 1 mM Microsomas + con citocromo C 100 μM Microsomas -NADPH

Convertidora

8,3 ± 0,4 pkat / mg de proteína 0,01 ± 0,01 pkat / mg de proteína 0,2 ± 0,2 pkat / mg de proteína 0,4 ± 0,4 pkat / mg de proteína

No convertidora

No detectada No detectada No detectada No detectada

Ejemplo 16: Identificación funcional de D121-AA8 como nicotina desmetilasa

La función del clon candidato (D121-AA8), fue confirmada como el gen que codifica para nicotina desmetilasa, mediante el análisis de la actividad enzimática de p450 expresada en forma heteróloga en células de levadura.

1. Construcción del vector de expresión de levadura

La secuencia de codificación de la proteína putativa del ADNc que codifica p450 (121AA8), se clonó en el vector de expresión de levadura pYeDP60. Se introdujeron los sitios apropiados BamHI y MfeI (subrayados) a través de cebadores de PCR que contienen estas secuencias ya sea secuencia arriba del codón de inicio de la traducción (ATG) o secuencia abajo del codón de detención (TAA). El MfeI en el producto PCR amplificado es compatible con el sitio EcoRI en el vector. Los cebadores utilizados para amplificar el ADNc 121AA8 fueron 5'-TAGCTACGCGGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3' y 5'-CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGAT GCGATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC'. Un segmento de secuencia que codifica nueve aminoácidos extra en el terminal C de la proteína, incluyendo seis histidinas, fue incorporado en el cebador inverso. Esto facilita la expresión de p450 marcada con 6 X His después de la inducción. Los productos de la PCR se ligaron en el vector pYeDP60 después de digestiones enzimáticas en la orientación sentido con referencia al promotor GAL10-CYC1. Las construcciones fueron verificadas por las restricciones de la enzima y la secuenciación del ADN.

2.

Transformación de levadura

La línea de la levadura WAT11, modificada para expresar NADPH-citocromo p450 reductasa ATR1 de Arabidopsis, fue transformada con el constructo pYeDP60-plásmidos de ADNc para p450. Se mezclaron cincuenta microlitros de la suspensión de células de levadura WAT11 con ~ 1 μg de ADN de plásmido en una cubeta con una entrada para el electrodo de 0,2 cm. Se aplicó un pulso de 2,0 kV por medio de un electroporador Eppendorf (Modelo 2510). Se extendieron las células sobre placas SGI (5 g / L de ácidos bactocasamino, 6,7 g / L de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 20 g / L de glucosa, 40 mg / L de DL-triptófano, 20 g / L de agar). Los transformantes fueron confirmados por medio de análisis de PCR realizado directamente sobre colonias seleccionadas al azar.

3.

Expresión de p450 en células de levadura transformadas

Se utilizaron colonias individuales de levadura para inocular 30 mL de medio SGI (5 g / L de ácidos bactocasamino, 6,7 g / L de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 20 g / L de glucosa, 40 mg / L de DL-triptófano) y se desarrollaron a 30º C durante aproximadamente 24 horas. Una parte alícuota de este cultivo se diluyó 1:50 en 1000 mL de medio YPGE (10 g / L de extracto de levadura, 20 g / L de peptona bacto, 5 g / L de glucosa, 30 ml / L de etanol) y se cultivó hasta que la glucosa fue consumida completamente como se indica por medio del cambio colorimétrico de una tira reactiva Diastix para análisis de orina (Bayer, Elkhart, IN). La inducción de p450 clonado se inició mediante la adición de DL-galactosa hasta una concentración final del 2%. Los cultivos se desarrollaron durante 20 horas adicionales antes de ser utilizados en el ensayo de actividad in vivo o para la preparación de microsomas.

Se utilizaron células de levadura WAT11 que expresan pYeDP60-CYP71D20 (una p450 que cataliza la hidroxilación de 5-epi-aristoloqueno y 1-desoxicapsidiol en Nicotiana tabacum) como control para la expresión de p450 y ensayos de actividad enzimática.

4. Ensayo de la enzima in vivo

Se analizó la actividad de la nicotina desmetilasa en las células de levadura transformadas alimentando el cultivo de levadura con DL-Nicotina (Pirrolidina-2-14C). A 75 μl del cultivo inducido de galactosa se le añadió nicotina marcada con 14C (54 mCi / mmol) hasta una concentración final de 55 μM. El cultivo del ensayo fue incubado con agitación en tubos de polipropileno de 14 ml durante 6 horas y se extrajo con 900 μl de metanol. Después de centrifugación, se separaron 20 μl del extracto de metanol con una rp-HPLC y se cuantificó la fracción de nornicotina por medio de LSC.

El cultivo de control de WAT11 (pYeDP60-CYP71D20) no convirtió a la nicotina en nornicotina, mostrando que la cepa de levadura WAT11 no contiene las actividades enzimáticas endógenas que pueden catalizar la etapa de bioconversión de nicotina en nornicotina. En contraste, la levadura que expresa al gen 121AA8 produjo una cantidad detectable de nornicotina, indicando la actividad de la nicotina desmetilasa de esta enzima p450.

5.

Preparación de microsomas de levadura

Después de la inducción por medio de galactosa durante 20 horas, se recolectaron las células de levadura por centrifugación y se las lavó dos veces con amortiguador TES-M (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, o sorbitol 0,6 M, 2-mercaptoetanol 10 mM). Se resuspendió el sedimento en amortiguador de extracción (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, sorbitol 0,6 M, 2-mercaptoetanol 2 mM, albúmina de suero bovino al 1%, cóctel inhibidor de proteasa (Roche) a razón de 1 tableta/50 ml). Se rompieron luego las células con perlas de vidrio (0,5 mm de diámetro, Sigma). Se centrifugó el extracto celular durante 20 min a 20.000 x g para remover los desechos celulares. Se sometió el sobrenadante a ultracentrifugación a 100.000 x g durante 60 minutos y el sedimento resultante contenía la fracción microsomal. Se suspendió la fracción microsomal en amortiguador TEG-M (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, glicerol al 20% y 2-mercaptoetanol 1,5 mM) hasta una concentración de proteína de 1 mg / mL. Se almacenaron las preparaciones microsomales en un congelador de nitrógeno líquido hasta su uso.

6.

Ensayo de la actividad enzimática en preparaciones microsomales de levadura

5 Las preparaciones microsomales de células de levadura de control que expresan CYP71D20 no tenían ninguna actividad detectable de nicotina desmetilasa microsomal. En contraste, las muestras microsomales obtenidas de células de levadura que expresan al gen 121AA8 mostraron niveles significativos de actividad de nicotina desmetilasa. La actividad de la nicotina desmetilasa tenía necesidad de NADPH y ha demostrado ser inhibida por los inhibidores de específicos de p450, en forma consistente con la p450 que está siendo investigada. Un conjunto típico

10 de resultados del ensayo enzimático obtenidos para las células de levadura se muestran en la Tabla VII.

Tabla VII: Actividad de desmetilasa en los microsomas de células de levadura que expresan 121AA8 y p450 de control

Muestra

Microsomas Microsomas + clorpromazina 1 mM Microsomas + con citocromo C 100 μM Microsomas -NADPH

D121-AA8

10,8 ± 1,2* pkat / mg de proteína 1,4 ± 1,3 pkat / mg de proteína 2,4 ± 0,7 pkat / mg de proteína 0,4 ± 0,1 pkat / mg de proteína

Control (CYP71D20)

No detectada No detectada No detectada No detectada

* - Resultados promedio de 3 replicas

15 En conjunto, estos experimentos demostraron que el gen clonado de longitud completa D121-AA8 codifica la proteína citocromo p450 que cataliza la conversión de la nicotina en nornicotina cuando se expresa en levadura.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   El uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 para reducir o silenciar la expresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco o en un tejido de la misma, o en un producto de tabaco elaborado a partir de dicha planta de tabaco o tejido de la misma.

2. 2.

   El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación antisentido.

3. 3.

   El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación sentido.

4. 4.

   El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula de ácido nucleico se expresa como una molécula de ARN bicatenario.

5. 5.

   El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el producto de tabaco se selecciona del grupo que consiste de cigarrillos, cigarros, tabaco de pipa, tabaco en polvo, tabaco para mascar, productos mezclados con el producto de tabaco, y sus mezclas.

6. 6.

   El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el tejido es una hoja que incluye lámina y / o tallo.

7. 7.

   Un método para generar una planta transgénica de Nicotiana que tiene una expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa, que comprende las etapas de:

   (i)

   enlazar operativamente una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 con un promotor funcional en la planta de Nicotiana para crear un vector de transformación de la planta;

   (ii)

   transformar la planta de Nicotiana con el vector de transformación de la planta de la etapa (i);

   (iii) seleccionar una célula de la planta transformada con el vector de transformación;

   (iv)

   regenerar una planta transgénica de Nicotiana de la célula de la planta transformada; y

   (v)

   seleccionar una planta transgénica de Nicotiana que tiene expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa.

8. 8. Un método para reducir o silenciar la expresión de nicotina desmetilasa en una planta de Nicotiana, que comprende las etapas de:

   (i)

   enlazar operativamente una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No.: 181 con un promotor funcional en la planta de Nicotiana para crear un vector de transformación de la planta;

   (ii)

   transformar la planta de Nicotiana con el vector de transformación de la planta de la etapa (i);

   (iii) seleccionar una célula de la planta transformada con el vector de transformación;

   (iv)

   regenerar una planta transgénica de Nicotiana de la célula de la planta transformada; y

   (v)

   seleccionar una planta transgénica de Nicotiana que tiene expresión reducida o silenciada de nicotina desmetilasa.

9. 9.

   El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación antisentido.

10. 10.

    El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la molécula de ácido nucleico está en una orientación sentido.

11. 11.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la molécula de ácido nucleico se expresa como una molécula de ARN bicatenario.

12. 12.

    El uso de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID No.: 181 para identificar y seleccionar plantas de Nicotiana que tienen expresión alterada de nicotina desmetilasa.

13. 13.

    El uso de la reivindicación 12, en donde la identificación comprende la etapa de hibridar, bajo condiciones rigurosas, materiales de ácido nucleico de la planta a partir de plantas Nicotiana con una sonda de ácido nucleico que hibrida a la SEQ ID NO:181 bajo condiciones que incluyen un lavado en SSC 0,2X a una temperatura de 65°C.

14. 14.

    El uso de la reivindicación 12, en donde la identificación comprende la etapa de llevar a cabo una PCR sobre material de ácido nucleico de la plantas de Nicotiana por la presencia de un gen de longitud completa que hibrida

15. 15.

    El uso de la reivindicación 12, en donde la identificación comprende la etapa de hibridar materiales de ácido nucleico de la planta a partir de plantas de Nicotiana con un arreglo de oligonucleótidos de alta densidad, dicho

    5 arreglo comprendiendo sondas de oligonucleótido que tienen secuencias de nucleótidos a partir de un gen de longitud completa que hibrida a la SEQ ID NO: 181 bajo condiciones rigurosas que incluyen un lavado en SSC 0,2X a una temperatura de 65°C.
16. 16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13 - 15, en donde dicha hibridación de ácido nucleico es una hibridación de transferencias tipo Southern.

    10 17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13 - 15, en donde dicha hibridación de ácido nucleico es una hibridación de transferencias tipo Northern.
17. 18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 12 - 17, en donde dichas plantas de Nicotiana comprende una o más plantas convertidoras o no convertidoras.
18. 19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 12 - 18, que comprende además la etapa de seleccionar dicha al 15 menos una planta identificada como parte de un programa de fitomejoramiento o un programa de mutagénesis.

19. 20.

    El uso de la reivindicación 19, en donde dicho programa de fitomejoramiento comprende el uso de una variedad tradicional o una variedad transgénica.

20. 21.

    El uso de cualquiera de las reivindicaciones 12 - 20, en donde dichas plantas comprenden una pluralidad de plantas de Nicotiana tabacum.

    FIG. 75

    NOMBRE D89-AB1 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 149

    SEQ. ID. NO. 150

    NOMBRE D95-AG1 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 155 NOMBRE D96-AB6 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 157

    SEQ. ID. NO. 170

    NOMBRE D110-AF12 (166, 1631) ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 175

    NOMBRE D112-AA5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 177

    NOMBRE D163-AF12 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 195 NOMBRE D163-AG11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 197

    SEQ. ID. NO. 208

    ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

    SEQ. ID. NO. 215

    NOMBRE D208-AC8 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 217

    NOMBRE D222-BH4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 235 NOMBRE D224-AF10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 237

    NOMBRE D249-AE8 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 255 NOMBRE D250-AC11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 257

    SEQ. ID. NO. 258

    NOMBRE D205-BE9 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 275 NOMBRE D136-AF4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 277

    SEQ. ID. NO. 282

    NOMBRE D267-AF10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 295 NOMBRE D284-AH5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 297

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 1

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 2

    10 PORCENTAJE DE IDENTIDAD GRUPO 2

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 3

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 4

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 4

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 5

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 6

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 7

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 7

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 9

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 9

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 14

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 14

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 15

    FIGURA 151: COMPARACIÓN DE GRUPOS DE SEQUENCIA

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 15

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 16

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 16

    10 ALINEAMIENTO DEL GRUPO 17

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 18

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 18

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 19

    10 PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 19

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 20

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 22

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 22

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 25

    ALINEAMIENTO DEL GRUPO 28

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 28

    PORCENTAJE DE IDENTIDAD DEL GRUPO 30

    Figura 153: Clonación de Fragmentos de ADNc para Citocromo p450 por medio de PCR