ES2376331T3 - Método de electroforesis y dispositivo para separar objetos. - Google Patents

Abstract

Un método de electroforesis para separar objetos (10) en un fluido (9) contenido en un canal (2) de separación, comprendiendo el método: aplicar un campo eléctrico (E) a lo largo del canal (2) de separación, teniendo el campo eléctrico un perfil de campo, y causando de este modo que al menos alguno de los objetos (10) se muevan en relación al fluido (9); variar el campo eléctrico (E) aplicado para ajustar el perfil de campo en relación al canal (2) de separación, causando de este modo que los objetos (10) se separen en bandas bajo las influencias combinadas de una fuerza eléctrica (Fe) debida al campo eléctrico y una fuerza hidrodinámica (Fh) debida al fluido; caracterizado porque el perfil del campo eléctrico es conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto (10), que resulta de la combinación de la fuerza eléctrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinámica ejercida por el fluido, es tal que la anchura de cada banda separada permanece sustancialmente constante con el tiempo; y en el que el fluido (9) y el canal (2) de separación están sustancialmente estacionarios uno con respecto al otro

Description

Metodo de electroforesis y dispositivo para separar objetos.

Esta invenci6n se refiere a un metodo y dispositivo para llevar a cabo la separaci6n electroforetica de objetos en un fluido. La tecnica descrita elimina la difusi6n de bandas y consigue una separaci6n rapida, de alta resoluci6n.

La electroforesis se refiere al movimiento de objetos cargados a traves de un fluido bajo la influencia de un campo electrico. Este fen6meno se puede usar para separar objetos segun sus propiedades electricas e hidrodinamicas, y estan en uso generalizado varias tecnicas para explotar esto. Los objetos a ser separados, comunmente protefnas u otras biomoleculas, se suspenden tfpicamente en un fluido tal como una disoluci6n amortiguadora o un gel. Una pequefa secci6n de la disoluci6n que contiene los objetos se coloca en el principio de un canal de separaci6n que contiene un fluido o gel y posteriormente se genera un campo electrico constante a lo largo del canal. Bajo la influencia de este campo, dichos objetos empiezan a moverse hacia el extremo opuesto del canal. Mientras migran a traves del fluido, experimentan una fuerza hidrodinamica diferencial que depende de su forma y tamafo. Debido a esta diferente fuerza hidrodinamica aplicada a ellos, los objetos se mueven con diferente velocidad terminal dependiendo de sus caracterfsticas individuales, y por tanto se separan y formas "bandas". Debido a sus diferentes velocidades terminales, la distancia entre las bandas aumenta con el tiempo.

Una banda es esencialmente un grupo de objetos que tienen propiedades electricas e hidrodinamicas similares. Una de las desventajas clave de la electroforesis es el hecho de que las bandas, mientras se mueven a su velocidad terminal, sufren difusi6n termica. Esto hace que las bandas se ensanchen con el tiempo, reduciendo la resoluci6n de la separaci6n.

Se revisan diversas implementaciones conocidas de la electroforesis en "Cyclic electrophoretic and chromatographic separation methods", Eijkel et al, Electrophoresis 2004, 25, 243-252.

El documento US-A-5126022 describe un dispositivo de electroforesis en el que se aplica una pluralidad de campos electricos para mover moleculas cargadas a traves de un medio. Mezclas de moleculas cargadas son arrastradas a traves del gel por la fuerza de los campos electricos. Los campos se activan preferiblemente de manera simultanea

o secuencial uno despues de otro a diversas velocidades, para crear distribuciones de fuerza complejas u ondas de campo en movimiento a lo largo del medio de separaci6n. Las moleculas cargadas capaces de moverse rapidamente a traves del gel seran movidas a lo largo por las ondas de campo en movimiento mas rapidas y seran separadas de moleculas en movimiento mas lentas.

Hay tambien un numero de variantes al metodo de electroforesis convencional que intentan limitar la difusi6n termica.

Un metodo tal es el Enfoque Isoelectrico (IEF, por sus siglas en ingles) que emplea un gradiente de pH en el canal de separaci6n. Mientras los objetos se mueven a traves del fluido bajo la influencia de un campo electrico constante, su carga aparente cambia debido al pH cambiante a lo largo del canal. Cada objeto, dependiendo de sus caracterfsticas de carga, se mueve hasta un punto donde su carga aparente es cero. Esto se llama el "punto isoelectrico". En ese punto el objeto deja de moverse, ya que alcanza una posici6n de equilibrio. Cada objeto con diferentes caracterfsticas de carga se detiene en un punto diferente a lo largo del canal, y por tanto tiene lugar una separaci6n de los objetos. Las bandas de los objetos pueden ser entonces detectadas e investigadas, por ejemplo por generaci6n de imagenes.

La ventaja de este metodo es la eliminaci6n de la difusi6n termica, y la desventaja es la limitada precisi6n del gradiente de pH. Otra desventaja son los tiempos de separaci6n aumentados (tfpicamente muchas horas).

Se describe otra variante de electroforesis en el documento US-A-2002/0043462. Las partfculas son separadas aplicando una primera fuerza que resulta del flujo del amortiguador a traves de la camara, al que se opone un gradiente de campo electrico. La forma del campo electrico estatico es tal que las partfculas se separan en bandas a lo largo de la camara. Las bandas representan posiciones de equilibrio en las que la fuerza neta sobre cada molecula es cero. Una vez que se forman las bandas, el campo electrico aplicado puede ser modificado para manipular las bandas, por ejemplo moviendo una banda de interes hasta un punto de salida. Sin embargo, como en el caso de otros sistemas conocidos, el dispositivo depende de un flujo constante de amortiguador a traves de la camara para imponer la fuerza hidrodinamica apropiada sobre cada partfcula y conseguir por tanto una separaci6n exitosa. Esto conduce a varios problemas.

En primer lugar, el equipo de bombeo y monitorizaci6n requerido para conseguir el altamente preciso flujo de lfquido a traves del canal conduce a una infraestructura potencialmente cara y complicada. Como resultado, los sistemas son tfpicamente costosos y pueden no ser fiables, comprendiendo varios componentes mecanicos complejos. La precisi6n del flujo de amortiguador es esencial para la precisi6n y resoluci6n del dispositivo.

En segundo lugar, un problema comun asociado al uso de lfquidos que fluyen, y que se experimenta mucho en procedimientos de cromatograffa lfquida de alta resoluci6n (HPLC) que usan flujo impulsado por presi6n, es que el lfquido interactua con las paredes del canal. Como resultado, el lfquido no fluye con una velocidad constante a

traves de la secci6n transversal del canal, sino que mas bien se mueve lentamente en la parte adyacente a las paredes y mas rapido hacia el centro del canal. Esto crea un frente de velocidad parab6lico, lo que afecta directamente a la forma de las bandas de las moleculas separadas. Cuanto mayor es la desviaci6n desde un frente de velocidad constante, mas anchas se hacen las bandas, reduciendose asf la resoluci6n en el dispositivo. El proceso de separaci6n puede ser acelerado aumentando el caudal del amortiguador. Esto es porque el tiempo empleado por las moleculas para alcanzar su posici6n de equilibrio se acorta, y de ahf que la separaci6n se complete mas rapidamente. En un primer metodo, aumentar el caudal tambien debe estrechar las bandas estacionarias, porque las fuerzas hidrodinamicas y electricas ejercidas son mas grandes. Esto darfa como resultado una resoluci6n mejorada.

Sin embargo, mientras el caudal es aumentado, el perfil de flujo parab6lico se hace mas acentuado, tendiendo a suprimir la mejora en resoluci6n esperada.

La electroforesis convencional implica a menudo el uso de geles como fluido de separaci6n. La relativamente alta viscosidad reduce la difusi6n y por tanto mejora la resoluci6n. Sin embargo, es diffcil, si no imposible, usar geles con tecnicas que requieren flujo de amortiguadores (tales como los dos metodos mencionados anteriormente) porque los geles, de manera general, no fluyen facilmente.

Lo que se necesita es una tecnica que controle de manera eficaz la difusi6n termica y que elimine la necesidad de un flujo constante del fluido de separaci6n a traves del aparato. Tal metodo debe conseguir una rapida separaci6n y una alta resoluci6n.

De acuerdo con la presente invenci6n, un metodo de electroforesis para separar objetos en un fluido contenido en un canal de separaci6n comprende los rasgos de la reivindicaci6n 1.

Ademas, de acuerdo con la presente invenci6n, un dispositivo de electroforesis para separar objetos comprende los rasgos de la reivindicaci6n 27.

Se apreciara que el termino "fluido" se usa aquf para describir cualquier medio de separaci6n apropiado. Por ejemplo, el fluido podrfa ser un lfquido o un gel capaz de generar fuerzas friccionales o hidrodinamicas sobre un objeto en movimiento.

Variando el campo electrico aplicado en relaci6n al canal de separaci6n desde sustancialmente el comienzo del proceso de separaci6n (a diferencia de despues de que se formen las bandas), los objetos pueden ser separados en bandas sin necesidad de un flujo de fluido a traves del canal de separaci6n. El campo electrico aplicado establece un perfil de campo variante en el tiempo, lo que consigue la separaci6n electroforetica forzando a las partfculas a moverse a traves del fluido, que puede ser por tanto estacionario en sf mismo. Se debe hacer notar que el campo electrico no es constante (con respecto al canal) a lo largo de al menos una parte del perfil del campo. En otras palabras, se aplica un gradiente de campo electrico variante en el tiempo (distinto de cero). Como resultado, los objetos se separan en bandas en movimiento que no se ensanchan con el tiempo.

Esto acaba con la necesidad de equipos de bombeo caros y complicados, y elimina los problemas asociados con el frente de velocidad parab6lico encontrado en los sistemas convencionales. Ademas, la tecnica se presta bien al uso de un gel como fluido de separaci6n, dado que no se requiere flujo de fluido. El campo electrico particular y su variaci6n dependeran de los tipos de objetos a ser separados y del fluido usado como medio de separaci6n. Preferiblemente, sin embargo, el campo electrico es variado de tal manera que el perfil del campo se mueve en relaci6n al canal de separaci6n.

El perfil del campo podrfa cambiar en forma y/o intensidad mientras se mueve, pero mas preferiblemente, el perfil del campo permanece sin cambios mientras se mueve en relaci6n al canal de separaci6n (es decir, mantiene su forma e intensidad). Por regla general, es conveniente que las bandas sean separadas a lo largo del canal, y por tanto es preferible que el campo electrico sea variado de una manera tal que el perfil del campo electrico se traslade a lo largo del canal de separaci6n.

Como ya se describi6, es ventajoso que el flujo de fluido pueda ser eliminado, y por lo tanto el fluido y el canal de separaci6n sean sustancialmente estacionarios uno con respecto al otro.

La forma particular del campo electrico aplicado sera seleccionada segun el rendimiento deseado del dispositivo. Segun la invenci6n, el perfil del campo electrico esta conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto, que resulta de la combinaci6n de la fuerza electrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinamica ejercida por el fluido, es tal que la anchura de cada banda separada permanece sustancialmente constante con el tiempo.

El perfil del campo es tal que las bandas adquieren una anchura finita (tfpicamente a lo largo del canal de separaci6n), y la difusi6n de los objetos en cada banda es limitada o confinada de tal modo que la anchura de las bandas no cambia con el tiempo, siempre y cuando las condiciones experimentales permanezcan iguales. En adelante, esto se denomina "difusi6n limitada".

Una vez que los objetos son separados en bandas, el campo electrico podrfa ser retirado. Sin embargo, es ventajoso continuar la aplicaci6n del campo y variarlo de tal modo que, una vez que los objetos se han separado en bandas, cada banda se mueva con una velocidad terminal distinta de cero en relaci6n al canal de separaci6n. Esto mantiene una alta resoluci6n, dado que las bandas continuamente en movimiento no se difunden a lo largo del tiempo.

En las separaciones electroforeticas convencionales, las bandas diferentes se mueven con velocidades terminales diferentes. En otras palabras, mientras se mueven a traves del amortiguador o el gel, se separan mas y mas unas de otras. Suponiendo que el aumento en la distancia relativa es mas rapido que el ensanchamiento de las bandas debido a la difusi6n, la resoluci6n de la electroforesis aumenta, con longitudes de separaci6n mas grandes (es decir, canales de separaci6n mas largo). Sin embargo, las sefales se debilitan con el tiempo debido a la difusi6n, y los canales de separaci6n muy largos no son practicos. Por lo tanto, en la practica se puede producir "perdida de bandas" cuando las bandas alcanzan el extremo del canal. En contraste, en la presente invenci6n, es preferible que las bandas se muevan con una velocidad terminal sustancialmente igual. Por lo tanto la eficacia de separaci6n no depende de la longitud del canal de separaci6n, sino por el contrario de las caracterfsticas del campo electrico variante en el tiempo aplicado y las caracterfsticas del amortiguador de separaci6n. Preferiblemente, la velocidad terminal de cada banda es esencialmente la misma, y por tanto el espaciado entre cada una es mantenido. Mas preferiblemente, la velocidad terminal es constante a lo largo del tiempo.

El campo electrico aplicado es de la forma

donde x es una coordenada espacial, tfpicamente a lo largo del canal de separaci6n, t es una coordenada temporal, n y k son cada uno numeros reales y n no es cero. En otras palabras, E(x, t) puede ser cualquier funci6n de x-kt, incluyendo lineal, exponencial o un polinomio a la enesima potencia. Ademas, es ventajoso que al menos una parte del campo electrico sea monot6nico con respecto a la distancia a lo largo del canal (x). Esto facilita la separaci6n de moleculas de la muestra y el confinamiento de la difusi6n de bandas.

Convenientemente, el metodo comprende ademas las etapas de mezclar los objetos a ser separados con el fluido y colocar la mezcla en el canal de separaci6n. Alternativamente, se podrfa colocar el fluido en el canal de separaci6n y despues insertar la muestra, comprendiendo la muestra al menos objetos a ser separados. La muestra podrfa comprender ademas fluido, que puede o no ser el mismo que el fluido ya contenido en el canal de separaci6n. Estas etapas podrfan tener lugar antes de la aplicaci6n del campo electrico o una vez que el campo es establecido. En algunos aspectos de la carga de muestras, la muestra puede ser introducida en el canal mientras el campo esta conectado. Esto es especialmente util para separaciones en bucle cerrado. Por ejemplo, en secuenciaci6n de ADN, tienen lugar cuatro inyecciones independientes en un unico experimento de separaci6n. Las inyecciones secuenciales pueden ser utiles en muchas aplicaciones, y aquellas se producirfan, de manera general, con el campo electrico conectado de antemano.

Preferiblemente, el metodo comprende ademas la etapa de detectar las bandas. Por regla general, se generan imagenes de las bandas. La generaci6n de imagenes o la detecci6n puede tener lugar despues de haberse completado la separaci6n o durante todo el proceso de separaci6n. De hecho, pueden extraerse conclusiones utiles de los "perfiles crecientes" de las bandas como una funci6n del tiempo. En particular, los perfiles crecientes de bandas en relaci6n a las inyecciones secuenciales pueden ser muy utiles para correlacionar esas bandas con una inyecci6n dada, por ejemplo en secuenciaci6n de ADN.

Ventajosamente, el metodo comprende ademas la etapa de modificar el campo electrico, despues de que los objetos se han separado en bandas, para ajustar el espaciado entre las bandas, el posicionamiento de las bandas o la resoluci6n de las bandas. Esto se puede conseguir cambiando la forma del perfil del campo electrico, su intensidad o su posici6n a lo largo del canal de separaci6n, por ejemplo. Esto se puede usar para ver un intervalo de bandas diferente, mover una banda a un punto particular a lo largo del canal de separaci6n o ajustar el numero de bandas que son resolubles, por ejemplo. En particular, el campo electrico puede ser modificado por cambios en su dependencia del tiempo y/o su intensidad.

Algunas aplicaciones implican retirar ciertos objetos separados de la mezcla de la muestra. En tales casos, es preferible que el metodo comprenda ademas la etapa de extraer una banda de interes del canal de separaci6n despues de que los objetos se han separado.

Ventajosamente, el metodo comprende ademas la etapa de hacer oscilar el campo electrico, causando que el movimiento de las bandas se invierta en direcci6n, moviendose asf las bandas hacia delante y hacia atras a lo largo del canal de separaci6n. Esto permite que se genere una imagen de cada banda o se detecte de otro modo repetidamente, y por tanto puede aumentar la sensibilidad del dispositivo para componentes en baja concentraci6n. Esto se puede conseguir tambien causando que las bandas viajen en circuitos alrededor de un canal de separaci6n de bucle cerrado.

En otras realizaciones, el canal de separaci6n es un bucle cerrado, y en este caso es preferible que el campo electrico aplicado sea peri6dico alrededor del bucle. En todas las realizaciones, los medios para aplicar el campo electrico podrfan comprender cualquier aparato conformador de campos conocido, por ejemplo una resistencia variable a lo largo del canal. Preferiblemente, sin embargo, los medios para aplicar un campo electrico comprenden una pluralidad de electrodos espaciados a lo largo del canal de separaci6n. Esta tecnica permite una conformaci6n precisa y elaborada del campo electrico, y se controla convenientemente variando el voltaje aplicado a cada electrodo individualmente. Es preferible que los electrodos esten espaciados del interior del canal de separaci6n de tal modo que no conduzca corriente entre los electrodos y el fluido. Esto evita el flujo de corriente a traves del fluido de separaci6n, y por tanto impide un excesivo calentamiento de Joule, el cual puede conducir a un comportamiento erratico en el sistema. Convenientemente, los electrodos comprenden tinta conductora impresa en o adyacente al canal de separaci6n.

Ventajosamente, al menos algunos de la pluralidad de electrodos estan espaciados del interior del canal de separaci6n por una capa de un material electricamente resistivo. De esta manera, el campo electrico establecido dentro del canal es mas suave, menos distorsionado por los efectos locales de los electrodos. El material resistivo es preferiblemente un semiconductor o semiconductor dopado, lo mas preferiblemente silicio dopado.

Preferiblemente, el canal de separaci6n es un capilar. Tales dimensiones permiten que el campo electrico sea controlado de manera precisa a traves de la secci6n transversal del canal, y conducen a bandas bien definidas incluso con muestras de concentraci6n baja. En una realizaci6n preferida, el canal de separaci6n es rectilfneo. Alternativamente, el canal de separaci6n podrfa estar en la forma de un bucle cerrado. Este podrfa ser sustancialmente circular o, preferiblemente, tener secciones lineales.

Convenientemente, el canal de separaci6n es grabado en un sustrato tal como una placa de vidrio. Esto proporciona una manera conveniente de implementar el dispositivo en una escala muy pequefa. Preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo microflufdico.

Ventajosamente, el dispositivo comprende una pluralidad de canales de separaci6n, estando cada canal de separaci6n provisto de medios para aplicar el campo electrico, y un controlador. El campo electrico aplicado a cada canal de separaci6n podrfa ser elegido individualmente segun los objetos a ser separados en cada canal. Preferiblemente, sin embargo, el campo electrico aplicado a cada canal de separaci6n es el mismo. Convenientemente, el campo electrico aplicado a cada canal de separaci6n es controlado por el mismo controlador. Preferiblemente, los objetos a ser separados comprenden biomoleculas, protefnas, polfmeros, ADN, ARN o celulas biol6gicas.

Un ejemplo de un dispositivo y metodo de electroforesis de acuerdo con la presente invenci6n sera descrito ahora con referencia a las siguientes figuras.

La Figura 1 es una representaci6n esquematica de un dispositivo de electroforesis;

Las Figuras 2a, b y c son graficos que representan perfiles de campo electrico ejemplares y su variaci6n con el tiempo;

Las Figuras 3a y 3b son graficos que ilustran las fuerzas a las que la partfcula es sometida;

La Figura 4 muestra la convergencia de la velocidad con el tiempo de una molecula ejemplar que sufre separaci6n;

La Figura 5 es un grafico que ilustra la co-migraci6n de partfculas identicas;

La Figura 6 representa una primera realizaci6n de una parte de un dispositivo electroforetico para separar objetos;

La Figura 7 representa una segunda realizaci6n de una parte de un dispositivo electroforetico para separar objetos;

La Figura 8 representa una tercera realizaci6n de una parte de un dispositivo electroforetico para separar objetos;

La Figura 9 muestra la configuraci6n de un canal de separaci6n para una cuarta realizaci6n de un dispositivo electroforetico para separar objetos;

La Figura 10 ilustra la separaci6n de bandas en un canal curvo sin correcci6n de velocidad;

La Figura 11 ilustra la separaci6n de bandas en un canal curvo con correcci6n de velocidad;

La Figura 12 es un grafico que ilustra un gradiente de campo electrico dual;

La Figura 13 muestra una primera configuraci6n de electrodos ejemplar;

La Figura 14 muestra una segunda configuraci6n de electrodos ejemplar;

La Figura 15 muestra una tercera configuraci6n de electrodos ejemplar;

La Figura 16 muestra una cuarta configuraci6n de electrodos ejemplar;

La Figura 17 es una vista en secci6n transversal de la configuraci6n ejemplar mostrada en la Figura 16, tomada a lo largo de la lfnea Q-Q';

La Figura 18A representa esquematicamente una parte de una quinta configuraci6n de electrodos ejemplar en vista en planta;

La Figura 18B muestra las lfneas de campo electrico calculadas para la quinta configuraci6n de electrodos;

La Figura 18C es un grafico que muestra la distribuci6n de voltaje a lo largo del centro del canal representado en la Figura 18A;

La Figura 18D es un grafico que muestra la distribuci6n del campo electrico a lo largo del centro del canal representado en la Figura 18A;

La Figura 19A representa esquematicamente una parte de una sexta configuraci6n de electrodos ejemplar en vista en planta;

La Figura 19B muestra las lfneas de campo electrico calculadas para la sexta configuraci6n de electrodos;

La Figura 19C es un grafico que muestra la distribuci6n de voltaje a lo largo del centro del canal representado en la Figura 19A; y

La Figura 19D es un grafico que muestra la distribuci6n del voltaje a lo largo del centro del canal representado en la Figura 19A;

La Figura 20 muestra una primera realizaci6n de un detector para el uso con un dispositivo electroforetico para separar objetos;

La Figura 21 muestra una segunda realizaci6n de un detector para el uso con un dispositivo electroforetico para separar objetos;

La Figura 22 representa esquematicamente la etapa de introducir una muestra en un canal de separaci6n usando tecnicas convencionales;

Las Figuras 23 y 24 muestran dos metodos de introducci6n de una muestra en un canal de separaci6n que se pueden emplear en el uso de un dispositivo electroforetico como el descrito en la presente memoria;

Las Figuras 25 a 28 son graficos que ilustran la secuenciaci6n de una cadena de ADN ejemplar;

Las Figuras 29a, b y c son graficos que representan dos bandas de ADN separadas bajo condiciones de electroforesis capilar convencional;

Las Figuras 30a, b y c son graficos que representan dos bandas de ADN separadas bajo condiciones similares usando un dispositivo como el descrito en la presente memoria; y

Las Figuras 31a, b y c representan dos bandas de ADN, que representan moleculas mas largas, separadas bajo condiciones similares usando un dispositivo como el descrito en la presente memoria.

El dispositivo 1 electroforetico comprende un canal 2 de separaci6n, que podrfa ser implementado en un chip capilar

o microflufdico por ejemplo, medios 3 para aplicar un campo electrico a lo largo del canal 2 de separaci6n y un controlador 4 para controlar al menos el campo electrico. El canal 2 de separaci6n contiene un fluido 9 que puede ser un amortiguador de elecci6n o un gel, por ejemplo. Los objetos 10 a ser separados se suspenden dentro del fluido 9 en el canal 2 de separaci6n. El dispositivo 1 puede estar provisto ademas de un detector 6, que puede comunicarse con el controlador 4, y orificios 7 y 8 de entrada y salida respectivamente, que tambien pueden ser controlador por el controlador 4. El controlador 4 a su vez genera una salida 5.

Como se describira en mas detalle mas adelante, el canal 2 de separaci6n podrfa tomar cualquier forma, incluyendo lineal o curvada. En algunas realizaciones, el canal de separaci6n puede formar un bucle cerrado. Los medios 3 de aplicaci6n del campo electrico podrfan comprender electrodos conformadores de campo o una resistencia variable a lo largo del canal 2, por ejemplo. Los objetos a ser separados incluyen, de manera general, al menos algunos cuerpos cargados, y tfpicamente comprenden polfmeros tales como protefnas, moleculas de ADN o moleculas de ARN u otros tipos de biomoleculas, tal como celulas biol6gicas. El fluido 9 de separaci6n particular seleccionado dependera de los objetos 10 a ser separados. Por ejemplo, el fluido podrfa ser un lfquido tal como un amortiguador. Alternativamente, el fluido podrfa ser un gel. La fuerza friccional es similar a, pero no la misma que, la fuerza hidrodinamica, ya que obedece diferentes leyes. De hecho, se podrfa seleccionar cualquier matriz de fluido o de gel que pudiera generar fuerzas friccionales o hidrodinamicas sobre un objeto en migraci6n (p.ej., una macromolecula). Ventajosamente, se puede emplear un gel como medio de separaci6n, lo que reduce la difusi6n no deseada de los

objetos separados aun mas debido a su viscosidad aumentada. Esto, de manera general, no es posible en los sistemas convencionales que requieren un flujo de fluido constante.

En el funcionamiento, un campo electrico E es aplicado por los medios 3 conformadores de campo a lo largo del canal 2 de separaci6n. El controlador 4 incluye un m6dulo 4a que controla los medios 3 de aplicaci6n del campo electrico para inducir un campo electrico variante en el tiempo sobre el canal 2 de separaci6n y su contenido. El campo electrico ejerce una fuerza Fe sobre cada objeto 10 que es proporcional a su carga q. Esto causa que el objeto 10 se mueva en relaci6n al fluido 9, que induce una fuerza hidrodinamica (friccional) FT sobre el objeto. Por ejemplo, tres objetos tales y las fuerzas sobre cada uno se muestran esquematicamente en la Figura 1.

La variaci6n en el tiempo del campo electrico se calcula para forzar a los objetos 10 en el canal 2 de separaci6n a que empiecen a moverse y converger en bandas que se mueven a lo largo del canal 2 de separaci6n y que no se difunden (ensanchan). Se pueden generar imagenes de las bandas en movimiento, o ser detectadas de otro modo, mediante un detector 6 que se comunica con otro m6dulo 4b de control. Si se desea, se pueden extraer bandas seleccionadas de interes del canal 2 de separaci6n por medio de un orificio 8 de salida, tambien controlado por un m6dulo 4c del controlador 4.

La forma y caracterfsticas particulares del campo electrico se seleccionaran segun el tipo de objetos 10 a ser separados y las propiedades del fluido 9 de separaci6n. Sin embargo, en todos los casos, el campo electrico tendra un perfil de campo. En otras palabras, el valor del campo electrico varfa a lo largo de al menos una parte de la longitud del canal de separaci6n, es decir, se emplea un gradiente de campo electrico variante en el tiempo. El campo electrico E variante en el tiempo aplicado al canal 2 es de la forma:

(1.1)

donde x es la coordenada espacial (tfpicamente la distancia a lo largo del canal 2 de separaci6n), t es el tiempo y n y k son numeros reales constantes (ℜ).

Se entendera que el campo electrico podrfa ser lineal o un polinomio de enesima potencia. Se muestran ejemplos esquematicos de perfiles de campo lineales y no lineales en las Figuras 2a, 2b y 2c. El perfil del campo es monot6nico, esto es, su primera derivada (con respecto a la distancia a lo largo del canal) no cambia de signo. Esto facilita la separaci6n de moleculas de la muestra y el confinamiento de la difusi6n de bandas. El perfil debe tener el signo correcto en relaci6n al parametro k. El campo electrico es continuo a lo largo del perfil del campo, es decir, no hay saltos repentinos en el campo. Se debe hacer notar ademas que el perfil del campo puede moverse en cualquier direcci6n (+x o -x) a lo largo del canal de separaci6n.

S6lo a modo de ejemplo, los autores de la invenci6n examinaran el caso mas simple de un perfil de campo lineal donde n=1 (a y c se introducen como constantes):

(1.2)

Esta forma de campo se representa esquematicamente en la Figura 2a para una serie de tiempos crecientes t1, t2 y t3. N6tese que el perfil de campo se mueve de manera efectiva a lo largo del eje x.

Para una partfcula u objeto 10 con carga q, la fuerza electrica Fe es:

(1.3)

En la presente invenci6n, la partfcula 10 se movera dentro del fluido 9 y por lo tanto habra una fuerza friccional (hidrodinamica) FT, que se opone a su movimiento. Esta fuerza, en el caso simplificado general, sera de la forma:

(1.4)

donde v(x,t) es la velocidad de la partfcula 10 y f es un coeficiente que describe la intensidad de la fricci6n y que

depende de la forma y tamafo de la partfcula 10. Cuando es sometido a estas dos fuerzas, cada objeto 10 intentara migrar a su posici6n de equilibrio (energfa mas baja), en la cual Fe -FT = 0. Esto se identifica como X* en la Figura 3a, y se mueve con velocidad k. Por ejemplo, supongamos que dos partfculas identicas empiezan en las posiciones x1 y x2 (Figura 3b). En x1, la fuerza electrica es mayor que la fuerza electrica en X*, que a su vez es mayor que la fuerza electrica en x2. Esto da como resultado velocidades separadas que son v1>k>v2.

Por lo tanto, el objeto que empez6 en x1 se mueve mas rapido que k y alcanza al punto en movimiento X* (que se mueve con velocidad k). Mientras el objeto esta alcanzando a X*, se mueve relativamente al perfil de fuerza electrica hacia valores mas bajos, y por lo tanto se decelera hasta que alcanza la velocidad k. Entonces su posici6n relativa al perfil de fuerza permanece constante y por lo tanto se mueve con velocidad terminal constante k desde entonces en adelante.

La Figura 3b muestra c6mo dos partfculas identicas adquiriran velocidades adaptadas para co-migrar finalmente con velocidad k.

El objetivo ahora es calcular la velocidad v(x,t) (relativa al canal de separaci6n). Para un conjunto dado de condiciones iniciales de la partfcula 10, s6lo una coordenada es independiente, es decir, t. Por lo tanto, necesitamos calcular v(t) y x(t). La aceleraci6n del objeto 10 depende de la fuerza neta que resulta de las influencias combinadas de la fuerza electrica y la fuerza friccional, las cuales se oponen tfpicamente una a la otra (vease la Figura 1). Esto da:

(1.5)

donde m es la masa de la partfcula 10. Por sustituci6n, lo anterior se convierte en:

(1.6)

Diferenciando la ecuaci6n anterior para t (y cambiando la notaci6n) obtenemos:

(1.7)

donde x'(t) = v(t). Por tanto, lo anterior se convierte en una ecuaci6n diferencial lineal de segundo orden:

(1.8)

que tiene la siguiente soluci6n:

(1.9)

donde A y B son constantes que dependen de las condiciones iniciales. El primer termino puede ser potencialmente divergente para t - 0. Sin embargo, si se satisface la siguiente condici6n:

(1.10)

el termino izquierdo de (1.9) desaparece para t - 0. Para t=0 podemos elegir la velocidad a ser Vo :

(1.11)

Necesitamos una condici6n inicial adicional para determinar A. Diferenciando la ec. (1.9) para t=0 obtenemos:

(1.12)

Para t=0 por definici6n x=x0 y la ec. (1.6) da:

(1.13)

15 Equiparando (1.12) y (1.13) podemos solucionar para A:

(1.14)

20 Sustituyendo en la ec. (1.11) obtenemos la soluci6n final para B:

(1.15)

Ahora hemos calculado ambos parametros A y B en terminos de las condiciones iniciales �t=0, x=x0 y v=v0� y por 25 tanto ahora conocemos la velocidad v(t) de la ec. (1.9).

Suponiendo que la condici6n (1.10) se mantiene, vemos que:

(1.16)

30 por lo tanto la velocidad de la partfcula 10 converge a una velocidad terminal que es igual al parametro del campo k. Ademas, a partir de la ec. (1.16) observamos que la velocidad convergera a k sin importar los valores de f, a, q y m. En otras palabras, todas las partfculas de todas las formas, tamafos y carga electrica (a condici6n de que el signo de la carga este alineado correctamente con el campo electrico como requiere la condici6n (1.10)) convergeran a la misma velocidad terminal k.

35 La Figura 4 muestra la aplicaci6n de las ecuaciones de movimiento a una molecula con caracterfsticas arbitrarias. La velocidad converge a una meseta, que es la velocidad terminal.

A fin de diferenciar entre bandas, las partfculas con diferentes caracterfsticas de forma y carga deben separarse ffsicamente unas de otras y formar bandas distinguidas. Convenientemente, todos los objetos 10 (y por tanto las bandas) deben alcanzar la misma velocidad terminal, que debe ser constante. Si todas las partfculas 10 alcanzaran

40 la misma velocidad terminal y co-migraran de un modo sobreimpuesto, entonces el dispositivo no serfa eficaz. La posici6n espacial de una partfcula 10 es:

(1.17)

Sustituyendo la ec. (1.9) a lo anterior e integrando, obtenemos:

(1.18)

y asf:

(1.19)

Una vez que la partfcula 10 ha alcanzado la velocidad terminal, los terminos exponenciales son muy pequefos, y la 15 ec. (1.19) se convierte en:

(1.20)

Esto significa que cada partfcula 10 se movera una distancia determinada por su velocidad terminal mas una

20 cantidad fija que dependera de las caracterfsticas de carga, masa y fricci6n de la partfcula. Por lo tanto, las partfculas diferentes migraran con la misma velocidad pero a una distancia fija unas de otras.

Las partfculas identicas incluso co-migran si su origen x0 es diferente. Esto se puede demostrar considerando dos partfculas identicas que parten de dos posiciones diferentes x1, x2. Sustrayendo la ec. (1.20) para ambas partfculas obtenemos:

(1.21)

Por lo tanto, las partfculas identicas co-migraran incluso si parten de un origen diferente a lo largo del canal de separaci6n. La Figura 5 demuestra esto usando dos pares de partfculas identicas. Las partfculas (1) y (4) comparten 30 caracterfsticas electricas e hidrodinamicas similares, como lo hacen los objetos (2) y (3). Cada partfcula en el par parte en una posici6n diferente a lo largo del eje x. Aplicando un campo variante en el tiempo apropiado, las partfculas siguen trayectorias que hacen a las partfculas identicas co-migrar. Los pares diferentes se mueven con la misma velocidad pero a una distancia unos de otros. Controlando el parametro de campo k y la intensidad a, la resoluci6n (es decir, la anchura de las bandas y/o el espaciado a lo largo del eje x) del dispositivo puede ser

35 ajustada. Tambien el intervalo dinamico (el intervalo de caracterfsticas de carga, masa y fricci6n que seran resueltas) del dispositivo puede ser ajustado para una longitud dada del canal 2 de separaci6n.

Se debe hacer notar que el escenario descrito anteriormente, incluyendo la naturaleza del campo electrico aplicado y la de la fuerza hidrodinamica sobre el objeto 10, es meramente ejemplar y pretende ilustrar los principios de la invenci6n sin limitaci6n. En la practica, la forma del perfil del campo electrico se seleccionara segun sea apropiado

40 para las partfculas 10 a ser separadas. Dependiendo de esta forma, el intervalo dinamico (en terminos de carga y coeficiente de fricci6n) de los objetos que se separan con una resoluci6n dada en una longitud de canal dada puede ser especificado.

Por ejemplo, si una muestra contiene objetos que ocupan los tamafos grandes (fricci6n y carga grandes) mas escasamente comparado con los tamafos pequefos (fricci6n y carga pequefas), entonces seleccionar un perfil de 45 campo "c6ncavo hacia abajo" tal como el mostrado en la Figura 2b "comprimira" los tamafos mas grandes mas estrechamente, mientras que los tamafos mas pequefos, mas densamente poblados, seran puestos mas

apartados. Esto consigue una resoluci6n mas alta en la regi6n mas densa donde se requiere, permitiendo al usuario "aumentar el enfoque" en una secci6n particular del tren de bandas. Que secciones son comprimidas y cuales son expandidas depende del signo de la curvatura del perfil del campo.

Comun a todas las realizaciones, no obstante, es el uso de un perfil de campo electrico que, a lo largo del tiempo, se ajusta en relaci6n al canal 2 de separaci6n. Esto conduce a que los objetos 10 cargados son sometidos continuamente a una fuerza electrica que les comunica movimiento en relaci6n al fluido 9. Como resultado, una fuerza hidrodinamica es aplicada continuamente por el fluido. Es una combinaci6n de estas fuerzas la que conduce a una separaci6n eficaz y, de manera importante, a bandas que no se difunden con el tiempo.

En la realizaci6n, no hay flujo del fluido 9 a traves del canal 2. Esto elimina los problemas asociados con un frente de velocidad parab6lico discutido previamente, y permite al dispositivo conseguir una resoluci6n mucho mas alta. La necesidad de una red de bombeo cara tambien es eliminada.

Dicho esto, el flujo del fluido puede ser establecido (intencionada o no intencionadamente) en el canal por flujo electroosm6tico ("EOF", por sus siglas en ingles). Este es un fen6meno causado por la combinaci6n del campo electrico aplicado con las propiedades electricas del fluido y las de la superficie interna del canal de separaci6n. Como en los sistemas de electroforesis convencionales, el EOF es detenido o controlado hasta un valor 6ptimo (que puede ser cero) por la selecci6n de una qufmica de superficies apropiada. Las interacciones entre las paredes del canal y el fluido son controladas qufmicamente tratando las paredes del canal. La configuraci6n del campo electrico tambien puede ser modificada para tener en cuenta el EOF.

Las Figuras 6, 7 y 8 muestran tres implementaciones preferidas. El canal 2 de separaci6n puede estar provisto en varias formas diferentes, aunque en cada caso es preferible que este dispuesto sustancialmente en horizontal (es decir, el canal 2 debe yacer en un plano horizontal). Esto evita las fuerzas gravitacionales que interfieren con los procesos flufdicos. En la realizaci6n de la Figura 6, el canal 2 de separaci6n es un tubo capilar que, en el uso, contiene el fluido 9 y una muestra que incluye los objetos 10 a ser separados. Una secci6n del canal 2 de separaci6n esta rodeada por una serie de electrodos 3a a 3e anulares, que proporcionan los medios 3 para aplicar un campo electrico a lo largo del canal 2. El voltaje en cada electrodo 3a a 3e es controlado por el controlador 4 (Figura 1). Se debe hacer notar que el numero de electrodos representado en las Figuras es meramente ejemplar.

La Figura 7 muestra una segunda realizaci6n en la que esta dispuesto un canal 2 de separaci6n microflufdico en la forma de un canal grabado en un sustrato 12. El sustrato 12 podrfa ser una placa de vidrio, cuarzo o polidimetilsiloxano (PDMS) o un chip semiconductor por ejemplo. Una matriz de electrodos 3a, 3b, 3c, etc. esta dispuesta a lo largo del canal 2 de separaci6n, y forma los medios 3 para aplicar un campo electrico a lo largo de al menos una secci6n del canal 2 de separaci6n. Los pocillos 7 y 8 proporcionan orificios de entrada y salida para introducir la muestra en el canal 2 de separaci6n y/o extraer partes de ella del canal 2. Esto sera descrito en mas detalle mas adelante.

Los electrodos 3a, 3b, 3c, etc. son controlados por un controlador 4 para proporcionar un campo electrico dependiente del tiempo. Los objetos que estan dentro del canal de separaci6n se separan para formar bandas dentro del canal de separaci6n moviendose con una velocidad (preferiblemente) constante. En las implementaciones lineales descritas anteriormente, se puede hacer que el campo electrico oscile de tal modo que las bandas se muevan hacia delante y hacia atras a lo largo del canal 2, permitiendo la detecci6n multiple de la misma banda. Esto puede aumentar la sensibilidad para componentes en baja concentraci6n.

Como una alternativa a las implementaciones lineales, el canal 2 de separaci6n podrfa ser provisto en la forma de un bucle cerrado, un ejemplo del cual se muestra en la figura 8. El bucle podrfa ser circular (es decir, tener una vista en planta circular como se muestra en la Figura 8), pero puede de hecho ser beneficioso que el canal 2 tenga secciones rectas, especialmente en la regi6n de detecci6n. Los electrodos 3a, 3b, 3c...3p estan provistos a intervalos alrededor del canal 2 para constituir los medios 3 generadores del campo. De manera general, los electrodos estan colocados de una manera simetrica, como se muestra en la Figura 8. El voltaje aplicado tambien puede ser simetrico, como indican los valores V0 a V8 mostrados en la Figura 8.

Cuando un campo electrico variante en el tiempo es aplicado, los objetos 10 (suponiendo que tienen carga del mismo signo) se separan bien en el semicfrculo izquierdo o bien en el derecho, moviendose bien en el sentido de las agujas del reloj o bien en sentido contrario a las agujas del reloj. Las moleculas en el semicfrculo opuesto no se separan sino se mueven de una manera erratica hasta que entran en el otro semicfrculo. Esto es porque las moleculas en un semicfrculo experimentaran un gradiente de campo electrico que esta incorrectamente alineado con el vector k dependiente del tiempo. Un conjunto dado de parametros de campo electrico s6lo permitira separar un intervalo de valores de carga y fricci6n en una longitud de separaci6n dada. Cuando las moleculas en migraci6n que caen dentro de este intervalo han completado un cfrculo completo, todas estas moleculas se mueven en sincronfa y son separadas en bandas. El tren de bandas resultante gira continuamente alrededor del canal 2 y puede ser detectado repetidamente.

El canal 2 de separaci6n puede ser recto o curvo o una combinaci6n de ambos. Los mismos principios se aplican a cada configuraci6n, aparte de una correcci6n de velocidad que se necesita para canales curvados (vease mas

adelante). La Figura 9 muestra una red ejemplar de una realizaci6n que tiene canales tanto rectos como curvados. En este ejemplo, la separaci6n tiene lugar en los canales 13, 14 circulares. Una estrategia de separaci6n podrfa ser que haya muchos cfrculos concentricos (o muchos canales lineales paralelos) que esten conectados flufdicamente en varios puntos. Los parametros de campo en el cfrculo 13 exterior (o primer canal lineal) se ajustan para condiciones iniciales dadas, para conseguir una separaci6n inicial en este canal que quiza muestra el dibujo grande (espacio fricci6n-carga ancho). Despues, ventanas individuales de este espacio son cortadas mientras pasan junto a los canales 15 de transporte (vease la Figura 9) y son transportadas a un canal 13' de separaci6n vecino con diferentes ajustes para el campo electrico para enfocar la separaci6n a este ventana seleccionada de fricci6n-carga. De esta manera se pueden seleccionar muchas ventanas y transportar a diferentes canales de separaci6n con ajustes de campos que optimizan la separaci6n de esta parte especffica de la muestra. La secuenciaci6n de ADN, por ejemplo, puede ser dividida automaticamente en intervalos de pares de bases y secuenciada por separado hasta una lectura de pares de bases muy alta.

Pueden estar implicadas otras estrategias con diferentes macromoleculas. Por ejemplo algunos anillos 16 pueden ser marcados como anillos de almacenamiento en los que las protefnas separadas son transportadas y almacenadas en un entorno amortiguador deseable. Se podrfan usar otros anillos 17 como canales de mezcla. Tambien puede haber "anillos de reacci6n" (o canales), en los que las macromoleculas transportadas son expuestas a productos qufmicos deseados, donde reaccionan mientras se mueven a lo largo del canal de separaci6n. El producto de la reacci6n qufmica puede ser separado automaticamente de la molecula parental mediante el principio de separaci6n estandar, y visualizado en tiempo real mientras la reacci6n esta ocurriendo.

Ademas, la temperatura y otros parametros ambientales pueden ser controlados en cada anillo (canal) a fin de tener reacciones controladas. Por ejemplo, el plegado de protefnas puede ser monitorizado aumentando la temperatura gradualmente en un canal donde se separan protefnas. A una temperatura dada, las protefnas se desplegaran, y este evento sera observado mediante la alteraci6n de las caracterfsticas electrocineticas de esas protefnas mientras se mueven a lo largo del canal de separaci6n.

Los pocillos de recogida e inyecci6n de muestra pueden estar situados en posiciones seleccionadas a lo largo de los canales o anillos de separaci6n para los siguientes prop6sitos (entre otros): llenado del canal con gel o amortiguador, lavado del canal con productos qufmicos, inyecci6n de muestra, recogida de muestra y otros.

En canales de separaci6n curvados (por ejemplo circulares), las moleculas que se mueven en el perfmetro exterior del canal deben moverse mas rapido que las moleculas que se mueven en el perfmetro interior para permanecer en fase y que se formen bandas coherentes. Si no se aplica tal correcci6n de velocidad, las moleculas que se mueven cerca del perfmetro exterior llegan a estar fuera de fase con aquellas en el perfmetro interior, y las bandas forman un patr6n espiral que se expande (Fig.10). Esto puede ser impedido empleando electrodos en cada lado del canal circular. Los medios 3 de aplicaci6n del campo electrico se controlan de tal modo que los electrodos exteriores implementaran el campo variante en el tiempo con un parametro ligeramente mas alto kexterior comparado con kinterior que es producido por los electrodos interiores. En la mayorfa de los casos, es suficiente que los electrodos interiores y exteriores en la misma posici6n angular esten en fase, es decir, lleven el mismo voltaje en cualquier caso. Cuando se aplican diferentes voltajes a los electrodos interiores y exteriores, debido a la pequefa distancia entre los electrodos exteriores e interiores, los ligeramente diferentes campos se interpolaran entre los dos electrodos creando valores de campo intermedios para la ubicaciones entre el perfmetro exterior e interior, dando como resultado bandas coherentes como se muestra en la Figura 11.

Se debe hacer notar que si los electrodos se extienden radialmente (es decir, cada electrodo esta dispuesto para intersecar el perfmetro interior y exterior del canal de separaci6n, y puntos hacia el centro de curvatura), tambien se puede conseguir una correcci6n automatica de k. Esto es porque el tren de voltajes en los electrodos completara un ciclo entero en un periodo de tiempo dado, sin importar la posici6n radial.

Se apreciara que se requiere una distribuci6n de voltaje no lineal para establecer un perfil de campo electrico (como se describe anteriormente) dentro del canal de separaci6n. A fin de implementar esto en cada una de las realizaciones anteriores, se propone que el perfil de campo electrico variante en el tiempo sea aplicado a lo largo del canal de separaci6n por una matriz de electrodos 3a, 3b, 3c etc. Los electrodos pueden estar en contacto no electrico con el amortiguador de separaci6n, pero muy cerca de el. Tal matriz de electrodos generarfa un campo electrico estatico dentro del canal de separaci6n. La ventaja de esta configuraci6n es que, en primer lugar, el consumo de energfa de la fuente de alimentaci6n es muy bajo, ya que no fluye corriente electrica entre los electrodos. En segundo lugar, los electrodos pueden ser colocados a una (pequefa) distancia del canal de separaci6n a fin de suavizar los efectos locales sobre el campo causados por la naturaleza discreta de una matriz de electrodos. De hecho, cuanto mas lejos esten los electrodos del canal de separaci6n, mas suave es el campo electrico dentro del canal.

Sin embargo, hay una desventaja con esta configuraci6n. La aplicaci6n de un campo estatico sobre un dielectrico polar, como un amortiguador acuoso, es atenuada por el coeficiente dielectrico, que para disoluciones acuosas es usualmente alrededor de 80. Para una generaci6n eficaz del campo dentro del fluido, se tiene que tener en cuenta la velocidad de cambio del campo, la constante dielectrica y la conductividad del medio. Por regla general, el campo electrico que es generado dentro del agua es 80 veces mas pequefo que el campo que se habrfa generado en el

aire (coeficiente dielectrico 1) por la misma carga electrica. Esto significa que en algunas configuraciones del dispositivo, se necesitarfa aplicar un voltaje muy alto. Esto requerirfa suministros AV especiales y una cuidadosa consideraci6n del material dielectrico donde se implantarfan los electrodos, para evitar la ruptura dielectrica y la formaci6n de chispas entre los electrodos. Este problema puede ser evitado mediante el uso de electrodos que esten en contacto electrico con el amortiguador de separaci6n. Es mucho mas facil generar campos electricos altos generando una corriente electrica en un amortiguador de separaci6n conductor.

A fin de mejorar la generaci6n del campo, se puede emplear una combinaci6n de electrodos externos (sin contacto) e internos. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 12, en la mayorfa de los casos el gradiente de campo a lo largo de un canal en cualquier instante de tiempo consiste en una parte constante y una parte variante. El campo constante E0 (que en la mayorfa de los casos sera el mas grande por mucho) se puede alcanzar mediante la aplicaci6n de un voltaje entre dos electrodos, 3x y 3y, en los extremos opuestos del canal de separaci6n. Despues se puede afadir el gradiente En mediante una matriz de electrodos externos a lo largo del canal de separaci6n mostrado en las Figuras 13 y 14. En la Figura 14 los electrodos, 3a, 3b, 3c etc son externos, es decir, cercanos pero no en contacto con el fluido, y los electrodos 3'a, 3'b, 3'c etc son internos, es decir, en contacto electrico con el fluido.

En el caso de un canal circular, no esta claro cuales son los "extremos" de la separaci6n. De hecho, los dos electrodos internos opuestos tienen que girar alrededor del canal en fase con la separaci6n. Por lo tanto se necesita una matriz de electrodos internos en este caso. N6tese que, en principio y en cada instante de tiempo, s6lo dos de los electrodos internos llevaran voltaje. Esos dos electrodos pueden estar en posiciones diametralmente opuestas. La Figura 15 muestra tal configuraci6n de electrodos internos y externos alternantes. Los electrodos externos generan un gradiente de campo estatico que es dependiente del tiempo y crea el principio de separaci6n especial del dispositivo. El campo estatico se afade al campo constante creado por los electrodos internos.

La Figura 14 muestra una disposici6n de electrodos internos y externos alternantes a lo largo de un canal microflufdico. N6tese que ambos electrodos internos y externos pueden estar dispuestos a lo largo de cada lado de un canal de separaci6n, o pueden rodearlo hermeticamente para conseguir el campo electrico mas suave posible a lo largo del canal.

Es posible crear el campo electrico unicamente mediante una matriz de electrodos internos. Sin embargo, se espera que los electrodos que esten en contacto electrico con el amortiguador de separaci6n creen distorsiones significativas en el campo electrico en el lugar de cada electrodo a lo largo del canal. Las moleculas en separaci6n pasarfan a una proximidad muy cercana (contacto) de los electrodos, "sintiendo" las distorsiones del campo. Esto degradarfa la resoluci6n. En el caso de generar s6lo un campo constante usando s6lo dos electrodos en cada extremo del canal (electroforesis convencional), el mismo problema no existe, porque las moleculas se separan entre los electrodos y no estan nunca en cercana proximidad a ellos.

De hecho, dado que las variaciones del campo electrico a lo largo del canal son muy sutiles, en algunos casos las distorsiones causadas por una matriz de electrodos internos pueden tener un impacto significativo sobre el principio de separaci6n del sistema descrito en la presente memoria. Ademas, el tamafo longitudinal de los electrodos puede jugar un importante papel. Por ejemplo, si suponemos electrodos planos de aproximadamente 100 �m de longitud (a lo largo del canal), el campo electrico entre dos electrodos opuestos con el mismo voltaje sera cero. Esto es porque el voltaje no esta variando longitudinalmente (a lo largo del canal) en el espacio entre electrodos opuestos, y por lo tanto el campo electrico tiende a caer a cero en ese area. Esto exacerba la distorsi6n local causada por los electrodos internos.

Sin embargo, como se discuti6 anteriormente, el uso de electrodos internos tiene una ventaja significativa en el sentido de que requiere una electr6nica mucho mas simple y voltajes mas bajos.

Una manera de reducir las distorsiones locales causadas por los electrodos internos es emplear un medio resistivo entre los electrodos y el gel en el canal de separaci6n. Por lo tanto, en un ejemplo adicional, se podrfan disponer multiples puntos de electrodo a lo largo del canal, conectados con un material que tuviera una resistencia electrica. Se aplica una matriz de voltajes en cada punto, y la resistencia entre los puntos interpola los campos entre dos puntos, creando un campo mas suave. La Figura 16 muestra un ejemplo de tal configuraci6n en la que se usan dos capas 11 semiconductoras para sustituir las paredes laterales del canal 2. Los electrodos 3''a1, 3''a2, 3''b1, 3''b2 etc estan posicionados en el exterior de estas capas 11 resistivas, las cuales tienen el efecto de suavizar el campo electrico generado dentro del canal 2 de separaci6n. El material 11 resistivo podrfa ser silicio dopado o cualquier otro medio que tuviera las propiedades deseadas en terminos de resistividad y constante dielectrica. Los semiconductores dopados son atractivos porque la resistividad puede ser controlada sobre muchos 6rdenes de magnitud. Ademas, tales materiales tienden usualmente a ser biocompatibles (es decir, qufmicamente inertes), y para el silicio especialmente, las tecnologfas disponibles para crear microestructuras son baratas y ampliamente disponibles.

La Figura 17 muestra una secci6n transversal de la configuraci6n ilustrada en la Figura 16 a lo largo de la lfnea Q-Q'. El canal 2 de separaci6n, que contiene el medio 9 de separaci6n, se muestra en el centro de la secci6n transversal, con una capa de material 11 resistivo dispuesta en cada lado. Los electrodos interiores y exteriores 3''a1 y 3''a2

estan situados en los lados exteriores de las capas 11 resistivas, de tal modo que el material resistivo esta entre los electrodos 3''a1, 3''a2 y el canal 2 de separaci6n.

Los autores de la invenci6n han usado un algoritmo de elementos finitos para calcular la forma del campo y su suavidad con y sin las capas 11 resistivas. En un primer ejemplo, se pusieron electrodos de platino en las paredes laterales del canal 2 de separaci6n, sin capas 11 resistivas. La distancia entre los electrodos fue 1 mm y su tamafo longitudinal (direcci6n z) fue 100 �m. La Figura 18A muestra esta disposici6n en una vista en planta, que ilustra el canal 2 de separaci6n lleno de gel y tres pares de electrodos 3''a1, 3''a2 etc. en contacto electrico con el gel 9. La Figura 18B muestra los vectores del campo electrico dentro de una secci6n del canal 2 de separaci6n calculados por el algoritmo de elementos finitos. Es evidente que en las proximidades de los electrodos hay una desviaci6n significativa del campo de la direcci6n longitudinal.

La Figura 18C muestra la distribuci6n de voltaje a lo largo del centro del canal 2 (a lo largo de la lfnea que esta colocada en el centro de la secci6n transversal del canal 2 y corre paralela a la direcci6n x). El intervalo de voltaje es consistente con el intervalo de valores unidos a los electrodos (0 a 700 V). La forma de la lfnea sigue la ecuaci6n

(2.1)

lo que da un campo lineal

(2.2)

Sin embargo, la Figura 18D, que representa la correspondiente distribuci6n del campo electrico longitudinal a lo largo del canal, muestra que las distorsiones del campo electrico en la vecindad de los electrodos son muy evidentes.

En un segundo ejemplo, mostrado en vista en planta en la Figura 19A, estan colocadas capas 11 resistivas de 1 mm de grosor en los lados del canal 2 de separaci6n, que esencialmente forman las paredes del canal 2. La resistividad del material en este ejemplo es 80 �m. Los electrodos 3''a1, 3''a2 son de 20 �m de ancho (a lo largo de la direcci6n z), y estan colocados en intervalos de 1 mm a lo largo de la pared exterior del material 11 resistivo. La Figura 19B muestra los vectores del campo electrico calculados para esta configuraci6n. Se puede ver que las distorsiones del campo estan confinadas dentro de las capas 11 resistivas, y los vectores del campo electrico dentro del canal 2 de separaci6n estan apuntando predominantemente a lo largo de la direcci6n z. La Figura 19C muestra la distribuci6n de voltaje a lo largo de una lfnea en el centro del canal 2 que corre paralela a la direcci6n x. De nuevo, el intervalo de voltaje es consistente con el voltaje de los electrodos, y la distribuci6n de voltaje sigue una ley de potencia de segundo orden. La Figura 19D muestra la forma del campo electrico, que esta ahora libre de las intensas oscilaciones generadas con la configuraci6n mostrada en la Figura 18.

Tambien se pueden colocar electrodos internos en posiciones estrategicas cerca de canales de transporte para desplazar bandas de protefnas o ADN fuera del canal de separaci6n y transportarlas a canales vecinos de anillos de separaci6n. Por ejemplo, en la configuraci6n mostrada en la Figura 15, se puede usar la misma matriz de electrodos internos para el doble prop6sito de aplicar el campo constante y para desplazar bandas desde el anillo de separaci6n hasta el canal de transporte en el camino a otro anillo o pocillo de recogida.

Los medios 3 de aplicaci6n del campo electrico pueden consistir en cables conductores fijados a lo largo del canal 2 de separaci6n (o las capas 11 resistivas). Alternativamente, los electrodos pueden ser producidos usando metodos de grabado similares a placas electr6nicas PCB o usando tinta conductora. Este ultimo metodo es especialmente atractivo, ya que se pueden imprimir electrodos muy finos en configuraciones complejas. El campo electrico tambien podrfa ser aplicado por medio de una resistencia variante a lo largo del canal. Tambien serfa posible proveer una matriz m6vil de electrodos, u otros medios generadores de campos, que podrfan ser controlados para moverse en relaci6n al canal 2 de separaci6n.

En cada una de las realizaciones descritas anteriormente, el dispositivo de electroforesis puede estar provisto de un detector 6 para detectar las bandas de objetos separados una vez que se han formado. Por regla general, el detector 6 genera una imagen de las bandas separadas. Puede haber una variedad de sistemas generadores de imagenes que son mas adecuados para requerimientos diferentes, p.ej. coste, precisi6n, y muestras diferentes. La posibilidad de ejecutar muestras exentas de marcas (sin tefir) es, de manera general, la opci6n mas atractiva, ya que deja a las muestras sin modificar hasta cierto punto. Ademas, el uso de tinciones es indeseable, dado que las sustancias que se unen a ADN o protefnas tambien se adheriran, de manera general, a un usuario. Ademas, los costes son mas bajos, dado que se elimina una etapa de preparaci6n. Tambien, el tiempo de preparaci6n se reduce

por la misma raz6n.

Se describiran ahora dos metodos para la detecci6n exenta de marcas. Las Figuras 20 y 21 muestran implementaciones ejemplares de tecnicas de absorci6n UV y Fluorescencia Inducida por Laser (LIF, por sus siglas en ingles) respectivamente. Se debe hacer notar que tambien se pueden emplear para la generaci6n de imagenes otras configuraciones que impliquen detecci6n por fluorescencia para muestras tefidas. En general, los patrones de luz, ya sean de absorci6n o fluorescencia, pueden ser detectados por un fotodiodo, detector de pfxeles (CCD, por ejemplo) o fotomultiplicador (PMT).

La Figura 20 muestra una configuraci6n de absorbancia UV. Una fuente 20 de luz UV emite luz que pasa a traves de la lente 21 condensadora, la lente 23 de enfoque y la lente 25 generadora de imagenes. La luz es filtrada por el filtro 22 de interferencia y enfocada en el canal 24 microflufdico. La imagen de absorci6n es detectada por un fotodiodo o detector 26 de pfxeles y digitalizada por un PC 27.

La Figura 21 muestra una configuraci6n de fluorescencia inducida por laser (LIF). Un laser 30 emite longitudes de onda UV a 30' en el canal 34 microflufdico y causa que las macromoleculas en las bandas que se estan separando fluorezcan a una longitud de onda. El filtro 32 de interferencia es sintonizado a esta ventana de longitud de onda. El fotodiodo 31 esta colocado en un angulo en relaci6n con la lfnea del laser. La 6ptica 33 permite al fotodiodo detectar una secci6n c6nica de la luz de fluorescencia. La sefal de emisi6n es digitalizada por un PC 35.

En cada caso, la sefal es transferida a un ordenador 27 o 35 que contiene un Convertidor Anal6gico a Digital (ADC, por sus siglas en ingles) que es responsable de la digitalizaci6n de la sefal. Un soft�are de control analiza las imagenes en tiempo real.

En la electroforesis convencional, como se menciona anteriormente, la distancia relativa entre las bandas aumenta con el tiempo, porque se mueven con diferentes velocidades terminales. Por lo tanto, es l6gico generar imagenes de s6lo la ultima secci6n de la separaci6n, donde las bandas han alcanzado su distancia relativa maxima. En contraste, el metodo propuesto consigue la separaci6n muy pronto, por lo tanto la generaci6n de imagenes puede tener lugar en cualquier punto a lo largo del canal de separaci6n o incluso, se pueden generar imagenes de muchos puntos a lo largo del canal de separaci6n usando un detector de pfxeles dispuesto longitudinalmente a lo largo del canal de separaci6n. El detector puede ser interrogado por la electr6nica de lectura (que puede estar incorporado en el controlador 4) muchas veces por segundo, dando asf una matriz de fotogramas que describen con exactitud el movimiento de las bandas a lo largo del canal. Tener una multitud de pfxeles a lo largo del canal de separaci6n no es necesario en la mayorfa de las realizaciones, sin embargo en algunas ocasiones puede ser ventajoso tener una imagen dinamica de la separaci6n en curso. En otras realizaciones, se puede usar un CCD para generar imagenes de un area mas grande de un sistema microflufdico o capilar multicanal. El detector y la 6ptica generadora de imagenes pueden ser dispuestos de una manera tal que se generen imagenes simultaneamente de una multitud de canales de separaci6n en los que estan teniendo lugar ejecuciones simultaneas. Esto hace mas facil realizar analisis comparativos entre los diferentes canales, en tiempo real o despues de que se hayan completado las ejecuciones de separaci6n. Una ventaja adicional de usar tal disposici6n de 6ptica y detector es que puede estar implicado s6lo un circuito de lectura, ayudando a reducir el ruido sistematico inducido en la generaci6n de imagenes por circuitos multiples.

Los orificios 7 de entrada estan provistos tfpicamente en la forma de pocillos, dispuestos para la recepci6n de una muestra inyectada. Los orificios 8 de salida comprenden tfpicamente pocillos equipados con electrodos que pueden ser activados por el controlador 4 a fin de extraer los componentes deseados fuera del canal de separaci6n y hacia el orificio de salida cuando la parte seleccionada de la muestra pase delante del punto de salida.

Esta previsto ademas que el dispositivo pueda estar provisto de mas que un canal 2 de separaci6n. En este caso, cada canal estarfa provisto de medios 3 para aplicar un campo electrico a lo largo de ese canal y un controlador para controlar el campo. Convenientemente, un controlador podrfa controlar varios (o todos) de los canales y tambien puede ser posible compartir los medios de aplicaci6n del campo entre canales. Cada canal podrfa estar provisto de un detector y orificios de entrada y salida como se describi6 previamente.

Cada canal podrfa ser controlado para experimentar la misma variaci6n de campo electrico. Sin embargo, si el contenido de cada canal es diferente, puede ser beneficioso controlar el campo aplicado a cada canal individualmente.

Se describira ahora el funcionamiento del dispositivo electroforetico, segun cualquiera de las realizaciones anteriores. En la siguiente descripci6n, el termino "muestra" se usa para describir una mezcla de los objetos 10 a ser separados con un volumen del fluido 9 de separaci6n. Por regla general, la muestra se prepara mezclando los objetos a ser separados con el fluido, y este se usa despues para llenar el canal 2 de separaci6n. Los objetos tfpicos a ser separados incluyen macromoleculas, biomoleculas o polfmeros tales como protefnas, moleculas de ADN o celulas biol6gicas. El fluido de separaci6n puede ser un amortiguador (composici6n de ejemplo: Tricina, albumina de suero bovino y n-octilgluc6sido) o un gel tal como poliacrilamida.

Una ventaja adicional de este dispositivo sobre las tecnicas electroforeticas o cromatograficas estandar es el hecho de que no se requiere un tap6n de inyecci6n de muestras. En la electroforesis capilar convencional por ejemplo,

cuando tiene lugar la inyecci6n de muestra, entonces, en primer lugar, un extremo del capilar es sumergido en un recipiente que contiene una disoluci6n de ADN o protefnas. Despues se sumergen tambien los electrodos en el recipiente de la muestra y el recipiente de desecho para formar un circuito cerrado a traves del capilar. El campo electrico que se forma arrastra una cantidad de ADN o protefna hacia el capilar. La aplicaci6n del voltaje se detiene, y el recipiente de muestra se sustituye por un recipiente que s6lo contiene una disoluci6n salina. Se vuelve aplicar el voltaje y el pequefo tap6n 40 de muestra (Fig. 22) que se habfa formado en la entrada del capilar empieza a moverse y a separarse. Este es el metodo estandar para la inyecci6n de muestras. N6tese que las bandas 41 separadas estan directamente influenciadas por la anchura inicial del tap6n de muestra. Esta anchura es aumentada adicionalmente por difusi6n termica.

El presente dispositivo sin embargo no necesita un tap6n de muestra como tal. La muestra de ADN o protefna puede ser mezclada con el gel o amortiguador antes de su introducci6n en el capilar (Figura 23). Alternativamente, el canal 2 de separaci6n podrfa ser llenado previamente con el fluido 9, y los objetos 10 o muestra a ser separados introducidos en una etapa posterior antes del comienzo del proceso de separaci6n. Una gota 43 de muestra puede ser introducida aleatoriamente en cualquier parte a lo largo del canal de separaci6n (Figura 24). La gota 43 de muestra se difunde en el fluido 9 sobre un area 44. El campo variante en el tiempo "recogera" todas las moleculas de la muestra y las distribuira en bandas 42 a lo largo del canal con alta resoluci6n. Tal inyecci6n "aleatoriaincoherente" es ineficaz en los procesos cromatograficos o electroforeticos estandar. La raz6n es que no hay un mecanismo para hacer una banda coherente si se parte de una incoherente. De hecho el tamafo del tap6n de inyecci6n es un asunto crucial, ya que afecta directamente a la resoluci6n.

Por ejemplo, los dispositivos comerciales actuales emplean inyecci6n electrocinetica (como se describe anteriormente, Figura 22) o inyecci6n por presi6n (en lugar de usar voltaje para arrastrar el tap6n, se usa presi6n). La raz6n por la que se usan dos metodos diferentes es precisamente porque cada metodo da una resoluci6n ligeramente mejor en configuraciones diferentes.

El dispositivo descrito en la presente memoria no es dependiente de ningun tap6n de inyecci6n tal. Esto es porque permite metodos de inyecci6n alternativos comparado con la tecnologfa estandar. La muestra puede ser cargada en el canal de separaci6n bien mezclandola de antemano con el amortiguador (o gel) de separaci6n, o inyectandola por presi6n a traves de un pocillo de entrada. Alternativamente, la muestra puede ser colocada dentro de un pocillo o recipiente e inyectada en el canal de separaci6n usando inyecci6n electrocinetica estandar. Esto significa que un electrodo se sumerge en el pocillo que contiene la muestra, y existe un electrodo en el otro extremo del canal de transporte. Aplicando un voltaje apropiado entre los electrodos, la muestra es atrafda electricamente fuera del pocillo, a traves del canal de transporte y hacia el canal de separaci6n.

Un metodo de inyecci6n alternativo aprovecharfa la ventaja de la naturaleza especial del dispositivo, que no requiere un tap6n de inyecci6n coherente. Simplemente se coloca una gota de muestra mediante un instrumento similar a una jeringa en cualquier punto a lo largo del canal de separaci6n, simplemente en la superficie del amortiguador o gel (vease la Figura 24). Posteriormente, la gota se difundira incoherentemente en la regi6n 44 del amortiguador cercana al punto de inyecci6n. Una vez que la gota se coloc6 en el amortiguador, mientras se difunde a traves de el el campo electrico variante afectara inmediatamente a las moleculas y el proceso de separaci6n habra sido iniciado.

El instrumento de tipo jeringa puede ser transferido a una parte expuesta del canal de separaci6n, bien a mano o bien automaticamente mediante un brazo rob6tico que es controlado por un soft�are especial.

Un campo electrico que tiene un perfil de campo de forma e intensidad apropiadas es aplicado por los medios 3 de generaci6n de campo a lo largo del canal 2 de separaci6n. El campo electrico es variado por el controlador 4 para producir una dependencia del tiempo que ajusta el campo en relaci6n al canal de separaci6n y causa asf que las moleculas se separen en bandas como se describi6 previamente. Entonces se pueden generar imagenes de las bandas, o detectarse de otro modo, mediante el detector 6, y el dispositivo genera una salida 5 correspondiente. La detecci6n o generaci6n de imagenes podrfa tener lugar despues de la formaci6n de bandas o durante la separaci6n. La evoluci6n de la sefal con el tiempo da informaci6n extra, un ejemplo de la cual es el "tiempo de reacci6n". Por ejemplo, si se afade una muestra polimerica a un entorno amortiguador en el que tiene lugar una reacci6n qufmica y se forman bandas adicionales, entonces el "tiempo de aparici6n" de la banda adicional (producto de reacci6n) puede dar informaci6n acerca de las caracterfsticas de esta reacci6n. Tambien el "plegado de protefnas" es un evento dependiente del tiempo, y podrfa por tanto ser monitorizado de manera util mientras tiene lugar.

Una vez que los objetos 10 son separados en bandas, las propias bandas pueden ser manipuladas mediante un ajuste adicional del campo electrico. Ajustando la dependencia del tiempo y la intensidad del campo, asf como la forma del perfil del campo, la resoluci6n y espaciado de las bandas pueden ser ajustados como se desee. Las bandas tambien pueden ser reposicionadas, por ejemplo para permitir que una banda particular de interes sea extrafda en uno de los orificios de salida.

En algunas aplicaciones, es util controlar el campo electrico aplicado de un modo tal que las bandas (u objetos en separaci6n) se muevan repetidamente pasado el detector. Un inconveniente adicional de los metodos de electroforesis o cromatograffa convencionales es que s6lo se pueden generar imagenes de las bandas en el unico momento en que pasan por delante de un detector dado. En esta tecnica, sin embargo, se pueden generar

imagenes de la misma banda una multitud de veces aumentando de manera efectiva el "camino 6ptico" para la generaci6n de imagenes de absorci6n. La generaci6n de imagenes de absorci6n es muy conveniente, porque las moleculas en las bandas no necesitan ser tefidas con una marca fluorescente. El metodo es tambien barato, ya que una fuente de luz UV comun tal como una lampara de D2 o una lampara de mercurio son muy rentables. Sin embargo, la generaci6n de imagenes de absorci6n adolece crfticamente de sensibilidad. Esto es porque, para reducir el calentamiento de Joule, el canal de separaci6n debe tener una pequefa secci6n transversal que logre una mejor disipaci6n del calor. Sin embargo, una secci6n transversal pequefa implica un camino 6ptico corto, y por tanto una pequefa absorci6n por parte de cada banda. En el presente dispositivo, la limitaci6n del camino 6ptico puede ser eliminada por generaci6n repetitiva de imagenes de cada banda. Por el contrario, cada ciclo afade una cantidad al camino 6ptico. Esto se podrfa conseguir haciendo oscilar el campo aplicado de tal modo que los objetos se muevan hacia delante y hacia atras, o haciendo circular los objetos varias veces alrededor de un canal de separaci6n en bucle cerrado, por ejemplo.

En una realizaci6n adicional, el dispositivo podrfa ser adaptado para la recepci6n continua o semicontinua de una muestra a traves del orificio 7 de entrada. El campo electrico aplicado se controla para separar los objetos en bandas y mover una o mas bandas de interes a o pasado uno o mas orificios 8 de salida. Los orificios de salida pueden ser activados cada vez que llega una banda, de tal modo que los componentes de interes puedan ser extrafdos del canal de separaci6n casi continuamente. De esta manera, el dispositivo puede funcionar como sistema de purificaci6n.

Como se ha descrito, los autores de la invenci6n proporcionan un dispositivo y metodo de electroforesis del que se predice que consigue una separaci6n de objetos rapida, eficaz, y una alta resoluci6n. La tecnologfa puede ser combinada o interconectada ventajosamente con tecnologfa microflufdica para conseguir dispositivos de separaci6n ultrarresolutivos, ultrarrapidos de miniaturizaci6n. Debe ser barato de producir, ya que no se requieren piezas adicionales costosas. El dispositivo descrito no requiere flujo de fluido, y por lo tanto no se necesita una cara red de bombeo. La resoluci6n es muy mejorada, dado que puede ser controlada cambiando el campo electrico y por ello puede ser aumentada arbitrariamente (dentro de un lfmite de sobrecalentamiento). La difusi6n de partfculas dependiente del tiempo es eliminada, la cual limita la resoluci6n de los dispositivos convencionales. Esta mejora en resoluci6n tambien permite al dispositivo rendir bien a corrientes aplicadas mas bajas que las requeridas en los sistemas conocidos, reduciendo asf los efectos del calentamiento de Joule.

Se describira ahora una aplicaci6n ejemplar del dispositivo. Especfficamente, se describe un metodo para realizar una secuenciaci6n de ADN. Las primeras etapas de extraer el ADN de un organismo, la posible amplificaci6n por PCR y la digesti6n como prescribe el metodo de Sanger o similares, no se describiran aquf. El procedimiento de secuenciaci6n es iniciado desde el punto en el que las cuatro reacciones (A, T, � y C) estan disponibles. En primer lugar, la reacci6n A es colocada en el canal de separaci6n que contiene gel de tamizado (por ejemplo poliacrilamida), segun los metodos de carga descritos previamente. Despues, el campo electrico dependiente del tiempo es iniciado y la separaci6n de las moleculas de ADN tiene lugar. Se generan imagenes de las bandas moleculares y el resultado tendra el aspecto de una serie de picos como se muestra en la Figura 25. Posteriormente, se inyecta la reacci6n T y los picos T aparecen como se muestra en la Figura 26. Posteriormente (y mientras las reacciones A y T han sido separadas y se estan moviendo a lo largo del canal) se inyectan las reacciones � y C en serie (Figuras 27 y 28).

En los procedimientos de secuenciaci6n normales, las cuatro reacciones necesitan ser tefidas qufmicamente con diferentes colores a fin de que las cuatro reacciones sean separadas simultaneamente en el mismo canal. Sin embargo, el dispositivo descrito en la presente memoria vence esto inyectando cada reacci6n con un retardo de tiempo desde la anterior, en el mismo canal de separaci6n y sin usar tinciones qufmicas (exento de marcas).

Realizando estas inyecciones secuenciales, los "picos" de imagenes correspondientes a las bandas de ADN se forman en una serie temporal. En primer lugar aparecen los picos de la reacci6n "A" y son registrados automaticamente por el soft�are generador de imagenes. Despues, aparecen gradualmente los picos "T". De manera similar, aparecen los picos � y C con retardos de tiempo adicionales. La medici6n del tiempo de los picos es un buen indicador de que pico pertenece a que reacci6n, y por lo tanto la secuenciaci6n puede tener lugar en un unico canal microflufdico y sin el uso de tinci6n para las moleculas de ADN.

Se puede obtener mas informaci6n observando la formaci6n de las bandas. Por ejemplo, si la segunda inyecci6n ha tenido lugar, las bandas que se forman debido a esta segunda inyecci6n se formaran gradualmente entre las bandas de la primera inyecci6n. Este perfil creciente puede ser muy util. Alternativamente, la generaci6n de imagenes podrfa tener lugar una vez que las bandas de la segunda inyecci6n se han formado totalmente, y despues se podrfa hacer una comparaci6n con el patr6n de separaci6n previo donde s6lo habfa una inyecci6n en el canal. De cualquier modo, los perfiles crecientes pueden ser una herramienta muy util para eliminar errores sistematicos en la generaci6n de imagenes y cuantificaci6n de una banda dada. Por ejemplo, representando graficamente la fuerza de la sefal frente al tiempo para una banda dada, se podrfa obtener una medida mas fiable del tamafo verdadero de la sefal.

El metodo de inyecci6n secuencial de diversas muestras se puede usar como herramienta para disefar protocolos de separaci6n de muestras complejas o multiples. Las reacciones qufmicas entre los componentes de la muestra o

entre los componentes y el amortiguador pueden ser tenidas en cuenta en la consideraci6n del orden de inyecci6n. Ademas, otros parametros, como la temperatura, el pH variante del amortiguador, pueden ser parte del protocolo de ejecuci6n. Las bandas pueden ser extrafdas de un canal de separaci6n y transportadas a otro en el que se aplican diferentes condiciones qufmicas o ambientales. Pueden ser inyectadas moleculas adicionales externamente y secuencialmente en el nuevo canal de separaci6n.

A fin de evaluar la resoluci6n esperada del dispositivo, los autores de la invenci6n usan las movilidades medidas experimentalmente de bandas de ADN en electroforesis capilar estandar en geles lineales de poliacrilamida, y aplican la ecuaci6n de Lamm para obtener la resoluci6n esperada para la invenci6n propuesta. No se proporcionara aquf un analisis detallado, pero la tecnica permite una comparaci6n de la resoluci6n esperada con la conseguida por las tecnicas convencionales.

Los autores de la invenci6n han estudiado la movilidad del ADN en electroforesis capilar en gel (C�E, por sus siglas en ingles) estandar de la bibliograffa. Las condiciones suponen un gel de poliacrilamida lineal al 6� y un campo electrico dependiente del tiempo. Las Figuras 29a a c muestran la resoluci6n esperada de un experimento C�E estandar con dos bandas de ADN, una de 1000 pb y una de 1001 pb de largo. La Figura 29a muestra las formas de banda esperadas (forma de campana) en el punto de detecci6n (30 cm de longitud de separaci6n). Como podemos ver, las bandas estan muy juntas. La Figura 29b muestra la suma de las dos sefales y en este caso la suma apenas muestra la existencia de dos bandas distintas. Esto es lo que se espera para esta longitud de ADN y resoluci6n conocida para la separaci6n por C�E de ADN en geles de Poliacrilamida.

Podemos predecir la resoluci6n del dispositivo descrito en la presente memoria para las mismas bandas de ADN (1000 + 1001 pb). La Figura 30a muestra las dos bandas. Es claro que en unidades de F�HM (anchura a media altura, por sus siglas en ingles) estan mas separadas comparado con la C�E estandar (Figuras 29a a c). La Figura 30b muestra la suma de las dos sefales, que estan resueltas claramente, y la Figura 30c muestra el campo electrico dependiente del tiempo que esta a aproximadamente 250 V/cm. Este valor es muy realista para tales geles. Para la C�E estandar, el valor 6ptimo esta por debajo de 50 V/cm para conseguir la mejor resoluci6n. Campos electricos mas altos causan una disminuci6n de la resoluci6n porque, por diversas razones, la dispersi6n de las bandas de ADN aumenta. Sin embargo, para el dispositivo propuesto, la misma regla no se aplica, dado que la dispersi6n es contenida por las especiales condiciones de separaci6n. Por lo tanto es perfectamente razonable aumentar la resoluci6n aplicando campos mas altos.

Los autores de la invenci6n han usado los mismos datos para dos fragmentos de ADN mas largos a 8000 y 8001 pb. La Figura 31a muestra la resoluci6n predicha. Las dos bandas estan claramente resueltas, lo que significa que el dispositivo propuesto podrfa resolver hasta una resoluci6n sin precedentes de > 8000 pares de bases de ADN, lo que tiene enormes implicaciones para la industria y la investigaci6n.

Para un canal de separaci6n dado, la resoluci6n puede ser optimizada para un intervalo dado de parametros de fricci6n-carga. En terminos practicos, esto significarfa para el ADN, por ejemplo, que en un canal el parametro "a" del campo puede ser disminuido. El efecto de esto es que la pendiente del gradiente del campo en x se reduce, pero la anchura real de las bandas no aumenta proporcionalmente. Esto a su vez causa que las bandas en el intervalo dinamico dado se muevan distanciandose mas unas de otras, pero el ensanchamiento de las bandas no suprime el aumento en distancia. Esto significa que efectivamente la resoluci6n es aumentada, y dado que a puede ser reducido, la resoluci6n para un intervalo dinamico dado puede ser ajustada facilmente. La raz6n para esto es porque en el analisis de Lamm, el termino que contiene f depende linealmente de x pero el termino que contiene a depende de x2. Sin embargo, f es inversamente proporcional al coeficiente de difusi6n D y por lo tanto a la anchura de una banda dada. Debido a esta dependencia diferencial de f y a de x, la resoluci6n puede ser ajustada de manera eficaz.

Un factor util adicional para ajustar la resoluci6n es el parametro k. Aumentando este factor la resoluci6n aumenta drasticamente. Sin embargo esto tiene su coste. El intervalo de campo electrico donde la separaci6n se produce aumenta con k y por lo tanto hay una limitaci6n en c6mo de grande se puede generar un campo electrico de manera realista en el canal de separaci6n para un suministro de AV (coste) dado, y las caracterfsticas de ruptura de voltaje del dielectrico del material del chip.

Claims (56)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de electroforesis para separar objetos (10) en un fluido (9) contenido en un canal (2) de separaci6n, comprendiendo el metodo:

   aplicar un campo electrico (E) a lo largo del canal (2) de separaci6n, teniendo el campo electrico un perfil de campo, y causando de este modo que al menos alguno de los objetos (10) se muevan en relaci6n al fluido (9);

   variar el campo electrico (E) aplicado para ajustar el perfil de campo en relaci6n al canal (2) de separaci6n, causando de este modo que los objetos (10) se separen en bandas bajo las influencias combinadas de una fuerza electrica (Fe) debida al campo electrico y una fuerza hidrodinamica (Fh) debida al fluido;

   caracterizado porque el perfil del campo electrico es conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto (10), que resulta de la combinaci6n de la fuerza electrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinamica ejercida por el fluido, es tal que la anchura de cada banda separada permanece sustancialmente constante con el tiempo; y

   en el que el fluido (9) y el canal (2) de separaci6n estan sustancialmente estacionarios uno con respecto al otro.

2. 2.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 1, en el que el campo electrico varfa con respecto al canal (2) de separaci6n a lo largo del perfil del campo.

3. 3.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en el que el perfil del campo electrico tiene un gradiente que es distinto de cero.

4. 4.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera delas reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico es variado de tal manera que el perfil del campo se mueve en relaci6n al canal (2) de separaci6n.

5. 5.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 4, en el que el perfil del campo permanece por lo demas sin cambios mientras se mueve en relaci6n al canal (2) de separaci6n.

6. 6.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico es variado de tal manera que el perfil del campo electrico se traslada a lo largo del canal (2) de separaci6n.

7. 7.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico aplicado es variado de tal modo que, una vez que los objetos (10) se han separado en bandas, cada banda se mueve con una velocidad terminal distinta de cero en relaci6n al canal (2) de separaci6n.

8. 8.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 7, en el que la velocidad terminal de cada banda es sustancialmente la misma.

9. 9.

   Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico aplicado es de la forma

   donde x es una coordenada espacial, tfpicamente a lo largo del canal de separaci6n, t es una coordenada temporal, n y k son cada uno numeros reales y n no es cero.

10. 10.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el perfil del campo electrico es monot6nico con respecto a la distancia a lo largo del canal.

11. 11.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas las etapas de mezclar los objetos (10) a ser separados con el fluido (9) y colocar la mezcla en el canal (2) de separaci6n.

12. 12.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademas las etapas de colocar el fluido en el canal de separaci6n e insertar una muestra en el canal de separaci6n, comprendiendo la muestra al menos objetos (10) a ser separados.

13. 13.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 12, en el que la muestra comprende ademas el fluido (9).

14. 14.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de detectar las bandas.

15. 15.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que

    comprende ademas la etapa de modificar el campo electrico, despues de que los objetos (10) se han separado en bandas, para ajustar el espaciado entre las bandas, el posicionamiento de las bandas o la resoluci6n de las bandas.

16. 16.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 15, en el que el campo electrico es modificado por cambios en su dependencia del tiempo y/o su intensidad.

17. 17.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de extraer una banda de interes del canal (2) de separaci6n despues de que los objetos

    (10) se han separado.

18. 18.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de hacer oscilar el campo electrico, causando que el movimiento de las bandas se invierta en direcci6n, moviendose asf las bandas hacia delante y hacia atras a lo largo del canal (2) de separaci6n.

19. 19.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el canal (2) de separaci6n es un bucle cerrado y el campo electrico aplicado es peri6dico alrededor del bucle.

20. 20.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo electrico es aplicado por medio de una pluralidad de electrodos (3) dispuestos a lo largo del canal (2) de separaci6n.

21. 21.

    Un metodo de electroforesis segun la reivindicaci6n 20, en el que al menos algunos de la pluralidad de electrodos (3) estan espaciados del interior del canal de separaci6n por una capa de material (11) electricamente resistivo.

22. 22.

    Un metodo de electroforesis segun la reivindicaci6n 21, en el que el material (11) electricamente resistivo es un semiconductor.

23. 23.

    Un metodo de electroforesis segun la reivindicaci6n 22, en el que el semiconductor es un semiconductor dopado.

24. 24.

    Un metodo de electroforesis segun la reivindicaci6n 23, en el que el material electricamente resistivo es silicio dopado.

25. 25.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que la pluralidad de electrodos (3) estan espaciados del interior del canal de separaci6n de tal modo que no conduce corriente entre los electrodos y el fluido.

26. 26.

    Un metodo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los objetos (10) a ser separados comprenden biomoleculas, protefnas, polfmeros, ADN, ARN o celulas biol6gicas.

27. 27.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos, comprendiendo el dispositivo:

    un canal (2) de separaci6n que, en el uso, contiene un fluido (9) y los objetos (10) a ser separados;

    medios para aplicar un campo electrico (E) a lo largo del canal (2) de separaci6n, teniendo el campo electrico un perfil de campo por el cual se causa que los objetos (10) en el canal (2) de separaci6n se muevan en relaci6n al fluido;

    un controlador (4) adaptado en el uso para aplicar y variar el campo electrico aplicado, para ajustar el perfil del campo electrico en relaci6n al canal (2) de separaci6n, por lo cual se causa que los objetos en el canal de separaci6n se separen en bandas bajo las influencias combinadas de una fuerza electrica (Fe) debida al campo electrico y una fuerza hidrodinamica (Fh) debida al fluido;

    caracterizado porque el controlador (4) esta adaptado ademas para aplicar un perfil de campo electrico conformado de tal modo que la fuerza neta experimentada por cada objeto, que resulta de la combinaci6n de la fuerza electrica ejercida por el campo y la fuerza hidrodinamica ejercida por el fluido, es tal que cada banda separada sufre una difusi6n espacial sustancialmente cero; y

    en el que, en el uso, el fluido contenido en el canal de separaci6n es sustancialmente estacionario en relaci6n al canal de separaci6n.

28. 28.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 27, en el que el campo electrico varfa con respecto al canal (2) de separaci6n a lo largo del perfil del campo.

29. 29.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 27 o la reivindicaci6n 28, donde el perfil del campo electrico tiene un gradiente que es distinto de cero.

30. 30.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que el controlador esta adaptado ademas para mover el perfil del campo electrico en relaci6n al canal (2) de separaci6n.

31. 31.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 30, en el que el controlador esta adaptado ademas para mantener el perfil del campo sin cambios mientras se mueve en relaci6n al canal (2) de separaci6n.

32. 32.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 30 o la reivindicaci6n 31, en el que el controlador esta adaptado ademas para trasladar el perfil del campo electrico a lo largo del canal (2) de separaci6n.

33. 33.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el que el controlador esta adaptado ademas para variar el campo electrico aplicado de tal modo que, una vez que los objetos (10) se han separado en bandas, cada banda se mueve con una velocidad terminal distinta de cero en relaci6n al canal (2) de separaci6n.

34. 34.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 33, en el que la velocidad terminal de cada banda es sustancialmente la misma.

35. 35.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34, en el que el campo electrico aplicado es de la forma

    donde x es una coordenada espacial, tfpicamente a lo largo del canal de separaci6n, t es una coordenada temporal, n y k son cada uno numeros reales y n no es cero.

36. 36.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 35, en el que el perfil del campo electrico es monot6nico con respecto a la distancia a lo largo del canal.

37. 37.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, en el que los medios para aplicar un campo electrico comprenden una pluralidad de electrodos (3) dispuestos a lo largo del canal (2) de separaci6n.

38. 38.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 37, en el que al menos algunos de la pluralidad de electrodos (3) estan espaciados del interior del canal de separaci6n por una capa de material (11) electricamente resistivo.

39. 39.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 38, en el que el material electricamente resistivo es un semiconductor.

40. 40.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 39, en el que el material electricamente resistivo es un semiconductor dopado.

41. 41.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 40, en el que el material resistivo es silicio dopado.

42. 42.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun las reivindicaciones 37 a 41, en el que los electrodos

    (3) estan espaciados del interior del canal de separaci6n de tal modo que no conduce corriente entre los electrodos y el fluido (9).

43. 43.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42, en el que los electrodos (3) comprenden tinta conductora impresa en o adyacente al canal de separaci6n o material resistivo.

44. 44.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 43, en el que canal (2) de separaci6n es un capilar.

45. 45.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 44, en el que canal (2) de separaci6n es rectilfneo.

46. 46.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 45, en el que el canal (2) de separaci6n esta en la forma de un bucle cerrado.

47. 47.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 46, en el que el canal (2) de separaci6n es circular.

48. 48.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 47, en el que el canal (2) de separaci6n esta grabado en un sustrato.

49. 49.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 48, en el que el dispositivo es un dispositivo microflufdico.

50. 50.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 49, que comprende ademas un detector (6) adaptado para detectar bandas en el canal de separaci6n.

51. 51.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 50, en el que el detector (6) esta adaptado para generar imagenes de bandas en el canal de separaci6n.

    5 52. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 51, en el que el canal de separaci6n esta provisto de al menos un orificio (7) de entrada para la inserci6n de una muestra en el canal de separaci6n, comprendiendo la muestra al menos objetos a ser separados.
52. 53. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 52, en el que

    el canal de separaci6n esta provisto de al menos un orificio (8) de salida para la extracci6n de bandas de objetos del 10 canal de separaci6n.
53. 54. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 27 a 53, que comprende una pluralidad de canales (2) de separaci6n, estando provisto cada canal de separaci6n de medios para aplicar un campo electrico y un controlador.
54. 55. Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 54, en el que el campo electrico 15 aplicado a cada canal de separaci6n es el mismo.

55. 56.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun la reivindicaci6n 54 o la reivindicaci6n 55, en el que el campo electrico aplicado a cada canal de separaci6n es controlado por el mismo controlador.

56. 57.

    Un dispositivo de electroforesis para separar objetos segun cualquiera de las reivindicaciones 28 a 56, en el que los objetos a ser separados comprenden biomoleculas, protefnas, polfmeros, ADN, ARN o celulas biol6gicas.