ES2375860A1 - Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos. - Google Patents
Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2375860A1 ES2375860A1 ES201030493A ES201030493A ES2375860A1 ES 2375860 A1 ES2375860 A1 ES 2375860A1 ES 201030493 A ES201030493 A ES 201030493A ES 201030493 A ES201030493 A ES 201030493A ES 2375860 A1 ES2375860 A1 ES 2375860A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pos
- cell
- enzymatic digestion
- papain
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
- C12N2533/32—Polylysine, polyornithine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos.Método para la purificación de células precursoras de oligodendrocitos (POs) de corteza cerebral a partir de la corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que comprende: obtener una muestra aislada de cerebro; seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida anteriormente y cultivar las POs en condiciones de proliferación, migración, movilidad o diferenciación celular. Además, la presente invención se refiere a los Pos obtenidos por el método de la invención y a las líneas celulares derivadas del mismo.
Description
Método para la obtención de células precursoras
de oligodendrocitos.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la neurobiología y la biomedicina. Específicamente, se
refiere a un método para la purificación de células precursoras de
oligodendrocitos (POs) de corteza cerebral a partir de ejemplares de
edad madura.
Los axones de muchas neuronas de vertebrados
están aislados por la vaina de mielina, que aumenta enormemente la
velocidad con la que el axón puede conducir el potencial de acción.
Los oligodendrocitos son los responsables de la formación de la
mielina en el sistema nervioso central (SNC). Estos oligodendrocitos
envuelven el axón capa a capa con su propia membrana hasta formar
una estrecha espiral, la vaina, que aísla la membrana del axón de
manera que no se pierde apenas intensidad del impulso eléctrico. La
vaina se interrumpe en los nódulos de Ranvier, que están espaciados
regularmente y son puntos donde se concentran casi todos los canales
de sodio. Estas excelentes características de la envuelta del axón
hacen que la despolarización de la membrana en un nodo se extienda
casi inmediatamente y de manera pasiva al siguiente. Así, el
potencial de acción se propaga a lo largo del axón mielinizado
saltando de nodo en nodo. Esta conducción tiene dos ventajas
principales: los potenciales de acción viajan más rápido y la
energía metabólica se conserva porque sólo se dispersa en pequeñas
regiones de la membrana axonal en los nódulos de Ranvier.
La importancia de la mielinización viene
demostrada por las enfermedades desmielinizantes, como la esclerosis
múltiple, en la que la vaina de mielina en algunas regiones del SNC
es destruida por algún mecanismo todavía desconocido.
Los oligodendrocitos son células
post-mitóticas, totalmente diferenciadas, que no se
dividen in vivo, lo cual dificulta su cultivo in vitro
a largo plazo (Verity y cols, 1993 J Neurochem.
60(2):577-87). Los POs, que tienen capacidad
de proliferar, migrar y de diferenciarse, ofrecen la posibilidad de
estudiar los mecanismos moleculares y celulares de diferenciación
morfofuncional, así como los procesos de mielinización,
desmielinización y remielinización in vitro, y pueden ser una
fuente para promover la mielinización y/o la remielinización in
vivo, con especial importancia en patologías
desmielinizantes.
Todas las células del SNC provienen de las
células troncales neuroepiteliales. Éstas dan lugar tanto a las
neuronas como a la macroglia. Las células gliales son los astrocitos
y los oligodendrocitos, que se distinguen por varias
características. Los oligodendrocitos son de menor tamaño y
presentan mayor densidad en su núcleo y su citoplasma. Carecen de
filamentos intermedios y glucógeno en su citoplasma y presentan un
elevado número de microtúbulos (Peters y cols, 1991, Anat Rec;
229(3):384-98).
El oligodendrocito puede tener muchos procesos o
extensiones celulares y cada una de ellas contacta y envuelve
repetidas veces una porción de axón neuronal. Cuando estas envueltas
se condensan, la espiral de membrana forma la vaina de mielina. En
el mismo axón, los segmentos de mielina adyacentes pertenecen a
distintos oligodendrocitos y cada unidad de mielina termina cerca de
un nódulo de Ranvier (Bunge, 1968, Physiol Rev.
48(1):197-251).
Antes de madurar hasta formar la vaina de
mielina, los oligodendrocitos pasan por varias etapas de desarrollo
definidas por la expresión de receptores de superficie específicos y
por su respuesta a distintos factores de crecimiento, entre otras
moléculas. Así, el factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF, del inglés "platelet-derived growth
factor") se asocia tanto a la autorrenovación como a la
generación de oligodendrocitos (Richardson y cols, 1988, Nature. 9;
333(6173):562-5.; Raff y cols, 1989
Development. 105(3):595-603; Noble y cols,
1988 Nature. 9; 333(6173):560-2).
Así, los POs se caracterizan por expresar
Nestina^{+}, A2B5^{+}, NG2/AN2^{+},
plp-dm20^{+}, PDGFR\alpha^{+}, GD3^{+},
CNP^{+}. Posteriormente los POs dan lugar a los
preoligodendrocitos que expresan los mismos marcadores excepto
Nestina y además presentan O4 (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci.
5:409-417; de Castro y Bribián, 2005, Brain Res
Brain Res Rev. 49(2):227-41).
El inicio de la diferenciación terminal
(oligodendrocito inmaduro) se asocia a la síntesis y a la presencia
en la superficie celular de galactosilceramidas (GalC), que reconoce
el anticuerpo contra O1.
Los oligodendrocitos maduros expresan la
proteína básica de la mielina (MBP) y la proteína proteolípida (PLP)
y sintetizan la membrana de mielina. Otros marcadores moleculares
expresados por los oligodendrocitos maduros son O4^{+}, RIP^{+},
GalC^{+}, ACNP^{+}, MAG^{+} (Rowitch, 2004, Nat Rev Neurosci.
5:409-417; de Castro y Bribián, 2005, Brain Res
Brain Res Rev. 49(2):227-41).
Aunque la mayoría de los estudios de los
progenitores O-2A y los oligodendrocitos maduros se
han llevado a cabo en roedores, tanto células O-2A,
como células multipolares A2B5^{+}/O4^{+}, así como
oligodendrocitos maduros O1^{+} han sido identificados en cerebro
fetal humano (Rivkin y cols, 1995, Ann Neurol;
38(1):92-101).
En el adulto, tanto los los oligodendrocitos
como los POs se distribuyen de manera homogénea por todo el SNC,
principalmente en la sustancia blanca, pero también en la sustancia
gris.
La proliferación y diferenciación de los POs
(incluyendo el subsiguiente proceso de mielinización) siguen un
gradiente caudorrostral a lo largo del tubo neural. Cada paso del
proceso de diferenciación, desde la fase de precursor hasta la de
oligodendrocito maduro, puede ser identificado por cambios en la
morfología celular y en la expresión de marcadores
inmunocitoquímicos, lo que se acompaña de un descenso paulatino de
la capacidad proliferativa y migratoria (Almazán, G y cols, 2001,
Microsc Res Tech. 15; 52(6):753-65; Rowitch,
D, 2004, Nat Rev Neurosci. 5(5):409-19). La
expresión de estos marcadores sirve incluso para diferenciar entre
diversas poblaciones de oligodendrocitos. De hecho, se ha propuesto
la existencia de dos poblaciones distintas de POs: una población
dependiente del PDGF, población que denominamos PDGFR\alpha^{+},
y otra independiente de este factor de crecimiento, población
plp/dm20^{+} (Spassky, N y cols, 2000, Glia. 15;
29(2):143-8; Spassky, N y cols, 1998, J
Neurosci. 15;18(20):8331-43.; Pringle, NP y
Richarson, WD, 1993,
Development.117(2):525-33.; Le Bras, B, 2005,
Int J Dev Biol.
49(2-3):209-20). Ambas
poblaciones de oligodendrocitos experimentan un variado patrón de
migración para colonizar todo el SNC durante el desarrollo.
Durante el desarrollo, los oligodendrocitos se
generan a partir de POs. Este tipo celular se ha descrito en el SNC
de humanos adultos y constituye una fuente celular interesante para
su uso en terapias regenerativas para el tratamiento de lesiones
desmielinizantes, como por ejemplo la esclerosis múltiple. Este
potencial resulta especialmente interesante, porque se ha demostrado
que los axones pueden ser mielinizados a lo largo de toda la vida de
las neuronas, incluso después de haber sufrido un proceso de
desmielinización (Setzu y cols., 2004, Glia
45:307-311). En respuesta al daño desmielinizante,
los POs endógenos migran hacia la zona de lesión, pero no son
capaces de penetrar y remielinizar de manera efectiva, sino que se
quedan en la periferia o, si penetran en la zona de lesión, mueren
(Chang y cols, 2002, N Engl J Med. 346:165-173).
El estudio de los POs durante el desarrollo
embrionario ha permitido conocer los mecanismos moleculares que
regulan la migración, proliferación y diferenciación de este tipo
celular. Sin embargo, existen pocos datos acerca de la biología de
los POs en cerebro adulto, ya que hasta la fecha sólo se han podido
aislar de manera eficiente los POs de embriones o neonatos. Por
tanto, no se ha podido estudiar cuál es la fisiología de estos POs
adultos, sus similitudes y divergencias con lo visto en POs
embrionarios o postnatales tempranos.
La eficacia de cualquier proceso de purificación
de un tipo celular dado es inversamente proporcional al tiempo que
transcurre desde la obtención de la muestra hasta el momento de la
siembra de las células obtenidas en la combinación de un medio de
cultivo y un sustrato que permitan su supervivencia. La purificación
de POs a partir de tejido embrionario o perinatal es un proceso
mucho más eficiente que a partir de tejido maduro o adulto, ya que
en estadio embrionario o a corta edad la cantidad absoluta y la
proporción relativa de POs son significativamente mayores, y con la
edad, además, el potencial de supervivencia celular disminuye.
Hasta la fecha, la mayor parte de los estudios
se han realizado con cultivos de POs purificados a partir de cerebro
embrionario, preferentemente, o perinatal (desde recién nacido
hasta, máximo, 3-4 días de edad). Hay pocos estudios
en los que se obtengan POs a partir de tejido adulto, con la
excepción del nervio óptico de rata (Shi y cols, 1998, J Neurosci.
18(12):4627-4636). Esto ha imposibilitado el
estudio de la neurobiología de los POs adultos, lo cual es crucial
para el avance de la investigación sobre las enfermedades
desmielinizantes en cuanto a la búsqueda de nuevas terapias
farmacológicas y al desarrollo de la medicina regenerativa se
refiere.
Las líneas celulares son una herramienta útil y
de uso frecuente en la búsqueda de nuevos fármacos. Las líneas
celulares se obtienen de forma espontánea o artificial a partir de
cultivos celulares primarios. Estas células pueden proliferar
indefinidamente y se usan frecuentemente como modelos para el
estudio de las células de las que
proceden.
proceden.
En el caso de la oligodendroglia, se han
descrito líneas celulares oligodendrogliales de rata derivadas de
cerebros de animales de 2 días de edad, como la línea
CG-4, descrita por Louis y cols en 1992 (J Neurosci
Res. 1992; 31 (1):193-204) o la línea
OL-1, descrita por Lagarde y cols en 2007 (Int J Dev
Neurosci. 2007 25(2):95-105). Las líneas
celulares oligodendrogliales humanas descritas proceden de gliomas,
oligodendrogliomas o de oligodendrocitos fusionados con células
tumorales humanas (Buntinx y cols 2003, J Neurocytol.
32(1):25-38). Estas células de origen tumoral
no pueden usarse de manera segura en el estudio de la neurobiología
oligodendroglial, ni como herramienta terapéutica para el
tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, pues se desconoce
su proceso de inmortalización. Por todo esto, una línea celular de
POs humanos obtenida mediante un proceso de inmortalización
controlada sería de gran utilidad para la realización de ensayos de
respuesta a fármacos y ensayos de terapia celular en enfermedades
desmielinizantes.
El SNC está rodeado de tres capas de tejido
conectivo de origen mesodérmico conocidas como las meninges
(duramadre, aracnoides y piamadre), que protegen el SNC, entre otras
cosas, frente a infecciones y contienen el líquido cefalorraquídeo
(LCR) en el espacio subaracnoideo, protegiendo también mecánicamente
el SNC. Los plexos coroideos son las zonas de los ventrículos
cerebrales donde se produce el LCR y están formados por capilares
sanguíneos enrollados sobre sí mismos, limitados por células
endoteliales, revestidos de un tejido conjuntivo laxo y finalmente
recubiertos por un tejido epitelial. Para la purificación de los POs
es necesaria la completa retirada tanto de las meninges como de los
plexos coroideos, para evitar la contaminación del cultivo con
células procedentes de otros tejidos. Los métodos de purificación de
POs descritos hasta ahora solucionan la retirada de las meninges y
los plexos coroideos con una ardua, lenta, laboriosa y delicada
disección con pinzas bajo el microscopio estereoscópico, lo cual
incrementa la muerte celular significativamente especialmente en
ejemplares adultos.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Es necesario, por tanto, un procedimiento
sencillo y que permita la purificación de POs a partir de tejido
neural maduro o adulto, que permita el estudio de la neurobiología
de esta población celular, así como la realización de ensayos de
respuesta a fármacos y ensayos de terapia celular en enfermedades
desmielinizantes.
Los autores de la presente invención
proporcionan un método para el aislamiento y la purificación de POs
de cerebro maduro y adulto que permite:
- i.
- estudiar la neurobiología de POs adultos, más concretamente los procesos de proliferación, migración y diferenciación celular,
- ii.
- estudiar los efectos de determinados fármacos en los POs,
- iii.
- realizar estudios de criba de moléculas para encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades desmielinizantes y
- iv.
- ensayar terapias celulares en modelos animales de lesiones desmielinizantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el procedimiento de la presente
invención permite disminuir la duración del proceso de purificación
celular e incrementa considerablemente la supervivencia de los POs
y, con ello, la eficacia del método valorada en el número final de
células obtenido.
Esto se consigue eliminando la mayor parte de
las meninges y los plexos coroideos mediante una digestión
enzimática. Como se detalla en el ejemplo 1, la incubación de los
cerebros previamente disecados en una solución de la
cistein-proteasa papaína a una concentración
(variable según la edad) durante 5 minutos a 37ºC, permite la rápida
separación de estos tejidos del tejido nervioso de interés.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un método de obtención de POs a partir de la corteza
cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que
comprende:
- a)
- obtener una muestra aislada de cerebro,
- b)
- seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida en (a) y
- c)
- cultivar las POs en condiciones de proliferación o diferenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "precursor de oligodendrocito" o
PO tal y como se usa en la presente invención, se refiere a una
célula que aún no se ha diferenciado en un oligodendrocito maduro, y
que tiene potencial para diferenciarse en oligodendrocitos. En un
aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo
Nestina^{+}/PSA-NCAM^{+}/
plp-dm20^{+}/PDGFR\alpha^{+}. En otro aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo Nestina^{+}/A2B5^{+}/
NG2/AN2^{+}/plp-dm20^{+}/PDGFR\alpha^{+}/GD3^{+}/CNP^{+}. Incluso en otro aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo A2B5^{+}/NG2/AN2^{+}/plp-dm20^{+}/PDGFR\alpha^{+}/O4^{+}/GD3^{+}/CNP^{+}. Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFR\alpha, A2B5, NG2, O4, GD3 y CNP se refieren a la expresión de marcadores citoplásmicos o de superficie que sean proteínas que se reconozcan por los anticuerpos Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFR\alpha, A2B5, NG2, O4, GD3 y CNP, respectivamente.
plp-dm20^{+}/PDGFR\alpha^{+}. En otro aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo Nestina^{+}/A2B5^{+}/
NG2/AN2^{+}/plp-dm20^{+}/PDGFR\alpha^{+}/GD3^{+}/CNP^{+}. Incluso en otro aspecto de la invención, el PO puede caracterizarse por el fenotipo A2B5^{+}/NG2/AN2^{+}/plp-dm20^{+}/PDGFR\alpha^{+}/O4^{+}/GD3^{+}/CNP^{+}. Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFR\alpha, A2B5, NG2, O4, GD3 y CNP se refieren a la expresión de marcadores citoplásmicos o de superficie que sean proteínas que se reconozcan por los anticuerpos Nestina, PSA-NCAM, PLP, PDGFR\alpha, A2B5, NG2, O4, GD3 y CNP, respectivamente.
El término "cerebro" tal y como se usa en
la presente invención, se refiere a tejido neural de mamífero de
edad superior a 7 días, incluyendo el prosencéfalo, el hipocampo, el
cerebelo, la corteza, el estriado, el telencéfalo, el diencéfalo, el
mesencéfalo, el hipotálamo, el locus coeruleus y el
rombencéfalo.
El término "mamífero" tal y como se usa en
la presente invención, se utiliza para referirse a cualquier
organismo del superreino Eukaryota, reino Metazoa, phylum Chordata,
subphylum Craniata, superclase Gnathostomata y clase Mammalia, y se
refiere a cualquier especie de mamífero, incluyendo humanos,
primates no humanos, roedores, equinos, caninos, felinos, bovinos,
porcinos, ovinos y lagomorfos.
Preferiblemente, el mamífero tiene más de una
semana de edad. Más preferiblemente, el mamífero tiene más de dos
semanas de edad. Aún más preferiblemente, el mamífero tiene entre 15
días y 9 meses de edad. Mucho más preferiblemente, el mamífero tiene
entre 15 días y 6 meses de edad. Preferiblemente, el paso (b)
comprende la digestión enzimática de la muestra obtenida según (a).
Más preferiblemente, la enzima empleada para la digestión del paso
(b) es la papaína. Aún más preferiblemente, la concentración de
papaína empleada para la digestión del paso (b) es de entre 50 y 200
microgramos/mililitro.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el paso (b)
comprende:
- i.
- una primera digestión enzimática de la muestra obtenida según (a),
- ii.
- retirar las meninges y los plexos coroideos,
- iii.
- disociar mecánicamente el tejido nervioso resultante del paso (ii), y
- iv.
- disociar enzimáticamente el tejido nervioso resultante del paso (iii).
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, la concentración de papaína
empleada en el paso (i) es de entre 150 y 200 microgramos/mililitro.
Más preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso
(i) es de entre 160 y 190 microgramos/mililitro. Aún más
preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso (i)
es de entre 170 y 185 microgramos/mililitro.
Preferiblemente, la concentración de papaína
empleada en el paso (iv) es de entre 50 y 120 microgramos/mililitro.
Más preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso
(iv) es de entre 60 y 110 microgramos/mililitro. Aún más
preferiblemente, la concentración de papaína empleada en el paso
(iv) es de entre 70 y 100 microgramos/mililitro.
Preferiblemente, el tiempo de la digestión
enzimática empleada en el paso (b) es de entre 2 y 22 minutos.
Preferiblemente, el tiempo de la digestión
enzimática empleada en el paso (i) es de entre 3 y 7 minutos. Más
preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el
paso (i) es de entre 4 y 6 minutos.
Preferiblemente, el tiempo de la digestión
enzimática empleada en el paso (iv) es de entre 8 y 18 minutos. Más
preferiblemente, el tiempo de la digestión enzimática empleada en el
paso (iv) es de entre 9 y 16 minutos.
Preferiblemente, el paso (b) comprende una
digestión enzimática de la muestra obtenida según (a) con DNasa. Más
preferiblemente, el paso (b) comprende una digestión enzimática de
la muestra obtenida según (a) con DNasa-I.
La eficiencia del método de la invención se ha
contrastado con el método de purificación celular mediante FACS (del
inglés "Fluorescence Activated Cell Sorting") y con el
kit comercial denominado "Oligodendrocyte Selection Kit"
de Heraclitus Biosciences (HB), como está descrito en los ejemplos
1-3. Además, se contrasta también la eficiencia del
método de la invención con el descrito en el ejemplo 4, donde se
purifican POs a partir de nervio óptico de rata adulta mediante
inmuno-adsorción.
Como muestra la tabla 1, la eficiencia del
método de la invención es mucho más elevada que la de cualquier otro
método descrito hasta ahora para la purificación de POs a partir de
tejido maduro o adulto. La invención presenta un método casi 7 veces
más eficiente que el método del ejemplo 2, casi 10 veces más
eficiente que el método del ejemplo 3 y más de 27 veces más
eficiente que el método del ejemplo 4.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
célula obtenida u obtenible mediante el método de la invención, de
ahora en adelante denominada "célula de la invención". Una
realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a
un cultivo celular derivado de la célula de la invención. Otra
realización más preferida se refiere a una línea celular derivada de
la célula de la invención. Más preferiblemente, la línea celular se
ha inmortalizado mediante transfección génica.
El término "inmortalización" se refiere al
proceso de transformación de una célula que consiste en la
adquisición de dicha célula de dividirse ilimitadamente en el
tiempo, sin sufrir envejecimiento o senescencia.
El término "transfección génica" se refiere
a cualquier técnica o procedimiento que permita la integración en
una serie de células de un organismo vivo de un gen exógeno, o
"transgén", y que confiere a dichas células una nueva propiedad
biológica. Este procedimiento es sobradamente conocido por un
experto en la materia, y puede llevarse a cabo mediante vectores
virales, mediante métodos químicos o físicos. Preferiblemente, el
método de transfección es la infección viral. El transgén o gen
exógeno se refiere a un ADN normalmente no residente, ni presente en
la célula que se pretende transformar. En el caso particular de la
presente invención el ADN codifica para un gen de inmortalización
celular. Pueden considerarse genes de inmortalización celular, pero
sin limitarnos, los genes que codifican para: telomerasa o
transcriptasa reversa de la telomerasa, genes myc, o genes virales
como SV40T (antígeno T del virus de simio 40), EBV (virus de
Epstein-Barr), genes adenovirales, genes del
Papilomavirus E6 y E7.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de descubrimiento o screening de fármacos que
comprende:
- a.
- establecer un cultivo celular a partir de los POs según la reivindicación 16, o una línea celular según la reivindicación 17,
- b.
- administrar una sustancia química al cultivo o línea celular de (a),
- c.
- estudiar el efecto de la sustancia química de (b) en el cultivo celular de (a).
\vskip1.000000\baselineskip
El término "estudiar el efecto de la sustancia
química" comprende, pero sin limitarnos, estudiar la
supervivencia celular, la viabilidad celular, la muerte celular, el
estrés celular, la proliferación celular, la migración celular, la
diferenciación celular, o estudios de desmielinización,
mielinización o remielinización.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Identificación de POs de ratones
adultos (60 días de edad) de la cepa CD-1. Los POs
se identificaron con una doble detección inmunocitoquímica contra
A2B5 y Olig-2 (A-C) o contra NG2 y
A2B5 (D-F). Barra de escala: 5 micras.
Figura 2. Separación por FACS de POs de cerebro
adulto de ratones transgénicos plp-GFP. Histogramas
de las células sin marcar (A) y teñidas con un anticuerpo
anti-A2B5 conjugado con ficoeritrina (PE, del inglés
"phyeoeritrin") (B). Porcentajes relativos de las
distintas poblaciones celulares (GFP^{-}/A2B5^{+},
GFP^{+}/A2B5^{-}, GFP^{+}/A2B5^{+}) sin marcar (C) y teñidas
con un anticuerpo anti-A2B5 conjugado con PE
(D).
Figura 3. Identificación de POs de corteza
cerebral humana. Los POs se identificaron con una doble tinción
inmunocitoquímica contra PDGFR\alpha y NG2 (A-C),
contra NG2 y A2B5 (D-F) y contra
Olig-2 y A2B5 (G-I).
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la
naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen
solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los
ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el
campo de aplicación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones de cepa CD1 fueron suministrados por
Charles River Laboratories. Todo el trabajo se llevó a cabo según
las Normativas Española (RD 1201/2005 (BOE
252/34367-91, 2005)) y Europea (86/ 609/ EEC y
2003/65/EC) sobre manejo y uso animal.
Un día antes del cultivo primario se recubren
los frascos en los que se sembrarán las células con
poli-ornitina a una concentración de 10 mg/l. Antes
de sembrar las células se retira la poli-ornitina y
se lavan los frascos para eliminar los restos.
Los animales fueron sacrificados por dislocación
cervical y/o asfixia con CO_{2} y los cerebros se extrajeron y se
llevaron a una placa con solución salina con calcio y magnesio (HBSS
del inglés "Hanks' Balanced Salt Solution") en
hielo.
Para retirar rápidamente las meninges y los
plexos coroideos, los cerebros se incubaron en diferentes diluciones
de una solución de papaína (SP, compuesta por: papaína 0,9 mg/ml,
L-cisteína 0,2 mg/ml, EDTA 0,2 mg/ml en HBSS) a 37ºC
durante 5 minutos (ver Tabla 2). Los restos de meninges y plexos se
terminaron de retirar con pinzas y con la ayuda de un microscopio
estereoscópico. Una vez limpias, las cortezas cerebrales se llevaron
a una nueva placa con HBSS en hielo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El tejido fue disociado mecánicamente con la
ayuda de unas tijeras y se preincubó durante 5 minutos a 37ºC. Los
trozos de tejido se incubaron en diferentes diluciones de la
solución de papaína arriba descrita pero en HBSS sin calcio ni
magnesio. La dilución y el tiempo de incubación empleados para cada
edad animal están detallados en la Tabla 2. La digestión enzimática
se paró mediante la adición de medio con suero y DNasal (DMEM, del
inglés "Dulbecco's Modified Eagle Medium", con 10% de
suero fetal bovino y 1% de DNasal).
Tras disociar mecánicamente el tejido mediante
unos 25 pases de micropipeta, la suspensión celular se incubó,
durante 5 minutos, a 37ºC y posteriormente se centrifugó a 900 rpm,
durante 10 minutos. El sobrenadante y los restos de mielina se
eliminaron y las células se resuspendieron en medio con suero. La
suspensión celular se filtró por una malla de 100 micras y se sembró
en un volumen final de 10 ml de medio de POs (DMEM con 10% de suero
fetal bovino (SFB), 10 ng/ml de PDGF\alpha y 1% de penicilina y
estreptomicina) por cada frasco de 75 cm^{2} de superficie,
previamente recubierto con poli-ornitina, como está
descrito arriba. La densidad celular de siembra depende de cada
estadio. El número de animales necesarios para cada frasco se
detalla la Tabla 2.
Un día después se cambió la totalidad de medio
para evitar la muerte celular. A partir de entonces, el medio se
cambió cada dos o tres días.
Un mes o 40 días después de la siembra se obtuvo
una monocapa de astrocitos con POs sobre ella. Para purificar los
POs, los frascos de cultivo se cerraron y se agitaron durante la
noche, a 300 rpm y 37ºC de temperatura.
A la mañana siguiente se recogió el medio con
los POs en suspensión y se filtró por una malla de 40 micras,
centrifugándose después la suspensión celular a 900 rpm durante 10
minutos. Las células se resuspendieron en medio de POs y se
sembraron en placas petri durante 45 minutos a 37ºC para eliminar
las células de microglía, que se adhieren rápidamente al sustrato.
Transcurrido este tiempo se recogió la suspensión celular, se volvió
a filtrar con una malla de 40 micras y se volvió a centrifugar como
antes. Las células se resuspendieron y sembraron de nuevo en medio
de POs y en placas petri durante otros 30 minutos a 37ºC para
retirar las células de microglía que pudieran quedar.
Este medio enriquecido en POs se recogió y
centrifugó como se describe arriba. Las células fueron finalmente
resuspendidas en medio BS (Bottenstein-Sato, para
10 ml de medio: 9,6 ml de DMEM, 100 microlitros de SFB, 100
microlitros de L-Glutamina 200 mM, 100 microlitros
de Penicilina/Estreptomicina, 60 microlitros de BSA al 5%, 10
microlitros de transferrina 100 mg/ml, 1,86 microlitros de Insulina
50 mg/ml, 1 microlitro de Progesterona 0,62 mg/ml, 1 microlitro de
putrescinal 60 mg/ml, 1 microlitro de T3 3 mg/ml, 1 microlitro de T4
4 mg/ml, 1 microlitro de selenito sódico 0,39 ng/ml), contadas y
sembradas de distinta forma para el estudio bien de proliferación,
de migración o de diferenciación hacía oligodendrocitos maduros
(Bribián y cols, 2006, Mol Cell Neurosci.
33(1):2-14; Merchán y cols., 2007, Mol Cell
Neurosci. 36(3):355-68, Bribián y cols.,
2008, Dev Neurobiol. 68(13):1503-16).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
La separación celular por activación de
fluorescencia se llevó a cabo con ratones transgénicos
plp-GFP (Spassky et al, 1998; Bribián et al,
2006, Merchán et al, 2007).
Los animales se sacrificaron como en el ejemplo
1 y los cerebros se extrajeron de la misma manera. Las meninges y
los plexos coroideos se retiraron como en el ejemplo 1 y las
cortezas cerebrales se disecaron mecánicamente con el "Neural
Tissue Dissociation Kit" de Miltenyi Biotec, según las
instrucciones del fabricante.
Los restos de mielina se eliminaron mediante una
filtración de la suspensión celular a través de una malla de 40
micras seguida de una centrifugación en sacarosa (0,9 M) en HBSS en
hielo.
Las células se tiñeron con anticuerpo
anti-A2B5 conjugado con PE y se analizaron y
separaron en un equipo FACSAria de BD. Las células se separaron en
HBSS con 2% de suero fetal bovino, 25 mM HEPES y 5 mM EDTA.
Como muestra la Figura 2, en el cerebro de
ratones adultos (2 meses de edad) hay un porcentaje muy bajo (en
torno al 2%) de células doble positivas para GFP (plp) y A2B5.
Además, el proceso de separación provoca una muerte masiva de
células, ya que sólo alrededor del 50% de las células analizadas
sobreviven 24 horas después de la separación.
La purificación de POs de corteza cerebral de
ratón de 2 meses de edad mediante FACS tiene un rendimiento final de
10.000 POs por cada animal utilizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Es importante puntualizar que este kit está
descrito por el fabricante para la obtención de oligodendrocitos
inmaduros con fenotipo O4^{+}/GalC^{-} a partir de cerebros de
rata o ratón P3, es decir, de 3 días de edad, lo que anteriormente
hemos llamado estadio perinatal.
Los animales se sacrificaron como en el ejemplo
1 y los cerebros se extrajeron de la misma manera. Posteriormente,
se siguieron las instrucciones del fabricante detalladas en el
manual del usuario.
A pesar de haber introducido el paso de
digestión enzimática de las meninges (ver arriba) para minimizar la
muerte celular, este método ("Oligodendrocyte Selection
Kit") resultó casi 10 veces menos eficaz que el descrito en
el Ejemplo 1, con un rendimiento final de 7.500 POs por animal
adulto.
\vskip1.000000\baselineskip
Este método está descrito en la solicitud de
patente PCT/US1996/013279 y consiste en la purificación de los POs
de nervio óptico de rata adulta a partir de una suspensión mixta de
células del nervio óptico. Esta suspensión celular se pone en
contacto primeramente con una placa donde previamente se ha
absorbido un anticuerpo anti-Thy1, lo que permite la
retirada de células de origen no glial. La suspensión celular se
pone entonces en contacto con una segunda placa previamente
adsorbida con anticuerpo anti-A2B5, anticuerpo
anti-NG2 o con aglutinina de cacahuete, que va a
permitir que sólo las células con estas proteínas en su superficie
queden adsorbidas a la placa. Estas células serán en su mayoría POs
aunque, en el caso de A2B5, podrán ser también precursores
O-2A.
La eficiencia de este método es aproximadamente
de 2.500 POs por cada animal (1.250 POs por nervio óptico;
WO/1997/007200; Shi y cols, 1998), lo cual es enormemente inferior
(30 veces) a la del método de la invención
(Tabla 1).
(Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la obtención de POs humanos se siguió el
protocolo descrito en el ejemplo 1 con las siguientes
modificaciones:
- a.
- Para la siembra de cada frasco de 25 cm^{2} se empleó una cantidad de tejido de entre 1 y 4 gramos, encontrando los mejores resultados empleando 4 gramos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- b.
- La digestión enzimática de las meninges y los plexos coroideos se realizó empleando la solución de papaína (SP) a una dilución de 1:2,5, durante 10 minutos.
- c.
- El volumen de medio de POs fue de 5 ml por frasco de 25 cm^{2}.
- d.
- La agitación para separar los POs se realizó a 250 rpm.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficiencia de este método es de 60.000
células POs por cada gramo de tejido fresco utilizado.
Claims (18)
1. Un método de obtención de POs a partir de la
corteza cerebral de un mamífero de edad superior a una semana, que
comprende:
- a)
- obtener una muestra aislada de cerebro,
- b)
- seleccionar las POs de la muestra biológica obtenida en (a) y
- c)
- cultivar las POs en condiciones de proliferación, migración, movilidad o diferenciación celular.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método según la reivindicación anterior
donde el paso (b) comprende la digestión enzimática de la muestra
obtenida según (a).
3. El método según la reivindicación 2 donde el
paso (b) comprende:
- i.
- una primera digestión enzimática de la muestra obtenida según (a),
- ii.
- retirar las meninges y los plexos coroideos,
- iii.
- disociar mecánicamente el tejido nervioso resultante del paso (ii), y
- iv.
- disociar enzimáticamente el tejido nervioso resultante del paso (iii).
\vskip1.000000\baselineskip
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 2-3 donde la enzima empleada para
la digestión enzimática del paso (b) es la papaína.
5. El método según la reivindicación 4 donde la
concentración de papaína empleada en el paso (b) es de entre 50 y
200 microgramos/mililitro.
6. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 4-5, donde la concentración de
papaína empleada en el paso (i) es de entre 150 y 200
microgramos/mililitro.
7. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 4-6, donde la concentración de
papaína empleada en el paso (iv) es de entre 50 y 120
microgramos/mililitro.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 4-7, donde la concentración de
papaína empleada en el paso (iv) es de entre 70 y 100
microgramos/mililitro.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 2-8, donde el tiempo de la
digestión enzimática empleada en el paso (b) es de entre 2 y 22
minutos.
10. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 3-9, donde el tiempo de la
digestión enzimática empleada en el paso (i) es de entre 3 y 7
minutos.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 3-9, donde el tiempo de la
digestión enzimática empleada en el paso (iv) es de entre 8 y 18
minutos.
12. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, donde el paso (b) comprende
una digestión enzimática con DNasa.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, donde el mamífero tiene más
de dos semanas de edad.
14. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, donde el mamífero tiene entre
15 días y 9 meses de edad.
15. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, donde el mamífero tiene entre
15 días y 6 meses de edad.
16. POs obtenibles por el método según
cualquiera de las reivindicaciones 1- 15.
17. Una línea celular de POs obtenible por el
método según cualquiera de las reivindicaciones
1-15, o por la inmortalización celular mediante
transfección génica de los POs de la reivindicación 16.
\newpage
18. Método de descubrimiento de fármacos que
comprende:
- a.
- establecer un cultivo celular a partir de los POs, según la reivindicación 16, o una línea celular de POs, según la reivindicación 17,
- b.
- administrar una sustancia química al cultivo o línea celular de (a),
- c.
- estudiar el efecto de la sustancia química de (b) en el cultivo celular de (a).
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201030493A ES2375860B8 (es) | 2010-03-31 | 2010-03-31 | Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos. |
| PCT/ES2011/070191 WO2011121158A2 (es) | 2010-03-31 | 2011-03-22 | Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos |
| EP11721797A EP2554663A2 (en) | 2010-03-31 | 2011-03-22 | Method for obtaining oligodendrocyte precursor cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201030493A ES2375860B8 (es) | 2010-03-31 | 2010-03-31 | Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2375860A1 true ES2375860A1 (es) | 2012-03-07 |
| ES2375860B1 ES2375860B1 (es) | 2013-01-25 |
| ES2375860B8 ES2375860B8 (es) | 2013-06-10 |
Family
ID=44484795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201030493A Expired - Fee Related ES2375860B8 (es) | 2010-03-31 | 2010-03-31 | Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2554663A2 (es) |
| ES (1) | ES2375860B8 (es) |
| WO (1) | WO2011121158A2 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115340982A (zh) * | 2022-08-23 | 2022-11-15 | 徐州医科大学 | 一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005046610A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-26 | Cornell Research Foundation, Inc. | Genes differentially expressed by acutely isolated resident progenitor cells of the human white matter |
| US20060172415A1 (en) * | 2003-07-18 | 2006-08-03 | Hiroshi Okazaki | Oligodendrocyte precursor cells and method of obtaining and culturing the same |
| US20060183147A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-08-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying genes which modulate myelination |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997007200A1 (en) | 1995-08-16 | 1997-02-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Adult oligodendrocyte precursor cell compositions and methods |
-
2010
- 2010-03-31 ES ES201030493A patent/ES2375860B8/es not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-03-22 EP EP11721797A patent/EP2554663A2/en not_active Withdrawn
- 2011-03-22 WO PCT/ES2011/070191 patent/WO2011121158A2/es active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060172415A1 (en) * | 2003-07-18 | 2006-08-03 | Hiroshi Okazaki | Oligodendrocyte precursor cells and method of obtaining and culturing the same |
| WO2005046610A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-26 | Cornell Research Foundation, Inc. | Genes differentially expressed by acutely isolated resident progenitor cells of the human white matter |
| US20060183147A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-08-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying genes which modulate myelination |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CACCI, E., et al. Generation of human cortical neurons from a new immortal fetal neural stem cell line. Experimental cell research. 01-02-2007. Vol. 313, nº 3, páginas 588-601. ISSN 0014-4827 (Impreso). doi:10.1016/j.yexcr.2006.11.001 . Ver apartado 1 de 'Materiales y Métodos'. * |
| CHEN, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nature protocols. 2007. Vol. 2, nº 5, páginas 1044-1051. ISSN 1750-2799 (Electrónico). Ver todo el documento, especialmente resumen y Protocolo A (página 1046). * |
| LAGARDE, W, et al. A non-transformed oligodendrocyte precursor cell line, OL-1, facilitates studies of insulin-like growth factor-I signaling during oligodendrocyte development. International journal of developmental neuroscience. Abril 2007. Vol. 25, nº 2, páginas 65-105. ISSN 0736-5748 (Impreso). doi:10.1016/j.ijdevneu.2006.12.006. Ver apartados 2.1.2. y 2.1.2. de ¿Procedimientos experimentales¿ (página 96, columna 2, y página 97, columna1, párrafo 1). * |
| PALMER, T.D., et al. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 1997. Vol. 8, nº 6, páginas 389-404. ISSN 1044-7431 (Impreso). doi:10.1006/mcne.1996.0595. Ver resumen y apartado 1 de 'Métodos experimentales'. * |
| PAN, H-C, et al. Enhanced regeneration in spinal cord injury by concomitant treatment with granulocyte colony-stimulating factor and neuronal stem cells. Journal of clinical neuroscience. Junio 2008. Vol. 15, nº 6, páginas 656-664. ISSN 0967-5868 (Impreso). doi:10.1016/j.jocn.2007.03.020. Ver apartado 1 de ¿Materiales y Métodos¿. * |
| ROY, N. S., et al. Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter. Journal of Neuroscience. 15-11-1999. Vol. 19, nº 22, páginas 9986-9995. ISSN 0270-6474 (Impreso). Ver apartado 2 de Materiales y Métodos¿ y Figura 4. * |
| VILLA, A., et al. Generation and properties of a new human ventral mesencephalic neural stem cell line. Experimental cell Research. 01-07-2009. Vol. 315, nº 11, páginas 1860-1874. ISSN 0014-4827. doi:10.1016/j.yexcr.2009.03.011. Ver apartado 2 de ¿Materiales y Métodos¿. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2554663A2 (en) | 2013-02-06 |
| ES2375860B8 (es) | 2013-06-10 |
| WO2011121158A2 (es) | 2011-10-06 |
| WO2011121158A3 (es) | 2011-12-08 |
| ES2375860B1 (es) | 2013-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Darsalia et al. | Survival, migration and neuronal differentiation of human fetal striatal and cortical neural stem cells grafted in stroke‐damaged rat striatum | |
| CN103146649B (zh) | 神经干细胞 | |
| Gaiano et al. | The role of notch in promoting glial and neural stem cell fates | |
| Jones et al. | Mesenchymal stem cells rescue Purkinje cells and improve motor functions in a mouse model of cerebellar ataxia | |
| CN103396993B (zh) | 衍生自灵长类胚胎干细胞的用于脊髓损伤的再髓鞘化和治疗的少突胶质细胞 | |
| CN103068974B (zh) | 体细胞至诱导的重编程神经干细胞(irNSC)的转化 | |
| Okano | Neural stem cells and strategies for the regeneration of the central nervous system | |
| US6638763B1 (en) | Isolated mammalian neural stem cells, methods of making such cells | |
| Abeysinghe et al. | Pre-differentiation of human neural stem cells into GABAergic neurons prior to transplant results in greater repopulation of the damaged brain and accelerates functional recovery after transient ischemic stroke | |
| CN104894060A (zh) | 诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用 | |
| JP6997716B2 (ja) | 間葉系マーカーおよびニューロンマーカーを発現する幹細胞、その組成物、ならびにその調製方法 | |
| JP7138959B2 (ja) | 神経前駆細胞集団を作出する方法 | |
| ES2649396T3 (es) | Métodos y composiciones para expandir, identificar, caracterizar y mejorar la potencia de células progenitoras restringidas gliales derivadas de mamíferos | |
| Westerlund et al. | Endoscopically harvested stem cells: a putative method in future autotransplantation | |
| CN103459590A (zh) | 可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞 | |
| CN101124319B (zh) | 神经干细胞 | |
| Zholudeva et al. | Preparation of neural stem cells and progenitors: neuronal production and grafting applications | |
| Yeh et al. | Radial stem astrocytes (aka neural stem cells): identity, development, physio‐pathology, and therapeutic potential | |
| JP2002518043A (ja) | 上衣神経幹細胞とその分離方法 | |
| Richardson et al. | Heterotypic neuronal differentiation of adult subependymal zone neuronal progenitor cells transplanted to the adult hippocampus | |
| CN111484977B (zh) | 重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法 | |
| WO2023165062A1 (zh) | 一种少突胶质细胞的制备方法及应用 | |
| ES2375860A1 (es) | Método para la obtención de células precursoras de oligodendrocitos. | |
| KR101738715B1 (ko) | 식물 줄기세포 또는 식물 역분화 줄기 세포의 추출물을 이용한 맞춤형 만능줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 | |
| Bi et al. | Dental follicle cells show potential for treating Parkinson’s disease through dopaminergic-neuronogenic differentiation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2375860 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20130125 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20210915 |