ES2374841T3 - Secuencias y composiciones de péptidos. - Google Patents
Secuencias y composiciones de péptidos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2374841T3 ES2374841T3 ES07712678T ES07712678T ES2374841T3 ES 2374841 T3 ES2374841 T3 ES 2374841T3 ES 07712678 T ES07712678 T ES 07712678T ES 07712678 T ES07712678 T ES 07712678T ES 2374841 T3 ES2374841 T3 ES 2374841T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- hla
- cells
- flu
- influenza
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 164
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 122
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 98
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 20
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 79
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 47
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 25
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 57
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 57
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 56
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 230000004044 response Effects 0.000 description 52
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 34
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 33
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 31
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 29
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 28
- 101000992283 Homo sapiens Optineurin Proteins 0.000 description 25
- 102100022389 Nucleosome assembly protein 1-like 1 Human genes 0.000 description 25
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 24
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 21
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 20
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 18
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 16
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 11
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 11
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 11
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 11
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 11
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 10
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 10
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 9
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 6
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 description 4
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 4
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 3
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 3
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 description 3
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 3
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100031618 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 2
- 108010093061 HLA-DPA1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010045483 HLA-DPB1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010067148 HLA-DQbeta antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 2
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010086377 HLA-A3 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000012153 HLA-B27 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010061486 HLA-B27 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010047214 HLA-DRB1*03:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010029657 HLA-DRB1*04:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 101000986084 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101100395310 Homo sapiens HLA-A gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- -1 M1A amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710204040 Myosin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101100117565 Oryza sativa subsp. japonica DRB4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002769 b effector cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000027950 fever generation Effects 0.000 description 1
- 101150020161 flu-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un polipéptido que consiste en hasta 40 aminoácidos, tal polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos 95% de homología con la SEQ ID 1: SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP en la que, el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado que expresa un alelo del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y es inmunogénica para una pluralidad de cepas del virus de la gripe.
Description
Secuencias y composiciones de péptidos.
La invención se refiere a secuencias de péptidos, composiciones que comprenden las secuencias de péptidos, y en particular vacunas de la gripe que comprenden las secuencias y las composiciones, y uso de las secuencias. La presente invención se refiere especialmente a vacunas que son protectoras contra una pluralidad de cepas del virus de la gripe, que incluyen los virus existentes a través de diferentes especies (por ejemplo, protectoras contra gripe humana y aviar) así como virus futuros que han mutado de virus existentes (tal como una forma mutada de gripe aviar que es fácilmente transmisible de ser humano a ser humano, que potencialmente puede originar a una gripe pandémica).
La defensa contra la enfermedad es crítica para la supervivencia de todos los animales, y el mecanismo de defensa empleado para este fin es el sistema inmunológico del animal. La comprensión del sistema inmunológico es en consecuencia una clave para la comprensión del desarrollo de tratamientos nuevos y más sofisticados para seres humanos y animales similares.
El mecanismo de operación del sistema inmunológico ha estado bajo investigación durante muchos años. El sistema está compuesto de numerosos tipos celulares y una variedad de moléculas, lo que lo hace extremadamente complejo. Aun después de muchos años de estudio, la extensión completa de los componentes del sistema inmunológico, y sus interacciones entre sí, no está perfectamente entendida.
Hace muchos años que se reconoció que una persona que se recupera de una enfermedad particular puede obtener alguna protección en el futuro contra esa enfermedad, pero no contra una enfermedad que esa persona no ha contraído todavía. Este aspecto fundamental del sistema inmunológico se interpretó en ese momento por la consideración de que el sistema inmunológico adquirió una clase de “memoria” contra ciertos patógenos una vez que ha ocurrido la exposición a tales patógenos, esta memoria es específica para una enfermedad determinada.
En forma gradual, se ha conocido que la exposición a variantes menos perjudiciales de un patógeno podría inducir la protección contra variantes más perjudiciales (por ejemplo, la exposición a la viruela de la vaca para proteger contra la viruela, o exposición a un ántrax inactivado para proteger contra un ántrax vivo). En consecuencia, surgió la idea de la vacunación contra una enfermedad.
En la actualidad se sabe que el sistema inmunológico tiene al menos dos divisiones: inmunidad innata e inmunidad adaptativa. El sistema innato es completamente funcional antes de que un patógeno entre al sistema, mientras que el sistema adaptativo cambia después que el patógeno entra en el sistema, Posteriormente este desarrolla un ataque específico para el patógeno. El sistema innato comprende numerosos componentes, que incluye fagocitos tales como macrófagos, los cuales (como sugiere el nombre) “comen” o ingieren cuerpos extraños tales como patógenos.
Normalmente, pero no en forma exclusiva, la presente invención se refiere al sistema inmunológico adaptativo, y a menos que indique específicamente lo contrario, “sistema inmunológico” en el presente contexto se refiere al sistema inmunológico adaptativo.
A fin de entender más completamente cómo funciona el sistema inmunológico, se debe considerar cuidadosamente el papel de sus componentes individuales. Con respecto al sistema inmunológico adaptativo, es bien conocido que la inmunidad contra los patógenos es provista por la acción de los linfocitos, que constituyen el tipo celular más común del sistema inmunológico. Existen dos tipos de linfocitos: el linfocito B y el linfocito T. Estos se denominan generalmente células B y células T respectivamente.
Las células B tienen la capacidad de desarrollarse en células plasmáticas, que fabrican anticuerpos. Los anticuerpos son componentes muy importantes del sistema inmunológico animal. Estos se producen en respuesta a alguna porción distintiva del patógeno invasor (un antígeno del patógeno – los antígenos de la presente se definen como cualquier sustancia extraña reconocida por el sistema inmunológico) y son usualmente específicos para ese patógeno. Sin embargo, si dos patógenos son muy similares, o al menos contienen el mismo antígeno, entonces los anticuerpos producidos contra uno pueden no obstante ser efectivos contra el otro (pueden “reaccionar en forma cruzada”). Esto explica por qué la inoculación con virus de la viruela bovina puede proteger contra la viruela. Es importante interpretar que los anticuerpos ‘reconocen’ solo una pequeña porción de la molécula antigénica del patógeno más que el patógeno como un todo. Estas porciones se denominan epitopes.
Las células T no poseen o producen anticuerpos. En cambio, reconocen fragmentos (es decir, epitopes) del antígeno extraño complejado con el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) (o en el caso de los seres humanos, antígeno leucocitario humano (HLA)) por medio de un receptor especializado conocido como TCR (receptor de células T). Las células T son divisibles por sí mismas en subconjuntos que pueden tener una función regulatoria o una función efectora. Las células efectoras están involucradas en la “realización” de la eliminación de las sustancias extrañas. Por ejemplos, las células T citotóxicas (CTL) son células efectoras que pueden destruir las células infectadas, así como otras especies no deseadas tales como células tumorales. Las células T regulatorias, a la inversa, cumplen un papel de ayudar a que las células efectoras T y B sean más efectivas. Debido a esta función, estas células T regulatorias se denominan frecuentemente células T ‘auxiliares’. Otras células T regulatorias, denominadas células T ‘supresoras’, se considera que inhiben las respuestas inmunes, pero estas son menos bien entendidas. Las células T regulatorias también pueden interactuar con los componentes del sistema inmunológico innato para reforzar su actividad.
En un individuo sano normal, los linfocitos en el sistema inmunológico permanecen en un estado de ‘reposo’ inactivo hasta desencadenar una respuesta inmune. Cuando se requiere una respuesta inmune, los linfocitos son activados, proliferan y comienzan a llevar a cabo sus funciones designadas. Por ejemplo, se activa cualquier célula T que despliega sobre su superficie un TCR que reconoce un epitope del patógeno invasor complejado con una molécula MHC, prolifera (esto se denomina expansión clonal) y la descendencia resultante comienza a realizar activamente sus funciones efectoras predeterminadas requeridas para combatir los organismos invasores.
Cuando se completa la respuesta inmune, (es decir, los patógenos y/o células infectadas se han eliminado) los linfocitos revierten a un estado en reposo nuevamente. Este estado de reposo no es, sin embargo, equivalente al estado inactivo inicial. Los linfocitos activados, pero en reposo, se pueden reclutar e inducir rápidamente para proliferar en respuesta a una infección con el mismo patógeno, o estrechamente relacionado en un momento posterior.
Esta capacidad de los linfocitos en reposo activados, para desencadenar una respuesta más rápida y potente después de un segundo encuentro con un patógeno invasor, proporciona efectivamente el sistema inmunológico con ‘memoria’. El aprovechamiento de la memoria inmunológica del sistema es la base para los fármacos inmunoprofilácticos de largo plazo (por ejemplo, vacunas) y aún es el objetivo del desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos al largo plazo.
A fin de que las células realicen sus funciones dentro de los sistemas complejos de un animal, las células deben tener ‘receptores’ en sus superficies. Estos receptores son capaces de ‘reconocer’ sustancias específicas que controlan varios procesos esenciales tales como activación, proliferación y adherencia a otras células o sustratos. Por ejemplo, en el caso del sistema inmunológico, los receptores de las células T y B les permiten no solo reconocer el antígeno sino también interactuar entre sí y de este modo regular sus actividades. Sin estos receptores, las células pueden carecer de un medio esencial de comunicación y pueden ser incapaces de actuar efectivamente en la forma concertada que es esencial para el sistema inmunológico de un organismo multicelular.
A fin de poder reconocer específicamente y tratar con la amplia variedad de patógenos presentes en el ambiente, el sistema inmunológico ha desarrollado dos tipos de receptor de antígeno altamente variables en los linfocitos: anticuerpos en las células B y receptores de las células T, o TCR, en las células T.
Existe una gran cantidad de diferentes receptores posibles en el organismo, para permitir que el sistema inmunológico reconozca una amplia variedad de patógenos invasores. En efecto hay aproximadamente 1012 receptores de células B y T diferentes en un individuo. Cada célula B individual tiene solo un tipo de receptor, y para tratar con un patógeno particular, se debe seleccionar una célula B que tiene el receptor de ‘mejor ajuste’ para un antígeno de este patógeno. Este proceso se denomina “selección clonal”. En teoría, solo un clon puede responder (una respuesta monoclonal) o varios (una respuesta oligoclonal) o muchos (una respuesta policlonal) que depende del número de antígenos/epitopes exhibidos por el patógeno, y la especificidad de las diversas células B seleccionadas para estos antígenos/epitopes.
Existe una mayor diferencia entre los tipos de antígeno que pueden ser reconocidos por las células B y células T. En la medida que se conoce, solo los receptores de la superficie de los linfocitos B (es decir anticuerpos) son capaces de reconocer directamente los antígenos tales como proteína de los virus o bacterias, o moléculas extrañas disueltas en fluidos orgánicos. Los anticuerpos también pueden ser producidos en forma soluble por las células B cuando se activan y desarrollan en las células plasmáticas. Los anticuerpos también se denominan inmunoglobulinas (abreviado como Ig). Los receptores de las células T por otra parte, reconocen solo péptidos cortos, también conocidos como epitopes de las células T, en la superficie de las células del organismo,. Estos receptores de las células T se producen por la degradación de proteínas más grandes que son propias (es decir proteínas corporales naturales) o no propias (es decir, derivadas de organismos extraños que infectan el organismo,). Solo los derivados de proteínas extrañas, es decir antígenos, son normalmente capaces de inducir una respuesta inmune en el organismo,. Una vez producidos, estos epitopes se unen a un tipo especial de molécula, el MHC (complejo de histocompatibilidad mayor) y el complejo resultante posteriormente se presenta la superficie celular para la unión al receptor de las células T.
Debería ser claro que debido a la naturaleza destructiva de la respuesta inmune, la respuesta debe actuar solo contra los patógenos extraños, no contra las células o proteínas propias del organismo. En consecuencia, el sistema inmunológico necesita distinguir entre ‘propio’ y ‘no propio’. Se ha propuesto que si bien se producen clones de linfocitos que reaccionan contra sí mismos, estos se suprimen antes de que se pueda producir alguna reacción. Este proceso se denomina `supresión clonal’. También se ha propuesto que cualquiera de los linfocitos de auto-reacción se podría retener solo en un estado ‘desactivado’. Este mecanismo se denomina ‘anergia clonal’. Cualquiera sea el proceso considerado, aun no está claro cuál es el mecanismo subyacente exacto que permite a los tejidos linfoides, tales como el timo, identificar los clones celulares T individuales que reaccionan contra sí mismos de la mezcla de linfocitos T que solo reaccionan no contra sí mismos. Los presentes inventores actualmente han investigado más completamente el mecanismo de auto-no auto discriminación, que ha llevado al desarrollo de la presente invención. Los inventores han establecido en la actualidad un método de predecir la inmunogenicidad de una sustancia tal como un péptido, lo que ha permitido la identificación más rápida de las secuencias peptídicas inmunogénicas dentro de las proteínas más grandes.
Se ha conocido durante muchos años que el complejo de histocompatibilidad mayor (MBC) cumple un papel clave en el sistema inmunológico de los animales. Las moléculas de MHC permiten que las células T reconozcan antígenos, como ya se descrito anteriormente. Existen tres tipos generales de moléculas de MHC, clase I, clase II y clase III. Las moléculas de MHC clase I y clase II son glicoproteínas que están presente en la superficie de la célula, mientras que la clase III son usualmente moléculas presentes en el interior de la célula. Existen una gran cantidad de tipos diferentes de molécula de MHC. Por ejemplo, en los seres humanos (donde el MHC se denomina HLA, antígeno leucocitario humano) existen varios cientos de alelos diferentes de los genes que codifican las moléculas de MHC, lo que significa que en la población humana existen muchos tipos diferentes de HLA. El MHC de diferentes especies se denomina normalmente de acuerdo con convenciones diferentes, de este modo el MHC para ratón se denomina H-2, para rata RT1 y para conejo RLA. Las diferentes regiones del gen que codifican para moléculas de MHC diferentes en un individuo se denominan usualmente en forma individual, tal como HLA-A, HLA-C etc. en los seres humanos.
La molécula de MHC es una molécula crítica del sistema inmunológico, debido a que es la molécula que presenta los epitopes de los antígenos al sistema inmunológico. Por ejemplo, si una célula T es para responder a un patógeno particular, el patógeno debe tener al menos un antígeno (tal como, una proteína) que tiene al menos un epitope (tal como, una porción peptídica de la proteína) que puede unirse a una molécula del MHC en la superficie de una célula y de este modo interactúa con una célula T que se une al complejo de MHC-péptido. En consecuencia, la respuesta inmune es dependiente de la capacidad de la MHC de unirse a un epitope. Si no existe un epitope al que se unirá el MHC, o si no existe una célula T que se unirá al complejo MHC-péptido, entonces no se producirá la respuesta inmune.
Con respecto a las ‘proteínas propias’, sin embargo, uno de los diversos epitopes se puede unir a la molécula de MHC y en consecuencia inducir potencialmente una respuesta inmune. En estas ocasiones se debe proporcionar una "señal" específica para que los clones de linfocitos de auto-reacción sean eliminados o “desactivados”.
Ya que, como se indicó anteriormente, los péptidos propios y extraños (es decir, no propios) se pueden unir a las moléculas de MHC, la unión de varios péptidos a las moléculas de MHC ha recibido particular examen en el campo de la inmunología. Muchas investigaciones han buscado calcular o predecir la fuerza de unión entre ciertos tipos de MHC (particularmente HLA y H-2) y las secuencias de péptidos, para tratar de explicar las respuestas inmunes, o la falta de ellas (es decir, la "señal" requerida para la discriminación entre propio y extraño). Los ejemplos de estos incluyen los siguientes:
Altuvia Y, Schueler 0, Margalit H. 1995. "Ranking potential binding peptides to MHC molecule by a computational threading approach". J. Mol. Biol., 249:244-250.
Altuvia Y, Sette A, Sidney J, Southwood S, Margalit H. 1997. "A structure-based algorithm to predict potential binding peptides to MHC molecules con hydrophobic binding pockets". Hum. Inununol. 58:1-11.
G.E. Meister, C.G.P. Roberts,. J.A. Berzofsky,= A.S. De Groot, "Two novel T cell epitope prediction algorithms based-on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis y H1V protein sequences" Vaccine, 13:581-591, (1995).
Gulukota K, Sidney J, Sette A, DeLisi C. 1997. "Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules". J. Mol. Biol. 267:1258-1267.
Pamer EG, Harty JT, Bevan MJ. "Precise prediction of a dominant class I MHC-restricted epitope of Listeria monocytogenes". Nature 1991; 353: 852 -855.
Parker KC, Bednarek MA, Coligan YE. 1994. "Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains". J. Immunol. 152:163-175.
Rammensee HG, Friede T, Stevanoviic S. 1995. "MHC ligands and peptide motifs: First listing". Immunogenetics 41:178-228.
Ruppert J, Sidney J, Celis E, Kubo RT, Grey Bivi, Sette A. 1993. "Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules". Cell 74:929-937.
Schueler-Furman 0, Elber R, Margalit H. 1998. "Knowledge-based structure prediction of MHC class I bound peptides: A study of 23 complexes". Fold Des. 3:549-564.
Sette A, Buus S, Appella E, Smith JA, Chesnut R, Miles C, Colon SM, Grey HM. 1989. "Prediction of major histocompatibility complex binding regions of protein antigens by secuencia pattern analysis". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3296-3300.
Sette A, Sidney J, del Guercio MF, Southwood S, Ruppert J, Dahlberg C, Grey HM, Kubo RT. 1994a. "Peptide binding to the most frequent HLA-A class I alleles measured by quantitative molecular binding assays". Mol. Immunol. 31:813-822.
Sette A, Vitiello A, Reherman B, Fowler P, Nayersina R, Kast WM, Melief CJM; Oseroff C, Yuan L, Ruppert J, et al. 1994b. "The relacioneship between class I binding affinity y immunogenicity of potential cytotoxic T cell epitopes". J. Immunol. 153:5586-5592.
Stefan Stevanovic (2002): "Structural basis of immunogenicity", Transplant Immunology 10 133-136
Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci 0, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. "Generation of tissue-specific and promiscuous BLA ligand databases using DNA microarrays y virtual HLA class II matrices". Nat. Biotechnol. 17:555-561.
T. Sudo, N. Kamikawaji, A. Kimura, Y. Date, C.J. Savoie, H. Nakashima, E. Furuichi, S. Kuhara, y T. Sasazuld, "Differences in MHC Class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes." J. Immunol.: 155: 4749-4756, (1995).
T. Tana, N. Kamikawaji, C.J.Savoie, T. Sudo, Y. Kinoshita, T. Sasazuki, "A HLA binding motif-aided peptide epitope library: A novel library design for the screening of HLA-DR4-restricted antigenic peptides recognized by CD4+ células T." J. Human Genet., 43:14-21 (1998).
K. Falk, et al. "Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules", Nature, Vol. 351, 290-297 (1991).
T Elliott et al. "Peptide-induced conformational change of the class I heavy chain", Nature, Vol. 351, 402-407, (1991).
P. Parham, `Deconstructing the MHC", Nature, Vol. 360, 300-301, (1992).
Hwai-Chen Guo et al., "Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle", Nature, Vol. 360, 364-367, (1992).
Y. Chen et al. "Naturally processed peptides longer than nine amino acids residue bind to the class I MHC molecules HLA-A2.1 con high affinity and in different conformaciones", J. Immunol., 152, 2874-2881, (1994). -
D. F. Hunt et al. "Characterizarion of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2.1 by mass spectrometry", Science, Vol. 255, 1261-1263, (1992).
Generalmente, la técnica previa intenta predecir la inmunogenicidad de los péptidos particulares por el cálculo de la fuerza de unión entre el péptido y el ambiente de unión conocido de una molécula de MHC particular. El ambiente de unión involucra un ‘bolsillo’ en la molécula de MHC que está adaptado para aceptar un péptido de una determinada longitud (tal como 7-15 aminoácidos). La estructura del bolsillo puede ser ya conocida a partir de estudios cristalográficos de rayos X previos. Esta fuerza se puede calcular matemáticamente usando algoritmos apropiados para la interacción atómica y molecular. De modo alternativo, la técnica previa puede intentar “calificar” la fuerza de unión de un péptido sobre la base de los motivos existentes en el péptido, tal como aminoácidos particulares que están en posiciones particulares de un péptido de determinada longitud, por ejemplo, una prolina presente en la posición 3 de un péptido de 8 aminoácidos que se une a una molécula de HLA conocida particular. Generalmente estos abordajes han hallado éxito limitado.
Los presente inventores consideran que han mejorado respecto de las teorías anteriores debido a una mejor compresión de cómo las células T reaccionan contra sustancias propias tales como proteínas propias que identifican antes de su eliminación - (supresión clonal) o silenciamiento (anergia clonal). Por consiguiente, los inventores han podido identificar secuencias peptídicas inmunogénicas específicas que pueden proporcionar protección contra patógenos específicos, y se han desarrollado vacunas para estos patógenos, usando las secuencias identificadas. En caso de la presente invención, los inventores han desarrollado péptidos útiles en las vacunas de la gripe que inducen una respuesta a las células T.
Previamente, las vacunas de la gripe se han desarrollado por la identificación de una cepa del virus de la gripe existente y posteriormente la producción de una vacuna específica para ese virus. Generalmente, las vacunas se han basado en una respuesta a las células B (anticuerpo), el anticuerpo que recibe los antígenos de superficie (es decir Hemaglutinina y Neuraminidasa) de la cepa del virus de la gripe específica contra la cual se ha desarrollado. Normalmente, las proteínas de superficie que comprenden los antígenos son variables de una cepa viral de la gripe a la próxima, debido a que la mutación del virus para producir un nuevo virus tiende a ocurrir en las proteínas de superficie. La consecuencia de esto es que las vacunas de la gripe convencionales generalmente protegen solo contra una cepa viral específica, y no protegerán contra una nueva cepa que proviene de una mutación. En consecuencia, se requiere una nueva vacuna para la protección contra una cepa emergente. El problema evidente con este abordaje es que existe un período de tiempo entre la aparición de la nueva cepa viral, y el desarrollo de la vacuna, durante el cual no hay protección disponible contra el virus. Si el virus es particularmente perjudicial, esto puede llevar a muchos millones de muertes, como ocurrió en la pandemia de gripe mayor del siglo pasado.
Se ha sabido desde hace algún tiempo que los linfocitos T citotóxicos pueden proporcionar una respuesta inmune a las cepas del virus de la gripe. Estudios recientes han mostrado que una respuesta de CTL en los seres humanos se puede dirigir hacia múltiples epitopes. Se ha sugerido que existe una respuesta dominante al HLA-A2 restringida al epitope M-1 58-66. Tales estudios incluyen A.C. Boon et al, J. Virol, Jan. 2002, 582-90; S. Tamura et al Jpn. J. Infect. Dis., Dec. 2004, 236-47; G. Deliyannis et al J. Virol., May 2002, 4212-21; C. Gianfrani et al Hum. Immunol., May 2000, 438-52; y J. Jameson et al J. Immunol., Jun. 1999, 7578-83.
Recientemente también se ha investigado péptidos inmunogénicos específicos que pueden ser útiles para desarrollar una vacuna de la gripe que induzca una respuesta de las células T. Normalmente, tal trabajo ha involucrado la investigación de la respuesta CTL a los péptidos de la gripe de ensayo, por ejemplo, en ratones transgénicos. Los péptidos ensayados tienden a ser secuencias cortas que pueden ser reactivas a un tipo de MHC (o HLA), y se toman de una cepa de gripe de ensayo específica. Por ejemplo, en Vaccine, 2005, 5231-44, N. Hu et al describen el ensayo del péptido M1 58-66 de tipo salvaje en ratones HLA Tg que expresan HLA-A2, -B7 o -B27. Los resultados muestran que el péptido es un epitope de la gripe reconocido por los ratones transgénicos que expresan HLA-A2. En Clin. Exp. Immunol., de octubre de 2005, 45-52, A.C. Boon et al describen los péptidos de la gripe A M1 58-66 y NP 44-52 como epitopes reconocidos en los individuos HLA-A*0101 y HLA-A*0201. En Cell Immunol., abril de 2005, 110-123, E. Cheuk et al describen el péptido de la gripe A NP 383-391 como epitope reconocido en ratones deficientes en HLA-B27/H2 clase I. Por medio de los programas de predicción de epitopes, los autores identificaron tres epitopes de gripe más restringidos B27, BP-2 702-710, PB-1 571-579 y PB-2 368-376. en J. Immunol., Feb 2004, 2453-60, A.C. Boon et al describen clones CTL humanos específicos para las variantes naturales del epitope restringido en HLA-B*3501 en NP 418-426. En J. Immunother., enero-febrero de 2003, 41-6, A. Trojan et al describen el HLA-A3 RLEDVFAGK restringido de 9-mer que es capaz de inducir reactividad de CTL específica. También se describe el péptido de la matriz del virus de la gripe A restringido en HLA-A2 GILGFVFTL. En J. Gen. Virol., July 2001, 1749-55, S. Tourdot et al identifican un epitope restringido D(k) murino derivado de la proteína PB-1 de polimerasa de la cepa viral de gripe AIPR18/34, correspondiente a los residuos de aminoácidos 349-357 (ARLGKGYMF). In J. Immunol., abril de 2001, 4627-33, G.T. Belz et al identifican un péptido inmunogénico (SSYRRPVGI) de la proteína PB-1 de polimerasa de la gripe, correspondiente a los residuos de aminoácidos 703711 y un mimotopo (ISPLMVAYM) de la polimerasa PB-2. PCT/US2005/002954 describe los epitopes de CTL que comprenden NP 265-273, que tiene la secuencia ILRGSVAHK, y también los epitopes que comprenden NP 305-313. Finalmente, US 6.740.325 describe dos epitopes CTL: NP 335-350, y NP 380-393.
En el documento WO 2005/120564 se describen métodos de potenciación de la presentación antigénica, o aumento de la inmunogenicidad de un polipéptido. Se describe una composición de vacuna, que utiliza un elemento disruptivo (tal como una supresión, sustitución o inserción) para aumentar la presentación antigénica por la degradación de la proteína en forma más eficiente. La proteína modificada empleada puede ser una proteína Np o M1 de la gripe.
Otros estudios han demostrado que los datos de ratones transgénicos proporcionan un modelo confiable para la investigación de respuestas de CTL en los seres humanos. En Int. Immunol., Apr. 1995, 597-605, S. Man et al han demostrado que el epitope dominante de la gripe A reconocido por los linfocitos T citotóxicos restringidos en HLAA2.1 de los ratones transgénicos HLA-A2.1 fue el epitope del péptido de la proteína de la matriz 1 (M-1) que es inmunodominante en las respuestas CTL humanas. Otros estudios de esta área han sido realizados por E.J. Bernhard et al (J. Exp. Med., Sep 1998, 1157-62) y E. Cheuk et al (J. Immunol., Nov 2002, 5571-80).
Sin embargo, si bien se han estudiado intensamente los epitopes conocidos, ninguno ha sido satisfactorio para constituir la base de una vacuna para la gripe que es capaz de proteger contra más de una sola cepa del virus de la gripe. Además, las vacunas basadas en estos epitopes únicos, aun cuando proporcionen alguna protección, probablemente serían específicas para un HLA particular, lo que las hace ineficaces en una proporción mayor de la población humana.
En consecuencia, un problema significativo con las vacunas conocidas, sea que dependen de una respuesta de las células B o células T es que solo protegen contra una cepa viral existente, y no proporcionan protección contra las futuras cepas posibles que se pueden desarrollar. Con la aparición de la cepa H5N1 altamente peligrosa en la población aviar, se ha vuelto más aguda la necesidad de una vacuna con antelación de una pandemia humana basada en una posterior mutación de la cepa H5N1. Más aún, las vacunas basadas en péptidos conocidos que inducen respuestas a las células T pueden no ser efectivas en grandes secciones de la población.
Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención resolver los problemas asociados con la técnica previa conocida tal como se expuso anteriormente. Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un polipéptido que es capaz de inducir una respuesta inmune CTL en los vertebrados contra una pluralidad de cepas de la gripe y/o en una pluralidad de individuos que expresan los MHC (HLA). Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar una vacuna de la gripe que usa el polipéptido de la invención. Preferiblemente la vacuna es capaz de protección contra una pluralidad de cepas de la gripe y/o es efectiva en una pluralidad de individuos que expresan diferentes MHC (HLA).
Por consiguiente, la presente invención proporciona un polipéptido que consiste en hasta 40 aminoácidos, tal polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos 95% de homología con la SEQ ID 1:
SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP
en el que, el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado que expresa un alelo del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y es inmunogénico para una pluralidad de cepas del virus de la gripe.
En consecuencia, el polipéptido es uno que comprende el total de la secuencia anterior, pero no puede tener más de 40 residuos de aminoácidos en total. El polipéptido también debe ser inmunogénico en un vertebrado que expresa un alelo de MHC (HLA en seres humanos). Se considera que un polipéptido inmunogénico en el presente contexto significa un polipéptido que induce una respuesta inmune en un vertebrado, tal como por la unión a un MHC de vertebrado y que causa que reaccione con un linfocito de células T citotóxicas. Un método para determinar si un polipéptido posee inmunogenicidad se establece en el siguiente Experimento 1. Sin embargo, la presente invención no se limita a tales métodos, y los expertos pueden seleccionar cualquier método conocido para determinar la inmunogenicidad, según se desee.
El polipéptido puede ser uno que comprende dos 7 o más epitopes del residuo que reacciona con uno o más MHC y de esta manera inducen una respuesta CTL amplia La respuesta puede ser en un individuo único o puede ser en al menos dos individuos diferentes (y los individuos pueden ser de la misma especie o diferentes especies). En consecuencia, el polipéptido puede comprender al menos dos diferentes 7 o más residuos de epitope, cada uno de los cuales proporciona individualmente una respuesta a un sujeto diferente. Un epitope en el contexto de la presente invención es una parte de un polipéptido que es capaz de unirse un MHC de vertebrado en un vertebrado, preferiblemente que induzca una respuesta inmune, tal como al causar que el complejo de MHC-epitope reaccione con un CTL. Un método para determinar si un polipéptido es o contiene un epitope se establece en el siguiente Experimento 1. Sin embargo, la presente invención no se limita a tales métodos, y los expertos pueden seleccionar cualquier método conocido para determinar si un polipéptido es o contiene un epitope, según corresponda.
Los presentes inventores han hallado que las secuencias anteriores comprenden una pluralidad de epitopes de CTL, que pueden proporcionar protección contra la gripe para una amplia variedad de vertebrados en una población. Además, los inventores han analizado todas las secuencias de cepas del virus de la gripe conocidas en todas las especies, y han hallado que las secuencias especificadas están marcadamente conservadas a través de todas las cepas conocidas del virus de la gripe. Como tal, es muy poco probable que estas secuencias se alteren significativamente en nuevas cepas resultantes de la mutación de las cepas existentes. Por consiguiente, es muy probable que los epitopes dentro de estas secuencias que proporcionan protección estén presentes en forma sin modificar en las nuevas cepas, ya que la mutación no ocurre normalmente en estas regiones. En consecuencia, estos epitopes proporcionan excelente oportunidad no solo para proporcionar protección contra las cepas de gripe existentes (tales como la cepa H5N1 de la ‘gripe aviar’), sino que también protegen contra las cepas aún desconocidas (tal como una forma mutada de H5N1 que puede pasar fácilmente de ser humano a ser humano y forma la base de una pandemia).
Como se describió antes, las secuencias se han identificado después del análisis de todas las secuencias de la cepa viral de la gripe conocidas en todas las especies. Las secuencias en consecuencia son secuencias de consenso desarrolladas del análisis anterior. A pesar de ser secuencias de consenso, las secuencias en algunos casos corresponden exactamente a las secuencias naturales de las cepas del virus de la gripe conocidas. Debido a la marcada conservación de las secuencias en todos los virus de todas las especies, las secuencias de consenso, incluso cuando difieren de las secuencias reales, solo difieren en una pequeña cantidad de residuos, y en consecuencia contienen epitopes mucho más pequeños (8-mers, 9-mers, 10-mers, etc.) en los cuales no hay diferencias de las secuencias naturales. Las secuencias de consenso anteriores como un todo, por ende contienen muchos epitopes efectivos que son los mismos que los epitopes naturales, así como epitopes efectivos que difieren solo ligeramente de los epitopes naturales. Será evidente para los expertos que la invención extiende no solo a las secuencias de consenso y sus epitopes, pero también a las correspondientes secuencias reales en cualquier cepa del virus de la gripe. En consecuencia, las secuencias con alguna homología con las secuencias de consenso también están dentro del alcance de la invención. Tales sustituciones son preferiblemente sustituciones conservadoras en línea con los esquemas de sustitución conocidos.
La presente invención se describirá con más detalle por medio del ejemplo solo con referencia a las siguientes Figuras, en las que:
La Figura 1A a 1F muestra la producción de IFN-y por cultivos de esplenocitos primarios de ratones vacunados con FLU-v y NRP estimulados con Con A (10 μg/ml), lisozima soluble (5 μg/ml), polipéptidos solubles purificados (P1 (Figura 1A), P2 (Figura 1B), P3 (Figura 1C), P4 (Figura 1D), P5 (Figura 1E) y P6 (Figura 1F); 5 μg/ml) y T1 apareado con HLA (T1) y células humanas JURKAT (Ju) no apareadas transfectadas con lisozima, P1, P2, P3, P4, P5 o P6 de acuerdo con el protocolo descrito en el siguiente Ejemplo 1 (la relación de esplenocito a células transfectadas es 10:1). La producción de IFN-y está representada como el diferencial entre el nivel de producción en respuesta al antígeno considerado menos el IFN-y producido en respuesta a cada lisozima soluble o la correspondiente c
élula transfectada con lisozima. Los niveles umbral de la producción de IFN-y mediada por lisozima fueron para el antígeno soluble 25 ± 10 pg/ml, para el antígeno en T1 316 ± 43 pg/ml, y para el antígeno en Jurkat 19 ± 6 pg/ml;
La Figura 2 muestra la producción de IFN-y por cultivos de esplenocitos primarios de ratones vacunados con FLU-v y NRP estimulados con Con A (10 μg/ml), lisozima soluble (5 μg/ml), preparación de polipéptido FLU-v soluble purificado (P1, P2, P3, P4, P5 y P6 todos juntos a 5 μg/ml) y T1 apareado con HLA (T1) y células humanas JURKAT (Ju) no apareadas infectadas con cepas de la gripe A/New Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 o B/Johannesburg/5/99
o transfectadas con lisozima de acuerdo con el protocolo descrito en el siguiente Ejemplo 1 (la relación de esplenocito a célula infectada/transfectada es 10:1); la producción de IFN-y está representada como el diferencial entre el nivel de producción en respuesta al antígeno considerado menos el IFN-y producido en respuesta a cada lisozima soluble o la correspondiente célula transfectada con lisozima; los niveles umbral de la producción de IFN-y mediada por lisozima fueron para el antígeno soluble 25 ± 10 pg/ml, para el antígeno en T1 316 ± 43 pg/ml, y para el antígeno en Jurkat 19 ± 6 pg/ml; y
Las Figuras 3A y 3B muestran la supervivencia de los animales después de un estímulo letal con Gripe A/PR/8/34; los animales se inmunizaron por vía subcutánea con FLU-v o NRP-v en los días 1 y 15 y en el día 20 todos se estimularon por vía intranasal con 45 μl del virus (5x107 pfu por dosis) bajo anestesia; los animales de la Fig 3A se inocularon por vía intraperitoneal con 100 μg de suero CD8 anti-ratón de rata en los días 19 y 22; los animales de la Fig 3B se inocularon por vía intraperitoneal con un suero de rata irrelevante en los días 19 y 22; la flecha indica la fecha del estímulo intranasal mientras que los rombos indican la fecha en que los animales se inocularon con el suero anti-CD8.
El polipéptido descrito antes normalmente comprende uno o más (preferiblemente, dos o más) epitopes. Estos epitopes son preferiblemente epitopes de las células T, tales como epitopes del linfocito T citotóxico (CM). En general el polipéptido es inmunogénico para una pluralidad de cepas del virus de la gripe. En el presente contexto, se considera que un polipéptido inmunogénico para una cepa viral de la gripe significa un polipéptido que es parte de una proteína del virus de la gripe y que induce una respuesta del sistema inmunológico, tal como exhibir reactividad CTL cuando se une a un MHC. Un método para determinar si un polipéptido posee tal inmunogenicidad se expone en el siguiente Experimento 1. Sin embargo, la presente invención no se limita a tales métodos, y los expertos pueden seleccionar cualquier método conocido para determinar la inmunogenicidad, según corresponda.
En la presente invención, el polipéptido puede comprender dos o más epitopes como se describió antes. Normalmente, dos, tres, cuatro, cinco o más epitopes pueden estar presentes en el polipéptido, según corresponda. Cuanto más de estos epitopes están presentes, mayor la amplitud de protección provista en una población de individuos humanos y/o animales con diferentes HLA o MHC.
En la presente invención, la cepa de gripe no está especialmente limitada, y los polipéptidos pueden ser inmunogénicos contra y/o derivados de, cualquier cepa de la gripe conocida. Preferiblemente, sin embargo, la cepa relevante es una cepa de la Gripe A o Gripe B. Las futuras cepas de la gripe que han mutado de cualquiera de estas cepas existentes también pueden ser algunas contra las cuales los polipéptidos son inmunogénicos, o de las cuales derivan los polipéptidos.
Las proteínas dentro de las cuales están situadas las secuencias que definen los polipéptidos de la presente invención se seleccionan de las proteínas M1 de cualquier cepa del virus de la gripe (especialmente las cepas A y B) (cuyas secuencias de consenso para todas las secuencias analizadas, o alternativamente las posiciones dentro de la proteína, se describieron antes). Las siguientes proteínas específicas fueron analizadas por los inventores, y preferiblemente las proteínas del virus de la gripe mencionadas en la invención se seleccionan de estas proteínas específicas, o mutaciones de estas proteínas. En consecuencia, las secuencias específicas homólogas para la SEQ ID 1 descrita anteriormente son preferiblemente las que están en las posiciones apropiadas dentro de las siguientes proteínas. De modo similar, las secuencias de la presente invención definidas por las posiciones del residuo dentro de las proteínas de cualquier cepa de la gripe, a saber los residuos 36-75 de la proteína M1 (especialmente gripe A Ml), son preferiblemente las que están dentro de las siguientes proteínas específicas. La lista está en forma de número de versión de la identificación de base de datos (número gi), número de acceso INCBI (por ejemplo, gb para GenBank) NCBI, información adicional opcional (por ejemplo, el número de acceso de la secuencia de nucleótidos de la cual deriva la secuencia de proteínas). Las secuencias y correspondientes cepas de la gripe de las cuales derivan se pueden hallar en la base de datos de proteínas pública NCBI, a la que se puede acceder en línea en la siguiente dirección de URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query/static/help/helpdoc.html#Protein. La base de datos de proteínas contiene datos de secuencia de las regiones codificadoras traducidas de las secuencias de ADN en GenBank, EMBL, y DDBJ así como las secuencias de proteínas presentadas en el Recurso de Información de Proteínas (PIR), SWISS-PROT, Fundación de Investigación de Proteínas (PRF), y Banco de Datos de Proteínas (PDB) (secuencias de estructuras resueltas).
Proteínas M1
Las cepas de la gripe preferidas mencionadas en la presente invención, por ejemplo contra las cuales los presentes polipéptidos deben ser inmunogénicos, son las que contienen estas proteínas específicas. Los anteriores números de acceso especifican explícitamente la identidad de la cepa además de la secuencia de proteína específica.
El por ciento de homología de una secuencia de polipéptidos con una segunda secuencia de polipéptidos, como se menciona en el contexto de la presente invención, se define como el número de residuos de aminoácidos de la segunda secuencia que coincide en posición e identidad con los de la primera secuencia, dividido por el número total de residuos de aminoácidos del segundo polipéptido (tanto los primeros como los segundos polipéptidos deben tener el mismo número de residuos de aminoácidos) y multiplicado por 100. En la presente invención, la homología del polipéptido con las secuencias definidas es 95% o más o preferiblemente 100% (o sustancialmente 100%).
Los epitopes dentro de la secuencia definidos anteriormente no están especialmente limitados, con la condición de que contienen 7 residuos de aminoácidos o más. Preferiblemente los epitopes son de una extensión que es apropiada para los epitopes de CTL en una especie vertebrada, tal como en un ser humano, que tiene un MHC específico. Normalmente los epitopes contienen 8, 9, 10, u 11 residuos de aminoácidos, pero pueden contener más, si se desea. Generalmente un epitope apropiado es uno que es un epitope de CTL en un vertebrado tal como un ser humano.
El polipéptido de la invención consiste en hasta 40 aminoácidos, y preferiblemente de hasta 35 aminoácidos. El tamaño no debe ser tan grande que los epitopes útiles sufran la competición con epitopes no protectores del sistema inmunológico (por esta razón no se incluyen las proteínas completas), ni el tamaño debe ser tan pequeño que solo se ofrece un intervalo muy estrecho de protección. Se prefiere particularmente que el polipéptido consista en una secuencia seleccionada preferida de la SEQ ID.
La invención también proporciona una composición de polipéptido que comprende dos o más polipéptidos diferentes definidos en las reivindicaciones. En consecuencia, la composición de polipéptidos puede comprender cualquier número de polipéptidos de la presente invención juntos en la misma mezcla o formulación. La presencia de una pluralidad de polipéptidos juntos es útil ya que cada uno puede inducir su propia respuesta inmune, lo que amplía el efecto protector de la composición. Se prefiere particularmente que la composición contenga todas las secuencias de la SEQ ID 1-6 cada una en un péptido separado o varias en un número pequeño de péptidos (por ejemplo, 3 combinados en un péptido más grande y los otros 3 en otro péptido más grande, etc.).
La presente invención además proporciona un polipéptido como se definió antes para usar en medicina. También se proporciona una composición de medicamento o vacuna contra la gripe, que comprende un polipéptido definido anteriormente y uno o más excipientes y/o adyuvantes apropiados.
El excipiente o adyuvante no es especialmente limitado, y se puede emplear cualquier excipiente o adyuvante usado en los medicamentos y vacunas. La composición de medicamento o vacuna se puede producir de acuerdo con cualquier método conocido apropiadamente adaptado para la presente invención, tal como por la mezcla de un polipéptido de la invención con un excipiente apropiado.
La invención también proporciona un método para producir un polipéptido como se definió anteriormente. El método no está especialmente limitado, y normalmente comprende la unión de dos o más epitopes para formar el polipéptido. El polipéptido, sin embargo, se puede sintetizar por síntesis química directa (por ejemplo, incorporar un aminoácido en un momento hasta que se forma el polipéptido completo) o por métodos recombinantes. Tales métodos generales son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden adaptar con la presente invención, según corresponda. En algunos casos, el polipéptido de la presente invención puede comprender secuencias adicionales de aminoácidos en uno o ambos extremos terminales para ayudar a la síntesis del polipéptido. Estas secuencias adicionales son preferiblemente de 1-5 aminoácidos de longitud. Normalmente están involucrados 3 aminoácidos.
La invención también proporciona adicionalmente el uso de un polipéptido o composición como se definió anteriormente, en la fabricación de un medicamento o vacuna, efectivo en el tratamiento o prevención de la gripe. El medicamento o la vacuna permite un método para tratar o prevenir la gripe, tal método comprende administrar un polipéptido, una composición, un medicamento o una vacuna que se definió anteriormente para un vertebrado. El método de administración no está especialmente limitado, y puede comprender administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, o intranasal o se puede administrar por vía oral (por ejemplo, en la forma de de una píldora o preparación líquida), o puede estar en forma de supositorio, según corresponda. La forma de tal administración de preparaciones no está especialmente limitada y se pueden emplear formas conocidas con modificaciones apropiadas que serán evidentes para los expertos. La dosis no está especialmente limitada y puede variar de 1 μg a 100 g del polipéptido por individuo, de acuerdo con el tamaño, peso y especie del individuo involucrado.
La invención se puede aplicar a cualquier vertebrado, ya que los sistemas inmunológicos de los vertebrados operan de una manera relacionada. Normalmente, el vertebrado mencionado en el presente contexto es un mamífero,
5 pájaro, un reptil o un pez. Se prefiere especialmente que el vertebrado sea un ser humano, un animal doméstico (tal como, un perro o gato), un animal de granja (tal como un cerdo o un caballo); un animal bovino (tal como ganado vacuno o una vaca), o aves (tal como un ave doméstica, un ave de granja, o un ave de caza). Cuando el vertebrado es un ave, es preferiblemente un pollo, un pavo, un pato o un ganso.
Los ejemplos de MHC humanos (RLA) que se pueden emplear en la presente invención incluyen los siguientes:
HLA-A
DMA*0101, DMA*0102, DMA*0103, DMA*0104.
DMB*0101, DMB*0102, DMB*0103, DMB*0104, DMB*0105, DMB*0106. 5 HLA-DOA DOA*010101, DOA*01010201, DOA*01010202, DOA*01010203, DOA*010103, DOA*01010401, DOA*01010402, DOA*010105.
DOB*01010101, DOB*01010102, DOB*010102, DOB*010201, DOB*010202, DOB*0103, DOB*01040101, 10 DOB*01040102.
H-2Db, H-2Dd, H-2Dk, H-2Dq, H-2Kb, H-2Kd, H-2Kk, H-2Ld, H-2M3, H-2Ad, H-2Ag7, H-2Ak, H2-Ab, H-2Ed, H-2Ek, H-2Bxk, H-2F, H-2I, H-2P, H-2R, H-2S, H-2Sxd, H-2T4, H-2U.
15 I-Ab, I-Ad, I-Ag7, I-Ak, I- -Ap, I-Aq, I-Ar, I-As, I-Au, I-Av, I-Ea, I-Eb, I-E- d, I-Ek, I-Es, I-Eu, H-2Q, H-2Qa.-2, H-2Qa-2a, Qa-la, Qa-lb.
La invención no está limitada a tales moléculas de MHC y HLA y se pueden adaptar a moléculas recién descubiertas, si se desea, solo por establecimiento de la reactividad de las sustancias tales como péptidos con las moléculas. Esto se puede lograr fácilmente por medio de técnicas conocidas que son estándares en el campo. Se
20 prefieren particularmente alelos HLA para usar con la presente invención incluyen los siguientes:
HLA A HLA B. HLA Cw
A*6802 B*5801 Cw*'1701 A*6801 B*5701 Cw*1601 A*6601 B*5501 Cw*1502 A*3303 B*5201 Cw*1402 A*3301 B*5101 Cw*1203 A*3201 B*5001 Cw*0802 A*310102 B*4901 Cw*080 A*3002 B*4501 Cw*0704 A*3001 B*4403 Cw*0703 A*2902 B*4402 Cw*0702 A*2608 B*4101 Cw*0701 A*2601 B*4002 Cw*0602 A*2501 B*4001 Cw*0501 A*2402 B*3901 Cw*0401 A*2301 B*3801 Cw*0304 A* 1101 B*3701 Cw*0303 A*0302 B*3503 Cw*0202
A*0301 B*3501 Cw*0102
A*0205 B*2705
A*0201 B*1801
A*0101 B*1501 B* 1402 B*1401 B*1302 B*0801 B*0705 B*0702
HLA DPB HLA DOA HLA DQB HLA DRB
DPB1*1701 DQA1*0505 DQB1*0604 DRB1*1601
DPB1*1301 DQA1*0501 DQB1*0603 DRB1*1501
DPB1*1001 DQA1*0401 DQB1*0602 DRB1*1401
DPB1*0601 DQA1*0303 DQB1*0503 DRB1*1302
DPB1*0501 DQA1*0302 DQB1*0502 DRB1*1301
DPB1*0402 DQA1*0301 DQB1*0501 DRB1*1201
DPB1*0401 DQA1*0201 DQB1*0402 DRB1*1104
DPB1*0301 DQA1*0104 DQB1*0303 DRB1*1101
DPB1*0201 DQA1*0103 DQB1*0302 DRB1*0801
DPB1*0101 DQA1*0102 DQB1*0301 DRB1*0701
DQA1*0101 DQB1*0202 DRB1*0404
DQB1*0201 DRB1*0401
DRB1*0301
DRB1*0103
DRB1*0102
DRB1*0101
Los alelos más preferidos de acuerdo con la invención son los siguientes:
HLA-A*0201, HLA-A*0206, HLA-A*0301, HLA-A* 1101, HLA-A* 2402, HLA-A* 3401, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*1301, HLA-B*27, HLA-B*4002, HLA-B*5101, HLA-Cw*03, HLA-cW*07 HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*0401, HLA-DRB1*0701, HLA-DRB1*1501, HLADRB1*1104, HLA-DRB1*1101, HLA
DRB4*0101
HLA DQA1*01, HLA-DQA1*02, HLA-DQA1*05
HLA-DQB1 *03, HLA-DQB 1 *04, HLA-DQB1 *05, HLA-DQB 1 *06
HLA-DPA1*01, HLA-DPA1*02 HLA-DPB1*02, HLA-DPB1*04
La invención se describirá a continuación solo por medio de ejemplos, con referencia a las siguientes realizaciones específicas.
Ejemplos
EXPERIMENTO 1- Reactividad de polipéptidos contra antígenos de la gripe
El fin del estudio fue demostrar la reactividad de los polipéptidos de la gripe anteriormente descritos y su capacidad para inducir una respuesta de citoquina específica tipo TH1 específica contra las proteínas de la gripe procesadas y presentadas naturalmente en el contexto de HLA humano (HLA A*0201).
Como antecedente para los experimentos, es útil entender que las respuestas Th1 y Th2 se definen con el patrón de citoquinas producidas por las células T auxiliares involucradas en ellas. Esto sin embargo no significa que los linfocitos restantes (células T y B) involucrados en las respuestas específicas tampoco producen citoquinas que ayudan a dirigir el patrón característico de respuesta en los que están involucradas. De esta manera, una respuesta tipo Th1 se caracteriza por la producción de IFN-y e IL-2, que lleva a la estimulación de una respuesta CD8+ CTL y una respuesta de anticuerpo IgG2a asociada (en ratones). La respuesta de IFN-y se puede producir por las células T auxiliares CD4+ así como por las células T CD8+ que también forman parte de esta. En este caso se investigó el componente IFN-y de la respuesta producida por las cEsto fue porque el experimento se realizó
élulas T CD8+. principalmente para investigar los epitopes de las células T CD8+ y fue conveniente para probar que la respuesta observada fue causada por estas células. Debido a que las células T CD8+ reaccionan con los epitopes solo en las moléculas de MHC clase I, se usaron las células humanas que comparten con el ratón transgénico solo una molécula de MHC clase I (es decir, HLA-A*0201). Una respuesta tipo Th2 se caracteriza por la producción de IL-4 e IL-10, que lleva a la estimulación de una respuesta de anticuerpos IgGE, IgG1 y (en ratones) IgG2b. Ambas respuestas son antagonistas con IFN-y e IL-10 regulando por disminución la producción entre sí.
Todos los experimentos que se describen a continuación se realizaron por duplicado.
Materiales y métodos
Péptidos y proteínas recombinantes
Todos los polipéptidos usados en este estudio (es decir P1: M1A amino acid (aa) 36 a 75 (SEQ ID 1); P2: M1B aa 124 a 158 (SEQ ID 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PB1 aa 395 a 428 (SEQ ID 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6) y NRP: un polipéptido no relevante control) se sintetizaron por química Fmoc y se resuspendieron en 10% de DMSO en PBS.
Líneas celulares y virus
Las líneas celulares T1 y JURKAT son líneas linfoblastoides humanas derivadas de individuos portadores de HLAA*0201 y no portadores respectivamente. T1 se mantuvo en medio IMDM (Invitrogen) mientras que JURKAT se mantuvo en medio RPMI-1640 (Sigma) que contiene 10 mM de HEPES y 1 mM de piruvato de sodio. Ambos medios se suplementaron con 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) y, como medio completo, 10% de FCS. Los cultivos celulares se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Los esplenocitos primarios se mantuvieron en medio IMOM (Invitrogen) suplementado con 0,02 mM de �mercaptoetanol (Sigma), 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) y 10% de FCS (Sigma) a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Las cepas de Gripe A New Caledonia/20/99, NYMC/X-147 y la cepa de Gripe B Johannesburgo/5/99 se obtuvieron de NIBSC como patrones liofilizados y se usaron para la infección de líneas celulares singeneicas (T1) y alogeneicas (JURKAT).
Preparación de células blanco para análisis de citoquinas
Los cultivos celulares en fase exponencial se recolectaron por centrifugación (250 g, 5 min) y se resuspendieron a una densidad de 106 células/ml en medio libre de suero. Alícuotas de las suspensiones celulares se transfectaron con una variedad de antígenos polipeptídicos a una concentración de 5 μg por 106 células por medio de Lipofectina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubaron en medio completo durante 8-10 horas antes del tratamiento con mitomicina C (MMC). Alternativamente, alícuotas de las suspensiones celulares se infectaron con una variedad de virus de la Gripe vivos (MOI de 5-10) durante una hora, se lavaron dos veces en medio libre de suero y se incubaron en medio completo durante 24 horas antes del tratamiento con MMC.
Para el tratamiento con MMC, las células se recolectaron por centrifugación (250 g, 5 min) y se resuspendieron en medio libre de suero IMDM que contiene 50 μg/ml de mitomicina C (Sigma). Después de 45 min de incubación a 37°C, las suspensiones celulares se lavaron cuatro veces in medio libre de suero IMDM (250 g, 5 min) y finalmente se resuspendieron en medio IMDM completo.
Inmunizaciones
Ratones C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J de siete a diez semanas (HLA-A*0201 transgénicos en un antecedente C57/BL6, Jackson Labs) se inmunizaron por vía subcutánea con una dosis de 200 μl de la preparación de antígeno por ratón. En el grupo de ensayo, cada dosis de la preparación de antígeno contenía 60 nmol de una mezcla
5 equimolar de los seis péptidos (10 nmol cada una) preparada en IFA (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (FLU-v preparación). En el grupo control, cada dosis de la preparación de antígeno contenía una dosis equivalente del polipéptido no relevante preparado en IFA (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (NRP preparación).
En el día 14 pos-inmunización, todos los animales recibieron una inmunización de refuerzo por medio de las mismas
10 dosis y vía de administración que se usó originalmente. Por último, en el día 21 o 22, se seleccionaron todos los animales y se recolectaron sus bazos.
El protocolo de inmunización se puede representar esquemáticamente de la siguiente manera:
Esquema 1 – inoculación
FLU-v= combinación de P1 P2 P3 P4 P5 & P6
Inmunizar el ratón con Flu-v
Recolectar esplenocitos después de 21 o 23 días-cualquier reacción inmune habrá causado la amplificación en las células T de ratón reactivas a los epitopes correctamente presentados dentro P1-P6, que se activarán y/o proliferarán. Si los péptidos están correctamente presentados por NEC de ratón y HLA humano, las células T reactivas para los epitopes en cada uno de estos contextos pueden estar presentes (células que presentan antígenos, APC, en los ratones transgénicos expresarán tanto MHC de ratón como HLA humano). Los esplenocitos recolectados pueden comprender cantidades significativas de células T activadas/proliferadas, junto con cantidad más péquelas de otras células, tales como células que presentan antígenos (APC)
Obtener esplenocitos que contienen:
(a) células HLA T en cantidades amplificadas, reactivas a APC(HLA)-PI (o APC(HLA)-P2 etc.)
1. Células T de ratón
(b) células MHC, no reactivas en APC(HLA)-P1 (o APC(HLA)-P2 etc.)
(a) APC(HLA)2. Células que presentan antígeno de ratón (APC) (b) APC(MHC)-
15 Análisis estadístico
Las diferencias estadísticamente significativas en la respuesta de IFN-y a diferentes antígenos entre animales vacunados FLU-v y NRP se establecieron a través del análisis de Mann-Whitney no paramétrico de las muestras. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si el valor de p fue inferior a 0.05.
ELISA de citoquina
20 Los bazos de ratón pertenecientes al mismo grupo experimental se mezclaron, se presionaron suavemente mediante filtros celulares y se extrajeron los eritrocitos por el tratamiento con buffer de lisis de eritrocitos (nueve partes de NH4Cl 0,16 M y una parte de Tris 0,17 M, pH 7,2). Las suspensiones de esplenocitos de cada grupo experimental se incubaron en placas de 24 pocillos a una densidad de 4 x 106 células/pocillo que contienen una variedad de antígenos polipeptídicos (5 Ig/ml) o, alternativamente, líneas celulares tratadas con MMC (relación de
25 esplenocito a células (S:C) 10:1) transfectadas con antígenos polipeptídicos o infectadas con diferentes virus de Gripe vivos como se describió antes.
Después de 4 días de incubación a 37°C, el sobrenadante se recolectó y analizó para determinar IFN-y e IL-4 por un ELISA sándwich de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pharmingen). Los límites de detección más bajos para el ensayo fueron 9,77 pg/ml para IL-4 y 39,06 pg/ml para IFN-y.
Resultados
5 Cada péptido del polipéptido individual descrito en esta solicitud de patente (que incluye P1, P2, P3, P4, P5 y P6 analizados en este ejemplo) se ha definido que contiene epitopes de las células T reactivos en múltiples moléculas de HLA humanas, entre ellos HLA-A*0201. El objetivo de este estudio es, en consecuencia, evaluar la capacidad de los polipéptidos descritos anteriormente para inducir una respuesta inmune tipo Th1 multi-antígeno específica (es decir mediada por IFN-y) así como la capacidad de esta respuesta para reaccionar específicamente a los antígenos
10 de gripe presentados y procesados naturalmente a partir de varias cepas no relacionadas patogénicas para los humanos en el contexto de células portadoras de HLA A*0201 humanas infectadas.
Reactividad del péptido 1
Después del procesamiento interno del polipéptido por las células que presentan antígenos (APC) de los ratones transgénicos, los epitopes específicos de las células T CD8+ contenidos se pueden presentar en la superficie de la
15 APC en asociación con las moléculas de HLA-A*0201 donde ellas pueden proceder para activar las células T CD8+ sin tratamiento e inducir una respuesta inmune tipo Th1 específica para P1.
Para confirmar esto, las líneas celulares humanas que portan HLA-A*0201 (T1) y no portadoras (JURKAT) se cargaron en forma intracelular con P1 por medio de un vehículo de lípidos (Lipofectin, INVITROGEN). Se halló que los esplenocitos de animales inmunizados con la preparación del polipéptido de la gripe (FLU-v) producen niveles
20 significativamente aumentados de IFN-y en comparación con los esplenocitos de animales inmunizados con NRP cuando se cocultivaron con células humanas portadoras de HLA-A*0201 tratadas con (T1) transfectadas con P1, pero no cuando se cocultivan con células humanas no portadoras de HLA-A*0201 (JURKAT) tratadas de la misma manera (ver la Figura 1A, cuyos datos se presentan en la siguiente Tabla 1).
Tabla 1
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6 ± 45,9 2257,5 ± 29,8
- Péptido 1 FLU (sol)
- 119,3 ± 7,1 < 39
- pep 1 T1-FLU (pro)
- 228,4 ± 16,6 55,8 ± 7
- pep 1 Ju-FLU (pro)
- < 39 51,2 ± 1,6
25 Nota:
"Lys" significa el umbral del control negativo sobre el cual se calculan los valores. "Sol" significa péptido soluble presentado en la población de esplenocitos primarios. "Pro" significa el péptido que se presenta complejado con las moléculas de HLA de la célula después del procesamiento interno y de la carga de los epitopes resultantes sobre las moléculas de MHC. Los valores representan el promedio ± error estándar del � IFN-y a Lys (pg/ml).
30 El experimento se puede representar esquemáticamente de la siguiente manera:
Esquema 2 –ensayo control para T1 y JURKAT T1 transfectado con P1 (o P2 etc.) o
células que presentan antígenos de ratón a las que se permite presentar P1 naturalmente por la adición de P1 (o P2 etc.) a los esplenocitos
APC(HLA)-P1 +
células T reactivas a APC(HLA)-NRP
Sin reacción (no IFN-y)
La inoculación control fue con NRP
JURKAT transfectado con P1 (o P2 etc.) o
células que presentan antígenos de ratón a las que se permite presentar P1 naturalmente por la adición de P1 (o P2 etc.) a los esplenocitos
APC(no HLA)-P1 + células T reactivas a APC(HLA)-NRP
Sin reacción (no IFN-y)
La inoculación control fue con NRP
Esquema 3 –Resultados del ensayo FLU-v para T1 y JURKAT
T1 transfectado con P1 (o P2 etc.)
o
células que presentan antígenos de ratón a las que se permite
presentar P1 naturalmente por la adición de P1 (o P2 etc.) a los esplenocitos
APC(HLA)-P1 +
células T reactivas a APC(HLA)-P1 (o P2, etc)
La inoculación fue con FLU-v
JURKAT transfectado con P1 (o P2 etc.)
o
células que presentan antígenos de ratón a las que se permite
presentar P1 naturalmente por la adición de P1 (o P2 etc.) a los esplenocitos
APC(no HLA)-P1 +
células T reactivas a APC(HLA)-P1
Sin reacción (no IFN-y)
(o P2 etc.)
La inoculación fue con FLU-v
Debido a que los ratones transgénicos usados en estos experimentos no portan ningún otro HLA humano y que la capacidad de sus células T CD8+ para reconocer específicamente epitopes derivados de P1 en el contexto de otros
10 HLA humanos a los que ellos nunca se han encontrado es baja, estos resultados muestran claramente que la respuesta IFN-y observada está causada específicamente po r células T CD8+ activadas que reconocen epitopes derivados de P1 en asociación con las moléculas de HLA-A*0201.
También es importante mencionar que no se detectó respuesta a IL-4 contra las células transfectadas con P1 en animales inmunizados con FLU-v o NRP (datos no mostrados). Debido a que la producción con IL-4 es antagonista
15 para la producción de IFN-y y en consecuencia a la creación de respuestas de las células T CD8+ específicas del antígeno, la falta de producción de IL-4 en ambos grupos muestra claramente que la inmunización con FLU-v induce una respuesta tipo Th1 específica para el componente P1 de la preparación.
También se observa un nivel aumentado significativamente de la producción de IFN-y en el FLU-v comparado con los grupos inmunizados con NRP cuando se añade simplemente antígeno P1 soluble al cultivo de esplenocitos (en 20 ausencia de células T1 o JURKAT). Sin embargo, el nivel total de esta respuesta IFN-y es menor que la observada cuando el antígeno estaba presentado por medio de las células T1 portadoras de HLA-A*0201. La explicación para esta observación es que P1 se definió sobre la base de los epitopes contenidos que son principalmente reactivos en el contexto de los HLA humanos y no de ratón. Los ratones transgénicos usados en la presente contienen un complemento total de moléculas de MHC de ratón además de las moléculas de HLA-A*0201, en consecuencia el P1 25 soluble capturado por la población de APC presente en los cultivos de esplenocitos primarios también se puede procesar en las vías de MHC Clase I y II de ratón (Peachman KK, Rao M, Alving CR, Palmer DR, Sun W, Rothwell SW. "Human dendritic cells and macrophages exhibit different intracellular processing pathways for soluble y liposome-encapsulated antigens." Immunobiology. 2005;210(5):321-33), que median las respuestas de células T CD8+ y CD4± restringidas en H-2D, respectivamente. Como resultado, si P1 contenía epitopes murinos múltiples, se 30 puede esperar que la respuesta IFN-y al P1 soluble puede ser igual o mayor que la observada para el caso de la
presentación mediada por células humanas ya que una mezcla mucho más grande de células T CD4+ y CD8+ puede reaccionar con el estímulo. Debido a que esto no se observa y el nivel de respuesta inmune in vitro se determina principalmente por la disponibilidad del antígeno, por lo que se deduce claramente que los linfocitos T CD8+ específicos de P1 detectados en los experimentos de cocultivo simplemente no pueden responder al mismo
5 nivel debido a la cantidad reducida de antígeno que se les presenta en el contexto del HLA-A*0201 correcto.
Reactividad del péptido 2
Se ha hallado que los esplenocitos de animales inmunizados con el FLU-v producen niveles significativamente aumentados de IFN-y en comparación con los esplenocitos de los animales inmunizados con NRP cuando se cocultivan con células humanas portadoras de HLA-A*0201 tratadas con MMC (T1) transfectadas con P2, pero no
10 cuando se cocultivan con células humanas no portadoras de HLA-A*0201 (JURKAT) tratadas de la misma manera (ver Figura 1B, cuyos datos se exponen en la siguiente Tabla 2). Como en el caso de P1, estos resultados muestran claramente que la respuesta observada de IFN-y está causada específicamente por las cé lulas T CD8+ que reconocen epitopes derivados de P2 en asociación con las moléculas de HLA-A*0201. De modo similar, como la producción de IL-4 es antagonista de la producción de IFN-y y en consecuencia al desarrollo de células T CD8+, la
15 falta de respuesta de IL-4 contra células transfectadas con P2 en animales inmunizados con FLU-v o NRP (datos no mostrados) muestra claramente que la inmunización con FLU-v induce una respuesta tipo Th1 específica de P2.
Tabla 2
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6± 45,9 2257,5± 29,8
- péptido FLU 2 (sol)
- 976,9±24,1 468,4±14,7
- pep T1-FLU 2 (pro)
- 372,9 ± 6,4 154,5 ± 10,7
- pep Ju-FLU 2 (pro)
- < 39 <39
Nota:
"Lys" significa el umbral del control negativo sobre el cual se calculan los valores. "Sol" significa péptido soluble
20 presentado en la población de esplenocitos primarios. "Pro" significa el péptido que se presenta complejado con las moléculas de HLA de la célula después del procesamiento interno y de la carga de los epitopes resultantes sobre las moléculas de MHC. Los valores representan el promedio ± error estándar del � IFN-y a Lys (pg/ml).
También se observó una producción significativamente aumentada de IFN-y en los grupos inmunizados con FLU-v en comparación con los NRP cuando P2 se añadió simplemente al cultivo de esplenocitos. En contraste con P1, sin
25 embargo, el nivel total de la respuesta de IFN-y fue mayor para el antígeno soluble que para el presentado por las células portadoras de HLA-A*0201. Esta observación puede indicar que P2 alberga no solo epitopes fuertes para HLA-A*0201 sino también epitopes fuertes para ratón (H-2D).
Reactividad de los péptidos 3, 4 y 5
Como en el caso de los P2, la producción significativamente aumentada de IFN-y se puede observar en los grupos
30 inmunizados con FLU-v y NRP cuando P3, P4 y P5 se añaden simplemente al cultivo así como cuando estos se presentan por medio de las líneas celulares humanas transfectadas con HLA apareada (T1), pero no cuando estas se presentan por medio de líneas celulares humanas no apareadas con HLA (JURKAT) (ver Figuras 1C, 1D y 1E, cuyos datos se exponen en las siguientes Tablas 3-5). En los tres casos, el incremento de la producción de IFN-y es mayor cuando los esplenocitos se cocultivan con células humanas transfectadas más que cuando se añade
35 solamente el antígeno soluble al medio. Estos resultados, debido a los mismos argumentos desarrollados para el caso de P2, indican que P3, P4 y P5 contienen numerosos epitopes de células T de ratón fuertes además de los humanos.
Tabla 3 Tabla 4
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6± 45,9 2257,5± 29,8
- péptido FLU 3 (sol)
- 1734,1± 57,2 268,0± 11,0
- pep T1-FLU 3 (pro)
- 587,5± 14,9 <39
- pep Ju-FLU 3 (pro)
- 148,5± 3,0 146,5± 17,6
Tabla 5
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6± 45,9 2257,5± 29,8
- péptido FLU 4 (sol)
- 1170,5± 27,8 693,8± 5,6
- pep T1-FLU 4 (pro)
- 229,9± 35,2 84,6 ± 11,6
- pep Ju-FLU 4 (pro)
- <39 <39
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6± 45,9 2257,5± 29,8
- péptido FLU 5 (sol)
- 1067,7 ± 7,3 220,5 ± 6,6
- T1-FLUpep5(pro)
- 405,6 ± 11,8 <39
- pep Ju-FLU 5 (pro)
- < 39 < 39
Nota:
"Lys" significa el umbral del control negativo sobre el cual se calculan los valores. "Sol" significa péptido soluble
5 presentado en la población de esplenocitos primarios. "Pro" significa el péptido que se presenta complejado con las moléculas de HLA de la célula después del procesamiento interno y de la carga de los epitopes resultantes sobre las moléculas de MHC. Los valores representan el promedio ± error estándar del � IFN-y a Lys (pg/ml).
Finalmente, los tres péptidos no pudieron inducir la producción- de IL-4 (datos no mostrados), es evidente que la respuesta inmune inducida por la vacunación con la preparación de FLU-v induce una respuesta tipo Th1 en cada
10 uno de estos tres polipéptidos.
Reactividad de péptido 6
Como en el caso de P1, la producción significativamente aumentada de IFN-y se puede observar entre los grupos inmunizados con FLU-v y NRP cuando P6 se añade simplemente al cultivo así como cuando ellos se presentan por medio de las líneas celulares humanas transfectadas apareadas con HLA (T1), pero no cuando se presenta por
15 medio de las Líneas celulares humanas no apareadas con HLA (JURKAT) (ver Figura IF, cuyos datos se exponen en la siguiente Tabla 6). Nuevamente como en P1, la mayor respuesta se observa con el antígeno soluble, lo que indica que P6 no contiene epitopes fuertes H-2D. Debido a que ya se han explicado las causas para estas observaciones para el caso de P1 no se desarrollarán adicionalmente aquí y se debe referir a la sección anterior.
Tabla 6
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6 ± 45,9 2257,5 ± 29,8
- péptido FLU 6 (sol)
- 496,2± 11,8 105,5 ± 7,0
- pep T1-FLU 6 (pro)
- 1210,5 ± 11,5 817,6 ± 8,9
- pep Ju-FLU 6 (pro)
- < 39 < 39
20 Nota:
"Lys" significa el umbral del control negativo sobre el cual se calculan los valores. "Sol" significa péptido soluble presentado en la población de esplenocitos primarios. "Pro" significa el péptido que se presenta complejado con las moléculas de HLA de la célula después del procesamiento interno y de la carga de los epitopes resultantes sobre las moléculas de MHC. Los valores representan el promedio ± error estándar del � IFN-y a Lys (pg/ml).
25 La falla en la estimulación con P6 para inducir cualquier producción de IL-4 (datos no mostrados), claramente muestra que la respuesta inmune inducida por la vacunación con FLU-v induce una respuesta tipo Th1 a P6.
Reactividad de FLU-v para cepas de gripe no relacionadas
Los experimentos descritos hasta este momento demuestran claramente que la inmunización con FLU-v induce una
respuesta de IFN-y de las células T CD8+ específicas contra cada uno de los seis polipéptidos constituyent es. Sin embargo, como se definió que estos polipéptidos contienen epitopes de células T CD8+ reactivos sujetos a un bajo nivel de variabilidad de secuencia dentro de la población del virus de la gripe analizada, también fue conveniente establecer si los ratones vacunados con FLU-v fueron capaces de reconocer, y en consecuencia inducir una 5 respuesta inmune tipo Th1 específica, los epitopes de células T procesados y presentados naturalmente después de la infección con diferentes cepas de gripe relacionadas. Tal análisis proporciona una indicación clara de la potencial eficacia de la mezcla de polipéptidos FLU-v como una vacuna antigripal que, en virtud de dirigirse a los epitopes de las células T de baja variabilidad de secuencia en la población de gripe humana y animal, puede proporcionar protección contra todas las cepas actuales así como las que pueden surgir en el futuro de la recombinación
10 espontánea entre cepas animales altamente patogénicas con cepas humanas actuales.
Para este análisis, los cultivos de esplenocitos primarios de animales transgénicos inmunizados con FLU-v o NRP se cocultivaron con varias células humanas infectadas portadoras de HLA-A*0201 (T1) y no portadoras (JURKAT). Las tres cepas de gripe usadas para la infección (A/New Caledonial20/99, A/NYMC/X-147 y B/Johannesburgo/5/99) son patogénicas para los seres humanos y se obtuvieron del depósito de Gripe de la OMS, sobre la base de NIBSC
15 (UK). Se usó como control positivo específico de antígeno una preparación soluble equimolar de los seis polipéptidos añadidos a la preparación de esplenocitos primaria.
Los esplenocitos de animales vacunados con FLU-v produjeron un nivel significativamente más alto de IFN-y en comparación con los de los animales vacunados con NRP cuando se cocultivan con células humanas portadoras de HLA-A*0201 (T1) infectadas con gripe tratadas con MMC transfectadas, pero no cuando se cocultivan con células 20 humanas no portadoras de HLA-A*0201 (JURKAT) tratadas de la misma manera (ver Figura 2, cuyos datos se exponen en la siguiente Tabla 7). No se detectó respuesta de IL-4 en ninguno de los ratones vacunados contra el antígeno de polipéptido soluble o las células infectadas con gripe (datos no mostrados). Estos resultados muestran claramente que la respuesta observada de IFN-y es causada específicamente por las células T CD8+ activadas que reconocen epitopes contenidas en la preparación FLU-v y que también son procesadas y presentadas naturalmente
25 en asociación con las moléculas de HLA-A*0201 en células humanas infectadas con gripe.
Tabla 7
- � IFN-y a Lys (pg/ml)
- FLU-v NRP
- Con A
- 2395,6 ± 45,9 2257,5 ± 29,8
- Mezcla de péptido FLU (sol)
- 1440,2 ± 44,9 678,3 ± 29,2
- T1-Flu A/NC/20/99
- 2146,4 ± 23,7 1282,1 ± 4,8
- Ju-Flu AINC/20/99
- 1246,9 ± 48,8 1206,4 ± 10,9
- T1-Flu AINYMC/X,147
- 1949,4 ± 37,9 1101 ± 5,9
- Ju-Flu AINYMCIX147
- 1342,3 ± 14,5 1248,6 ± 8,3
- T1-Flu B/Johannesburg/5/99
- 1769,0 ± 33,6 1196,0 ± 16,2
- Ju-Flu B/Johannesburg/5/99
- 257,6 ± 3,0 257,0 ± 8,3
Nota:
"Lys" significa el umbral del control negativo sobre el cual se calculan los valores. "Sol" significa péptido soluble presentado en la población de esplenocitos primarios. "Pro" significa el péptido que se presenta complejado con las
30 moléculas de HLA de la célula después del procesamiento interno y de la carga de los epitopes resultantes sobre las moléculas de MHC. T1 es la línea celular humana portadora de HLA-A*0201. "Ju" se refiere a JURKAT que es la línea celular humana no portadora de HLA-A*0201. A/NC/20/99 (es decir, A/New Caledonia/20/99), A/NYMC/X-147-y B/Johannesburgo/5/99 son, respectivamente, las dos cepas de gripe A y un gripe B usada para la infección de las líneas celulares humanas. Los valores representan el promedio ± error estándar del � IFN-y a Lys (pg/ml).
35 De modo interesante, la producción umbral de IFN-y para todos los grupos infectados con gripe fue mayor que la observada cuando se realizaron análisis similares por medio de antígeno de polipéptido purificado. Esta observación, sin embargo, refleja más probablemente la incapacidad del tratamiento con MMC para inactivar completamente el virus presente en la preparación celular. Esto, a su vez, puede producir virus gripal viable que infecta células de ratón sensibles en los cultivos de esplenocitos primarios, esto lleva a una respuesta primaria in
40 vitro. Esta interpretación está respaldada por la observación de que la mayoría de las cepas del virus de la gripe usadas indujeron el mismo nivel de respuesta de IFN-y umbral de modo independiente de la línea celular humana infectada y el grupo vacunado considerado. La única excepción a esta regla es la muy reducida producción de IFN-y umbral observada en las células JURKAT infectadas con B/Johannesburgo/5/99. Sin embargo, como aun este caso la producción de IFN-y para los animales vacunados con FLU-v y NRP es equivalente, parecería que la diferencia observada es causada más por la reducción de la sensibilidad de las células JURKA T a la infección con la Gripe B/Johannesburgo/5/99, que por cualquier causa intrínsecamente asociada con los diferentes regímenes de vacunación. En cualquier caso, esta observación, no desmerece el hecho evidente de que la vacunación con FLU-v produce un reconocimiento específico de los epitopes de gripe procesados naturalmente presentados en asociación con las moléculas de HLA-A*0201 después de la infección de las células humanas con varias cepas no relacionadas de virus de gripe infecciosas. En consecuencia, FLU-v constituye una preparación de vacuna candidata efectiva para la protección contra cepas de gripe múltiples, de este modo obvia la necesidad de protocolos de revacunación anuales.
EXPERIMENTO 2 – Efecto protector de polipéptidos en ratones
El fin de este estudio fue demostrar que la inmunización de baja dosis con los péptidos poliepitópicos de células T conservados de gripe identificados (FLU-v) induce la protección, mediada por las células T CD 8+, contra el estímulo letal con el virus de la gripe.
Materiales y métodos
Péptidos, antisueros y virus:
La preparación de la vacuna candidato (FLU-v) analizada en este estudio se compone de varios péptidos (es decir P1: M1A aminoácido (aa) 36 a 75 (SEQ ID 1); P2: M1B aa 124 a 158 (SEQ ID 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PB1 as 395 a 428 (SEQ ID 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6)) que se sintetizaron por química Fmoc y se resuspendieron en DMSO en PBS (la concentración de DMSO en la preparación final fue menor de 5%). La lisozima (Sigma) desnaturalizada por ebullición se usó como la preparación relevante no control (NRP-v).
La IgG2a CD8 anti-ratón de rata purificada (clon YTS 169,4) se obtuvo de AbD Serotec (UK) mientras que los virus infecciosos Gripe-A/PR/8/34 se obtuvieron de NIBSC como patrón liofilizado - estándar.
Inmunizaciones
En el día 1, ratones C57BL/6-Tg(H A-A2,1)1Enge/J de siete a diez semanas (KLA-A*0201 transgénico en un antecedente C57/BL6, Jackson Labs) se inmunizaron subcutáneamente en la base de la cola con una dosis de 200 Il de la preparación de antígeno emulsionada en IFA (Sigma). En el grupo de ensayo (n = 14), cada dosis de la preparación de antígeno contenía 60 nmol de una mezcla equimolar de los seis péptidos (10 nmol cada uno) mientras que en el grupo control (n = 14), cada dosis de la preparación de antígeno contenía una dosis equivalente del polipéptido no relevante.
En el día 15 todos los animales recibieron una inmunización de refuerzo por medio de las mismas dosis y la vía de administración como se usó originalmente.
En el día 16 los grupos ensayo y control se dividieron en dos subgrupos iguales (n = 7 cada uno; es decir Control-1, Control-2, Ensayo-1 y Ensayo-2).
En el día 19, todos los animales de los grupos Control-1 y Ensayo-I recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μl de suero anti-ratón-CD8 (100 μg) de rata mientras que todos los animales en los grupos Control-2 y Ensayos-2 recibieron una inyección equivalente de suero no relacionado.
El día siguiente (Día 20), todos los grupos se estimularon por intranasal bajo anestesia con una dosis letal grande (aproximadamente 1,5x107 pfu) de Gripe A/PR/8/34.
En el día 22, los animales se inyectaron por vía intraperitoneal nuevamente con anti-ratón-CD8 de rata o suero no relacionado como se describió antes.
Desde el día 20 todos los animales se controlaron diariamente en cuanto a síntomas de gripe (por ejemplo, estornudos y pirexia) así como la pérdida de peso.
Se seleccionaron todos los animales aún vivos en el día 27 y el estudio se terminó.
Resultados
A fin de evaluar la eficacia de la preparación de FLU-v como una vacuna de la gripe candidata fue conveniente montar un estudio de estímulo en los animales inmunizados con NRP-v y FLU-v por medio de la cepa de la gripe A/PR/8/34. Normalmente, una dosis intranasal de aproximadamente 1,5x 107 pfu matará ratones C57BL/6-Tg(HLAA2,1)1Enge/J no inmunizados en el día 4 o 5 después del estímulo (datos no mostrados).
Como se muestra en la Fig. 3A, la mayoría de los animales inmunizados con las preparaciones peptídicas de FLU-v
o NRP-v, pero sujetos a la reducción de CD8, han sucumbido a la infección con Gripe A/PR/8/34 en el día 7 después del estímulo intranasal (71% versus 100% respectivamente). En contraste, como se muestra en la in Fig. 3B y en ausencia de la reducción de CD8, los animales inmunizados con la preparación de FLU-v mostraron una reducción significativa (p < 0,05) en su tasa de mortalidad en comparación con los animales inmunizados con la preparación de NRP-v (28% versus 100%).
Los resultados de este estudio indican claramente que la vacunación con la preparación del péptido FLU-v, incluso a
5 bajo nivel de dosis de cada uno de sus péptidos activos constituyentes (10 nmol), induce un nivel significativo de protección contra el estímulo letal con la gripe. Estos péptidos, como se indicó antes, se identificaron in silico principalmente por su reactividad de las células T dentro del contexto del HLA humano Clase 1. Los resultados corroboran el hecho de que las células T CD8+ estimularon por la vacunación con la preparación de péptido FLU-v cumplen un papel significativo para conferir protección contra la infección de la gripe.
Claims (10)
- REIVINDICACIONES:1. Un polipéptido que consiste en hasta 40 aminoácidos, tal polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos 95% de homología con la SEQ ID 1:SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPen la que, el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado que expresa un alelo del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y es inmunogénica para una pluralidad de cepas del virus de la gripe.
-
- 2.
- Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, tal polipéptido comprende un epitope del linfocito T citotóxico (CTL).
-
- 3.
- Un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que consiste en hasta 35 residuos de aminoácidos.
-
- 4.
- Una composición de polipéptido que comprende uno o más polipéptidos definidos en cualquier reivindicación precedente, además que comprende uno o más polipéptidos que tienen no más de 100 aminoácidos, los polipéptidos que comprende: una secuencia que tiene al menos 85% de homología con cualquiera de las SEQ ID 2-6; o que comprende dos o más epitopes que tienen 7 aminoácidos o más, cada epitope que tiene al menos 85% de homología con una subsecuencia de cualquiera de las SEQ ID 2-6 que tiene la misma longitud que el epitope:
SEQ ID 2 LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSSEQ ID 3 DLIFLARSALILRGSVAHKSCSEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVVVRPSEQ ID 5 LLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQSEQ ID 6 IIGILHLILWILDRLFFKCIYRLF -
- 5.
- Un polipéptido, o composición de polipéptido, definido en cualquier reivindicación precedente para usar en medicina.
-
- 6.
- Un método de producir un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, tal método comprende combinar dos o más epitopes para formar el polipéptido.
-
- 7.
- Una composición de medicamento o vacuna contra la gripe, que comprende un polipéptido, o una composición de polipéptido, que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y opcionalmente un excipiente y/o adyuvante apropiado.
-
- 8.
- Un método para producir una composición de medicamento o vacuna definida en la reivindicación 7, tal método comprende mezclar un polipéptido, o una composición de polipéptido, que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5; con un excipiente y/o adyuvante apropiado.
-
- 9.
- Uso de un polipéptido, una composición de polipéptido, o una composición de medicamento o vacuna , que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y 7 en la fabricación de un medicamento o vacuna en el tratamiento o prevención de la gripe.
-
- 10.
- Un polipéptido, método, medicamento, vacuna o uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la gripe es una cepa de gripe A o la gripe es una cepa de gripe B.
Figura 1 Figura 2 Figura 3
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0602416A GB0602416D0 (en) | 2006-02-07 | 2006-02-07 | Peptide sequences and compositions |
| GB0602416 | 2006-02-07 | ||
| GBGB0613977.8A GB0613977D0 (en) | 2006-02-07 | 2006-07-13 | Peptide sequences and compositions |
| GB0613977 | 2006-07-13 | ||
| PCT/GB2007/000383 WO2007091030A2 (en) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Peptide sequences and compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2374841T3 true ES2374841T3 (es) | 2012-02-22 |
Family
ID=38109631
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES17180723T Active ES2790730T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos |
| ES11157383.8T Active ES2635590T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos |
| ES11157382.0T Active ES2611034T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos |
| ES07712678T Active ES2374841T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos. |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES17180723T Active ES2790730T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos |
| ES11157383.8T Active ES2635590T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos |
| ES11157382.0T Active ES2611034T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-05 | Secuencias y composiciones de péptidos |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (10) | US8475802B2 (es) |
| EP (6) | EP3263589B1 (es) |
| JP (1) | JP5603551B2 (es) |
| KR (1) | KR20080100441A (es) |
| CN (3) | CN102807608B (es) |
| AP (1) | AP2646A (es) |
| AT (1) | ATE534660T1 (es) |
| AU (1) | AU2007213562A1 (es) |
| BR (1) | BRPI0707543B8 (es) |
| CA (1) | CA2641602A1 (es) |
| DK (4) | DK1991563T3 (es) |
| EA (1) | EA017387B1 (es) |
| ES (4) | ES2790730T3 (es) |
| GB (1) | GB0613977D0 (es) |
| HK (1) | HK1249115A1 (es) |
| IL (2) | IL193232A (es) |
| MX (1) | MX2008010113A (es) |
| NO (1) | NO20083416L (es) |
| NZ (1) | NZ570553A (es) |
| PL (4) | PL3263589T3 (es) |
| PT (1) | PT1991563E (es) |
| SG (1) | SG169392A1 (es) |
| WO (1) | WO2007091030A2 (es) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0716992D0 (en) * | 2007-08-31 | 2007-10-10 | Immune Targeting Systems Its L | Influenza antigen delivery vectors and constructs |
| GB0408164D0 (en) | 2004-04-13 | 2004-05-19 | Immune Targeting Systems Ltd | Antigen delivery vectors and constructs |
| GB0613977D0 (en) | 2006-02-07 | 2006-08-23 | Peptcell Ltd | Peptide sequences and compositions |
| US8080645B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-12-20 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological specimen collection/transport compositions and methods |
| US8097419B2 (en) | 2006-09-12 | 2012-01-17 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009 |
| US9481912B2 (en) | 2006-09-12 | 2016-11-01 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples |
| ES2539818T3 (es) * | 2007-08-02 | 2015-07-06 | Biondvax Pharmaceuticals Ltd. | Vacunas contra la gripe multiepitópicas multiméricas |
| US11041215B2 (en) | 2007-08-24 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences |
| US9683256B2 (en) | 2007-10-01 | 2017-06-20 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Biological specimen collection and transport system |
| EP3058954B1 (en) | 2007-08-27 | 2017-03-01 | Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC | Immunogenic compositions and methods |
| US10004799B2 (en) | 2007-08-27 | 2018-06-26 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| DK2535428T3 (en) | 2007-10-01 | 2015-11-23 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological prøvesamlings- and transport system, and methods of using |
| US11041216B2 (en) | 2007-10-01 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples |
| GB0719526D0 (en) | 2007-10-05 | 2007-11-14 | Isis Innovation | Compositions and methods |
| EP2072529A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-24 | basisnote AG | MHC rapid assay used for the customization of odours |
| FR2962739B1 (fr) * | 2010-07-13 | 2014-01-31 | Univ Claude Bernard Lyon | Souches virales modifiees et procede pour ameliorer la production de semences vaccinales de virus influenza |
| CA2828068C (en) | 2011-02-22 | 2019-03-19 | Biondvax Pharmaceuticals Ltd. | Multimeric multiepitope polypeptides in improved seasonal and pandemic influenza vaccines |
| WO2013093514A2 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Retroscreen Virology Ltd | Vaccines - peptides |
| CA2863083C (en) | 2012-01-26 | 2023-09-19 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| CN107106668A (zh) * | 2014-12-10 | 2017-08-29 | 华西亚生医有限公司 | 用于免疫中的有效抗体生产的新颖蛋白质结构 |
| WO2016183292A1 (en) | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
| CN106310214A (zh) * | 2015-06-30 | 2017-01-11 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 流感病毒蛋白与宿主蛋白cpsf30的相互作用在抑制癌细胞增殖中的应用 |
| JP2019064924A (ja) * | 2016-02-24 | 2019-04-25 | Ａｇｃ株式会社 | インフルエンザワクチン |
| KR101888751B1 (ko) * | 2016-09-22 | 2018-09-21 | 이화여자대학교 산학협력단 | 인플루엔자 b 백신 |
| AU2017386682A1 (en) | 2016-12-28 | 2019-07-25 | Invvax, Inc. | Influenza vaccines |
| EP3730620A4 (en) | 2017-12-21 | 2022-01-05 | Green Biomed, Inc. | Cross-immunizing antigen vaccine and method for preparation thereof |
| JP2023534839A (ja) * | 2020-07-21 | 2023-08-14 | フルゲン， インコーポレイテッド | インフルエンザウイルスバックボーン |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4981782A (en) | 1987-05-14 | 1991-01-01 | Sri International | Synthetic peptides for diagnosis and prevention of influenza virus infection and their use |
| US5741493A (en) * | 1991-01-24 | 1998-04-21 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Vaccine composition against influenza, with synergic effects, containing influenza virus core as an additive |
| IL101639A0 (en) * | 1992-04-17 | 1992-12-30 | Yeda Res & Dev | Recombinant influenza vaccines |
| WO1994003205A1 (en) * | 1992-08-07 | 1994-02-17 | Cytel Corporation | Hla binding peptides and their uses |
| US20040087521A1 (en) * | 1993-03-18 | 2004-05-06 | Merck & Co., Inc. | Nucleic acid pharmaceuticals-influenza matrix |
| IL109664A0 (en) | 1993-05-18 | 1994-08-26 | Rijksuniversiteit | Peptides of human influenza virus for use in human t cell response inducing compositions |
| US6939546B2 (en) | 1993-05-21 | 2005-09-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Model for testing immunogenicity of peptides |
| FR2718452B1 (fr) | 1994-04-06 | 1996-06-28 | Pf Medicament | Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation. |
| WO1996010631A1 (en) | 1994-09-30 | 1996-04-11 | St. Jude Children's Research Hospital | Nucleic acid encoding mutant matrix proteins useful for attenuation or enhancement of influenza a virus |
| US7269219B1 (en) * | 1997-02-14 | 2007-09-11 | At&T Corp. | Non-linear quantizer for video coding |
| IL127331A0 (en) | 1998-11-30 | 1999-09-22 | Yeda Res & Dev | Peptide-based vaccine for influenza |
| JP2001151698A (ja) * | 1999-09-10 | 2001-06-05 | Nichiko Pharmaceutical Co Ltd | インフルエンザワクチン |
| AU2002223398A1 (en) | 2000-08-10 | 2002-04-08 | Tsinghua University | A vaccine for influenza virus and its preparation |
| CN1582333B (zh) * | 2000-09-25 | 2010-06-16 | 波利门科学生物免疫研究有限公司 | 活疫苗及生产方法 |
| US6906169B2 (en) | 2001-05-25 | 2005-06-14 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide |
| US20050013826A1 (en) * | 2002-12-20 | 2005-01-20 | Shneider Alexander M. | Vaccine compositions and methods |
| CA2807534A1 (en) * | 2003-02-25 | 2005-02-17 | Medimmune Vaccines, Inc. | Methods of producing influenza vaccine compositions |
| KR20050114225A (ko) * | 2003-03-07 | 2005-12-05 | 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드 | 인플루엔자 바이러스 백신 |
| US8592197B2 (en) | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
| DE102004052026B4 (de) * | 2003-11-07 | 2015-08-27 | Totankako Co., Ltd. | Kollektor |
| FR2863758B1 (fr) * | 2003-12-11 | 2006-07-14 | Centre Nat Rech Scient | Cellule de commande electronique pour diode electroluminescente organique d'afficheur a matrice active, procedes de fonctionnement et afficheur |
| GB0408164D0 (en) | 2004-04-13 | 2004-05-19 | Immune Targeting Systems Ltd | Antigen delivery vectors and constructs |
| AU2005248361B2 (en) | 2004-05-18 | 2010-03-11 | Vical Incorporated | Influenza virus vaccine composition and methods of use |
| NZ583564A (en) * | 2005-04-21 | 2011-09-30 | Univ Florida | Materials and Methods For Respiratory Disease Control in Canines |
| US20070116717A1 (en) | 2005-08-01 | 2007-05-24 | Shneider Alexander M | Influenza vaccine compositions and methods |
| KR20140029551A (ko) | 2006-02-02 | 2014-03-10 | 글로브이뮨 | 면역 반응 유도를 위한 효모-기반 백신 |
| GB0613977D0 (en) * | 2006-02-07 | 2006-08-23 | Peptcell Ltd | Peptide sequences and compositions |
-
2006
- 2006-07-13 GB GBGB0613977.8A patent/GB0613977D0/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-02-05 EP EP17180723.3A patent/EP3263589B1/en active Active
- 2007-02-05 PT PT07712678T patent/PT1991563E/pt unknown
- 2007-02-05 CN CN201210252429.0A patent/CN102807608B/zh active Active
- 2007-02-05 AU AU2007213562A patent/AU2007213562A1/en not_active Abandoned
- 2007-02-05 ES ES17180723T patent/ES2790730T3/es active Active
- 2007-02-05 NZ NZ570553A patent/NZ570553A/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-02-05 DK DK07712678.7T patent/DK1991563T3/da active
- 2007-02-05 WO PCT/GB2007/000383 patent/WO2007091030A2/en not_active Ceased
- 2007-02-05 EP EP17210264.2A patent/EP3320918A3/en not_active Withdrawn
- 2007-02-05 PL PL17180723T patent/PL3263589T3/pl unknown
- 2007-02-05 EP EP11157383.8A patent/EP2383285B1/en active Active
- 2007-02-05 PL PL11157383T patent/PL2383285T3/pl unknown
- 2007-02-05 US US12/278,728 patent/US8475802B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-05 DK DK11157383.8T patent/DK2383285T3/en active
- 2007-02-05 MX MX2008010113A patent/MX2008010113A/es active IP Right Grant
- 2007-02-05 KR KR1020087021658A patent/KR20080100441A/ko not_active Ceased
- 2007-02-05 DK DK11157382.0T patent/DK2383284T3/en active
- 2007-02-05 AP AP2008004571A patent/AP2646A/xx active
- 2007-02-05 EP EP07712678A patent/EP1991563B1/en not_active Revoked
- 2007-02-05 PL PL07712678T patent/PL1991563T3/pl unknown
- 2007-02-05 CN CN201110311189.2A patent/CN102382179B/zh active Active
- 2007-02-05 ES ES11157383.8T patent/ES2635590T3/es active Active
- 2007-02-05 PL PL11157382T patent/PL2383284T3/pl unknown
- 2007-02-05 EP EP19192958.7A patent/EP3620463A1/en not_active Ceased
- 2007-02-05 EA EA200870237A patent/EA017387B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-02-05 CA CA002641602A patent/CA2641602A1/en not_active Abandoned
- 2007-02-05 EP EP11157382.0A patent/EP2383284B1/en active Active
- 2007-02-05 BR BRPI0707543A patent/BRPI0707543B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-02-05 CN CN2007800079350A patent/CN101395176B/zh active Active
- 2007-02-05 SG SG201100861-2A patent/SG169392A1/en unknown
- 2007-02-05 ES ES11157382.0T patent/ES2611034T3/es active Active
- 2007-02-05 ES ES07712678T patent/ES2374841T3/es active Active
- 2007-02-05 DK DK17180723.3T patent/DK3263589T5/da active
- 2007-02-05 JP JP2008553817A patent/JP5603551B2/ja active Active
- 2007-02-05 AT AT07712678T patent/ATE534660T1/de active
-
2008
- 2008-08-04 NO NO20083416A patent/NO20083416L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-08-04 IL IL193232A patent/IL193232A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-05-07 US US13/465,940 patent/US8444995B2/en active Active
-
2013
- 2013-05-30 US US13/906,232 patent/US9446116B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-08 US US15/231,347 patent/US9889191B2/en active Active
-
2017
- 2017-04-23 IL IL251867A patent/IL251867B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-01-08 US US15/865,214 patent/US10279032B2/en active Active
- 2018-01-22 US US15/876,781 patent/US10335480B2/en active Active
- 2018-07-03 HK HK18108547.1A patent/HK1249115A1/en unknown
-
2019
- 2019-03-07 US US16/295,488 patent/US10765734B2/en active Active
- 2019-08-14 US US16/540,811 patent/US20190365883A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-09-04 US US17/013,000 patent/US11439702B2/en active Active
-
2022
- 2022-09-09 US US17/931,017 patent/US20230233660A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2374841T3 (es) | Secuencias y composiciones de péptidos. | |
| AU2013201008C1 (en) | Peptide sequences and compositions |