BRPI0707543A2 - polipeptìdeo, composição de polipeptìdeo, métodos para produzir um polipeptìdeo e uma construção de polipeptìdeos, composição de vacina ou medicamento contra influenza, método para produzir uma composição de vacina ou medicamento, uso de um polipeptìdeo, uma composição de polipeptìdeo, uma construção de polipeptìdeo ou uma composição de vacina ou medicamento, e, método de tratamento ou prevenção de influenza - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEO, COMPOSIçãO DE POLIPEPTìDEO, METODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTìDEO E UMA CONSTRUçãO DE POLIPEPTìDEOS, COMPOSIçãO DE VACINA OU MEDICAMENTO CONTRA INFLUENZA, METODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIção DE VACINA OU MEDICAMENTO, USO DE UM POLIPEPTìDEO, UMA COMPOSIçãO DE POLIPEPTìDEO, UMA CONSTRUçãO DE POLIPEPTìDEO OU UMA COMPOSIçãO DE VACINA OU MEDICAMENTO, E, MéTODO DE TRATAMENTO OU PREVENçãO DE INFLUENZA Provê-se um polipeptídeo não tendo mais do que 100 aminoácidos, cujo polipeptídeo compreende uma ou mais seqúências tendopelo menos 60% de homologia com qualquer uma de SEQ ID 1-6 ou compreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais, cada epítopo tendo, pelo menos, 60% homologia com uma sub-seqúência de qualquer SEQ ID 1-6, que tem o mesmo comprimento que o epítopo: SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP, SEQ ID 2, LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHs, SEQ ID 3, DLIFLARSALILRGSVAHKSC, SEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVWRP, SEQ ID 5 LLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQ, SEQ ID 6 IIGILHLILWILDRLFFKCFYRLF em que o polipeptídeo é imunogênico em um vertebrado expressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), e em que o polipeptídeo não é uma proteína do vírus de influenza completa.

Description

"POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO DE POLIPEPTÍDEO, MÉTODOSPARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E UMA CONSTRUÇÃO DEPOLIPEPTÍDEOS, COMPOSIÇÃO DE VACINA OU MEDICAMENTOCONTRA INFLUENZA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMACOMPOSIÇÃO DE VACINA OU MEDICAMENTO, USO DE UMPOLIPEPTÍDEO, UMA COMPOSIÇÃO DE POLIPEPTÍDEO, UMACONSTRUÇÃO DE POLIPEPTÍDEO OU UMA COMPOSIÇÃO DEVACINA OU MEDICAMENTO, E, MÉTODO DE TRATAMENTO OUPREVENÇÃO DE INFLUENZA"

A invenção refere-se a seqüências de peptídeos, composiçõescompreendendo as seqüências de peptídeos e, em particular, vacinas deinfluenza compreendendo as seqüências e as composições, e usos dasseqüências. A presente invenção refere-se especialmente a vacinas que sãoprotetoras contra uma pluralidade de cepas de vírus de influenza, incluindovírus existentes através de diferentes espécies (por exemplo, protetoras tantocontra influenza humana como aviária) bem como vírus futuros que mudaramde vírus existentes (como uma forma mudada futura de gripe aviária que éprontamente transmissível de humano para humano, que pode potencialmentedar origem a uma pandemia de influenza).

A defesa contra doença é crítica para a sobrevivência de todosos animais, e o mecanismo de defesa empregado para este fim é o sistemaimune do animal. Compreender o sistema imune é assim uma chave paracompreender o desenvolvimento de tratamentos novos e mais sofisticadospara humanos e aves similares.

O mecanismo de operação do sistema imune se encontra sobinvestigação há muitos anos. O sistema é composto de vários tipos de célulase uma variedade de moléculas, tornando o mesmo extremamente complexo.Mesmo após muitos anos de estudo, a extensão completa dos componentes dosistema imune e sua interação uns com os outros, é imperfeitamentecompreendida.

Há muitos anos atrás foi reconhecido que uma pessoa que serecupera de uma doença particular pode adquirir alguma proteção no futurocontra essa doença, mas não contra uma doença que a pessoa ainda nãocontraiu. Este aspecto fundamental do sistema imune foi interpretado em talocasião ao se considerar que o sistema imune adquire um tipo de "memória"contra determinados patógenos uma vez já tendo ocorrido a exposição a taispatógenos, sendo a memória específica para uma determinada doença.

Gradualmente, tornou-se conhecido que a exposição avariantes menos prejudiciais de um patógeno pode induzir proteção contravariantes mais prejudiciais (por exemplo, exposição a varíola bovina paraproteger contra varíola, ou exposição a um antraz inativado para protegercontra antraz vivo). Assim, surgiu a idéia de vacinação contra uma doença.

Sabe-se agora que o sistema imune tem pelo menos duasdivisões: imunidade inata e imunidade adaptiva. O sistema inato é totalmentefuncional antes de um patógeno entrar no sistema, enquanto o sistemaadaptivo é comutado após o patógeno entrar no sistema. Desenvolve-se entãoum ataque específico ao patógeno. O sistema inato compreende um númerode componentes incluindo fagócitos como macrófagos, que (como o nomesugere) "comem" ou engolem corpos estranhos como patógenos.

Tipicamente, mas não exclusivamente, a presente invençãorefere-se ao sistema imune adaptivo, e salvo especificamente indicado aocontrário, "sistema imune", no presente contexto, refere-se ao sistema imuneadaptivo.

A fim de compreender mais completamente como o sistemaimune funciona, o papel de seus componentes individuais pode sercuidadosamente considerado. Em relação ao sistema imune adaptivo, sabe-sebem que a imunidade contra patógenos é provida pela ação dos linfócitos, queconstituem o tipo de células mais comuns no sistema imune. Existem doistipos de linfócitos: o linfócito Beo linfócito T. Estes são geralmentedenominados células B e células T, respectivamente.

As células B têm a capacidade de desenvolver-se nas célulasdo plasma, que fabricam anticorpos. Os anticorpos são componentes muitoimportantes do sistema imune animal. Eles são produzidos em resposta aalguma porção de assinatura do patógeno invasor (um antígeno do patógeno -antígenos aqui sendo definidos como qualquer substância estranhareconhecida pelo sistema imune) e são geralmente específicos para aquelepatógeno. No entanto, se dois patógenos forem muito similares, ou pelomenos contiverem o mesmo antígeno, então os anticorpos produzidos contraum podem ser efetivos mesmo assim contra o outro (ele podem "reagircruzados"). Isto explica porque inoculação com varíola bovina pode protegercontra varíola. É importante perceber que os anticorpos "reconhecem"somente uma porção pequena da molécula antigênica do patógeno em vez dopatógeno como um todo. Estas porções são denominadas epítopos.

As células T não possuem ou produzem anticorpos. Aocontrário, elas reconhecem fragmentos (isto é, epítopos) do antígeno estranhocomplexados com complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (ou nocaso de humanos, antígeno de leucócito humano (HLA)) via um receptorespecializado conhecido como TCR (receptor de células T). As células T são,elas mesmas, divisíveis em subconjuntos que podem ter tanto uma funçãoregulatória como uma função efetora. As células efetoras estão envolvidascom "efetuar" a remoção de substâncias estranhas. Por exemplo, as células Tcitotóxicas (CTL) são células efetoras que são capazes de exterminar célulasinfectadas, bem como outras espécies indesejadas como células de tumor.Células T regulatórias, por outro lado, desempenham um papel em auxiliar ascélulas BeTa tornarem-se mais efetivas. Devido a esta função, as células Tregulatórias são freqüentemente denominadas células T "auxiliares". Outrascélulas T regulatórias, denominadas células T "supressoras", inibem, como se4pensa, as respostas imunes, mas estas são menos bem compreendidas. CélulasT regulatórias também podem interagir com componentes do sistema imuneinato para reforçar sua atividade.

Em um indivíduo saudável normal, os linfócitos no sistemaimune permanecem em um estado "de repouso" inativo até uma respostaimune ser desencadeada. Quando se requer uma resposta imune, os linfócitostornam-se ativados, proliferam e começam a realizar suas funções designadas.Por exemplo, qualquer célula T em repouso exibindo em sua superfície umTCR que reconhece um epítopo do patógeno invasor complexado com umamolécula de MHC é ativada, prolifera (isto sendo denominado expansãoclonal) e os descendentes resultantes começam a realizar ativamente suasfunções efetoras predeterminadas requeridas para combater os organismosinvasores.

Quando é completada a resposta imune, (isto é, os patógenose/ou células infectadas foram eliminados) os linfócitos revertem em umestado de repouso mais uma vez. Este estado de repouso não é, no entanto,equivalente ao estado de repouso inativo inicial. Linfócitos ativados, mas emrepouso, podem ser rapidamente recrutados e induzidos a proliferar emresposta a uma infecção pelo mesmo, ou patógeno intimamente relacionado,em um período posterior.

Esta capacidade de linfócitos em repouso ativados forneceremuma resposta mais rápida e mais potente após um segundo encontro com umpatógeno invasor efetivamente provê o sistema imune com "memória". Aexploração da memória do sistema imune é a base para todas os fármacosimunoprofiláticos de longo prazo (por exemplo, vacinas) e permanece umalvo para o desenvolvimento de fármacos imunoterapêuticos de prazo bemmais longo.

A fim de que as células realizem suas funções dentro desistemas complexos de um animal, as células necessitam ter "receptores" emsuas superfícies. Estes receptores são capazes de "reconhecer" substânciasespecíficas que controlam vários processos essenciais como ativação,proliferação e aderência a outras células ou substratos. Por exemplo, no casodo sistema imune, os receptores em células BeT permitem às mesmas nãosomente reconhecerem antígeno mas também interagirem umas com as outrase, assim, regular suas atividades. Sem estes receptores, as células podem serdesprovidas de meios essenciais de comunicação e podem ser incapazes deagir efetivamente em comum acordo, que é essencial para o sistema imune deum organismo multicelular.

A fim de ser capaz de reconhecer e tratar especificamente coma ampla faixa de patógenos presentes no meio ambiente, o sistema imunedesenvolveu dois tipos de receptores de antígeno altamente variáveis emlinfócitos: anticorpos em receptores de células B e células T, ou TCRs, emcélulas T.

Existem muitos receptores de antígeno possíveis, diferentes,presentes no corpo para permitir ao sistema imune reconhecer uma amplavariedade de patógenos invasores. De fato, existem aproximadamente 10receptores de células B e células T diferentes em um indivíduo. Cada célula Bindividual tem somente um tipo de receptor, e, assim, para tratar com umpatógeno particular, uma célula B tendo o receptor "de melhor encaixe" paraum antígeno desse patógeno deve ser selecionada. Este processo édenominado "seleção clonal". Na teoria, somente um único clone poderesponder (uma resposta monoclonal) ou vários (uma resposta oligoclonal) oumuitos (uma resposta policlonal) dependendo do número de antígenos/epítopos demonstrados pelo patógeno, e da especificidade das várias células Bselecionadas para estes antígenos/epítopos.

Existe uma diferença principal entre os tipos de antígenos quepodem ser reconhecidos por células B e células T. Até onde se sabe, somenteos receptores sobre a superfície de linfócitos B (isto é, anticorpos) são capazesde reconhecer diretamente antígenos tal como proteínas sobre vírus ebactérias, ou moléculas estranhas dissolvidas no fluido corporal. Osanticorpos também podem ser produzidos em uma forma solúvel pelas célulasB quando são ativados e se desenvolvem em células do plasma. Os anticorpostambém são denominados imunoglobulinas (abreviado para Ig). Os receptoresde células T, por outro lado, reconhecem somente peptídeos curtos, tambémconhecidos como epítopos de células T, sobre a superfície de células docorpo. Estes epítopos de células T são produzidos por degradação de proteínasmaiores que são tanto próprias (isto é, proteínas do corpo ocorrendonaturalmente) como não próprias (isto é, derivadas de organismos estranhosinfectando o corpo). Somente os derivados de proteínas estranhas, isto é,antígenos, são normalmente capazes de induzir uma resposta imune no corpo.Uma vez produzidos, estes epítopos são ligados a um tipo especial demolécula, o MHC (complexo de histocompatibilidade principal) e o complexoresultante é então apresentado sobre a superfície das células para ligar oreceptor de células T.

Deve estar claro que devido à natureza destrutiva da respostaimune, a resposta deve agir somente contra patógenos estranhos, não contra aspróprias proteínas ou células do corpo. Assim, o sistema imune precisadistinguir entre "próprio" e "não próprio". Foi proposto que embora os clonesde linfócitos reagindo contra os próprios sejam produzidos, eles são deletadosantes que qualquer reação possa ocorrer. Este processo é denominado"deleção clonal". Também foi proposto que quaisquer linfócitos de reaçãoprópria podem ser retidos, mas somente em um estado "desligado". Estemecanismo é denominado "anergia clonal". Qualquer que seja o processoconsiderado, não é evidente qual é o mecanismo subjacente exato permitindoque os tecidos linfóides, como o timo, identifiquem clones de células Tindividuais reagindo contra próprios dentre o conjunto de linfócitos Treagindo somente contra não próprios. Os presentes inventores investigamagora mais totalmente o mecanismo de discriminação "próprio/não próprio",que levou ao desenvolvimento da presente invenção. Os inventoresestabeleceram agora um método para prever a imunogenicidade de umasubstância como peptídeo, que possibilitou a identificação mais rápida deseqüências de peptídeos imunogênicos em proteínas grandes.

Sabe-se há muitos anos que o complexo dehistocompatibilidade principal (MHC) desempenha um papel chave nosistema imune de animais. As moléculas de MHC possibilitam às células Treconhecerem antígenos, como já discutido acima. Existem três tipos geraisde moléculas de MHC5 classe I, classe II e classe III. As moléculas de MHCclasse I e classe II são glicoproteínas que estão presentes sobre a superfície dacélula, enquanto as de classe III são geralmente moléculas presentes nointerior da célula. Existe um grande número de tipos diferentes de moléculasde MHC. Por exemplo, em humanos (onde MHC é denominado HLA,antígeno de leucócito humano) existem várias centenas de diferentes alelos degenes codificando moléculas de MHC, significando que, na populaçãohumana, existem muitos tipos diferentes de HLA. O MHC de espéciesdiferentes é tipicamente designado de acordo com convenções diferentes,assim MHC para camundongo é denominado H-2, para rato RTl e paracoelho RLA. As regiões de genes diferentes codificando diferentes moléculasde MHC em um indivíduo são geralmente designadas individualmente, comoHLA-A, HLA-C, etc. em humanos.

A molécula de MHC é uma molécula do sistema imune crítica,uma vez que é esta molécula que apresenta os epítopos dos antígenos aosistema imune. Por exemplo, se uma célula T deve responder a um patógenoparticular, o patógeno deve ter pelo menos um antígeno (como uma proteína)que tem pelo menos um epítopo (como uma porção de peptídeo da proteína)que pode ligar-se a uma molécula de MHC sobre a superfície de uma célula eassim interagir com uma célula T que se liga ao complexo MHC-peptídeo.Assim, a resposta imune depende da capacidade do MHC de se ligar a umepítopo. Se não existe nenhum epítopo ao qual o MHC irá se ligar, ou se nãoexiste nenhuma célula T que irá se ligar ao complexo MHC-peptídeo, entãonão irá ocorrer qualquer resposta imune.

Com relação a proteínas "próprias", no entanto, um dentrevários epítopos pode ser capaz de se ligar à molécula de MHC e,conseqüentemente, induzir potencialmente uma resposta imune. Nestasocasiões, um "sinal" específico deve ser provido para os clones de linfócito dereação própria a ser deletado ou "desligado".

Uma vez que, como indicado acima, ambos os peptídeospróprio e estranho (isto é, não próprio) podem ligar-se a moléculas de MHC, aligação de vários peptídeos a moléculas de MHC recebeu um exameminucioso particular no campo de imunologia. Muitas investigações temprocurado calcular ou prever a resistência de ligação entre certos tipos deMHC (particularmente HLA e H-2) e seqüências de peptídeos, para tentarcalcular respostas imunes, ou a falta das mesmas (isto é, o "sinal" requeridopara discriminação entre próprio e estranho). Exemplos destes incluem osseguintes:

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Em geral, as tentativas da técnica anterior para prever aimunogenicidade de peptídeos particulares por cálculo da resistência deligação entre o peptídeo e o ambiente de ligação conhecido de uma moléculade MHC particular. O ambiente de ligação envolve uma "bolsa" na moléculade MHC que é adaptada para aceitar um peptídeo de um certo comprimento(como 7-15 aminoácidos). A estrutura da bolsa já pode ser conhecida a partirde estudos cristalográficos de raios X prévios. Esta resistência pode sercalculada matematicamente usando algoritmos apropriados para interaçãoatômica e molecular. Alternativamente, a técnica anterior pode tentar"classificar" a resistência de ligação de um peptídeo com base em motivosexistentes no peptídeo, como aminoácidos particulares estando presentes emposições particulares em um peptídeo de determinado comprimento, porexemplo, uma prolina presente na posição três de uma ligação de peptídeo de8 aminoácidos a uma molécula de HLA conhecida particular. Geralmenteestas abordagens alcançaram sucesso limitado.

Os presentes inventores acreditam que melhoraram as teoriasacima a partir de uma compreensão melhor de como células T reagindo contrasubstâncias próprias, como proteínas próprias, são identificadas antes de suaeliminação (deleção clonal) ou silenciamento (anergia clonal).Conseqüentemente, os inventores foram capazes de identificar seqüências depeptídeos imunogênicos específicas que podem prover proteção contrapatógenos específicos, e desenvolveram vacinas para estes patógenos, usandoas seqüências identificadas. No caso da presente invenção, os inventoresdesenvolveram peptídeos utilizáveis em vacinas para influenza elicitando umaresposta de células T.

Previamente, vacinas para influenza foram desenvolvidasidentificando uma cepa de vírus de influenza existente e então produzindouma vacina específica para o vírus. Geralmente, as vacinas são baseadas emuma resposta de células B (anticorpo), o anticorpo sendo reativo com osantígenos de superfície (isto é, hemaglutinina e neuraminidase) da cepa devírus de influenza específica contra a qual ela está sendo desenvolvida.Tipicamente, as proteínas de superfície compreendendo os antígenos sãovariáveis de uma cepa de vírus de influenza para a próxima, uma vez quemutação do vírus para produzir um novo vírus tende a ocorrer nas proteínasde superfície. A conseqüência disto é que vacinas de influenza convencionaisgeralmente protegem somente contra uma cepa de vírus específica, e não irãoproteger contra uma nova cepa que resulte de uma mutação. Assim, uma novavacina é requerida para proteção contra uma cepa emergente. O problemaclaro com esta abordagem é que existe um período de tempo entre aemergência da nova cepa de vírus, e desenvolvimento da vacina, durante oqual não há nenhuma proteção disponível contra o vírus. Se o vírus forparticularmente nocivo, isto pode levar a muitos milhões de mortes, como temocorrido nas maiores pandemias de influenza do último século.

Conhece-se há algum tempo que linfócitos T citotóxicospodem prover uma resposta imune em cepas de vírus de influenza. Estudosrecentes mostram que uma resposta de CTL em humanos pode ser dirigidapara epítopos múltiplos. Foi sugerido que existe uma resposta dominante parao epítopo M-I 58-66 restrito de HLA-A2. Estes estudos incluem A.C. Boon etal, J. Virol, janeiro de. 2002, 582-90; S. Tamura et al Jpn. J. Infect. Dis.,dezembro de 2004, 236-47; G. Deliyannis et al J. Virol., maio de 2002, 4212-21; C. Gianfrani et al Hum. Immunol, maio de 2000, 438-52; e J. Jameson etal J. Immunol., junho de 1999, 7578-83.

Também recentemente foi realizada uma investigação sobrepeptídeos imunogênicos específicos que podem ser utilizáveis nodesenvolvimento de uma vacina para influenza elicitando uma resposta decélulas T. Tipicamente, este trabalho envolve a investigação de resposta deCTL para testar peptídeos de influenza, por exemplo, em camundongostransgênicos. Os peptídeos testados tendem a ser seqüências curtas que podemser reativas em um tipo de MHC (ou HLA) e são tomados de uma cepa deinfluenza de teste específica. Por exemplo, em Vaccine, 2005, 5231-44, N. Huet al. descrevem o teste de peptídeo Ml 58-66 do tipo selvagem emcamundongos Tg HLA expressando HLA-A2, -B7 ou -B27. Os resultadosmostram que o peptídeo é um epítopo de influenza reconhecido porcamundongos transgênicos expressando HLA-A2. Em Clin. Exp. Immunol.,outubro de 2005, 45-52, A.C. Boon et al descrevem peptídeos de influenza AMl 58-66 e NP 44-52 como epítopos reconhecidos em indivíduos HLA-A*0101 e HLA-A*0201. Em Cell Immunol., abril de 2005, 110-123, E.Cheuk et al descrevem peptídeo de influenza A NP 383-391 como um epítoporeconhecido em camundongos deficientes da classe I HLA-B27/H2. Usandoprogramas de previsão de epítopos, os autores identificaram mais trêsepítopos de influenza A restritos a B27, BP-2 702-710, PB-I 571 579 e PB-2368-376. Em J. Immunol., fevereiro de 2004, 2453-60, A.C. Boon et aldescrevem clones de CTL humanos específicos para variantes naturais doepítopo restrito a HLA-B*3501 em NP 418-426. Em J. Immunother., janeiro-fevereiro de 2003, 41-6, A; Trojan et al descrevem o RLEDVFAGK de 9meros, restrito a HLA-A3 que é capaz de induzir reatividade de CTLespecífica. O peptídeo GILGFVFTL de matriz do vírus de influenza A restritoa HLA-A2 também é descrito. Em J. Gen. Virol., julho de 2001, 1749-55, S.Tourdot et al identificam um epítopo restrito D(k) de murino derivado daproteína PB-I de A/PR/8/34 polimerase da cepa de vírus de influenza,correspondente a resíduos de aminoácidos 349-357 (ARLGKGYMF). Em J.Immunol., abril de 2001, 4627-33, G.T. Belz et al identificam um peptídeoimunogênico (SSYRRPVGI) da proteína PB-I polimerase de influenza,correspondente aos resíduos de aminoácidos 703-711 e um mimotopo(ISPLMVAYM) de PB-2 polimerase. PCT/US2005/002954 descreve epítoposde CTL compreendendo NP 265-273, tendo a seqüência ILRGSVAHK, etambém epítopos compreendendo NP 305-313. Finalmente, US 6.740.325descreve dois epítopos de CTL: NP 335-350, e NP 380-393.

Outros estudos mostram que dados de camundongostransgênicos deram um modelo confiável para a investigação de respostas deCTL em humanos. Em Int. Immunol. Abril de 1995, 597-605, S. Man et almostram que o epítopo de influenza A dominante reconhecido por linfócitosT citotóxicos restritos a HLA-A2.1 de camundongos transgênicos HLA-A2.1foi o epítopo do peptídeo (M-I) de proteína 1 de matriz que éimunodominante em respostas de CTL em humanos. Outros estudos nestaárea foram conduzidos por EJ. Bernhard et al (J. Exp. Med., setembro de1998, 1157-62) e E. Cheuk et al (J. Immunol., novembro de 2002, 5571-80).

No entanto, apesar dos epítopos conhecidos serem estudadosextensamente, nenhum se tornou ainda satisfatório para formar a base de umavacina para influenza que é capaz de proteger contra mais do que uma únicacepa de vírus de influenza. Além disso, vacinas baseadas nestes epítoposúnicos, mesmo se forem para prover alguma proteção, podem provavelmenteser específicas para um HLA particular, tornando as mesmas ineficazes emuma grande proporção da população humana.

Assim, um problema significativo com vacinas conhecidas,seja se baseando em uma resposta de células B ou células T, é que elasprotegem somente contra uma cepa de vírus existente, e não provêemproteção contra possíveis cepas futuras que podem se desenvolver. Com aemergência da cepa H5N1 altamente perigosa na população aviária, anecessidade de uma vacina antes de uma pandemia humana baseada em umamutação subseqüente da cepa H5N1 torna-se mais aguda. Além disso, vacinasbaseadas em peptídeos conhecidos elicitando respostas de células T podemnão ser efetivas em grandes seções da população.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente invençãoresolver os problemas associados com a técnica anterior conhecida comodescrito acima. É ainda outro objetivo da presente invenção prover umpolipeptídeo que seja capaz de elicitar uma resposta imune de CTL emvertebrados contra um pluralidade de cepas de influenza e/ou em umapluralidade de indivíduos expressando MHCs diferentes (HLAs). E aindaoutro objetivo da presente invenção prover uma vacina para influenza usandoo polipeptídeo da invenção. Preferivelmente, a vacina é capaz de protegercontra uma pluralidade de cepas de influenza e/ou é efetiva em umapluralidade de indivíduos expressando MHCs diferentes (HLAs).

Conseqüentemente, a presente invenção provê um polipeptídeonão tendo mais do que 100 aminoácidos, cujo polipeptídeo compreende umaou mais seqüências tendo pelo menos 60% de homologia com qualquer umadas SEQ ID: 1-16, ou compreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidosou mais, cada epítopo tendo pelo menos 60% de homologia com uma sub-seqüência de qualquer uma das SEQ ID: 1-6 que têm o mesmo comprimentocomo o epítopo:

SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP

SEQ ID 2 LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHS

SEQ ID 3 DLIFLARSALILRGSVAHKSC

SEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVWRP

SEQ ID 5 LLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQ

SEQ ID 6 IIGILHLILWILDRLFFKCrYRLF

em que o polipeptídeo é imunogênico em um vertebradoexpressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC),e em que o polipeptídeo não é uma proteína do vírus de influenza completa.

Assim, o polipeptídeo é um que pode compreender o total de(ou pode compreender pelo menos 7 ou mais partes de resíduo) de qualqueruma das seqüências acima, mas não pode ter mais do que 100 resíduos deaminoácidos no total. O polipeptídeo também deve ser imunogênico em umvertebrado expressando um alelo de MHC (HLA em humanos). Umpolipeptídeo imunogênico é compreendido no presente contexto comosignificando um polipeptídeo que elicita uma resposta imune em umvertebrado, como por ligação a um MHC de vertebrado e fazendo com omesmo reagir com um linfócito de células T citotóxico. Um método paradeterminar se um polipeptídeo possui imunogenicidade é descrito naexperimento 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitada aestes métodos, e o versado na técnica pode selecionar qualquer métodoconhecido para determinar a imunogenicidade, como desejado.

Como mencionado acima, o polipeptídeo pode ser umcompreendendo dois epítopos de 7 ou mais resíduos que reagem com um oumais MHCs e, assim, elicitar uma resposta de CTL ampla. A resposta podeestar em um único indivíduo ou pode estar em pelo menos dois indivíduosdiferentes (e os indivíduos podem ser da mesma espécie ou de espéciesdiferentes). Assim, o polipeptídeo pode compreender pelo menos doisepítopos de 7 ou mais resíduos, cada um dos quais individualmente provêuma resposta a um indivíduo diferente. Um epítopo no contexto da presenteinvenção é uma parte de um polipeptídeo que é capaz de se ligar a um MHCde vertebrado em um vertebrado, preferivelmente elicitando uma respostaimune, como levando o complexo MHC-epítopo a reagir com um CTL. Ummétodo para determinar se um polipeptídeo é ou contém um epítopo édescrito no experimento 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não estálimitada a estes métodos, e o versado na técnica pode selecionar qualquermétodo conhecido para determinar se um polipeptídeo é ou contém umepítopo, como desejado.

Os presentes inventores verificaram que as seqüências acimacompreendem uma pluralidade de epítopos de CTL, que podem dar proteçãocontra influenza para uma ampla variedade de vertebrados em umapopulação. Além disso, os inventores analisaram todas as seqüências de cepasde vírus de influenza conhecidas através de todas as espécies, e verificaramque as seqüências especificadas são notavelmente conservadas através detodas as cepas de vírus de influenza conhecidas. Como tais, estas seqüênciassão muito improváveis de ser significativamente alteradas em novas cepasresultantes de mutação de cepas existentes. Conseqüentemente, os epítoposnestas seqüências que provêem proteção são altamente prováveis de estarempresentes na forma não alterada em novas cepas, uma vez que a mutação nãoocorre normalmente nestas regiões. Conseqüentemente, estes epítoposprovêem excelente oportunidade não somente para prover proteção contracepas de influenza existentes (como a cepa H5N1 de "gripe aviária"), mastambém proteção contra cepas ainda desconhecidas (como uma formamudada de H5N1 que pode passar facilmente de humano para humano eformar a base de uma pandemia).

Como discutido acima, as seqüências foram identificadas apósanálise de todas as seqüências de cepas de vírus de influenza conhecidasatravés de todas as espécies. As seqüências são, assim, seqüências deconsenso desenvolvidas a partir da análise acima. A despeito de seremseqüências de consenso, as seqüências em alguns casos correspondemexatamente a seqüências naturais em algumas das cepas de vírus de influenzaconhecidas. Devido à notável conservação nas seqüências através dos vírusem todas as espécies, as seqüências de consenso, mesmo quando diferindo dasseqüências presentes, somente diferem em um pequeno número de resíduos, eassim contêm muitos epítopos pequenos (8 meros, 9 meros, 10 meros, etc.)para os quais não há nenhuma diferença das seqüências naturais. Asseqüências de consenso acima, como um todo, contêm, assim, muitosepítopos efetivos que são iguais aos epítopos naturais, bem como epítoposefetivos que diferem somente levemente de epítopos naturais. Será evidenteao versado na técnica que a invenção estende-se não somente às seqüências deconsenso e seus epítopos, mas também às seqüências presentescorrespondentes em quaisquer cepas de vírus de influenza. Assim, seqüênciascom alguma homologia com as seqüências de consenso também estão dentrodo escopo da invenção. Esta homologia permite substituição, por exemplo, deaté 3 aminoácidos em um epítopo de 8 meros (62,5% de homologia) ou emum epítopo de 9 meros, 10 meros ou 11 meros. Prefere-se que não mais que10 destas substituições sejam identificáveis em uma seqüência da invençãocorrespondente às seqüências totais de SEQ ID 1-6 (66,6% de homologia parauma de 30 meros). Estas substituições são preferivelmente substituiçõesconservativas em linha com esquemas de substituição conhecidos.

Tendo em mente que a invenção estende-se da seqüência deconsenso às seqüências naturais correspondentes, então a invenção tambémprovê um polipeptídeo tendo não mais do que 100 aminoácidos, cujopolipeptídeo compreende uma ou mais seqüências definidas pelos seguintesresíduos de aminoácidos de uma proteína de vírus de influenza, oucompreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais de umaseqüência definida pelos seguintes resíduos de aminoácidos de uma proteínade vírus influenza:

resíduos 36-75 de uma proteína Ml (preferivelmente de uma cepa deinfluenza A)

resíduos 124-158 de uma proteína Ml (preferivelmente de uma cepa deinfluenza B )

resíduos 255-275 de uma proteína NP (preferivelmente de uma cepa deinfluenza A)

resíduos 306-326 de uma proteína NP (preferivelmente de uma cepa deinfluenza B )

resíduos 395-428 de uma proteína PBlresíduos 32-55 de uma proteína M2

em que, o polipeptídeo é imunogênico em um vertebradoexpressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC),e em que o polipeptídeo não é uma proteína de vírus de influenza completa.A numeração da seqüência referida na presente invenção édefinida de acordo com princípios bem reconhecidos. Assim, a numeraçãocomeça em 1 do códon de iniciação de tradução reconhecido (ATG). Istocorresponde a uma metionina (M), para o segmento do genoma de influenzacodificando a proteína de interesse. Em outras palavras, ele começa em 1 comrelação a metionina mostrada como o primeiro aminoácido na seqüência daproteína de interesse como usado e definido pelas bases de dados em que asseqüências foram descritas (isto é, GenBank, SwissProt, etc.).

A presente invenção será descrita em maiores detalhes pormeio de exemplo somente com referência às seguintes figuras, em que:

As figuras IAalF mostram a produção de IFN-γ por culturasde esplenócitos primários de camundongos vacinados com Flu-v e NRPestimulados com Con A (10 μg/ml), lisozima solúvel (5 μ^ιηΐ), polipeptídeossolúveis purificados (PI, figura IA); P2 (figura 1B); P3 (figura 1C), P4(figura 1D), P5 (figura 1E) e P6 (figura F); 5 μ^πύ) e Tl alinhado a HLA(Tl) e células humanas JURKAT (Ju) desalinhadas, transfectadas tanto comlisozima, PI, P2, P3, P4, P5, como P6 de acordo com o protocolo descrito noexemplo 1 abaixo (a relação de esplenócito para célula transfectada é 10:1). Aprodução de IFN-γ é representada como o diferencial entre o nível deprodução em resposta ao antígeno considerado menos o IFN-γ produzido emresposta tanto a lisozima solúvel como a célula correspondente transfectadacom lisozima. Os níveis de fundo da produção de IFN-γ mediada por lisozimaforam para 25 ± 10 pg/ml de antígeno solúvel, para antígeno em 316 ± 43pg/ml de Tl, e para antígeno em 19 ± 6 pg/ml de Jurkat;

A figura 2 mostra a produção de IFN-γ por culturas deesplenócitos primários de camundongos vacinados com Flu-v e NRPestimulados com Con A (10 μg/ml), lisozima solúvel (5 μg/ml), preparaçãode polipeptídeo Flu-v solúvel purificado (PI, P2, P3, P4, P5 e P", todos juntosem 5 μ^πιΐ) e Tl alinhado a HLA (Tl) e células humanas JURKAT (Ju)desalinhadas tanto infectadas com cepas de influenzaA/New_Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 ou B/Johannesburg/5/99 outransfectadas com lisozima de acordo com o protocolo descrito no exemplo 1abaixo (a relação de esplenócito para célula infectada/transfectada é 10:1). Aprodução de IFN-γ é representada como o diferencial entre o nível deprodução em resposta ao antígeno considerado menos o IFN-γ produzido emresposta tanto a lisozima solúvel como a célula correspondente transfectadacom lisozima; os níveis de fundo da produção de IFN-γ mediada por lisozimaforam para 25 + 10 pg/ml de antígeno solúvel, para antígeno em 316 ± 43pg/ml de Tl, e para antígeno em 19 ± 6 pg/ml de Jurkat; e

Figuras 3A e 3B mostram a sobrevivência dos animais apósum desafio letal com Influenza A/PR/8/34; os animais foram imunizadossubcutaneamente tanto com FLU-v como NRP-v nos dias 1 e 15 e no dia 20todos foram desafiados intranasalmente com 45 μΐ do vírus (5x10 pfu pordose) sob anestesia; os animais na figura 3A foram inoculadosintraperitonealmente com 100 μg de soro CD8 anti-camundongo de rato nosdias 19 e 22; os animais na figura 3B foram inoculados intraperitonealmentecom um soro de rato irrelevante nos dias 19 e 22; a seta indica a data dodesafio intranasal enquanto os diamantes indicam a data que os animais foraminoculados com soro anti-CD8.

O polipeptídeo descrito acima compreende tipicamente um oumais (preferivelmente dois ou mais) epítopos. Estes epítopos sãopreferivelmente epítopos de células T, como epítopos de linfócitos Tcitotóxicos (CTL). Geralmente, o polipeptídeo é imunogênico em uma cepade vírus de influenza, e preferivelmente em uma pluralidade de cepas de vírusde influenza. No presente contexto, um polipeptídeo imunogênico em umacepa de vírus de influenza se destina a significar um polipeptídeo que é partede uma proteína de vírus de influenza e que elicita uma resposta do sistemaimune, como demonstrando reatividade de CTL quando ligado a um MHC.Um método para determinar se um polipeptídeo possui tal imunogenicidade édescrito no experimento 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não estálimitada a estes métodos, e o versado na técnica pode selecionar qualquermétodo conhecido para determinar imunogenicidade, como desejado.

Na presente invenção, o polipeptídeo compreende duas oumais seqüências como descrito acima. Tipicamente, duas, três, quatro, cincoou mais destas seqüências podem estar presentes no polipeptídeo, se desejado.Quanto mais os epítopos estão presentes, maior a amplitude de proteção dadadentro de uma população de indivíduos humanos e/ou de animais com HLAsou MHCs diferindo.

O polipeptídeo de acordo com a presente invenção tambémpode compreender uma ou mais outras seqüências que não são epítopos, sedesejado. Tipicamente, as outras seqüências são de uma ou mais proteínas devírus de influenza. Estas seqüências podem estar situadas entre duas ou maisdas seqüências (os epítopos) descritas acima, ou podem estar situadas em umaou ambas as extremidades do polipeptídeo. A presença destas outrasseqüências não deve afetar a função do polipeptídeo, com a condição de que opolipeptídeo como um todo não se torne muito grande, interferindo com aapresentação dos epítopos no sistema imune de vertebrados. Nas formas derealização específicas da invenção, quando o polipeptídeo é homólogo à SEQID 1, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de uma proteínaMl de influenza (preferivelmente de uma cepa de influenza A), quando opolipeptídeo é homólogo à SEQ ID 2, as outras seqüências sãopreferivelmente uma ou mais de uma proteína Ml de influenza(preferivelmente de uma cepa de influenza B), quando o polipeptídeo éhomólogo à SEQ ID 3, as outras seqüências são preferivelmente uma ou maisde uma proteína NP de influenza (preferivelmente de uma cepa de influenzaA), quando o polipeptídeo é homólogo à SEQ ID 4, as outras seqüências sãopreferivelmente uma ou mais de uma proteína NP de influenza(preferivelmente de uma cepa de influenza B), quando o polipeptídeo éhomólogo à SEQ ID 5, as outras seqüências são preferivelmente uma ou maisde uma proteína de influenza PB1, e quando o polipeptídeo é homólogo àSEQ ID 6, as outras seqüências são preferivelmente uma ou mais de umaproteína M2de influenza.

Nas formas de realização mais preferidas, as outras seqüênciasdas proteínas acima mencionadas são as dentro das seguintes seqüências deconsenso, ou as tendo pelo menos 60% de homologia com uma seqüênciadentre as seguintes seqüências de consenso:

Consenso Ml Influenza Á -SEQID 7MS LLTCVETYVLS TVTSGPLKL^ILGFVFTLTVPSERGLQM^Q

AI^YSAGALASCMGLIYNRMGAVTTBVAFGLVCATÍ^QIADSQ

LHGraNRMVLASTTAKAME^

TGLRDDLLENLQTYQKRMGVQMQRFK

Consenso Ml InfiuenzaB -SEQID 8

MSLFGDIIAYJXSLTEDGEGi^LAEKLHCW^

ALIGASICFLKKC^

EGHESSAIXYCXKmrrLhTGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSHRAHSRAARSSW

GVRREMQKWSAMOTAK.TMNGMGKGEDVQKLAEELQSN1GVLRSLGASQICNGEG1

AKDVMEVLKQSSMGNSALVKKYL

Consenso NP Influenza  - SEQID 9Consenso NPInfluenzaB - SEQ ED 10

Consenso mi Influenza - SEQID H

Consenso M2 Jnfiuema - SEQ JDD 12

A homologia referida acima com relação a estas seqüências épreferivelmente 75%, 85%, 95% ou substancialmente 100%.

Na presente invenção, a cepa de influenza não é especialmentelimitada, e os polipeptídeos podem ser imunogênicos contra, e/ou derivados de,qualquer cepa de influenza conhecida. Preferivelmente, entretanto, a ceparelevante é uma cepa de Influenza A ou Influenza B. Cepas de influenza futurasapresentaram mutações de qualquer destas cepas existentes podem também seralgumas contra as quais os polipeptídeos são imunogênicos, ou das quais ospolipeptídeos são derivados.

As proteínas dentro das quais as seqüências definindo ospolipeptídeos da presente invenção estão situadas são selecionadas de proteínas deMl, NP, PB e M2 de qualquer cepa de vírus da influenza (especialmente cepas deAeB) (cujas seqüências de consenso para todas as seqüências analisadas, oualternativamente cujas posições dentro da proteína, estão descritas acima). Asproteínas específicas seguintes foram analisadas pelos inventores, epreferivelmente as proteínas de vírus da influenza que se referem à invenção sãoselecionadas dentre estas proteínas específicas, ou mutações dessas proteínas.

Deste modo, as seqüências específicas homólogas a SEQ ID 1-6 descrita acimasão preferivelmente as seqüências nas posições apropriadas dentro das seguintesproteínas. Similarmente, as seqüências da presente invenção definidas pelasposições de resíduo dentro de proteínas de qualquer cepa de influenza, isto éresíduos 36-75 de proteína Ml (especialmente Ml de influenza A), resíduos 124-158 de proteína Ml (especialmente em Ml de influenza B), resíduos 255-275 deproteína NP (especialmente em NP de influenza A), resíduos 306-326 de proteínaNP (especialmente em NP de influenza B), resíduos 395-428 de proteína PB1, eresíduos 32-55 de proteína M2, são preferivelmente aqueles dentro das proteínasespecíficas seguintes. A listagem está na forma [número de versão (número degi)|identificação de banco de dados (por exemplo gb para GenBank)|Número deacesso de NCBI|informação nova opcional (por exemplo o número de acesso daseqüência de nucleotídeo da qual a seqüência de proteína é derivada). Asseqüências e cepas de influenza correspondentes das quais elas derivam podemtodas ser encontradas do banco de dados público de proteínas NCBI, que pode seracessado online no seguinte endereço de URLhttp://www.ncbi .nlm.nih. gov/entrez/querv/ static/help/lielpdoc.html#Protein. Obanco de dados de proteína contém dados de seqüência das regiões de codificaçãotraduzidas de Seqüências de DNA em GenBank, EMBL, e DDBJ bem comoseqüências de proteínas submetidas Protein Information Resource (PIR), SWISS-PROT, Protein Research Foundation (PRF), e Protein Data Bank (PDB)(seqüências de estruturas resolvidas).Proteínas Ml

i27530653|dbj|BAC54009.1|; j27530634Jdbj}BAC53998.1); |S3829719|gbiAAU94746.1|;|S3829716jgb | AAU94744.11; |53829713|gbJAAU94742.1 [; [538297lO|gbÍAAU94740. 1 j;|53829707fgb|AAU94738.1 [; |53829704|gbjAAU94736.1j· 15 3S29701]gb|AAU94734.1j;(53829698[gb[AAU94732.1|; j53S29695|gb|AAU94730.l|; l53829692|gbjAAU94728,l|;jS3829ó89|gbtAAU94726.11; !538296S6|gb^U94724.1t; [53829683|gb|AAU94722.1j;l8486160|refJNP_056ô64. Ij; |30466242|reí]NP_84S689.11; |30349250tgb|AAP22121.1|;13046621 l|ref]NP_84S672J|; |30349219|gb[AAP22104.1|;

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]4761001 jgb j AAD29192,1 |AF100384_1|4760998»gb|AAD29I9Q.l[AFl003S3_lt;]4760995jgb|AAD29188.1 [AF100382 I|; |4760992|φ|ΑΑΕ>29186.1|AF100381 II;

|47609S9lgb|AAD29184.l[AP10038(Tl| |4760986jgb|AAD29182.1[AF100379_1 j;

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10

As cepas de influenza preferidas referidas na presenteinvenção, por exemplo contra as quais os presentes polipeptídeos podemimunogênicos, são as contendo estas proteínas específicas. O números deacesso acima especificam explicitamente a identidade da cepa em adição àseqüência de proteína específica.

Em algumas formas de realização preferidas, o polipeptídeo deacordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais seqüênciascomo descrito acima e tendo pelo menos 60% de homologia com umaseqüência de consenso com relação a cepas de vírus de influenza humana eaviária conhecidas (ou dois ou mais epítopos de 7 aminoácidos ou mais tendopelo menos 60% de homologia com tal seqüência). Em outras formas derealização preferidas o polipeptídeo pode compreender uma ou maisseqüências como descrito acima e tendo pelo menos 60% de homologia comuma seqüência de consenso sobre as cepas de vírus da influenza humanaconhecidas (ou dois ou mais epítopos de 7 aminoácidos ou mais tendo pelomenos 60% de homologia com tal seqüência).

A homologia percentual de uma primeira seqüência depolipeptídeo para uma segunda seqüência de polipeptídeo, como referido nocontexto da presente invenção, é definida como o número de resíduos deaminoácido na segunda seqüência que iguala, em ambas, posição eidentidade, para aqueles na primeira seqüência, dividido pelo número total deresíduos de aminoácido no segundo polipeptídeo (tanto o primeiro como osegundo polipeptídeo deve ter o mesmo número de resíduos de aminoácido) emultiplicados por 100. Na presente invenção, prefere-se que a homologia depolipeptídeo para as seqüências definidas seja de 75% ou mais, 85% ou mais,95% ou mais ou 100% (ou substancialmente 100%).

Os epítopos dentro das seqüências definidas acima não sãoespecialmente limitados, desde que eles contenham 7 resíduos de aminoácidoou mais. Preferivelmente os epítopos são de um comprimento que éapropriado para epítopos de CTL em espécies vertebradas particulares, talcomo em um humano, tendo um MHC específico. Tipicamente os epítoposcontêm 8, 9, 10, ou 11 resíduos de aminoácido, mas podem conter mais sedesejado. Geralmente, um epítopo apropriado é um que é um epítopo de CTLem um vertebrado, tal como um humano.

Tipicamente, o polipeptídeo compreende entre 7 e 100aminoácidos, e preferivelmente de 8-50 aminoácidos. O tamanho não deve sertão grande que epítopos úteis sofram de competição com epítopos nãoprotetores no sistema imune (por essa razão proteínas completas não estãoincluídas), nem o tamanho deve ser tão pequeno que apenas uma faixa muito56

estreita de proteção seja oferecida. Faixas mais preferidas são de 8-40aminoácidos, 15-40 aminoácidos e 15-35 aminoácidos. O comprimento maispreferido é de 20-35 resíduos de aminoácido. Prefere-se particularmente que opolipeptídeo consista de (ou substancialmente consista de) uma seqüênciaselecionada das seqüências nas posições definidas acima na listagemespecífica de proteínas acima definidas.

Além dos polipeptídeos descritos acima, que não devem sermaiores que 100 resíduos de aminoácido em comprimento, a invençãotambém provê polipeptídeos imunogênicos de múltiplos epítoposcompreendendo dois ou mais polipeptídeos da presente invenção. Estespolipeptídeos de múltiplos epítopos não são limitados em tamanho. Assim,eles se estendem não apenas para os polipeptídeos tendo de 7-100 resíduos deaminoácido como resumido acima, mas também para polipeptídeos extensos,desde que estes polipeptídeos extensos compreendam duas ou mais unidades,cada unidade consistindo de um polipeptídeo da invenção. Deste modo, umpolipeptídeo tendo 100 unidades repetindo de um 7 meros, de acordo com apresente invenção, é englobado pela presente invenção, assim como é umpolipeptídeo tendo, digamos, 52 unidades de um epítopo de 8 meros, e 23unidades de um segundo epítopo de 10 meros. Polipeptídeos desse tipo nãosofrerão dos problemas de competição associados com polipeptídeos decomprimento similar que compreendem apenas um ou dois epítopos. Para quenão restem dúvidas, o polipeptídeo de múltiplos epítopos pode compreendermúltiplas cópias do mesmo epítopo, ou cópias simples de uma pluralidade deepítopos diferentes, ou múltiplas cópias de 2 ou mais epítopos.

Também a invenção provê uma composição de polipeptídeocompreendendo dois ou mais polipeptídeos diferentes como definido acima.Deste modo, a composição de polipeptídeo pode compreender qualquernúmero de polipeptídeos da presente invenção juntos na mesma mistura ouformulação. A presença de uma pluralidade de polipeptídeos juntos é útil umavez que cada pode elicitar sua própria resposta imune, ampliando o efeitoprotetor da composição. Prefere-se particularmente que a composiçãocontenha todas as seqüências de SEQ ID 1-6 quer cada em um peptídeoseparado ou várias em um número menor de peptídeos (por exemplo 3combinados em um peptídeo maior e os outros três 3 em outro peptídeomaior, etc.).

A invenção também provê uma construção de polipeptídeo,cuja construção compreende um polipeptídeo como definido acima e umveículo. A construção pode ser formada combinando dois ou mais epítopose/ou um polipeptídeo como definido acima com o veículo. O veículo pode seruma molécula, tal como um adjuvante e/ou um excipiente. Combinação, nestecontexto, significa quer misturando junto, ou fixando junto (por exemploatravés de uma ligação covalente).

A presente invenção ainda provê um polipeptídeo comodefinido acima para uso em medicina. Também é provida uma composição devacina ou medicamento contra influenza, compreendendo um polipeptídeocomo definido acima, e um ou mais excipientes apropriados e/ou adjuvantes,ou uma construção de polipeptídeo como definido acima e opcionalmente umou mais excipientes apropriados e/ou adjuvantes (se parte do veículo daconstrução for, ela mesma, um excipiente ou adjuvante, então um novoexcipiente ou adjuvante pode não ser necessário).0 excipiente ou adjuvantenão é especialmente limitado, e quaisquer excipientes ou adjuvantes usadosem medicamentos e vacinas podem ser empregados. A composição de vacinaou medicamento pode ser produzida de acordo com qualquer métodoconhecido adaptado apropriadamente para a presente invenção, tal comomisturando um polipeptídeo da invenção com um excipiente apropriado.

Um método para produzir um polipeptídeo como definidoacima é também provido pelo invenção. O método não é especialmentelimitado, e tipicamente compreende ligar dois ou mais epítopos para formar opolipeptídeo. O polipeptídeo pode, entretanto, ser sintetizado por síntesequímica direta (por exemplo incorporação de um aminoácido em um tempoaté que o polipeptídeo completo seja formado) ou por métodosrecombinantes. Tais métodos gerais são bem conhecidos para o versado epodem ser adaptados para a presente invenção como desejado. Em algunscasos, o polipeptídeo da presente invenção pode compreender seqüências deaminoácido adicionais em um ou ambos términos para ajudar na síntese dopolipeptídeo. Estas seqüências adicionais são preferivelmente de 1-5aminoácidos de comprimento. Tipicamente 3 aminoácidos estão envolvidos.Por exemplo, em uma forma de realização preferida, SEQ ID 6 compreendeos aminoácidos AAS imediatamente anterior à parte de IIG da seqüência.

A invenção ainda provê uso de um polipeptídeo oucomposição como definido acima, na fabricação de um medicamento ouvacina, efetivo no tratamento ou prevenção de influenza. Também provê-seum método de tratar ou prevenir influenza, método que compreendeadministrar um polipeptídeo, um composição, um medicamento ou umavacina como definido acima a um vertebrado. O método de administração nãoé especialmente limitado, e pode compreender administração subcutânea,intramuscular, intravenosa, intradérmica, ou intranasal, ou pode seradministrado oralmente (por exemplo na forma de uma pílula ou umpreparação líquida), ou pode estar na forma de um supositório, se desejado. Aforma de tais preparações de administração não é especialmente limitada, eformas conhecidas podem ser empregadas com modificações apropriadas queestarão aparentes para o versado. A dosagem não é especialmente limitada epode variar de 1 μg a 100 g do polipeptídeo por indivíduo, dependendo dotamanho, peso e espécie do indivíduo envolvido.

A invenção pode ser aplicada a qualquer vertebrado, uma vezque os sistemas imunes de vertebrados operam em uma maneira relacionada.Tipicamente, o vertebrado referido para o presente contexto é um mamífero,pássaro, um réptil ou um peixe. É especialmente preferido que o vertebradoseja um humano, um animal doméstico (tal como um cachorro ou um gato),um animal de criação (tal como um porco ou um cavalo); um animal bovino(tal como gado, ou uma vaca), ou aves (tal como um pássaro doméstico, umpássaro de criação, ou uma ave para prática de jogos). Quando o vertebrado éum pássaro, é preferivelmente uma galinha, um peru, um pato, ou um ganso.

Exemplos de MHCs humanos (HLAs) que podem serempregados com a presente invenção incluem os seguintes:

HLA-A

À*010101s A*010102, À*010Í03, A*Ó102, A^O 103, A*0104N, A*0106, A*01G7, Á*Q108?A*0IÜ9, A*O110, A*02010101> A*02010102L, A*020102, A*020103, A*G20104?A*020105, A*0201Q6? A*020Í07, A*020108, À*020109, A*020110, A*020111, A*0202,A%020301, A*020302, A*0204, A*0205, A*020601, A*020602, A*020603, A*0207,A*0208, A*0209, A*Q210, A*02U, A*0212, A*0213, Α*0214, A*0215N, A*0216,A*021701, À*021702, A*0218, A*0219, A*022001, A*022QO2, A*0221, A*0222, A*Q224,A*0225, A*Q226, A*0227, A*0228; A*0229, A*0230, A*0231, A*0232K, A*0233,A*0234, A*023501, A*023502, A*0236, Aitl0237, A*0238, A*0239, A*0240, A*024l,A*0242, A*0243N, A*0244í A*Ü245, A*0246, A*0247, À*0248> A*0249, Â*0250,A*0251, A*0252, A*0253N, A*0254, A*0255, A*02S6, A*0257, A*0258, A*0259,A*026O, A*0261, A*0262} A*0263, A*0264, A*0265, A*0266, A*0267t A*0268, A*0269,A*0270, A*0271, A*0272, À*0273, A*03010101, A*03010102N, Ai=03010103, A*03OÍ02,A*030103, À*03025 A*0303N, AsftOBOij A*0305, A*0306, A*0307, A*0308, A*0309,Α*0310, A*031 IN, A*0312f A*0313, A*0314, A5jtIlOlOlj A* 110102, Ait 1102, A* 1103,A*I104, A* 1105, A* 1106, An 107, AsnHOS5 Α*Π09, Anuo, A*llll, Asf5IlR A* 1113,A*im, AitIllS, A*3116, A*1117, Α*Π18, Á*l 11% A*2301, A*2302, A*2303, A*2304,A*2305, A*2306, A*2307N, A*2308N, A*2309, A*2310, A*2312N, A*2312, A*24020101,A*24020102L, A*24Q202, A*240203, A*240204, A*24O205, Á*240206s A*240301,A*240302, A*2404, A*24Ü5, A*2406, A*2407, A*2408, A*2409N, A*2410, A*2411N,A*2413> A*2414, Α*2415, A*2417, A*2418, A*2419, A*2420, A*2421, A*2422, A*2423,A*2424, Á*2425J A*2426, A*2427, A*2428, A*2429, Α*2430, A*2431, À*2432, A*2433,Α*2434, Α*2435, Α*2436Ν, Α*2437, Α*2438, Α*2439, Α*2440Ν, Α*2441, Α*2442,Α*2443, Α*2444, Α*2445Ν, Α*244ό, Α*250101, Α*250Ι02, Α*2502, Α*2503, Α*2504,Α*2601, Α*2602> Α*2603, Α*2604, Α*2605, Α*2606, Α*260701, Α*260702, Α*2608,Α*2609, Α*2610, Α*2611Ν, Α*2612, Α*2613, Α*2614, Α*2615, Α*2616, Α*2617,Α*2618. Α*2$19, Α*2620, A*262l, Α*2622, Α*2623, Α*29010101, Α*29010102Ν,Α*290201, Α*290202, Α*290203, Α*2903, Α*2904, Α*2905, Α*2906, Α*2907, Α*2908Ν,Α*2909, Α*2910, Α*2911, Α*300101» Α*300102, Α*300201, Α*300202, Α*3003, Α*3004,À*3006, Α*3007, Α*3008, Α*3009, Α*3010, Α*301ϊ, Α*3012, Α*310102, Α*3102,Α*3103, Α*3104, Α*3105, Α*3106, Α*3107, Α*3108, Α*3109, Α*3110, Α*3201, Α*3202,Aif3203, Α*3204, Α*3205} Α*3206, Α*3207, Α*3208, Α*3301, Α*330301, Α*330302,Α*3304, Α*3305, Α*3306, Α*3307, Α*3401, Α*3402, Α*3403, Α*3404, Α*3405, Α*3406,Α*3601, Α*3602, Α*3603, Α*3604, Α*4301, Α*6601, Α*6602, Α*6603, Α*6604,A*6801Ó1, Α*680102, Α*680103, Α*6802, Α*680301, Α*680302, Α*6804, Α*6805,Α* 6806, Α*6807, Α*6808, Α*6809, Α®6810, Α*6811Ν, Α*6812> Ali6813, Α*6814,Α*6815, Α*6816, Α*6817, Α*68-18Ν, Α*6819, Α*6820, Α*6821, Α*6822, Α*6823,Α*6824, Α®6825, Α*6826, Α*6827, Α*6901, Α*7401, A1"7402, Α*7403, Α*7404, Α*7405,Α*7406, Α*7407, Α*7408, A*7409s Α*7410, A*8G0L

HLA-B

Β*070201, Β*070202, Β*070203, Β*070204, Β*0703, Β*0704, Β*0705, Β*0706, Β*0707,Β*0708, 6*0709, Β*0710, B*07ll, Β*07ί2, Β*0713, B*Q714, B*0715t Β*0716, BU717,Β*0718, Β*0719, Β*0720, Β*0721, Β*0722, Β*0723} Β*0724, Β*0725, Β*0726, Β*0727,Β*0728, Β*0729, Β*0730, Β*0731, Β*0732, Β*0733, Β*0734, Β*0735, Β*0736, Β*0737,Β*0738, Β*0801, Β*0802,6*0803, Β*0804, Β*0805, Β*0806, Β*0807, BifiOSOSN, Β*0809,BsfeOaiO5 B4OSll, Β*0812, Β*0813, 6*0814, B11OSlSi B5fiOSlfi, B*0S17, Β*0818, BjfOSWN,Β*0820, Β*0821, BsfcOm, Β*13013 BmOli Β*1303, Β* 1304, Β* 1306, ΒΉ307Ν, Β* 1308,Β*1309, Β* 1310, Β*1311, Β*1312, Β* 1313, 6*1401, 3*1402, Β*1403, Β*1404, Β* 1405,Β* 140601, Β* 140602, 8*15010101, Β*15010102Ν, Β*150102, Β*150103, Β*150104,Β*150105, Β*1.502, Β*1503, Bη504, B"1505, Β*1506, Β*1507, Β*1508, Β* 1509, Β*1510,Β*151101, Β* 151102, Β*1512, Β*1513, Β*1514} Β*1515, 8*1516, 3^15170101,15170102, Β*1518, Β*1519, Β*1520, Β*1521, Β*1523, Β*1524, Β*1525, Β*1526Ν,Β* 1527, Β*1528, 6*1529, Β*1530, Β*1531, Β*1532, Β*1533, Β^1534, Β*1535, Β*1536,Β* 1537, Β*1538, Β*1539, Bn540, Bn542, Β*1543, Bn544, Β*1545, Bn546, 6*1547,Β*1548, Β* 1549, Β*1550, Β*1551, Β*1552, 8*1553,8*1554, Β*1555, Βη556, Β*1557,BlbISSSi Β*1560, Βη561, Bn562, Β*1563, Β*1564, 8*1565, B^l566, Β*1567, 8*1568,Β* 1569, 570, Βη571, Bn572, 6*1573, Β*1574, Β*1575, 6*1576, 3*1577, Bn578,Β*Ϊ579Ν, Β* 1580, B4=ISSl, Β*1582, 6*1583, Β*1584, 6*1585, Β*1586, 8*1587,6*1588,Β*1589, Β*1590, Β*1591, Βη592, Β*1593, Β*1594Ν, 6*180101, Β*180102, Β*1802,Β*1803, Β*1804, Β*1805, 8*1806, Bn.807, Β*1808, Β*1809, Β*1810, Β*1811, B*1S12,6*1813, Βη814, Βη815, Β*1817Ν, 3*1818, Β*1819, Β* 1820, Β*2701, Β*2702, Β*2703,Β*2704, Β*270502, 6*270503, Β*270504, Β*270505, Β*270506, Β*270507, Β*2706,Β*2707, Β*2708, Β*2709, 6*2710, Β*2711, Β*2712, Β*2713, Β*2714, Β*2715, Β*2716,Β*2717, 8*2718, Β*2719, 6*2720, Β*2721, Β*2723, Β*2724, 6*2725,6*2726, Β*350101,8*350102, Β*3502, Β*3503, Β*3504, Β*3505, Β*3506, Β*3507, Β*3508, Β*350901,8*350902, B45BS10, Β*35Π, Β*3512, Β*3513, Β*351401, Β*351402, Β*3515, Β*3516,8*3517, 6*3518, Β*3519, Β*3520, Β*3521, 6*3522, Β*3523, Β*3524, 6*3525, Β*3526,Β*3527, Β*3528, Β*3529, Β*3530, Β*3531, Β*3532, Β*3533, Β*3534, 5*3535, Β*3536,Β*3537, Β*3538, B*3539s Β*3540Ν, Β*3541, Β*3542, Β*3543, Β*3544, 8*3545, 6*3546*3547, Β*3548, Β*3549} Β*3550, Β*3551, Β*3552, Β*3553Ν, Β*3701, Β*3702,Β*3703Ν, Β*3704, Β*3705, Β*370ό, Β*3707, Β*3801, Β*380201, 6*380202, Β*3803,Β*3804, Β*3805, Β*3806, Β*3807, Β*3808, Β*3809, Β*3810, Β*390101, Β*390103,Β*390104, B*39020l, B*390202s Β*3903, Β*3904, Β*3905, Β*390601, Β*390602,Β*3907, Β*3908, Β*3909, 6*3910, Β*3911, Β*3912, 8*3913, Β* 3914, Β*3915, Β*3916,Β*3917, Β*3918, Β*3919, Β*3920, Β*3922, Β*3923, Β*3924, Β*3925Ν, B'"3926, Β*3927,8*3928, Β*3929, Β*3930, Β*3931, Β*3932, Β*400101, 0*400102» Β*400103, 6*400104,Β*400105, Β*400201, Β*400202, Β*4003, Β*4004, Β*4005, Β*40060101, 6*40060102,Β*4007, Β*4008, ΒΜ009, Β*4010, Β*4011, Β*4012, Β*40Ι3, Β*401401, Β*401402,Β*4ΟΙ403, BHOl5, Bsi4016, Β*4018, Β*4019, B*402Q, B*4Ü21, Β*4022Ν, Β*4023,Β*4024, B*4Ó25, Β*4026, 6*4027,1*4028, Β*4029, Β*4030, Β*4031, Β*4032, Β*4033,Β^4034, Β*4035, Β*4036, Β*4037, Β*4038, Β*4039, Β*4040, 6*4042, Β*4043, Β*4044,B^4045, Β*4046, Β*4047, 8*4048, 8*4049, Β*4050, Β*4051, B*40S2, Β*4053, Β*4054,Β*4055, Β*4056, 6*4057, 6*4101, Β*4102, Β*4103, Β*4104, BMl05, 0*4106, 8*4201,8*4202, Β*4204, Β*420501, Β*420502, Β*4206, Β*44020101, B*44020102S, Β*440202,Bift440203, Β*440301, 6*440302, Β*4404, Β*4405, 6*4406, Β*4407, Β*4408, Β*4409,33*4410, Β*44ί I1 B*4412,6*4413, 3*4414, B*4415, 3*4416, B*4417, B*4418, B*4419N,B*4420, B*442'l, B*4422, B*4423N, B*4424, B*4425, B*4426, B*4427, 3*4428, B*4429,B*4430, 3*4431, B*4432, B*4433, B*4434, B*4435, B*4436, B*4437, B*4438, B*4439,B*4440j B*4501s B*4502, B*4503, B*4504, 3*4505, B*45Q6, B*4507, B*4601, B*4602,B*4603, B*4ó04, B*47010101, B*47010102, B*4702, B*4703, BM704, B*4705, BM801,B*4802j B*4803, B*4804, B*4805, B*4806, B*4S07, B*4S08, B*4809, B*4810, B*4901,B*4902, B*4903, B*5001, B*50G2, B*5004, B*510I01, B*510102, B*510l03, B* 510104,B*510105, B*510201, B*510202, B*5103, B*5104, B*5105, B*5106, B*5107, B*5108,B*5109, B*5110, BsfiSlllN, B*5112, B*511301, B*5U302, Β*5Π4, Β*5Π5, B*5116,Bi4iSini B*5118, B*5U9, BjfSUOs B*S121, B*5122, B*5123, B»S124, B*5126, B*5127N,B4S128, B*5129, B*5130, B*5131, B*5132,.B*5133, B*5134, B*5135, B*5136, B*520101,B*52Q102, B*520103, B*520104, B*5202, B*5203, B*5204, B*5205, B*5206, B*5301G1,B*S3O102, B*5302, B*5303, B*5304, B*5305, B*5306, B*5307, B*530S, B*53C9, B*5401,B*5402, B*55G1 „ B*5502, B*5503, B*5504, B*5505, B*5507» B*5508, B*5S09, B*55Í0,B*551I, B*5512, B*55I3, B*5514, B*5S15, B*5516, B*S601, B*5602, B*56G3, B*5604,B*560501, B* 560502, B*5Ó06, B*5607, B*5Ó0S> B*5609, BisSglO, B*5611, B*5612,B*5613, B*5õl4, B*570101, B*570102, Β*5702, Β*57030ί, B*570302,1*5704, Β*5705,Β*5706, Β*5707, Β*5708, Β*5709, BsfcS801, Β*5802, Β*5804, Β*5805, 6*5806, Β*5807,Β*5808, B*5S09, Β*5810Ν, Blfc5901, Β*670101, Β*670102, Β*6702, Β*7301, Β*7801(Β*780201, Β*780202, Β*7803, Β*7804, Β*7805, Β*8101, Β*8102, Β*8201, Β*8202,Β*'8301.

HLA-C

0*010201, 0*010202, 0*0103, 0*0104, 0*0105, 0*0106, 0*0107, 0*0108,O*01 09, 0*0110, 0*020201, 0*020202, O*020203, 0*020204, 0*020205,0*0203, 0*0204, 0*0205, CW*0206, 0*0207, 0*0208, 0*0209, 0*030201,0*030202, 0*030301, 0*030302, CwijsOSOSOB, 0*030304» 0*030401, 0*030402,0*030403, Or*O305, Cw*0306, Cw*0307, Ctv*0308, Cw*O309, Cw*0310, €w*03Il,0*0312, Cw*0313, Cw*0314, Cw*0315, Cw*0316, Cw*0317, Cw*0318, 0*04010101,Cw*04010102, 0*040102, Cw*0403, Cw*Q40401, Cw*040402, 0*0405, 0*0406,0*0407, 0*0408, 0*0409H, 0*0410, Cw*Q4lh 0*0412, 0*0413, 0*0414,0*0415, 0*050101, 0*050102, Cw*0502, 0*0503, 0*0504, 0*0505, 0*0506,Ο*Ο507Ν, 0*0508, 0*0509, Cw4tOSlO1 0*0602, 0*0603, 0*0604, 0*0605,0*0606, Cw*0607, 0*0608, 0*0609, 0*0610, Cw*06II, Cw*070l01} 0*070102,0*070103, 0*07020101, 0*07020102, 0*07020103, 0*0703, 0*070401,0*070402, 0*0705, 0*0706,. 0*0707, 0*0708, 0*0709, 0*0710, 0*0711,0*0712, 0*0713, 0*0714, 0*0715, 0*0716, O*0717, 0*0718, 0*0719,0*0720, 0*0721, 0*0722, 0*0723, 0*0724, 0*0725, Cw*0726, Çw*0727}0*0728, 0*0729, Cw5fOBOIOI, 0*080102, 0*0802, 0*0803, 0*0804, 0*0805,0*0806, 0*0807, 0*0808, 0*0809, 0*0810, 0*0811, 0*0812, 0*120201,,0*120202, 0*120203,0*120301, 0*120302,0*120303,0*120401, 0*120402,0*1205; O*1206, 0*1207, 0*1208, 0*1209, 0*1210, 0*1211, Cw*l212,0*1213, O*1214, 0*1215, 0*140201, 0*140202, 0*140203, 0*1403,0*1404, 0*1405, 0*150201, Cw*150202, 0*1503, 0*1504, Cw* 150501,0*150502, Cw*150503, Cw*150504, 0*1506, 0*1507, 0*1508, 0*1509,0*1510, 0*1511, Cw*1512, 0*1601, 0*1602, 0*160401, 0*1606, 0*1701,Cw*1702,0*1703, Cw* 1801,0'*1802.

HLA-E

E*0101, E*010301,E*010302, E*010303, E*0104,HLA-F

F*010101, F*010102,HLA-G

G*010101, G*010102, G*010103, G* 010104, G* 010105, G*010106, G*010107, G*010108,G*0102,0*0103, G*010401,0*010402, G*010403, G*0105N, G*0106.

HLA-DRA

DRA*010Í5DRA*010201,DRA*010202.

HLA-DRBl

DRB1*010101, DRB 1*010102, DRBl ftOlOl 03, DRBP01020L DRB1*010202,DRB1*010203, DRB1*010204, DRB1*0103, DRB1*0104/ DRB1*0105, DRB 1*0106,DKBι*ο 107," Drbpoios5 drbpolq9,- drBpouo, drbpoiii, drbpo3O10í?DBB1 *Ü30102/-DEBP030201, DRB 1*030202, DRBP0303, DRB1*0304, DRBP030501,DRB 1*030502j. DRB 1*0306, 'DRBP03O7/; DRBP0308, DRBP0309, DRBP0310,DRBP0311. ^RBP03125 DRBP0313, :DRB1*0314, DRBlltlOSlS, DRB 1*0316,DRBli-OSns DRBP0318, DRBP0319, DRB 1*0320, DRB1*0321, DRB 1*0322,DRB 1*0323, DRBP0324, Dm *0325, -DRBP0326, DRB 1*0327, DRB 1*0328,DRBP040101, DRBP040Í02, DRB 1*0402, DRBP040301, DRBP040302, DRBP0404,DRB1*0405Ü1- ■ DRBP040502, DRBP040503, DRB1*040504, DRBP0406,DRB1*040701, DRB 1*040702, DRBP040703,. DRB1*0408, DRBP0409, DRB 1*0410,DRBP0411, 'DRBP0412, DRBP0413", DRB 1*0414, DRB 1*0415, , DRBP0416,DRB 1*0417, ,DRBP0418, ,DRBllfcOftlQj"' DRBP0420, DRBP0421, DRBP0422,DRBP0423,7 DRBP0424, DRBP0425, DRBP0426, DRBP0427, DRB 1*0428,DRBl *0429, DRBP0430, DRBP0431, DRBP0432, DRB P 0433, DRBP0434,DRBPG435, DRB1*0436, DRBP0437,- DRBP0438, DRB 1*0439, DRBP0440,DRB1*0441, DRBP0442, DRB1*0443, DRB1*0444, DRB 1*0445, DRB P0446,DRBP0447, DRBIlf0448, DRB 1*0449, DRB 1*045O, DRB 1*070101, DRB 1*070102,DRB1*0703, DRB1*0704, DRBP0705, DRBP0706, DRBP0707, DRBP0708,DRBPOSOIOI, DRBP080102, DRBP080201, DRB 1*080202, DRBP080203,DRB1*080302, DRBP080401, DRB 1*080402, DRB1*080403, DRBP0S04G4,DRBP0805, DRBlifcOSOe, DRBP0807, DRBP0S08, DRBP0809, DRBPOSlOfDRBP0811, DRB 1*0812, DRB1*0813> DRBP0814, DRBP0815, DRBP0816,DRBP0817, DRB 1*0818, DRBP0819, DRB 1*0820, DRB 1*0821, DRBP0822,DRBP0823, DRB1*0824, DRBP0825, DRBP0826, DRB 1*0827, DRB 1*0828,DRB 1*0829, DRBP090102, DRBPG90103, DRBP0902, DRB 1*0903, DRBP100101,DRBP100102, DRBPHOIOÍ, 'DRBl »110102, DRB 1*110103, DRBP1IQ104,DRBPl ÍOÍOS, DRBPl 102, DRBP1103, DRBP110401, DRBPl 10402, DRBP1105,DRBPIlOdOl, DRBPl í 0602, DRBP1107, DRBPl 10801, DRBP110802, DRBP1109,DRBPI110, DRBPl 111, DRBPl 11201, DRBP111202, DRBPU13, DRBP1114,DRBPll 15, DRBPl 116, DRBPl 117, DRBPl 118, DRBP1119, DRBPI120,DRBP1121, DRBPl 122, DRBP1123, DRBP1124, DRBP1125, DRBP1126,DRBPI12701Γ DRBP112702; DRBP1128, DRBPI129, DRBP1130, DRBP1131,DRBPl 132, DRBPl 133, · DRBPl 134, DRBP1135, DRBP1136, DRBP1137,DRBPl 138, DRBP 1139, DRBP1140, DRBP1141, DRBP1142, DRBP1143,DRB 1*1144, DRBIH145, DRB 1*1146, DKBPl 147, DRBP1148, DRB P1149,DRBPl 150, DRBP Π51, DRBP1152, DRBP1I53, DRBP1154, DRBP120101,DRBP120102, DRB P120201, DRB P120202, DRBP120302, DRBP1204, DRBP1205,DRBP1206, DRBl*1207,- DRBP1208, DRBP1209, DRBP1210, DRBP130Í01,DRBl ikI 30102, DRBP130103, DRB P130201, DRB Pl30202/ DRBP130301,DRBP130302, DRBP1304, DRBP1305, DRBP1306, DBBP13O701, DRB P130702,DRBl *1-308, DRBP.1309, DRBP1310, DRBl=tOllj DRB P1312, DRBP1313,DRBP131401, DRBPl31402, DRBP1315, DRBP1316, DRBP1317, DRBP1318,DRBP1319, DRBP1320, DRBP1321, DRBP1322, DRBPl 323, DRB P1324,DRBP1325, DRBP1326, DRBP1327, DKBP1328, DRBP1329, DRBP1330,DRBP1331, DKBP1332, DRBP1333, DRBP1334, DRB P1335, DRBP1336,DRBP1337, DRBPl 338, DRBP1339, DRB P1340, DRBP1341, DRBP1342,DRBP1343, DRBP1344, DRBP1345, DRBP1346, DRBP1347, DRBP1348,DRB P1349, DRBPl 350, DRBP1351, DRBP1352, DRBP1353, DRBP1354,DRBP1355, DRBP1356, DRBP1357, DRBP1358, DRBP1359, DRBP1360,DRBP1361, DRBP1362, DRBP1363, DRBP1364, DRBP1365, DRBP140101,DRB1*140102, DRB1*1402, DRBP140301, DRBP1403G2, DRBP1404, DRBP140501,DRBPl40502, DRBP1406, DRBP140701, DRBP140702, DRBP1408, DRBP1409,DRBP1410, DRBP1411, DRBP1412, DRBP1413, DRBP1414, DRBP1415,DRBPÍ4I6, DRBP1417, DRBP1418, DRBP1419, DRBP1420, DSBP1421,DRB P1422, DRBPl423, DRBP1424, DRB P1425, DRB P1426, DRBP1427,DRB P1428, DRBP1429, DRBP1430, DRBP1431, DRBP1432, DRBP1433,DRBP1434, DRBP1435, DRBP1436, DRBPI437, DRBP1438, DRB P1439,DRBP1440, DRBP1441, DRBP1442, DRBliftWS, DRBP1444, DRB1H445,DRBP1446, DRBP1447, DRBP1448, DRBPl50101, DRBP150102, DRB 1*150103,DRBP150104, DRB P150105, DRB P150201, DRBP150202, DRBP150203,DRB P1503, DRBPl504, DRBPl 505, DRB Pl 506, DRBP1507, DRB P1508,DRBP1509, DRBP1510, DRBPI511, DRBP1512, DRBP1513, DRBP1514,DRBP1515, DRBP1516, DRBP160101, DRBP16O102, DRBP160201, DRBP160202,DRBP1603, DRB P1604, DRBP160501, DRB P160502, DRB P1607, DRBP1608.HLA-DRB2-9

DRB2*0l0l·, DRB3*010101,, DRB3*Ol0I0201, DRB3*01010202, DRB3*01G103,DRB3*010Í04S DRB3*0102, DRB3*0103, DKB3*0104, DRB3*0105, DRB3*0106,DRB3*0l07, DRB3*0108, DitB3*0109, - DRB3*01105 DRB3*0m, DRB3*0201,DRB3*020201, DRB3*020202, DRB3*020203> DRB3*020204, DRB3*0203, DRB3*0204,DRB3*020S, DRB3*0206, DRB3*0207, DRB3*0208, DRB3*02095 DKB3*0210,DRB3*02llf DRB3*0212, DRB3*0213, DRB3*0214, DRBS5sOZlSy DRB3*0216,DRB3*0217? DKB3*0218} DRB3*0219, DRBSstOSOlOli DRB3*030102, DRB3*0302,DRB3*0303, DRB4*01010101, DRB4*0102, DRB4*01030101, DRB4*01030102NtDRB4*010302, DRB4*010303, DRB4*010304, DRB4*0104, DRB4*0105Í DRB4*0106,DRB4®0107, DRB4*Q201N, DRB4*0301N, DRB5*010101, DRBSikO 10102, DRBSifeOlOZ3DRB5*0103, DRB5*0104, DRB5*Ü105, DRB5*0106, DRB5*0107, DBBSltsOlOSN,DRBS3ltOlO?, DRB5*0110N, DRBSskOitl, DRB5*0U2, DRBSii=OUS, DRB5*0202,DRB5*0203, DRB5*0204, DRB5*020S, DRB6*0101, DRR6*0201, DRB6*0202,DRB7*010Í01SDRB7*0101G2, DRBSsiOlOi1DRBSiliOlOL

HLA-DQAl

DQA1*010101, DQA^OlOlOli DQA1*010201, DQÂ1*010202, DQAljliOlOS,DQAl *010401, DQAlsOl 0402, DQA1*0105, DQA1*0106, DQA1*0107, DQAl*020ltDQA1*030101, DQA1*0302, DQAl*0303, DQA1*040101, DQA1*040102, DQAl »0402,DQA1*0403N, DQA1*0404, DQA1*050101, DQAl*050l02, DQA1*0502, DQAl*0503,DQA1*0504, DQAPOSOSf DQÂ1*060101, DQA1*060102, DQAP0602.

HLA-BQBl

DQB1*020101, DQB1*020102, DQB1*0202, DQB 1*0203, DQB1+030101, DQB1*030102,DQB1*0302G1, DQB 1*030202, DQBP030302, DQB1*O3O303, DQB1*0304,DQB 1*030501, DQB 1*030502, DQBl »030503, DQB1*0306, DQB 1*0307, DQB1*0308,DQB 1*0309» DQB 1*0310, DQB 1*0311, DQB 1*0312, DQB 1*0313, DQB1*0401,DQBl ®0402, DQB 1*050101, DQB POSO 102, DQB 1*05020!, DQB 1*050202,DQB1*050301, DQB 1*050302, DQBP0504, DQB1*060I01, DQBP060102,DQB1*060103, DQB1*0602, DQB 1*0603, DQB 1*060401, DQB1*060402, DQB 1*060501,DQB1*060502, DQB1*0606, DQBl*0607, DQB 1*0608, DQBl *0609, DQB 1*06 IO5DQB 1*061 IOif DQBl *06ί 102, DQB 1*0612, DQBl*06l3, DQB 1*0614, DQB 1*0615,DQB1*0616, DQB 1*0617, DQB 1*0618, DQB 1*0619, DQB1*0620/ DQB 1*0621,DQB1*0622, DQB1*0623.

HLA-DPAl

DPA1*010301, DPAl *010302, DPAl *010303, DPA1*0104, DPAl «0105, DPAls=Ol 06,DPAl *G107, DPA1*0108, DPAl*02dl01, DPA1*020102, DPAl»020103, DPÀ1*0201Q4}.DPA1*020105, DPA1*020106, DPA1*020201, DPA1*020202> DPAl*020203,DPAI*0203, DPAl *030l, DPA1*0302, DPA1*0303, DPAl*040l.

HLA-DPBl

DPBl*01010l, DPB 1*010102, DPBP010103, DPBP0102, DPBP020102, DPB 1*020103,DPB1*020104, DPB1*020105, DPB1*020106, DPB1*0202, DPBl*0203, DPB1*03G101,DPBÍ*03O102, DPB1*0302, DPB1*040101, DPB1*040102, DPB1*0402, DPB1*0501,DPB1*0601, DPB1*0801, DPB1*0901, DFB 1*1001, DPBiniOlOl, DPB1*U0102,

DPB1*1301, DPB1*1401, DPBinSOl, DPB1*1601, DPB1*1701, DPB1*1S01,DPBI*1901, DPBF200101 , DPB1*200102 , DPB1*21013 DPB1*2201, DPB1*2301,DPB1*2401, DPB1*2501, DPB1*26O101, DPB 1*260102, DPB1*2701, DPB1*2801,DPB1*2901, DPB1*3001, DPBP3101, DPB1*3201, DPB1*3301, DPB1*3401,DPB1*3501, DPB1*3601, DPB1*3701, DPB1*3801, DPB1*3901, DPB1*4001,DPBl *4101, DPB1*4401, DPB1*4501, DPB 1*4601, DPB1*4701,, DPB1*4801,DPB1*4901, DPBlitSOOl, DPB1*5101, DPB1*5201, DPB1*5301, DPB1*54QI,DPB1*5501, DPB1*5601, DPB1*5701, DPB1*5801, DPB1*5901, DPB1*6001,DPB1*61Ô1N, , I)PB1*62Ü1 , DPB1*6301, DPBP6401H, DPB 1*6501, DPB 1*6601,DPB1*6701> DPBP680U DPB1*6901, DPB1*7001, DPBl*710l, DPBl *7201,DPB1*7301, DPB1*74QI, DPB1*7501, DPB1*7601, DPBP7701, DPB1*7801,DPB1*7901, DPB1*8001, DPB 1*8101, DPB1*S201, DPBI*8301, DPB1*8401,DPB1*8501, DPB1*8601, DPB1*870Í, DPB1*8S01, DPB1*8901, DPB1*9001,DPB 1*9101, DPB 1*9201, DPB1*9301, DPB 1*9401, DPBP9501, DPB 1*9601,

DPB1*9701; DPBl *980l, DPBl*990i.HLA-DMA

DMA^OIOI, DMA*0102, DMA*01Ô3; DMAè0104.-HLA-DMB

DMB*01Gl, DMB *Q 102, DMB*Q103, DMBilOlM, DMBipOlOS, DMB*0106.HLA-DOA

DOAiiiOlOlOl, DOAsiO1010201, DOA*010I0202, DOA4Ol Ol0203, DOA*010103,ΒΟΑ*01010401, DOA*01010402, DOA*010105.

HLA-DOB

DOB*0I010101, DOB*01O1O1O2, DOB*010102, DOB*010201, DOB*Q10202, DOB*01G3,DOB^OKMOlOli DOB*01040102.

MHC Oass I

H-2Db, H-2Dd, H-2Dk, H-2Dq, H-2Kb, H-2K4 H-ZKk, H-2Ld, E-2M3, H-2Ad, H-2Ag7,H-2Ak, H2-Ab, H~2Ed, H-2Ek, H-2Bxk, H-2F, H-2I, H-IPjE-IRj H-2S, H-ISxdi H-2T4, H-ZU

MHCClassn

I-Ab, I-Ad, I-Ag?, I-Ak, I-Ap, I-Aq, I-Ar, I-As, I-Au, I-Av, I-Ea, I-Eb, I-Edi I-Ek, I-Es, I-Eu,H-2Q, H-2Qa-2, H-2Qa-2a, Qa-la, Qa-lb.

A invenção não é limitada para tais moléculas de MHC eHLA5 e pode ser adaptada para tais moléculas recém descobertas, se desejado,simplesmente estabelecendo a reatividade de substâncias tal como peptídeoscom as moléculas. Isso pode ser prontamente realizado usando técnicasconhecidas que são o padrão no campo. Os alelos de HLA particularmentepreferidos para uso com a presente invenção incluem os seguintes:

HLA Classe IHLAA HLAB HLACwAlb6802 B*5S01 0*1701A*6801 B*5701 Cw* 1601A*6601 B*5501 0*1502A*3303 B*5201 Cw* 1402A* 33 Ol B*5101 Cw* 1203A*3201 B^SOOl 0*0802A*310102 B*4901 Cw*0801A*3002 B*4501 0*0704A*3001 B*4403 0*0703A*2902 B*4402 0*0702A*2608 B*4101 0*0701A*2601 3*4002 0*0602A*2501 B*4001 0*0501A*2402 B*3901 0*0401A*230! B*3S0Í Cw*0304A* IlOi B*3701 0*0303A*0302 B*3503 0*0202A*0301 B*3501 0*0102A*0205 B*27Q5 A*Q201 B*1801 Ai9iOlOl B*1501 6*1402 B*1401 B*1302 B*0801 B*0705 B*0702

HLA Classe II

HLADPB HLADOA HlAPOB HlLA PRB

DPB 1*1701 DQA1*0505 DQB 1*0604 DRB 1*1601DPB1*1301 DQAP0501 DQB 1*0603 DRB P1501DPBP1001 DQA1*O401 DQB1*0602 DRBl*1401DPB1*0601 DQA1*0303 DQB1*0503 DRB 1*1302DPB 1*0501 DQAP0302 DQBP0502 DRB1*1301DPB1*0402 DQA1*03Q1 DQB1*0501 DRB1H201DPB 1*0401 DQA1*0201 DQB1*0402 DRB 1*1104DPBI111OSOI DQA1*0104 DQB1*0303 DRBiniOlDPBI*0201 DQAl103 DQB 1*0302 DRBP0801DPBl5fcOlOl DQAl *0102 DQB1*0301 DRB1*0701DQAlijOlOl DQB 1*0202 DRB1*0404DQB 1*0201 DRB 1*0401DRB1*0301DEB 1*0103DRB 1*0102DRBP0101

Os alelos mais preferidos de acordo com a invenção são osseguintes:

HLA-A*0201, HLA-À*0206> HLA-A*0301, HLA-Â*U01, HLA-A*2402, HLA-A*340l,HLA-B*0702, HLA-B*ÕS01, HLA-B*1301, HLA-B*27, HLA-B*4002, HLA-BlliSlOl,HLA-CwsliOSi HLA-CWlfeO?

HLA-DRBI *0301, HLA-DRB1*0401, HLA-DKBlWOli HLA-DRB1*1501, HLA-DRBliltI 104, HLA-DRBl * 1101, HLA-DRB4*0101

HLA-DQA1*01, HLA-DQAlitOl, HLA-DQAl *05

HLA-DQBl *03, HLA-DQBl *04, HLA-DQBl *05, HLA-DQB 1*06

HLA-DPAl *0l, HLA-DPAl *02

HLA-DPB 1*02, HLA-DPB 1*04

A invenção será agora descrita a título de exemplo apenas,com referência às seguintes formas de realização específicas.EXEMPLOS

EXPERIMENTO 1 - Reatividade de polipeptídeos contra antígenos deinfluenza

O propósito do estudo foi demonstrar a reatividade dospolipeptídeos de influenza acima descritos e sua capacidade para induzir umaresposta de citoquina de tipo Thl contra proteínas de influenza naturalmenteprocessadas e apresentadas no contexto de HLA humano (HLA A* 0201).

Como base de fundo para os experimentos, é útil entender querespostas de Thl e Th2 são definidas pelo padrão de citoquinas produzidaspelas células auxiliares T envolvidas nas mesmas. Isto, entretanto, nãosignifica que os linfócitos restantes (células TeB) envolvidos naquelasrespostas específicas não produzem também citoquinas que ajudam a dirigir opadrão característico de resposta em que eles estão envolvidos. Desta forma,uma resposta de tipo Thl é caracterizada pela produção de IFN-γ e IL-2,conduzindo a estimulação de uma resposta CTL de CD8+ e uma resposta deanticorpo de IgG2a associada (em camundongos). A resposta de TFN-γ podeser produzida tanto pelas células auxiliares 1 de T CD4+ bem como pelascélulas T CD8+ que também formam parte disso. Nesse caso o componentede EFN-γ da resposta produzida pelas células T CD8+ foi investigado. Isto éporque o experimento estava investigando primariamente epítopos de célulasT CD8+ sendo assim desejável provar que a resposta vista foi causada porestas células. Uma vez que células T CD8+ reagem a epítopos apenas nasmoléculas de classe I de MHC, células humanas que compartilham com ocamundongo transgênico apenas uma molécula de classe I de MHC (isto éHLA-A*0201) foram usadas. Uma resposta de tipo Th2 é caracterizada pelaprodução de TL-4 e IL-10, conduzindo à estimulação de uma resposta deanticorpo de IgGE, IgGl e (em camundongos) IgG2b. Ambas as respostas sãoantagonísticas com IFN-γ e IL-IO regulando de modo negativo a produção decada uma.

Todos os experimentos descritos abaixo foram realizados emduplicata.

Materiais e métodos

Peptideos e proteínas recombinantes

Todos os polipeptídeos usados neste estudo (isto é PI:Aminoácido de MlA (aa) 36 a 75 (SEQ ID 1); P2: MlB aa 124 a 158 (SEQID 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4);P5: PBl aa 395 a 428 (SEQ ID 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6) e NRP:polipeptídeo não relevante de controle) foram sintetizados por química Fmoce recolocados novamente em suspensão em 10% DMSO em PBS.Linhagens celulares e vírus

As linhagens celulares de Tl e JURKAT são linhagens delinfoblastóides humanos derivados de indivíduos contendo e não contendoHLA-A*0201 respectivamente. Tl foi mantida em meio de cultura de IMDM(Invitrogen) enquanto JURKAT foi mantida em Meio de cultura RPMI-1640(Sigma) contendo 10 mM de HEPES e 1 mM de piruvato de sódio. Ambosmeios de cultura foram suplementados com 50 IU/50 mg/ml depenicilina/estreptomicina (Sigma) e, como meio de cultura completo, 10 %FCS. Culturas celulares foram mantidas a 37 0C em uma atmosfera umedecidade 5 % de CO2.

Esplenócitos primários foram mantidos em meio de culturaIMDM (Invitrogen) suplementados com 0,02 mM de β mercaptoetanol(Sigma), 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) e 10 % FCS(Sigma) a 37°C em uma atmosfera umedecida de 5 % de CO2.

Cepas de influenza A New_Caledonia/20/99, NYMC/X-147 ecepa de influenza B Johannesburg/5/99 foram obtidas de NIBSC como lotesliofilizados e usadas para a infecção de linhagens celulares humanassingenêicas (Τ 1) e alogenêicas (JURKAT).

Preparação de células alvo para análise de citoquina

Culturas celulares em fase exponencial foram colhidas porcentrifiigação (250 g, 5 min) e recolocadas novamente em suspensão a umadensidade de IO6 células/ml em meio de cultura livre de soro. Alíquotas dassuspensões celulares foram transfectadas com uma faixa de antígenos depolipeptídeo em uma concentração de 5 μg por IO6 células usando Lipofectina(Invitrogen) de acordo com instruções dos fabricantes e incubadas em meio decultura completo por 8-10 horas antes de tratamento de Mitomicina C (MMC).

Alternativamente, alíquotas das suspensões celulares foram infectadas com umafaixa de vírus da influenza vivo (MOI de 5-10) por uma hora, lavadas duas vezesem meio de cultura livre de soro e incubadas em meio de cultura completo por 24horas antes de tratamento de MMC.

Para tratamento de MMC, células foram colhidas porcentrifiigação (250 g, 5 min) e recolocadas novamente em suspensão em meio decultura de IMDM livre de soro contendo 50 pg/ml de Mitomicina C (Sigma).Após incubação de 45 min a 37°C, as suspensões celulares foram lavadas quatrovezes em meio de cultura de IMDM livre de soro (250 g, 5 min) e finalmentecolocadas novamente em suspensão em meio de cultura de IMDM completo.

ImunizaçõesCamundongos C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J de sete a dezsemanas de idade (HLA-A*0201 transgênicos em um fundo de C57/BL6, JacksonLabs) foram imunizados subcutaneamente com uma dose de 200 μΐ da preparaçãode antígeno por camundongo. No grupo de teste, cada dose da preparação deantígeno continha 60 nmol de uma mistura equimolar de todos seis peptídeos (10iimol cada) preparados em EFA (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante(preparação de FLU-v). No grupo de controle, cada dose da preparação deantígeno continha uma dose equivalente do polipeptídeo não relevante preparadosem IFA (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante (preparação de NRP).

No dia 14 após imunização, todos animais receberam umaimunização de reforço usando as mesmas doses e via de entrega como usadooriginalmente. Finalmente, no dia 21 ou 22, todos animais foram separados e seusbaços coletados.

O protocolo de imunização pode ser representadoesquematicamente como a seguir:

Esquema 1 - Inoculação

FLU-v=combinação de Pl P2 P3 P4 P5 e P6

Imunizar camundongo com FLU-v

Coletar os esplenócitos após 21 ou 22 dias - qualquer reação imune terácausado amplificação nas células T do camundongo reativas paraepítopos apresentados corretamente dentro de Pl- P6, que irão se tornarativados e/ou proliferar. Se peptídeos estão corretamente apresentadospor ambos, MHC de camundongo e HLA de humano, células T reativaspara epítopos apresentados em cada destes contextos podem estarpresentes (células apresentando antígeno, APCs, nos camundongostransgênicos irão expressar tanto MHC de camundongo como HLA dehumano). Os esplenócitos coletados podem compreender quantidadessignificantes de células T ativadas/proliferadas, junto com quantidadesmenores de outras células, tais como células apresentando antígeno(APCs)

Obter esplenócitos contendo:

1 células T de camundongo

(a) células T HLA em quantidades amplificadas, reativas aAPC(HLA)-Pl (ou APC(HLA)-P2 etc.)

(b) células T de MHC, não reativas a APC(HLA)-Pl (ouAPC(HLA)-P2 etc.)

2 células apresentando antígeno de camundongo

(a) APC(MHC)-

(b) APC (MHC)-

Análise estatísticaDiferenças estatisticamente significantes na resposta de IFN-γpara diferentes antígenos entre animais vacinados com FLU-v e NRP foramestabelecidas através de análise de Mann-Whitney não paramétrica dasamostras. Diferenças foram consideradas estatisticamente significantes se ovalor de ρ estava abaixo de 0,05.

ELISA de citoquinas

Baços de camundongo pertencendo ao mesmo grupoexperimental foram agrupadas, suavemente pressionadas através de coadoresde células e células vermelhas de sangue removidas por tratamento comtampão de Iise de células vermelhas (nove partes 0,16M de NH4Cl e umaparte de 0,17M de Tris, pH 7,2). Suspensões de esplenócito de cada grupoexperimental foram laminadas em placas de 24 cavidades em uma densidadede 4 χ IO6 células/cavidade contendo uma faixa de antígenos de polipeptídeo(5 μg/ml) ou, alternativamente, Linhagens celulares tratadas com MMC(relação de esplenócitos para células (S:C) 10:1) ou transfectadas comantígenos de polipeptídeo ou infectadas com diferente vírus da influenza vivocomo descrito acima.

Após incubação de 4 dias a 37 0C, o sobrenadante foi coletadoe analisado para IFN-γ e IL-4 por um ELISA de citoquina sanduíche deacordo com o protocolo do fabricante (Pharmingen). Os limites de detecçãomais baixos para o teste foram 9,77 pg/ml para IL-4 e 39,06 pg/ml para JJFN-Y.

Resultados

Cada peptídeo de polipeptídeo de indivíduo descrito nestepedido de patente (incluindo PI, P2, P3, P4, P5 e P6 testados neste exemplo)tem sido definido como contendo epítopos de célula T reativos em moléculasmúltiplas de HLA humano, entre eles HLA-A* 0201. O objetivo deste estudoé, conseqüentemente, avaliar a habilidade dos polipeptídeos acima descritospara induzir uma resposta imune específica de tipo Thl de múltiplosantígenos (isto é mediada por IFN-γ) bem como a habilidade dessa respostapara reagir especificamente a antígenos de influenza naturalmenteprocessados e apresentados de várias cepas não relacionadas patogênicas ahumanos no contexto de células contendo HLA - A*0201 humano infectado.

Reatividade de peptídeo 1

Após processamento interno do polipeptídeo pelas célulasapresentando antígeno (APCs) dos camundongos transgênicos, epítoposespecíficos de células T CD8+ contidos devem ser apresentados na superfíciede APC em associação com as moléculas HLA- A*0201 onde elas iriamproceder para ativar células T CD8+ nativas e induzir uma resposta imune detipo Thl específica de PI.

Para confirmar isso, linhagens celulares de humano contendoHLA - A*0201 (Tl) e não contendo (JURKAT) foram intracelularmentecarregadas com Pl por meio de um veículo de lipídio (Lipofectina,INYITROGEN). Esplenócitos de animais imunizados com a preparação depolipeptídeo de influenza (FLU-v) foram verificados como produzindo níveissignificativamente aumentados de IFN-γ comparados a esplenócitos deanimais imunizados como NRP quando co-cultivados com células humanascontendo HLA - A*0201 tratadas com MMC (Tl) transfectadas com PI, masnão quando co-cultivadas com células humanas não contendo HLA - A*0201(JURKAT) tratadas do mesmo modo (ver Figura IA, cujos dados sãoapresentados na Tabela 1 abaixo).

Tabela 1

<formula>formula see original document page76</formula>

Nota:

"Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qualtodos os valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentadopara a população primária de esplenócitos. "Pro" significa que o peptídeo estásendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das célulasseguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes sobre asmoléculas de MHC. Valores representam erro padrão ± médio de Δ IFN-γpara Lys (pg/ml).

O experimento pode ser esquematicamente representado comosegue:

Esquema 2 - teste de controle para Tl e JURKAT

<formula>formula see original document page 77</formula>Esquema 3 - Resultados de teste de FLU-v de Tle JURKAT

Tl transfectado com células Pl (ou P2 etc.)ou

apresentando antígeno de camundongo permitiram apresentarPl naturalmente por adição de Pl (ou P2 etc.) a esplenócitos

APC(HLA)-Pl +

células T reativas a APC(HLA)-P 1 -► HLA

(ou P2 etc.)

Inoculação foi com FLU-v

T ,

Células JURKAT transfectadas com Pl (ou P2 etc.)ou

células apresentando antígeno de camundongo deixaram apresentar

APC(não HLA)-P1 +

células T reativas a APC(HLA)-Pl -► Sem reação (nenhum IFN-?)

(ou P2 etc.) ]

Inoculação foi com FLU-vComo os camundongos transgênicos usados nestesexperimentos não contém qualquer outro HLA humano e a habilidade de suascélulas T CD8+ de especificamente reconhecer epítopos derivados de Pl nocontexto de outros HLA humanos que eles nunca encontraram é baixa, estesresultados claramente mostraram que a resposta de IFN-γ observada éespecificamente causada por epítopos derivados de Pl reconhecendo célulasT CD8+ iniciados em associação com moléculas HLA - A* 0201.

Também é importante notar que nenhuma resposta de IL-4 foidetectada contra as células transfectadas de Pl em ou FLU-v ou animaisimunizados com NRP (dados não mostrados). Uma vez que a produção de IL-4 é antagonística para a produção de IFN-γ e por conseguinte para a criaçãode respostas de células T CD8+ específicas de antígeno, a necessidade deprodução de IL-4 em ambos os grupos claramente mostra que a imunizaçãocom FLU-v induz uma resposta de tipo Thl específica para o componente dePl da preparação.

Um nível significantemente aumentado em produção de IFN-γé também observado em FLU-v comparado a grupos imunizados de NRPquando antígeno de Pl solúvel é simplesmente adicionado à cultura deesplenócitos (na ausência de células de Tl ou JURKAT). No entanto, o nívelglobal dessa resposta de IFN-γ é menor do que aquele observado quando oantígeno foi apresentado através das células de Tl contendo HLA - A*0201.A explicação para essa observação é que Pl foi definido na base de conterepítopos que são primariamente reativos no contexto de HLAs de humano nãode camundongo. Os camundongos transgênicos aqui usados contêm umcomplemento completo de moléculas de MHC de camundongo em adição àsmoléculas HLA - A*0201, conseqüentemente o Pl solúvel capturado pelapopulação de APC presente nas culturas primárias de esplenócitos podemtambém ser processadas nas vias de Classe I e II de MHC de camundongo(Peachman KK, Rao M, Alving CR, Palmer DR, Sun W, Rothwell SW."Human dendritic cells and macrophages exhibit different intracellularprocessing pathways for soluble and liposome-encapsulated antigens."Immunobiology. 2005;210(5):321-33), que mediam as respostas de células TCD8+ e CD4-V restritas a H-2D respectivamente. Como um resultado, se Plcontém epítopos de murino múltiplos, seria esperado que a resposta de IFN-γpara Pl solúvel seria igual ou maior àquela observada para o caso deapresentação mediada por célula humana pois um conjunto muito maior decélulas T CD4+ e CD8+ estaria apto a reagir aos estímulos. Como isso não éobservado e o nível de uma resposta imune in vitro é primariamentedeterminado pela disponibilidade de antígeno, segue-se claramente que oslinfócitos T CD8+ específicos de Pl detectados nos experimentos de co-cultura de Tl seriam simplesmente incapazes de responder no mesmo níveldevido à quantidade reduzida de antígeno sendo apresentado aos mesmos nocontexto HLA - A*0201 correto.

Reatividade de peptídeo 2

Esplenócitos de animais imunizados com FLU-v foramverificados como produzindo níveis significantemente aumentados de IFN-γcomparados a esplenócitos de animais imunizados com NRP quando co-cultivados com células humanas contendo HLA - A* 0201 tratadas com MMC(Tl) transfectadas com P2, mas não quando co-cultivadas com célulashumanas não contendo HLA - A*0201 (JURKAT) tratadas do mesmo modo(ver Figura 1B, os dados para isto são especificados na Tabela 2 abaixo).

Como foi o caso para PI, esses resultados mostraram claramente que aresposta de IFN-γ observada é especificamente causada por células T CD8+reconhecendo epítopos derivados de P2 em associação com moléculas HLA -A* 0201. Similarmente, como a produção de IL-4 é antagonística à produçãode IFN-γ e conseqüentemente ao desenvolvimento de células T CD8+, a faltade uma resposta de IL-4 contra células transfectadas de P2 em ou animaisimunizados com FLU-v ou com NRP (dados não mostrados) claramentemostra que a imunização de FLU-v induz uma resposta de tipo Thl específicade P2.

Tabela 2

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Nota:

"Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qualtodos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentadopara a população primária de esplenócitos. "Pro" significa que o peptídeo estásendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das célulasseguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nasmoléculas de MHC. Valores representam erro padrão ± médio do Δ IFN-γpara Lys (pg/ml).

Uma produção de IFN-γ significantemente aumentada foitambém observada em grupos imunizados com FLU-V comparados aos comNRP quando P2 foi simplesmente adicionado à cultura de esplenócitos. Emcontraste a PI, entretanto, o nível global da resposta de IFN-γ foi maior para oantígeno solúvel que para aquele apresentado pelas células contendo HLA -A*0201. Essa observação indica que P2 abriga não apenas epítopos HLA -A*0201 fortes mas também epítopos fortes de camundongo (H-2D).Reatividade de peptídeos 3, 4 e 5

Como foi o caso para P2, produção de IFN-γ significantementeaumentada pode ser observada entre grupos imunizados com FLU-v e NRPquando P3, P4 e P5 são simplesmente adicionados à cultura bem comoquando eles são apresentados através de linhagens de células humanastransfectadas alinhadas a HLA (TI), mas não quando elas estão apresentadasatravés de linhagens celulares humanas desalinhadas com HLA (JURKAT)(ver Figuras 1C, ID e 1E, cujos dados são especificados nas Tabelas 3-5abaixo). Em todos três casos, o incremento na produção de IFN-γ é maiorquando esplenócitos são co-cultivados com células humanas transfectadas emvez de quando antígeno solúvel é simplesmente adicionado ao meio decultura. Estes resultados, devido aos mesmos argumentos desenvolvidos parao caso de P2, indicam que P3, P4 e P5 contêm um número de epítopos fortesde células T de camundongo além das dos humanos.

Tabela 3

<table>table see original document page 81</column></row><table>Tabela 4

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Tabela 5

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Nota:

"Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qualtodos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentadopara a população primária de esplenócitos. "Pro" significa que o peptídeo estásendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das célulasseguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nasmoléculas de MHC. Valores representam erro padrão ±médio do Δ IFN-γpara Lys (pg/ml).

Finalmente, como todos os três peptídeos deixam de induzir aprodução de IL-4 (dados não mostrados), está claro que a resposta imuneinduzida por vacinação com a preparação de FLU-v induz uma resposta detipo Thl para cada desses três polipeptídeos.

Reatividade de peptídeo 6

Como foi o caso de PI, produção de IFN-γ significantementeaumentada pode ser observada entre grupos imunizados com FLU-v e NRPquando P6 é simplesmente adicionado à cultura bem como quando éapresentado através de linhagens de células humanas transfectadas alinhadascom HLA (TI), mas não quando é apresentado através de linhagens celulareshumanas desalinhadas com HLA (JURKAT) (ver Figura 1F, cujos dados sãoespecificados na Tabela 6 abaixo). De novo como para PI, a maior resposta éobservada para o antígeno solúvel, indicando que P6 não contém epítopos deH-2D fortes. Como as caudas para essas observações já foram explicadas parao caso de Pl elas não devem mais ser desenvolvidas aqui devendo-se fazerreferência para a seção anterior.

Tabela 6

<table>table see original document page 83</column></row><table>

Nota:

"Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qualtodos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentadopara a população de esplenócito primária. "Pro" significa que o peptídeo estásendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das célulasseguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nasmoléculas de MHC. Valores representam erro padrão ± médio do Δ IFN-γpara Lys (pg/ml).

A falha de estimulação com P6 para induzir qualquer produçãode IL-4 (dados não mostrados), claramente mostrou que a resposta imuneinduzida por vacinação com FLU-v induz uma resposta de tipo Thl para P6.Reatividade de FLU-v para cepas de influenza não relacionadas

Os experimentos descritos até este ponto claramentemostraram que imunização com FLU-v induz uma resposta de IFN-γ decélulas T CD8+ específica contra cada um dos seis polipeptídeosconstituintes. No entanto, como estes polipeptídeos foram definidos comocontendo epítopos de célula T CD8+ reativos sujeitos a um nível baixo devariabilidade de seqüência dentro da população de vírus de influenzaanalisada, foi também desejável estabelecer se camundongos vacinados comFLU-v foram capazes de reconhecer, e conseqüentemente induzir umaresposta imune de tipo Thl específica, epítopos de células T naturalmenteprocessaram e apresentaram seguinte infecção com diferentes cepas deinfluenza não relacionadas. Tal análise provê uma indicação clara da eficáciapotencial da mistura de polipeptídeos de FLU-v como uma vacina parainfluenza que, devido à marcação de epítopos de células T de variabilidade deseqüência baixa em toda a população de influenza humana e animal, iriaprover proteção contra todas as cepas presentes, bem como aqueles quepoderiam surgir no futuro a partir de uma recombinação espontânea entrecepas de animais altamente patogênicas com cepas de humanos presentes.

Para esta análise, culturas de esplenócitos primárias de animaistransgênicos imunizados com FLU-v ou NRP foram co-cultivados com váriascélulas humanas contendo HLA-A*0201 (Tl) e não contendo (JURKAT)infectadas por influenza. As três cepas de influenza usadas para(A/New_Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 e B/Johannesburg/5/99) são todaspatogênicas para humanos e foram obtidas do repositório WHO de Influenza,baseado em NIBSC (UK). Como um controle positivo específico de antígenouma preparação solúvel equimolar dos seis polipeptídeos adicionados àpreparação de esplenócito primária foi usada.

Esplenócitos de animais vacinados com FLU-v produziram umnível significantemente maior de IFN-γ comparado aqueles de animaisvacinados com NRP quando co-cultivados com células humanas contendoHLA - A*0201 infectadas com influenza tratadas de MMC (Tl) transfectadas,mas não quando co-cultivados com células humanas não contendo HLA -A*0201 (JURKAT) tratadas do mesmo modo (ver Figura 2, cujos dados sãoespecificados na Tabela 7 abaixo). Nenhuma resposta de IL-4 foi detectadaem quaisquer dos camundongos vacinados contra ou o antígeno depolipeptídeo solúvel ou as células infectadas com influenza (dados nãomostrados). Estes resultados claramente mostraram que a resposta de IFN-γobservada é especificamente causada por epítopos reconhecendo células TCD8+ iniciadas contidas na preparação de FLU-v e que também sãonaturalmente processadas e apresentadas em associação com moléculas HLA- Α*0201 em células humanas infectadas com influenza.

Tabela 7

<table>table see original document page 85</column></row><table>

Nota:

"Lys" significa o fundo de controle negativo sobre o qualtodos valores são calculados. "Sol" significa peptídeo solúvel apresentadopara a população de esplenócito primária. "Pro" significa que o peptídeo estásendo apresentado complexado com as moléculas de HLA das célulasseguindo processamento interno e carga dos epítopos resultantes nasmoléculas de MHC. Tl é a Linhagem celular humana contendo HLA -A* 0201. "Ju" refere-se a JURKAT que é a linhagem celular humana nãocontendo HLA - A*0201. A/NC/20/99 (isto é A/New_Caledonia/20/99),A/NYMC/X-147 e B/Johannesburg/5/99 são, respectivamente, as duas cepasde influenza A e uma influenza B usadas para infecção das linhagenscelulares humanas. Valores representam erro padrão ±médio do Δ IFN-γ paraLys (pg/ml).

De maneira interessante, a produção de fundo de IFN-γ paratodos os grupos infectados com influenza foi maior que a observada quandoanálises similares foram efetuadas usando antígeno de polipeptídeopurificado. Esta observação, entretanto, mais provavelmente reflete aincapacidade de tratamento com MMC para desativar completamente o víruspresente na preparação celular. Isso, por sua vez, resultaria em vírus deinfluenza viável infectando células de camundongos suscetíveis nas culturasprimárias de esplenócitos, deste modo conduzindo a uma resposta primária invitro. Esta interpretação é apoiada pela observação que as cepas de vírus dainfluenza as mais usadas induziram o mesmo nível de resposta de IFN-γ defundo independentemente da linhagem celular humana infectada e o grupovacinado considerado. A única exceção para essa regra é a produção de IFN-γde fundo muito reduzida observada em células JURKAT infectadas comB/Johannesburg/5/99. No entanto, como ainda neste caso, a produção de IFN-γ para ambos os animais vacinados com FLU-v e com NRP, é equivalente,será notado que a diferença observada é causada mais pela suscetibilidadereduzida de células de JURKAT à infecção por influenzaB/Johannesburg/5/99, do que por qualquer outra causa intrinsecamenteassociada para os diferentes regimes de vacinação. Seja qual for o caso, estaobservação, não detrai do fato evidente de que a vacinação com FLU-v levaao reconhecimento específico de epítopos de influenza processadosnaturalmente apresentados em associação com moléculas HLA - A*0201 apósa infecção de células humanas com várias cepas não relacionadas de vírus deinfluenza infecciosos. Assim, FLU-v constitui uma preparação de vacinacandidata efetiva para proteção contra cepas múltiplas de influenza, destemodo diminuindo a necessidade para os protocolos de re-vacinação presentesanualmente.

EXPERIMENTO 2 -Efeito protetor de polipeptídeos em camundongos

A finalidade deste estudo foi demonstrar que a imunização dedose baixa com os peptídeos de polipeptídeo de células T conservados deinfluenza identificados (FLU-v) induzem proteção, mediada por células TCD8+, contra desafio letal com o vírus de influenza.

Materiais e métodos

Peptídeos, antisoros e vírus:

A preparação de vacina candidata (FLU-v) testada nesteestudo é composta de vários peptídeos (isto é PI: Aminoácido de MlA (aa) 36a 75 (SEQ ID 1); P2: MlB aa 124 a 158 (SEQ TD 2); P3: NPA aa 255 a 275(SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PBl aa 395 a 428 (SEQDD 5); Ρ6: Μ2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6)) que foram todos sintetizados porquímica Fmoc e colocadas novamente em suspensão em DMSO em PBS (aconcentração de DMSO na preparação final foi menor do que 5%). Lisozima(Sigma) desnaturada por ebulição foi usada como a preparação não relevantede controle (NRP-v).

IgG2a de CD8 anti-camundongo de rato purificado (cloneYTS 169,4) foi obtido de AbD Serotec (UK) enquanto vírus infeccioso deinfluenza A/PR/8/34 foi obtido de MBSC como lote de padrão liofilizado.

Imunizações

No dia 1, camundongos C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J desete a dez semanas de idade (Transgênico HLA - A*0201 em um fundo deC57/BL6, Jackson Labs) foram imunizados subcutaneamente na base do rabocom uma dose de 200 μΐ da preparação de antígeno emulsificada em IFA(Sigma). No grupo de teste (n = 14), cada dose da preparação de antígenocontinha 60 nmol de uma mistura equimolar de todos seis peptídeos (10 nmolcada) enquanto no grupo de controle (n = 14), cada dose da preparação deantígeno continha uma dose equivalente do polipeptídeo não relevante.

No dia 15, todos os animais receberam uma imunização dereforço usando as mesmas doses vias de liberação, como usado originalmente.

No dia 16, ambos os grupos, de teste e controle, foramdivididos em dois subgrupos iguais (n = 7 cada; isto é Controle-1, Controle-2,

Teste-I e Teste-2).

No dia 19, todos os animais nos grupos Controle-I e Teste-Ireceberam uma injeção intraperitoneal de 200 μΐ de soros de CD8 de anti-camundongo de rato (100 μg) enquanto todos os animais nos grupos deControle-2 e Teste-2 receberam uma injeção equivalente de soros nãorelacionados.

O dia seguinte (Dia 20), todos os grupos foram desafiadosintranasalmente sob anestesia com uma dose letal grande (aproximadamente1,5χ107 pfu) de Influenza A/PR/8/34.

No dia 22, foram de novo intraperitonealmente injetados comquer soros de CD8 anti-camundongo de rato ou não soros não relacionados,como descrito acima.

Do dia 20, todos animais foram monitorados diariamente parasintomas de influenza (por exemplo espirros e pirexia) bem como perda depeso.

Todos animais ainda vivos no dia 27 foram abatidos e o estudofoi terminado.

Resultados

A fim de avaliar a eficácia da preparação de FLU-v como umavacina para influenza candidata foi desejável estabelecer um estudo de desafioem animais imunizados com NRP-v e FLU-v usando a cepa de influenzaA/PR/8/34. Tipicamente, uma dose intranasal de 1.5x107 pfu irá matar oscamundongos C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J não imunizados no dia 4 ou 5após desafio (dados não mostrados).

Como mostrado na Fig. 3A, a maior parte de animaisimunizados com ou as preparações de peptídeos de FLU-v ou NRP-v, massujeitos à depleção de CD8, sucumbiram à infecção por Influenza A/PR/8/34em 7 dias após desafio intranasal (71% versus 100% respectivamente). Emcontraste, como mostrado na Fig. 3B e na ausência de depleção de CD8,animais imunizados com a preparação de FLU-v mostraram uma reduçãosignificante (p < 0,05) em seu índice de mortalidade comparados a animaisimunizados com a preparação de NRP-v (28% versus 100%).

Os resultados deste estudo indicam claramente que avacinação com a preparação de peptídeo de FLU-v, mesmo a uma dose denível baixo de cada um de seus peptídeos ativos constituintes (10 nmol),induz um nível de proteção significante contra desafio letal com Influenza.Estes peptídeos, como indicado anteriormente, foram identificados in silicoprimariamente por sua reatividade de células T dentro do contexto de HLAclasse I humano. Os resultados corroboraram o fato que as células T CD8+estimuladas por vacinação com a preparação de peptídeo de FLU-vdesempenham um papel significativo em conferir proteção contra infecçãopor influenza.

Claims (34)

1. Polipeptídeo não tendo mais do que 100 aminoácidos, opolipeptídeo caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais seqüênciastendo pelo menos 60% de homologia com qualquer uma de SEQ ID 1-6 oucompreende dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais, cada epítopotendo, pelo menos, 60% homologia com uma subseqüência de qualquer SEQID 1-6, que tem o mesmo comprimento que o epítopo:SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSEQ ID 2LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSSEQ ID 3 DLIFLARSALILRGSVAHKSCSEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVWRPSEQ ID 5LLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQSEQ ID 6 IIGILHLILWILDRLFFKCrYRLFem que o polipeptídeo é imunogênico em um vertebradoexpressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC),e em que o polipeptídeo não é uma proteína do vírus de influenza completa..

2. Polipeptídeo não tendo mais do que 100 aminoácidos, opolipeptídeo caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais seqüênciasdefinidas pelos seguintes resíduos de aminoácidos de uma proteína de vírusde influenza, ou compreender dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos oumais de uma seqüência definida pelos seguintes resíduos de aminoácidos deuma proteína de vírus de influenza:resíduos 36-75 de uma proteína Mlresíduos 124-158 de uma proteína Mlresíduos 255-275 de uma proteína NPresíduos 306-326 de uma proteína NPresíduos 395-428 de uma proteína PB1resíduos 32-55 de uma proteína M2em que, o polipeptídeo é imunogênico em um vertebradoexpressando um alelo do complexo de histocompatibilidade principal (MHC),e em que o polipeptídeo não é uma proteína de vírus de influenza completa.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende umepítopo de linfócito T citotóxico (CTL).

4. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de compreender 2, 3, 4, 5 ou maisepítopos.

5. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de ser imunogênico a um epítopo dentrode qualquer uma das seqüências de SEQ ID 1-6.

6. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de ser imunogênico a uma cepa de vírusde influenza.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de ser imunogênico a uma pluralidade de cepas de vírus deinfluenza.

8. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de ainda compreender uma ou mais deoutras seqüências de uma proteína de vírus de influenza.

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que quando o polipeptídeo é pelo menos 60% homólogo a SEQID 1, a proteína é uma proteína Ml de influenza, quando o polipeptídeo é pelomenos 60% homólogo a SEQ ID 2, a proteína é uma proteína Ml deinfluenza, quando o polipeptídeo é pelo menos 60% homólogo a SEQ ID 3, aproteína é uma proteína NP de influenza, quando o polipeptídeo é pelo menos 60% homólogo a SEQ ID 4, a proteína é uma proteína NP de influenza,quando o polipeptídeo é pelo menos 60% homólogo a SEQ ID 5, a proteína éuma proteína PBl de influenza, e quando o polipeptídeo é pelo menos 60%homólogo a SEQ ID 6, a proteína é uma proteína M2 de influenza.

10. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a homologia é 75% ou mais.

11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a homologia é 85% ou mais.

12. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a homologia é substancialmente-100%.

13. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende 8, 9, 10 ouaminoácidos ou mais.

14. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de ter não mais que 50 resíduos deaminoácidos.

15. Polipeptídeo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de compreender de 15-35 resíduos deaminoácidos.

16. Polipeptídeo imunogênico de múltiplos epítopos,caracterizado pelo fato de compreender dois ou mais polipeptídeos comodefinidos em qualquer reivindicação precedente.

17. Composição de polipeptídeo caracterizada pelo fato decompreender dois ou mais polipeptídeos como definidos em qualquerreivindicação precedente.

18. Composição de polipeptídeo de acordo com areivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos tendoseqüências de SEQ ID 1-6 estão todos presentes.

19. Polipeptídeo, ou composição de polipeptídeos de acordocom qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de ser parauso em medicina.

20. Método para produzir um polipeptídeo como definido emqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de compreendercombinar dois ou mais epítopos para formar o polipeptídeo.

21. Construção de polipeptídeo, caracterizado pelo fato de quea construção compreende um polipeptídeo como definido em qualquerreivindicação precedente e um veículo.

22. Método para produzir uma construção de polipeptídeoscomo definida na reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreendercombinar dois ou mais epítopos e/ou um polipeptídeo com o veículo.

23. Construção de polipeptídeo ou um método de acordo coma reivindicação 21 ou reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que oveículo é uma molécula.

24. Construção de polipeptídeo ou um método de acordo coma reivindicação 22 ou reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que oveículo compreende um adjuvante e/ou excipiente.

25. Composição de vacina ou medicamento contra influenza,caracterizada pelo fato de compreender um polipeptídeo, ou composição depolipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-19, e umexcipiente e/ou adjuvante apropriados.

26. Composição de vacina ou medicamento contra influenza,caracterizada pelo fato de compreender uma construção de polipeptídeo comodefinida na reivindicação 21, reivindicação 23 ou reivindicação 24, eopcionalmente um excipiente e/ou adjuvante apropriados.

27. Método para produzir uma composição de vacina oumedicamento, como definido na reivindicação 25, caracterizado pelo fato decompreender misturar um polipeptídeo, ou uma composição de polipeptídeo,como definida em qualquer uma das reivindicações 1-19, com um excipientee/ou adjuvante apropriados.

28. Uso de um polipeptídeo, uma composição de polipeptídeo,uma construção de polipeptídeo ou uma composição de vacina oumedicamento, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1-19, e23-26, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento ouvacina, efetivo no tratamento ou prevenção de influenza.

29. Método de tratamento ou prevenção de influenza,caracterizado pelo fato de compreender administrar um polipeptídeo, umacomposição de polipeptídeo, uma construção de polipeptídeo, umacomposição de vacina ou medicamento, como definidos em qualquer uma dasreivindicações 1-19, 21 e 23-26 a um vertebrado.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o vertebrado é selecionado dentre um mamífero, um pássaro,um réptil, e um peixe.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o vertebrado é um humano, um animal doméstico, ou umanimal de criação, um animal bovino ou é uma ave.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o vertebrado é selecionado dentre uma galinha, um pato, umganso, um suíno, um cavalo, uma vaca, um cachorro ou um gato.

33. Polipeptídeo, construção de polipeptídeo, método,medicamento, vacina ou uso de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a influenza é uma cepa deinfluenza A.

34. Polipeptídeo, construção de polipeptídeo, método,medicamento, vacina ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-32, caracterizado pelo fato de que a influenza é uma cepa de influenza B.