ES2372809T3

ES2372809T3 - Uso de vegf 165 y homólogos para tratar trastornos de neurona.

Info

Publication number: ES2372809T3
Application number: ES01947222T
Authority: ES
Inventors: Peter Carmeliet; Désiré COLLEN; Bert Oosthuyse
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: US7888322B2; CA2404616A1; WO2001076620A2; US20070249539A1; ATE526981T1; CY1116296T1; EP2277528B1; EP1272208A2; EP2277528A2; AU2001268968B2; ES2551160T3; CA2404616C; DK2277528T3; AU6896801A; US7592314B2; US20080032314A1; DK1272208T3; EP2277528A3; EP1272208B1; PT2277528E

Abstract

Uso de VEGF165 para la preparación de un medicamento para tratar cualquiera de demencia del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y enfermedades de neurona motora.

Description

Uso de VEGF 165 y homólogos para tratar trastornos neuronales

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a disfunción neurológica y fisiológica asociada a trastornos neuronales. En particular, la invención se refiere a la participación del factor de crecimiento endotelial vascular 165 (VEGF165) y homólogos en la etiología de trastornos de las neuronas motoras. La invención se refiere adicionalmente al novedoso ratón transgénico mutante (VEGFm/m) con una deleción homocigótica en el elemento sensible a hipoxia (HRE) del promotor del VEGF que altera la regulación hipóxica por incremento de VEGF. Estos ratones sufren debilidad muscular de aparición en la edad adulta grave debido a una degeneración progresiva de las neuronas motoras espinales que recuerda a la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) - un trastorno mortal de etiología desconocida. Además, la neuropatía de estos ratones no es producida por defectos vasculares, sino que es debida a señales de supervivencia mediadas por VEGF defectuosas a las neuronas motoras. La presente invención se refiere a la isoforma VEGF165 que estimula la supervivencia de neuronas motoras mediante la unión a neuropilina 1, un receptor conocido por unirse a semaforina 3A que participa en la retracción axónica y la muerte neuronal, y el receptor 2 del VEGF. Por tanto, la presente invención se refiere al uso de VEGF, en particular VEGF165, para el tratamiento de trastorno neuronal y además se refiere al uso de polimorfismos en el promotor del VEGF para diagnosticar estos trastornos.

Antecedentes de la invención

[0002] El VEGF desempeña un papel clave en la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) durante el desarrollo embrionario, además de en una variedad de afecciones patológicas 1,2. Aunque el VEGF estimula principalmente las células endoteliales, también puede actuar sobre otros tipos de células. De hecho, el VEGF, el receptor 1 del VEGF (VEGFR-1/Flt1) y el receptor 2 del VEGF (VEGFR-2/KDR/Flk1) se han implicado recientemente en accidente cerebrovascular 3,4, isquemia de la médula espinal 5 y en neuropatía isquémica y diabética 6 , documento WO 0062798. Sin embargo, estas moléculas actúan predominantemente afectando el crecimiento o la función vascular y no se han mostrado un efecto directo del VEGF sobre, por ejemplo, células neuronales 11, 12. Además, la relevancia in vivo de un efecto directo tal no tiene validez.

[0003] La isquemia desempeña una función esencial en la patogénesis de trastornos neurológicos, agudamente durante accidente cerebrovascular y crónicamente durante el envejecimiento y varios trastornos neurodegenerativos tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington. Las neuronas son particularmente vulnerables al estrés oxidativo por radicales libres (generados durante la isquemia/reperfusión) debido a su alta tasa de consumo de oxígeno, abundante contenido de lípidos y escasez relativa de enzimas antioxidantes en comparación con otros órganos 16. La lesión oxidativa acumulada debida a un aumento tóxico de la función de la Cu,Zn-superóxido dismutasa (SOD1) mutante participa en la degeneración de neuronas motoras en varios pacientes con esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELA) 17,18. La ELA afecta a de 5 a 10 individuos por cada

100.000 personas mundialmente durante la segunda mitad de su vida, es progresiva, normalmente mortal en el plazo de 5 años desde la aparición de los síntomas, e intratable 17-19. Del noventa al 95% de los casos son esporádicos. Aunque los mecanismos que subyacen a la ELA esporádica siguen siendo desconocidos, hay pruebas que sugieren que la lesión oxidativa, similar a la producida por las mutaciones de SOD1, desempeñan una función patogenética 18,20,21 .

[0004] En respuesta a hipoxia, las respuestas de 'supervivencia' se inician, incluyendo la producción de hormonas de estrés, eritropoyetina, enzimas glicolíticas y moléculas angiogénicas tales como VEGF 22,23. Los factores inducibles por hipoxia (HIF) desempeñan una función esencial en la mediación de esta respuesta de retroalimentación mediante la unión al elemento de respuesta a hipoxia (HRE) definido en el promotor de estos genes 23. La hipoxia es un regulador predominante de la expresión del VEGF ya que la inducción de la expresión del

22,23

VEGF es rápida (minutos), significativa (>10 veces) y sensible a cambios mínimos en el oxígeno . Sorprendentemente se ha prestado poca atención a la posible función de la hipoxia y el HIF en el inicio de los mecanismos de supervivencia por retroalimentación en el sistema nervioso. Aunque se han identificado varias moléculas neurotróficas 24,25, se ha mostrado que pocas están reguladas por hipoxia. A este respecto, sigue siendo desconocido si la regulación hipóxica del VEGF proporciona neuroprotección, independientemente de su actividad angiogénica.

[0005] Adicionalmente, en el sistema nervioso, las neuronas motoras son un grupo bien definido, aunque heterogéneo, de células responsables de transmitir la información del sistema nervioso central al aparato locomotor. Las neuronas motoras espinales están especificadas por factores solubles producidos por estructuras adyacentes a la médula espinal primordial, señalizando mediante proteínas de homeodominio. El hallazgo de la ruta axónica está regulado por receptores de la superficie de la célula que interactúan con ligandos extracelulares y, una vez han formado conexiones sinápticas, la supervivencia de la neurona motora somática depende de la provisión de factores de crecimiento derivados de diana, aunque posiblemente también participan factores derivados de no diana, producidos tanto por astrocitos como por células de Schwann. La degeneración de neuronas motoras somáticas conduce a una profunda discapacidad y a múltiples mecanismos patogenéticos que incluyen señalización aberrante del factor de crecimiento, acumulación anormal de neurofilamentos, excitotoxicidad; se ha postulado que la responsable es la autoinmunidad. Incluso cuando se han identificado carencias específicas, por ejemplo, mutaciones del gen superóxido dismutasa 1 en esclerosis lateral amiotrófica familiar y expansión de poliglutamina del receptor androgénico en atrofia muscular espinal y bulbar, siguen sin estar claros los mecanismos por los que se produce la degeneración de neuronas motoras somáticas. Con el fin de tratar eficazmente la degeneración del aparato motor, lo inventores necesitan entender estos mecanismos más meticulosamente. Aunque se ha mostrado en la materia que el VEGF tiene acciones neurotróficas sobre los ganglios cervicales superiores de ratones cultivados y sobre los ganglios de la raíz dorsal (Sondell M. y col. Journal of Neuroscience, (1999) 19, 5731), no están disponibles estudios sobre la posible función del VEGF en neuronas motoras. La presente invención demuestra que el VEGF tiene una función trófica para las neuronas, en particular las neuronas motoras, y revela que la regulación hipóxica defectuosa del VEGF predispone a la degeneración neuronal. Además, la presente invención indica que el VEGF es un agente terapéutico para el tratamiento de trastornos de las neuronas motoras y se refiere al uso de polimorfismos en el promotor del VEGF para diagnosticar trastornos neuronales.

Objetivos de la invención

[0006] La presente invención tiene como objetivo proporcionar herramientas de investigación, diagnósticos y agentes terapéuticos con el fin de mejorar la salud y el bienestar de pacientes que padecen trastornos neurales. En particular, la presente invención tiene como objetivo proporcionar el uso de VEGF u homólogos o fragmentos del mismo con el fin de tratar pacientes que padecen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad cerebral isquémica crónica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades similares a esclerosis lateral amiotrófica y otros trastornos neuronales degenerativos, en particular de las neuronas motoras. Más particularmente, la presente invención tiene como objetivo proporcionar el uso de VEGF165 para prevenir la muerte de neuronas motoras en la médula espinal. La presente invención también tiene como objetivo proporcionar receptores, tales como neuropilina 1 y el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2), que se unen específicamente al VEGF y que pueden usarse para cribar otras moléculas que se unen a él. En otras palabras, la presente invención tiene como objetivo proporcionar agentes terapéuticos que estimulan la supervivencia de neuronas o que inhiben la muerte de neuronas inducida por, por ejemplo, semaforina 3A. La presente invención tiene adicionalmente como objetivo proporcionar un animal que se caracteriza porque tiene una expresión alterada del VEGF inducida por hipoxia (es decir, defectuosa o no funcional) en comparación con su homólogo natural y que puede usarse como herramienta de investigación para cribar agentes terapéuticos como se ha mencionado anteriormente. La presente invención tiene finalmente como objetivo proporcionar polimorfismos en los que la región del promotor del VEGF, tal como en el elemento sensible a hipoxia, que pueden usarse para identificar individuos propensos a desarrollar un trastorno neuronal o para tratar pacientes con trastorno neuronal mediante terapia génica.

Leyendas de las figuras

[0007]

Figura 1: Elección como diana del gen VEGF y debilidad muscular en ratones VEGFm/m. Estrategia para delecionar el elemento de unión a HIF-1a en el promotor del VEGF. Se muestran el vector de elección de diana pBSK.VEGFm, el alelo de VEGF natural (VEGFWT), el alelo de VEGF homólogamente recombinado (VEGFneo) y el alelo de VEGFm modificado después de la escisión de Cre del casete neo flanqueado por lox P. Las sondas se indican por barras sólidas. HRE: elemento de respuesta a hipoxia al que se une HIF-1alfa; el asterisco y “m” denotan la deleción de HRE.

Figura 2: Función neurotrófica de VEGF.

A, VEGF165, pero no VEGF121, protege a las neuronas motoras SCN34 de la apoptosis (cuantificada por oligonucleosomas) inducida por TNF-alfa (50 ng/ml). La actividad de supervivencia de VEGF165 es comparable a la de bFGF o TGF-�1. B, VEGF165 también protege a células SCN34 de la apoptosis inducida por hipoxia, H2O2 o privación de suero. *: p<0,05 frente a 0,01 ng/ml de VEGF. C, El efecto de supervivencia de VEGF165 (100 ng/ml) es bloqueado por anticuerpos (Ab; 50 μg/ml) contra VEGFR-2 (R2) y neuropilina 1 (NP1), pero no contra VEGFR-1 (R1), neuropilina 2 (NP2) o IgG de control (ctr). La apoptosis se indujo por privación de suero (0,5%). Ninguno de los anticuerpos modificó el nivel inicial de apoptosis en ausencia de VEGF. *: p<0,05 frente a IgG de control.

Descripción detallada de la invención

[0008] La presente invención muestra que la deleción del elemento de respuesta a hipoxia en el promotor del VEGF deroga eficazmente la inducción hipóxica de VEGF. Basándose en la función muy conocida del VEGF en la angiogénesis se anticipó que los ratones VEGFm/m sufrirían una angiogénesis mediada por VEGF alterada. De hecho, parece que los defectos vasculares contribuyen a la letalidad de embriones VEGFm/m pero, sorprendentemente, no hay signos de insuficiencia vascular en la supervivencia de ratones VEGFm/m bajo condiciones iniciales. Además, la neuropatía que se observa en ratones VEGFm/m adultos tampoco es debida a insuficiencia vascular debido a los siguientes hallazgos: (i) el número, la diferenciación y la ultraestructura de células endoteliales en la médula espinal, los nervios periféricos y los músculos de aquellos ratones son normales; (ii) la perfusión endoneural es normal sin signos de falta de estanqueidad; (iii) la tinción con pimonidazol de médulas espinales después de hipoxia es comparable a la de ratones naturales; (iv) los infartos o la microangiopatía normalmente encontrados en pacientes diabéticos con neuropatía isquémica 47 están ausentes; (v) las lesiones axónicas no sólo están presentes en el centro (propenso a isquemia), sino también en la periferia de los nervios; (vi) la degeneración de neuronas motoras se encuentra frecuentemente en la vecindad inmediata de capilares normales; y (vii) se excluyen otras causas de isquemia que incluyen insuficiencia cardíaca, anemia o insuficiencia pulmonar.

[0009] Por tanto, la presente invención se refiere a un modelo de ratón transgénico novedoso con una regulación hipóxica alterada por incremento del VEGF y caracterizado porque tiene una predisposición a la degeneración progresiva de neuronas motoras de aparición en la edad adulta con características neuropatológicas que recuerdan a la esclerosis lateral amiotrófica. En este novedoso modelo de ratón, la neuropatía no se produce por efectos vasculares, sino por la privación de neuronas motoras del efecto neurotrófico del VEGF. Sin embargo, debe ser evidente que la presente invención no sólo se refiere a un ratón transgénico novedoso, sino que también engloba cualquier animal transgénico no humano (tal como una rata, perro, conejo, primate no humano, etc.) que se caracterice por tener una expresión del VEGF inducida por hipoxia alterada o no funcional en comparación con sus homólogos naturales. La presente invención tiene significativas implicaciones médicas. Primero, la etiología genética de los trastornos de las neuronas motoras degenerativas sigue sin estar determinada. En menos del 2% de los casos de ELA, las mutaciones en el gen SOD1 causan la enfermedad, pero la patogénesis del 98% restante sigue siendo desconocida. Los hallazgos de los inventores indican que la regulación génica anormal - no la función - del VEGF constituye un factor de riesgo novedoso para la degeneración de neuronas motoras, y obliga a una búsqueda de alteraciones genéticas que afectan la regulación del gen VEGF. Incluso en pacientes con ELA con una mutación SOD1, las diferencias genéticamente determinadas en la regulación del gen VEGF pueden explicar la significativa variabilidad fenotípica intrafamiliar. Segundo, hasta la fecha no hay tratamiento médico para la ELA. Los datos de los inventores demuestran que el VEGF tiene valor terapéutico para trastornos de las neuronas motoras. La disponibilidad de un modelo animal con características de ELA familiar (expresión transgénica del SOD1 mutante) proporciona una herramienta de investigación esencial. Los hallazgos de los inventores también indican que el VEGF165 protege a las neuronas corticales del N-metil-D-aspartato. Tercero, el presente modelo de ratón VEGFm/m de degeneración de neuronas motoras de aparición en la edad adulta refleja varias características clínicas y neuropatológicas de la ELA (atrofia muscular progresiva debida a la degeneración de neuronas motoras espinales caracterizada por inclusiones de neurofilamentos en el pericarión e hinchazones axónicas 17-19,32-34). Por tanto, el ratón VEGFm/m es un modelo adecuado para la reevaluación de estrategias terapéuticas. Cuarto, los datos de los inventores abogan por la prudencia contra el uso a largo plazo de antagonistas del VEGF (estando actualmente probado para el tratamiento de cáncer, diabetes y artritis reumatoide), ya que pueden predisponer a la degeneración de neuronas motoras.

[0010] La presente invención también indica que el VEGF165, u homólogos, derivados o fragmentos del mismo, pueden usarse para preparar un medicamento para el tratamiento de trastornos neuronales, y específicamente para el tratamiento de neuronopatías y más específicamente para el tratamiento de trastornos de las neuronas motoras e incluso más específicamente para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades similares a esclerosis lateral amiotrófica. En otra realización, el VEGF165, u homólogos, derivados o fragmentos del mismo, pueden usarse para preparar un medicamento para prevenir la muerte de neuronas motoras en la médula espinal. En una realización particular, la isoforma VEGF165 puede usarse para el tratamiento de trastornos de las neuronas motoras.

[0011] Por 'trastornos neuronales' se indica cualquier disfunción fisiológica o muerte de neuronas presentes en el sistema nervioso central. Una lista no limitada de tales trastornos comprende demencia, demencia del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedades de priones, neuronopatías y trastornos de las neuronas motoras. Las 'neuronopatías' se caracterizan por la muerte de las células neuronales de neuronas motoras o neuronas sensitivas y de ahí que las neuronopatías puedan subdividirse en trastornos de las neuronas motoras y sensitivas. La enfermedad de la neurona motora (MND) o los trastornos de las neuronas motoras es un grupo de enfermedades (trastornos) que implican la degeneración de las células del asta anterior, los nervios en el sistema nervioso central que controlan la actividad muscular. Esto conduce a un debilitamiento gradual y eventualmente a la pérdida de la musculatura (atrofia). Las enfermedades de la neurona motora se clasifican según la implicación de la neurona motora superior (UMN) y/o la neurona motora inferior (LMN). Las neuronas motoras superiores se originan en el cerebro, en particular la corteza motora, y forman sinapsis tanto directamente como indirectamente con las neuronas motoras inferiores. Las neuronas motoras superiores se denominan con más exactitud en lo sucesivo las neuronas pre-motoras y son las responsables de transportar las órdenes descendentes para el movimiento. Las neuronas motoras inferiores pueden dividirse en dos categorías: neuronas motoras viscerales y somáticas. Las neuronas motoras viscerales son neuronas pregangliónicas autonómicas que regulan la actividad de las neuronas gangliónicas, que inervan glándulas, vasos sanguíneos y músculo liso. Las neuronas motoras somáticas inervan músculo esquelético e incluyen, primero, células del asta anterior que, como implica el nombre, se localizan en el asta anterior de la médula espinal, y segundo, las neuronas motoras inferiores localizadas en los núcleos del nervio craneal. La esclerosis lateral amiotrófica o ELA es la forma más frecuente (representa aproximadamente el 80% de todos los casos) de trastornos de neuronas motoras. La ELA se conoce como enfermedad de Lou Gehrig, que lleva el nombre del famoso jugador de beisbol yanqui. Los síntomas iniciales de la ELA son debilidad en las manos y las piernas y frecuentemente fasciculación de los músculos afectados. Sea cuales sean los primeros miembros afectados, los cuatro miembros se afectan eventualmente. La lesión a las neuronas motoras superiores produce debilidad muscular, espasticidad y reflejos tendinosos profundos hiperactivos. La lesión de neuronas motoras inferiores produce debilidad muscular con atrofia, fasciculaciones, flacidez y reflejos tendinosos profundos disminuidos. La ELA tiene características de neuronas motoras tanto superiores como inferiores de los nervios craneales, por tanto, los síntomas se aíslan a la cabeza y el cuello. Algunos pacientes también mostrarán implicación de UMN de los nervios craneales y, si esta es la única manifestación, se denomina en lo sucesivo parálisis seudobulbar. La atrofia muscular espinal o la atrofia muscular progresiva es una MND que no implica los nervios craneales y es debida a una menor degeneración de neuronas motoras. El síndrome de Shy-Drager se caracteriza por hipotensión postural, incontinencia, sudoración, rigidez y temblor muscular, y por la pérdida de neuronas de los núcleos torácicos en la médula espinal a partir de la cuales se originan las fibras simpáticas. Las lesiones destructivas de la médula espinal dan como resultado la pérdida de células del asta anterior. Esto se observa en mielomeningocele y en siringomielia, en los que se forma un gran quiste lleno de fluido en el centro de la médula espinal cervical. La infección por el virus de la poliomielitis también destruye células del asta anterior. Los tumores de la médula espinal pueden lesionar localmente las células del asta anterior tanto por crecimiento dentro de la médula (gliomas) como por compresión de la médula espinal desde el exterior (meningiomas, schwannomas, carcinoma metastásico, linfomas).

[0012] Las células de los ganglios de la raíz dorsal pueden lesionarse por virus del herpes simple y de la varicelazóster. Tales infecciones están asociadas a una erupción vesicular en las regiones de la piel suministradas por aquellas neuronas. Una pérdida similar de neuronas sensitivas se observa en ataxia-telangiectasia, un trastorno asociado a ataxia cerebelosa progresiva y a telangiectasias simétricas de la piel y la conjuntiva. La pérdida neuronal de ganglios autonómicos se observa en neuropatías amiloides y en diabetes.

[0013] Se desarrolló un número normal de capilares en músculo esquelético de VEGFm/m, pero el tamaño de su luz se redujo. Independientemente de si los capilares más pequeños fueron la causa o la consecuencia del reducido crecimiento del músculo, la oxigenación fue normal y no hubo signos de isquemia en el músculo de VEGFm/m, que indica que la perfusión se correspondió con las necesidades metabólicas de las fibras del músculo. El VEGF puede inducir vasodilatación que podría producir remodelación vascular estructural (Laitinen M. y col. (1997) Hum Gene Ther 8, 1737), pero los niveles de VEGF en músculo normóxico e hipóxico de VEGFm/m fueron normales. Los niveles de VEGF normales y de IGF-1 reducidos pueden sugerir que el crecimiento de fibras de músculo y no de vasos estuvo principalmente afectado. A diferencia, la perfusión neuronal se redujo el 50% en ratones VEGFm/m, a pesar de un número, tamaño y diferenciación normal de los capilares, y una respuesta vasorreactiva hipercápnica normal. Queda por determinar por qué la perfusión se reduce en algunos, pero no en otros órganos, en ratones VEGFm/m y si estas carencias de perfusión específica de órgano se refieren a niveles iniciales variablemente reducidos y de VEGF hipóxicos en estos órganos. A diferencia del músculo esquelético en el que la vasculatura se expande casi 10 veces, la red vascular neuronal se expande menos, pero principalmente se remodela después del nacimiento (Feher G. y col. (1996) Brain Res Dev Brain Res 91, 209). El VEGF participa en la remodelación del plexo capilar primitivo (escasamente perfundido) en el nacimiento hasta una vasculatura funcionalmente perfundida en el adulto (Ogunshola y col. (2000) Brain Res Dev Brain Res 119, 139). Por tanto, una cuestión interesante es si los niveles de VEGF neuronal reducidos en ratones VEGFm/m redujeron o no la perfusión neuronal mediante la remodelación vascular alterada. Independientemente del mecanismo, la hipoperfusión neuronal en ratones VEGFm/m podría haber contribuido al crecimiento atrofiado y a infertilidad, por ejemplo, alterando la secreción de factores hipotalámicos. Los ratones con defectos hipotalámicos o de la pituitaria son más pequeños y estériles (Chandrashekar V. y col. (1996) Biol Reprod 54, 1002). Los reducidos niveles de IGF-1 en plasma concuerdan con tal hipótesis.

[0014] Aunque una reducción de la perfusión neuronal del 50% no predispone a ratones VEGFm/m a infartos neuronales, es probable que se produzca isquemia neuronal crónica. No están disponibles modelos animales de isquemia crónica de médula espinal, pero la isquemia aguda de la médula espinal produce una degeneración significativa de neuronas motoras (Lang-Lazdunski, L. y col. (2000) Stroke 31, 208). La falta de perfusión cerebral quirúrgicamente inducida produjo defectos cognitivos, pero previno a las ratas de disfunción motora, y produjo variablemente signos histológicos de pérdida neuronal (Ohta H. y col. (1997) Neuroscience 79, 1039). Sin embargo, no está disponible un modelo animal de isquemia neuronal crónica espontánea. Por tanto, en una realización específica, la invención proporciona un modelo para isquemia crónica de la médula espinal.

[0015] El modelo de ratón VEGFm/m promete ser fructífero para estudiar las consecuencias de insuficiencia neurovascular en la función cognitiva y en la progresión de trastornos neurodegenerativos. En una realización específica, la invención proporciona un modelo para disfunción cognitiva y en otra realización específica el modelo de ratón VEGFm/m es útil para la cría con modelos de ratón actuales conocidos en la técnica para trastornos neurodegenerativos, por ejemplo, modelos para enfermedad de Alzheimer (Bornemann y col. (2000) Ann NY Acad Sci 908, 260, Van Leuven F. (2000) Prog Neurobiol 61, 305, Sommer B. y col. (2000) Rev Neurosci 11, 47).

[0016] Una disminución de la circulación sanguínea nerviosa en el cerebro puede conducir a isquemia cerebral. La isquemia cerebral es un proceso de muerte de células neuronales retrasado y no un acontecimiento instantáneo. Una disminución de la circulación sanguínea nerviosa inicia una serie de acontecimientos (la “cascada isquémica”) que puede conducir a la destrucción de células. El objetivo de la neuroprotección es intervenir en el proceso en el que las neuronas isquémicas experimentan muerte celular como parte de la ruta común final. La cascada isquémica se ha estudiado intensamente y, aunque no se ha delineado completamente, se reconocen ciertos aspectos reproducibles. La cantidad normal de perfusión a la materia gris del cerebro humano es 60 a 70 ml/100 g de tejido de cerebro/min. Si la perfusión disminuye a <25 ml/100 g/min, la neurona ya no puede mantener la respiración aerobia. Las mitocondrias son obligadas a cambiar a respiración anaerobia y se generan grandes cantidades de ácido láctico. Este subproducto metabólico se acumula en las regiones extracelulares y produce un cambio local en el nivel de pH. Este cambio fundamental en el entorno que rodea las células isquémicas se ha confirmado en seres humanos por espectroscopía de resonancia magnética y por tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Muchos estudios se han centrado en el accidente cerebrovascular como modelo para isquemia cerebral. Sin embargo, se ha observado que las reducciones recientemente crónicas en la circulación sanguínea cerebral se asocian al envejecimiento y a los trastornos neurodegenerativos progresivos que pueden precipitar la insuficiencia cognitiva (Bennet y col. (1998) Neuroreport 9, 161). Por ejemplo, se observan anomalías en la circulación sanguínea cerebral regional a las regiones frontales y temporales en pacientes deprimidos con deterioro cognitivo (Dolan y col. (1992) J Neurol Neurosurg Psychiatry 9, 768, Ritchie y col. (1999) Age Ageing 28, 385). En la enfermedad de Alzheimer (EA), un ejemplo de un trastorno neurodegenerativo, como la perfusión cerebral alterada, se origina en la microvasculatura que afecta la administración óptima de glucosa y oxígeno y produce una rotura de las rutas metabólicas en la célula cerebrales tales como en las rutas biosintéticas y sinápticas. Se propone que dos factores necesitan estar presentes antes de la disfunción cognitiva y que la neurodegeneración se expresa en cerebro con EA, envejecimiento avanzado y la presencia de una afección específica que reduce adicionalmente la perfusión cerebral (de la Torre (1999) Acta Neuropathol 98, 1). Adicionalmente en EA, una hipoperfusión cerebral de umbral crítico es una insuficiencia circulatoria autoperpetuante, contenida y progresiva que desestabilizará neuronas, sinapsis, neurotransmisión y la función cognitiva, creando en su estela un proceso neurodegenerativo caracterizado por la formación de placas seniles, ovillos neurofibrilares y angiopatía amiloide.

[0017] La cognición se refiere al proceso que participan en saber, o el acto de saber, que en su completitud incluye la percepción y el juicio. La cognición incluye cualquier proceso mental que pueda describirse como una experiencia de saber a diferencia de una experiencia de sentir o de estar dispuesto. Incluye, en resumen, todos los procesos de consciencia por los que se forma el conocimiento, que incluyen percibir, reconocer, concebir y razonar. La esencia de la cognición es el juicio, en el que un cierto objeto se distingue de otros objetos y se caracteriza por algún concepto o conceptos. Los trastornos cognitivos o la disfunción cognitiva son alteraciones en el proceso mental relacionado con la cognición. Una visión general de trastornos cognitivos (también llamados trastornos amnésicos) puede encontrarse en Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV™) (ISBN 0890420629).

[0018] En una realización específica, el novedoso modelo de ratón VEGFm/m puede usarse para identificar y/o para probar moléculas para prevenir y/o para tratar isquemia neuronal o trastornos neurodegenerativos y/o disfunción cognitiva.

[0019] En otra realización, la presente invención indica adicionalmente que el VEGF165, u homólogos, derivados o fragmentos del mismo, pueden usarse para la preparación de un medicamento para prevenir y/o para tratar isquemia neuronal tal como isquemia cerebral. Y en otra realización más, el VEGF165, u homólogos, derivados o fragmentos del mismo, pueden usarse para la preparación de un medicamento para prevenir y/o para tratar disfunción cognitiva.

[0020] El VEGF165 se describe en detalle en Neufeld G. y col., Faseb Journal, 13, 9-22, 1999, Korpelainen E.I. y col., Curr. Opin. Cell. Biol. 10, 159-164, 1998 y en Joukov, V. y col. J. Cell. Physiol 173, 211-215, 1997. En particular, ciertos de los genes VEGF, homólogos, fragmentos y derivados de los mismos que son útiles para poner en práctica la invención reivindicada se describen en los números de acceso de GenBank NM 003376 (“ARNm de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de Homo sapiens”) y AF 024710 (“ARNm de factor de crecimiento vascular (VEGF165) de Homo sapiens), 3'UTR, secuencia de ARNm”). Los ácidos nucleicos preferidos de la invención codifican los polipéptidos de los factores de crecimiento angiogénicos anteriormente mencionados, además de sus homólogos y alelos y fragmentos funcionalmente equivalentes o variantes de los anteriores. Preferentemente, el ácido nucleico del VEGF tiene la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor de crecimiento angiogénico humano intacto, es decir, la secuencia codificante completa del gen que codifica un VEGF165 humano; sin embargo, la invención también engloba el uso de ácidos nucleicos que codifican fragmentos de un VEGF165 intacto.

[0021] La invención también engloba fragmentos funcionalmente equivalentes aislados, variantes y análogos de los ácidos nucleicos anteriores; proteínas y péptidos codificados por cualquiera de los ácidos nucleicos anteriores; y complementos de los ácidos nucleicos anteriores. 'Funcionalmente' significa que los fragmentos, variantes y análogos deben tener la capacidad de tratar un trastorno neuronal y en particular un trastorno de las neuronas motoras.

[0022] El término 'derivados' se refiere a cualquier variante, mutante o composición peptídica de VEGF165 que retiene la capacidad, o puede usarse, para tratar trastornos degenerativos de las neuronas motoras como se ha definido anteriormente. El último término también incluye modificaciones postraduccionales de las secuencias de aminoácidos de VEGF165 tales como glicosilación, acetilación, fosforilación, modificaciones con ácidos grasos y similares. Incluidas dentro de la definición están, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo aminoácidos no naturales), secuencias de aminoácidos con enlaces sustituidos, péptidos que contienen enlaces disulfuro entre residuos de cisteína, secuencias de aminoácidos biotiniladas, además de otras modificaciones conocidas en la técnica. Por tanto, el término incluye cualquier proteína

o péptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada en este documento en la que uno o más residuos se han sustituido conservativamente con un residuo biológicamente equivalente. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparaginas, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. La frase “sustitución conservativa” también incluye el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado siempre que la proteína o péptido resultante sea biológicamente equivalente a la proteína o péptido de la invención. 'Derivado químico' se refiere a una proteína o péptido que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados haciendo reaccionar un grupo lateral funcional. Ejemplos de tales moléculas derivatizadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas moléculas en las que grupos amino libres han sido derivatizados para formar clorhidratos de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-imbencilhistidina. También están incluidos como derivados químicos aquellas proteínas o péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que se producen naturalmente de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo: 4-hidroxiprolina puede estar sustituida por prolina; 5-hidroxilisina puede estar sustituida por lisina; 3-metilhistidina puede estar sustituida por histidina; homoserina puede estar sustituida por serina; y ornitina puede estar sustituida por lisina. Las proteínas o péptidos de la presente invención también incluyen cualquier proteína o péptido que tenga una o más adiciones y/o deleciones o residuos con respecto a la secuencia de un péptido cuya secuencia se muestra en este documento, mientras que el péptido sea biológicamente equivalente a las proteínas o péptidos de la invención. Si se usa porcentaje de identidad de secuencias en referencia a los polipéptidos (es decir, homólogos), se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas se diferencian frecuentemente por sustituciones conservativas de aa, en las que los residuos de aa están sustituidos por otros residuos de aa con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia) y, por tanto, no cambian las propiedades del polipéptido. Si las secuencias se diferencian en sustituciones conservativas, la identidad de secuencias en porcentaje puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Normalmente esto implica puntuar una sustitución conservativa como un desapareamiento parcial en vez de uno completo, aumentando así la identidad de secuencias en porcentaje. Por tanto, por ejemplo (y como se describe en el documento WO 97/31116 a Rybak y col.), si a un aa idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se le da una puntuación entre cero y 1. A este respecto, debe ser evidente que los polipéptidos, o partes de los mismos, que comprenden una secuencia de aa con al menos el 55%, preferentemente el 75%, más preferentemente el 85% o lo más preferentemente el 90% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de VEGR165, o partes del mismo, están dentro del alcance de la presente invención. También debe ser evidente que los polipéptidos que son inmunológicamente reactivos con anticuerpos producidos contra VEG165, o partes del mismo, se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

[0023] El término 'fragmentos de VEGF165' se refiere a cualquier fragmento que incluya cualquier modificación de dicho fragmento como se ha descrito anteriormente, que retiene la capacidad, o puede usarse, para tratar trastornos neuronales y en particular trastornos de las neuronas motoras.

[0024] Los términos 'composición farmacéutica' o 'medicamento' o 'uso para la preparación de un medicamento para tratar' se refieren a una composición que comprende VEGF165 u homólogos, derivados o fragmentos del mismo como se ha descrito anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable (ambos términos pueden usarse indistintamente) para tratar enfermedades como se ha indicado anteriormente. Vehículos o excipientes adecuados conocidos para el experto son solución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, disolución de Hank, aceites no volátiles, oleato de etilo, 5% de dextrosa en solución salina, sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química, tampones y conservantes. Otros vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composición tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. El 'medicamento' puede administrarse por cualquier procedimiento adecuado dentro del conocimiento del experto. La vía de administración preferida es parenteralmente. En la administración parental, el medicamento de la presente invención se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria tal como una disolución, suspensión o emulsión, en asociación con los excipientes farmacéuticamente aceptables como se han definido anteriormente. Sin embargo, la dosificación y el modo de administración dependerán del individuo. Generalmente, el medicamento se administra de manera que la proteína, polipéptido, péptido de la presente invención se administre a una dosis entre 1 μg/kg y 10 mg/kg, más preferentemente entre 10 μg/kg y 5 mg/kg, lo más preferentemente entre 0,1 y 2 mg/kg. Preferentemente, se administra como una dosis en bolo. También puede usarse infusión continua e incluye administración subcutánea continua mediante una minibomba osmótica. Si es así, el medicamento puede infundirse a una dosis entre 5 y 20 μg/kg/minuto, más preferentemente entre 7 y 15 μg/kg/minuto.

[0025] En una realización particularmente preferida, la infusión con una composición que comprende VEGF165 u homólogos, derivados o fragmentos del mismo es intratecal. La administración intratecal puede realizarse, por ejemplo, por medio de implantación quirúrgica de una bomba y pasando un catéter a la columna vertebral. Debe mencionarse que la administración intratecal de VEGF u homólogos, derivados o fragmentos del mismo es un aspecto particularmente importante de la presente invención. De hecho, como los inventores han mostrado que el VEGF165 tiene un aspecto neurotrófico sobre neuronas y más particularmente sobre neuronas motoras, la administración intratecal es una forma preferida. Esto es a diferencia del documento WO 0062798 que tiene como objetivo la angiogénesis terapéutica con el fin de tratar neuropatía periférica isquémica.

[0026] En lugar de administrar VEGF165, o un homólogo, derivado o fragmento del mismo, como una proteína a un paciente en necesidad de tratamiento de un trastorno neuronal o más particularmente un trastorno de las neuronas motoras, también puede administrarse un ácido nucleico que codifica VEGF165, o un homólogo, derivado o fragmento del mismo, a dicho paciente. En ese caso, el ácido nucleico que codifica VEGF165, u homólogo, derivado o fragmento del mismo, puede estar operativamente acoplado a un promotor que puede expresar dicho factor de crecimiento angiogénico en una célula diana (por ejemplo, una célula endotelial, una célula nerviosa, una célula muscular, una neurona, una neurona motora). Frecuentemente, el ácido nucleico está contenido en un vector de expresión apropiado (por ejemplo, plásmido, vector adenovírico, vector adenovírico modificado, vector retrovírico, liposoma) para modificar más eficientemente genéticamente la célula diana y conseguir la expresión de dicho factor de crecimiento angiogénico. Por ejemplo, en el documento WO 9831395 se describe completamente la transferencia selectiva de genes en neuronas motoras.

[0027] En otra realización de la invención se muestra que la isoforma VEGF165, pero no la isoforma VEGF121, proporciona neuroprotección mediante la unión a neuropilina 1 y VEGFR-2.

[0028] En otra realización más, VEGF165, u homólogos, derivados o fragmentos del mismo, puede administrarse para la prevención de pérdida neuronal o más específicamente de pérdida de neuronas motoras en la médula espinal en, por ejemplo, indicaciones quirúrgicas en las que puede esperarse una lesión isquémica a neuronas o neuronas motoras. Se requiere el inicio de rutas neuroprotectoras durante hipoxia, ya que estas neuronas motoras posmitóticas vitales no pueden regenerarse después de una lesión hipóxica mortal. A este respecto solo se han caracterizado algunas moléculas neuroprotectoras tales como NGF, bFGF, TGF�1 52-54. La presente invención indica claramente que el VEGF165 es un potente agente neuroprotector ya que la regulación de su expresión por hipoxia es rápida (minutos), significativa (> 10 veces) y sensible a pequeños cambios en oxígeno. La ausencia de respuestas de VEGF neuroprotectoras en ratones VEGFm/m - aún cuando sólo podrían producirse transitoriamente, pero repetidamente - puede explicar por qué las neuronas motoras en estos ratones degeneran por último lugar después de mini-lesiones submortales acumuladas de hipoxia.

[0029] Se muestra que la neuropilina 1 (NP-1), un receptor para la isoforma VEGF165 9,10 y para la semaforina 3A neurorepelente (Sema3A) 11-13, es esencial para guiar las prolongaciones neuronales durante el modelado embrionario 11-15 . Sin embargo, no se sabe si NP-1 y/o Sema3A tienen alguna función en la función neuronal después del nacimiento. En otra realización, la invención proporciona además procedimientos para identificar compuestos o moléculas que se unen al receptor de neuropilina y VEGFR-2 y estimulan la supervivencia de neuronas y más particularmente neuronas motoras. En la presente invención, los resultados muestran que VEGF165, mediante la unión a neuropilina 1 y VEGFR-2, media en la supervivencia de neuronas motoras NSC34. Ambos receptores se expresan en neuronas motoras en médulas espinales adultas in vivo y, por tanto, son accesibles a VEGF165, producido por la propia neurona motora o por otras células cercanas. La neuropilina 1 y VEGFR-2 actúan de co-receptores en la estimulación de la motilidad de células endoteliales 9, 10 y también cooperan en la mediación de la supervivencia neuronal. Estos procedimientos también se denominan en lo sucesivo 'ensayos de cribado de fármacos' o 'bioensayos' y normalmente incluyen la etapa de cribar un candidato/compuesto de prueba o agente para la capacidad para interactuar con (por ejemplo, unirse a) neuropilina 1 y VEGFR-2. Los compuestos o agentes candidatos que tienen esta capacidad pueden usarse como fármacos para tratar trastornos degenerativos. Los candidatos/compuestos de prueba tales como moléculas pequeñas, por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas, y otros candidatos a fármacos pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de bibliotecas combinatorias y de productos naturales.

[0030] La invención también proporciona procedimientos para identificar compuestos o agentes que pueden usarse para tratar neuronas degenerativas. Estos procedimientos también se denominan en lo sucesivo 'ensayos de cribado de fármacos' o 'bioensayos' y normalmente incluyen la etapa de cribar un candidato/compuesto de prueba o agente para la capacidad para interactuar con (por ejemplo, unirse a) neuropilina 1 y VEGFR-2. Los candidatos/compuestos o agentes de prueba que tienen esta capacidad pueden usarse como fármacos para tratar trastornos neuronales degenerativos. Los candidatos/compuestos de prueba tales como moléculas pequeñas, por ejemplo, moléculas pequeñas orgánicas y otros candidatos a fármaco pueden obtenerse, por ejemplo, de bibliotecas combinatorias y de productos naturales. En una realización, la invención proporciona ensayos para cribar candidatos/compuestos de prueba que interactúan con (por ejemplo, se unen a) neuropilina 1 y VEGFR-2. Normalmente, los ensayos son ensayos libres de células que incluyen las etapas de combinar neuropilina 1 y VEGFR-2 y un candidato/compuesto de prueba, por ejemplo, en condiciones que permiten la interacción de (por ejemplo, la unión de) el candidato/compuesto de prueba con neuropilina 1 y VEGFR-2 para formar un complejo, y detectar la formación de un complejo, en el que la capacidad del compuesto candidato para interactuar con neuropilina 1 y VEGFR-2 se indica por la presencia del compuesto candidato en el complejo. La formación de complejos entre la neuropilina 1 y el compuesto candidato puede cuantificarse, por ejemplo, usando inmunoensayos convencionales. La neuropilina 1 empleada en una prueba tal puede estar libre en disolución, fijada a un soporte sólido, transmitirse sobre una superficie celular o localizarse intracelularmente. En otra realización, la invención proporciona ensayos de cribado para identificar candidatos/compuestos de prueba que estimulan la neuropilina 1 y el VEGFR-2 o inhiben la unión de Sema3A a neuropilina 1 y/o VEGFR-2. Normalmente, los ensayos son ensayos libres de células que incluyen las etapas de combinar neuropilina 1 y VEGFR-2 de la presente invención o fragmentos de los mismos y un candidato/compuesto de prueba, por ejemplo, en condiciones en las que, excepto para la presencia del compuesto candidato, la neuropilina 1 y VEGFR-2 o una porción biológicamente activa de los mismos interactúe con (por ejemplo, se una a) la molécula diana o el anticuerpo, y detectar la formación de un complejo que incluye la neuropilina 1 y la molécula diana o el anticuerpo, o detectar la interacción/reacción de neuropilina 1 y la molécula diana o anticuerpo. La detección de la formación del complejo puede incluir la cuantificación directa del complejo.

[0031] Para realizar los ensayos de cribado de fármacos anteriormente descritos es factible inmovilizar la neuropilina 1 y el VEGFR-2 o su su(s) molécula(s) diana para facilitar la separación de complejos de formas no complejadas de una o ambas de las proteínas, además de para adaptar la automatización del ensayo. La interacción (por ejemplo, la unión de) de neuropilina 1 y VEGFR-2 a una molécula diana puede llevarse a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayos y tubos de microcentrífuga. En una realización puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que la proteína se una a una matriz. Por ejemplo, la neuropilina 1-His marcada puede absorberse sobre placas de microtitulación de Ni-NTA (Paborsky y col., 1996), o las fusiones de neuropilina 1-ProtA adsorberse a IgG, que luego se combinan con los lisados celulares (por ejemplo, marcados con 35S) y el compuesto candidato, y la mezcla incubarse en condiciones que son propicias para la formación de complejos (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para sal y pH). Tras la incubación, las placas se lavan para eliminar cualquier marca sin unir y la matriz inmovilizada y la radiomarca se determinan directamente o en el sobrenadante después de que los complejos se disocien. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, separarse por SDS-PAGE y cuantificarse el nivel de proteína de unión a neuropilina 1 encontrado en la fracción de perlas a partir del gel usando técnicas electroforéticas convencionales. También pueden usarse otras técnicas para inmovilizar la proteína sobre matrices en los ensayos de cribado de fármacos de la invención. Por ejemplo, tanto la neuropilina 1 como el VEGFR2 o sus moléculas diana pueden inmovilizarse utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. La neuropilina 1 y el VEGFR-2 biotinilados pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas muy conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.) e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemicals). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con neuropilina 1, pero que no interfieren con la unión de la proteína a su molécula diana, pueden derivatizarse a los pocillos de la placa, y la neuropilina 1 y el VEGFR-2 atraparse en los pocillos por la conjugación con el anticuerpo. Como se ha descrito anteriormente, las preparaciones de una proteína de unión a neuropilina 1 y un compuesto candidato se incuban en los pocillos de la placa que presentan neuropilina 1 y puede cuantificarse la cantidad de complejo atrapado en el pocillo. Los procedimientos para detectar tales complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados sobre GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la molécula diana de neuropilina 1 y la molécula diana de VEGFR-2, o que son reactivos con neuropilina 1 y VEGFR-2 y compiten con la molécula diana; además de ensayos ligados a enzima que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada a la molécula diana. Otra técnica para cribar fármacos que proporciona cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a neuropilina 1 y VEGFR-2 se describe en detalle en “Determination of Amino Sequence Antigenicity” de Geysen HN, documento WO 84/03564 publicado en 13/09/84. En resumen, grandes números de diferentes compuestos de prueba peptídicos pequeños se sintetizan sobre un sustrato sólido tal como clavos de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba proteínicos se hacen reaccionar con fragmentos de neuropilina 1 o/y VEGFR2 y se lavan. Entonces, la neuropilina 1 unida se detecta mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. La neuropilina 1 o/y el VEGFR-2 purificados también pueden recubrirse directamente sobre placas para su uso en las técnicas de cribado de fármacos anteriormente mencionadas. Alternativamente pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido. La presente invención también contempla el uso de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los que los anticuerpos neutralizantes que pueden unirse a neuropilina 1 o/y VEGFR-2 compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse a neuropilina 1 o/y VEGFR-2. De este modo, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier proteína, que comparte uno o más determinantes antigénicos con la neuropilina 1 y el VEGFR-2

[0032] Por tanto, ninguna mutación genética del gen VEGF, que produce la rotura del gen, se ha ligado a la enfermedad humana, probablemente debido a que la ausencia de incluso un único alelo de VEGF es embrionariamente mortal 1,2,26. Sin embargo, recientemente se ha mostrado que la regulación hipóxica alterada de VEGF constituye un factor de riesgo para enfermedad cardíaca isquémica 27. Sin embargo, no se sabe si esta regulación génica anormal del VEGF - no función - puede predisponer trastornos patológicos. En otra realización de la invención, los polimorfismos en la región reguladora del gen VEGF, que tienen una influencia sobre la regulación hipóxica de dicho gen, pueden detectarse y usarse diagnósticamente para identificar pacientes en riesgo de desarrollar una neuropatía o más específicamente una neuropatía motora cuando se exponen a breves periodos de isquemia. La transcripción inducida por hipoxia del ARNm de VEGF está mediada, al menos en parte, por la unión del factor inducible de hipoxia 1 (HIF-1) a un sitio de unión a HIF-1 localizado en el promotor del VEGF. Por la detección de polimorfismos que influyen la regulación hipóxica del gen VEGF también se indican polimorfismos en el factor de transcripción HIF-1, factores similares a HIF-1 adicionales, reguladores aguas arriba de HIF-1 y factores de transcripción similares a HIF-1 que comprenden el sensor de oxígeno, factores adicionales que se unen a la región sin traducir de 5' y 3' del ARNm de VEGF y en el sitio interno de entrada del ribosoma presente en la región sin traducir de 5' de VEGF (Neufeld G. y col. FASEB J. 13, 9-22, 1999).

[0033] Se han desarrollado varios procedimientos para cribar genes con el fin de detectar polimorfismos en genes. En términos de uso real, muchos de los procedimientos para barrer o cribar genes emplean electroforesis en gel en placa o capilar para la etapa de separación y de detección en los ensayos. Algunos de estos procedimientos comprenden polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) (Orita y col., “Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single-Stranded Conformation Polymorphisms”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766 (1989)), electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE) (Abrams y col., “Comprehensive Detection of Single Base Changes in Human DNA Genomic Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and a GC Clamp”, Genomics 7, 463 (1990)), escisión química en el desapareamiento (CCM) (J. A. Saleeba & R. G. H. Cotton, “Chemical Cleavage of Mismatch to Detect Mutations”, Methods in Enzymology 217, 286 (1993)), escisión por desapareamiento enzimático (EMC) (R. Youil y col., “Screening for Mutations by Enzyme Mismatch Cleavage with T4 Endonuclease VII”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 87 (1995)), y polimorfismo de longitud de fragmentos de “cleavasa” (CFLP). Todavía otros procedimientos se basan en el uso de espectrometría de masas como herramienta de análisis genético. La espectrometría de masas requiere muestras diminutas, proporciona información extremadamente detallada sobre las moléculas que se analizan que incluye precisión a alta masa y está fácilmente automatizada. El documento US 5.965.363 describe análisis de ácidos nucleicos por medio de análisis espectrométrico de masas.

[0034] En otra realización de la invención, el elemento de respuesta a hipoxia (HRE) puede usarse para el tratamiento de trastornos neuronales o más específicamente trastornos de las neuronas motoras. El VEGF, u homólogo, derivados o fragmentos del mismo, puede colocarse bajo el control hipóxico cortando y empalmando dichos genes a uno o más elementos HRE. Entonces, estas construcciones pueden usarse en terapia génica.

[0035] La terapia génica significa el tratamiento por la administración de ácidos nucleicos terapéuticos a las células del paciente. Esto se revisa exhaustivamente en Lever y Goodfellow 1995; Br. Med Bull., 51, 1-242; Culver 1995; Ledley, F.D. 1995. Hum. Gene Ther. 6, 1129. Para lograr la terapia génica debe haber un procedimiento de administración de genes a las células del paciente y procedimientos adicionales para garantizar la producción eficaz de cualquier gen terapéutico. Hay dos enfoques generales para lograr la administración de genes; éstos son administración no vírica y administración de genes mediada por virus. El sistema de administración de genes mediada por virus mejor caracterizado usa retrovirus defectuosos en la replicación para introducir establemente genes en células del paciente.

[0036] La presente invención se ilustrará ahora por referencia a los siguientes ejemplos que exponen realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, debe observarse que estas realizaciones son ilustrativas y no pueden interpretarse de ningún modo como limitante de la invención.

Ejemplos

1. Deleción elegida como diana del sitio de unión a HIF en el promotor del VEGF

[0037] La deleción elegida como diana en el promotor del VEGF del elemento de respuesta a hipoxia (HRE), es decir, el sitio de unión para los factores inducibles por hipoxia (HIF) 23, se logró usando la elección como diana mediada por CrelloxP (Fig. 1) y se confirmó por análisis de transferencia Southern. La inducción hipóxica alterada de VEGF en citoblastos embrionarios, homocigóticos para la deleción de HRE (VEGFm/m), se confirmó por análisis de transferencia Northern y por mediciones de la liberación de VEGF durante 36 h de hipoxia (19 ± 5 μg/ml después de normoxia frente a 45 ± 6 μg/ml después de hipoxia en células de VEGF+/+, n=6, p<0,05; 11 ± 2 pg/ml después de normoxia frente a 13 ± 3 pg/ml después de hipoxia en células de VEGFm/m, n=6; p=NS). La deleción del sitio de unión a HIF en el gen VEGF fue tan eficaz como la deleción del propio gen HIF-1a 28 en la abolición de la regulación hipóxica por incremento de VEGF (13 ± 4 pg/ml después de normoxia frente a 14 ± 2 pg/ml después de hipoxia en células HIF-1a-/-; n=6; p=NS). Los embriones VEGFm/m se recuperaron a una frecuencia mendeliana normal. De los ratones VEGFm/m, el 30% murió antes del nacimiento y otro 30% dentro de los primeros días posnatales, mientas que el 40% restante sobrevivió más de 12 meses. Aquí se describe el fenotipo de los ratones VEGFm/m supervivientes; los fenotipos embrionarios y neonatales se informarán por separado.

2. Coordinación motora y rendimiento muscular en ratones VEGFm/m

[0038] Los ratones VEGFm/m parecieron normales hasta los 4 meses, pero después desarrollaron síntomas de enfermedad de las neuronas motoras. Progresivamente fueron cada vez menos móviles y presentaron signos de debilidad muscular grave y paresia de las extremidades. Después de los seis meses de edad, los ratones mutantes eran demasiado débiles para girarse cuando se colocan sobre su lomo, arrastraba sus patas cuando caminaban y tuvieron una marcha de pato y escoliosis. Cuando se levantaban por sus colas, contraían de forma reflexiva sus extremidades al tronco y permanecían inmóviles, mientras que los ratones naturales extendían extremidades y luchaban. Los ratones VEGFm/m desarrollaron un pelo grueso que sugería alteración del cepillado y parecieron delgados a lo largo de sus flancos y patas. Notablemente, cuando los ratones VEGFm/m asintomáticos de dos meses de edad se mantuvieron en una cámara hipóxica (10% de O2), desarrollaron signos neurológicos (dificultad para girarse, contractura refleja cuando se levantaban por la cola) en el plazo de dos semanas, que indica que la hipoxia aceleró marcadamente la aparición y la progresión del fenotipo. Después de 4 a 6 meses de edad, los ratones VEGFm/m obtuvieron resultados significativamente peores que los compañeros de camada naturales en varias pruebas de coordinación motora y rendimiento muscular 29 que incluían la prueba de la rueda sin fin, prueba de la rejilla, prueba del eje giratorio y la prueba de la huella (distancia entre las almohadillas centrales de las patas traseras: 65 ± 5 mm para ratones VEGF+/+ frente a 45 ± 5 mm para ratones VEGFm/m; n=7; p<0,05). En comparación con ratones VEGF+/+, los ratones VEGFm/m fueron significativamente menos activos por la noche (número de vueltas en la rueda sin fin: 5400 ± 600 para ratones VEGF+/+ frente a 2700 ± 400 para ratones VEGFm/m; n=7; p<0,05) y durante periodos mucho más cortos (minutos de actividad intensa: 150 ± 40 para ratones VEGF+/+ frente a 14 ± 6 para VEGFm/m; n=7; p<0,05). En la prueba de la 'rejilla' (los ratones se colocan sobre una rejilla que posteriormente se gira al revés), cinco de siete ratones VEGF+/+ se colgaron en la rejilla durante al menos un minuto. Dos ratones VEGF+/+ se movieron tan activamente que se cayeron de la rejilla después de 23 y 45 segundos. A diferencia, cuatro de seis ratones VEGFm/m de 20 semanas de edad ya se cayeron de la rejilla después de 8 segundos, y sólo dos ratones mutantes consiguieron sujetarse a la rejilla sin moverse en absoluto. Cuando se probó la fuerza al agarre (se obliga a que los ratones se cuelguen con sus extremidades delanteras sobre un hilo horizontal), todos los ratones VEGF+/+ (n=7) se agarraron inmediatamente al hilo con sus extremidades traseras. A diferencia, los ratones VEGFm/m tuvieron dificultades para agarrarse al hilo con sus extremidades delanteras, se colgaron inmóviles y se cayeron. Cuando finalmente lo consiguieron (cinco de seis ratones), los ratones VEGFm/m no pudieron sujetarse al hilo y se cayeron. Los ratones VEGFm/m también dieron peores resultados en la prueba del 'eje giratorio', usada para evaluar cuánto tiempo podrían permanecer los ratones en un eje giratorio antes de caerse: todos excepto un ratón VEGF+/+ (n=8) permanecieron en el eje durante al menos dos minutos (tiempo de análisis), mientras que los seis ratones VEGFm/m se cayeron después de menos de un minuto (53 ± 20 s). El umbral de dolor, una función medida como la respuesta de chuparse la pata en una prueba en placa caliente 29 fue normal en ratones VEGFm/m (el tiempo para chuparse las patas delanteras o traseras para ambos genotipos fue 7 ± 1 s y 10 ± 2 s, respectivamente; n=6; p=NS). Sin embargo, los ratones VEGF+/+ saltaron de la caja después de 100 ± 20 s, mientras que los ratones VEGFm/m estaban demasiado débiles para escapar durante este periodo.

3. Atrofia muscular en ratones VEGFm/m

[0039] Los músculos esqueléticos en ratones VEGFm/m de más de 4 meses de edad mostraron signos de atrofia neurogénica. El peso en húmedo de los músculos plantar y flexor dorsal fue 170 ± 14 mg y 92 ± 19 mg en ratones VEGF+/+ frente a 94 ± 5 mg y 58 ± 18 mg en ratones VEGFm/m (n=3; p<0,05). Inicialmente, un número variable de fibras fueron atróficas, pero en animales mayores, la mayoría de las fibras musculares fueron gravemente atróficas, “angulosas” o “alargadas”, características de fibras desnervadas. El tamaño de las fibras musculares disminuyó más del 50% en ratones VEGFm/m (área de la sección transversal: 1700 ± 200 μm2 en ratones VEGF+/+ frente a 700 ± 100 μm2 en ratones VEGFm/m; n=8; p<0,05). La regeneración de las fibras musculares, identificadas por su núcleo vesicular centralmente localizado, menor tamaño e inmunorreactividad a desmina, se observaron comúnmente en ratones VEGFm/m. La tinción con miosina ATPasa reveló atrofia de todos los tipos de fibras (tipo I, IIa y IIb). A diferencia del patrón de tablero de ajedrez típico de todas los tipos de fibras en ratones VEGF+/+, el agrupamiento de fibras de un tipo similar, un signo de reinervación, se observó en ratones VEGFm/m. Los husos musculares implicados en el control reflejo - estaban presentes en ambos genotipos (número de husos/sección de cuádriceps: 3,9 ± 0,9 en ratones VEGF+/+ frente a 4,5 ± 0,8 en ratones VEGFm/m; n=5; p=NS). No se detectaron cambios miopáticos (desintegración de sarcolema, necrosis de fibras, pérdida de fibras musculares, elevados niveles de creatina cinasa en plasma o fibrosis) en ratones VEGFm/m. La atrofia muscular en ratones VEGFm/m no se pareció a las características degenerativas de miopatías primarias. De hecho, no hubo pérdida de fibras musculares y, debido al encogimiento, la densidad de las fibras musculares aumentó en ratones VEGFm/m (1250 ± 190 células/mm2) con respecto a ratones VEGF+/+ (720 ± 80 células/mm2; p<0,05). A diferencia de en miopatías, no hubo signos de necrosis de las fibras, lisis de sarcómeros o rotura de sarcolemas (análisis ultraestructural; titina normal y tinción con desmina; ausencia de albúmina intracelular), infiltración grasa, fibrosis (tinción con rojo Sirius) o calcificación distrófica. Los niveles en plasma de creatina cinasa (liberada tras la muerte de los miocitos) fueron normales en ratones VEGFm/m de 8 meses de edad (88 ± 20 U/ml en ratones VEGF+/+ frente a 94 ± 9 U/ml en ratones VEGFm/m; n=5; p=NS). Además, la atrofia se confinó a músculo esquelético y no a cardíaco, y no se produjo por trastornos sistémicos. La atrofia se confinó a fibras musculares esqueléticas, ya que los cardiomiocitos no estuvieron afectados (área de la sección transversal: 130 ± 10 μm2 en ratones VEGF+/+ frente a 125 ± 8 μm2 en ratones VEGFm/m; n=5; p=NS). Los cambios estructurales en fibras musculares tampoco fueron debidos a enfermedad infecciosa (informe sanitario libre de patógenos), trastornos inflamatorios de tejido conjuntivo o vasos sanguíneos (sin signos de vasculitis), trastornos metabólicos (niveles de glucosa normales en plasma) o anomalías del almacenamiento en glucógeno o lípidos.

4. Degeneración de neuronas motoras en ratones VEGFm/m

[0040] La prueba de un proceso neurodegenerativo se obtuvo por análisis de la médula espinal y de los nervios periféricos. La tinción de Nissl reveló un número comparable de neuronas en el asta ventral en la médula espinal a la edad temprana (12 semanas) en ambos genotipos (neuronas con un citoplasma claramente identificable/sección del asta ventral: 110 ± 2 en ratones VEGF+/+ frente a 107 ± 6 en ratones VEGFm/m; n=3; p=NS), que indica que la deleción del sitio de unión a HIF en el promotor del VEGF no produjo por sí misma el desarrollo neuronal anormal. Sin embargo, después de 7 meses de edad se detectaron menos neuronas en el asta ventral en ratones VEGFm/m (neuronas/sección del asta ventral: 110 ± 3 en ratones VEGF+/+ frente a 98 ± 4 en ratones VEGFm/m; n=8; p<0,05). La inmunotinción para colina acetiltransferasa (ChAT), un marcador de neuronas motoras, reveló un 30% menos de neuronas motoras en VEGFm/m que en ratones VEGF+/+ (neuronas positivas para ChAT/sección de la médula espinal: 26 ± 2 en ratones VEGF+/+ frente a 18 ± 2 en ratones VEGFm/m; n=4; p=0,05). A diferencia de los ratones VEGF+/+, los cuerpos de células neuronales (pericariones) y axones proximales de neuronas motoras en ratones VEGFm/m contuvieron inclusiones de neurofilamento fosforilado (NFP), un distintivo de enfermedad de neuronas motoras 31 (número de neuronas positivas para NFP/sección de la médula espinal: ninguno en ratones VEGF+/+ frente a 7 ± 2 en ratones VEGFm/m; n=6; p<0,05). Estas neuronas motoras positivas para NFP fueron más pequeñas en tamaño (250 ± 20 μm2) que las neuronas motoras negativas para NFP en ratones VEGF+/+ (500 ± 40 μm2; n= 4, p<0,05). La complejidad y la incidencia de axones positivos para el neurofilamento desfosforilado (NF) y de dendritas positivas para MAP-2 fue comparable en ambos genotipos, incluso cuando más neuronas en ratones VEGFm/m tendieron a acumular NF desfosforilado en su pericarión. Las inflamaciones axónicas focales ('esferoides'), también encontradas en pacientes con ELA 33,34, se produjeron en la médula espinal en ratones VEGFm/m, pero no en ratones VEGF+/+ (número de axones inflamados/sección de la médula espinal a las 31 semanas de edad: ninguno en ratones VEGF+/+ frente a 17 ± 1 en ratones VEGFm/m; n=7). Los axones inflamados con axoplasma denso se localizaron principalmente en el asta ventral, mientras que la médula espinal dorsal o los tractos corticoespinales aparecieron relativamente libres. Una fracción de estos axones inflamados fue inmunorreactiva para sinaptofisina, un signo de transporte axónico alterado, y para ubicuitina, que se une a proteínas lesionadas en afecciones neurodegenerativas tales como ELA 35. Frecuentemente contuvieron inclusiones de neurofilamentos, como se reveló por tinción de Bielschowski e inmunotinción para neurofilamento fosforilado (NFP). En comparación con ratones VEGF+/+ se observó coherentemente una astrocitosis reactiva prominente en la médula espinal de ratones VEGFm/m, pero característicamente sólo en el asta ventral. Los numerosos astrocitos hipertróficos acumulados en las zonas ventrales e intermedias (área positiva para GFAP en la materia gris: 0,8 ± 0,4 % en ratones VEGF+/+ frente a 7 ± 1% en ratones VEGFm/m; n=4; p<0,05) y en la materia gris ventral (área positiva para GFAP en materia blanca: 8 ± 3% en ratones VEGF+/+ frente a 31 ± 2% en ratones VEGFm/m; n=4; p<0,05).

5. Degeneración de axones en ratones VEGFm/m

[0041] Se encontraron signos de degeneración walleriana y la pérdida significativa de grandes axones. Algunas fibras se sustituyeron completamente por los macrófagos activados más numerosos, fagocitando hojas de mielina rotas (número de células positivas para F4/80/mm2: 150 ± 27 en ratones VEGF+/+ frente a 340 ± 20 en ratones VEGFm/m; n=6; p<0,05). La fibrosis endoneural y la expresión de GFAP, un marcador de células de Schwann desnervadas, fueron más destacados en nervios mutantes.

6. Electrofisiología de ratones VEGFm/m

[0042] Los registros electromiográficos (EMG) durante el reposo y la contracción muscular revelaron claros signos de desnervación y reinervación. Se observaron actividad espontánea difusa (potenciales de fibrilación, aislados o libres de ondas agudas positivas), junto con potenciales de acción unitaria motora polifásica (MUAP) de amplitud normal, y potenciales satélite inestables en el músculo gastrocnemio superficial, los músculos paravertebrales y el diafragma en ratones VEGFm/m, pero no en VEGF+/+. En el diafragma, la desnervación se demostró por un reclutamiento reducido de MUAP durante la inspiración en ratones VEGFm/m (número de MUAP por explosión inspiratoria: 124 ± 20 en ratones VEGF+/+ frente a 56 ± 4 en ratones VEGFm/m; n=7; p<0,05). En comparación con el patrón normal bi o trifásico de MUAP en ratones VEGF+/+, los MUAP polifásicos de larga duración se detectaron regularmente. La duración de las explosiones inspiratorias en ratones VEGFm/m siguió normal (2300 ± 230 ms en ratones VEGF+/+ frente a 2100 ± 300 ms en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS) y la amplitud de los MUAP diafragmáticos mayores se preservaron en ratones VEGFm/m (MUAP con una amplitud > 200 μV por explosión inspiratoria: 14 ± 2 en ratones VEGF+/+ frente a 11 ± 4 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS), de acuerdo con un procedimiento continuo de desnervación y reinervación. Además, a diferencia de la inervación de placas finales individuales por un único axón terminal, los axones terminales en ratones VEGFm/m se ramificaron más frecuentemente como delgados brotes (supuestamente sin mielinar) en dos o más placas finales. Las latencias de potenciales de acción musculares compuestos (medidos de sitio de estimulación a sitio de registro) fueron algo elevadas en ratones mutantes (810 ± 36 μs en ratones VEGF+/+ frente a 1030 ± 44 μs en ratones VEGFm/m; n=7; p<0,05), compatible con la pérdida axónica. La función del nervio sensitivo apareció electrofisiológicamente normal: las amplitudes del potencial de acción del nervio sensitivo (SNAP) fueron 100 ± 7 μV en ratones VEGF+/+ frente a 120 ± 14 μV en ratones VEGFm/m (n=5; p=NS) y las velocidades de conducción del nervio sensitivo fueron 33 ± 2 m/s en ratones VEGF+/+ frente a 30 ± 2 m/s en ratones VEGFm/m (n=5; p=NS). Estos hallazgos concuerdan con un trastorno neurogénico puramente motor.

7. Crecimiento vascular normal en ratones VEGFm/m

[0043] Debido a la función angiogénica muy conocida del VEGF, los ratones VEGFm/m se examinaron para defectos vasculares. Sin embargo, no hubo signos de insuficiencia vascular en el músculo esquelético, nervios periféricos o médula espinal. (i) En músculo, debido a la atrofia, las densidades capilares fueron mayores en VEGFm/m que en ratones VEGF+/+ (capilares/mm2: 1200 ± 150 en ratones VEGF+/+ frente a 1740 ± 150 en ratones VEGFm/m; n=5; p<0,05). La fluoroangiografía 6 del diafragma reveló vascularización comparable en ambos genotipos.

(ii) Los nervios ciáticos en ratones VEGFm/m tuvieron una densidad similar de vasos de los nervios (capilares/mm2: 90 ± 6 en ratones VEGF+/+ frente a 100 ± 7 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS), se perfundieron normalmente (unidades de perfusión de circulación sanguínea por láser Doppler: 150 ± 15 en ratones VEGF+/+ frente a 190 ± 12 en ratones VEGFm/m; n=5; p=NS) y contuvieron una densidad comparable y patrón de vasos peri- y endoneurales sin signos de falta de estanqueidad u obstrucción (fluoroangiografía). La degeneración axónica se produjo en la periferia, además de en el centro de los nervios de VEGFm/m, dando razones en contra de la neuropatía isquémica, que es normalmente más grave en el centro 37 . (iii) En la médula espinal, las densidades capilares fueron comparables en ambos genotipos en la materia gris (capilares/mm2 : 380 ± 17 en ratones VEGF+/+ frente a 390 ± 13 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS) y en la materia blanca (capilares/mm2: 170 ± 12 en ratones VEGF+/+ frente a 170 ± 11 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS), con densidades similares en astas ventrales y dorsales. Las células endoteliales de ambos genotipos expresaron características de la barrera hematoencefálica (transportador de glucosa de tipo I; Glut-1). No se detectaron signos de microangiopatía isquémica o diabética 38 en ratones VEGFm/m. No se detectados signos característicos de neuropatía isquémica (depósitos amiloides, vasculitis inflamatoria) o neuropatía diabética (hialinización de microvasos endoneurales, engrosamiento de la membrana basal capilar, retirada de pericitos, obstrucción de la luz debido a hiperplasia/hipertrofia endotelial, neovascularización, infarto de nervios) en ratones VEGFm/m. La debilidad muscular en ratones VEGFm/m no fue debida a oxigenación alterada ni a niveles reducidos de la hemoglobina portadora de O2 (perfil hematológico normal). Además, la determinación ecocardiográfica del acortamiento de fibras circunferenciales (VCF, una medida de la contractilidad) reveló que los ratones VEGFm/m tenían función cardíaca normal durante las condiciones iniciales (15 ± 2 en ratones VEGF+/+ frente a 17 ± 3 en ratones VEGFm/m; p=NS) y después del estrés a dobutamina (27 ± 6 en ratones VEGF+/+ frente a 26 ± 6 en ratones VEGFm/m; p=NS). No hubo desequilibrio metabólico en ratones mutantes (electrolitos normales; niveles de glucosa en plasma: 200 ±10 mg/dl en ratones VEGF+/+ frente a 180 ± 16 en ratones VEGFm/m, n=7; p=NS).

[0044] Después de la exposición a hipoxia (10% de O2; 24 h), las neuronas motoras en ambos genotipos se tiñeron comparablemente para el marcador de hipoxia pimonidazol. La debilidad muscular en ratones VEGFm/m no fue debida a oxigenación alterada, anemia, desequilibrio metabólico, disfunción cardíaca o a desarrollo vascular anormal en otros órganos. En conjunto, no hubo signos de insuficiencia vascular o isquemia en ratones VEGFm/m.

8. Expresión de VEGF y neuropilina 1 en la médula espinal

[0045] La exposición de ratones VEGF+/+ a hipoxia (10% de O2; 24 h) reguló por incremento la expresión de VEGF en la médula espinal (pg/mg de proteína: 15 ± 1 en normoxia frente a 94 ± 20 en hipoxia; n=7, p<0,05), pero sólo mínimamente en ratones VEGFm/m (pg/mg de proteína: 9 ± 2 en normoxia frente a 15 ± 2 en hipoxia; n=7; p=0,06). La inducción hipóxica de LDH-A (otro gen inducible por hipoxia) en médulas espinales de VEGFm/m no fue abolida (LDH-A/103 copias de ARNm de hprt: 230 ± 100 durante normoxia frente a 1100 ± 400 durante hipoxia; n=7; p<0,05), confirmando la especificidad de la elección como diana del gen. Se obtuvieron resultados similares en el cerebro. A diferencia, los niveles de VEGF se redujeron en músculo esquelético después de hipoxia (pg/mg de proteína: 40 ± 10 en normoxia y 22 ± 9 en hipoxia en ratones VEGF+/+, n=7, p<0,05 frente a 52 ± 6 en normoxia y 23 ± 4 en hipoxia en ratones VEGFm/m, n=7; p<0,05), de acuerdo con observaciones previas de que la expresión de VEGF en respuesta a hipoxia es específica de tejido 39.

9. Función neurotrófica de VEGF y neuropilina 1

[0046] La apoptosis de células neuronales participa en varios trastornos neurodegenerativos que incluyen ELA

24,33

. Una posible función neuroprotectora de VEGF, independientemente de su efecto angiogénico, se estudió usando células NSC34, una línea celular de neuronas motoras murinas 40, en respuesta a diversos estímulos apoptósicos. Los factores de supervivencia de neuronas motoras conocidos (bFGF 41, TGFß-1 42) protegieron a las células NSC34 contra apoptosis inducida por TNF-a (Fig. 2a). Las concentraciones fisiológicas de VEGF165 también protegieron a las neuronas motoras contra apoptosis inducida por TNF-a, hipoxia, estrés oxidativo (H2O2) y privación de suero. Notablemente, VEGF121 (que no se une a NP-1 10) no rescató neuronas motoras. La implicación de NP-1 se demostró por la neutralización parcial del efecto de supervivencia de VEGF165 por anticuerpos, bloqueándose NP1, pero no por anticuerpos que bloquean NP-2. El efecto neurotrófico de VEGF165 también se bloqueó parcialmente por anticuerpos para VEGFR-2, pero no para VEGFR-1, mientras que la neutralización completa se logró por la combinación de tanto anticuerpos para VEGR-2 como para NP-1. Se sabe que NP-1 se une a semaforina III/olapsina 1 (Sema3A), que participan en la repulsión y el modelado de prolongaciones sensitivas y motoras en la médula espinal durante el desarrollo 11-15. Se sugirió recientemente que Sema3A promovía la apoptosis de neuronas simpatéticas y cerebelosas 43 y prevenía la regeneración axónica después de la lesión nerviosa en el adulto 44 (y, por tanto, podría implicarse en la retracción de axones y la muerte de neuronas motoras en ratones VEGFm/m). La exposición de ratones naturales a hipoxia (10% de O2; 24 h) aumentó ligeramente la expresión de Sema3A en la médula espinal. Las neuronas motoras SCN34 también expresaron Sema3A. Por tanto, las neuronas motoras expresan tanto un factor neuroprotector (VEGF165), además de un factor neurorepulsivo/apoptósico (Sema3A), que son antagonistas recíprocos para la unión a NP-1.

10. Perfusión neuronal anormal en ratones VEGFm/m

[0047] Los inventores examinaron si la debilidad muscular y la neuropatía se produjeron por insuficiencia vascular. En músculo esquelético de VEGFm/m sólo podría detectarse una reducción en el tamaño de la luz del capilar, pero las mediciones de la presión parcial del oxígeno microvascular revelaron que los capilares más pequeños no produjeron isquemia muscular. Y, lo que es más importante, la relación de capilar con respecto a músculo fue normal cuando se desarrollaron los primeros signos de atrofia muscular neurogénica, que muestra que la angiogénesis alterada no fue la causa de degeneración de neuronas motoras. En su lugar, la ligera disminución de esta relación en ratones VEGFm/m ancianos con atrofia muscular grave de más de 7 meses puede ser el resultado de desnervación muscular, como se observa en pacientes con atrofia muscular por desnervación (Carpenter y col. (1982) Muscle Nerve 5, 250). Además, el marcado de PCNA fracasó en detectar diferencias genotípicas en la proliferación endotelial en músculo esquelético a todas las edades y la fluoroangiografía (Schratzberger P. y col. (2000) Nat Med 6, 405) del diafragma reveló vascularización comparable en ambos genotipos. No pudieron detectarse defectos vasculares estructurales obvios en tejido neuronal pero, sorprendentemente, la perfusión neuronal se redujo el 50% en ratones VEGFm/m. En nervios ciáticos, ambos genotipos tuvieron una densidad comparable de vasos de los nervios (capilares/mm2: 90 ± 6 en ratones VEGF+/+ frente a 100 ± 7 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS) y patrón de vasos peri- y endoneurales sin signos de falta de estanqueidad u obstrucción (fluoroangiografía). En la médula espinal, las densidades capilares fueron comparables en ambos genotipos en la materia gris (capilares/mm2: 380 ± 17 en ratones VEGF+/+ frente a 390 ± 13 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS) y en la materia blanca (capilares/mm2: 170 ± 12 en ratones VEGF+/+ frente a 170 ± 11 en ratones VEGFm/m; n=7; p=NS), con densidades similares en astas ventrales y dorsales. Las células endoteliales en ratones VEGFm/m expresaron características de barrera hematoencefálica (transportador de glucosa de tipo I; Glut-1), pero no se detectaron signos ultraestructurales de microangiopatía diabética (Boulton A.J. y col. (1998) Med Clin North Am 82, 909). Debido a la falta de accesibilidad y al pequeño tamaño de la médula espinal, la circulación sanguínea se cuantificó en el cerebro usando microesferas. La circulación sanguínea cerebral inicial fue 0,9 ± 0,1 ml/min/g en ratones VEGF+/+ frente a 0,5 ± 0,1 en ratones VEGFm/m (n=8; p<0,05). Sin embargo, los ratones VEGFm/m todavía pudieron aumentar su circulación sanguínea cerebral en respuesta a hipercapnia (7,5% de CO2), como se mide usando láser Doppler (aumento en % del flujo: 43 ± 3 % en ratones VEGF+/+ frente a 39 ± 6 % en ratones VEGFm/m; n=10; p=NS). Pareció que el déficit de perfusión neuronal era específico, ya que la perfusión renal era normal en ratones VEGFm/m (1,5 ± 0,2 ml/min/g en ratones VEGF+/+ frente a 1,8 ± 0,3 en ratones VEGFm/m; n=8; p=NS). Debe ser evidente que los signos característicos de neuropatía diabética (hialinización de microvasos endoneurales, engrosamiento de la membrana basal capilar, retirada de pericitos, obstrucción de la luz debido a hiperplasia/hipertrofia endotelial, neovascularización, infarto de nervios) no se detectaron en ratones VEGFm/m. Además, la debilidad muscular en ratones VEGFm/m no fue debida a oxigenación alterada ni a niveles reducidos de la hemoglobina portadora de O2 (perfil hematológico normal). Además, la determinación ecocardiográfica del acortamiento de fibras circunferenciales (VCF, una medida de la contractilidad) reveló que los ratones VEGFm/m tenían función cardíaca normal durante las condiciones iniciales (15 ± 2 en ratones VEGF+/+ frente a 17 ± 3 en ratones VEGFm/m; p=NS) y después del estrés a dobutamina (27 ± 6 en ratones VEGF+/+ frente a 26 ± 6 en ratones VEGFm/m; p=NS). Tampoco hubo desequilibrio metabólico en ratones mutantes (electrolitos normales; niveles de glucosa en plasma: 200 ± 10 mg/dl en ratones VEGF+/+ frente a 180 ± 16 en ratones VEGFm/m, n=7; p=NS). En conclusión, la debilidad muscular y la neuropatía en ratones VEGFm/m no fueron debidas a niveles de saturación de oxígeno reducidos en la sangre, anemia, desequilibrio metabólico o disfunción cardíaca.

Materiales y procedimientos

1. Generación de ratones VEGFm/m

[0048] El gen VEGF murino (129/SvJ; Genome Systems Inc., St. Louis, Missouri) se aisló y se mapeó previamente

26. La deleción del sitio de unión a HIF-1alfa en el promotor del VEGF se logró construyendo un vector que elige diana, pBSK.VEGFm, en que el elemento de respuesta a HIF-1alfa (HRE) de TACGTGGG natural estaba delecionado, que abole la unión a HIF-1alfa 23. Este vector contuvo un casete de neomicina fosfotransferasa (neo), flanqueado por los sitios loxP para permitir la posterior eliminación de la recombinasa Cre (Fig. 1a). Después de la electroporación de pBSK.VEGFm, los clones de células ES recombinados, que contienen tanto la deleción del sitio de unión a HIF-1alfa como el casete neo flanqueado por lox P (VEGF+/neo), se identificaron por análisis de transferencia Southern y secuenciación (Fig. 1a). Las células ES de VEGFneo/neo se obtuvieron cultivando células ES de VEGF+/neo en alta selección en G418 (1800 μg/ml) y se usaron para obtener células ES de VEGFm/m por expresión transitoria de la recombinasa Cre. Las sondas para el análisis de transferencia Southern incluyeron: sonda A (0,7 kb del fragmento Pst1/BstEII) y sonda B (fragmento de PCR de 1 kb, amplificado a partir de ADN genómico usando como cebador directo 5'-TTA TCA GAA TTC ATT CCC GAG GCC TGG GGA GAG TTG GG-3' y como cebador inverso 5'-ATA AAG AAT TCG GAA GGT CAC AGC CCT TCG GTG G-3'). Se indican los digestos de restricción analíticos usados para la identificación de clones de células ES recombinantes. Los clones de ES de VEGF+/neo elegidos como diana se usaron para generar ratones quiméricos mediante la agregación de mórulas, que para la prueba se criaron con hembras Swiss para la transmisión de la línea germinal. No se obtuvieron crías VEGF+/neo viables, supuestamente debido a la presencia de la expresión génica de VEGF inactivada por el gen neo y se produjo letalidad haploinsuficiente. Sin embargo, cuando los ratones quiméricos se entrecruzaron con ratones pgk:Cre se obtuvieron crías VEGF+/m, que se entrecruzaron para obtener crías VEGFm/m homocigóticas. Todos los procedimientos de cultivo de ES, selección y agregación diploide se han descrito 26.

2. Expresión génica, morfología, pruebas de rendimiento motor, par de torsión y electromiografía

[0049] La transferencia Western y Northern, la RT-PCR en tiempo real cuantitativa, la histología, la microscopía electrónica, la inmunotinción, sola o en combinación con hibridación in situ, y el análisis morfométrico se realizaron como se ha descrito previamente 4,26,56. Los siguientes anticuerpos se usaron para inmunotinción: Glut-1 (C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA), VEGF (Santa Cruz), desmina (D33; Dako S/A, Glostrup, Dinamarca), ChAT (AB144; Chemicon, Biognost, Wevelgem), NF (SM32; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, Mariland), NFP (SMI 31; Sternberger Monoclonals Inc.), calretinina (Swant, Bellinzon, Suiza), MAP2 (Sigma, Bornem, Bélgica), GFAP (Z0334; Dako S/A), ubicuitina (Z0458; Dako S/A), sinaptofisina (A0010; Dako S/A), F4/80 (A3-1; Serotec Ltd, Oxford, RU), clorhidrato de pimonidazol (Hypoxyprobe-1; Natural Pharmacia International Inc., Belmont, MD), BrdU (Beckton Dickinson, Bruselas, Bélgica). La tinción histoquímica (la ATPasa miosina, Nissl, Bielschowski) se realizó usando protocolos convencionales. Todas las tinciones se realizaron en secciones de 7 μm de espesor, excepto para ChAT (40 μm), Nissl (15 μm) y la ATPasa miosina (15 μm). El análisis por RT-PCR en tiempo real cuantitativa se realizó como se ha descrito previamente 56. Los niveles relativos de expresión de estos genes se calcularon dividiendo sus señales entre las señales obtenidas para el gen HPRT.

[0050] Las pruebas de coordinación motora y de rendimiento muscular (prueba de la huella, prueba de colgar, prueba de agarre, prueba del eje giratorio) 29, los registros electromiográficos en ratones anestesiados 58 y los análisis ecocardiográficos 56 se realizaron como se ha descrito. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el comité de ética. Para la fluoroangiografía 6, 500 μl de 5% de dextrano fluorescente (peso molecular de 2x106 dalton; Sigma) se inyectaron intravenosamente en ratones anestesiados con uretano. Después de 5 minutos, los ratones fueron perfundidos con 1,9 ml de dextrano fluorescente y 100 μl de Adenocor (Sanofi Pharma, Bruselas, Bélgica), y los nervios ciáticos se analizaron inmediatamente por microscopía confocal. Las mediciones por láser Doppler de la circulación sanguínea (unidades de perfusión de sangre) a través de los nervios ciáticos se realizaron en ratones anestesiados usando una sonda de flujo con aguja (ADInstruments Pty Ltd, Castle Hill, Australia) a intervalos de 1 mm a través de un segmento de nervio de 5 mm. Los análisis de gases en sangre, química clínica y perfil hematológico se realizaron usando técnicas convencionales en el hospital universitario (Lovaina, Bélgica).

3. Cultivo celular y análisis de supervivencia

[0051] Se cultivaron células SCN-34 como se ha descrito 40. Los anticuerpos de bloqueo para NP-1 y NP-2 fueron una donación del Dr. A. Kolodkin y los anticuerpos para VEGFR-2 (DC101) del Dr. P. Bohlen, (Imclone). Para los estudios de apoptosis, las células SCN-34 se cultivaron en matraces T75 recubiertos con 0,1% de gelatina en medio RPMI 1640 que contenía 10% de suero bovino fetal (Life Technologies, Paisley, RU), 100 UI/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, heparina (100 μg/ml) y complemento del crecimiento de células endoteliales (30 μg/ml). La apoptosis se indujo por complementación de TNF-alfa (50 ng/ml; R&D, Abingdon, RU), retirada de factores de crecimiento (0,1% o 0,5% de suero bovino fetal) o tratamiento con hipoxia (2% de O2) o 2% de H2O2. VEGF121 y VEGF165 fueron de R&D. La apoptosis se cuantificó midiendo fragmentos de ADN asociados a histonas citoplásmicas (mono- y oligonucleosomas) usando un inmunoensayo enzimático fotométrico (Cell Detection ELISA, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). La determinación de los niveles de VEGF se realizó usando ELISA comercialmente disponibles (R&D).

REFERENCIAS

[0052]

1.: Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 6, 389-395 (2000).

2.: Ferrara, N. & Alitalo, K. Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nat Med 5, 1359-1364 (1999).

3.: van Bruggen, N. y col. VEGF antagonism reduces edema formation and tissue damage after ischemia/reperfusion injury in the mouse brain. J Clin Invest 104, 1613-1620 (1999).

4.: Plate, K.H., Beck, H., Danner, S., Allegrini, P.R. & Wiessner, C. Cell type specific upregulation of vascular endothelial growth factor in an MCA-occlusion model of cerebral infarct. J Neuropathol Exp Neurol 58, 654-666 (1999).

5.: Hayashi, T. y col. Expression of angiogenic factors in rabbit spinal cord after transient ischaemia. Neuropathol Appl Neurobiol 25, 63-71 (1999).

6.: Schratzberger, P. y col. Favorable effect of VEGF gene transfer on ischemic peripheral neuropathy. Nat Med 6, 405-413 (2000).

7.: Sondell, M., Lundborg, G. & Kanje, M. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system. J Neurosci 19, 5731-5740 (1999).

8.: Sondell, M., Lundborg, G. & Kanje, M. Vascular endothelial growth factor stimulates schwann cell invasion and neovascularization of acellular nerve grafts. Brain Res 846, 219-228 (1999).

9.: Miao, H.Q. y col. Neuropilin-1 mediates collapsin-1/semaphorin III inhibition of endothelial cell motility: functional competition of collapsin-1 and vascular endothelial growth factor-165. J Cell Biol 146, 233-242 (1999).

10.: Soker, S., Takashima, S., Miao, H.Q., Neufeld, G. & Klagsbrun, M. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform- specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 92, 735-745 (1998).

11.: Fujisawa, H. & Kitsukawa, T. Receptors for collapsin/semaphorins. Curr Opin Neurobiol 8, 587-592 (1998).

12.: He, Z. & Tessier-Lavigne, M. Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent Semaphorin III. Cell 90, 739-751 (1997).

13.: Yu, H.H. & Kolodkin, A.L. Semaphorin signaling: a little less per-plexin. Neuron 22, 11-14 (1999).

14.: Raper, J.A. Semaphorins and their receptors in vertebrates and invertebrates. Curr Opin Neurobiol 10, 88-94 (2000).

15.: Varela-Echavarria, A., Tucker, A., Puschel, A.W. & Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron 18, 193-207 (1997).

16.: Knight, J.A. Reactive oxygen species and the neurodegenerative disorders. Ann Clin Lab Sci 27, 11-25 (1997).

17.: Bromberg, M.B. Pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis: a critical review. Curr Opin Neurol 12, 581-588 (1999).

18.: Robberecht, W.L. & de Jong, J.M.B.V. Oxidative stress in amyotrophic lateral sclerosis: pathogenic mechanism or epiphenomenon? in Amyotrophic Lateral Sclerosis. (eds. Brown, R.H.J., Meininger, V. & Swash, M.) 211-222 (Martin Dunitz Ltd., London, 2000).

19.: Green, S.L. & Tolwani, R.J. Animal models for motor neuron disease. Lab Anim Sci 49, 480-487 (1999).

20.: Beal, M.F. y col. Increased 3-nitrotyrosine in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis [see comments]. Ann Neurol 42, 644-654 (1997).

21.: Ferrante, R.J. y col. Evidence of increased oxidative damage in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 69, 2064-2074 (1997).

22.: Dor, Y. & Keshet, E. Ischemia-driven angiogenesis. Trends Cardiovasc Med 7, 289-294 (1997).

23.: Semenza, G.L. Expression of hypoxia-inducible factor 1: mechanisms and consequences. Biochem Pharmacol 59, 47-53 (2000).

24.: Kilpatrick, T.J. & Soilu-Hanninen, M. Molecular mechanisms regulating motor neuron development and degeneration. Mol Neurobiol 19, 205-228 (1999).

25.: Pettmann, B. & Henderson, C.E. Neuronal cell death. Neuron 20, 633-647 (1998).

26.: Carmeliet, P. y col. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single vascular endothelial growth factor allele. Nature 380, 435-439 (1996).

27.: Schultz, A. y col. Interindividual heterogeneity in the hypoxic regulation of VEGF: significance for the development of the coronary artery collateral circulation. Circulation 100, 547-552 (1999).

28.: Carmeliet, P. y col. Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis. Nature 394, 485-490 (1998).

29.: Tilson, H.A. & Mitchell, C.L. Neurobehavioral techniques to assess the effects of chemicals on the nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol 24, 425-450 (1984).

30.: Hamelmann, E. y col. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am J Respir Crit Care Med 156, 766-775 (1997).

31.: Lee, M.K. & Cleveland, D.W. Neuronal intermediate filaments. Annu Rev Neurosci 19, 187-217 (1996).

32.: Dal Canto, M.C. & Gurney, M.E. Development of central nervous system pathology in a murine transgenic model of human amyotrophic lateral sclerosis. Am J Pathol 145, 1271-1279 (1994).

33.: Martin, L.J., Price, A.C., Kaiser, A., Shaikh, A.Y. & Liu, Z. Mechanisms for neuronal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis and in models of motor neuron death. Int J Mol Med 5, 3-13 (2000).

34.: Bernstein, M. & Lichtman, J.W. Axonal atrophy: the retraction reaction. Curr Opin Neurobiol 9, 364370 (1999).

35.: Lowe, J., Mayer, R.J. & Landon, M. Ubiquitin in neurodegenerative diseases. Brain Pathol 3, 55-65 (1993).

36.: Kawamura, Y., Okazaki, H., O'Brien, P.C. & Dych, P.J. Lumbar motoneurons of man: I) number and diameter histogram of alpha and gamma axons of ventral root. J Neuropathol Exp Neurol 36, 853860 (1977).

37.: Mackenzie, M.L. & Allt, G. The vasa nervorum: microcorrosion casts for scanning electron microscopy. Acta Anat 136, 319-324 (1989).

38.: Boulton, A.J. & Malik, R.A. Diabetic neuropathy. Med Clin North Am 82, 909-929 (1998).

39.: Marti, H.H. & Risau, W. Systemic hypoxia changes the organ-specific distribution of vascular endothelial growth factor and its receptors. Proc Natl Acad Sci USA 95, 15809-15814 (1998).

40.: Cashman, N.R. y col. Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons. Dev Dyn 194, 209-221 (1992).

41.: Grothe, C. & Wewetzer, K. Fibroblast growth factor and its implications for developing and regenerating neurons. Int J Dev Biol 40, 403-410 (1996).

42.: Iwasaki, Y., Shiojima, T., Tagaya, N., Kobayashi, T. & Kinoshita, M. Effect of transforming growth factor beta 1 on spinal motor neurons after axotomy. J Neurol Sci 147, 9-12 (1997).

43.: Shirvan, A. y col. Semaphorins as mediators of neuronal apoptosis. J Neurochem 73, 961-971 (1999).

44.: Pasterkamp, R.J., Giger, R.J. & Verhaagen, J. Regulation of semaphorin III/collapsin-1 gene expression during peripheral nerve regeneration. Exp Neurol 153, 313-327 (1998).

45.: Gerber, H.P. y col. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126, 1149-1159 (1999).

46.: Benjamin, L.E., Hemo, I. & Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF- B and VEGF. Development 125, 1591-1598 (1998).

47.: Dyck, P.J. & Giannini, C. Pathologic alterations in the diabetic neuropathies of humans: a review. J Neuropathol Exp Neurol 55, 1181-1193 (1996).

48.: Nohl, H., Staniek, K. & Gille, L. Imbalance of oxygen activation and energy metabolism as a consequence or mediator of aging. Exp Gerontol 32, 485-500 (1997).

49.: Copin, J.C. y col. Oxygen deprivation but not a combination of oxygen, glucose, and serum deprivation induces DNA degradation in mouse cortical neurons in vitro: attenuation by transgenic overexpression of CuZn-superoxide dismutase. J Neurotrauma 13, 233-244 (1996).

50.: Ochiai-Kanai, R., Hasegawa, K., Takeuchi, Y., Yoshioka, H. & Sawada, T. Immunohistochemical nitrotyrosine distribution in neonatal rat cerebrocortical slices during and after hypoxia. Brain Res 847, 59-70 (1999).

51.: Hellwig-Burgel, T., Rutkowski, K., Metzen, E., Fandrey, J. & Jelkmann, W. Interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha stimulate DNA binding of hypoxia-inducible factor-1. Blood 94, 1561-1567 (1999).

52.: Yun, J.K., McCormick, T.S., Judware, R. & Lapetina, E.G. Cellular adaptive responses to low oxygen tension: apoptosis and resistance. Neurochem Res 22, 517-521 (1997).

53.: Lorez, H., Keller, F., Ruess, G. & Otten, U. Nerve growth factor increases in adult rat brain after hypoxic injury. Neurosci Lett 98, 339-344 (1989).

54.: Klempt, N.D. y col. Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor beta 1 mRNA in the infant rat brain. Brain Res Mol Brain Res 13, 93-101 (1992).

55.: Takahashi, T. y col. Plexin-neuropilin-1 complexes form functional semaphorin-3A receptors. Cell 99, 59-69 (1999).

56.: Carmeliet, P. y col. Impaired myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188. Nat Med 5, 495-502 (1999).

57.: Gorselink, M. y col. Accurate measurements of in situ isometric contractile properties of hind limb plantar and dorsal flexor muscle complex of intact mice. Eur. J. Physiol. 439, 665-670 (2000).

58.: Kennel, P.F. y col. Electromyographical and motor performance studies in the pmn mouse model of neurodegenerative disease. Neurobiol Dis 3, 137-147 (1996).

59.: de Lima, A.D., Merten, M.D. & Voigt, T. Neuritic differentiation and synaptogenesis in serum-free neuronal cultures of the rat cerebral cortex. J Comp Neurol 382, 230-246 (1997).

60.: de Hoop, M.J., Meyn, L. & Dotti, C.G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal brain. Cell Biology: a laboratory handbook. Vol. 1 154-163 (Academic Press, 1998).

LISTA DE SECUENCIAS

[0053]

<110> Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnol

<120> USO DE VEGF Y HOMÓLOGOS PARA TRATAR TRASTORNOS NEURONALES

<130> PCA/NEU/V056

<140>

<141>

<150> 00201325.8

<151> 04/12/2000

<160> 2

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador directo

<400> 1 5 ttatcagaat tcattcccga ggcctgggga gagttggg 38

<210> 2

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador inverso

<400> 2 ataaagaatt cggaaggtca cagcccttcg gtgg 34

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de VEGF165 para la preparación de un medicamento para tratar cualquiera de demencia del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y enfermedades de neurona motora.
2.

Uso según la reivindicación 1, en el que dichas enfermedades de neurona motora son esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades similares a esclerosis lateral amiotrófica.
3.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho VEGF165 contiene una deleción, adición y/o sustitución conservativa que no cambia las propiedades funcionales de VEGF165 según la reivindicación 1 ó 2.
4.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho VEGF165 se administra como un ácido nucleico que codifica VEGF165.
5.

Uso según la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico está contenido en un vector de expresión apropiado.
6.

Uso según la reivindicación 5, en el que dicho vector es un plásmido, un vector adenovírico, un vector adenovírico modificado, un vector retrovírico o un liposoma.
7.

Uso según las reivindicaciones 1-6, en el que dicho VEGF165 se administra mediante una vía parenteral.
8.

Uso según la reivindicación 7, en el que dicha vía parenteral es intratecal.
9.

Uso de neuropilina 1 y el receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) para identificar moléculas que estimulan la supervivencia de neuronas o que inhiben la muerte de neuronas inducida por semaforina 3A que comprende:

-

poner en contacto neuropilina 1 y VEGFR-2 con al menos una de dichas moléculas, y

-

determinar la interacción entre dichas moléculas con neuropilina 1 y VEGFR-2 mediante la detección de la formación de un complejo entre neuropilina 1 y VEGFR-2 y la molécula candidata.
10.

Un animal no humano que tiene una deleción del elemento de respuesta a hipoxia en el promotor del VEGF.
11.

Un animal según la reivindicación 10, en el que dicho animal es un roedor.
12.

Uso de polimorfismos en el promotor de VEGF en la preparación de una composición de diagnóstico para identificar pacientes en riesgo de desarrollar una neuropatía cuando se exponen a breves periodos de isquemia que comprende barrer la región de HRE de dicho promotor del VEGF de dicho paciente con el fin de detectar polimorfismos.
13.

Uso de polimorfismos del elemento de respuesta a hipoxia (HRE) en el promotor del VEGF para la preparación de una composición de diagnóstico para identificar pacientes en riesgo de desarrollar una neuropatía.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción