PT1272208E - Utilização de fcev 165 e homólogos para tratar distúrbios dos neurónios - Google Patents

Claims (60)

1. DESCRIÇÃO UTILIZAÇÃO DE FCEV 165 E HOMÓLOGOS PARA TRATAR DISTÚRBIOS DOS NEURÓNIOS Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto uma disfunção neurológica e fisiológica associada a distúrbios dos neurónios. Em particular, a presente invenção tem por objecto o envolvimento do factor de crescimento endotelial vascular 165 (FCEV165) e dos seus homólogos na etiologia de distúrbios dos neurónios motores. A presente invenção ainda tem por objecto um novo murganho transgénico mutante (FCEVm/m) com uma eliminação homozigótica no elemento sensível a hipóxia (HRE) do promotor de FCEV que altera a estimulação hipóxica do FCEV. Estes murganhos sofrem, em adultos, com o aparecimento de uma grave fraqueza muscular devida a uma degeneração progressiva dos neurónios motores da medula que é reminiscente da esclerose lateral amiotrófica (ELA) - uma doença fatal com etiologia desconhecida. Além disso, a neuropatia destes murganhos não é causada por defeitos vasculares, mas é devida a defeitos dos sinais de sobrevivência referentes aos neurónios motores, mediados pelo FCEV. A presente invenção tem por objecto, em particular, a isoforma FCEV165 que estimula a sobrevivência dos neurónios motores, por via da ligação a neuropilina-1, um receptor conhecido por se ligar a semaforina-3A que está implicada na retracção axónica e na morte de neurónios e o receptor 2 de FCEV. A presente invenção tem assim por objecto a utilização de FCEV, em particular FCEVi65, no tratamento de distúrbios dos neurónios e tem por objecto, além disso, a utilização de polimorfismos no promotor do FCEV para o diagnóstico destes últimos distúrbios. 1 Antecedentes da invenção 0 FCEV é um elemento chave na formação de novos vasos sanguíneos (angiogénese) durante o desenvolvimento embriónico assim como numa variedade de estados clínicos patológicos 1,2. Embora o FECV estimule principalmente as células endoteliais, pode actuar também noutros tipos de células. Na verdade, o FCEV, o receptor 1 de FCEV (RI de FCEV/Fltl) e o receptor 2 de FCEV (R2 de FCEV/KDR/Flkl) foram implicados, recentemente, em acidentes vasculares 3,4, isquémia da espinal medula 5 e na neuropatia isquémica e na neuropatia diabética 6, WO 0062798. Contudo, estas últimas moléculas actuam predominantemente afectando o crescimento ou a função vascular e não tem sido evidenciado nenhum efeito directo do FCEV, por exemplo, nas células neuronais 11' 12. Além disso, nunca foi validada qualquer relevância, in vivo, desse efeito directo. A isquémia desempenha um papel essencial na patogénese de doenças neurológicas, durante o acidente vascular cerebral agudo e crónico, durante o envelhecimento e em várias doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a doença de Huntington. Os neurónios são particularmente vulneráveis ao stresse oxidativo por radicais livres (gerados durante a isquémia/reperfusão) por causa da sua elevada taxa de consumo de oxigénio, teor abundante de lípidos e relativa escassez de enzimas antioxidantes em comparação com outros órgãos 16. Os danos oxidativos cumulativos devidos a um ganho tóxico da função do superóxido de Cu, Zn - dismutase (S0D1) mutante participam na degeneração dos neurónios motores num certo número de doentes com esclerose lateral amiotrofica (ELA) familiar ' . A ELA afecta 5 a 10 indivíduos por 100.000 pessoas em todo o mundo durante a segunda metade da sua vida, é progressiva, geralmente fatal dentro de 5 anos após o início dos sintomas 2 e intratável 17-19. Noventa a 95 % dos casos são esporádicos. Embora os mecanismos subjacentes à ELA esporádica permaneçam desconhecidos, as evidências sugerem que a lesão oxidativa, similar à causada pelas mutações de S0D1, desempenha um papel patogenico ' ' . Em resposta à hipóxia, as respostas de "sobreviência" são iniciadas, incluindo a produção das hormonas do stresse, a eritropoietina, as enzimas glicoliticas e as moléculas angiogénicas, tal como o FCEV 22'23, os factores indutiveis por hipóxia (FIH) desempenham um papel essencial na mediação desta resposta de retroacção através da ligação a um elemento definido de resposta à hipóxia (ERH) no promotor destes genes 23. A hipóxia é um regulador predominante da expressão do FCEV dado que a indução da expressão do FCEV é rápida (minutos), significativa (> 10 vezes) e sensível a alterações mínimas do oxigénio 22, 23. Surpreendentemente, tem sido prestada pouca atenção ao possível papel da hipóxia e dos FIH na iniciação de mecanismos de sobrevivência de resposta no sistema nervoso. Embora se tenham identificado várias moléculas neurotróf icas 25, poucas evidenciaram ser reguladas por hipóxia. A este respeito, não se sabe ainda se a regulação da hipóxia do FCEV origina neuroprotecção, independentemente da sua actividade angiogénica. Ainda no sistema nervoso, os neurónios motores estão bem definidos, apesar do grupo heterogéneo de células responsáveis pela transmissão da informação do sistema nervoso central para o sistema locomotor. Os neurónios motores da coluna vertebral são especificados por factores solúveis produzidos por estruturas adjacentes à espinal medula principal, sendo a sinalização feita através de proteínas do homeodomínio. O reconhecimento axonal é regulado pelos receptores da superfície celular que interagem com 3 ligandos extracelulares e, uma vez formadas as ligações sinápticas, a sobrevivência do neurónio motor somático depende do fornecimento de factores de crescimento derivados do alvo, embora os factores derivados de não alvos, produzidos quer por astrócitos quer por células de Schwann, estão também potencialmente implicados. A degeneração somática dos neurónios motores leva a uma deficiência profunda e vários mecanismos patogénicos, incluindo a sinalização do factor de crescimento aberrante, a acumulação anormal de neurofilamentos, a excito-toxicidade; a auto-imunidade foi postulada como sendo responsável por isso. Mesmo quando se identificaram déficits específicos, por exemplo, mutações do gene superóxido dismutase-1 na esclerose lateral amiotrófica familiar e expansão da poliglutamina do receptor andrógeno na atrofia muscular espinhal e bulbar, os mecanismos pelos quais ocorre a degeneração somática dos neurónios motores permanecem obscuros. A fim de tratar eficazmente a degeneração do sistema motor, é necessário compreender esses mecanismos mais profundamente. Embora tenha sido demonstrado na técnica que o FCEV tem acções neurotróficas nos gânglios cervicais superiores de murganhos e nos gânglios da raiz dorsal (Sondell M. et al. Journal of Neuroscience, (1999) 19, 5731), não há estudos disponíveis sobre o possível papel do FCEV nos neurónios motores. A presente invenção demonstra que o FCEV tem um papel trófico para os neurónios, em particular para os neurónios motores e revela que a regulação hipóxica defeituosa de FCEV predispõe para a degeneração dos neurónios. Além disso, a presente invenção indica que o FCEV é um agente terapêutico para o tratamento de doenças dos neurónios motores e está relacionado com o uso de polimorfismos no promotor de FCEV para o diagnóstico de distúrbios dos neurónios. 4 Objectivos da invenção A presente invenção tem por objecto providenciar instrumentos de pesquisa, diagnóstico e terapêutica, a fim de melhorar a saúde e o bem-estar dos doentes que sofrem de distúrbios neurais. Em particular, a presente invenção tem por objecto providenciar o uso de FCEV ou dos seus homólogos ou fragmentos, a fim de tratar doentes que sofrem de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença cerebral isquémica crónica, esclerose lateral amiotrófica, doenças degenerativas semelhantes à esclerose lateral amiotrófica e outras degenerativas dos neurónios, em particular distúrbios dos neurónios motores. Mais particularmente, a presente invenção visa proporcionar o uso de FCEV165 para evitar a morte dos neurónios motores da espinhal medula. A presente invenção também tem por objecto proporcionar receptores, como neuropilina-1 e o receptor 2 do factor de crescimento endotelial vascular (R-2FCEV), que se ligam especificamente ao FCEV e que podem ser usados para a triagem de outras moléculas que se ligam a eles. Por outras palavras, a presente invenção tem por objecto proporcionar terapêuticas que estimulam a sobrevivência de neurónios ou que inibem a morte de neurónios induzida, por exemplo por semaforina 3A. A presente invenção também tem por objecto providenciar um animal que se caracteriza por ter uma expressão alterada do FCEV induzida por hipóxia (ou seja, comprometida ou não funcional) comparada com a sua contra-parte de tipo selvagem e que pode ser usado como uma ferramenta de pesquisa para as terapêuticas como as mencionadas antes. A presente invenção visa proporcionar, finalmente, polimorfismos na região promotora de FCEV, como no elemento sensível a hipóxia, que pode ser usado para identificar os indivíduos propensos a desenvolver um 5 transtorno dos neurónios ou para tratar doentes com distúrbios dos neurónios através de terapia por via genética. Legendas das figuras Figura 1: Libertação do gene FCEV e fraqueza muscular em murganhos com o FCEVm/m. A estratégia para eliminar o elemento de ligação de FIH-Ια no promotor de FCEV. Mostra-se o vector de direccionamento de pBSK, FCEVm, o alelo de FCEV de tipo selvagem (FCEVTS) , o alelo de FCEV recombinado de forma homóloga (FCEV1ieo) e o alelo de FCEV" modificado após a excisão de Cre da cassete neo "ensaduichada". As sondas são indicadas por barras a cheio. ERH: 0 elemento de resposta à hipoxia à qual se liga FIH-lalfa; o asterisco e "m" indicam a eliminação de ERH. Figura 2: Papel neurotrófico de FCEV. A, FCEVTS, mas não o FCEV121, protege os neurónios motores SCN34 contra a apoptose (quantificada por oligonucleosomas) induzida por FNT-alfa (50 ng/ml). A actividade de sobrevivência de FCEVi65 é comparável à de FCFb ou FTC-B1. B, FCEVi65 também protege as células SCN34 contra a apoptose induzida por hipóxia, H202 ou privação de soro. *: p < 0,05 versus 0,01 ng/ml de FCEV. C, 0 efeito sobrevivência do FCEVi65 (100 ng/ml) é bloqueado por anticorpos (Aa; 50 pg/ml) contra R-2FCEV (R2) e neuropilina-1 (NP1), mas não contra R-1FCEV (RI), neuropilina-2 (NP2) ou o controlo (CTR) de IgG. A apoptose foi induzida pela falta de soro (0,5 %) . Nenhum dos anticorpos modificou o nivel de base da apoptose na ausência de FCEV. *: p < 0,05 versus a IgG de controlo. 6 Descrição detalhada da invenção A presente invenção mostra que a eliminação do elemento de resposta à hipoxia no promotor de FCEV anular eficazmente a indução da hipóxia de FCEV. Com base no papel bem conhecido do FCEV na angiogénese, previu-se que o FCEVm/m de murganhos sofreria angiogénese mediada por um FCEV deficiente. Os defeitos vasculares, de facto, parecem contribuir para a letalidade de embriões do FCEVm/m mas, surpreendentemente, não há sinais de insuficiência vascular em murganhos com FCEVm/m sobrevivendo nas condições básicas. Além disso, a neuropatia que é verificada em FCEVm/rtl de murganhos adultos também não é devido à insuficiência vascular, devido às seguintes verificações: (i) o número, a diferenciação e a ultra-estrutura das células endoteliais na medula espinhal, nervos periféricos e músculos desses ratos são normais, (ii) a perfusão endoneural é normal, sem sinais de perdas, (iii) a coloração de pimonidazol da espinhal medula após hipóxia é comparável com a de ratos ts; (iv) os enfartes ou microangiopatias, normalmente encontrados em doentes diabéticos com neuropatia isquémica 47, estão ausentes; (v) as lesões axonais não só estão presentes no centro (propenso à isquémia), mas também na periferia dos nervos; (vi) a degeneração dos neurónios motores verifica-se, frequentemente, nas imediações dos capilares normais e (vii) outras causas de isquémia, incluindo insuficiência cardíaca, anemia, ou pulmonar insuficiência estão excluídas. A presente invenção tem assim por objecto um novo modelo de rato transgénico com uma estimulação hipóxica deficiente de FCEV e caracterizada por ter uma predisposição para a degeneração progressiva dos neurónios motores de adultos com características neuropatológicas, uma reminiscência de esclerose lateral amiotrófica. Neste novo modelo de rato a 7 neuropatia não é causada por defeitos vasculares, mas pela escassez dos neurónios motores do efeito neurotrófico do FCEV. Deve ficar claro, porém, que a presente invenção não tem apenas por objecto um novo rato transgénico, mas também engloba qualquer animal transgénico não humano (como um rato, cão, coelho, primatas não humanos, etc.) que se caracteriza por ter uma expressão do FCEV induzida por hipóxia não funcional ou deficiente, em comparação com os seus homólogos de tipo selvagem. A presente invenção tem importantes implicações clinicas. Primeiro, a etiologia genética de doenças degenerativas dos neurónios motores permanece indeterminada. Em menos de 2% dos casos de ELA, as mutações no gene S0D1 estão subjacentes à doença, mas a patogénese dos 98 % restantes permanece desconhecida. As constatações dos requerentes indicam que a regulação - não função - do gene anormal de FCEV constitui um novo factor de risco para a degeneração dos neurónios motores e obriga a uma pesquisa de alterações genéticas que afectam a regulação do gene FCEV. Mesmo em doentes com ELA, com uma mutação S0D1, as diferenças determinadas geneticamente na regulação do gene FCEV podem explicar a variabilidade intrafamiliar fenotipica significativa. Em segundo lugar, não há, até à data, tratamento médico para ELA. Os dados dos requerentes demonstram que o FCEV tem valor terapêutico para doenças do neurónio motor. A disponibilidade de um modelo animal com caracteristicas de ELA familiar (expressão transgénica do mutante S0D1) fornece uma ferramenta de pesquisa essencial. As constatações dos requerentes também indicam que o FCEVi6s protege os neurónios corticais contra N-metil-D-aspartato. Em terceiro lugar, o presente modelo de rato FCEVm/m de degeneração do neurónio motor de adulto reflecte vários aspectos clínicos e neuropatológicos da ELA (atrofia muscular progressivo devido à degeneração dos neurónios motores da coluna vertebral, caracterizada por inclusões neurofilamentos no pericário e edemas axonais 17-19'32-34) . o rato com o FCEVm/m é, portanto, um modelo adequado para avaliação de estratégias terapêuticas. Em quarto lugar, os dados dos requerentes aconselham cautela contra o uso a longo prazo de antagonistas de FCEV (actualmente está a ser ensaiado para tratamento de cancro, diabetes e artrite reumatóide) , já que podem predispor à degeneração dos neurónios motores. A presente invenção também indica que FCEVi65 ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos podem ser usados para o fabrico de um medicamento para o tratamento de distúrbios dos neurónios e, especificamente, para o tratamento de neuronopatias e, mais especificamente, para o tratamento de doenças do neurónio motor e, ainda mais especificamente, para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica e doenças semelhantes a esclerose lateral amiotrófica. Noutra modalidade, o FCEVi65 ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos podem ser usados para o fabrico de um medicamento para evitar a morte de neurónios motores na espinhal medula. Numa modalidade particular, a isoforma FCEVi65 pode ser usada para o tratamento de doenças dos neurónios motores. Por 'distúrbios dos neurónios' entende-se qualquer disfunção fisiológica ou morte de neurónios presentes no sistema nervoso central. Uma lista não limitada desses distúrbios compreende demência, demência do lobo frontotemporal, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doenças do prião, neuronopatias e distúrbios do neurónio motor. As 'neuronopatias' são caracterizadas pela morte celular neuronal dos neurónios motores ou dos neurónios sensoriais e, portanto, as neuronopatias podem ser subdivididas em distúrbios motores e do neurónio sensorial. A doença dos neurónios motores (DNM) ou distúrbios dos neurónios motores é um grupo de doenças 9 (distúrbios) que envolvem a degeneração das células do corno anterior, os nervos no sistema nervoso central que controlam a actividade muscular. Isto leva ao enfraquecimento gradual e, eventualmente, à perda da musculatura (atrofia). As doenças do neurónio motor são classificadas de acordo com o neurónio motor superior (NMS) e/ou o envolvimento do neurónio motor inferior (NMI). Os neurónios motores superiores têm origem no cérebro, em particular, no córtex motor e sinapsam directa ou indirectamente nos neurónios motores inferiores. Os neurónios motores superiores são mais precisos no que se refere aos neurónios pré-motores e são responsáveis por transmitir comandos descendentes ao movimento. Os neurónios motores inferiores são divisíveis em duas categorias: neurónios motores viscerais e somáticos. Os neurónios motores viscerais são neurónios pré-ganglionares autonômicos que regulam a actividade dos neurónios ganglionares, que enervam as glândulas, os vasos sanguíneos e o músculo liso. Os neurónios motores somáticos enervam o músculo esquelético e incluem, em primeiro lugar, as células do corno anterior, que tal como o nome indica, estão localizadas no corno anterior da espinhal medula e, em segundo lugar, os neurónios motores inferiores localizados nos núcleos dos nervos cranianos. A esclerose lateral amiotrófica ou ELA é a forma mais frequente (representando cerca de 80 % de todos os casos) de distúrbios do neurónio motor. A ELA é conhecida como doença de Lou Gehrig, em homenagem ao famoso jogador de beisebol dos Yankee. Os sintomas iniciais de ELA são fraqueza nas mãos e nas pernas e, muitas vezes, fasciculação dos músculos afectados. Sejam quais forem os membros afectados primeiro, tos quatro membros são eventualmente afectados. Os danos nos neurónios motores superiores produzem fraqueza muscular, convulsividade e reflexos hiperactivos nos tendões profundos. Os danos dos neurónios motores inferiores produzem fraqueza muscular com atrofia, fasciculações, flacidez e diminuição 10 dos reflexos dos tendões profundos. A ELA tem caracteristicas tanto dos neurónios motores superiores e inferiores dos nervos cranianos, portanto, os sintomas são isolados na cabeça e no pescoço. Alguns doentes também apresentam um envolvimento dos NMS dos nervos cranianos e, se esta for a única manifestação, é referida como paralisia pseudobulbar. Atrofia muscular espinhal ou a atrofia muscular progressiva é uma DNM que não envolve os nervos cranianos e é devida à degeneração dos neurónios motores inferiores. 0 síndroma de Shy-Drager é caracterizado por hipotensão postural, incontinência, suores, rigidez muscular e tremor e pela perda de neurónios dos núcleos torácicos na espinhal medula onde têm origem as fibras simpáticas. As lesões destrutivas da espinhal medula resultam na perda de células do corno anterior. Isto é visto no mielomeningocélio e na siringomiélia, onde se forma um grande quisto, cheio com líquido, no centro da espinhal medula cervical. A infecção pelo vírus da poliomielite também destrói células do corno anterior. Os tumores da espinhal medula podem danificar localmente as células do corno anterior, quer pelo crescimento dentro da medula (gliomas) ou por compressão da espinhal medula a partir do exterior (meningiomas, neurofibromastoses, carcinoma metastásico, linfomas). As células ganglionares da raiz dorsal podem ser danificadas pelos vírus do herpes simples e pelo vírus do herpes-zoster da varicela. Tais infecções estão associadas com uma erupção vesicular nas regiões da pele fornecidas pelos neurónios. Uma perda semelhante de neurónios sensoriais observa-se na telangiectasia da ataxia, uma doença associada à ataxia cerebral progressiva e telangiectasias simétricas da pele e da conjuntiva. Observa-se a perda neuronal de gânglios autónomos em neuropatias amilóides e na diabetes. 11 Desenvolveu-se um número normal de capilares no músculo-esquelético com o FCEVm/m, mas o tamanho do seu lúmen era reduzido. Independentemente de os capilares menores serem a causa ou a consequência do reduzido crescimento muscular, a oxigenação foi normal e não havia sinais de isquémia em músculo com FCEVm/m, indicando que a perfusão combinava com as necessidades metabólicas das fibras musculares. 0 FCEV é capaz de induzir vasodilatação que poderia resultar em remodelação vascular estrutural (Laitinen M. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 1737) mas os níveis de FCEV no músculo com FCEVm/m normóxico e hipóxico foram normais. Os níveis normais de FCEV e reduzidos de IGF-1 podem sugerir que principalmente foi afectado o crescimento das fibras musculares e não dos vasos. Ao contrário, a perfusão neuronal foi reduzida de 50 % em ratos FCEVm/m, apesar de um número, tamanho e diferenciação normais dos capilares e uma resposta vasorreactiva hipercápnica normal. Por que a perfusão é reduzida nalguns, mas não em outros órgãos nos ratos com FCEVm/m e se esses déficits de perfusão específicos dos órgãos estão relacionados com a variabilidade, ficam por determinar a linha de base e os níveis hipóxicos de FCEV nestes órgãos. Ao contrário do músculo-esquelético, onde o vasculatura se expande quase 10 vezes, a rede neuronal vascular expande menos, mas basicamente remodela-se após o nascimento (Feher G. et al. (1996) Brain Res Dev Brain Res 91, 209). O FCEV tem sido implicado na remodelação do plexo capilar primitivo (mal perfundido) no nascimento com uma vasculatura funcionalmente perfundida no adulto (Ogunshola et al. (2000) Brain Res Dev Brain Res 119, 139). Uma questão intrigante é, portanto, se a redução dos níveis neuronais de FCEV em ratos com FCEVm/m reduz a perfusão neuronal através de uma remodelação vascular insuficiente. Independentemente do mecanismo, a hipoperfusão neuronal em ratos com FCEVm/m pode ter contribuído para o crescimento atrofiado e para a infertilidade, por exemplo, 12 prejudicando a secreção de factores do hipotálamo. Ratos com defeitos do hipotálamo ou da pituitária são mais pequenos e estéreis (Chandrashekar V. et al. (1996) Biol Reprod 54, 1002) . Os níveis reduzidos de IGF-1 no plasma são consistentes com essa hipótese. Enquanto uma redução da perfusão neuronal de 50 % não predispõe ratos FCEVm/m para enfartes neuronais, provavelmente causa isquémia neuronal crónica. Modelos animais de isquémia medular crónica não estão disponíveis, mas a isquémia aguda da espinhal medula provoca degeneração significativa dos neurónios motores (Lang-Lazdunski, L. et al. (2000) Stroke 31, 208). Os déficits de perfusão cerebral induzidos cirurgicamente causam defeitos cognitivos mas aliviam os ratos de disfunção motora e variavelmente causada por sinais histológicos de perda neuronal (Ohta H. et al (1997) Neuroscience 79, 1039) . Contudo, não está disponível um modelo animal de isquémia neuronal crónica espontânea. Assim, numa modalidade específica da presente invenção, providencia-se um modelo de isquémia crónica da espinal medula. O modelo de rato FCEVm/m promete ser proveitoso para estudar as consequências da insuficiência neuro-vascular na função cognitiva e na progressão de doenças neurodegenerativas. Numa modalidade específica da presente invenção fornece-se um modelo para a disfunção cognitiva e, noutra modalidade específica do modelo de rato FCEVm/m é útil para cruzar com modelos actuais de ratos conhecidos na técnica para doenças neurodegenerativas, por exemplo, modelos para a doença de Alzheimer (Bornemann et al. (2000) Ann NY Acad Sei 908, 260, Van Leuven F. (2000) Prog Neurobiol 61, 305, Sommer B. et al. (2000) Rev Neurosci 11, 47). 13 A diminuição do fluxo sanguíneo nervoso no cérebro pode levar a isquémia cerebral. A isquémia cerebral é um processo de morte celular neuronal retardada e não um evento instantâneo. Um fluxo sanguíneo cerebral diminuído inicia uma série de eventos (a "cascata isquémica") que podem levar à destruição celular. 0 objectivo da neuroprotecção é intervir no processo que os neurónios isquémicos sofrem como parte da via final comum de morte celular. A cascata isquémica tem sido intensamente estudada e, embora não tenha sido completamente delineada, certos aspectos reprodutíveis são reconhecidos. A quantidade normal de perfusão na massa cinzenta do cérebro humano é de 60 a 70 mL/100 g de tecido cerebral/min. Quando a perfusão diminui para < 25 mL/100 g/min, o neurónio já não é capaz de manter a respiração aeróbica. As mitocondrias são forçadas a alterar a respiração anaeróbica e geram-se grandes quantidades de ácido láctico. Este subproduto metabólico acumula-se nas regiões extracelulares e provoca uma mudança local no nível do pH. Esta mudança fundamental no ambiente que envolve as células isquémicas foi confirmada em seres humanos por espectroscopia de ressonância magnética e por tomografia computadorizada por emissão de fotão único (TCEFU, em inglês SPECT). Muitos estudos têm-se concentrado no acidente vascular como um modelo da isquémia cerebral. No entanto, observou-se que as reduções crónicas recentes no fluxo sanguíneo cerebral estão associadas ao envelhecimento e a doenças neurodegenerativas progressivas que podem precipitar um défice cognitivo (Bennet et al. (1998) Neuroreport 9, 161). Por exemplo, observam-se anomalias regionais do fluxo sanguíneo cerebral nas regiões frontal e temporal em doentes deprimidos com transtorno cognitivo (Dolan et al. (1992) J Neurol Neurosurg Psychiatry 9, 768, Ritchie et al. (1999) Age Ageing 28, 385). Na doença de Alzheimer (DA), um exemplo de uma doença neuro-degenerativa, um comprometimento isquémico cerebral origina- 14 se no microvasculatura que afecta a libertação ideal de glicose e oxigénio e resulta num colapso das vias metabólicas nas células do cérebro, como nos circuitos de biossintese e sinápticos. Propõe-se que dois factores devem estar presentes antes de disfunção cognitiva e a neurodegeneração é expressa no cérebro com DA, envelhecimento avançado e presença de um estado clinico especifico que diminui ainda mais a perfusão cerebral (de la Torre (1999) Acta Neuropathol 98, 1) . Ainda na DA, o limiar critico da hipoperfusão cerebral é uma auto-prepetuação, insuficiência circulatória contida e progressiva que vão desestabilizar os neurónios, sinapses, neuro-transmissão e função cognitiva, criando, no seu rastro um processo neurodegenerativo caracterizado pela formação de placas senis, emaranhados neurofibrilares e angiopatia amilóide. Cognição refere-se ao processo envolvido em saber ou no acto de saber, que na sua integralidade inclui percepção e julgamento. A cognição inclui qualquer processo mental que possa ser descrito como uma experiência conhecimento, distinguindo-se de uma experiência de sentimento ou de vontade. Inclui, em resumo, todos os processos de consciencialização incluem, em resumo, todos os processos de consciencialização através dos quais se constrói o conhecimento, incluindo percepção, reconhecimento, concepção e raciocínio. A essência da cognição é o julgamento, em que um determinado objecto se distingue de outros objectos e é caracterizado por algum conceito ou conceitos. Distúrbios cognitivos ou disfunção cognitiva são distúrbios no processo mental relacionados com a cognição. Uma visão geral dos transtornos cognitivos (também chamados distúrbios amnésicos) pode ser encontrada no Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV™) (ISBN 0890420629). 15 Numa modalidade especifica pode-se usar o novo modelo de rato FCEVm/m para identificar e/ou para ensaiar moléculas para prevenir e/ou tratar isquémia neuronal ou distúrbios neurodegenerativos e/ou disfunção cognitiva. Noutra modalidade, a presente invenção indica ainda que FCEVies ou os seus homólogos derivados ou fragmentos podem ser usados para o fabrico ou para um medicamento para prevenir e/ou tratar a isquémia neuronal, tal como isquémia cerebral. E ainda outra modalidade, o FCEVi65 ou os seus homólogos derivados ou fragmentos podem ser usados para o fabrico ou para um medicamento para prevenir e/ou tratar disfunção cognitiva. 0 FCEVies está descrito com detalhe em Neufeld G. et al, Faseb Journal, 13, 9-22, 1999, Korpelainen E.I. et al, Curr. Opin. Cell. Biol. 10, 159-164, 1998 em Joukov, V. et al. J. Cell. Physiol 173, 211-215, 1997. Em particular, alguns dos genes FCEV, os seus homólogos, fragmentos e derivados, que são úteis para a prática da presente invenção reivindicada estão descritos em GenBank com os N.os de acesso NM 003376 ("Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA"); e AF 024710 ("Homo sapiens vascular growth factor (VEGFi65) ) sequência de ARNm, 3'UTR, sequência de ARNm") ; os ácidos nucleicos preferidos da presente invenção codificam os polipéptidos do factor de crescimento angiogénico mencionados antes, bem como os seus homólogos e alelos e os fragmentos ou variantes destes elementos funcionalmente equivalentes. Por exemplo, o ácido nucleico do FCEV tem a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido do factor humano de crescimento angiogénico intacto, ou seja, a sequência de codificação completa do gene que codifica um FCEV165 humano; no entanto a presente invenção também abrange a utilização de 16 ácidos nucleicos que codificam fragmentos de um FCEVi65 intacto. A presente invenção também engloba fragmentos equivalentes funcionalmente isolados, variantes e análogos dos ácidos nucleicos precedentes; proteínas e péptidos codificados por qualquer um dos ácidos nucleicos precedentes; e complementos dos ácidos nucleicos precedentes. "Funcionalmente" significa que os fragmentos, variantes e análogos devem ter capacidade para tratar um distúrbio de neurónio e, em particular, distúrbio dos neurónios motores. 0 termo 'derivados' refere-se a qualquer variante, mutante ou composição de péptido de FCEV165, que mantém a capacidade ou pode ser usado para tratar doenças degenerativas de distúrbios dos neurónios motores conforme definido antes. Este último termo também inclui modificações pós-tradução das sequências de aminoácidos de FCEV165, tais como glicosilação, acetilação, fosforilação, modificações com ácidos gordos e similares. Incluídas na definição, estão, por exemplo, sequências de aminoácidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo aminoácidos não naturais), sequências de aminoácidos com ligações substituídas, péptidos contendo pontes de dissulfureto entre resíduos de cisteína, sequências de aminoácidos biotinilados, bem como outras modificações conhecidas na técnica. 0 termo inclui, assim, qualquer proteína ou péptido tendo uma sequência de resíduos de aminoácidos praticamente idêntica a uma sequência específica mostrada aqui em que um ou mais resíduos foram substituídos de maneira conservadora com um resíduo biologicamente equivalente. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo polar (hidrofóbico), tais como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, a substituição de um resíduo polar 17 (hidrofilico) por outro tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparaginas, entre glicina e serina, a substituição de um resíduo básico como lisina, arginina ou histidina por outro ou a substituição de um resíduo ácido, tal como o ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro. A frase "substituição conservadora" também inclui o uso de um resíduo derivado quimicamente no lugar de um resíduo não derivado, desde que a proteína ou o péptido resultantes sejam biologicamente equivalentes à proteína ou ao péptido da presente invenção. 'Derivado químico' refere-se a uma proteína ou um péptido com um ou mais resíduos quimicamente derivados por reacção de um grupo lateral funcional. Exemplos dessas moléculas derivadas incluem mas não se limitam às moléculas em que os grupos amino livres foram derivados para formar cloridratos de amina, grupos p-totueno-suifonilo, grupos carbobenzoxi, t-butiloxi-carbonilo, grupos cloro-acetilo ou grupos formilo. Os grupos carboxilo livres podem ser derivados para formar sais, ésteres metílicos e etílicos ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Grupos hidroxilo livres podem ser derivados para formar derivados de O-acilo ou O-alquilo. 0 azoto imidazólico da histidina pode ser derivado para formar N-imbenzil-histidina. Também incluídos como derivados químicos estão as proteínas ou péptidos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos-padrão. Por exemplo: 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode estar substituído por lisina; a 3-metil-histidina pode estar substituída por histidina; a homo-serina pode estar substituída por serina; e ornitina pode estar substituída por lisina. As proteínas ou os péptidos da presente invenção também incluem qualquer proteína ou péptido tendo um ou mais adições e/ou eliminações ou resíduos em relação à sequência de um péptido, cuja sequência é mostrado aqui, desde que o péptido é seja biologicamente equivalente 18 às proteínas ou aos péptidos da presente invenção. Quando a percentagem de identidade de sequência é usado em referência a polipéptidos (isto é, homólogos), reconhece-se que as posições dos resíduos que não são idênticas, muitas vezes diferem por substituições conservadoras dos aa, em que os resíduos estão substituídos por outros resíduos de aa com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais dos polipéptidos. Quando as sequências diferem em substituições conservadoras, a percentagem da identidade da sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Meios para fazer este ajustamento são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Normalmente, isto envolve a pontuação de uma substituição conservadora como um emparelhamento parcial em vez de um emparelhamento completo, aumentando assim a percentagem de identidade da sequência. Assim, por exemplo (e, conforme descrito na WO 97/31116 para Rybak et al.), em que a um aa idêntico é dada uma pontuação de 1 e a uma substituição não conservadora é atribuída uma pontuação de zero, a uma substituição conservadora é atribuída uma pontuação entre zero e 1. A este respeito, deve ficar claro que os polipéptidos ou as suas partes compreendem uma sequência de aa com pelo menos 55%, de preferência 75%, mais preferivelmente 85 % ou o mais preferível uma identidade de sequência de 90 % com uma sequência de aminoácidos de FCEVi65 ou as suas partes estão dentro do âmbito da presente invenção. Também deve ficar claro que polipéptidos que são imunologicamente reactivos com anticorpos produzidos contra o FCEVies e as suas partes estão dentro do âmbito da presente invenção. A expressão 'fragmentos de FCEV^' refere-se a qualquer fragmento, incluindo qualquer modificação do referido 19 fragmento, tal como descrito antes, que mantém a capacidade ou pode ser usada para tratar distúrbios do neurónio e, em particular distúrbios dos neurónios motores. As expressões 'composição farmacêutica' ou 'medicamento' ou 'utilização para o fabrico de um medicamento para tratar' refere-se a uma composição que compreende FCEV165 ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos, conforme descrito antes e um veiculo ou excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico (ambos as expressões podem ser usadas intermutavelmente) para tratar doenças como indicado antes. Os veículos ou excipientes adequados conhecidos dos especialistas, são solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, óleos não voláteis, oleato de etilo, dextrose a 5 % em soro fisiológico, substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, tampões e conservantes. Outros veículos adequados incluem qualquer veículo que não induza ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos e copolímeros de aminoácidos. 0 'medicamento' pode ser administrado por qualquer método adequado dentro do conhecimento dos especialistas. A via de administração preferida é a parentérica. Na administração parentérica, o medicamento da presente invenção será formulada numa forma injectável de dose unitária tal como uma solução, suspensão ou emulsão, em associação com os excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tal como definido antes. No entanto, a dosagem e o modo de administração dependerá do indivíduo. Geralmente, o medicamento é administrado de forma que a proteína, o polipéptido, o péptido da presente invenção seja administrado numa dose de 1 pg/kg e 10 mg/kg, mais preferencialmente entre 10 pg/kg e 5 mg/kg e o que é mais preferencial entre 0,1 e 2 20 mg/kg. De preferência, é dada como uma dose em bólus. A infusão continua pode também ser utilizada e inclui a libertação continua por via subcutânea continua através de uma minibomba osmótica. Se assim for, o medicamento pode ser administrado por infusão com uma dose entre 5 e 20 pg/kg/minuto, mais preferencialmente entre 7 e 15 pg/kg/minuto. Numa modalidade particularmente preferida, a infusão com uma composição que compreende FCEVi65 ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos é intratecal. A administração intratecal pode ser feita, por exemplo, por meio da implantação cirúrgica de uma bomba e administração à coluna através de um cateter. Deve mencionar-se que a administração intratecal de FCEV ou homólogos, derivados ou fragmentos é um aspecto particularmente importante da presente invenção. Na verdade, uma vez que temos mostrado que o FCEV165 tem um aspecto neurotrófico sobre os neurónios e, mais particularmente, sobre os neurónios motores, a administração intratecal é a via preferida. Isto está em contraste com a WO 0062798 em que a angiogénese terapêutica tem como objectivo tratar neuropatia periférica isquémica. Em vez de libertar FCEVi65 ou um seu homólogo, derivado ou fragmento, como uma proteína, num doente com necessidade de tratamento de um distúrbio dos neurónios ou, mais particularmente, um distúrbio dos neurónios motores, também se pode fazer libertar no paciente um ácido nucleico que codifica FCEVies ou um seu homólogo, derivado ou fragmento. Nesse caso os ácidos nucleicos que codificam FCEVi65 ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos, podem ser acoplados operacionalmente a um promotor que pode expressar o referido factor de crescimento angiogénico numa célula alvo (por exemplo, uma célula endotelial, uma célula nervosa, uma 21 célula muscular, um neurónio, um neurónio motor). Muitas vezes, o ácido nucleico está contido num vector de expressão adequado (por exemplo, plasmido, vector adenoviral, vector adenoviral modificado, vector retroviral, lipossomas) de forma a modificar de forma mais eficiente a célula-alvo e atingir a expressão do referido factor de crescimento angiogénico. Por exemplo, na WO 9831395 a transferência selectiva de genes para neurónios motores está totalmente descrita. Noutra modalidade da presente invenção, mostra-se que a isoforma de FCEVi65, mas não a isoforma de FCEV121, providencia neuroprotecção através de ligação a neuropilina-1 e R-2 de FCEV. Ainda noutra modalidade, FCEV165 ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos podem ser administrados para a prevenção da perda neuronal ou, mais especificamente, da perda de neurónios motores na espinhal medula, por exemplo, em indicações cirúrgicas em que se pode esperar um traumatismo isquémico nos neurónios ou nos neurónios motores. É necessário o inicio das vias neuroprotectoras durante a hipoxia, uma vez que estes neurónios motores vitais pós-mitóticos não podem regenerar-se após um traumatismo hipóxico letal. A este respeito apenas algumas moléculas neuroprotectoras como FCN, FCFb, FTCpi 52-54 têm sido caracterizadas. A presente invenção indica claramente que o FCEVies é um agente neuroprotector potente, como a regulação da sua expressão por hipóxia é rápida (minutos), significativa (> 10 vezes) e sensível a pequenas mudanças no oxigénio. A ausência de respostas neuroprotectoras do FCEV em ratos FCEVm/m, mesmo que possam ocorrer somente transitoriamente, mas repetidamente, pode explicar porque é 22 que os neurónios motores nesses ratos acabam por degenerar após mini-traumatismos sub-letais cumulativos de hipóxia. A neuropilina-1 (NP-1), um receptor para a isoforma de FCEVies 9,10 e para a semaforina 3A (Sema3A) neurorepelente 11-13 tem-se mostrado essencial para orientar as projecções neuronais durante a padronização embrionárias 11-15. No entanto, não se sabe se NP-1 e/ou Sema3A têm qualquer papel na função neuronal após o nascimento. Numa outra modalidade a presente invenção ainda providencia processos para identificar compostos ou moléculas que se ligam ao receptor de neuropilina-1 e R-2 de FCEV e estimulam a sobrevivência de neurónios e, mais particularmente neurónios motores. Na presente invenção, os resultados mostram que FCEVi65, por via da ligação a neuropilina-1 e R-2FCEV, medeia a sobrevivência de neurónios motores NSC34. Ambos os receptores são expressos em neurónios motores na espinhal medula de adultos in vivo e, portanto, acessível a FCEViês, produzido pelo próprio neurónio motor em si ou por outras células vizinhas. A neuropilina-1 e R-2 FCEV actuam como co-receptores na estimulação da motilidade celular endotelial 9,10 e também colaborar na mediação da sobrevivência neuronal. Estes processos são também referidos como 'ensaios de rastreio de fármacos' ou 'bioensaios' e normalmente incluem a etapa de triagem de um composto candidato/de ensaio ou um agente para a capacidade de interagir com (por exemplo, ligarem-se a) neuropilina-1 e R-2 FCEV. Os compostos ou agentes candidatos, que têm esta capacidade, podem ser usados como fármacos para tratar doenças degenerativas. Os compostos candidatos/de ensaio, tais como moléculas pequenas, por exemplo, moléculas pequenas orgânicas e outros candidatos a fármacos podem ser obtidos, por exemplo, de bibliotecas produto combinatórios e naturais. 23 A presente invenção também providencia processos para identificar compostos ou agentes que podem ser usados para tratar neurónios degenerativos. Estes processos são também referidos como 'ensaios de rastreio de fármacos' ou 'bioensaios' e normalmente incluem a etapa de triagem de um composto candidato/de ensaio ou um agente para a capacidade de interagir com (por exemplo, ligarem-se a) neuropilina-1 e R-2 de FCEV. Os compostos ou agentes candidatos/de ensaio, que têm esta capacidade, podem ser usados como fármacos para tratar doenças degenerativas dos neurónios. Os compostos candidatos/de ensaio, tais como moléculas pequenas, por exemplo, moléculas pequenas orgânicas e outros candidatos a fármacos podem ser obtidos, por exemplo, de bibliotecas produto combinatórios e naturais. Numa modalidade, a presente invenção providencia ensaios para rastrear os compostos candidatos/de ensaio que interagem com (por exemplo, ligam-se a) neuropilina-1 e R2 de FCEV. Normalmente, os ensaios são ensaios isentos de células que incluem as etapas de combinação de neuropilina-1 e R2 de FCEV e um composto candidato/de teste, por exemplo, em condições que permitem a interacção de (por exemplo, a ligação de) o composto candidato/de teste com neuropilina-1 e R2 de FCEV para formar um complexo e detectar a formação de um complexo, em que a capacidade do composto candidato para interagir com neuropilina-1 e R2 de FCEV é indicada pela presença do composto candidato no complexo. A formação de complexos entre a neuropilina-1 e o composto candidato pode ser quantificado, por exemplo, usando imunoensaios padrão. A neuropilina-1 utilizada em tal teste pode estar livre em solução, fixa num suporte sólido, fixada na superfície das células ou localizadas intracelularmente. Noutra modalidade, a presente invenção providencia ensaios de rastreio para identificar compostos candidatos/de ensaio que estimulam a neuropilina-1 e R-2 de FCEV ou inibem a ligação de sema3A a neuropilina-1 24 e/ou a R-2 de FCEV. Normalmente, os ensaios são ensaios isentos de células que incluem as etapas de combinação de neuropilina-1 e R2 de FCEV da presente invenção ou os seus fragmentos e um composto candidato/de ensaio, por exemplo, em condições onde não fosse a presença do composto candidato, a neuropilina-1 e R2 de FCEV ou uma porção activa sob o ponto de vista biológico interage (por exemplo, liga-se a) com a molécula-alvo ou o anticorpo e detecta a formação de um complexo que inclui a neuropilina-1 e a molécula-alvo ou o anticorpo ou detecta a interacção/reacção de neuropilina-1 e molécula-alvo ou o anticorpo. A detecção de formação de complexos pode incluir a quantificação directa do complexo. Para realizar os ensaios de rastreio de fármacos descritos antes é viável imobilizar a neuropilina-1 e o R2 de FCEV ou as suas moléculas-alvo para facilitar a separação dos complexos das formas não complexadas de uma ou de ambas as proteínas, bem como para acomodar a automação do ensaio. A interacção (por exemplo, a ligação a) da neuropilina-1 e do R2 de FCEV com uma molécula-alvo pode ser conseguida em qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Exemplos desses recipientes incluem placas de microtitulação, tubos de ensaio e tubos de micro-centrifugadoras. Numa modalidade, pode-se providenciar uma proteína de fusão que acrescenta um domínio que permite que a proteína possa ligar-se a uma matriz. Por exemplo, a neuropilina-l-His marcada pode ser adsorvida em placas de mcirotitulação de Ni-NTA (Paborsky et al. 1996) ou fusões de neuropilinas-l-ProtA adsorvidas em IgG, que se combinam então com os lisados celulares (por exemplo, marcados com 35S) e o composto candidato e a mistura foram incubados em condições propícias à formação de complexos (por exemplo, em condições fisiológicas para sal e pH) . Após a incubação, lavam-se as placas para eliminar qualquer marcador não ligado e a matriz 25 foi imobilizada e determinou-se directamente o marcador de rádio ou então no sobrenadante após a complexos se dissociarem. Alternativamente, os complexos podem ser dissociados da matriz, separados por EGPA-SDS e que o nivel de neuropilina-1 ligada à proteína encontrada na fracção da pérola é quantificado a partir do gel usando técnicas padrão de electroforese. Outras técnicas para imobilizar proteína em matrizes também podem ser usadas nos ensaios de triagem de fármacos da presente invenção. Por exemplo, quer a neuropilina-1 e o R-2 do FCEV quer as suas moléculas-alvo podem ser imobilizados utilizando a conjugação de biotina e estreptavidina. A neuropilina-1 biotinilada e o R-2 de FCEV podem ser preparados a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas bem conhecidas na técnica (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemical, Rockford, III) e imobilizando-as nos poços das placas de 96 poços revestidas com estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, os anticorpos reactivos com neuropilina-1, mas que não interferem com a ligação da proteína à sua molécula-alvo podem ser derivados para os poços da placa e a neuropilin-1 e o R-2 de FCEV ficam retidos nos poços por conjugação dos anticorpos. Tal como descrito antes, faz-se a incubação das preparações de uma proteína de ligação à neuropilina-1 e um composto nos poços da placa que apresentam neuropilina-1 e quantifica-se a quantidade de complexo retida nos poços. Os processos para a detecção de tais complexos, para além dos descritos antes para os complexos imobilizados em, incluem a imunodetecção de complexos utilizando anticorpos reactivos com a molécula-alvo de neuropilina-1 e a molécula-alvo de R2 de FCEV ou que são reactivos com neuropilina-1 e R-2 de FCEV e competem com a molécula-alvo; bem como ensaios ligados a enzimas que se baseiam na detecção de uma actividade enzimática associada à molécula-alvo. Outra técnica para a triagem de fármacos, que providencia uma 26 triagem de alto rendimento de compostos com afinidade de ligação adequada para a neuropilina-1 e o R-2 de FCEV está descrita em detalhe em "Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity" por Geysen HN, WO 84/03564, publicada no 13/09/84. Em resumo, um grande número de compostos de ensaio de péptidos pequenos diferentes é sintetizado num substrato sólido, tal como pinos de plástico ou qualquer outra superfície. Os compostos de ensaio de proteína reagem com fragmentos de neuropilina-1 e/ou R-2 de FCEV e lavam-se. A neuropilina-1 ligada é então detectada por processos conhecidos na técnica. A neuropilina-1 e/ou R-2 de FCEV também podem ser revestidos directamente nas placas para utilização nas técnicas de triagem de fármacos mencionadas antes. Em alternativa, podem utilizar-se anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e imobilizá-lo num suporte sólido. A presente invenção também contempla a utilização de ensaios de triagem de fármacos concorrentes em que anticorpos neutralizantes capazes de se ligarem a neuropilina-1 e/ou a R-2 de FCEV competem especificamente com um composto de ensaio na ligação de neuropilina-1 e/ou de R-2 de FCEV. Desta maneira, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de qualquer proteína, que compartilha um ou mais determinantes antigénicos com neuropilina-1 e R-2 de FCEV. Até agora, nenhuma mutação genética do gene FCEV, resultando na dissociação do gene, foi ligada a doenças humanas, provavelmente por causa da ausência de um único alelo de FCEV que seja embrionariamente letal ^2,26. Recentemente, contudo, a regulação hipóxica deficiente de FCEV tem demonstrado constituir um factor de risco para doença cardíaca isquémicas 27. Embora este regulação anormal do gene FCEV - falta de função - possa predispor para distúrbios patológicos, no entanto, isso não é conhecido. 27 Numa outra modalidade da presente invenção podem detectar-se polimorfismos na região reguladora do gene FCEV, que têm uma influência na regulação hipóxica do referido gene e usá-los para o diagnóstico para identificar doentes em risco de desenvolver uma neuropatia ou, mais especificamente, uma neuropatia motora, quando expostos a breves períodos de isquémia. A transcrição do ARNm do FCEV induzida por hipóxia é mediada, pelo menos em parte, pela ligação do factor 1 indutivel por hipóxia (FIH-1) a um sítio de ligação de HIF-1 localizado no promotor de FCEV. Pela detecção dos polimorfismos que influenciam a regulação hipóxica do gene FCEV também se entende polimorfismos no factor de transcrição de FIH-1, factores adicionais semelhantes a FIH-1, reguladores a montante do FIH-1 e factores de transcrição semelhantes a FIH-1 que compreendem o sensor de oxigénio, factores adicionais de ligação à região não traduzida de 5'e 3' do ARNm do FCEV e no local de entrada ribossómico interno presente na região 5' não traduzida de FCEV (Neufeld G. et al. FASEB J. 13, 9-22, 1999). Desenvolveram-se vários procedimentos para rastrear genes a fim de detectar polimorfismos nos genes. Em termos de uso corrente, muitos dos processos para rastrear ou triar genes utilizam electroforese com placas ou de gel capilar para a etapa de separação e detecção nos ensaios. Alguns destes processos compreendem polimorfismo conformacional de hélice simples (PCHS) (Orita et al., "Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single-Stranded Conformation Polymorphisms," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 2766 (1989)), electroforese em gel com um gradiente de desnaturação (EGGD) (Abrams et al. "Comprehensive Detection of Single Base Changes in Human Genomic DNA Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and a GC Clamp", Genomics 7, 463 (1990)), clivagem química no 28 desemparelhamento (CQD) (JA Saleeba e G. H. Cotton, "Chemical Cleavage of Mismatch to Detect Mutations," Methods in Enzymology 217, 286 (1993)), clivagem enzimática de incompatibilidade (CEI) (R. Youil et al. "Screening for Mutations by Enzyme Mismatch Cleavage with T4 Endonuclease VII," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 87 (1995)) e "cleavase" de polimorfismo de comprimento do fragmento (CFLP). Ainda outros processos focam-se no uso da espectrometria de massa como uma ferramenta de análise genética. A espectrometria de massa requer amostras minuto, fornece informações extremamente detalhadas sobre as moléculas que estão a ser analisadas, incluindo as de alta precisão de massa e é facilmente automatizada. A patente norte-americana 5.965.363 descreve a análise de ácidos nucleicos por meio da análise por espectrometria de massa. Numa outra modalidade da presente invenção, o elemento de resposta à hipóxia (ERH) pode ser usado para o tratamento de distúrbios dos neurónios ou, mais especificamente, distúrbios dos neurónios motores. 0 FCEV ou os seus homólogos, derivados ou fragmentos podem ser colocadas sob o controlo hipóxico por combinação dos referidos genes com um ou mais elementos ERH. Estas estruturas podem ser usadas na terapia de genes. Terapia genética significa o tratamento por meio da libertação de ácidos nucleicos terapêuticos nas células do doente. Isto está extensivamente revisto em Lever e Goodfellow 1995; Br. Med Buli. , 51, 1-242; Culver 1995; Ledley, F.D. 1995. Hum. Gene Ther. 6, 1129. Para alcançar a terapia genética deve haver um processo para a libertação de genes nas células do doente e processos adicionais para garantir a produção eficaz de qualquer gene terapêutico. Existem duas abordagens gerais para conseguir a libertação do 29 gene; trata-se da libertação não virai de genes e a libertação de genes mediada por vírus. 0 sistema de libertação de genes mediado por vírus melhor caracterizado usa retrovírus de replicação defeituosa para introduzir estavelmente genes nas células dos doentes. A presente invenção será agora ilustrado com referência aos exemplos que se seguem que estabelecem modalidades particularmente vantajosas. No entanto, deve notar-se que estas modalidades são ilustrativas e não podem ser interpretadas como restringindo, de alguma forma, a presente invenção. Exemplos 1. Eliminação dirigida do sitio de ligação de FIH no promotor do FCEV A eliminação dirigida no promotor de FCEV do elemento de resposta à hipóxia {ERH) , ou seja, o sítio de ligação para os factores indutíveis de hipóxia (FIH) 23, foi realizada com uma orientação mediada por CrelloxP (fig. 1) e foi confirmada por análise de Southern blot. A indução hipóxia insuficiente de FCEV em células estaminais embrionárias homozigóticas, para a eliminação de ERH (FCEVm/m) , foi confirmada por análise de Northern blot e por medições da libertação de FCEV durante 36 h de hipóxia (19 ± 5 pg/ml após normoxia versus 45 ± 6 pg/ml após hipóxia em células de FCEVm/m, n = 6, p = NS) . A eliminação do sítio de ligação de FIH no gene FCEV foi tão eficaz como a eliminação do próprio gene FIH-la 28 na abolição da estimulação hipóxica de FCEV (13 ± 4 pg/ml após normoxia versus 14 ± 2 pg / ml após hipóxia em células de FIH-lcT/_; n=6; p=NS) . Os embriões de FCEVm/m foram recuperados a uma frequência mendeliana normal. Dos ratos FCEVm/m, 30 % 30 morreram antes do nascimento e outros 30 % nos primeiros dias após o nascimento, enquanto os restantes 40 % sobreviveram mais de 12 meses. Aqui, descreve-se o fenótipo dos ratos VEGFm/m sobreviventes; os fenótipos embrionário e neonatal serão relatados separadamente.
2. 2. Desempenho da coordenação motora e muscular em ratos com FCEV”7” Os ratos FCEVm/m pareceram normais até 4 meses, mas depois desenvolveram sintomas de doença dos neurónios motores. Tornam-se progressivamente menos móveis e exibiram sinais de fraqueza muscular grave e paralisia dos membros. A partir dos seis meses de idade, os ratos mutantes estavam muito fracos para se virarem quando colocados de costas, arrastavam os pés ao caminhar e tinham uma marcha hesitante e escoliose. Quando levantados pelas suas caudas, reflexivamente contraiam os seus membros para o tronco e permaneciam imóveis, enquanto os ratos de tipo selvagem estendem os seus membros e lutam. Os ratos com FCEVm/m desenvolveram uma pele grossa sugestiva de um tratamento insuficiente e apareceu fina ao longo dos flancos e pernas. Nomeadamente, quando se mantiveram ratos com FCEVm/m, com seis meses, assintomáticos, numa câmara de hipóxia (10 % de 02) , eles desenvolveram sinais neurológicos (dificuldade em virarem-se, contractura reflexa quando levantados pela cauda) no prazo de duas semanas, indicando que a hipóxia acelerou marcadamente o aparecimento e a progressão do fenótipo. Para além dos 4 a 6 meses de idade, os ratos com FCEVm/m tiveram significativamente menos ninhadas do que os ratos de tipo selvagem em número de coordenação motora e ensaios de desempenho muscular 29, incluindo o ensaio de andar sem parar, ensaio da rede, ensaio do eixo em rotação e ensaio da pegada (distância entre as plantas centrais das patas 31 versus 45 ± 5 mm traseiras: 65 ± 5 mm para ratos com FCEV+/+ para ratos com VEGFm/m; n=7; p < 0,05) . Comparados com ratos FCEV+/+, os ratos FCEVm/m estavam signif icativamnte menos activos à noite (número de voltas que andam sem parar: 5400 ± 600 para os ratos FCEV+/+ versus 2700 ± 400 para os ratos FCEVm/m; n=7; p < 0,05) e durante períodos mais curtos (minutos de actividade intensa: 150 ± 40 para ratos com FCEV+/+ versus 14 ± 6 para ratos com VEGFm/m; n=7; p < 0,05) . No ensaio da 'rede' (os ratos são colocados numa rede, que é posteriormente virada ao contrário), cinco dos sete ratos FCEV+/+ ficaram pendurados na rede durante pelo menos um minuto. Dois ratos FCEV+/+ movimentaram-se tão activamente que caiu da prateleira, após 23 e 45 segundos. Ao contrário, quatro dos seis ratos FCEV+/+ com 20 semanas de idade caíram para fora da rede após 8 segundos e apenas dois ratos mutantes conseguiram segurar-se à rede mas não se moveram. Ao testar a sua força de preensão (os ratos são forçados a pendurar-se com suas patas dianteiras num segmento horizontal), todos os ratos FCEV+/+ (N = 7) agarram-se imediatamente ao fio com as suas patas traseiras. Em contraste, os ratos FCEVm/m tiveram dificuldades em agarrar-se ao fio com seus membros posteriores, ficaram pendurados imóveis e encurvados. Quando finalmente conseguiram (cinco dos seis ratos), os ratos FCEVm/m não conseguiram segurar-se ao fio e caíram. Os ratos FCEVm/m também tiveram desempenho pior no ensaio do "eixo de rotação", usado para avaliar quanto tempo os ratos poderiam ficar num eixo em rotação antes de caírem: todos, menos um dos ratos FCEV+/+ (n = 8) permaneceram no eixo durante pelo menos dois minutos (tempo de análise), enquanto seis ratos FCEVm/m caíram para fora depois de menos de um minuto (53 ± 20 seg) . O limiar da dor, uma função sensorial medida como a resposta da lambidela da para num teste da placa quente 29 foi normal em ratos FCEVm/m (o tempo para lamber as patas da frente ou traseira de ambos 32 os genótipos foi de7±lsel0±2s, respectivamente; n=6; p=NS) . No entanto, os ratos FCEV+/+ pularam para fora da caixa após 100 ± 2 0 s, enquanto os ratos FCEVra/ra estavam muito fracos para escapar durante este período.
3. 3. Atrofia muscular em ratos FCEV“/m Os músculos esqueléticos em ratos FCEVm/m com mais de 4 meses de idade mostraram sinais de atrofia neurogénica. O peso húmido dos músculos flexores plantares e dorsais foi de 17 0 ± 14 mg e 92 ± 19 mg em ratos FCEV+/+ versus 94 ± 5 mg e 58 ± 18 mg em ratos FCEVm/m (n=3; p < 0,05) . Inicialmente, um número variável de fibras ficaram atróficas, mas em animais mais velhos, a maioria das fibras musculares ficaram severamente atróficas, "anguladas" ou "alongadas", características das fibras denervados. O tamanho da fibra muscular diminuiu mais de 50 % em ratos FCEVm/m (área transversal: 1700 ± 200 pm2 em ratos FCEV+/+ versus 700 ± pm2 em ratos FCEVm/m; n=8; p < 0,05) . A regeneração das fibras musculares, identificada pelos seus núcleos vesiculares, localizados centralmente, com tamanho menor e uma imunorreactividade diminuída, observaram-se normalmente em ratos FCEVm/m. A coloração com miosina ATPase revelou atrofia de todos os tipos de fibras (do tipo-I, -lia, e -Ilb) . Em contraste com o padrão xadrez tipico de todos os tipos de fibras em ratos FCEV+/+, um agrupamento de fibras de um tipo semelhante, observou-se um sinal de re-inervação nos ratos FCEVm/m. Os fusos musculares - envolvidos no controlo do reflexo - estavam presentes em ambos os genótipos (número de secções dos fusos/quadrícepes: 3,9 ± 0,9 em ratos FCEV+/+ versus 4,5 ± 0,8 em ratos FCEVm/m; n=7; p < 0,05) . Não se detectaram alterações miopática (desintegração do sarcolema, necrose das fibras, perda de fibras musculares, elevação dos níveis plasmáticos de creatina cinase ou fibrose) em ratos 33 FCEVm/m. A atrofia muscular em ratos FCEVm/m não se assemelham às caracteristicas degenerativas das miopatias primárias. Na verdade, não houve perda de fibras musculares e, por causa da retracção, a densidade das fibras musculares estava aumentada nos ratos FCEVm/m (1250 ± 190 células/mm2) em comparação com ratos FCEV+/+ (720 ± 80 células/mm2; p < 0,05) . Ao contrário das miopatias, não havia sinais de necrose das fibras, lise do sarcómero ou rompimento da sarcolema (análise ultra-estrutural; titina normal e coloração com desmina; ausência de albumina intracelular), infiltração gordurosa, fibrose (coloração vermelha de sirius), ou calcificação distrófica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase (libertado após a morte do miócito) foram normais em ratos FCEVm/m com 8 meses de idade (88 ± 20 U/ml em ratos FCEV+/+ ver sus 94 ± 9 U/ml em ratos FCEVm/m; n=5; p=NS) . Além disso, a atrofia confinou-se ao músculo cardíaco e não ao músculo esguelético e não foi causado por doenças sistémicas. A atrofia ficou confinada a fibras musculares esqueléticas, dado que os cardiomiócitos não foram afectados (área da secção transversal: 130 ± 10 pm2 em ratos FCEV+/+ versus 125 ± 8 pm2 em ratos FCEVm/m; n=5; p = NS). As mudanças estruturais nas fibras musculares também não foram devidas a doenças infecciosas (relatório de saúde isento de agentes patogénicos), doenças inflamatórias do tecido conjuntivo ou vasos sanguíneos (sem sinais de vasculite), distúrbios metabólicos (níveis normais de glicose no plasma) ou anomalias de armazenagem em glicogénio ou lípidos.
4. 4. Degeneração dos neurónios motores em ratos FCEV^” Obtiveram-se evidências de um processo neuro-degenerativo pela análise da espinhal medula e dos nervos periféricos. A coloração de Nissl revelou um número comparável de neurónios no corno ventral da espinhal medula 34 em tenra idade (12 semanas) em ambos os genótipos (neurónios com uma secção do citoplasma/corno ventral claramente identificável: 110 ± 2 em ratos FCEV+/+mice versus 107 í 6 em ratos FCEVm/m; n=3; p=NS) , indicando que essa supressão do sitio de ligação de FIH no promotor de FCEV, por si só, não causa o desenvolvimento neuronal anormal. No entanto, para além dos 7 meses de idade, detectaram-se menos neurónios no corno ventral nos em ratos FCEVm/m (secção dos neurónios/corno ventral: 110 ± 3 em ratos FCEV+/+ versus 98 ± 4 em ratos FCEVm/m; n=8; p < 0,05) . A imunocoloração para a colina acetiltransferase (Chat), um marcador de neurónios motores, revelou 30 % menos neurónios motores em ratos FCEVm/m que em ratos FCEV+/+ (secção de neurónios/espinhal medula positiva para ChAT) : 26 ± 2 em ratos FCEV+/+ versus 18 ± 2 em ratos FCEVm/m; n=4; p = 0,05) . Em contraste com os ratos FCEV+/+, os corpos celulares neuronais (pericário) e os axónios proximais dos neurónios motores nos ratos FCEVm/m continham inclusões de neurofilamentos fosforilado (NFf) , uma marca de doença dos neurónios motores 31 (número de neurónios positivos para NFF/secção da espinhal medula: nenhum em ratos FCEV+/+ versus 7 ± 2 em ratos FCEVm/m; n=6; p < 0,05) . Estes neurónios motores positivos para NFf foram menores em tamanho (250 ± 20 pm2) que os neurónios motores negativos para NFf em ratos FCEV+/+ (500 ± 40 pm2; n= 4, p < 0,05) . A complexidade e a ocorrência de axónios positivos para neurofilamentos desfosforilados (NF) das dendrites positivas para MAP-2 foi comparável em ambos os genótipos, apesar de mais neurónios em ratos FCEVm/m tendem a acumular-se nos NF desfosforilados do seu pericário. Os edemas focais dos axónios ("esferóides"), também encontrados em doentes com ELA 33, 34, ocorreram na espinhal medula em ratos FCEVm/m, mas não em ratos FCEV+/+ (número de axónios com edema/ secção da espinhal medula às 31 semanas de idade: nenhum nos ratos FCEV+/+ versus 17 ± 1 em ratos FCEVm/m; n=7) . Os axónios inchados com axoplasma denso 35 foram localizados principalmente no corno ventral, enquanto a espinhal medula dorsal ou o tracto corticoespinhal apareceram relativamente poupados. Uma fracção desses axónios inchados foi imunorreactiva para a sinaptofisina, um sinal de transporte axonal deficiente e para a ubiquitina, que liqa as proteínas danificadas em estados clínicos neurodeqenerativas tais como ELA 35. Muitas vezes continham inclusões de neurofilamentos, como revelado pela coloração de Bielschowski e a imunocoloração para neurofilamentos fosforilados (NFf) . Em comparação com os ratos FCEV+/+, a astrocitose um proeminente reactiva foi observada de forma consistente na espinhal medula de ratos FCEVm/m, mas caracteristicamente apenas no corno ventral. Numerosos astrócitos hipertróficos acumulados nas zonas ventral e intermédia (área positiva para GFAP na massa cinzenta: 0,8 ± 0,4 % em ratos FCEV+/+ versus 1 ± 1 % em ratos FCEVm/m; n = 4, p < 0,05), e na matéria branca ventral (área positiva para GFAP na massa branca: 8 ± 3 % em ratos com FCEV+/+ versus 31 ± 2 % em ratos com VEGFm/m; n=4; p < 0,05) .
5. 5. Degeneração axónica em ratos FCEV“/m Encontraram-se sinais de degeneração valeriana e significativa perda de axónios grandes. Algumas fibras foram completamente substituídas pelos macrófagos activado mais numerosos, fagocitando folhas de mielina dissociadas (número de células positivas para F4/80/mm2: 150 ± 27 em ratos FCEV+/+ versus 340 ± 20 em ratos FCEVm/m; n=6; p < 0,05) . A fibrose endoneural e a expressão de GFAP, um marcador das células de Schwann desnervadas, eram mais proeminentes nos nervos mutantes. 36
6. 6. Eletrof isiologia de ratos FCEV“/m Os registos electromiográficos (EMG) durante o repouso e a contracção do músculo revelaram sinais claros de denervação e reinervação. A actividade espontânea difusa (potenciais de fibrilação, isolada ou salva de ondas agudas positivas) , juntamente com os potenciais de acção da unidade polifásica do motor (PAUM) de amplitude normal e os potenciais satélites instáveis foram observados no músculo gastrocnémio superficial, os músculos paravertebrais e o diafragma em ratos FCEVm/m, mas não em ratos FCEV+/+. No diafragma, a denervação foi evidenciada por um recrutamento reduzido de PAUM durante a inspiração em ratos FCEVm/m (número de PAUM por explosão inspiratória: 124 ± 20 em ratos FCEV+/+ versus 56 ± 4 em ratos FCEVm/m; n=7; p < 0,05) . Em comparação com o padrão normal bi- ou trifásico de PAUM em ratos FCEV+/+, detectou-se regularmente PAUM polifásicos de longa duração. A duração das explosões inspiratórias em ratos FCEVm/m manteve-se normal (2.300 ± 230 ms em ratos FCEV+/+ versus 2100 ± 300 ms em ratos FCEVm/m; n = 7;p = NS) ea amplitude dos maiores PAUM diafragmáticos foram preservados em ratos FCEVm/m (PAUM com uma amplitude> 200 pV por explosão inspiratória: 14 ± 2 em ratos FCEV+/+ versus 11 ± 4 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS), consistente com um processo continuo de denervação e reinervação. Além disso, em contraste com a inervação das placas individuais por um único axónio terminal, os axónios terminais em ratos FCEVm/m muito frequentemente ramificam-se como esporos finos (presumivelmente desmielinizados) em duas ou mais placas. As latências das potenciais acções musculares do composto (medido a partir do sitio de estimulação para o sitio de registo) estavam de alguma forma aumentadas em ratos mutantes (810 ± 36 nos ratos FCEV+/+ versus 1030 ± 44 nos ratos FCEVm/m; n = 7, p < 0,05), compatíveis com a perda axonal. A função dos nervos sensoriais pareceu 37 eletrofisiologicamente normal: as amplitudes do potencial de acção nos nervos sensitivos (SNAP) foram de 100 ± 7 pV em ratos FCEV+/+ versus 120 ± 14 pV em ratos FCEVm/m (n=5; p=NS) e as velocidades de condução dos nervos sensitivos foram de 33 ± 2 m/s em ratos FCEV+/+ versus 30 ± 2 m/s em ratos FCEVm/m (n=5; p=NS). Estas constatações são consistentes com um distúrbio neurogénico puramente motor.
7. 7. Crescimento vascular normal em ratos FCEV"17"1 Por causa do papel angiogénico bem conhecido de ratos FCEV, examinaram-se ratos FCEVm/m quanto a defeitos vasculares. No entanto, não havia sinais de insuficiência vascular no músculo esquelético, nervos periféricos ou espinhal medula, (i) No músculo, por causa da atrofia, as densidades capilares foram mais elevadas em ratos FCEVm/m do que em ratos FCEV+/+ (capilares/mm2: 1200 ± 150 em ratos FCEV+/+ versus 1740 ± 150 em ratos FCEVm/m; n=5; p < 0, 05) . A fluoro-angiografia 6 do diafragma revelou uma vascularização comparável em ambos os genótipos. (ii) Os nervos ciáticos em ratos FCEV"17111 tinham uma densidade similar a vasa nervorum (capilares/mm2: 90 ± 6 em ratos FCEV+/+ versus 100 ± 7 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS) estavam normalmente perfundidos (dopler a laser das unidades de perfusão do fluxo sanguíneo: 150 ± 15 em ratos FCEV+/+ versus 190 ± 12 em ratos FCEVm/m; n=5; p=NS) e tinha uma densidade comparável e padrão de vasos peri- e endoneurais sem sinais de permeabilidade ou de obstrução (fluoro-angiografia). A degeneração axonal ocorreu na periferia bem como no centro dos nervos de ratos FCEVm/m' lutando contra a neuropatia isquémica, que normalmente é mais grave no centro 37. (iii) Na espinhal medula, as densidades capilares foram comparáveis em ambos os genótipos na massa cinzenta (capilares/mm2: 380 ± 17 em ratos FCEV+/+ versus 390 ± 13 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS) e na massa branca 38 (capilares/mm2 : 170 ± 12 em ratos FCEV+/+ versus 170 ± 11 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS) com densidades similares nos cornos ventral e dorsal. As células endoteliais de ambos os genótipos expressaram caracteristicas barreira hemato-encefálica (transportador de glicose do tipo I; Glut-1). Os sinais de microangiopatia diabética e isquémica 38 não foram detectados em ratos FCEVm/m. Os sinais caracteristicos da neuropatia isquémica (depósitos de amilóide, vasculite inflamatória) ou neuropatia diabética (hialinização de microvasos endoneurais, espessamento da membrana basal capilar, saida de pericitos, obstrução do lúmen devido a hiperplasia/hipertrofia endotelial, neovascularização, enfarte dos nervos) não foram detectados em ratos FCEVm/m. A fraqueza muscular em ratos FCEVm/m não foi devida a oxigenação deficiente, nem à redução de níveis da hemoglobina veiculadora de O2 (perfil hematológico normal). Além disso, a determinação ecocardiográfica do encurtamento circunferencial das fibras (VCF, uma medida da contractilidade) revelou que os ratos FCEVm/m tinham a função cardíaca normal durante as condições básicas (15 ± 2 em ratos FCEV+/+ versus 17 ± 3 em ratos FCEVm/m; p = NS) e após o stresse de dobutamina (27 ± 6 em ratos FCEV+/+ versus 26 ± 6 em ratos FCEVm/m; p=NS) . Também não houve desequilíbrio metabólico em ratos mutantes (electrólitos normais; níveis de glicose no plasma: 200 ± 10 mg/dl em ratos FCEV+/+ versus 180 ± 16 em ratos FCEVm/m; n=7; p =NS) . Após a exposição à hipoxia (10 % de O2, 24 h) , os neurónios motores em ambos os genótipos ficaram corados de forma comparável para o pimonidazole, marcador da hipóxia. A fraqueza muscular em ratos FCEVm/m não foi devido à oxigenação deficiente, anemia, desequilíbrio metabólico, disfunção cardíaca ou desenvolvimento vascular anormal em outros 39 órgãos. Colectivamente, não havia sinais de insuficiência vascular ou isquémia em ratos FCEVm/m.
8. 8. Expressão de FCEV e neuropilina-1 na espinhal medula Exposição de ratos FCEV+/+ à hipóxia (O2 a 10 %: 24 h) estimulou a expressão de FCEV na espinal medula (pg/mg de proteína: 15 ± 1 em normóxia versus 94 ± 20 em hipóxia; n = 7, p < 0,05), mas apenas minimamente em ratos FCEVm/m (pg/mg de proteína: 9 ± 2 em normoxia versus 15 ± 2 em hipóxia; n=7; p=0,06). A indução de hipóxia de LDH-A (outro gene indutível por hipóxia) na espinhal medula de FCEVm/m não foi revogada (LDH-A/103 hprt cópias de ARNm: 230 ± 100 durante a normóxia versus 1100 ± 400 durante a hipóxia; n = 7, p < 0,05), confirmando a especificidade do gene alvo. Obtiveram-se resultados similares no cérebro. Pelo contrário, os níveis de FCEV foram reduzidos no músculo esquelético após hipóxia (pg/mg de proteína: 40 ± 10 em normóxia e 22 ± 9 em hipóxia em ratos FCEV+/+, n = 7, p < 0,05 versus 52 ± 6 em normóxia e 23 ± 4 em hipóxia em ratos FCEVm/m, n = 7, p < 0,05), consistente com observações anteriores da expressão do FCEV, em que a resposta à hipóxia é específica do tecido 39.
9. 9. Papel neurotrófico de FCEV e de neuropilina-1 A apoptose de células neuronais tem sido implicada em várias doenças neurodegenerativas, incluindo ELA 24,.33. Estudou-se um possível papel neuroprotector do FCEV, independentemente de seu efeito angiogénico, utilizando células NSC34, uma linha de células de neurónios motores de murino 40, em resposta a vários estímulos apoptóticos. Os factores de sobrevivência dos neurónios motores conhecidos (FCFb 41, FTCp-l 42) protegidos por células NSC34 contra a apoptose induzida por FNT-cx) . As concentrações fisiológicas 40 de FCEVies, também protegeram os neurónios motores contra a apoptose induzida por FNT-α, hipóxia, stresse oxidativo (H202) e privação de soro. Nomeadamente, FCEVm, (que não se liga a NP-1 10) não resgata os neurónios motores. 0 envolvimento de NP-1 foi demonstrada pela neutralização parcial do efeito de sobrevivência de FCEVi65 por anticorpos, bloqueando NP-1, mas não por anticorpos bloqueando NP-2. 0 efeito neurotrófico de FCEVi65 também foi parcialmente bloqueado por anticorpos de R-2 de FCEV, mas não para R-l de FCEV, enquanto a neutralização completa foi conseguida através da combinação de ambos os anticorpos de R-2 de FCEV e NP-1. NP-1 é conhecido por se ligar a semaforina III/olapsina-1 (Sema3A), implicados na repulsa e na padronização das projecções sensoriais e motoras na espinhal medula durante o desenvolvimento 11-15. Recentemente foi sugerido que Sema3A promover a apoptose dos neurónios simpáticos e cerebelares 43 e impede a regeneração axonal após a lesão do nervo no adulto 44 (e, portanto, estaria implicada na retracção do axónio e na morte do neurónio motor em ratos FCEVm/m) . A exposição de ratos de tipo selvagem à hipóxia (02 a 10 %; 24 h) aumenta ligeiramente a expressão de Sema3A na espinhal medula. Os neurónios motores SCN34 também expressaram Sema3A. Assim, os neurónios motores expressam tanto um factor neuroprotector (FCEV165) como um factor neurorepulsivo/ apoptótico (Sema3A), que são antagonistas recíprocos da ligação com NP-1.
10. 10. Perfusão neuronal anormal em ratos FCEV“/m Os requerentes examinaram se a fraqueza muscular e a neuropatia foram causadas por insuficiência vascular. No músculo esquelético de FCEVm/m só pode ser detectada uma redução no tamanho do lúmen capilar, mas as medições da pressão parcial do oxigénio microvascular revelou que os 41 capilares mais pequenos não causaram isquémia muscular. É importante que a relação capilar-músculo foi normal quando se desenvolveram os primeiros sinais de atrofia muscular neurogénica, mostrando que a angiogénese insuficiente não foi a causa da degeneração dos neurónios motores. Em vez disso, a ligeira diminuição dessa relação em ratos FCEVm/m velhos com atrofia muscular grave, para além dos 7 meses pode ser o resultado da denervação muscular, como observado em doentes com atrofia muscular de denervação (Carpenter et al. (1982) Muscle Nerve 5, 250) . Além disso, a marcação de PCNA não conseguiu detectar diferenças genotipicas na proliferação endotelial no músculo esquelético em todas as idades e na fluoro-angiografia (Schratzberger P. et al. (2000) Nat Med 6, 405) do diafragma revelou uma vascularização comparável em ambos os genótipos. Defeitos estruturais vasculares óbvios podem ser detectados em tecidos neuronais mas, surpreendentemente, a perfusão neuronal foi reduzida em 50% em ratos FCEVm/m. Nos nervos ciáticos, ambos os genótipos tinham uma densidade comparável à dos vasa vasorum (capilares/mm2: 90 ± 6 em ratos FCEV+/+ versus 100 ± 7 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS) e padrão de vasos peri- e endoneurais sem sinais de permeabilidade ou de obstrução (fluoro-angiografia). Na espinhal medula, as densidades capilars foram comparáveis em ambos os genótipos na massa cinzenta (capilares/mm2: 380 ± 17 em ratos FCEV+/+ versus 390 ± 13 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS) e na massa branca (capilares/mm2: 170 ± 12 em ratos FCEV+/+ versus 170 ± 11 em ratos FCEVm/m; n=7; p=NS) com densidades similares nos cornos ventral e dorsal. As células endoteliais em ratos FCEVm/m expressam caracteristicas de barreira hemato-encefálica (transportador de glicose do tipo I; Glut-1), mas não se detectaram sinais ultraestruturais de microangiopatia diabética (Boulton A.J. et al. (1998) Med Clin North Am 82,

    909). Devido à inacessibilidade e pequeno tamanho da espinhal 42 medula, quantificou-se o fluxo sanguíneo no cérebro usando microesferas. 0 fluxo sanguíneo cerebral inicial foi de 0,9 ± 0,1 ml/min/g em ratos FCEV+/+ versus 0,5 ± 0,1 em ratos FCEVm/m (n=8; p < 0,05) . Os ratos FCEVm/m foram, no entanto, ainda capazes de aumentar o seu fluxo sanguíneo cerebral em resposta a hipercapnia (C02 a 7,5 %), medida usando um doppler a laser (% de aumento do fluxo: 43 ± 3 % em ratos com FCEV+/+ versus 39 ± 6 % em ratos com FCEVm/m; n=10; p = NS) . O déficit de perfusão neuronal pareceu ser específico porque a perfusão renal estava normal em ratos FCEVm/m (1,5 ± 0,2 ml/min/g em ratos FCEV+/+ versus 1,8 ± 0,3 em ratos FCEVm/m; n=8; p=NS). Deve tornar-se claro que os sinais característicos da neuropatia diabética (hialinização de microvasos endoneurais, espessamento da membrana basal capilar, saída de pericitos, obstrução do lúmen devido a hiperplasia/hipertrofia endotelial, neovascularização, enfarte dos nervos) não foram detectados em ratos FCEVm/m. Além disso, a fraqueza muscular em ratos FCEVm/m não foi devida a oxigenação deficiente, nem à redução de níveis da hemoglobina veiculadora de 02 (perfil hematológico normal). Além disso, a determinação ecocardiográfica do encurtamento circunferencial das fibras (VCF, uma medida da contractilidade) revelou que os ratos FCEVm/m tinham a função cardíaca normal durante as condições básicas (15 ± 2 em ratos FCEV+/+ versus 17 ± 3 em ratos FCEVm/m; p = NS) e após o stresse de dobutamina (27 ± 6 em ratos FCEV+/+ versus 26 ± 6 em ratos FCEVm/m; p=NS) . Também não houve desequilíbrio metabólico em ratos mutantes (electrólitos normais; níveis de glicose no plasma: 200 ± 10 mg/dl em ratos FCEV+/+ versus 180 ± 16 em ratos FCEVm/m; n=7; p =NS) . Em conclusão, a fraqueza muscular e a neuropatia em ratos FCEVm/m não foram devidas a níveis reduzidos de saturação de oxigénio no sangue, anemia, desequilíbrio metabólico ou disfunção cardíaca. 43 MATERIAIS E PROCESSOS. Geração de ratos FCEV^"1 0 gene FCEV de murino (129/SvJ; Genoma Systems Inc., St. Louis, Missouri) já foi isolado e mapeado anteriormente 26. A eliminação do sitio de ligação de FIH-lalfa no promotor de FCEV foi conseguida através da preparação de um vector de direccionamento, pBSK. 0 FCEVm, em que foi eliminado o elemento de resposta de FIH-lalfa {ERH) de TACGTGGG tipo selvagem, o que elimina a ligação de FIH-lalfa 23. Este vector continha uma cassete de neomicina fosfotransferase (neo), flanqueada por sítios loxP para permitir a remoção subsequente por Cre-recombinase (fig. la) . Depois da electroporação de pBSK.FCEVm, os clones de células ES recombinados, contendo tanto a eliminação do sítio de ligação de FIH-lalfa como a cassete de neo "ensaduichada" (FCEV+/neo) foram identificados por análise de Southern blot e sequenciados (fig. la) . As células ES de FCEVneo/neo foram obtidas através da cultura de células ES de FCEV+/neo numa grande selecção de G418 (1800 pg/ml) e usadas para obter células ES de FCEVm/m pela expressão transitória da recombinase Cre. As sondas para a análise de Southern blot incluíram: sonda A (fragmento de PstI/BstEII de 0,7 kb) e sonda B (fragmento de RCP de 1 kb, amplificado a partir do ADN genómico, utilizando como iniciador directo 5'-TTA TCA GAA TTC ATT CCC GAG GCC TGG GGA GAG TTG GG-3' e como iniciador inverso 5'-ATA AAG AAT TCG GAA GGT CAC AGC CCT TCG GTG G-3'). Indicam-se as dissoluções de restrição analítica utilizadas para a identificação dos clones de células ES recombinantes. Os clones alvo de ES de FCEVneo foram usados para gerar ratos quiméricos através da agregação de mórulas, que foram reproduzidos com fêmeas Swiss para a transmissão germinal. Não se obteve descendência viável de FCEV+/neo, 44 presumivelmente porque a presença do gene de neo inactivou a expressão do gene FCEV e causou letalidade haploinsuficiente. No entanto, quando os ratos quiméricos foram intercruzadas com ratos pgk:Cre, obteve-se uma descendência viável de FCEV+/m, que foi intercruzada para a obtenção de uma descendência de FCEVm/m homozigótica. Todos os processos de cultura de ES, selecção e agregação de diplóides já foram descritos 26. 2. Expressão genética, morfologia, testes de desempenho motor, torque e electromiografia As análises de Western e Northern blotting, a RCP-TI quantitativa, em tempo real, a histologia, a microscopia electrónica, a imuno-coloração, a hibridação in situ isolada ou em combinação e a análise morfométrica foram realizadas conforme descrito anteriormente 4,26,56. Os anticorpos que se seguem foram utilizados para a imunocoloração: Glut-1 (C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) , FCEV (Santa Cruz), desmina (D33; Dako S/A, Glostrup, Dinamarca), ChAT (AB144; Chemicon, Biognost, Wevelgem), NF (SM32; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, Maryland) , NFf (SMI 31; Sternberger Monoclonals Inc.), calretinina (Swant, Bellinzon, Suiça), MAP2 (Sigma, Bornem, Bélgica), GFAP (Z0334; Dako S/A), ubiquitina (Z0458; Dako S/A), sinaptofisina (A0010; Dako S/A), F4/80 (A3-1; Serotec Ltd, Oxford, RU), cloridrato de pimonidazol (Hipoxi-sonda-1; Natural Pharmacia International Inc., Belmont, MD), BrdU (Beckton Dickinson, Brussels, Bélgica). A coloração histoquímica (miosina ATPase, Nissl, Bielschowski) foi realizada utilizando protocolos padrão. Todas as colorações foram realizadas em secções com uma espessura de 7 pm, excepto para ChAT (40 pm) , Nissl (15 pm) e miosina ATPase (15 pm) . A análise quantitativa, em tempo real, por RCP-TI foi realizada conforme descrito 45 anteriormente 56. Os níveis de expressão relativos destes genes foram calculados dividindo os seus sinais pelos sinais obtidos para o gene HPRT. A coordenação motora e os testes de desempenho muscular (teste de pegada, teste do animal pendurado, teste da rede, teste de rotação do eixo)23, registos electromiográficos em ratos anestesiados58 e análise ecocardiográfica56 foram realizados tal como descrito. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela comissão de ética. Para a fluoro-angiografia 6, injectou-se, por via intravenosa, 500 μΐ de dextrano fluorescente a 5 % (peso molecular de 2xl06 dalton; Sigma) em ratos anestesiados, intravenosamente com uretano. Após 5 minutos, os ratos foram perfundidos com 1,9 ml de dextrano fluorescente e 100 μΐ de adenocor (Sanofi Pharma, Bruxelas, Bélgica) e os nervos ciáticos foram imediatamente analisados por microscopia confocal. As medições do fluxo de sangue (unidades de perfusão sanguínea) feitas com dopler a laser nos nervos ciáticos foram realizadas em ratos anestesiados com uma sonda de fluxo de agulha (ADlnstruments Pty Ltd, Castle Hill, Austrália) a intervalos de 1 mm ao longo de um segmento do nervo de 5 mm. Análise dos gases sanguíneos, a química clínica e o perfil hematológico foram realizados usando técnicas padrão no Hospital universitário (Leuven, Bélgica). 3. Cultura de células e análise de sobrevivência Fez-se uma cultura de células SCN-34, tal como descrito 40. Os anticorpos de bloqueio para NP-1 e NP-2 foram uma oferta do Dr. A. Kolodkin e os anticorpos do R-2 de FCEV (DC101) do Dr. P. Bohlen, (Imclone) . Para os estudos de apoptose, fez-se uma cultura de células SCN-34 em frascos T75 revestidos com gelatina a 0,1 % em meio RPMI 1640 contendo 46 soro bovino fetal a 10 % (Life Tecnologias, Paisley, RU) , 100 UI/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, heparina (100 pg/ml) e suplemento de crescimento endotelial das células (30 pg/ml). A apoptose foi induzida por um suplemento de FNT-alfa (50 ng/ml; R & D, Abingdon, RU), a retirada de factores de crescimento (soro bovino fetal a 0,1 % ou a 0,5 %) ou o tratamento com hipóxia (O2 a 2%) ou H202 a 2 %. Os FCEVi2i e FCEVi65 eram da R&D. A apoptose foi quantificada através da medição de fragmentos de ADN associados à histona citoplásmica (mono- e oligo-nucleossomas) utilizando um ensaio imunoenzimático fotométrico (Cell Detection ELISA, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) . A determinação dos níveis de FCEV foi realizada utilizando testes ELISA disponíveis comercialmente (R&D). REFERÊNCIAS 1. Carmeliet, P. 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