ES2370205A1 - Uso de poloxaminas como inductoras de la diferenciacion osteogenica de celulas mesenquimales. - Google Patents
Uso de poloxaminas como inductoras de la diferenciacion osteogenica de celulas mesenquimales. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de poloxaminas como inductoras de la diferenciación osteogénica de células mesenquimales. La presente invención se dirige a medicamentos, composiciones y métodos de aplicación en las que las poloxaminas son el ingrediente activo.
Description
Uso de poloxaminas como inductoras de la
diferenciación osteogénica de células mesenquimales.
La presente invención se enmarca en el campo de
la inducción de diferenciación de células mesenquimales y
progenitoras en osteoblastos.
En situaciones patológicas graves (fracturas
complejas, traumatismos, tratamiento de tumores óseos y
reemplazamiento de articulaciones o defectos congénitos) el hueso
dañado no se forma o regenera espontáneamente. Para restaurar su
integridad estructural y funcional, se pueden aplicar autoinjertos o
hueso "alogénico" procedente de bancos de tejidos, lo que no
está exento de efectos adversos que pueden llegar a ser graves
(Bauer y Muschler, Clin. Orthop. 10-27, 2000).
Además, la terapia de reparación del hueso se puede suplementar con
la estimulación bioquímica de su curación local mediante la
administración de factores de crecimiento que promueven la formación
de osteoblastos (Lieberman et al., J. Bone Joint Surg. Am.
84A, 1032-1044, 2002; Finkemeier. J. Bone Joint
Surg. Am. 84, 454-464, 2002). La aplicación
terapéutica de los factores de crecimiento plantea importantes
dificultades derivadas de su corta semivida biológica, su deficiente
estabilidad, su selectividad tisular y su toxicidad y actividad
carcinogénica potenciales. Ello hace que la búsqueda de moléculas
sintéticas con capacidad osteogénica, mejor perfil de
seguridad/eficacia y más accesibles desde el punto de vista
económico constituya un área de investigación muy activa
(Chun-Ya E. Han y col. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19,
1442-1445, 2009). En este sentido, se ha demostrado
ya la efectividad osteogénica de la simvastatina (Ayukawa y col., J.
Oral Rehab. 37, 123-130, 2010).
En la patente WO20077108689 se reivindica un
método ex vivo que comprende adicionar una poliamina sobre un
medio de cultivo que contiene células madre en suspensión. En una
reivindicación dependiente se concreta que las poliaminas son las
moléculas de origen natural espermidina, espermina y sus precursores
ornitina y putrescina. La estructura de la putrescina es
H_{2}N-(CH_{2})_{4}-NH_{2}, la
ornitina es un aminoácido de fórmula
H_{2}N-(CH_{2})_{3}-CH(NH_{2})-COOH,
la espermidina es una triamina
H_{2}N-(CH_{2})_{4}-NH-(CH_{2})_{3}-NH_{2}
y la espermina es una tetramina
H_{2}N-(CH_{2})_{3}-NH-(CH_{2})_{4}-NH-(CH_{2})_{3}-NH_{2}.
Todas ellas son aminas o poliaminas de bajo peso molecular
caracterizadas por presentar grupos amino terminales y una distancia
entre grupos amino de 3 ó más átomos de carbono.
Ming Cai y col. (Pharmazie 63,
751-756, 2008) han descrito la actividad osteogénica
de CBMIDA (catecol-3,6-bis(ácido
metileniminodiacetico)).
Por otra parte, los copolímeros bloque con
capacidad de gelificación in situ se han mostrado como
excipientes farmacéuticos muy adecuados para la preparación de
sistemas inyectables de factores de crecimiento que forman un depot
en las inmediaciones de la zona de administración. Los polímeros
bloque de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de
propileno)-poli(óxido de etileno),
PEO-PPO-PEO, de la familia de los
Pluronics han sido ampliamente ensayados como transportadores de
factores de crecimiento, que son capaces de retenerlos y de
proporcionar una cesión sostenida en el entorno del defecto óseo que
se quiere corregir (Clokie y col. Plast. Reconstr. Surg. 105,
628-637, 2000). Los Pluronics por sí solos, en
ausencia de factor de diferenciación, carecen de actividad
osteogénica aunque sí se ha descrito su capacidad para inducir la
formación de adipocitos a partir de células madre mesenquimales
(Vashi y col. Biomaterials 29, 573-579, 2008).
Otra familia de copolímeros bloque de PEO y PPO
es la de las poloxaminas o Tetronics, que presentan una estructura
en estrella con cuatro brazos de PEO-PPO que
terminan en grupos hidroxilo, unidos a través de un grupo
etilendiamino central. Se encuentran disponibles comercialmente en
una amplia variedad de pesos moleculares y relaciones molares EO/PO
(Chiappetta y Sosnik. Eur. J. Pharm. Biopharm. 66,
303-317, 2007). Las poloxaminas se utilizan como
agentes solubilizantes y estabilizantes de fármacos, para crear
superficies stealth en nanopartículas, como componentes de
hidrogeles para cesión controlada de fármacos y como componentes de
líquidos de limpieza y conservación de lentes de contacto
(Alvarez-Lorenzo y col. Frontiers in Bioscience E2,
424-440, 2010).
También se ha propuesto el uso de poloxaminas
como componentes de sistemas de liberación de factores de
crecimiento para el tratamiento de defectos óseos. Por ejemplo, Tae
y col. (Composite comprising
polysaccharide-fimctionalized nanoparticle and
hydrogel matrix, a drug delivery system and a bone defect
replacement matrix for sustained release comprising the same, and
the preparation method thereof. U.S. Pat. Appl. Publ. (2007),
Cont.-in-part of U.S. Ser. No. 391,480. CODEN:
USXXCO US 2007248675 A1) reivindican la preparación y el uso de
nanopartículas recubiertas con polímeros emulsificantes
biocompatibles, entre los que se citan las poloxaminas, para
controlar la cesión de factores de crecimiento. Por otra parte, en
la solicitud de patente WO94/25080 se reivindica un método que
comprende mezclar un hidrogel con células e implantarlas en un
animal. Entre los copolímeros que se citan como componentes de los
hidrogeles se encuentran las poloxaminas. En estos sistemas, las
poloxaminas sólo actúan como excipientes inertes y no como
sustancias activas.
\newpage
En la presente invención se describe por primera
vez la actividad de las poloxaminas como inductoras en la
diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En
particular, se demuestra que tienen capacidad osteogénica.
Por tanto se proporcionan métodos para tratar a
pacientes que padecen defectos óseos en general, mediante la
administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una
composición farmacéutica de poloxaminas. Las poloxaminas son el
ingrediente activo en estas composiciones, y por lo tanto, no se
requiere de la incorporación de otras sustancias activas.
De este modo, un aspecto de la invención se
dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento; en
un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su
uso como medicamento para inducir diferenciación de células
mesenquimales o progenitoras; en un aspecto más particular, para
inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en
osteoblastos.
En otro aspecto particular, la invención se
dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento para
el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas
conminutas.
En otro aspecto particular se dirige a una o
varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento
de fracturas asociadas a osteopenia. De entre dichas fracturas son
típicas las de la zona distal del radio.
En un aspecto particular se dirige a una o
varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento
de pseudoartrosis.
En un aspecto particular se dirige a una o
varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento
de pérdidas de la reserva ósea. Dicha pérdida de la reserva ósea
puede ser consecuencia de diversos problemas como por ejemplo la
respuesta a ciertos materiales traducida en osteolisis y/o
protección de esfuerzos, como ocurre en las prótesis articulares, en
quistes oseoesenciales, gangliones intraóseos y fusiones
espinales.
Las poloxaminas tienen grandes ventajas frente a
las sustancias para las que se ha descrito hasta el momento
capacidad osteogénica:
- -
- Las poloxaminas, debido a que son polímeros sintéticos, tienen una estructura bien definida y conocida, y se incluyeron en numerosos ensayos para aplicaciones biomédicas, y su uso está autorizado en cosmética y productos de limpieza y conservación de lentes de contacto;
- -
- Las poloxaminas son citocompatibles hasta proporciones muy elevadas, lo que hace que su margen de seguridad pueda ser más alto que el de los factores de crecimiento;
- -
- No se ha descrito hasta el momento para las poloxaminas ninguna actividad farmacológica, por lo que no es previsible que de su uso se puedan derivar efectos secundarios relevantes;
- -
- Se comercializan a precios mucho más bajos que los factores de crecimiento, por lo que ofrecen una mejor relación coste/efectividad;
- -
- Son estables frente a la esterilización por procedimientos convencionales;
- -
- En un intervalo de concentración adecuado para ejercer la actividad osteogénica, permiten preparar composiciones que se comportan como implantes inyectables, es decir, como sistemas de gelificación in situ que se pueden aplicar fácilmente por inyección y que permanecen en el lugar de aplicación durante tiempos prolongados.
\vskip1.000000\baselineskip
Una ventaja adicional de la invención es que
para la utilización de las poloxaminas como agentes osteoinductores
no se requiere la modificación previa de su estructura, ni tampoco
se requiere la incorporación de factores de crecimiento o sustancias
osteogénicas adicionales.
Para la presente invención, se entiende por
"poloxaminas" un copolímero de bloque de poli(óxido de etileno)
(PEO) y poli(óxido de propileno) (PPO) que presentan una estructura
en estrella con cuatro brazos de PEO-PPO que
terminan en grupos hidroxilo; estos cuatro brazos están unidos a
través de un grupo etilendiamino central, y se representan por las
siguientes fórmulas generales I y II:
donde a tiene un valor entre 1 y
150 y b tiene un valor entre 1 y
150.
\vskip1.000000\baselineskip
Las poloxaminas se encuentran disponibles
comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares y
relaciones molares EO/PO (catálogo de BASF, The Chemical Company, en
la edición de Norte América, sección marcas en la clasificación de
productos químicos). Son ejemplos de poloxaminas útiles para la
invención, los Tetronic (marca registrada de BASF) 304, 701, 901,
904, 908, 1107, 1301, 1304, 1307, 90R4 y 150R1 caracterizados por
las propiedades que se especifican en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención se dirige hacia una
composición farmacéutica que consiste en una disolución o dispersión
acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas para inducir la
diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En
particular, para inducir la diferenciación de células mesenquimales
o progenitoras en osteoblas-
tos.
tos.
Otro aspecto de la invención se dirige hacia una
composición farmacéutica que consiste en una disolución o dispersión
acuosa esterilizada, de una o varias poloxaminas para el tratamiento
de defectos óseos creados en fracturas conminutas, fracturas
asociadas a osteopenia, pseudoartrosis, y pérdida de la reserva
ósea.
En un aspecto particular, la invención se dirige
al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de dichas
composiciones farmacéuticas.
En la presente invención, se entiende por
"composición farmacéutica" una composición líquida para
constituir un medicamento; de forma preferida para su administración
parenteral. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la
invención pueden administrarse en forma de implante mediante una
inyección en la zona específica en la que el paciente sufre la
patología, que gelifica a la temperatura corporal y produce sus
efectos durante un tiempo continuado en la zona a tratar.
Otro aspecto de la invención se dirige a un gel
viscoelástico obtenible mediante un procedimiento que comprende
poner en contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada
de una o varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o
progenitoras, siendo la concentración total de poloxaminas en la
etapa a) superior a la concentración crítica de gelificación a la
temperatura del medio en el que se encuentran las células
mesenquimales o progenito-
ras.
ras.
Para la presente invención, se entiende por
"concentración crítica de gelificación" aquella a la que la
disolución de poloxamina experimenta una transición de sol a gel a
la temperatura a la que se encuentran las células mesenquimales o
progenitoras o a la temperatura corporal.
En una realización particular, cuando la
concentración total de poloxaminas supere la concentración crítica
de gelificación a la temperatura del medio en el que se encuentran
las células mesenquimales o progenitoras, la composición debe
conservarse entre 3 y 7ºC hasta el momento de la aplicación. Cuando
esta aplicación se lleva a cabo empleando una jeringa, el
mantenimiento en frío asegura una buena jeringabilidad.
Las células mesenquimales o progenitoras pueden
encontrarse in vivo o in vitro.
En una realización particular, las células
mesenquimales o progenitoras de la etapa b) se encuentran en un
medio de cultivo in vitro. Es posible realizar este
procedimiento mediante el empleo de una pipeta o jeringa.
De forma preferida, las disoluciones o
dispersiones acuosas esterilizadas de una o varias poloxaminas de la
invención, presentan una concentración total de poloxaminas
comprendida entre el 2 y el 30%. De forma más preferida, la
concentración total de poloxaminas está comprendida entre el 10 y el
20%.
En otro aspecto, la invención se dirige a un
procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica,
como se describió anteriormente, que consiste en una disolución o
dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, que
comprende a) mezclar una o varias poloxaminas en un medio acuso a pH
entre 6.5 y 7.5 y a una temperatura entre 0 y 37ºC, y b)
esterilización de la mezcla.
En un aspecto particular, el procedimiento
comprende una etapa adicional después de la etapa a) y antes de la
etapa b), que consiste en añadir un agente isotonizante.
Se entiende por agente isotonizante, cualquier
sustancia que incremente la presión osmótica de una disolución
acuosa como por ejemplo el cloruro sódico, la glicerina, la glucosa,
el manitol o el sorbitol.
La etapa b) de esterilización puede llevarse a
cabo mediante procesos conocidos por el experto en la materia, entre
ellos, están en la práctica común los que se citan en el siguiente
grupo: filtración en condiciones estériles, calor húmedo en el
envase definitivo, o radiaciones ionizantes y no ionizantes.
En otro aspecto la invención también se dirige a
un método para inducir la diferenciación de células mesenquimales o
progenitoras en osteoblastos que comprende poner en contacto a) una
disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias
poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras.
En un aspecto particular, las células
mesenquimales o progenitoras se encuentran en un medio de cultivo y
el método se realiza in vitro.
En un aspecto particular, se exceptúan de las
células mesenquimales o progenitoras, las células madre procedentes
de embriones humanos.
\newpage
En otro aspecto particular, la disolución o
dispersión de la etapa a) se administra a animales o a humanos in
vivo, en particular, mediante inyección en la zona donde debe
inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en
osteoblastos.
De este modo, cuando la concentración total de
poloxaminas supere la concentración crítica de gelificación a la
temperatura corporal, se formará in situ un depot de
consistencia semisólida o gel viscoelástico.
Figura 1. Viabilidad celular al cabo de 24 horas
de estar en contacto con las disoluciones de poloxaminas (n=3) de
distintas concentraciones. 0.01 %p/p: columna blanca; 0.1%p/p: gris
claro; 1%p/p: gris oscuro; 5%: negro.
Figura 2. Módulos elástico (G', símbolos
cerrados) y viscoso (G'', símbolos abiertos) de disoluciones de
Tetronic al 20% en Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) antes y
después de ser autoclavadas.
Figura 3. Actividad de la fosfatasa alcalina
(ALP) de las células cultivadas en presencia de distintas
poloxaminas. También se muestran los datos correspondientes a los
controles positivo y negativo.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la
invención y no deben interpretarse como limitativos de la misma. Se
incluyen ejemplos para ilustrar la citocompatibilidad, capacidad
gelificante y capacidad osteoinductora de las poloxaminas en
disolución.
La poloxamina o combinaciones de varias
poloxaminas se disuelven bajo agitación en agua o medio tampón de pH
adecuado (entre 6.5 y 7.5), preferentemente pH 7.4. La concentración
total en poloxamina puede estar comprendida entre el 2 y el 30%,
preferiblemente entre el 10 y el 20%. La temperatura del medio de
disolución puede estar comprendida entre 0 y 37ºC, preferiblemente
entre 4 y 20ºC, para evitar la formación de un gel durante la
preparación de la disolución. La presión osmótica de la disolución
se puede ajustar con NaCl.
La disolución de poloxamina se esteriliza por
calor húmedo a 121ºC durante 20 minutos.
Se prepararon disoluciones de Tetronic 304, 901,
904, 908, 1170, 1301, 1307, y 150R1 al 10%, disolviendo la cantidad
necesaria de cada poloxamina en el volumen adecuado de tampón
fosfato pH 7.4. Las disoluciones se filtraron a través de membranas
de 0.2 \mum. Se cultivaron células CHO-K1 y
Balb/3T3 en medio D-MEM sin rojo fenol, conteniendo
suero fetal bovino (10% p/v) y gentamicina (130 \mug/100 ml). Se
sembraron 5000 células por pocillo (50 \mul) en placas de 96
pocillos y se adicionaron 50 \mul de disolución de poloxamina
convenientemente diluida para que la concentración en el pocillo
fuese de 0.01, 0.1, 1 ó 5% p/v. Las placas se incubaron 24 h a 37ºC
en atmósfera 5%CO_{2} humidificada. Las células supervivientes se
evaluaron usando un kit de citotoxicidad LDH y la absorbancia se
midió a 490 nm. En la Figura 1 se muestran los resultados
obtenidos.
En líneas generales, los copolímeros con peso
molecular elevado y carácter hidrofílico (Tetronic 908, 1107, 1301 y
1307) mostraron alta citocompatibilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon disoluciones concentradas de
Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 al 20% p/p en medio DMEM sin rojo
fenol a 4ºC y se filtraron a través de membranas de 0.2 \mum. Se
cultivaron células SAOS-2 en medio DMEM suplementado
con suero fetal bovino (10% w/v) y gentamicina (130 \mug/100 ml).
Se sembraron 200.000 células por pocillo (1.5 ml) en placas de 24
pocillos y se adicionaron 0.5 ml de disolución de poloxamina. Las
placas se incubaron 24 h a 37ºC en atmósfera 5%CO_{2}
humidificada. Las células se tripsinizaron y se incubaron a 37ºC
durante 5 minutos. A continuación, las células se centrifugaron
(1400 rpm, 4 min) y se resuspendieron en medio DMEM fresco, se
diluyeron alícuotas de 100 \mul de suspensión de células con 200
\mul de tampón fosfato de pH 7.4. Se transfirieron a un citospin
para fijar las células en un portaobjetos. A continuación, se
efectuó una tinción con calceina/yoduro de propidio. Las tinciones
revelaron que la viabilidad fue superior al 90% después de 24 horas
de contacto con las disoluciones de poloxamina al 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon disoluciones concentradas de
Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 al 20% p/p en tampón fosfato pH 7.4
y DMEM. Se registró la evolución de los módulos elástico (G') y
viscoso (G'') en función de la temperatura entre 15 y 45ºC, a una
velocidad de calefacción de 2ºC/min, aplicando una velocidad de
oscilación de 5 rad/s. Los ensayos se llevaron a cabo con alícuotas
de disolución sin autoclavar y con otras esterilizadas en autoclave
a 121ºC durante 20 min.
A 20ºC las disoluciones presentaron una
viscosidad muy baja, que corresponde a un sistema fácilmente
jeringable. La temperatura de gelificación del Tetronic 908 se situó
en 33ºC y para los Tetronic 1107, 1301 y 1307 en 25ºC (Figura 2). A
37ºC todos los sistemas se comportaron como geles con módulo
elástico comprendido entre 10^{3} y 10^{4} Pa y el autoclavado
no modificó el comportamiento reológico de las disoluciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células madre mesenquimales en
medio MesenPRO RS^{TM} adecuadamente suplementado y se sembraron
(3\cdot10^{4} células/pocillo, 1.5 ml) en placas de 6 pocillos.
Se añadieron 200 \mul de disolución de poloxamina al 20% en tampón
fosfato de pH 7.4 en el compartimento superior de cada Transwell®.
En total se incorporaron a cada pocillo 40 mg de poloxamina. Como
controles negativo y positivo se utilizaron células en medio basal y
células en medio de diferenciación osteogénica (10 mM
\beta-glicerofosfato, 100 \muM dexametasona y 50
\mul/ml ácido ascórbico), respectivamente. Las placas se incubaron
a 37ºC en atmósfera de 5% CO_{2} humidificada. El medio se
reemplazó con medio fresco dos veces a la semana. Para llevar a cabo
el ensayo de fosfatasa alcalina (ALP), las células se lisaron al
cabo de 3, 7, 14 y 23 días por adición de 150 \mul de tampón Tris
HCl 10 mM de pH 7.5 con 0.1% Tritón X-100. Las
muestras se sometieron a tres ciclos de congelación
(-80ºC)/descongelación (45 min por ciclo). Los lisados se lavaron
por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutes a 4ºC. Cada
muestra (50 \mul) se incubó con 150 \mul de sustrato de ALP en
placas de 96 pocillos a 37ºC durante 30 min. La absorbancia de las
muestras se leyó a 405 nm usando un lector de ELISA. Se usó una
curva de calibración de p-nitrofenilfosfato para
determinar la concentración de ALP. Las medidas de actividad ALP se
normalizaron por el contenido en proteína, que se midió por el
ensayo de proteína BCA, y los resultados se expresaron como
micromoles de ALP por minuto y por mg de proteína.
También se llevaron a cabo dos análisis
histoquímicas, visualizando la actividad ALP de la manera siguiente:
las células se fijaron con una disolución de paraformaldehído al 4%
durante 5 min, se lavaron con tampón fosfato, se incubaron en la
oscuridad con naftol ASMX-fosfato al 0.1% y violeta
rápido al 0.1% AMPD 56 mM y se observaron al microscopio óptico.
Para detectar la mineralización de las células se efectuó una
tinción con rojo de alizarina. Las células se fijaron con etanol 70%
durante 1 hora y se lavaron con agua dos veces. A continuación, se
tiñeron con rojo de alizarina al 2% durante 30 min, se lavaron con
agua tres veces y se observaron las células al microscopio.
En la Figura 3 se muestran los perfiles de
actividad ALP obtenidos con las poloxaminas Tetronic 908, 1107 y
1307 y con controles negativo y positivo de osteogeneidad. Los
controles negativos indican que la actividad ALP se incrementa
ligeramente a los 7 días retornando después a los valores basales.
La actividad ALP de las células mesenquimales cultivadas en medio
osteogénico estándar (control positivo) mostraron un máximo en el
día 7, que fue mucho más intenso que el que se observó con el
control negativo. Los geles de poloxamina indujeron un crecimiento
progresivo de la actividad ALP durante dos o tres semanas.
Los geles de poloxamina dieron lugar a la
proliferación de las células mesenquimales durante la primera semana
y, a continuación, a la diferenciación a osteoblastos en la segunda
y la tercera semana. La tinción de alizarina mostró nódulos de
mineralización en los cultivos con las poloxaminas Tetronic 908,
1107 y 1307, al cabo de 23 días.
Claims (13)
1. Uso de una o varias poloxaminas para inducir
la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en
osteoblastos, con la condición de que se exceptúan las células madre
procedentes de embriones humanos.
2. Uso de una o varias poloxaminas para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de defectos óseos
creados en fracturas conminutas.
3. Uso de una o varias poloxaminas para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de fracturas
asociadas a osteopenia.
4. Uso de una o varias poloxaminas para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de
pseudoartrosis.
5. Uso de una o varias poloxaminas para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de pérdidas de la
reserva ósea.
6. Composición farmacéutica que consiste en una
disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias
poloxaminas para inducir la diferenciación de células mesenquimales
o progenitoras en osteoblastos.
7. Composición farmacéutica según la
reivindicación 6, donde la concentración total de poloxaminas está
comprendida entre el 2 y el 30%.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, donde la concentración total de poloxaminas está
comprendida entre el 10 y el 20%.
9. Procedimiento para la preparación de una
composición farmacéutica, como se describió en las reivindicaciones
6 a 8, que comprende a) mezclar una o varias poloxaminas en un
medio acuoso a pH entre 6.5 y 7.5 y a una temperatura entre 0 y
37ºC, y b) esterilización de la mezcla.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, que
comprende una etapa adicional después de la etapa a) y antes de la
etapa b), que consiste en añadir un agente isotonizante.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 9 y
10, donde el pH es 7.4.
12. Procedimiento según las reivindicaciones 9 a
11, donde la esterilización se lleva a cabo mediante un proceso
seleccionado del siguiente grupo: filtración en condiciones
estériles, aplicación de calor húmedo en el envase definitivo, y
radiaciones ionizantes o no ionizantes.
13. Método para inducir la diferenciación de
células mesenquimales o progenitoras, excepto células madre
embrionarias humanas, en osteoblastos que comprende poner en
contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o
varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras,
excepto células madre embrionarias humanas, que se encuentran en un
medio de cultivo y el método se realiza in vitro.
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- 2011-05-13 WO PCT/ES2011/070348 patent/WO2011144785A1/es active Application Filing
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