ES2367310T3 - Modelo transgénico de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
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Abstract
Un ratón transgénico que expresa un transgén que comprende una secuencia de ADN que codifica una Proteína Precursora Amiloide (APP) heteróloga que comprende la mutación Arctic (E693G) y una mutación patógena adicional de la EA (enfermedad de Alzheimer) seleccionada entre el grupo que consiste en KM670/671DF, KM670/671DY, KM670/671EF, KM670/671EY, KM670/671NL, KM670/671NY, KM670/671NF, KM670/671KL, KM670/671DL and KM670/671EL, y sin mutaciones de APP adicionales, en el que dicho transgén se une de manera operable a un promotor eficaz para la expresión de dicho gen en el tejido cerebral de dicho ratón, lo que da como resultado cantidades crecientes de agregados A13 solubles intracelulares, que incluyen péptidos Aß.
Description
La presente invención se refiere a un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer y a los trastornos neurológicos relacionados. La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir dicho ratón transgénico, y a los procedimientos de cribado de agentes terapéuticos o diagnósticos útiles en el tratamiento o el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno degenerativo progresivo e irreversible que produce discapacidades cognitivas, de memoria y de comportamiento. Es la causa más habitual de demencia entre los ancianos afectando aproximadamente al 5% de la población por encima de los 65 años y al 20% por encima de los 80 años de edad La EA se caracteriza por un comienzo insidioso y un deterioro progresivo en múltiples funciones cognitivas. La neuropatología implica depósitos proteínicos argirofílicos extracelulares e intracelulares. Los depósitos extracelulares, denominados placas neuríticas, están constituidos principalmente por péptidos de beta amiloide (Aβ) rodeados por neuritas distróficas (procesos neuronales hinchados, distorsionados). Los péptidos Aβ contenidos en estos depósitos extracelulares son fibrilares en su carácter con una estructura en lámina β plegada. Se puede teñir el Aβ en estos depósitos con algunos colorantes, por ejemplo, Rojo Congo y muestra una ultraestructura fibrilar: Estas características, adoptadas por los péptidos Aβ en su estructura fibrilar de placas neuríticas son la base del término genérico amiloide. Frecuentes placas neuríticas y depósitos de ovillos neurofibrilares en el cerebro son criterios diagnósticos de la EA, que se realizan cuando el paciente ha muerto. Los cerebros EA muestran también atrofia macroscópica del cerebro, pérdida de células nerviosas, inflamación local (microgliosis y astrocitosis) y a menudo, angiopatía amiloide congofílica (AAC) en las paredes de los vasos cerebrales.
Dos formas de péptidos Aβ,Aβ40 y Aβ42, son las especies dominantes en las placas neuríticas de EA (Masters y col., 1985), aunque Aβ40 es la especie destacada en el amiloide cerebrovascular asociada con la EA (Glenner y Wong, 1984). Las actividades enzimáticas permiten que se formen continuamente estas Aβ a partir de una proteína más grande denominada la proteína precursora amiloide (AAP) en sujetos sanos y que padecen EA en todas las células del cuerpo. Dos episodios principales de procesamiento de AAP (las actividades β y γ-secretasa, permiten la producción de péptido Aβ mediante escisión enzimática, mientras que una tercera actividad, denominada αsecretasa, evita el péptido Aβ mediante la escisión en el interior de la secuencia del péptido Aβ (revisado en Selkoe, 1994; documento US5604102). El Aβ42 es un péptido que tiene una longitud de cuarenta y dos aminoácidos, es decir, dos aminoácidos más largo en el extremo C, en comparación con Aβ40 E péptido Aβ42 es más hidrófobo, y se agrega más fácilmente en estructuras más grandes de péptidos Aβ, tales como dímeros Aβ, tetrámeros Aβ, oligómeros Aβ, protofibrillas Aβ o fibrillas Aβ son hidrófobas e insolubles, mientras que las otras estructuras son todas menos hidrófobas y solubles. Todas estas estructuras moleculares mayores de péptidos Aβ se definen individualmente basándose en su apariencia biofísica y estructural, por ejemplo, en el microscopio electrónico, y sus características bioquímicas, por ejemplo mediante análisis de cromatografía de exclusión por tamaño/transferencia western. Estos péptidos Aβ, particularmente Aβ42 se ensamblarán gradualmente en diversas estructuras moleculares mayores de Aβ durante toda la vida. La EA, que es un trastorno fuertemente dependiente de la edad, se producirá antes en el transcurso de la vida si su proceso de ensamblaje se produce más rápidamente en el cerebro del individuo. Esto es el punto central de la “hipótesis de la cascada amiloide” de la EA, que requiere el procesamiento de APP, los niveles de Aβ42 y su ensamblaje en estructuras moleculares mayores son la causa central de toda la patogénesis de la EA. Todas las diferentes neuropatologías de la EA cerebral y los síntomas de la EA tales como la demencia son, de alguna manera, producidos por los péptidos Aβ o sus formas de ensamblaje. La evidencia principal de la “hipótesis de la cascada amiloide” procede de los estudios genéticos de individuos de familias que padecen un comienzo temprano de la EA familiar como rasgo dominante. Estos estudios han desvelado que mutaciones raras en el gen de la AAP son suficientes para generar formas graves de EA. Las mutaciones se agrupan en y alrededor de Val 717 ligeramente en la dirección 3’ del extremo C de Aβ1-42 (Goate y col., 1991, Chartier-Harlan, y col., 1991, Murrell, y col., 1991) y una única mutación doble (670-671) inmediatamente en la dirección 5’ del extremo N de Aβ en una familia Swedish (Mullan, y col., 1992; US5795963). Las mutaciones de AAP, que enmarcan la secuencia del péptido Aβ (la mutación “Swedish”; Citron, y col., 1992, Cai y col., 1993), o que aumentan la relación de producción de Aβ42/Aβ40 y que generan también péptidos Aβ que se extienden en el extremo C para incorporar la mutación patogénica en el péptido Aβ, por ejemplo, Aβ50 (las mutaciones “717” están en la posición 46; Suzuki y col., 1994; Roher y co., 2003). De esta manera, las mutaciones “717”, además de Aβ40 natural y Aβ42 natural, generan también los péptidos London Aβ (V717I) y los péptidos Aβ Indiana (V717F, Aβ46 y formas más largas de Aβ) que forman rápidamente fibrilla Aβ. En contraste, la mutación Sueca genera únicamente niveles crecientes de péptidos Aβ40 y Aβ42 naturales. El comienzo temprano de la EA familiar se produce más a menudo por mutaciones en presenilina 1 (en el cromosoma 14; documentos US5986054; US5840540; US5449604) y en algunas casos por mutaciones en presenilina 2 (cromosoma 1). La presenilina 1 y la presenilina 2 son proteínas transmembrana politópicas que, junto las otras tres proteínas nicastrina, aph1 y pen-2, constituyen el núcleo funcional necesario del complejo de la γ-secretasa que permite la formación del péptido Aβ mediante la escisión enzimática de AAP (Edbauer y col., 2003). Todas las mutaciones patógenas de la EA en proteínas presenilina 1 y presenilina 2 aumentan significativamente la producción en exceso de Aβ1-42 (Schuener y col., 1996). La apolipoproteína E (ApoE) es, además de la edad, el factor de riesgo más importante para el comienzo tardío de la EA. Existen tres variantes de la proteína ApoE en seres humanos, debido a una única sustitución de aminoácidos en la proteína ApoE. La variante ApoE4 confiere un creciente riesgo de EA, mientras que la variante ApoE2 es protectora en comparación con la variante ApoE3 predominante (Strittmatter y col., 1993; Corder y col., 1993). Estos cambios de proteínas no son determinísticos, pero confieren una susceptibilidad creciente o decreciente a desarrollar la EA en una población. La capacidad de las variantes de ApoE de facilitar la deposición amiloide en modelos APP de ratones transgénicos de EA es mayor para ApoE4, intermedia para ApoE3 y menor para ApoE2, sugiriendo que el mecanismo patógeno de la EA es para potenciar el ensamblaje del péptido Aβ y/o la deposición amiloide (Fagan y col., 2002). Otras proteínas tales como a1-antiquimotripsina (Nilsson y col., 2001) y ApoJ/clusterina (DeMattos y col., 2002), potencian también el ensamblaje del péptido Aβ y/o la deposición amiloide en ratones APP transgénicos, de manera simular a ApoE. Neprilisina (NEP) y la enzima degradadora de la insulina (IDE) degradan los péptidos Aβ y están implicadas probablemente en la EA. Sin embargo, ningún genetista humano ha probado que estas proteínas estén implicadas en la EA. Una característica esencial es comprender mejor como el aumento de los niveles de Aβ o de sus agregados producen demencia y pérdida funcional en pacientes con EA. Se ha creído desde hace mucho tiempo que las fibrillas amiloides insolubles, el principal componente de la placa neurítica, son las especies patógenas en el cerebro con EA. Se ha demostrado que elevadas concentraciones de fibrillas Aβ son citotóxicas en modelos de cultivo celular de células nerviosas en el cerebro (Pike y col., 1991; Lorenzo y Yankner y col., 1994). Sin embargo la hipótesis de la fibrilla amiloide como la principal especie neurotóxica es inconsistente con la mala correlación entre la densidad de la placa neurítica y el marco de la demencia por EA y también con pequeños signos de neurodegeneración en ratones APP transgénicos actuales. Se podrían hacer desaparecer la unión las especies neurotóxicas solubles de intermedios de Aβ y sus sitios subcelulares de formación y distribución lo que explicaría mejor la hipótesis amiloide. Esta idea ha ganado apoyo a partir del reciente descubrimiento de la mutación Arctic (E693) de APP, que produce el comienzo temprano de la EA (documento W00203911; Nilsberth y col., 2001). La mutación se localiza en el interior de la secuencia del péptido Aβ. Los portadores de la mutación generarán por tanto variantes de péptidos Aβ, por ejemplo Arctic Aβ40 u Arctic Aβ42. Arctic Aβ40 y Arctic Aβ42 se ensamblarán mucho más fácilmente en estructuras moleculares mayores de péptidos Aβ que sean solubles y no fibrilares en su estructura, particularmente, protofibrillas Aβ denominadas LSAP (Protofibrillas amiloides solubles grandes). De esta manera, el mecanismo patogénico de la mutación Arctic difiere del de otras APP, las mutaciones PS1 y PS2 y sugiere que las estructuras moleculares mayores solubles de los péptidos Aβ, por ejemplo, las protofibrillas Aβ son la causa de la EA. Se ha demostrado recientemente que los péptidos Aβ oligoméricos solubles deterioran el potenciamiento a largo plazo (LTP), una medida de la plasticidad sináptica que se piensa que refleja la formación de la memoria en el hipocampo (Walsh y col., 2001). Además, estos péptidos Aβ Arctic oligoméricos muestran un efecto inhibidor mucho más profundo que los Aβ naturales en el LTP en el cerebro, debido probablemente a su fuerte propensión a formar protofibrillas Aβ (Klyubin y col., 2003).
Es muy necesario un modelo animal de la EA con las características de la enfermedad humana para mejorar la comprensión de la patogénesis de la EA ya para evaluar la eficacia de nuevos agentes terapéuticos. El modelo animal ideal de EA generaría la neuropatología completa de la EA y el fenotipo clínico, por ejemplo las disfunciones progresivas cognitivas y en la memoria. Se ha llevado a cabo un progreso importante en esta dirección usando la expresión transgénica en exceso de las mutaciones patógenas de la EA que albergan APP. Los modelos de APP transgénicos actuales de la EA muestran importantes características de la patogénesis de EA tales como la formación regioespecífica y dependiente de la edad de las placas difusa y neurítica en el cerebro. La patología amiloide está asociada con tau hiperfosforilada, inflamación local (microgliosis y astrocitosis) y en una extensión variable con angiopatía amiloide congofílica (AAC). Estos modelos se han generado mediante una expresión muy elevada del transgén de la APP humana, particularmente en las células nerviosas del cerebro. Los transgenes trasportan siempre una mutación patógena de la EA. De esta manera, se han usado una mutación “717” de APP (V717F; Games y col. 1995; documentos US2002104104; US5720936; US581 1633), o la mutación “Swedish” (KM670/671NL; Hsiao y col., 1996; Sturchler-Pierrat y col., 1997; documentos WO 09803644; US2002049988; US6245964; US5850003; US5877399; US5777194). Ratones doblemente transgénicos que contienen transgenes de APP mutante y de pesenilina-1 mutante desarrollan una formación acelerada de placas amiloides, pero los animales muestran aun un pequeño deterioro mental y no consiguen aún mostrar NFT, células nerviosas y atrofia cerebral (Holcomb y col., 1998; documentos US5898094; US2003131364). Además, los modelos de APP transgénicos actuales tienen probablemente bajos niveles de intermedios solubles en el proceso de fibrilación de Aβ tal como la protofibrillas Aβ, lo que puede ser de gran importancia para la patogénesis de la EA. Se han combinado previamente algunas de las mutaciones patógenas de la EA en un único transgén por ejemplo, se han usado la mutación “Swedish” (KM670/671NL)b y la mutación “717” de APP (Indiana, V717F) para potenciar y aumentar la formación de péptidos Aβ fibrilares y la formación de placa neurítica (Janus y col., 2001). De manera similar, se han combinado y usado la mutación “Swedish” (KM670/671NL), la mutación “Arctic” (E693G) y una mutación “717” de APP (Londres, V717I) en un intento de generar una formación más temprana y aumentada de placa (Teppner y col., 2003), de manera similar a las de los modelos de APP transgénicos Swedish + Indiana (Janus y col., 2001), debido a que los péptidos London Aβ facilitarán fuertemente la formación de fibrilla Aβ (Teppner y col., 2003; Roher y col., 2003). Se han demostrado las características únicas de Arctic Aβ40 y Arctic A42 de formar una abundancia de protofibrillas estables (Nilsberth y col., 2001; Lashuel y col., 2003). La marcada diferencia en la patología de cerebro humano con EA entre portadores de la mutación London APP (Lantos y col., 1992; Cairns y col., 1993) y la mutación Arctic APP, refuerza la distinción en las características químicas de los péptidos London Aβ y los péptidos Arctic Aβ para la neuropatología.
Se encuentra que las siguientes referencias son actualmente las más relevantes:
Stenh C. y col., dan a conocer en "Metabolic consequences of the arctic (E693G) APP alzheimer mutation", Society for Neuroscience. Abstract Viewer and Itenary Planner 2002, 32ª Reunión Anual de la Sociedad de Neurociencia, noviembre 02-07 de 2002, Resumen Nº 296.6 y en Neuroreport 13, 1857-60 (2002) una línea celular tumorigénica transfectada que alberga ADNc de APP con las mutaciones "Swedish" (KM670/671NL) y "Arctic" (E693G).
Hsiao y col., Science 274, 99-102 (1996) dan a conocer un ratón transgénico que alberga solo la mutación "Swedish" (KM670/671NL).
Mullan y col., Nature Genet. 1, 345-347 (1992) dan a conocer la herencia dominante de la mutación "Swedish" (KM670/671NL) en una familia con enfermedad de Alzheimer.
Nilsberth y col., Nat Neurosci. 4, 887-893 (2001) dan a conocer la herencia dominante de la mutación "Arctic" (E693G) en una familia con enfermedad de Alzheimer.
Teppner y col., 6ª Conf. Internat. AD/PD, Sevilla, España, comité nº 52 (2003), dan a conocer un intento preliminar de generar un ratón transgénico que alberga las mutaciones "Swedish" (KM670/671NL), "Arctic" (E693G) y "London" (V717I). No se describe la patología.
Roher y col., J Biol Chem. 279(7): 5829-36 (2004), dan a conocer que los péptidos Aβ se extienden más allá del aminoácido 42, por ejemplo. Aβ1-46 y Aβ1-50, en el tejido del cerebro con Alzheimer de un paciente que alberga una mutación de tipo "London" (V717F).
Kang y col., Nature 325, 733-6 (1987) describe la clonación del ADNc de APP695 humana.
A la vista de las limitaciones de los modelos de la técnica anterior, el objeto de la invención es proporcionar un modelo de ratón transgénico que muestre fenotipos más tempranos de la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA) que se puedan cuantificar. Esto podría permitir un cribado más rápido y económico de agentes farmacológicos en la industria farmacéutica y biotecnológica.
Se da a conocer un modelo de ratón de la EA y de los trastornos neurológicos relacionados que tienen patologías de producción de péptidos Aβ-40 y/o Aβ-42 Arctic y protofibrillas Aβ Arctic potenciados y una patología temprana impulsora de péptidos Aβ Arctic protofibrilares y oligoméricos solubles, que incluye la agregación de Aβ en el interior de las neuronas del cerebro.
La tinción intraneuronal inmunopositiva de Aβ (punteada y fuerte) fue resistente al pretratamiento con ácido fórmico concentrado, que es una característica típica del amiloide, es decir, de agregados Aβ con una estructura de lámina β (protofibrillas), y que se localizó en la capa de células piramidales de CA1 en el hipocampo y en neuronas dispersas de la lámina inferior en la corteza cerebral así como otras neuronas en el cerebro.
Se da a conocer un ratón transgénico con EA, que presenta agregación de Aβ intracelular temprana y aumentada, que se puede medir de manera precisa. Esta agregación de Aβ intracelular se produce antes de y aumenta gradualmente en una cantidad antes del comienzo de la formación de la placa extracelular. La agregación de Aβ intraneuronal soluble temprana y potenciada es un fenotipo patológico de la EA que va más allá de los modelos APP de ratones transgénicos descritos anteriormente. Este fenotipo de la EA está presente en el modelo de ratón de acuerdo con la presente invención mucho antes que en cualquier marcador de la EA que se encuentre en modelos animales anteriores.
Se da a conocer también un medio para la identificación de agentes que interfieren, retrasan o inhiben el proceso de la enfermedad de Alzheimer en una etapa temprana Dichos agentes serían de significativa importancia clínica para el tratamiento de la etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer o la prevención de su manifestación. La provisión del modelo de ratón de acuerdo con la presente invención puede acortar mucho el tiempo necesario para el cribado de dichos agentes.
De esta manera, la medida de la extensión de la agregación de Aβ intracelular permite predecir también la posterior deposición de Aβ extracelular por adelantado. Se puede realizar esta predicción tan pronto como en 1-2 meses del desarrollo de la neuropatología de la EA. Con las técnicas de la técnica anterior, es posible solo después de 15 meses La presente invención puede usarse de esta manera para cribar más rápida y económicamente los capaces que son capaces de evitar, inhibir e invertir la neuropatología de la EA e una etapa más temprana.
El modelo de ratón transgénico proporcionado por la invención muestra también una reducción en el peso del cerebro, lo que sugiere cambios atróficos en el cerebro tal como los observados normalmente en un cerebro humano que padecía la patogénesis de la EA.
El ratón transgénico expresa un transgén que comprende una secuencia de ADN que codifica una Proteína Precursora Amiloide (APP) heteróloga que comprende la mutación Arctic (E693G) y una mutación patogénica adicional de la EA (Enfermedad de Alzheimer) seleccionada entre el grupo constituido por KM670/671DF, KM670/671DY, KM670/671EF, KM670/671EY, KM670/671NL, KM670/671NY, KM670/671NF, KM670/671KL, KM670/671DL y KM670/671EL, y sin mutaciones adicionales de APP, en el que dicho transgén se une de manera operable con un promotor eficaz para la expresión de dicho gen en el tejido cerebral de dicho ratón lo que da como resultado cantidades crecientes de agregados de Aβ solubles intracelulares, que incluyen péptido Aβ.
De acuerdo con otra forma de realización, el ratón transgénico de acuerdo con la presente invención puede comprender además una construcción directora integrada de manera homóloga para al menos uno de los genes de la enzima neprilisina o degradadora de la insulina (IDE), que perturba estos genes mediante la ablación del gen (inactivación) y aumenta la producción de del péptido Aβ-40 y/o Aβ-42 Arctic.
De acuerdo con una forma de realización actualmente preferida, el animal transgénico es un ratón que alberga un transgén que codifica una proteína precursora amiloide (APP) constituida por la mutación Arctic (E693G) y la mutación Swedish KM670/671NL) y sin mutaciones adicionales de APP.
El modelo de la EA de ratón transgénico se define en la reivindicación 1.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento para preparar dicho ratón transgénico. El procedimiento de producción de dicho ratón transgénico se define en la reivindicación 7.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento de cribado, en el que el ratón transgénico se usa para cribar los agentes útiles para tratar, evitar o inhibir la enfermedad de Alzheimer. Se define dicho procedimiento en la reivindicación 11.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento de cribado, en el que el ratón transgénico se usa para cribar agentes diagnósticos para la enfermedad de Alzheimer Se define dicho procedimiento en la reivindicación 12.
La presente invención proporciona un modelo de ratón de la EA y trastornos neurológicos relacionados que tienen patologías de formación de protofibrillas Aβ y agregación intraneuronal de péptidos Aβ potenciadas.
Los ratones transgénicos y su progenie, que producen normalmente péptidos Arctic Aβ en el tejido cerebral, se pueden usar como modelo de una variedad de enfermedades y para el cribado de fármacos, ensayo de diversos compuestos, evaluación de marcadores diagnósticos así como otras aplicaciones.
Fig. 1: Gel de ADN teñido con bromuro de etidio que muestra la presencia de una señal positiva de la PCR en fragmentos de ADN que tienen una longitud de 428 pb con la pareja de cebadores en la dirección 5’ (A) y 441 pb con la pareja de cebadores en la dirección 3’ (B) Se ha analizado el ADN genómico de diferentes fundadores y se han asignado a fundadores Thy-SwvedishArcticAPP positivos para la PCR los números de línea A, B, C, y D, tal como denotan anteriormente los geles Los patrones del peso molecular del ADN (“mw-std”) muestran las longitudes de diversos fragmentos de ADN predefinidos. Las dos parejas de cebadores enmarcan la región completa del transgén APP y del promotor basal del promotor Thy-1.
Fig. 2: Imagen del formador de imágenes de fósforo de una transferencia en hendidura que refleja la emisión radioactiva de muestras de ADN genómico hibridadas con sondas de ARNc de ratones individuales de las diferentes líneas fundadoras (líneas A, B, C y D de Thy-SwedishArcticAPP) y ratones no transgénicos, como se denota para cada ratón individual encima de la correspondiente señal fotográfica (izquierda) y la estimación cuantitativa de estas señales para medir el número de copias de las diferentes líneas fundadoras de ratones ThySwedishArctic-APP (derecha).
Fig. 3 Gráfica que representa la proteína APP con el dominio kunitz (sombreado) que permite el corte y empalme alternativo de APP El dominio de los péptidos Aβ (negro) reside parcialmente en el interior del dominio transmembrana. Se indican las localizaciones de los epítopos de los anticuerpos APP usados en el experimento. En la isoforma de proteína APP770, se localizan los epítopos entre los aa 66-81 (22C11) y el aa 672-687 (6E10). Los anticuerpos 22C11 detectan APP tanto humano como murino endógeno, mientras que el anticuerpo 6E10 detecta únicamente APP humano. La transferencia Western muestra el aumento de expresión relativa tres veces de APP en el cerebro del ratón transgénico Thy-SwedishArctic-APP, línea fundadora B. La tinción de Coomasie (“Cooma.”) es una medida de la proteína total cargada en el gel (A). Se verificó la presencia de APP humana y de péptidos Arctic Aβ en el cerebro del ratón transgénico Thy-SwedishArctic-APP, línea fundadora B (“B”) y la ausencia en el cerebro del ratón no transgénico (“ntr”) (B) mediante tinción con el anticuerpo 6E10. Ya que dicho anticuerpo detecta únicamente la presencia de APP humana, se verificó de esta manera la funcionalidad del transgén.
Fig. 4: Proteína APP en ratón transgénico Thy-SwedishArctic-APP joven. Expresión de la proteína APP en el cerebro de un ratón Thy-SwedishArcticAPP de 1 mes de edad, línea fundadora B (a – hemisferio izquierdo y b– hipocampo) y un ratón no transgénico (c – hipocampo) teñido con 6E10 (epítopo 1-16 en Aβ, este anticuerpo es específico de APP y Aβ humanas). La tinción visualiza la distribución neuronal de la síntesis de proteína APP en el cerebro.
Fig. 5: inmunotinción puntuada de Aβ intraneuronal que muestra la agregación de Aβ en la corteza cerebral en el ratón Thy-SwedishArctic APP (a, marcada por flechas) de acuerdo con la presente invención y un ratón transgénico Swedish APP (byc). Los ratones tenían la misma expresión de APP y el modelo de expresión anatómica (tanto estos parámetros como el de la edad con una fuerte influencia de los fenotipos EA en cualquier modelo de ratón transgénico). Se encontró poco o muy poco Aβ intraneuronal en un ratón Thy-Swedish APP de 2 meses de edad (b). Algunas neuronas corticales contienen agregados Aβ intraneuronales a los 15 meses de edad en ratón transgénico Thy-Swedish APP (c), pero todavía muy débil y menos frecuente que en el ratón transgénico Thy-SwedishArctic APP a los 2 meses de edad (a). No se encontró inmunotinción de Aβ en ratones no transgénicos (d).
(e) representa una vista superior de agregados Aβ en el hemisferio derecho de un cerebro de un ratón transgénico Thy-SwedishArctic-APP. Las flechas apuntan a la pronunciada tinción inmunoreactiva de Aβ resistente a ácido fórmico en neuronas piramidales CA1 del Thy-SwedishArctic APP. La barra de la escala mide 20 µm (a-d).
Fig. 6: Proteína Aβ en ratón transgénico Thy-SwedishArctic-APP de 2 meses de edad (línea fundadora B) y ratón transgénico Thy-Swedish-APP. La extracción química secuencial de tejido cerebral muestra que la mayor parte de Aβ en el ratón Thy-SwedishArctic-APP es soluble, es decir, se puede recuperar mediante extracción química suave en tampón carbonato y que poco Aβ permanece en el tejido tras la reextracción en SDS al 1% o ácido fórmico al 70º, es decir, como Aβ insoluble (a, FA = ácido fórmico). Los niveles de Aβ1-40 (b)yAβ1-42 (c), tal como se midieron mediante ELISA, en ratones transgénicos Thy-SwedishArctic de 2 meses de edad, se redujeron en comparación con ratón transgénico Thy-Swedish, de la misma edad y que expresa la misma cantidad del transgén (la proteína APP humana). En contraste, los niveles de Aβ totales, es decir, tanto Aβ1-40 como Aβ1-42 medidos en conjunto con la transferencia western, presentan un aumento de cinco veces en el tejido cerebral de ratón transgénico Thy-SwedishArctic de 2 meses de edad en comparación con ratón transgénico Thy-Swedish de la misma edad que expresa la misma cantidad del transgén (la proteína APP humana) (d). Los resultados (b-d) sugieren fuertemente que agregados Aβ solubles tales como protofibrillas están presentes en el cerebro del ratón transgénico Thy-SwedishArctic de 2 meses de edad, debido a que la transferencia western es un procedimiento de desnaturalización en el que agregados Aβ solubles se disocian en sus componentes individuales, y péptidos Aβ individuales proporcionan un valor numérico mayor. En contraste, ELISA es una técnica no desnaturalizante, por la cual cada agregado Aβ soluble se medirá como una única unidad y el valor numérico será inferior.
Fig. 7: La Aβ puntuada intraneuronal (marcada mediante flechas en A-D) es muy fuerte y frecuente en ThySwedish-Arctic APP tanto a los 2 meses (B) como a los 5 meses (D) de edad. En contraste, la inmunotinción intraneuronal de Thy-Swedish APP (emparejada para la expresión del transgén de APP), Aβ tanto a los 2 meses (A) como a los 5 meses (C) de edad es infrecuente y escasa. El análisis de cuantificación de imágenes (E) muestra un aumento de 7 veces o más en la inmunotinción puntuada de Aβ intraneuronal en Thy-SwedishArctic APP (barras sólidas) en comparación con Thy-Swedish APP (barras abiertas).
Fig. 8: Gráfica que muestra que un aumento en la agregación de Aβ intraneuronal precede un aumento en la deposición de la placa de Aβ extracelular durante al menos 2 meses Se cuantificó la fracción de área de la agregación de Aβ intraneuronal en las neuronas piramidales CA1 (eje y a la izquierda) y la frecuencia de deposición de la placa de Aβ extracelular en el hipocampo (eje y a la derecha escala logarítmica) en una cohorte de ratones transgénicos Thy SwedishArctic APP de diversas edades. Cada cuadrado sólido representa la Aβ intraneuronal (% de fracción del área) de un único ratón, mientras que el correspondiente cuadrado abierto localizado por debajo representa la frecuencia de la placa de Aβ en el mismo ratón. El resultado representa el promedio ± S.E.M. del análisis de algunas secciones de tejido de ratones transgénicos individuales.
Fig. 9: Diagrama de dispersión que muestra el promedio del grupo (línea) y la distribución entre individuos del peso del cerebro del hemisferio izquierdo tal como se diseccionó de las cohortes de ratones transgénicos Thy-SwedishArcticAPP y Thy-SwedishAPP a los 2 meses de edad. Los ratones transgénicos Thy-SwedishArcticAPP muestran un peso cerebral reducido ((221 ± 9mg; n=9), en comparación con ratones transgénicos Thy-SwedishAPP (239 ± 5mg; n=8), lo que sugiere cambios atróficos en los cerebros de ratones transgénicos Thy-SwedishArctic APP, tal como se observó normalmente en un cerebro humano que padecía la patogénesis de la EA.
Fig. 10: Placas seniles extracelulares en el hipocampo de un ratón transgénico Thy-SwedishArcticAPP a los 7 meses de edad Se observó la inmunoreactividad de Aβ con dos anticuerpos diferentes que eran específicos de los fragmentos de aminoácidos cortos en los extremos C-terminales de Aβ42 (a)yAβ40 (b) y de esta manera no detectan APP o los fragmentos de APP (Näslund y col., 2000). La inmunoreactividad de Aβ fue resistente a y se potenció mediante pretratamiento con ácido fórmico concentrado. Las flechas apuntan a depósitos inmunoreactivos de Aβ que se mostraron a mayor aumento (imágenes entre a y b). La inmunotinción de Rojo Congo y GFAP combinados muestra una astrogliosis robusta que rodea una placa amiloide compacta (c), que muestra una birrefringencia oro-verde clásica en luz polarizada (d).
Los transgenes de acuerdo con la presente invención comprenden una secuencia de polinucleótidos, más específicamente un polipéptido APP heterólogo que comprende las mutaciones descritas en el presente documento, y se unen de manera operable a un promotor de la transcripción capaz de producir la expresión del polipéptido APP heterólogo en el tejido cerebral del ratón transgénico.
Dicho promotor puede ser constitutivo o inducible y puede afectar la expresión de un polinucleótido de una manera específica de tejido. Los promotores específicos de tejidos incluyen, sin limitación, el promotor de la enolasa específico de neurona (NSE), el promotor de la cadena ligera de neurofilamento (NF-L) y de la cadena pesada de neurofilamento (NF-H), el promotor de la proteína priónica (PrP), el promotor de la tirosina hidroxilasa, el promotor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el promotor de la glucoproteína thy1, el promotor de la β actina, el promotor de la ubiquitina, el promotor del virus 40 de simio (SV40), y los promotores específicos de genes tales como el promotor de APP.
Las proteínas precursoras amiloides (APP) comprenden un grupo de glucoproteínas transmembrana expresadas de manera ubicua cuya heterogeneidad surge del corte y empalme alternativo y del procesamiento después de la traducción [Selkoe, D. J. (1994) NCBI, número de acceso P=5067, SEQ ID NO: 1]. Además de las formas de corte y empalme de los restos 751 y 770 que se expresan mucho en células no neuronales a lo largo del cuerpo, las neuronas expresan más abundantemente la isoforma del resto 695. Todas las isoformas son precursoras de diversos metabolitos que son el resultado de diferentes condiciones fisiológicas o patológicas inducidas por escisión proteolítica. La propia APP, tal como se usa de acuerdo con los principios de esta invención, puede ser cualquiera de las formas de corte y empalmen alternativas de esta molécula y se puede usar tanto como forma glicosilada o no glicosilada.
En una forma de realización adicional, el animal comprende una construcción directora integrada de manera homóloga en una localización cromosómica endógena con el fin de potenciar los niveles de los péptidos Aβ-40 y/o Aβ-42 Arctic, mediante aclaramiento desvirtuado, por ejemplo, mediante la ablación del gen (inactivación) de los genes de la enzima neprilisina y/o que degradan la insulina (IDE) en los tejidos de dichos animales transgénicos que albergan la mutación Arctic (E693G) y generar por tanto un fenotipo similar al del descrito en la invención, es decir, la agregación de Aβ temprana y aumentada.
Antes de la transfección, dichos transgenes adicionales se cruzan con el transgén que comprende la mutación Arctic.
[0028] La invención proporciona además un ratón transgénico que alberga una copia de un transgén de la invención integrada de forma tanto homóloga como no homóloga en una localización del cromosoma endógeno de tal manera que produce péptidos Arctic Aβ. Dichos animales transgénicos se producen normalmente introduciendo el transgén
o la construcción directora en un huevo fertilizado o embriocitoblasto, normalmente mediante microinyección, electroporación, lipofección, o biolística.
Los ratones transgénicos de acuerdo con la presente invención tienen al menos un alelo APP endógeno inactivado, son preferiblemente homocigóticos para los alelos APP inactivados, y son sustancialmente incapaces de dirigir de eficiente expresión del APP endógeno (es decir, natural).
En una forma de realización preferida, un ratón transgénico es homocigótico para los alelos APP endógenos inactivados y sustancialmente incapaz de producir APP de murino codificado por un gen APP endógeno (es decir, que se produce naturalmente). Dicho ratón transgénico, que tiene inactivados los genes APP endógenos es un receptor hospedador preferido de u transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo, preferiblemente una mutación Arctic humana y la mutación Swedish APP (KM670/671NL) (numeración APP770) para potenciar la producción del péptido Aβ40 y Aβ-42 Arctic.
Se puede sustituir dicha mutación Swedish por mutaciones similares tales como KM670/671DL, KM670/671DF, KM670/671DY, KM670/671EL, KM670/671EF, M670/671EY, KM670/671NY, KM670/671NF, KM670/ 671KL (numeración APP770)
Sin embargo, la mutación Swedish (KM670/671NL) es actualmente la mutación que es la más preferible combinada con la mutación Arctic.
Los compuestos encontrados que tienen un efecto sobre la expresión del péptido Aβ Arctic, o para promover o inhibir cualquiera de los diversos efectos bioquímicos de los péptidos Aβ Arctic y/o de las formas agregadas de los péptidos Aβ Arctic tales como protofibrillas Aβ, se ensayan y se usan adicionalmente a continuación en el tratamiento de la EA y/o de los trastornos neurológicos relacionados.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se pueden usar el animal transgénico o su progenie como puntos de partida para el diseño racional de fármacos para proporcionar ligandos, fármacos terapéuticos u otros tipos de pequeñas moléculas químicas así como proteínas, anticuerpos o productos naturales. Alternativamente, pequeñas moléculas u otros compuestos tal como se ha descrito e identificado anteriormente mediante los ensayos de cribado anteriormente descritos pueden servir como compuestos “compuestos principales” en el diseño de fármacos racionales.
Procedimientos generales
Se siguieron por lo general técnicas de biología molecular normalizadas conocidas en la materia, como en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), y en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989) y que no se describen específicamente en el presente documento. Se siguieron técnicas transgénicas normalizadas para la introducción de un gen extraño en huevos fertilizados de ratón conocidos en la materia y que no se describen específicamente como en Nagy y col, Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1986, 1994, 2002), ISBN 0-87969-574-9. (Figs. 1 y2). Se siguieron procedimientos generales en inmunohistoquímica Se siguieron generalmente procedimientos normalizados conocidos en la materia y que no se describen específicamente como en Stites y col. (eds), Basic and Clinical Immunology (8ª Edición), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994) y Johnstone y Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982 (Figs. 4-5, 7-8 y 10).
Subclonación de vectores de expression Thy-SweArcAPP)
Las construcciones transgénicas usadas para este estudio contienen el vector de expresión Thy-1 de murino y los ADNc de APP. Se usó la isoforma APP695, que es la isoforma APP predominante en el cerebro. Se hicieron modificaciones en el clon de ADNc de APP humano (Kang y col., 1987) entre NruI (+145nt) y SmaI(+3100) con la extensión enzimática del cebador usando el kit de mutagénesis Transformer (Clontech). Se usaron los siguientes cebadores:
CACTCGGTGCC CCGCGCGCGGCCGCCATGCTGCCCGGTTTGGC (SEQ ID NO: 2) y CATAAATAAATTAAATAAAATAACCGCGGCCGCAGAAACATACAAGCTGTCAG (SEQ ID NO: 3) para incorporar sitios Notl flanqueantes y una secuencia Kozak para el inicio mejorado de la traducción
CAAATATCAAGACGGAGGAGATATCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGAC (SEQ ID NO: 4) para introducir la mutación KM670/671NL y CAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGGAGATGTGGGTTCAAACAAAG (SEQ ID NO: 5) para introducir la mutación E693G. Se seleccionaron inicialmente los clones mediante la PCR seguido por la digestión de la enzima de restricción y se comprobaron los clones seleccionados mediante la secuenciación del ADN a través de la región de codificación completa de la proteína precursora amiloide (APP). Se digirieron finalmente lo clones correctos con NotI, se ligaron enromados en el extremo en el sitio XhoI del casete de expresión Thy1. Se linealizó la construcción de ADN con NotI para permitir eliminar las secuencias estructurales del vector del casete de expresión. Tras la purificación del gel de β-agarosa (SeaPlaque GTG) con β-agarasa (Invitrogen) y extracción con fenol-cloroformo se microinyectó la construcción de ADN linealizado (2 µg/ml) en oocitos pronucleares de la línea B6-CBA-F1 de ratón híbrido (B&M, Dinamarca). Se prefiere la técnica de microinyección pronuclear. Se inyectaron unidades de transcripción de una construcción de ADN recombinante de la invención en pronúcleos de embriones animales y se reprodujeron los transgénicos fundadores obtenidos para establecer la línea transgénica.
Genotipificación de camadas
Se genotipó la descendencia resultante cortando puntas de la cola de individuos destetados, extrayendo el ADN usando un kit de extracción de ADN Quiagen y se analizaron con la PCR a través de la secuencia de codificación de APP y el promotor basal de la glucoproteína Tht-1. Se diseñaron dos parejas de cebadores Thy-1 Prom (GAATCCAAGTCGGAACTCTT, SEQ ID NO: 6) junto con APP-SQ6 (TGTCAGGAACGAGAAGGGCA, SEQ ID NO: 7), y también APP-SQ3 (GCCGACCGAGGACTGA-CCAC, SEQ ID NO: 8) junto con APP-SQ7 (GACACCGATGGGTAGTGAA, SEQ ID NO: 9) (Fig. 1).
Cuidado animal y disección y manipulación del tejido cerebral
Se anestesiaron ratones transgénicos SwedishArcticAPP con 0,4 ml de Avertin (25 mg/ml) comprobado para la pérdida de reflejos espinales y a continuación se perfundieron intracardialmente con solución salina al 0,9%. Se preparó el cerebro y se cortó en dos hemisferios; uno de ellos se sumergió en PFA al 4% (paraformaldehído)/1 x SPB (Tampón Fosfato de Sorensons, KH2PO4 23 mM, Na2HPO4 70,5 mM X 2H2O, NaN3 5 mM, pH 7,4) durante la noche, 4ºC. Después de esto, el cerebro se transfirió secuencialmente y se sumergió en Sacarosa al 10%, 20% y 30% (peso/volumen)/0,1 X solución de SPB durante cada noche. Se llevó a cabo el procedimiento de la sacarosa para preservar mejor la morfología del tejido tras la congelación. El cerebro se mantuvo en una solución de sacarosa al 30% hasta que se cortaron las secciones del criostato.
Análisis de la proteína
Se diseccionaron los hemisferios izquierdos de los cerebros de las diferentes líneas fundadoras y se pesaron (Fig. 9) (así como los otros órganos medidos). Se extrajo el tejido cerebral en Tween-20 al 0,2% en 1 x PBS con comprimidos inhibidores de la proteasa (número de catálogo 1836153, Roche, un comprimido es suficiente para una solución de extracción de 10 ml) (Fig. 3). La relación de extracción era de 1:10 (peso del tejido; tampón de extracción) y se extrajo el tejido en 2 x 10 lotes en hielo. Las soluciones de extracción se centrifugaron a 17900 g a 4ºC durante 15 min. Los sobrenadantes se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC. Alternativamente, los tejidos cerebrales usados para la transferencia western se homogeneizaron en 1:10 (relación volumétrica de extracción del tejido) en Na2CO3 100 mM con NaCl 50 mM (pH 11,5) con inhibidores de la proteasa, se centrifugaron a 100.000 g a +4ºC durante 1 h y los sobrenadantes se almacenaron congelados a -80ºC antes del análisis. Se volvió a extraer el residuo en SDS al 2% y se sonicó de manera breve, se centrifugó tal como se ha descrito anteriormente. Finalmente, se volvió a extraer el residuo insoluble en SDS en ácido fórmico al 70% (Fig. 6). Todas las muestras (cada una ~ de 40 µg) se desnaturalizaron añadiendo mercaptoetanol al 1% y 1 X Tampón de muestra (concentración final), se mezclaron las muestras y se hirvieron durante 5 min y a continuación se cargaron en un gel de Tris-Glicina al 4-20% (InVitrogen). 1 X Tampón de muestra contiene Glicerol al 10%, SDS al 2%, Tris-HCl 50 mM y Bromofenol azul (diluido x40 procedente de una disolución madres al 1,5%). El tampón de avance en SDS-PAGE usado incluye Tris-base 250 mM, Glicina 1,9 M y SDS 35 mM (Dodecil Sulfato de Sodio). Se hizo avanzar el gel a 96V. Se prehumedeció un filtro de nitrocelulosa en ddH2O y a continuación se equilibró en tampón 1 X Transferencia (Tris-base 30 mM, Glicina 230 mM, pH 8,3) con metanol al 20%. Se ensambló el conjunto de transferencia en un tampón de transferencia y se hizo avanzar la transferencia a 55V, 4ºC durante la noche. Antes de las incubaciones con el anticuerpo, se hirvió el filtro de nitrocelulosa en 1xPBS durante 5 min, para estabilizar y aumentar la exposición a los epítopos en Aβ. A continuación se bloqueó el filtro en leche en polvo desnatada al 1% p/v preparada recientemente, Tween-20 al 0,1% en 1X tampón-TBS (Tris básico 100 mM, NaCl al 0,9%, pH 7,5) durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el bloqueo, se incubó el filtro con anticuerpo primario (0,5 µg/ml de 6E10
o 2 µg/ml de 22C11) en Tween-20 al 0,1% en 1 X tampón TBS durante 1 h a temperatura ambiente. Se siguió esto por un lavado 3-4 veces (5 min) a temperatura ambiente con Tween-20 al 0,1% en 1 X tampón TBS. El anticuerpo secundario, 0,2 µg/ml de IgM-HRP dirigida contra IgG de ratón (Pierce), a temperatura ambiente con leche en polvo desnatada al 1% p/v, Tween-20 en tampón 1 X TBS, y se incubó el filtro en esta solución durante 30 min. A continuación se lavó el filtro tres veces más en Tween-20 al 0,1% en tampón 1 X TBS, y la última fue un enjuague final en tampón 1 X TBS sin Tween antes de la incubación de 5 min en SuperSignal (Pierce-ECL). Se dejaron proceder todas las incubaciones sobre una plataforma en agitación. El filtro de la transferencia resultante se incubó finalmente frente a una ECL-Hyperfilm (Amersham) (Fig. 3, 6). ELISA de Aβ: Se analizaron los extractos de tejido
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cerebral soluble en SDS para los niveles de Aβ1-40 y Aβ1-42 con ELISA usando los kits ELISA del beta Amiloide 140 y 1-42 (Signet Laboratories), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para asegurar el mismo reconocimiento de los epítopos entre Arctic y Aβ natural mediante los anticuerpos usados en el ELISA, se analizaron diluciones en serie de Aβ1-40 Arctic sintético y Aβ1-40 natural en su forma monomérica con el kit ELISA del Beta Amiloide 1-40.
Inmunohistoquímica
Se llevaron los hemisferios cerebrales de las líneas fundadoras a una etapa de congelación y se cortaron secciones de 25 µm con un microtomo de deslizamiento y se almacenaron a +4ºC hasta el uso. Para la inmunotinción se utilizó un kit M.O.M de Vector. Las secciones de tejido fijo congelado se incubaron en tampón citrato precalentado (25 mM, pH 7,3) durante 5 min a 85ºC. Se siguió esto por un enjuague en 1 X PBS. Las secciones de tejido fijo congelado se incubaron en ácido fórmico concentrado (96%) durante 5 min a TA y a continuación se enjuagaron en agua durante 10 min. Después las secciones se incubaran con H2O2 (0,3%) en un bloque de DAKO al 50%/1 X PBS al 50 % durante 15 min a temperatura ambiente para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Se enjuagaron de nuevo una vez las secciones de cerebro en 1 X PBS antes de la incubación con un Reactivo de Bloqueo M.O.M de IgG de ratón durante 1 h para bloquear la unión no específica. A continuación se permeabilizaron las secciones con 1 X PBS (pH 7,4) + Triton X-100 al 0,4%), y se enjuagaron brevemente durante 5 min dos veces en 1 X PBS (pH 7,4) para aumentar la tensión superficial. Se usó diluyente
M.O.M. de Ratón durante la incubación de 5 min para bloquear la unión no específica y se eliminó con un trapo el exceso. Se dejó proceder la incubación con 0,2 µg/ml de 6E10, 14 µg/ml de GFAP (clon G-A-5; 1 x 1500) 1,5 µg/ml de anticuerpos Aβ42 y 1,7 µg/ml de anticuerpos Aβ40 (anticuerpos primarios) en diluyente MOM (Triton X-100) al 0,1%, durante la noche a 4ºC. Tras otro lavado con tampón 1XPBS, se incubaron las secciones con reactivo biotinilado con M.O.M. dirigido contra IgG de ratón o IgG de conejo en diluyente M.O.M./Triton X-100 al 0,1% durante 8 min. Se enjuagaron las secciones una vez más en tampón 1XPBS. Se dejó proceder la incubación con un lapso de 30 min con el complejo ABC del kit M.O.M. (complejo de avidina-biotina, seguido por un enjuagado en 1xPBS. Después de eso, se usó un kit con un sustrato basado en peroxidasa de rábano picante (NOVA Red, Vector) para desarrollar la tinción durante 10 min. Finalmente, se lavaron brevemente las secciones en ddH2O, se deshidrataron en EtOH al 70%, 95%, 99,5%, se dejaron secar al aire, se deshidrataron en xileno y se montaron en DPX (Dibutil Ftalato Xileno, VWR) montando el medio para el microscopio óptico. Todas las incubaciones anteriores, a no ser que se establezca de otra manera, se llevaron a cabo a temperatura ambiente y en una plataforma de agitación (Figs. 4-5, 7-8 y 10). Se llevó a cabo la tinción del Rojo Congo incubando secciones de tejido con disolución alcalina saturada de cloruro de sodio (NaOH 10 mM) durante 20 min seguido por Rojo Congo (0,2% p/v) en disolución alcalina saturada de cloruro de sodio (NaOH 10 mM) durante 15 min y deshidratación en EtOH al 70%, 95%, 99,5%. Se dejaron secar al aire las secciones de tejido, se deshidrataron en xileno y se montaron en DPX (Dibutil Ftalato Xileno, VWR) montando el medio para el microscopio óptico con luz polarizada.
Análisis por imágenes (Figs. 7-8)
Se investigaron secciones de tejido coronal separadas por igual a lo largo del eje rostral-caudal del hipocampo, 4-5 secciones de tejido de cada animal, capturando cuatro campos de imágenes diferentes de cada sección de tejido separada. Las imágenes de la tinción inmunoreactiva de 6E10 Aβ se capturaron a un aumento de 400X en un microscopio Leica con una cámara CCD de color enfriada a unas configuraciones de luz y filtro definidas. Las imágenes capturadas de agregados Aβ intraneuronales en las neuronas piramidales CA1 en el hipocampo dorsal se convirtieron a imágenes en la escala de los grises, se procesaron con función de delineación para enfocar bordes y permitir una segmentación precisa. Se segmentaron las imágenes con un comando de umbral automático (Qwin, Leica). Los resultados se expresan como fracción de área (áreatot teñida/áreatot medida expresada en %) y se presentaron como promedio ± S.E.M. entre las secciones de tejido analizadas de cada ratón transgénico individual
RESULTADOS
Cribado mediante la PCR
Los resultados de la genotipificación mediante PCR se observan a la derecha (Fig. 1). Ambos conjuntos de cebadores identificaron 4 ratones fundadores (de 13) que tenían la construcción mThyl-SwedishArctic-hAPP y se establecieron estas cuatro líneas fundadoras. Líneas A-D de Thy-SwedishArcticAPP. Se podrían detectar parejas de cebadores con fragmentos de ADN de 428 pb de longitud en la dirección 5’ (A) y 441 pb de longitud en la dirección 3’ (B). Se genotipó la descendencia de cada línea fundadora de la misma manera (Fig. 1).
Transferencia en hendidura
Se analizaron numerosas copias en la descendencia positiva del transgén individual usando la transferencia en hendidura. Las cuatro líneas fundadoras Thy-SwedishArcticAPP incorporaban números variantes de copias de ADN, teniendo la línea fundadora B el número más elevado de copias (41 ± 2), teniendo en cuenta que los ratones no transgénicos tienen dos copias del gen Thy1 endógeno (Fig. 2).
Transferencia Western y ELISA
Se muestran APP humana y Aβ de síntesis procedentes de los extractos cerebrales de las diferentes líneas fundadoras Thy-SwedishArctic. El dibujo ilustra la proteína precursora amiloide (APP) y los epítopos dentro de APP que están dirigidos por los anticuerpos. En la isoforma de la proteína APP770, los epítopos dirigidos son los amino 66-81, para 22C11, y los aminoácidos 672-687, para 6E10. Se ha analizado la intensidad de las manchas con el software de imágenes Scion y se ha calculado la expresión en exceso con respecto a APP en las diferentes líneas fundadoras. Se ha confirmado la misma carga de los geles con la tinción de Coomassie y el análisis de la proteína total. Se puede estimar la expresión relativa a APP con el anticuerpo 22C11 que permite la detección del APP murino endógeno y del transgén APP humano. En contraste, el anticuerpo 6E10 detecta únicamente el transgén APP humano y los péptidos Aβ. Se encontró que la línea fundadora B Thy-SwedishArcticAPP mostraba una expresión de APP en exceso de 3 veces (Fig. 3). La extracción química secuencial de tejido cerebral de ratón transgénico Thy-SwedishArctic de 2 meses de edad muestra que la mayor parte de Aβ es soluble, es decir, se puede recuperar mediante extracción química suave en tampón carbonato y que permanece poco Aβ en el tejido tras la reextracción en SDS al 1% o ácido fórmico al 70%, es decir, como Aβ insoluble (Fig. 6, a). Los niveles de Aβ1-40 (Fig. 6, b)yAβ1-42 (Fig. 6, c) tal como se midieron mediante ELISA, en ratón transgénico Thy-SwedishArctic, se redujeron en comparación con ratones transgénicos Thy-Swedish que son de la misma edad y expresan la misma cantidad del transgén (la proteína APP humana). En contraste, los niveles de Aβ totales, es decir, Aβ1-40 y Aβ1-42 medidos en conjunto con la transferencia western, aumentaron cinco veces en los tejidos cerebrales de ratones transgénicos Thy-SwedishArctic de 2 meses de edad en comparación con ratones transgénicos Thy-Swedish que son de la misma edad y que expresan la misma cantidad del transgén (la proteína APP humana) (Fig. 6, d). Los resultados (Fig. 6, b-d) sugieren con fuerza que agregados Aβ solubles tales como protofibrillas están presentes en el cerebro de ratones transgénicos Thy-SwedishArctic de 2 meses de edad, debido a que la transferencia western es un procedimiento de desnaturalización que el que agregados Aβ solubles se disocian en sus componentes individuales, es decir, péptidos Aβ individuales que proporcionan por tanto una mayor medida numérica. En contraste es no desnaturalizante, y cada agregado Aβ soluble se medirá como una única unidad y para el número total de sus componentes individuales.
Inmunohistoquímica
Se presentan los resultados de la inmunohistoquímica de APP que se observan en la línea B fundadora de ratón Thy-SwedishArcticAPP (Fig. 4, a-b), aunque sol es aparente una difusa tinción de fondo en un ratón no transgénico de la misma camada (Fig. 4, c). La inmunotinción intraneuronal puntuada de Aβ muestra la agregación de Aβ en la corteza cerebral de un ratón Thy-SwedishArctic APP de 2 meses de edad (Fig. 5, a), marcada por flechas). Poco o muy poco Aβ intraneuronal en ratón Thy-Swedish APP de 2 meses de edad con una expresión de APP igual (Fig. 5, b). Algunas neuronas corticales contienen agregados Aβ intraneuronales a los 15 meses de edad en el ratón Thy-Swedish APP (Fig. 5, c). No se encontró inmunotinción de Aβ en ratones no transgénicos (Fig. 5, d). Los inventores encontraron inclusiones inmunopositivas de Aβ intraneuronal en la capa de células piramidales de CA1 en el hipocampo y en neuronas dispersas de la lámina inferior en la corteza cerebral en el ratón transgénico Thy-SweArcAPP (Fig. 5, e). La tinción inmunopositiva de Aβ es resistente a pretratamiento con ácido fórmico concentrado, lo que es una característica típica del amiloide, es decir, de agregados Aβ con una estructura en lámina β. La barra de escalas mide 20 µm (Fig. 5, a-d). La inmunotinción intraneuronal puntuada de Aβ (marcada por flechas en la Fig. 5, a-d) muestra la agregación de Aβ en el hipocampo de una ratón transgénico Thy-SwedishArctic APP de 2 meses de edad (Fig. 7, b) y de 5 meses de edad (Fig. 7, d). Poco y muy poco Aβ intraneuronal en un ratón Thy-Swedish APP de 2 meses de edad (Fig. 7, a) y de 5 meses de edad (Fig. 7, c) con una expresión de APP igual. El análisis de imágenes muestra un aumento de 11 veces (2 meses; 1,91 ± 9,16 (4) en comparación con 0,17 ± 0,02 (3); promedio ± S.E.M. (n)) y de 7 veces (5 meses; 2,66 ± 0,28 (3) en comparación con 0,38 ± 0,10 (4); promedio ± S.E.M. (n) en el porcentaje de área bajo la curva por la inmunotinción de Aβ intraneuronal en el ratón transgénico Thy-SwedishArctic APP en comparación con el ratón transgénico Thy-Swedish APP (Fig. 7, e). Se cuantificó la fracción de área de la agregación de Aβ intraneuronal en las neuronas piramidales CA1 (eje y a la izquierda) y la frecuencia de deposición de la placa de Aβ extracelular en el hipocampo (eje y a la derecha, escala logarítmica) en una cohorte de ratones transgénicos Thy-SwedishArctic APP de diversas edades. Cada cuadrado sólido representa el Aβ intraneuronal (% de fracción de área) de un único ratón, mientras que el cuadrado abierto correspondiente localizado a menudo por debajo representa la frecuencia de la placa de Aβ en el mismo ratón. Los resultados representan el promedio ± S.E.M. del análisis de diversas secciones de tejido de ratones transgénicos individuales (Fig. 8). Se presentaban también placas seniles extracelulares en la parte caudal del hipocampo del ratón transgénico Thy-SweArcticAPP a esta edad, tal como se muestra con los anticuerpos específicos de Aβ42 y Aβ40 (Fig. 10, a-b). La inmunoreactividad de Aβ fue resistente a y se potenció mediante el
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pretratamiento con ácido fórmico concentrado. Las flechas (en la Fig. 10, a-b) apuntan a depósitos inmunoreactivos de Aβ que se muestran a mayor aumento (imágenes de la parte media adyacente a 10, a y b). La inmunotinción de Rojo Congo y GFAP combinados muestra una reacción astrogliótica robusta que rodea una placa amiloide compacta (Fig. 10, c), que muestra una clásica birrefringencia de color oro-verde en luz polarizada (Fig. 10, d)
Peso del cerebro
Se diseccionaron los cerebros y se dividieron en sus dos hemisferios. El diagrama de dispersión muestra el promedio y la distribución entre individuos del peso del hemisferio izquierdo del cerebro. Se analizó bioquímicamente de manera posterior el tejido cerebral para la APP humana y la síntesis de Aβ. Se pesó inicialmente el hemisferio izquierdo en una balanza, para servir como medida de la degeneración atrófica del cerebro (Fig. 9).
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10
Claims (12)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un ratón transgénico que expresa un transgén que comprende una secuencia de ADN que codifica una Proteína Precursora Amiloide (APP) heteróloga que comprende la mutación Arctic (E693G) y una mutación patógena adicional de la EA (enfermedad de Alzheimer) seleccionada entre el grupo que consiste en KM670/671DF, KM670/671DY, KM670/671EF, KM670/671EY, KM670/671NL, KM670/671NY, KM670/671NF, KM670/671KL, KM670/671DL and KM670/671EL, y sin mutaciones de APP adicionales, en el que dicho transgén se une de manera operable a un promotor eficaz para la expresión de dicho gen en el tejido cerebral de dicho ratón, lo que da como resultado cantidades crecientes de agregados A13 solubles intracelulares, que incluyen péptidos Aβ.
-
- 2.
- El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el transgén se integra en el ADN genómico.
-
- 3.
- El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que la APP endógena se expresa o no se expresa.
-
- 4.
- El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha mutación patógena adicional de la EA es la mutación KM670/671NL de APP.
-
- 5.
- El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el ratón transgénico expresa únicamente un transgén.
-
- 6.
- El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende adicionalmente una construcción directora integrada de manera homóloga para al menos uno de los genes de la neprilisina o que degrada la insulina (IDE), que perturba estos genes mediante la ablación del gen (inactivación) y potencia los niveles de los péptidos Aβ-40 y/o Aβ-42 Arctic.
-
- 7.
- Un procedimiento de producción del ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende integrar en el ADN genómico un transgén que comprende una secuencia de ADN que codifica una Proteína Precursora Amiloide (APP) que comprende la mutación Arctic (E693G) y una mutación patógena adicional de la EA (enfermedad de Alzheimer) seleccionada entre el grupo que consiste en KM670/671DF, KM670/671DY, KM670/671EF, KM670/671EY, KM670/671NL, KM670/671NY, KM670/671NF, KM670/671KL, KM670/671DL y KM670/671EL y sin mutaciones de APP adicionales, en el que dicho transgén se une de manera operable a un promotor eficaz para la expresión de dicho gen en el tejido cerebral de dicho ratón.
-
- 8.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la APP endógena se prepara no expresiva.
-
- 9.
- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha mutación patógena de la EA adicional es la mutación KM670/671NL de APP.
-
- 10.
- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende adicionalmente integrar de manera homóloga una construcción directora para al menos uno de los genes de la enzima neprilisina o que degrada la insulina (IDE).
-
- 11.
- Un procedimiento de cribado, en el que el ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 se usa para cribar los agentes útiles para tratar, evitar o inhibir la enfermedad de Alzheimer.
-
- 12.
- Un procedimiento de cribado, en el que el ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 se usa para cribar los agentes de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
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-
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