ES2362589A1 - Exosomas derivados de reticulocitos infectados con plasmodium sp., método para su obtención y su uso. - Google Patents
Exosomas derivados de reticulocitos infectados con plasmodium sp., método para su obtención y su uso. Download PDFInfo
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Abstract
Exosomas derivados de reticulocitos infectados con plasmodium sp., método para su obtención y su uso.La presente invención pertenece al campo de la vacunas para la prevención y profilaxis contra la malaria, más concretamente se refiere a un exosoma aislado a partir de reticulocitos infectados con Plasmodium sp., al método para su obtención y a su uso para la prevención y profilaxis frente a la malaria.
Description
Exosomas derivados de reticulocitos infectados
con Plasmodium sp., método para su obtención y su uso.
La presente invención pertenece al campo de las
vacunas para la prevención y profilaxis contra la malaria, más
concretamente se refiere a un exosoma aislado a partir de
reticulocitos infectados con Plasmodium sp., al método para
su obtención y a su uso para la prevención y profilaxis frente a la
malaria.
Plasmodium sp., es el agente etiológico
causante de la malaria, también conocida como paludismo. Dentro del
genero Plasmodium hay diferentes especies algunas de las
cuales son inocuas. Otras especies, por el contrario, son altamente
infecciosas y son la causa de la mayor parte de los casos de malaria
humana a nivel mundial. Entre estas últimas, las especies más
importantes son P. falciparum, y P. vivax.
Todas las especies humanas de Plasmodium
(P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P.
ovale) infectan en mayor o menor medida a eritrocitos y/o a los
precursores de estos los reticulocitos que requieren un proceso de
maduración y diferenciación para alcanzar su estadio funcional final
como eritrocitos. De entre las diferentes especies de
Plasmodium existen algunas que tienen mayor capacidad de
infección de reticulocitos que otras como, por ejemplo,
Plasmodium vivax que infecta predominantemente este tipo de
células.
Dentro del proceso de maduración y
diferenciación de reticulocitos a eritrocitos, algunas proteínas que
no son necesarias para estos últimos son secuestradas en vesículas
internas localizadas en cuerpos multivesiculares
"multi-vesicular bodies" (MVBs) y
posteriormente liberadas al medio extra-celular como
pequeñas nano-vesículas conocidas como
exosomas.
Recientemente, la investigación de exosomas ha
sido estimulada tras el hallazgo que otras células, tales como las
células presentadoras de antígenos, son capaces de secretar este
tipo de nano-vesículas sugiriendo un papel más allá
del originalmente descrito en la maduración y diferenciación de
reticulocitos. De hecho, varios estudios con diferentes tipos de
células han revelado que los exosomas juegan un papel en la
regulación del sistema inmune al transferir información entre
células durante la respuesta inmune, y, por lo tanto, representan un
nuevo modo de comunicación inter-celular (Schorey
and Bhatnagar, 2008). En esta línea, ha sido demostrada la capacidad
protectora de exosomas en infecciones experimentales con
Toxoplasma gondii, miembro del phylum Apicomplexa al que
pertenece también Plasmodium (Bhatnagar et al.,
2007).
Además, se han descrito varias estrategias
basadas en el uso de exosomas como agentes profilácticos o
inmunoestimuladores (Viaud et al. Exosomes for the treatment
of human malignancies. Horm Metabl Res 2008, 40:82).
Entre otras, WO9705900 describe exosomas
obtenidos a partir de células presentadoras de antígenos como
células B, macrófagos o células dendríticas. Los exosomas descritos
en este documento tienen la particularidad de que al ser obtenidos a
partir de células presentadoras de antígeno, los antígenos son
presentados en el contexto MHC-I y
MHC-II.
Por su parte, el documento EP1523990 describe
exosomas obtenidos a partir de células cancerígenas (identificados
como texosomas) o a partir de células dendríticas cargadas o no de
antígenos (este documento los denomina dexosomas).
WO2004014954 utiliza una estrategia diferente ya
que para obtener exosomas que muestren en su superficie un antígeno
deseado, se transfectan células de la línea CT26 (cáncer de colon
murino) y células de la línea TA3HA (carcinoma mamario de ratón) con
virus recombinantes que comprenden en su genoma la secuencia que
codifica el antígeno deseado (muc-1) que es así
expresado en la superficie de los exosomas aislados a partir de este
tipo de células.
WO0028001 describe exosomas obtenidos a partir
de mastocitos esencialmente desprovistos de moléculas MHC endógenas.
Los exosomas descritos en este documento si expresan en su
superficie, sin embargo, MHC recombinantes.
Por último, WO2008092153 describe exosomas
obtenidos a partir de células cancerosas y desprovistas de uno o más
polipéptidos inmunosupresivos normalmente presentes en los
exosomas.
Los autores de la presente invención han
desarrollado ahora una nueva estrategia en la prevención y
profilaxis de la malaria basada en el uso de exosomas aislados a
partir de reticulocitos de sujetos o modelos murinos infectados con
Plasmodium. Estos exosomas son obtenidos por aislamiento de
la fracción de exosomas derivados de reticulocitos a partir de
sangre infectada con Plasmodium.
\newpage
Figura 1: representa la caracterización de
exosomas aislados a partir de plasma de ratones. (A) Análisis de
tamaño por dispersión dinámica de luz. (B) Tinción negativa después
de una fijación con paraformaldehído al 2%. La escala representa 100
nm.
Figura 2: representa la evolución en el tiempo
de parasitemia y el análisis del tropismo celular de ratones
inmunizados con exosomas. Las curvas de parasitemia fueron
calculadas de la media de 2 ratones controles no infectados, 2
ratones controles infectados con exosomas aislados de animales
normales, de 3 ratones infectados con exosomas obtenidos de animales
infectados con la cepa no letal de P. yoelli, y de 3 ratones
infectados con exosomas obtenidos de animales infectados con la cepa
letal de P. yoelli. Tinción de Giemsa de extendidos de sangre
periférica en el día antes de sacrificar de un animal representativo
de cada grupo.
Figura 3: análisis por Western blot de la
respuesta de anticuerpos IgG anti-P. yoelli en suero de
animales inmunizados con exosomas. Las muestras fueron colectadas
por punción maxilar en el día 20 después de la segunda inmunización.
Cada panel corresponde a una mezcla de sueros de cada grupo de
animales utilizados en estos experimentos. En el Western blot fue
utilizado antígeno total obtenido de las cepas
no-letal (AgNL) y letal (AgL), de P. yoelli
y las respuestas de anticuerpos IgG fueron detectadas mediante el
uso de suero de cabra conjugado a fosfatasa alcalina y producido
contra la IgG de ratón.
Figura 4: representa un análisis por tinción
intra-celular de células T, CD4+ y CD8+ en animales
inmunizados con exosomas de la cepa no-letal de
P. yoelli. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 5
microgramos de exosomas PyNL en CpG-ODN. Dos semanas
después de la primera inmunización, se realizó un refuerzo con 5
microgramos de exosomas sin CpG-ODN. (A) El
porcentaje de linfocitos que son CD8^{+}
IFN-\gamma^{+} fue calculado después de una
re-estimulación in vitro, tinción
intra-celular y análisis por citometría de flujo. El
porcentaje de linfocitos CSFE^{+} que son CD4^{+}
IFN-\gamma^{+} está representado en (B) y el de
CD4^{+}IFN-\gamma^{+}
IL-2^{+} en (C). Los datos corresponden a un
experimento y son expresados como la media \pm error estándar de 3
ratones no inmunizados y 3 ratones inmunizados con exosomas
provenientes de ratones infectados con la cepa no letal exPyNL.
Figura 5: (A)-(D) espectro MS/MS resultante del
análisis proteómico de los antígenos presentes en exosomas derivados
de reticulocitos provenientes de ratones infectados con P.
yoelli y de un paciente infectado con P. vivax. El
análisis bioinformático del espectro confirma la presencia de
antígenos tanto de P. yoelli como de P. vivax en las
muestras de exosomas analizadas.
El primer objeto de la presente invención viene
representado por un exosoma aislado a partir de plasma que comprende
al menos un antígeno de Plasmodium sp. en su interior o en su
superficie (a partir de ahora exosomas de la invención).
Los exosomas de la invención han demostrado
capacidad inmunogénica frente a la malaria por lo que resultan de
gran potencial utilidad en la preparación de una vacuna para la
prevención y profilaxis de esta enfermedad.
El antígeno o antígenos presentes en los
exosomas de la presente invención pueden provenir de cualquier
especie de Plasmodium. En una realización particular de la
invención el antígeno o antígenos presentes en los exosomas
provienen de P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P.
yoelli, P. achiotense, P. achromaticum, P. aegyptensis, P.
aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P. azurophilum, P.
balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P. bigueti P.
brasilianum, P. brygooi, P. booliati, P. bubalis, P. bucki, P.
coatneyi, P. cathemerium, P. cephalophi, P. chabaudi, P.
chiricahuae, P. circularis, P. cnemidophori, P. coatneyi, P.
coggeshalli, P. colombiense, P. corradettii, P. coturnix, P.
coulangesi, P. cuculus, P. popo, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P.
diminutivum, P. diploglossi, P. dissanaikei, P. dominicana, P.
durae, P. egerniae, P. elongatum, P. eylesi, P. fabesia, P.
fairchildi, P. fallax, P. fieldi, P. foleyi, P. forresteri, P.
floridense, P. fragüe, P. garnhami, P. gallinaceum, P. giganteum, P.
giovannolai, P. girardi, P. gonatodi, P. gonderi, P. georgesi, P.
gracilis, P. griffithsi, P. guanggong, P. gundersi, P. guyannense,
P. heischi, P. hegneri, P. hermani, P. heteronucleare, P.
hexamerium, P. holaspi, P. huffi, P. hylobati, P. icipeensis, P.
inopinatum, P. inui, P. jefferi, P. josephinae, P. juxtanucleare, P.
kempi, P. knowlesi, P. kentropyxi, P. leanucteus, P. lemuris, P.
lophurae, P. lepidoptiformis, P. lygosomae, P. mabuiae, P.
mackerrasae, P. maculilabre, P. maior, P. marginatum, P. matutinum,
P. mexicanum, P. minasense, P. morulum, P. nucleophilium, P.
octamerium, P. odocoilei, P. papernai, P. paranucleophilum, P.
parvulum, P. pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. petersi,
P. pifanoi, P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P.
polare, P. praecox, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P.
rhodaini, P. robinsoni, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P.
schweitzi, P. silvaticum, P. simium, P. semiovale, P. shortii, P.
smirnovi, P. subpraecox, P. tenue, P. tejerai, P. tomodoni, P.
torrealbai, P. traguli, P. tribolonoti, P. tropiduri, P. uilenbergi,
P. watteni, P. wenyoni, P. vacuolatum, P. vastator, P. vaughani, P.
vinckei, P. volans y/o P. youngi.
En una realización preferida de la invención los
exosomas comprenden antígenos que provienen de especies de
Plasmodium que infectan al hombre, monos y/o roedores, es decir, en
una realización preferida de la invención, dicho antígeno o
antígenos presentes en el interior o en la superficie de los
exosomas pertenecen a Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum,
Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli, P.
berghei, P. brasilianum, P. chabaudi, P. cynomolgi, P. fragile, P.
knowlesi y/o P. reichenowi.
Los exosomas de la presente invención pueden ser
aislados a partir de reticulocitos de cualquier mamífero infectado
con Plasmodium sp. aunque preferiblemente se aíslan a partir
de reticulocitos humanos, de monos y/o de ratones. Una realización
preferida contempla el uso de reticulocitos humanos para en la
medida de lo posible evitar reacciones indeseadas al ser
administrados a pacientes humanos.
Otro objeto de la presente invención viene
representado por un método para la obtención de los exosomas de la
invención que comprende:
- a)
- obtener una muestra de sangre infectada con Plasmodium sp.,
- b)
- obtener la fracción de exosomas derivada de reticulocitos mediante ultracentrifugación secuencial de la muestra de sangre de a).
En una realización particular la muestra de
sangre puede estar infectada con P. vivax, P. falciparum, P.
malariae, P. ovale, P. yoelli, P. achiotense, P. achromaticum, P.
aegyptensis, P. aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P.
azurophilum, P. balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P.
bigueti P. brasilianum, P. brygooi, P. booliati, P. bubalis, P.
bucki, P. coatneyi, P. cathemerium, P. cephalophi, P. chabaudi, P.
chiricahuae, P. circularis, P. cnemidophori, P. coatneyi, P.
coggeshalli, P. colombiense, P. corradettii, P. coturnix, P.
coulangesi, P. cuculus, P. popo, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P.
diminutivum, P. diploglossi, P. issanaikei, P. dominicana, P. durae,
P. egerniae, P. elongatum, P. eylesi, P. fabesia, P. fairchildi, P.
fallax, P. fieldi, P. foleyi, P. forresteri, P. floridense, P.
fragile, P. garnhami, P. gallinaceum, P. giganteum, P. giovannolai,
P. girardi, P. gonatodi, P. gonderi, P. georgesi, P. gracilis, P.
griffithsi, P. guanggong, P. gundersi, P. guyannense, P. heischi, P.
hegneri, P. hermani, P. heteronucleare, P. hexamerium, P. holaspi,
P. huffi, P. hylobati, P. icipeensis, P. inopinatum, P. inui, P.
jefferi, P. josephinae, P. juxtanucleare, P. kempi, P. knowlesi, P.
kentropyxi, P. leanucteus, P. lemuris, P. lophurae, P.
lepidoptiformis, P. lygosomae, P. mabuiae, P. mackerrasae, P.
maculilabre, P. maior, P. marginatum, P. matutinum, P. mexicanum, P.
minasense, P. morulum, P. nucleophilium, P. octamerium, P.
odocoilei, P. papernai, P. paranucleophilum, P. parvulum, P.
pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. petersi, P. pifanoi,
P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P. potare, P.
praecox, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P. rhodaini, P.
robinsoni, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P. schweitzi, P.
silvaticum, P. simium, P. semiovale, P. shortii, P. smirnovi, P.
subpraecox, P. tenue, P. tejerai, P. tomodoni, P. torrealbai, P.
traguli, P. tribolonoti, P. tropiduri, P. uilenbergi, P.
watteni, P. wenyoni, P. vacuolatum, P. vastator, P. vaughani, P.
vinckei, P. volans y/o P. youngi.
En una realización preferida de la invención,
sin embargo, la muestra de sangre se encuentra infectada con
Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae,
Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli, P. berghei, P. brasilianum, P.
chabaudi, P. cynomolgi, P. fragile, P. knowlesi y/o P.
reichenowi.
A partir de la muestra de sangre infectada, el
método de obtención de los exosomas de la invención comprende una
serie de pasos de ultracentifugación secuencial (etapa b del
método). La secuencia de ultracentrifugación comprende
preferiblemente:
- i)
- centrifugar entre 400-900 x g durante 25-35 minutos
- ii)
- centrifugar entre 10 000-14 000 x g durante 20-40 minutos
- iii)
- centrifugar entre 90 000-110 000 x g durante 1-3 horas.
Opcionalmente, después de esta primera secuencia
de ultracentifugación el pellet resultante se resuspende en una
solución tampón, preferiblemente PBS, y se filtra a través de un
filtro que discrimine por tamaño de partícula la fracción de
exosomas (el filtro debe tener alrededor de 0,20 \mum de poro).
Preferiblemente, después de esta operación se vuelve a centrifugar a
90 000-110 000 x g durante 1-3
horas.
La centrifugación secuencial debe llevarse
preferiblemente a cabo a una temperatura baja de entre
0-7ºC para preservar la integridad de las proteínas
y las estructuras proteicas de los exosomas purificados.
Tras la etapa b) del método se obtiene una
fracción exosómica mayoritariamente formada por exosomas derivados
de reticulocitos. Sin embargo, esta fracción puede contener una
mínima fracción de exosomas derivados de otros tipos celulares
sanguíneos.
Aunque la fracción obtenida está suficientemente
enriquecida en exosomas derivados de reticulocitos, opcionalmente,
si se desea obtener una fracción aún más enriquecida se puede
someter la fracción de exosomas obtenidos a un método de
purificación por inmunoaislamiento. El inmunoaislamiento implica el
uso de anticuerpos específicos frente a reticulocitos o frente a
moléculas específicas de reticulocitos presentes en los exosomas. En
una realización particular y preferida el inmunoaislamiento se
realiza mediante el uso de anticuerpos específicos frente al
receptor de la transferrina.
La realización preferida comprende el
inmunoaislamiento de los exosomas derivados de reticulocitos
mediante el uso de bolas magnéticas recubiertas de anticuerpos
frente al receptor de la transferrina. Los exosomas derivados de
reticulocitos, una vez unidos a las bolas magnéticas a través de los
anticuerpos anti-receptor de la transferrina, son
separados de estas por medio de un tratamiento ácido.
Los exosomas de la invención han sido analizados
por espectrometría de masa. Con esta información se ha desarrollado
otro de los aspectos de la presente invención un exosoma artificial
que comprende al menos un antígeno de Plasmodium sp en su
interior o en su superficie.
Los exosomas se han desarrollado por métodos
conocidos (de la Peña et al. 2009) a partir de los antígenos
de Plasmodium identificados por espectrometría de masa. El
uso de exosomas artificiales reduce el riesgo de que se produzca una
respuesta autoinmune en el paciente inmunizado.
En una realización preferida de la invención los
exosomas artificiales se encuentran acoplados principalmente por
antígenos de Plasmodiums que infectan a monos ratones o humanos como
por ejemplo Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium
malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli, P. berghei, P.
brasilianum, P. chabaudi, P. cynomolgi, P. fragüe, P. knowlesi, P.
reichenowi. En una realización preferida, los exosomas
artificiales comprenden antígenos de P. vivax, P. falciparum, P.
malariae y/o P. ovale.
Otro objeto de la presente invención es
composición farmacéutica que comprende los exosomas de la invención
o los exosomas artificiales de la invención y al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Los excipientes pueden seleccionarse entre
portadores, excipientes, materiales de soporte, lubricantes, cargas,
disolventes, diluyentes, colorantes, acondicionadores del sabor
tales como azúcares, antioxidantes y/o aglutinantes. La selección de
estos materiales auxiliares y/o excipientes y de las cantidades que
han de utilizarse dependerá de la forma de aplicación de la
composición farmacéutica.
La composición farmacéutica según la invención
puede adaptarse a cualquier forma de administración, ya sea por vía
oral o por vía parenteral, por ejemplo, por vía pulmonar, por vía
nasal, por vía rectal y/o por vía intravenosa. Por tanto, la
formulación según la invención puede adaptarse para la aplicación
tópica o sistémica, particularmente para la aplicación dérmica,
subcutánea, intramuscular, intraarticular, intraperitoneal,
pulmonar, bucal, sublingual, nasal, percutánea, vaginal, oral o
parenteral.
Un último objeto de la presente invención es una
vacuna frente a la malaria que comprende exosomas de la invención o
los exosomas artificiales de la invención.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención pero no pretenden ser limitativos del alcance de la
misma.
Los exosomas fueron purificados de plasma
obtenido de sangre de ratones colectado en EDTA. Fueron utilizados
plasmas de ratones Balb/c no infectados e infectados con cepas P.
yoelli 17X y 17XL al 10-30% de parasitemia. Para
el aislamiento de los exosomas, los sueros fueron centrifugados
secuencialmente a 500 x g por 30 min., a 12 000 x g por 35 min. y a
100 000 x g por 2 h a 4ºC. El precipitado final fue resuspendido en
PBS (usualmente 5x el volumen original de suero), filtrado a través
de un filtro de 0.22-\mum y centrifugado a 100 000
x g por 2 h a 4ºC. Los precipitados fueron resuspendidos en 1XPBS y
la cantidad de proteínas recuperada fue determinada mediante un
ensayo de Bradford. Aproximadamente 5 microgramos de exosomas son
obtenidos de 1.5 ml de suero. El material obtenido se utiliza
inmediatamente o se congela mediante enfriamiento rápido y se
almacena a -80ºC. Los exosomas han sido analizados mediante
dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica (EM) para
confirmar su pureza y visualizar su morfología (Figura 1). Para las
medidas de DLS, se analizaron 50 \mul de una suspensión 0.1
\mug/\mul en PBS a 25ºC utilizando un Zetasizer Nano S (Malvern
Instruments). Los análisis de EM fueron hechos a partir de
preparados frescos de exosomas fijados en 2% de paraformaldehído
durante toda la noche a 4ºC. Los exosomas fueron colocados en
rejillas de formar durante 1 min. antes de ser lavados en agua
destilada. Las rejillas fueron teñidas negativamente por 1 min. con
una solución de 2% de acetato de uranilo en agua destilada. Después
de ser secadas completamente, las rejillas fueron observadas en un
microscopio de transmisión electrónica JEOL 1010. Ambas técnicas
revelaron poblaciones homogéneas de nano-vesículas
con un diámetro compatible con el tamaño previamente descrito para
exosomas.
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Ratones Balb/c fueron inmunizados con exosomas
derivados de la sangre de ratones no infectados (exC) y ratones
infectados con exosomas de la cepa no letal (exPyNL) y letal
(exPyL). Para las inmunizaciones, los ratones recibieron inyecciones
intravenosas (i.v.) de 5 \mug de exosomas en 100 \mul de PBS
después de haber sido anestesiados con una combinación de Ketamina
(100 mg/Kg) y Midazolam (5 mg/Kg) inyectado
intra-peritonealmente. Han sido realizados dos
experimentos con grupos de 4-6 ratones Balb/c
(9-11 semanas de edad) inmunizados i.v. a intervalos
de 20 días con dos dosis de exosomas. Los ratones no inmunizados
(NI) no fueron tratados. Veinte días después de la segunda
inmunización, todos los ratones fueron infectados con
5.10^{5}-10^{6} parásitos de la cepa letal
(P. yoelli 17XL) y la parasitemia controlada diariamente.
Notablemente, la mitad de los ratones inmunizados con exosomas de
cada cepa mostró diferencias en las curvas de parasitemia con un
tiempo mayor de supervivencia al compararlos con los ratones NI y
exC (Figura 2A). Además, los ratones inmunizados con exosomas de
animales infectados presentaron no solamente un aumento de
reticulocitemia sino también un cambio de tropismo celular de la
cepa letal de normocitos para reticulocitos (Tabla I).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de demostrar la capacidad inmunogénica
de los exosomas derivados de animales infectados con las cepas letal
y no letal de P. yoelli, se iniciaron experimentos para
evaluar si las respuestas protectoras estaban asociadas con
respuesta inmune celular y/o humoral.
Para estudiar la producción de anticuerpos
específicos, los sueros fueron recolectados en el día 20 después de
la segunda inmunización y almacenados a -20ºC. Mezclas de sueros de
los grupos de animales NI, exC, exPyNL y exPyL fueron utilizados
para analizar los anticuerpos circulantes anti P. yoelli
inducidos por la inmunización con exosomas. Western blots fueron
realizados utilizando un lisado de antígeno total de P.
yoelli obtenido por lisis de eritrocitos infectados con 1.5 M
NH_{4}CL, 0.1 M KHCO_{3} y 0.01 M EDTA seguido de varios ciclos
de congelación y descongelación. Ratones inmunizados con exosomas
provenientes de infección no letal produjeron anticuerpos IgG
específicos contra antígenos de P. yoelli de ambas cepas
(Figura 3). Como era de esperarse, no se detectaron anticuerpos
contra P. yoelli en los sueros de animales no
inmunizados.
La producción de citoquinas de células
individuales para evaluar la respuesta inmune celular, se realizó
mediante tinción intra-celular. Veinte días después
de la segunda inmunización, células del bazo (esplenocitos) de
animales inmunizados fueron sembradas por triplicado en placas de
cultivo de 96 pozos (5x10^{5} células/pozo). Los esplenocitos
fueron cultivados en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal
de ternero (FCS) inactivado por temperatura, HEPES (10 mM),
L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM),
2\beta-mercaptoetanol (50 \muM), y
penicilina-estreptomicina (0.1 mM), y, en presencia
o ausencia, de 10 \mug/ml de antígeno de P. yoelli o 5
\mug de una preparación congelada de exosomas. Para analizar la
proliferación, las células fueron teñidas con
5-6-carboxy-fluoresceína
diacetatosuccinimidil éster (CFSE) utilizando el kit vibrant CFDASE
"cell tracer" kit (Invitrogen) antes del cultivo. Las placas
fueron incubadas por 72 h a 37ºC y con acetato de forbol miristato
(50 ng/ml), ionomicina (500 ng/ml) y brefeldina A (10 \mug/ml) en
las últimas 4 horas. Las células fueron colectadas, lavadas y
teñidas para detectar diferentes marcadores de superficie por 20
min. utilizando anticuerpos conjugados a diferentes fluoróforos.
Después de dos lavados con PBS/BSA, las células fueron fijadas por
20 min. a temperatura ambiente con cytofix/cytoperm (BD Biosciences)
y luego lavadas y resuspendidas en una solución perm/wash la cual
las permeabiliza. Después de la permeabilización, las células fueron
teñidas por 30 min. con anticuerpos conjugados específicos para
diferentes citoquinas. Las muestras fueron analizadas en un FACS
Calibur. El examen visual del color y la cantidad de células en los
pozos después de 72 h de cultivo reveló una respuesta proliferativa
mayor en esplenocitos de exPyNL, solo en presencia de exosomas y de
antígeno de P. yoelli. El número de esplenocitos CD8^{+} T
que produjeron IFN-\gamma incrementó en animales
inmunizados con exPyNL, y, después de la
re-estimulación, con exosomas y antígeno total de
P. yoelli (Figura 4A). Células T proliferativas CD4^{+}
(CSFE low) que producen IFN-\gamma, solo o en
combinación con IL-2, se detectaron en mayor número
en el mismo grupo de animales después de la
re-estimulación con antígeno total de P.
yoelli y exosomas (Figura 4B, 4C).
\vskip1.000000\baselineskip
Además de generar datos sobre inmunogenicidad de
exosomas en infecciones experimentales de malaria utilizando el
modelo murino de Balb/c - P. yoelli, también han sido
generado datos que demuestran que los exosomas obtenidos de ratones
infectados con P. yoelli o exosomas obtenidos de un paciente
con P. vivax contienen antígenos del parásito. Para ello,
alícuotas de 5 microgramos de exosomas purificados de ratones no
infectados, ratones infectados con la cepa letal y no letal de P.
yoelli, de un voluntario humano saludable y de un paciente con
malaria de P. vivax, fueron analizados por espectrometría de
masa.
Las preparaciones de exosomas fueron
resuspendidas en NH_{4}HCO_{3} 0.4 M en urea 8M. Las muestras
fueron reducidas con 5 mM DTT por 15 min a 50ºC, alquilizadas con 10
mM iodoacetamida por 30 min. a temperatura ambiente y diluidas con
agua grado HPLC hasta obtener una concentración de urea de 1 M.
Después de digerir durante 16 h con tripsina con pureza de
secuenciación 1/50 (relación enzima/proteína), la reacción fue
terminada añadiendo ácido fórmico (FA) al 1% (Stone and Williams,
1996). Las muestras fueron desalineadas con POROS R2 ziptips (Jurado
et al., 2007) y secadas en una bomba de vacío.
Posteriormente, las muestras fueron resuspendidas en 0.1% FA
(sujetas a 2D LC-MS system (LC - Eksigent 1
D-plus, MS - Thermo Fisher LTQ XL with ETD, ESI
source - Triversa, Adivion). Las muestras fueron colocadas
individualmente en una columna de intercambio catiónico fuerte (SCX)
(5 \muL, Optimized Technologies), y eluídas automáticamente
mediante la inyección de concentraciones crecientes de NaCl
(0-500 mM NaCl en 5% acetonitrilo/0.5% FA). Los
péptidos eluídos fueron atrapados y lavados en una columna casera
C18 (1 cm, 75 \mum, Phenomenex Luna C18, 5 \mum). La separación
se consiguió mediante una columna capilar C18 (20 cm, 75 \mum,
Phenomenex Luna C18, 5 \mum) en un gradiente linear de ACN con
0.1% FA. Los espectros fueron recogidos en el modo
"data-dependent acquisition mode" (Figura
5).
Los espectros MS/MS (figura 5) fueron
convertidos a formato DTA y enviados a una búsqueda de bases de
datos utilizando Sequest (Available in Bioworks 3.3.1, Thermo Fisher
Scientific). Las bases de datos utilizadas de P. vivax y
P. yoelli fueron las mas recientes liberadas en PLasmoDB
(http://plasmodb.org), y las de secuencias contaminantes tales como
queratina human, tripsina porcina, proteínas de medios de cultivo se
buscaron en (http://www.ebi.ac.uk/IPI/
IPIhelp.html o http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Protein&itool=toolbar). Todas las secuencias fueron concatenadas con la versión reversa para permitir el cálculo de falso-positivos (Elias and Gygi, 2007). Los datos obtenidos fueron filtrados para obtener aproximadamente una tasa de error de falso-positivos de 1-2%.
IPIhelp.html o http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Protein&itool=toolbar). Todas las secuencias fueron concatenadas con la versión reversa para permitir el cálculo de falso-positivos (Elias and Gygi, 2007). Los datos obtenidos fueron filtrados para obtener aproximadamente una tasa de error de falso-positivos de 1-2%.
Notablemente, exosomas obtenidos de ratones
infectados o del paciente con P. vivax, revelaron la
presencia de proteínas de Plasmodium (Tabla II). Los datos de
los espectros individuales validaron 100% que estos péptidos
corresponden a proteínas de Plasmodium. Todos estos
resultados demuestran inequívocamente que los exosomas contienen
proteínas del parasito que causa malaria, incluyendo la malaria
humana causada por P. vivax, y que estos son capaces de
presentar antígeno, generar respuestas inmunes y protectoras en un
modelo murino.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
- Bhatnagar, S., Shinagawa, K.,
Castellino, F.J., and Schorey, J.S. (2007).
Exosomes released from macrophages infected with intracellular
pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and
in vivo. Blood 110, 3234-3244.
- De La Pena, H., Madrigal, J.A.,
Rusakiewicz, S., Bencsik, M., Cave, G.W.,
Selman, A., Rees, R.C., Travers, P.J., and
Dodi, I.A. (2009). Artificial exosomes as tools for
basic and clinical immunology. Journal of immunological
methods 344, 121-132.
- Elias, J.E., and Gygi, S.P.
(2007). Target-decoy search strategy for
increased confidence in large-scale protein
identifications by mass spectrometry. Nat Methods 4,
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Lieb, C.S., Nakayasu, E., Hayes, W.K.,
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inactivating proteins and intraspecies venom variation in
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- Schorey, J.S., and Bhatnagar, S.
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- Stone, K.L., and Williams, K.R.
(1996). Enzymatic digestión of proteins in solution and in
SDS polyacrilamide gel. In The protein protocol handbook, J.M.
Walker, ed. (Totowa, NJ, Humana Press Inc.).
Claims (11)
1. Exosoma aislado a partir de reticulocitos que
comprende al menos un antígeno de Plasmodium sp en su
interior o en su superficie.
2. Exosoma de acuerdo con la reivindicación 1
donde dicho antígeno o antígenos presentes en el exosoma pertenecen
a Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae,
Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli P. achiotense, P. achromaticum,
P. aegyptensis, P. aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P.
azurophilum, P. balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P.
bigueti P. brasilianum, P. brygooi, P. booliati, P. bubalis, P.
bucki, P. coatneyi, P. cathemerium, P. cephalophi, P. chabaudi, P.
chiricahuae, P. circularis, P. cnemidophori, P. coatneyi, P.
coggeshalli, P. colombiense, P. corradettii, P. coturnix, P.
coulangesi, P. cuculus, P. popo, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P.
diminutivum, P. diploglossi, P. dissanaikei, P. dominicana, P.
durae, P. egerniae, P. elongatum, P. eylesi, P. fabesia, P.
fairchildi, P. fallax, P. fieldi, P. foleyi, P. forresteri, P.
floridense, P. fragüe, P. garnhami, P. gallinaceum, P. giganteum, P.
giovannolai, P. girardi, P. gonatodi, P. gonderi, P. georgesi, P.
gracilis, P. griffithsi, P. guanggong, P. gundersi, P. guyannense,
P. heischi, P. hegneri, P. hermani, P. heteronucleare, P.
hexamerium, P. holaspi, P. huffi, P. hylobati, P. icipeensis, P.
inopinatum, P. inui, P. jefferi, P. josephinae, P. juxtanucleare, P.
kempi, P. knowlesi, P. kentropyxi, P. leanucteus, P. lemuris, P.
lophurae, P. lepidoptiformis, P. lygosomae, P. mabuiae, P.
mackerrasae, P. maculilabre, P. maior, P. marginatum, P. matutinum,
P. mexicanum, P. minasense, P. morulum, P. nucleophilium, P.
octamerium, P. odocoilei, P. papernai, P. paranucleophilum, P.
parvulum, P. pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. petersi,
P. pifanoi, P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P.
polare, P. praecox, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P.
rhodaini, P. robinsoni, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P.
schweitzi, P. silvaticum, P. simium, P. semiovale, P. shortii, P.
smirnovi, P. subpraecox, P. tenue, P. tejerai, P. tomodoni, P.
torrealbai, P. traguli, P. tribolonoti, P. tropiduri, P. uilenbergi,
P. watteni, P. wenyoni, P. vacuolatum, P. vastator, P. vaughani, P.
vinckei, P. volans y/o
P. youngi.
P. youngi.
3. Exosoma de acuerdo con la reivindicación 2
donde dicho antígeno o antígenos presentes en el exosoma pertenecen
a Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae,
Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli, P. berghei, P. brasilianum, P.
chabaudi, P. cynomolgi, P. fragüe, P. knowlesi y/o P.
reichenowi.
4. Exosoma de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde dicho exosoma ha sido aislado a
partir de reticulocitos de mono, de ratón y/o humanos.
5. Uso de un exosoma de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores para su uso en la elaboración de
un medicamento para la prevención y profilaxis frente a la
malaria.
6. Método para la obtención de los exosomas de
acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:
- a)
- obtener una muestra de sangre infectada con Plasmodium sp.,
- b)
- obtener la fracción de exosomas derivada de reticulocitos mediante ultracentrifugación secuencial de la muestra de sangre de a).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6
donde la muestra de sangre puede estar infectada con Plasmodium
vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale,
Plasmodium yoelli P. achiotense, P. achromaticum, P. aegyptensis, P.
aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P. azurophilum, P.
balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P. bigueti P.
brasilianum, P. brygooi, P. booliati, P. bubalis, P. bucki, P.
coatneyi, P. cathemerium, P. cephalophi, P. chabaudi, P.
chiricahuae, P. circularis, P. cnemidophori, P. coatneyi, P.
coggeshalli, P. colombiense, P. corradettii, P. coturnix, P.
coulangesi, P. cuculus, P. popo, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P.
diminutivum, P. diploglossi, P. dissanaikei, P. dominicana, P.
durae, P. egerniae, P. elongatum, P. eylesi, P. fabesia, P.
fairchildi, P. fallax, P. fieldi, P. foleyi, P. forresteri, P.
floridense, P. fragile, P. garnhami, P. gallinaceum, P. giganteum,
P. giovannolai, P. girardi, P. gonatodi, P. gonderi, P. georgesi, P.
gracilis, P. griffithsi, P. guanggong, P. gundersi, P. guyannense,
P. heischi, P. hegneri, P. hermani, P. heteronucleare, P.
hexamerium, P. holaspi, P. huffi, P. hylobati, P. icipeensis, P.
inopinatum, P. inui, P. jefferi, P. josephinae, P. juxtanucleare, P.
kempi, P. knowlesi, P. kentropyxi, P. leanucteus, P. lemuris, P.
lophurae, P. lepidoptiformis, P. lygosomae, P. mabuiae, P.
mackerrasae, P. maculilabre, P. maior, P. marginatum, P. matutinum,
P. mexicanum, P. minasense, P. morulum, P. nucleophilium, P.
octamerium, P. odocoilei, P. papernai, P. paranucleophilum, P.
parvulum, P. pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. petersi,
P. pifanoi, P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P.
polare, P. praecox, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P.
rhodaini, P. robinsoni, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P.
schweitzi, P. silvaticum, P. simium, P. semiovale, P. shortii, P.
smirnovi, P. subpraecox, P. tenue, P. tejerai, P. tomodoni, P.
torrealbai, P. traguli, P. tribolonoti, P. tropiduri, P. uilenbergi,
P. watteni, P. wenyoni, P. vacuolatum, P. vastator, P. vaughani, P.
vinckei, P. volans y/o P. youngi.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 7
donde la muestra de sangre puede estar infectada con Plasmodium
vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale,
Plasmodium yoelli, P. berghei, P. brasilianum, P. chabaudi, P.
cynomolgi, P. fragile, P. knowlesi y/o P. reichenowi.
\newpage
9. Método de acuerdo con la reivindicación 6
donde la ultracentrifugación secuencial de la etapa b)
comprende:
- i)
- centrifugar entre 400-900 x g durante 25-35 minutos
- ii)
- centrifugar entre 10 000-14 000 x g durante 20-40 minutos
- iii)
- centrifugar entre 90 000-110 000 x g durante 1 -3 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Composición farmacéutica que comprende
exosomas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y
al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. Vacuna frente a la malaria que comprende
exosomas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
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