ES2360547B1 - Procedimiento de obtención de los alcaloides activos de la planta medicinal peganum harmala y su uso. - Google Patents
Procedimiento de obtención de los alcaloides activos de la planta medicinal peganum harmala y su uso. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención describe un procedimiento para la obtención de los principios activos responsables de la actividad biológica y farmacológica de la planta medicinal Peganum harmala, mediante un procedimiento que consiste en una extracción selectiva de los alcaloides quinazolínicos (peganina o vasicina, deoxipeganina y glicósido de peganina) y beta-carbolínicos (harmalina y harmina). Los alcaloides aislados puros, en extractos y/o las fracciones enriquecidas de éstos, obtenidas desde distintas partes de la planta pueden ser utilizados en preparados farmacéuticos, cosméticos, nutracéuticos, productos naturales o preparados de herbolario y como remedio natural para el tratamiento de distintas patologías en las que se utilizan la planta medicinal P. harmala como los problemas o enfermedades respiratorias, infecciosas, neurodegenerativas, y cáncer. El procedimiento fracciona o purifica los principios activos evitando interacciones indeseables y aumentando la selectividad y seguridad de los extractos medicinales de P. harmala.
Description
Procedimiento de obtención de los alcaloides activos de la planta medicinal Peganum harmala y su uso.
Sector de la técnica
La presente invención se encuadra en el sector químico y describe un procedimiento mejorado de producción y obtención de los principios activos de la planta medicinal P. harmala: alcaloides quinazolínicos (peganina -vasicina-, deoxipeganina y glicósido de peganina) y alcaloides beta-carbolina, harmalina y harmina para su uso en preparados farmacéuticos, cosméticos, parafarmacia, nutracéuticos y/o productos de herbolario para su uso como remedio natural
o en el tratamiento de patologías en las que se utiliza tradicionalmente esta planta medicinal (por ej. enfermedades respiratorias, neurológicas, infecciones, antiparasitarias, antiprotozoarias) o como remedio natural en otros tratamientos dermatológicos (calvicie).
Estado de la técnica
Peganum harmala L. es una planta medicinal utilizada desde muy antiguo en distintas partes del mundo como remedio natural eficaz para el tratamiento de distintas patologías por sus propiedades farmacológicas y psicoactivas (análogo de Ayahuasca). P. harmala L. (Zygophyllaceae) (Syrian rue, harmal, harmel) es una planta perenne herbáceanativa de terrenos áridos del norte de África, región mediterránea, oriente medio, Paquistán, India y China y que se ha introducido y naturalizado en partes de sudoeste de EEUU, Sudáfrica y Australia. La ingestión de sus semillas poseen efectos hipotérmicos, y propiedades alucionógenas y se utiliza como remedio medicinal, incienso, especia y condimento. Tiene actividad como agente abortivo, narcótico, afrodisíaco, estimulante, sedativo, emenagogo, emético, y para el tratamiento de sífilis, fiebre, histeria, malaria, neuralgia, parkinsonismo, reumatismo, cólico, asma y enfermedades respiratorias y oculares (Berrougui et al., 2006, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 58, 967-974; Abdelfattah et al., 1995, Pharmacology Biochemistry and Behavior, 52, 421-426; Astulla et al., 2008, Journal of Natural Medicines, 62, 470-472; Elbahri and Chemli, 1991, Veterinary and Human Toxicology, 33, 276-277. Farouk et al., 2008, Journal of Ethnopharmacology, 115, 449-454.; Mahmoudian et al. (2002) Iranian Journal of Pharmacology & Therapeutics, 1, 1-4; Im et al., 2009, Vascular Pharmacology, 50, 147-152.; Shahverdi et al., 2008, Pharmacognosy Magazine, 4, 236-240.; Monsef et al., 2004, Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7, 65-69). Extractos de P. harmala también son útiles contra la caída del cabello (Imad y col, patente FR2912914). Estudios recientes han demostrado que los extractos de P. harmala también tienen actividad como fungicida, bactericida y antitumoral (Sobhani et al., 2002, Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5, 19-23; Lamchouri et al., 1999, Therapie, 54, 753-758.; Song et al., 2004 Biochemical and Biophysical Research Communications, 317, 128-132; Luay, 2003, patente NZ522055 y Suo Huazhong, 2001, patente CN1299664; Ismail, patente WO9924048).
Además de sus efectos farmacológicos, los extractos de P. harmala pueden ocasionar efectos toxicológicos moderados. Una sobredosis ingerida de P. harmala puede producir casos de intoxicación con parálisis, euforia, convulsiones, alucinaciones, problemas digestivos (nauseas, vómitos), hipotermia y bradicardia (Frison et al., 2009, Forensic Science International, 179, e37-e43; Ben Salah et al., 1986, Essaydali Scietifique, 21, 13-18). Estos efectos, son moderados y los síntomas remiten a las pocas horas de cesar en la ingestión. Preparaciones de la planta pueden mostrar efectos psicofarmacológicos potentes y pueden afectar a la enzima monoamino oxidasa (MAO) con la posibilidad de producir interacciones con alimentos y generar crisis hipertensivas debido a la presencia de aminas vasoactivas. Estos datos demuestran la necesidad de una caracterización y separación de los distintos principios activos de la planta ya que éstos conjuntamente pueden producir efectos contrarios e interacciones indeseables, impidiendo el uso racional de esta planta medicinal en distintas patologías. Una caracterización, fraccionamiento y purificación de los principios activos puede permitir la obtención de resultados mejores y más selectivos sobre los efectos farmacológicos buscados evitando posibles acciones toxicológicas secundarias.
Peganum harmala L. contiene diversos principios activos útiles en el tratamiento de enfermedades. Las propiedades farmacológicas de P. harmala se atribuyen principalmente a su contenido en alcaloides β-carbolínicos y quinazolínicos que son los principales principios activos de P. harmala. Los alcaloides β-carbolinas son sustancias psicoactivas que muestran potente actividad como inhibidores de MAO y ejercen actividad sobre el sistema CNS debido a la interacción con muchos receptores (Airaksinen y Kari, 1981, Medical Biology, 59, 190-211. Herraiz y Chaparro, 2005 Biochemical and Biophysical Research Communications, 326, 378-386). Estos compuestos podrían ser muy útiles como posibles agentes antidepresivos o para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Los alcaloides quinazolínicos son potentes broncodilatadores, agentes hipotensivos y pueden tener actividad antiprotozoaria (antileishmania) (Khaliq, 2009, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 2585). Son estimulantes de la contracción del útero y se han utilizado como agentes abortivos. Se ha sugerido, también, que estos componentes podrían inhibir la enzima MAO, tienen actividad acetilcolinesterasa y son de uso potencial en el tratamiento de la dependencia de nicotina (WO2008007163) y en la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, estos alcaloides también podrían contribuir a los efectos psicofarmacológicos que produce la ingestión de P. harmala. Los alcaloides quinazolínicos también se encuentran en la planta medicinal Adhatoda vasica (US2003/0180392) (familia Acanthaceae), comúnmente conocida como Arusa, Vasaka, o Malabarnut. Esta planta se utiliza en la medicina India para el tratamiento de problemas respiratorios como catarro, asma, y resfriados, siendo los principales principios activos responsables de estas actividades, los alcaloides vasicina (peganina) y derivados de vasicina. Estos mismos compuestos pueden ser obtenidos desde la planta P. harmala tal y como se demuestra en esta invención.
Así pues, los principios activos de la planta P. harmala muestran destacada actividad biológica y farmacológica, y son utilizados en diversos tratamientos en la medicina tradicional y como remedios derivados de plantas medicinales. Sin embargo, cuando se utilizan conjuntamente podrían dar lugar a posibles efectos secundarios debido a los efectos cruzados de interacción entre principios activos en la acción farmacológica de los distintos principios activos. Así, por ejemplo, las β-carbolinas pueden mostrar actividad como inhibidores de MAO, y efectos sobre el SNC, mientras que la vasicina y los derivados quinazolínicos muestran actividad antiparasitaria o broncodilatadora. Unos u otros muestran acción citotóxica de posible aplicación en el tratamiento de tumores. Por ello, un procedimiento que consiga identificar, aislar y obtener los compuestos puros y fracciones de ellos enriquecidos con actividades selectivas para cada tratamiento tiene ventajas para su uso.
A pesar de las interesantes propiedades farmacológicas y toxicológicas de P. harmala, utilizada en la medicina oriental, no se han descrito con suficiente detalle procedimientos prácticos y determinaciones precisas sobre la distribución relativa y el contenido de alcaloides y principios activos en la planta. Algunos estudios son limitados y se centran en la presencia de beta-carbolinas con poca atención a las quinazolinas (Kartal et al., 2003, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 31, 263-269; Hemmateenejad et al., 2006, Analytica Chimica Acta, 575, 290-299. Pulpati et al., 2008 Journal of AOAC International, 91, 1179-1185). En la presente invención se describe la identificación y separación de los principales principios activos de la planta P. harmala tanto los alcaloides quinazolínicos como beta-carbolínicos, caracterizado su presencia en diferentes partes de la planta, y describiendo un nuevo compuesto activo caracterizado como un glicósido de peganina.
Para distinguir actividades biológicas, se determinan los alcaloides y fracciones de alcaloides de P. harmala útiles como inhibidores de MAO y antidepresivos y los principios activos que no poseen esta actividad. Los alcaloides producidos o extractos de ellos producidos desde la planta P. harmala pueden ser utilizados como productos o subproductos para la preparación de remedios farmacológicos, nutracéuticos o productos de herbolario o cosméticos basados en esta planta medicinal.
El procedimiento de invención comprende la extracción de diferentes partes de la planta P. harmala: hojas, flores y cápsulas verdes inmaduras y semillas secas. Se utilizan hojas, flores y capsulas verdes para la obtención de peganina (también llamada vasicina), capsulas verdes inmaduras para la obtención de peganina y deoxipeganina (también llamada deoxivasina) y semillas secas para la obtención de vasicina, un nuevo glicósido de peganina (glicósido de vasicina) y los alcaloides beta-carbolínicos harmalina y hamina. El procedimiento comprende los siguientes pasos: extracción de las partes de la planta con un extracto alcohólico en medio ácido a temperatura ambiente, ajuste del pH del extracto entre 5-11 según el compuesto a obtener, y extracción con un disolvente orgánico, y procesamiento posterior de la fase orgánica y/o la fase acuosa por concentración a vacío para obtener extractos enriquecidos de alcaloides, o bien separación por columna de cromatografía preparativa, para obtener los principios activos puros peganina, deoxipeganina, un nuevo compuesto caracterizado como glicósido de peganina, harmalina y harmina, en función de las partes de la planta que se ha extraído.
La presente invención presenta ventajas con respecto al estado de la técnica:
1) Se caracterizan los principales principios activos de la planta medicinal P. harmala, incluido un nuevo alcaloide caracterizado como glicósido de peganina.
2) Establece las partes de la planta a procesar según el principio activo o alcaloide a obtener.
3) Permite obtener los principales principios activos de la planta medicinal P. harmala puros o en su defecto productos o extractos enriquecidos.
4) Permite fraccionar dos tipos de alcaloides, quinazolina y beta-carbolina como principales principios activos naturales de la planta P. harmala.
5) Se facilita la utilización selectiva de fracciones de la planta medicinal P. harmala en función del alcaloides y principios activos buscados.
6) El fraccionamiento selectivo por alcaloides puede posibilitar una acción farmacológica más selectiva de los productos obtenidos de esta planta medicinal reduciendo los posibles procesos toxicológicos o de interacción entre principios farmacológicos.
Descripción de la invención
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- Breve descripción de la invención
Esta invención describe un procedimiento mejorado para obtener los principios activos de la planta medicinal P. harmala: alcaloides quinazolínicos, peganina (vasicina), deoxivasicina y un nuevo compuestos caracterizado como un glicósido de peganina o vasicina y los alcaloides beta-carbolínicos obtenidos a partir de extractos específicos de la planta P. harmala, así como su utilización para distintas formulaciones basadas en esta planta medicinal para el tratamiento de enfermedades respiratorias, neurodegenerativas, cancerígenas, antimicrobianas o antiparasitarias, o dermatológicas.
Se describe un procedimiento ventajoso para obtener y aislar los principios activos de la planta medicinal P. harmala: alcaloides quinazolínicos peganina, deoxipeganina y un nuevo compuesto caracterizado como glicósido de peganina y los alcaloides beta-carbolínicos, y que pueden ser de utilidad en preparados farmacéuticos o en formulaciones basadas en plantas medicinales, para su uso en el tratamiento de diversas patologías en las que estos principios activos son de utilidad como enfermedades respiratorias, neurodegenerativas, cancerígenas, antimicrobianas, antiparasitarias, antiprotozoarias. El procedimiento se basa en una extracción hidroalcohólica-ácida, y posterior extracción selectiva con disolventes orgánicos para la obtención de fracciones enriquecidas de los distintos alcaloides, que pueden ser separados y purificados con columna preparativa, para obtener los principales principios activos: peganina, deoxipeganina, glicósido de peganina y las beta-carbolinas, harmalina y harmina.
Descripción del contenido de las figuras
Figura 1. Cromatograma obtenido por RP-HPLC de los compuestos extraídos en la fase orgánica de diclorometano resultante de extraer un medio hidroalcohólico-ácido de semillas secas de P. harmala a pH 5 en embudo de decantación. La fase orgánica tras su concentración a sequedad y redisolución en HCl 0.1 M se inyecta en HPLC. Columna Novapak C18 (Waters). Eluyente A: tampón fosfato amónico pH 3; Eluyente B: 20% de A en acetonitrilo. Gradiente 32% B a los 8 min, 90%Balos 18 min. Aparecen principalmente los alcaloides beta-carbolínicos.
Figura 2. Cromatograma obtenido por RP-HPLC de la fase acuosa restante tras extraer un medio hidroalcohólicoácido de semillas secas de P. harmala a pH 5 con diclorometano en embudo de decantación. Columna Zorbax C18 (Agilent). Eluyente A: tampón fosfato amónico pH 3; Eluyente B: 20% de A en acetonitrilo. Gradiente 32% B a los 8 min, 90% B a los 18 min. En esta fase aparecen principalmente los alcaloides quinazolínicos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención describe un procedimiento para la producción, y obtención de los principios activos: alcaloides quinazolínicos de la formula 1, y beta-carbolinas obtenidos a partir de la planta medicinal P. harmala y que pueden ser utilizados como compuestos puros, mezclas o fracciones enriquecidas con utilidad farmacológica para el tratamiento de diversas patologías o condiciones patológicas y que comprende los siguientes pasos:
Donde R en la formula 1 es H (deoxivasicina) (1) ; OH (peganina o vasicina) (2); glicósido de peganina (-Opiranosa-O-piranosa) (3)
a) extracción de las hojas y flores secas pulverizadas con una disolución alcohólica-ácida a temperatura ambiente,
b) extracción de las capsulas verdes inmaduras con una disolución alcohólica-ácida a temperatura ambiente,
c) extracción de las semillas secas con una disolución alcohólica-ácida a temperatura ambiente,
d) extracción del extracto hidroalcohólico del paso a) con disolventes orgánicos a un pH básico,
e) extracción del extracto hidroalcohólico del paso b) con disolventes orgánicos a un pH básico,
f) extracción del extracto hidroalcohólico del paso c) con disolventes orgánicos a un pH determinado, entre pH 411, preferiblemente pH 5,
g) utilización de la fase orgánica obtenida en el paso d) para la obtención de un extracto enriquecido en peganina (vasicina) (2), y que puede concentrarse a vacío, o pasarse por columna cromatográfica C18 para aislar peganina pura.
h) utilización de la fase orgánica obtenida en paso e) para la obtención de un extracto enriquecido en peganina (vasicina) (2) y deoxivasicina (1), que puede concentrase a vacío o pasarse por columna cromatográfica preparativa para aislar los compuestos puros peganina (2) y deoxivasicina (1) con alta pureza,
i) utilización de la fase acuosa obtenida en paso f) para la obtención de un extracto enriquecido en peganina
(2) y glicosido de peganina (3) que pueden concentrarse en vacío o que pueden separarse y aislarse por columna cromatográfica C18, para obtener los compuestos puros (2) y (3),
j) utilización de la fase orgánica del paso f) para la obtención de los alcaloides beta-carbolínicos harmina y harmalina, que pueden concentrarse o enriquecerse a vacío o que pueden separarse por cromatografía en columna C18,
k) la utilización de los extractos o productos puros obtenidos en los pasos a) hasta j), que incluyen alcaloides quinazolínicos y beta-carbolínicos para la formulación de preparados farmacéuticos, o cosméticos, útiles en el tratamiento de distintas patologías, incluido enfermedades respiratorias, cáncer, antimicrobianas, antiparasitarias, enfermedades dermatológicas.
En los pasos a), b) y c) en que el alcohol utilizado se selecciona de un grupo consistente en metanol, etanol, propanol, isopropanol, y preferiblemente etanol, metanol.
En los pasos a), b) y c) en los que el medio ácido se selecciona entre los ácido clorhídrico, perclórico, y acético, preferiblemente ácido clorhídrico o ácido perclórico.
En el paso d), e) y f), el disolvente orgánico se selecciona de un grupo consistente en diclorometano, acetato de etilo, hexano y cloroformo, y preferiblemente diclorometano y acetato de etilo.
La extracción en el paso f) se realiza entre pH 4 y 10, preferiblemente pH 5, ajustado con disolución de NaOH o KOH.
La purificación por cromatografía preparativa C18 se realiza con agua-metanol como eluyente, y permite obtener peganina (vasicina) (2) con una pureza superior al 90% desde el paso c), d), e), deoxivasicina (1) con una pureza superior al 90% desde el paso b), glicósido de peganina (3) con una pureza superior al 90% desde paso c) y las betacarbolinas harmina y harmalina con una pureza superior al 90%.
La invención comprende la obtención de los distintos principios activos de la planta medicinal P. harmala desde partes seleccionadas mediante un procedimiento de extracción hidroalcohólica, extracción con disolventes orgánicos a un pH prefijado, concentración a vacío, purificación en columna preparativa C18 y los nuevos compuestos o las fracciones de estos pueden utilizarse en distintas preparaciones o formulaciones con interés farmacológico o cosmético.
En la presente invención, los compuestos asilados peganina (vasicina) (2), deoxipeganina (1) pueden ser de utilidad en formulaciones para el tratamiento de problemas o enfermedades respiratorias, antimicrobianos, antiparasitarios, antileishmaniosis, cáncer, enfermedades o problemas dermatológicos.
En la presente invención el compuesto glicósido de peganina (3) aislado de P. harmala, puede ser de utilidad en formulaciones para el tratamiento de enfermedades respiratorias, contracción uterina, antimicrobiano, antiparasitario, antileishmaniosis, cáncer, enfermedades dermatológicas.
En la presente invención, los alcaloides beta-carbolínicos harmalina y harmina obtenidos mediante el procedimiento citado, pueden ser de utilidad en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, y del sistema nervioso central, y para el tratamiento de la depresión por su condición de excelentes inhibidores de monoaminooxidasa (MAO), así como en el tratamiento de enfermedades parasitarias y cáncer por su carácter citotóxico y enfermedades dermatológicas.
Ejemplo de la realización de la invención
La planta P. harmala se recoge en la provincia de Toledo entre Abril-Diciembre y se procesa para obtener los alcaloides quinazolínicos y carbolínicos según se detalla a continuación.
Ejemplo 1
1 g de flores y hojas pulverizadas secas de P. harmala se extraen en un medio metanol-ácido perclórico 1:1 (20 ml), utilizando un ultraturrax y este proceso se repite dos veces más con el residuo. El extracto metánolico-ácido se lleva con NaOH1NapH9yseextrae con 3 volúmenes de diclorometano utilizando un embudo de decantación. La fase orgánica se concentra en rotavapor para obtener un extracto enriquecido en peganina (vasicina) (2), analizado por RP-HPLC, y caracterizado por UV-VIS y HPLC-MS (ESI, masa exacta) y RMN. El compuesto se cromatografía en columna preparativa C18 para su purificación y obtener 28 mg de peganina.
Peganina (vasicina) (C11H12N20) (2): masa molecular: 188.0946
1H-RMN (300 MHz): (CDCl3):
ESI-HR-MS (Agilent Technologies) : 189.1019 (M+H)+ ,
ESI-HPLC-MS: Eluyentes A: 0.1% ácido fórmico; Eluyente B: acetonitrilo-0.1% ácido fórmico, m/z 189 (M+H)+; pureza mayor de 95%
UV-VIS: max relativo 280 nm
Ejemplo 2
1 g de cápsulas (frutos) inmaduras verdes de P. harmala se extraen en un medio metanol-ácido perclórico 1:1 (20 ml), utilizando un ultraturrax y este proceso se repite dos veces más con el residuo. El extracto metánolico-ácido se lleva con NaOH 1 N a pH 9 y se extrae con 3 volúmenes de diclorometano utilizando un embudo de decantación. El proceso se repite varias veces y la fase orgánica se concentra en rotavapor para obtener un extracto enriquecido en peganina, identificado por RP-HPLC, UV-VIS y HPLC-MS (ESI, masa exacta) y RMN. El compuesto se cromatografía por C18 para su purificación y obtención de peganina (49 mg) (2) como antes y deoxivasicina (16 mg) (1).
Deoxipeganina (deoxivasicina) (C11H12N2) (1): masa molecular calculada: 172.1002
1H-RMN (500 MHz) (D2O):
ESI-HR-MS (Agilent Technologies) : 173.1075 (M+H)+ ,
ESI-HPLC-MS: Eluyentes A: 0.1% ácido fórmico; Eluyente B: acetonitrilo-0.1% ácido fórmico, m/z 173 (M+H)+; pureza mayor de 95%
UV-VIS: max relativo 280 nm
Ejemplo 3
5 g de semillas secas pulverizadas de P. harmala se extraen en un medio metanol-ácido perclórico (1:1) (200 ml) en un ultraturrax, se centrifuga a 10000 rpm 10 min y el proceso se repite dos veces más con el residuo. El extracto hidroalcohólico se diluye con agua, se ajusta a pH 5 con una solución de 1N NaOH y se extrae seis veces con 1.5 volúmenes de diclorometano en embudo de decantación. La fase orgánica (Figura 1) contiene los alcaloides betacarbolínicos que se concentra en rotavapor y se identifican por HPLC-MS y espectros de UV-VIS. La fase acuosa que contiene, principalmente, los alcaloides quinazolínicos (Figura 2), se concentra en rotavapor a vacío a 40-55ºC y el concentrado se fracciona en columna preparativa C18 que se eluye con agua-ácido fórmico para obtener los alcaloides peganina (2) y glicósido de peganina (3) en distintas fracciones que se caracterizaron por HPLC, espectroscopia y RMN y ESI-HRMS (masa exacta). La fracción que contiene el glicósido de peganina se extrae con diclorometano en medio básico para separar impurezas restantes de peganina (2) que coeluyen en la columna cromatográfica con el glicósido (3). Tras el proceso se obtienen en total 90 mg de peganina y 360 mg de glicósido de peganina (3). Por otro lado, la fase orgánica del extracto inicial de las semillas se concentra, y se separa en columna preparativa, permitiendo obtener 215 mg de harmina y 280 mg de harmalina.
Los compuestos obtenidos se caracterizan:
- -
- Peganina (vasicina) (2) (C11H12N2O): masa molecular: 188.0946
1H-RMN (300 MHz): (CDCl3)
ESI-HR-MS (Agilent Technologies): 189.1019 (M+H)+ ,
ESI-HPLC-MS: Eluyentes A: 0.1% ácido fórmico; Eluyente B: acetonitrilo-0.1% ácido fórmico, m/z 189 (M+H)+; pureza mayor de 95%
UV-VIS: max relativo 280 nm -Peganina glicósido (o vasicina glicósido) (3):
Peganina glicósido (C23H32N2O11): masa molecular: 512.201
1H-RMN (500 MHz): (D2O):
ESI-HRMS (Agilent Technologies): 513.2083 (M+H)+ ,
ESI-HR-MS/MS (ión 513.2078) proporciona los fragmentos a m/z 351.1544 (C17H23N2O6) (H+H-162) (15%), y m/z 189.1017 (C11H11N2O) (MH-324) (75%) y m/z 171 (C11H11N2) (10%) (fragmentador V= 90 V), correspondientes a la pérdida de dos hexosas.
ESI-HPLC-MS: Eluyentes A: 0.1% ácido fórmico; Eluyente B: acetonitrilo-0.1% ácido fórmico, m/z 513 (M+H)+; pureza mayor de 95%.
Hidrólisis ácida de (3) en HCl conc./90ºC: se degrada y proporciona varios compuestos que se separan por HPLC-MS y que corresponden a un glicósido con una molécula de hexosa (MH+ , m/z 351) y un pico correspondiente a peganina (2) (m/z 189). Con el tiempo de hidrólisis el glicósido MH+ a 351 se termina hidrolizando y proporciona finalmente un pico correspondiente a peganina (2) (m/z 189).
UV-VIS: max relativo 280 nm
-Beta-carbolinas: harmalina (ESI-HPLC-MS): Eluyentes A: 0.1% ácido fórmico;
Eluyente B: acetonitrilo-0.1% ácido fórmico; (M+H)+ m/z 215; UV-VIS (max relativo a 355 nm); harmina (ESI-HPLC-MS): Eluyentes A: 0.1% ácido fórmico;
Eluyente B: acetonitrilo-0.1% ácido fórmico. (M+H)+ a m/z 213), UV-VIS (max relativo a 245 nm y 322 nm).
Estudio de inhibición de monoaminooxidasa (MAO) en las fracciones y alcaloides puros
Se estudió la actividad inhibidora sobre la enzima monoamiooxidasa A humana de un extracto de semillas secas de P. harmala (según Herraiz y Chaparro, 2006, Life Sciences 78, 295), obteniéndose que la inhibición de MAO-A es considerable con una IC50 de 25 μg/L en el medio de extracción HClO4 0.6 M:metanol, diluido convenientemente, para la realización de los ensayos.
Con el fin de determinar la actividad de inhibición de MAO de los extractos, se estudió la inhibición que proporcionan la peganina (2), deoxipeganina (1) y glicósido de peganina (3). Ninguno de los compuestos tuvo una inhibición detectable hasta 15 μM. También se estudió la inhibición de las fracciones de semillas secas de P. harmala, correspondientes a peganina (vasicina) y glicósido de peganina por un lado y de las beta-carbolinas por otro, tras su aislamiento por HPLC-preparativa. Los datos indicaron que la actividad de inhibición de la planta Peganum harmala correspondió en su totalidad a la presencia de beta-carbolinas (98%) y no a la presencia de los alcaloides quinazolínicos, peganina
(2) y glicósido de peganina (3). Así pues, la actividad inhibidora de MAO y su acción sobre el SNC de esta planta se debe a los alcaloides de tipo beta-carbolina y no a los de tipo quinazolina.
Claims (4)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para la obtención y producción de los principios activos de la planta medicinal P. harmala, caracterizados por ser alcaloides quinazolínicos derivados de la Formula 1, y alcaloides beta-carbolínicos como harmalina y harmina,donde el sustituyente R de la Formula 1, es H, deoxipeganina o deoxivasicina (1), OH, peganina o vasicina (2), o un sustituyente O-glicósido (3), donde la parte glicosídica unida al aglicón peganina (vasicina) es un disacárido constituido por dos carbohidratos o moléculas de hexosa (glucosa o sus isómeros o fructosa), y con uniones glicosídidas de la forma hexosa-O-hexosa-peganina,y que se caracteriza por comprender alguno o varios de los siguientes pasos:a) un procedimiento de extracción de hojas y flores pulverizadas secas de P. harmala en una disolución hidroalcohólica-ácida, donde el alcohol se selecciona entre metanol, etanol, propanol o isopropanol y el medio ácido entre ácido clorhídrico, ácido perclórico o ácido acético, y que se utiliza para obtener compuestos de la formula 1, preferiblemente peganina (2).b) un procedimiento de extracción de los frutos o capsulas verdes en un medio hidroalcohólico-ácido donde el alcohol se selecciona entre metanol, etanol, propanol, o isopropanol y el medio ácido entre ácido clorhídrico, ácido perclórico o ácido acético y que se utiliza para obtener alcaloides quinazolínicos de la formula 1, preferiblemente, peganina (vasicina) (2) y deoxipeganina (deoxivasina) (1),c) un procedimiento de extracción de semillas secas pulverizadas en medio hidroalcohólico-ácido donde el alcohol se selecciona entre metanol, etanol, propanol, isopropanol y el medio ácido entre ácido clorhídrico, ácido perclóricoo ácido acético, y que se utiliza para obtener preferiblemente los alcaloides quinazolínicos de la formula 1, peganina (vasicina) (2) y el peganina glicósido (3), y los alcaloides beta-carbolínicos harmalina y harmina,d) un procedimiento en el que el extracto hidroalcohólico obtenido según los pasos a) o b), donde el extracto se lleva a pH básico (8-11), y se extrae con disolventes orgánicos, preferiblemente diclorometano o acetato de etilo,e) un procedimiento en el que el disolvente orgánico obtenido en d) se concentra para obtener un extracto enriquecido en alcaloides quinazolínicos de la formula 1, preferiblemente, peganina (2) y deoxipeganina (1),f) un procedimiento en el que el extracto obtenido según e) se purifica en columna cromatográfica para obtener puros los alcaloides peganina (vasicina) (2) y deoxipeganina (1),g) un procedimiento en el que el extracto obtenido según el paso c) donde el extracto se lleva a pH 5-11, preferiblemente a pH 5, y se extrae con diclorometano o acetato de etilo,h) un procedimiento según el paso g) en el que la fase acuosa que queda después de extraer con medio orgánico, se concentra a vacío para obtener un extracto enriquecido en alcaloides quinazolínicos de la formula 1, principalmente peganina (vasicina) (2) y peganina glicósido (3),i) un procedimiento según el paso g) en el que la fase orgánica se concentra a vacío para obtener un extracto enriquecido en alcaloides de tipo beta-carbolina,j) un procedimiento según el paso h) en el que los alcaloides quinazolínicos se purifican por columna cromatográfica C18, para obtener puros peganina (vasicina) (2) y glicósido de peganina (3),k) un procedimiento según el paso i) en el que los alcaloides beta-carbolínicos se separan por columna cromatográfica preparativa para obtener puros los compuestos harmalina y harmina.
- 2. La utilización de los alcaloides quinazolínicos peganina (vasicina) (2), deoxipeganina (1) y peganina glicósido(3) de la formula 1, obtenidos puros, en extractos y/o fracciones enriquecidas de ellos, obtenidos desde la planta P. harmala según el procedimiento reivindicado en 1), para la elaboración de preparados farmacéuticos, nutracéuticos, parafarmacia, productos derivados de plantas medicinales y de herbolario, cosméticos, para el tratamiento, remedio natural o alivio de distintas enfermedades o patologías, entre las que se pueden incluir respiratorias, infecciosas, parasitarias, tumorales, neurodegenerativas.
- 3. La utilización de los alcaloides beta-carbolínicos harmalina y harmina puros y de las fracciones enriquecidas de ellos, obtenidos desde la planta P. harmala, según el procedimiento reivindicado en 1), para la elaboración de formulaciones o preparados farmacéuticos, nutracéuticos, preparados de plantas medicinales, y de herbolario o cosméticos para el tratamiento, remedio natural o alivio de distintas patologías, y particularmente para enfermedades del sistema nervioso central y cáncer.OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud:200930942ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 02.11.2009Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : Ver Hoja AdicionalDOCUMENTOS RELEVANTES
- Categoría
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- X
- US 20080069899 A1 (JOSSANG, A. et al.) 20.03.2008, párrafos [0088]-[0089], ejemplo 1; párrafos [0112]-[0134], ejemplos 3-6; párrafos [0041]-[0042]. 1-3
- X
- ASTULLA, A. et al. “Alkaloids from the seeds of Peganum harmala showing antiplasmodial and vasorelaxant activities”. Journal of Natural Medicine 2008, Volumen 62, páginas 470-472. [Disponible en línea el 04.06.2008]. Ver página 470, resumen; página 470, columna 2, párrafo 3. 1-3
- X
- YALCIN, D. & BAYRAKTAR, O. “Inhibition of cathecol-O-methyltransferase (COMT) by some plant-derived alkaloids and phenolics”. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010, Volumen 64, páginas 162-166. [Disponible en línea el 03.05.2009]. Ver página 162, resumen e introducción; página 164, columna 1, párrafo 2; página 163, apartado 2.2. 1-3
- X
- HEMMATEENEJAD, B. et al. “Partial least squares-based multivariate spectral calibration method for simultaneous determination of beta-carboline derivatives in Paganum harmala seed extracts”. Analytica Chimica Acta 2006, Volumen 575, páginas 290-299. [Disponible en línea el 06.06.2006]. Ver página 290, resumen e introducción; página 293, apartado 2.7. 1-3
- A
- ES 2316595 T3 (HF ARZNEINMITTELFORSCHUNG GMBH) 16.04.2009, página 3, líneas 11-24; reivindicación 1. 1-3
- A
- SU 878295 B ((AUZN-R) AS UZB VEGET CHEM) 07.11.1981 (resumen) [en línea] (recuperado el 26.11.2010). Recuperado de la base de datos WPI/Thomson. Número de Acesso: 1982-74317E [35]. 1-3
- E
- HERRAIZ, T. et al. “1-Carboline alkaloids in Peganum harmala and inhibition of human monoamine oxidase (MAO)”. Food and Chemical Toxicology 2010, Volumen 48, páginas 839-845. [Disponible en línea el 28.12.2009]. Ver página 839, resumen; página 840, apartado 2.1. 1-3
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 23.12.2010
- Examinador G. Esteban García Página 1/5
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICACLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUDC07D487/04 (01.01.2006) A61K31/519 (01.01.2006) A61K31/4375 (01.01.2006) A61P11/00 (01.01.2006) A61P3/00 (01.01.2006) A61P33/00 (01.01.2006) A61P35/00 (01.01.2006) A61P25/28 (01.01.2006)Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)C07D, A61K, A61PBases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)INVENES, EPODOC, WPI, TXTE, MEDLINE, BIOSIS, XPESP, NPL, EMBASE, PUBMED, GOOGLEOPINIÓN ESCRITAFecha de Realización de la Opinión Escrita: 23.12.2010Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-3 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-3 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.OPINIÓN ESCRITA1. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- US 2008/0069899 A1 20.03.2008
- D02
- ASTULLA, A. et al. Journal of Natural Medicine 2008, Vol. 62, pp. 470-472 04.06.2008
- D03
- YALCIN, D. & BAYRAKTAR, O. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010, Vol. 64, pp. 162-166 03.05.2009
- D04
- HEMMATEENEJAD, B. et al. Analytica Chimica Acta 2006, Vol. 575, pp. 290-299 06.06.2006
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónEl objeto de la invención es un procedimiento para la obtención y producción de los principios activos de la planta medicinalP. harmala, que son alcaloides quinazolínicos y 1-carbolínicos, a partir de hojas, flores, frutos o semillas de dicha planta, que comprende una o varias etapas de extracción y purificación; y la utilización de los alcaloides peganina, deoxipeganina, peganina glicósido, harmina y harmalina para la preparación de diversas formulaciones farmacéuticas, nutracéuticas o cosméticas.Novedad (Artículo 6.1 de la Ley de Patentes):El documento D01 divulga un procedimiento en varias etapas para la extracción de los alcaloides de Peganum harmala, que comprende la extracción de semillas molidas con metanol, la disolución del residuo obtenido tras la evaporación del disolvente en ácido clorhídrico al 2%, el lavado de la solución acuosa con diclorometano, la alcalinización de la misma con NaHCO3 y la extracción con diclorometano. El extracto obtenido una vez eliminado el disolvente se somete a una cromatografía en columna, dando lugar, entre otras fracciones, a los alcaloides puros harmina y peganina (compuesto 2 de la invención) (ver párrafos [0088]-[0089], ejemplo 1). El documento divulga además la actividad antineoplásica del alcaloide harmina (ver párrafos [0112]-[0134], ejemplos 3-6) y su utilización para la preparación de una composición farmacéutica (ver párrafos [0041]-[0042]).Por tanto, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-3 no es nuevo según lo divulgado en el documento D01.El documento D02 divulga un procedimiento para el aislamiento y purificación de los alcaloides presentes en Peganum harmala, como son los derivados de 1-carbolina harmina y harmalina, y los alcaloides quinazolínicos vasicinona y deoxivasicinona, que mostraron diferentes actividades biológicas, en concreto, actividad antiplasmodio (en el caso de harmina y harmalina) y vasorrelajante (vasicinona) (ver página 470, resumen). El procedimiento de obtención de estos alcaloides se inicia con la extracción de semillas secas de Peganum harmala con metanol, que da lugar a un extracto que se disuelve en una mezcla de acetato de etilo y ácido tartárico al 3%. La fase acuosa separada se lleva a pH 10 mediante la adición de NaHCO3, y se extrae con cloroformo, obteniéndose una fracción que comprende los materiales solubles en cloroformo y que se somete a dos procesos consecutivos de cromatografía, primero en columna y posteriormente preparativa, tras los cuales se aíslan fracciones que contienen cada uno de los componentes (harmina, harmalina, vasicinona y deoxivasicinona) (ver página 470, columna 2, párrafo 3).En consecuencia, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-3 no presenta novedad según lo divulgado en el documento D02.OPINIÓN ESCRITAEl documento D03 divulga un procedimiento para la extracción de los productos naturales presentes en plantas de la especie Peganum harmala, entre los que se encuentran los alcaloides 1-carbolínicos (harmina, harmalina, harmalol, harmano, etc.) y quinazolínicos (vasicina o peganina, vasicinona, etc.), algunos de los cuales, harmina y harmalina, actúan como inhibidores de catecol-O-metiltransferasa (COMT), y por tanto, pueden tener aplicación en la terapia de la enfermedad de Parkinson (ver página 162, resumen e introducción; página 164, columna 1, párrafo 2). El procedimiento de obtención de estos alcaloides comprende la extracción de semillas trituradas de P. harmala con metanol, la evaporación del disolvente, la disolución del residuo en una solución de HCl al 5%, la extracción de dicha disolución con éter de petróleo, la basificación de la fase acuosa ácida con NH4OH hasta pH 9, la extracción con cloroformo y la evaporación del disolvente a vacío (ver página 163, apartado 2.2).Por tanto, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-3 no es nuevo según lo divulgado en el documento D03.El documento D04 divulga un procedimiento para la extracción de los alcaloides 1-carbolínicos (harmina, harmano, harmalol y harmalina) presentes en las semillas de la planta Peganum harmala, que presentan diversas actividades biológicas, entre los que se encuentran los efectos potenciales sobre el sistema nervioso central y el sistema cardiovascular, actividades citotóxicas y de inhibición de topoisomerasa I de DNA humano (ver página 290, resumen e introducción). El procedimiento de obtención de estos alcaloides comprende las siguientes etapas: extracción de semillas secas y pulverizadas de P. harmala con metanol a 50ºC; evaporación del disolvente a sequedad; disolución del residuo en HCl al 2%; extracción de dicha disolución, una vez filtrada, con éter de petróleo; basificación de la fase acuosa ácida con NH4OH hasta pH 10; extracción con cloroformo; y evaporación del disolvente (ver página 293, apartado 2.7).Por tanto, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-3 no presenta novedad respecto a lo divulgado en el documento D04.
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| FD2A | Announcement of lapse in spain |
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