ES2353270T3 - Frasco para colorantes fotosensibles. - Google Patents

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Abstract

Un envase que comprende un conjunto constituido por un fluorocromo sensible a la luz visible y un recipiente que lo contiene, formando al menos las paredes laterales de dicho recipiente una pantalla eficaz contra las radiaciones del espectro luminoso entre 200 y 900 nm, caracterizado por que el fluorocromo se elige entre isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), PercP y caracterizado por que las paredes laterales del recipiente tienen una estructura que bloquea al menos el 95% de las radiaciones del visible.

Description

La presente invención se refiere a envases novedosos para colorantes fotosensibles y un método novedoso de envasado de reactivos formado por fluorocromos para citometría.
La citometría de flujo es una técnica de análisis de células muy utilizado desde hace decenios. Esta técnica implica al menos un fluorocromo.
Es una herramienta poderosa para el análisis antigénico celular. Esta técnica permite analizar diversos blancos antigénicos al mismo tiempo gracias a las combinaciones de anticuerpos conjugados con los fluorocromos. Los principales fluorocromos utilizados en citometría son isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), PercP, las parejas ficoeritrina-cianina 5 (PC5), ficoeritrina-cianina 7 (PC7) y ficoeritrina-rojo texas (ECD o PETR). Estos fluorocromos absorben las radiaciones luminosas, en particular a 488 nm y 633 nm,que son las principales longitudes de onda de emisión de los láseres utilizados en las citometrías. Las parejas PC5, PC7, ECD utilizan el principio de transferencia de energía, es decir que el láser de citometría excita la molécula en la zona espectral de la ficoeritrina que restituye la energía absorbida a la molécula aceptora (cianina 5, cianina 7 o rojo Texas) que la va a restituir ella misma en forma radiativa en su longitud de onda de emisión.
Las parejas de colorantes absorben sin embargo la luz en toda la zona espectral y en particular en la zona del visible (400-800 nm) y el solicitante se ha dado cuenta de que estos fluorocromos, solos o en pareja, están sometidos a degradaciones sensibles durante su conservación.
Estas degradaciones inducen un deterioro de la eficacia de la transferencia energética que conduce a un aumento de la intensidad de la fluorescencia de la ficoeritrina a 580 nm. Este fenómeno se traduce en citometría por un aumento de la fluorescencia (denominada fuga) en el canal de la ficoeritrina (FL2) que puede ocasionar diferentes problemas:
-Aparición de células falsamente positivas
2
-Necesidad de aumentar las compensaciones para recobrar los valores de intensidad de fluorescencia iniciales. El último punto es particularmente crucial en el caso de sistemas informáticos de compensación automática.
La patente británica GB-A-2 086 342 describe un recipiente para productos que son sensibles a las radiaciones del espectro luminoso especialmente la leche, caracterizado porque el recipiente comprende dos capas que efectúan la retención de la luz con una longitud de onda menor que 800 nm y de 800 nm o más alta.
La pareja ficoeritrina-aloficocianina ha sido descrita hace cerca de 20 años (Glazer y col. Biophys. J. (1.983) 83, 383-386 y las parejas ficoeritrinacianina 5 desde hace cerca de 10 años Lanier y col. Methods (1.991) Vol 2 Nº 3 192-199. Desde entonces, esta clase de productos se ha comercializado en recipientes de vidrio pardo o ámbar por las Compañías BECTON DICKINSON, PHARMINGEN, DAKO, IQP O CALTAG.
Será deseable pues disponer de un envase de fluorocromos que asegure la conservación de dichos fluorocromos durante un periodo prolongado.
Después de un determinado número de ensayos, el solicitante ha realizado la hipótesis de que estos fluorocromos podrían ser sensibles a la luz visible. Así ha recubierto las paredes laterales de los recipientes de fluorocromos con una funda termorretráctil que absorbe la luz visible. Se ha observado entonces una mejora muy sensible sin conseguir aún plena satisfacción. Entonces ha procedido a otros ensayos que no aportaron más progreso.
Al continuar sus investigaciones, el solicitante ha descubierto con sorpresa el hecho de que el fondo de los recipientes recubiertos no esté protegido es suficiente para degradar los fluorocromos, durante la manipulación de los recipientes o cuando se tumbaban sobre un lado en vez de apoyarse en la parte inferior. El solicitante ha comprendido entonces que estos fluorocromos eran muy sensibles a las longitudes de onda comprendidas entre
3
200 y 900 nanómetros, especialmente a la luz visible, particularmente a las longitudes de onda comprendidas entre 400 a 700 nanómetros y especialmente a las longitudes de onda comprendidas entre 400 y 600 nanómetros.
Según el solicitante, la degradación de las parejas tendría por origen un fenómeno de oxidación fotoinducida en el que las moléculas desempeñan el papel de fotosensibilizador, es decir, que son capaces de activar el oxígeno:
-
por transferencia de la energía luminosa absorbida con generación de oxigeno singlete (mecanismo denominado de tipo II),
-
por transferencia de electrones al estado excitado con generación de radicales oxigenados (mecanismo denominado de tipo I).
La invención se basa en la utilización de recipientes opacos a las radiaciones luminosas excitadoras de las parejas, es decir, entre 200 y 900 nm y más en particular entre 400 y 800 nm.
Por tanto, la presente solicitud tiene por objeto un envase que comprende un fluorocromo sensible a las longitudes de onda comprendidas entre 200 y 900 nanómetros y especialmente a las longitudes de onda comprendidas entre 400 y 600 nanómetros, situado en un recipiente en que al menos las paredes laterales forman una pantalla eficaz a las radiaciones del espectro luminoso entre 200 y 900 nm, en particular a las longitudes de onda comprendidas entre 400 a 800 nanómetros, más en particular de 400 a 700 nanómetros y especialmente entre 400 y 600 nm.
En la presente solicitud y en lo que sigue, el término “fluorocromo sensible a la luz visible” designa un fluorocromo en el que la estructura se degrada por una emisión a las longitudes de onda indicadas, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), PercP, las parejas ficoeritrina-cianina 7 (PC7), ficoeritrina-cianina 5 (PC5) y ficoeritrina-rojo texas (ECD o PETR), preferentemente estos dos últimos. La expresión “forman una pantalla eficaz contra las radiaciones” significa que al menos el 95%, preferentemente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% y muy particularmente el 100% de las radiaciones del visible son
4
bloqueadas por las paredes laterales del recipiente debido a su estructura (naturaleza, tratamiento o recubrimiento especialmente). El término “recipiente” designa preferentemente una botella pequeña preferentemente de rosca, provista de un tapón con o sin septo. El recipiente puede ser de polietileno, polipropileno, policarbonato, pero preferentemente de vidrio. Su capacidad puede ir preferentemente de 50 �l a 50 ml, especialmente de 100 �l a 20 ml, particularmente de 500 �l a 10 ml y muy particularmente de 1 ml a 10 ml. Un recipiente de 5 ml puede ser llenado por ejemplo por 1 a 2 ml de disolución.
Se prefieren muy en particular recipientes de vidrio de aproximadamente 5 ml.
En las condiciones preferentes de aplicación de la invención, el fondo del recipiente forma igualmente una pantalla eficaz contra las radiaciones del espectro visible.
Son ya conocidas en perfumería las técnicas de recubrimiento o revestimiento de recipientes que forman una pantalla eficaz contra las radiaciones del espectro visible, utilizadas con fines estéticos.
Se puede citar por ejemplo el revestimiento por pulverización electrostática que consiste en adaptar un septo a los recipientes que se perfora mediante un electrodo que se instala en el recipiente que se va a recubrir. Los recipientes se colocan en un recinto que contiene un polvo pulverizado, con carga de signo opuesto al del recipiente. El polvo se deposita entonces sobre el recipiente sobre el que se fija por ejemplo por cocción en una estufa a aproximadamente 180ºC. En el ámbito de la invención, se puede utilizar por ejemplo un polvo de resina epoxídica que absorbe preferentemente en las longitudes de onda indicadas anteriormente, en particular de 600 a 800 nanómetros, de color negro o azul especialmente.
También se puede recubrir el recipiente ventajosamente con un recubrimiento termorretráctil que recubre preferentemente igualmente el fondo del recipiente.
Se puede incluso irradiar ciertos tipos de vidrios con radiación gamma.
Se puede efectuar tanto un moldeo a vacío con ayuda de una película
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de plástico, lo que ofrece la ventaja de poder recubrir el fondo de los recipientes.
Los envases objeto de la presente invención poseen propiedades muy interesantes. La utilización de los conjuntos de recipientes recubiertos o tratados como se ha descrito anteriormente suprime el fenómeno de la oxidación fotoinducida y confiere una excelente estabilidad a los conjugados fluorocromos-anticuerpos o pareja-anticuerpos.
Estas propiedades se ilustran más adelante en la parte experimental.
La presente solicitud también tiene por objeto un procedimiento de protección de fluorocromos sensibles a la luz visible y especialmente a las longitudes de onda comprendidas entre 400 y 600 nanómetros durante su conservación, en la que se utiliza el envase según la presente invención.
Las condiciones preferentes de aplicación de los envases descritas anteriormente se aplican igualmente a los demás objetos de la invención indicados anteriormente, especialmente al procedimiento de protección de fluorocromos.
Los ejemplos que siguen ilustran la presente solicitud:
-las figuras 1A, B, C, D y E representan los resultados de fluorescencia obtenidos con las muestras de conjugados de anticuerpos contra CD3Ficoeritrina-cianina 5 contenidos en su recipiente de origen o de un recipiente según la invención y sometidos a la acción de la luz, y
-las figuras 2A, B, C y D representan los resultados de fluorescencia obtenidos con las muestras de conjugados de anticuerpos contra CD19-Ficoeritrina-rojo texas contenidos en su recipiente de origen o de un recipiente según la invención y sometidos a la acción de la luz.
Más precisamente, -las figuras 1A y 2A se refieren a un conjugado protegido de la luz, que sirve de testigo,
-
las figuras 1B y 2B se refieren a un conjugado acondicionado en un recipiente de vidrio comercial BeckmanCoulter Immunotech de la gama IOTEST,
-
las figuras 1C y 2C se refieren a un conjugado acondicionado en un recipiente de vidrio comercial BeckmanCoulter Immunotech de la gama Cytostat,
-la figura 1D se refiere a un conjugado acondicionado en un recipiente de vidrio comercial BECTON DICKINSON Pharmingen, y
-
las figuras 1E y 2D se refieren a un conjugado acondicionado en un recipiente de vidrio comercial BeckmanCoulter Immunotech de la gama IOTEST, recubierto por una capa de barniz epoxídico según el procedimiento de pulverización electrostática del ejemplo 1.
6
Ejemplo 1: Revestimiento de un recipiente de vidrio mediante resina epoxídica
Se ponen los recipientes comerciales de vidrio destinados a contener los conjugados de anticuerpos contra CD3-Ficoeritrina-cianina 5 de BeckmanCoulter Immunotech de la gama IOTEST en una cadena que realiza las siguientes etapas:
Se lavan los recipientes.
Se pasan por una estufa de secado.
Se pasan a continuación a una cabina en la que los recipientes se
recubren de un septo perforado por un electrodo.
El polvo de resina epoxídica Negro mate AKZO referencia NOIR MAT 1P200 8391 (referencia nueva AN052F) con carga opuesta a la del electrodo pulverizado en la cabina se aplica por el fenómeno electrostático sobre la superficie de recipientes que se hacen pasar después a una estufa para cocción a 180ºC. Ejemplo 2: Revestimiento de un recipiente de vidrio con ayuda de una funda termorretráctil de polietileno.
Se han recubierto los lados y el cuello de los recipientes comerciales de 6 ml de vidrio destinados a contener los conjugados de anticuerpos contra CD3-Ficoeritrina-cianina 5 de Beckman Coulter Immunotech de la gama IOTEST, con ayuda de una funda termorretráctil de polietileno comercializada por la compañía SLEEVER INTERNATIONAL. Ejemplo 3: Fabricación de un recipiente de vidrio recubierto de resina epoxídica
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lleno con una disolución de conjugados de anticuerpos contra CD3-Ficoeritrinacianina 5 en PBS, 2 mg/ml de BSA, azida de sodio al 0,1%.
Se llenaron los recipientes fabricados según el ejemplo 1 con 2 ml de cada disolución de conjugados de anticuerpos contra CD3-Ficoeritrina-cianina 5, en tampón fosfato/albúmina de suero bovino (2 mg/ml)/ nitruro de sodio al 0,1%. Ejemplo 4: Ensayo de conservación de conjugados de anticuerpos contraCD3Ficoeritrina-cianina 5
Para demostrar la eficacia del procedimiento de la invención, los recipientes comerciales y modificados que contienen los anticuerpos contraCD3 conjugados con los fluorocromos PC5 y ECD se sometieron a un ensayo de degradación forzada según el procedimiento descrito en las buenas prácticas de fabricación (Good Manufacturing Practice (GMP)) de la oficina federal estadounidense de fármacos y alimentos..
Se han ensayado diferentes envases: -Recipiente comercial BeckmanCoulter Immunotech de la gama IOTEST -Recipiente comercial BeckmanCoulter Immunotech de la gama Cytostat
-Recipiente comercial BeckmanCoulter Immunotech de la gama IOTEST recubierto por una capa de barniz epoxídico según el procedimiento de pulverización electrostática.
-Recipiente comercial BECTON DICKINSON Pharmingen.
Estos recipientes que contenían los conjugados anticuerpo-pareja se introdujeron en una cámara equipada con tubos fluorescentes y se sometieron a una dosis luminosa total de 1,2.106 lux.h.
La figura 1 muestra la excelente protección del contenido de los recipientes aplicando la invención. En efecto, las parejas introducidas en el recipiente BeckmanCoulter Immunotech de la gama IOTEST recubierto por una capa de barniz epoxídico según el procedimiento de pulverización electrostática presentan una autofluorescencia en FL2 idéntica a la del testigo no irradiado.
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En cambio, el resto de tipos de envasadorecipiente muestran una permeabilidad luminosa que se traduce por una “fuga” en FL2, es decir, un aumento de la autofluorescencia con aparición de células falsamente positivas. Ejemplo 5: Ensayo de conservación de conjugados de anticuerpos
5 contraCD19-ficoeritrina-rojo texas
Se ha operado como en el ejemplo 4, pero con los conjugados de anticuerpos contraCD19-ficoeritrina-rojo texas. Los resultados se dan en la figura 2. El análisis de los resultados conduce a las mismas conclusiones que el
10 ejemplo 4.

Claims (5)

1.
Un envase que comprende un conjunto constituido por un fluorocromo sensible a la luz visible y un recipiente que lo contiene, formando al menos las paredes laterales de dicho recipiente una pantalla eficaz contra las radiaciones del espectro luminoso entre 200 y 900 nm, caracterizado por que el fluorocromo se elige entre isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), PercP y caracterizado por que las paredes laterales del recipiente tienen una estructura que bloquea al menos el 95% de las radiaciones del visible.
2.
Un envase según la reivindicación 1, caracterizado por que el fondo del recipiente forma igualmente una pantalla eficaz contra las radiaciones del espectro visible.
3.
Un envase según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que el efecto pantalla eficaz contra las radiaciones se obtiene por revestimiento mediante pulverización electrostática, por recubrimiento del recipiente con una funda, por irradiación de algunos tipos de vidrio con radiación gamma o por moldeo a vacío.
4.
Un envase según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el fluorocromo forma parte de las parejas ficoeritrina-cianina 7 (PC7), ficoeritrina-cianina 5 (PC5) y ficoeritrina-rojo texas (ECD o PETR).
5.
Un procedimiento de protección de fluorocromos sensibles a la luz visible durante su conservación, en el que se utiliza el envase según una de las reivindicaciones 1 a 4.
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