ES2349498T3 - Métodos y composiciones para modular la fosforilación de la beta-catenina. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un agente contra el cáncer, en el que dicho método comprende las etapas de: (a) poner en contacto un agente con una mezcla de reacción que comprende -catenina, axina y/o caseína cinasa I alfa (CKIa), (b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan un cambio en la fosforilación de -catenina en la serina 45 (S45), y (c) detectar la fosforilación de -catenina en S45, con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicho agente es útil como un agente contra el cáncer.
Description
Campo de la Invención
5
La presente invención se refiere al campo del trata-miento del cáncer. Más específicamente, la presente inven-ción describe moduladores de -catenina, métodos para iden-tificar tales moduladores, así como composiciones y sus usos. 10
Antecedentes de la Invención
Los estudios genéticos en moscas, ranas y mamíferos situaron a la ruta Wnt como un regulador maestro en el de-15 sarrollo de animales, tanto durante la embriogénesis como en el organismo maduro [Wodarz, A. y R. Nusse (1998) Annu Rev Cell Dev Biol 14 : 59-88; Eastman, Q. y R. Grosschedl (1999) Curr Opin Cell Biol 11: 233-240; Peifer, M. y P. Po-lakis (2000) Science 287: 1606-1609; Huelsken, J. y W. 20 Birchmeier (2001) Curr Opin Genet Dev 11: 547-553]. Una diana principal de la ruta Wnt es la catenina citoplásmica la cual, cuando se estabiliza en respuesta a la señaliza-ción de Wnt, entra en el núcleo y sirve como un coactivador de la transcripción inducida por TCF/LEF [Willert, K. y R. 25 Nusse (1998) Curr Opin Genet Dev 8: 95-102; Bienz, M. y H. Clevers (2000) Cell 103: 311-320; Polakis, P. (2000) Genes Dev 14: 1837-1851]. Las células no estimuladas alojan un complejo multiproteico citoplásmico que contiene -catenina, la Ser/Thr cinasa glucógeno sintasa cinasa-3 30 (GSK-3), axina [Zeng, L. et al. (1997) Cell 90: 181-192;
Ikeda, S. et al. (1998) EMBO J 17: 1371-1384; Sakanaka, C. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U. S. A. 95: 3020-3023], o su homólogo axina/conductina [Behrens, J. et al. (1998) Science 280: 596-599; Yamamoto, H. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 2867-2875], y el supresor de tumores de la polipo-5 sis adenomatosa del colon (APC) [Groden, J. et al. (1991) Cell 66: 589-600; Kinzler, K.W. et al, (1991) Science 253: 661-665]. Se piensa que APC y axina desempeñan una función de armazón, facilitando la fosforilación de -catenina por GSK-3 en la región N-terminal [Hart, M.J., R. et al. 10 (1998) Curr Biol 8: 573-581; Hinoi, T. et al. (2000) J Biol Chem 275: 34399-34406]. Este suceso o sucesos de fosforila-ción marcan a la -catenina para la ubiquitinación por la SCF-TrCP E3 y la degradación proteasómica subsiguiente [Aberle, H. et al. (1997) EMBO J 16: 3797-3804; Hart, M. et 15 al. (1999) Curr Biol 9: 207-210; Kitagawa, M. et al. (1999) EMBO J 18: 2401-2410; Latres, E. et al. (1999) Oncogene 18: 849-854; Winston, J.T. et al. (1999) Genes Dev 13: 270-283].
La señalización de Wnt se inicia mediante proteínas 20 de Wnt segregadas, que se unen a miembros de la familia de receptores Frizzled [Wodarz y Nusse (1998) id ibid.]. La unión a Wnt da como resultado la activación de Dishevelled (Dvl-1, 2 y 3 en seres humanos y ratones) [Boutros, M. y M. Mlodzik (1999) Mech Dev 83: 27-37], que, vía su asociación 25 con axina, evita que GSK-3 fosforile -catenina, condu-ciendo su estabilización [Yamamoto, H. et al. (1999) J Biol Chem 274: 10681-10684]. El mecanismo de acción de Dvl in-hibiendo la fosforilación de -catenina por GSK-3 es des-conocido en su mayor parte. Según un modelo actual, implica 30 FRAT (GBP), una proteína de unión a GSK-3 que desplaza la
axina de GSK-3, dando como resultado que no se fosforile la -catenina [Li, L. et al (1999) EMBO J 18: 4233-4240; Farr, G.H. et al. (2000) J Cell Biol 148: 691-702; Bax, B. et al. (2001) Structure (Camb) 9: 1143-1152; Fraser, E. et al. (2002) J Biol Chem 277(3): 2176-85]. Sin embargo, ac-5 tualmente no hay pruebas que relacionen la actividad de Dvl directamente con la disociación de la axina-GSK-3 inducida por FRAT.
La importancia de la fosforilación de -catenina en el control de su degradación se ha deducido principalmente 10 de estudios de mutaciones de -catenina N-terminal en célu-las tumorales [Polakis (2000) id ibid.]. Éstas, al igual que las aberraciones de APC o axina, conducen a una acumu-lación excesiva de -catenina en el núcleo, y a la expre-sión desregulada de sus genes diana, promoviendo la trans-15 formación neoplásica [Morin, P. J. et al. (1997) Science 275: 1787-1790; Rubinfeld, B. et al. (1997) Science 275: 1790-1792; Sparks, A. B. et al. (1998) Cancer Res 58: 1130-1134]. Las mutaciones de -catenina se agrupan alrededor del sitio de unión a SCF-TrCP, y por lo tanto se piensa que 20 comprometen a la ubiquitinación de -catenina y su degrada-ción consiguiente [Wong, C. M. et al. (2001) Cancer 92: 136-145]. Muchas de estas mutaciones estabilizantes se pro-ducen en restos de Ser/Thr a lo largo de un sitio de fosfo-rilación de GSK putativo que moldea el motivo de unión a E3 25 ubiquitina ligasa, enfatizando el papel de GSK-3 en la de-terminación de la estabilidad de -catenina [Polakis (2000) id ibid.]. Incluso, la Serina 45 (S45), el punto de muta-ción tumoral más frecuente individual, no se ajusta a un sitio de GSK-3 [Polakis (2000) id ibid.; Wong et al. 30
(2001) id ibid.]. Esto puede haber contribuido a la noción de que la -catenina es un sustrato inusual de GSK-3 que obvia la necesidad del cebado-fosforilación como un activa-dor para iniciar una cascada de fosforilación mediante GSK-3 [Ding, V. W. et al. (2000) J Biol Chem 275: 32475-32481; 5 Cohen, P. y S. Frame (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2: 769-776; Harwood, A. J. (2001) Cell 105: 821-824]. Contraria-mente a este punto de vista, los resultados de los invento-res muestran que la fosforilación de -catenina en S45 es inducida por un complejo de axina-CKI, independientemente 10 de CSK-3. Además, parece que este suceso molecular consti-tuye una diana importante para la regulación de la ruta de Wnt, puesto que los inventores muestran que Dvl puede fun-cionar como un inhibidor de la fosforilación de -catenina (véanse los Ejemplos). 15
Por tanto, en base a los hallazgos de los inventores, se describen moduladores de la fosforilación de -catenina. Mientras que la -catenina normalmente fosforilada es diri-gida hacia la degradación, en muchos tumores (particular-mente en cáncer colorrectal) la maquinaria de la fosforila-20 ción está mutada, la -catenina no fosforilada se acumula en el núcleo y funciona como un activador transcripcional. Consiguientemente, los moduladores descritos, especialmente los potenciadores de la fosforilación de -catenina, son herramientas importantes para la prevención y control del 25 desarrollo de cáncer, en particular para aquellos tipos de cáncer que resultan de la acumulación y exceso de actividad de -catenina no fosforilada. Sorprendentemente, ciertos tipos de tumores (por ejemplo, melanoma maligno) acumulan -catenina establemente fosforilada. En una descripción 30
adicional, se muestra un método para suprimir la fosforila-ción de -catenina en esta clase específica de tumores, tratando células con un inhibidor como se describe.
La invención describe tanto potenciadores como in-hibidores de la fosforilación de -catenina. De este modo, 5 además, se describe un método para identificar moduladores, es decir, inhibidores y potenciadores, de la fosforilación de -catenina.
Los objetos de la invención serán manifiestos a medi-da que transcurra la descripción. 10
Sumario de la Invención
La presente invención se refiere a moduladores de la fosforilación de -catenina y a su uso en el tratamiento 15 del cáncer.
De este modo, en un primer aspecto, la presente in-vención reivindica un método para identificar un agente contra el cáncer, en el que dicho método comprende las eta-pas de: 20
(a) poner en contacto un agente con una mezcla de reac-ción que comprende -catenina, axina y/o caseína cinasa I alfa (CKIa),
(b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan un 25 cambio en la fosforilación de -catenina en la serina 45 (S45), y
(c) detectar la fosforilación de -catenina en S45, con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicho agente es útil como un agente contra 30
el cáncer.
Como se describe, un modulador es un inhibidor de la fosforilación de -catenina en Serina 45 (S45), selec-cionándose dicho inhibidor de una cualquiera de las proteí-5 nas Dishevelled (DVl), una proteína Wnt, fosfatasa PP2A, e inhibidores de CKI. Se describe además un modulador que es un potenciador de la fosforilación de -catenina en la Se-rina 45 (S45), seleccionándose dicho potenciador de uno cualquiera de los inhibidores de fosfatasa, acetilasas y 10 proteínas que promueven la acetilación de -catenina. Pre-feriblemente, dicho inhibidor de fosfatasa es ácido okadai-co, y dicha proteína que promueve la acetilación de -catenina es FRAT.
La presente descripción muestra un método para iden-15 tificar un agente que modula la fosforilación de -catenina en S45, en el que dicho método comprende las etapas de:
a. proporcionar un agente candidato, poniendo en con-tacto dicho agente con una mezcla de reacción que com-20 prende -catenina y cualquier otro reactivo o reactivos necesarios para la fosforilación de -catenina, en el que dicha mezcla es una mezcla celular o una mezcla li-bre de células,
b. incubar dicha mezcla en condiciones adecuadas, y 25
c. detectar por cualquier medio adecuado si la -catenina en S45 se ha fosforilado o no, en el que dicho medio adecuado de detección puede ser uno cualquiera de una reacción con un anticuerpo específico, cartografia-do fosfopeptídico o espectrometría de masas, 30
con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicha sustancia es un potenciador de la fosforilación de -catenina, y la fosforilación reduci-da de -catenina en S45 indica que dicha sustancia es un inhibidor de la fosforilación de -catenina. 5
Se describe además un modulador de la fosforilación de -catenina en la Serina 45 (S45) que se ha identificado mediante el método de identificación descrito en la inven-ción. Dicho modulador puede ser un inhibidor o un potencia-10 dor de la fosforilación de -catenina en S45.
La presente descripción muestra un método para poten-ciar la fosforilación de -catenina en una célula tratando la célula con un potenciador como se define mediante la in-vención. 15
En un aspecto adicional, la presente invención se re-fiere a una composición farmacéutica, preferiblemente para el tratamiento de cáncer, que comprende CKI-7.
En aún una realización adicional, la presente inven-ción se refiere al uso de CKI-7 para la fabricación de un 20 medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que prefe-riblemente la -catenina de dicho cáncer está estabilizada y su fosforilación no está impedida.
En aún una realización adicional, la presente inven-ción comprende el uso de CKI-7 para el tratamiento de 25 cáncer, particularmente melanoma maligno.
Se describe además el uso del modulador de la fosfo-rilación de -catenina para el tratamiento de células can-cerosas, en el que la -catenina está estabilizada y su fosforilación está impedida, como en el adenoma o carcinoma 30
de colon, por ejemplo, y dicho modulador es un potenciador de la fosforilación de -catenina. Como alternativa, el uso del modulador de la fosforilación de -catenina, como se define por la invención, es para el tratamiento de células cancerosas en el que la -catenina está estabilizada y su 5 fosforilación no está impedida, como en el melanoma, por ejemplo, y dicho modulador es un inhibidor de la fosforila-ción de -catenina. En una segunda realización, el modula-dor de la fosforilación de -catenina, como se define por la invención, se usa en la preparación de una composición 10 farmacéutica para el tratamiento de cáncer, es decir, CKI-7.
En una descripción adicional, el modulador de la fos-forilación de -catenina se usará en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer. 15
Otros objetos de la presente invención son el uso de ARNsi de CKI- para la fabricación de un medicamento iden-tificado para el tratamiento de cáncer, y una composición farmacéutica que comprende un ARNsi de CKI-.
En una realización adicional, el modulador de la fos-20 forilación de -catenina se va a usar en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de células cancerosas. Se debería observar que, en aquellos tipos de cáncer en los que la fosforilación de catenina está impedi-da, el modulador de elección debe de ser un potenciador de 25 la fosforilación de catenina. Como alternativa, en aquellos tipos de cáncer en los que la fosforilación de -catenina no está impedida, el modulador de elección debe de ser un inhibidor de la fosforilación de -catenina.
30
Breve Descripción de las Figuras
Figura 1 a-c: la axina induce la fosforilación de -catenina exclusivamente en S45, aunque la degradación proteasómica requiere además la fosforilación mediada 5 por GSK en T41, S37 y S33.
Fig. 1a: estabilidad de -catenina [wt o -catenina mu-tada en el N-terminal (DP)] en respuesta a la transfec-ción de axina y GSK-3. En la línea 7 se incluyó un 10 fragmento Flag-F-caja--TrCP negativo dominante (WD). Como referencia de la expresión, en todas las transfec-ciones se incluyó un vector de expresión de GFP.
Fig. 1B: análisis de la fosforilación de -catenina con 15 anticuerpos anti-fosfopéptidos en células inhibidas me-diante proteasomas.
Fig. 1c: análisis de la fosforilación de -catenina me-diante espectrometría de masas (MS). Las bandas de 20 Flag--catenina inmunopurificadas se digirieron con Asp-N endoproteinasa, y los péptidos N-terminales re-sultantes, incluyendo Asp17-Leu31 y Asp32-Glu55 (mos-trados en la parte superior), se analizaron mediante MS de nanoelectropulverización. Las relaciones m/z mostra-25 das (6 paneles superiores) corresponden a los iones triplemente cargados [M+3H]3+ del péptido Asp32-Glu55, y está marcado por asteriscos (incluyendo todas sus va-riantes isotópicas). Se presentan los espectros de péptidos que contienen 1 (+1P) y 4 (+4P) grupos fosfato 30 de -catenina sola(paneles 1, 2), -catenina coexpresa-
da con axina (paneles 3, 4), y axina más GSK-3 (pane-les 5, 6). Los iones [M+3H]3+ procedentes de los pépti-dos marcados con barras (gris y negro) se seleccionaron para la fragmentación. Los espectros en los paneles in-feriores (7, 8) corresponden a fragmentos derivados de 5 MS/MS del péptido de la barra gris (procedente del pa-nel 3) y del péptido de la barra negra (procedente del panel 6). El péptido Asp32-Glu55 se fragmentó mediante MS/MS en mitades, conteniendo una mitad C-terminal Ser45, y conteniendo una mitad N-terminal 10 Ser33/Ser37/Thr41. El fragmento C-terminal de la barra gris estaba en su mayor parte fosforilado, mientras que el fragmento N-terminal estaba en su mayor parte no fosforilado (panel 7). La relación de fragmentos no fosforilados a fosforilados (+1P) está indicada median-15 te flechas torcidas. El fragmento N-terminal de la ba-rra negra (panel 8) está en su mayor parte triplemente fosforilado (+3P). Su fragmento C-terminal está mono-fosforilado (no mostrado), de forma similar al de la barra gris. El análisis de MS/MS del péptido Asp17-20 Leu31 (procedente de +1P del MS) revela una fosforila-ción minoritaria aunque significativa de Ser29 (no mos-trada).
Abreviaturas: frag., fragmentos. 25
Figura 2a-b: mutaciones en cuatro sitios de fosforila-ción N-terminales de -catenina acortan la cascada de fosforilación, conduciendo a la estabilización de -catenina. 30
Fig. 2a: -catenina de tipo salvaje (wt) y mutada pro-
cedente de células tratadas con MG-132 se detectó con anticuerpos anti-Myc o anti-fosfo--catenina.
Fig. 2b: análisis de estabilidad de mutantes de -catenina en el sitio de fosforilación en células no tratadas con MG-132. 5
Figura 3a-c: la fosforilación en S45 mediada por axina es independiente de GSK-3.
Fig. 3a: la fosforilación en S45 no se efectúa mediante LiCl. Análisis de catenina wt o T41A procedente de células tratadas con MG-132, con o sin LiCl. No se de-10 tectó ninguna señal de fosforilación en 833/87 en el mutante T41A (véase la Fig. 2a).
Fig. 3b: la L525P-axina no se une a GSK3. Inmunopreci-pitación anti-Flag de células transfectadas con Flag-GSK-3 y Myc-axina de tipo salvaje (wt) o L525P. 15
Fig. 3c: L525P-axina induce la fosforilación en S45 y mantiene una cascada de degradación de la fosforilación en presencia de GSK-3 exógena. Todas las células se transfectaron con Myc--catenina y los vectores de ex-presión indicados. 20
Abreviaturas: Tot. lys., lisado total.
Figura 4: la fosforilación sustituta en S45 indepen-diente de axina promueve la cascada de fosforilación 25 mediante GSK-3, dando como resultado la degradación de -catenina. Todas las células se transfectaron con el mutante de -catenina 45PKA y los vectores de expresión indicados. Se detectaron HA-GSK-3 (W1) o Flag-R96A-GSK-3 (R96A) usando anticuerpos anti-GSK-3 (la posi-30
ción de GSK-3 varía según su marcador).
Figura 5a-e: identificación de la -catenina S45 cina-sa.
Fig. 5a: la axina inmunopurificada y CKI recombinante (aa1-318) fosforilan -catenina in vitro en S45, crean-5 do un sitio de cebado para la fosforilación secuencial en S33-37 mediante GSK-3 recombinante. La Flag--catenina se inmunoprecipitó a partir de células 293 transfectadas y se sometió a un ensayo de cinasa in vi-tro usando la cinasa indicada o Flag-axina inmunopuri-10 ficada procedente de transfectantes 293, con o sin ATP (30 M), y se analizó mediante transferencia Western, usando anticuerpos anti-fosfo -catenina.
Fig. 5b: CKI dominante negativa inhibe la fosforilación en S45 inducida por axina. Células 293 se transfectaron 15 con Myc--catenina sola (línea 1), con axina (líneas 2-5) y CKI de tipo salvaje (wt) (línea 3) o dominante negativa (D-N, línea 4; K-R, línea 5). La flecha de CKI inferior apunta a la hCKI endógena, mientras que la flecha superior apunta a las proteínas xCKI exógenas 20 detectadas mediante anticuerpo monoclonal anti-CKI.
Fig. 5c: CKI-7 inhibe la fosforilación en S45 de -catenina de tipo salvaje (wt) inducida por axina, pero no la fosforilación constitutiva de 45PKA.
Fig. 5d: efectos de los inhibidores de cinasa específi-25 cos sobre la fosforilación de -catenina endógena en S41, 45 y S33 en células HeLa. CKI-7 se usó a 100 M, H89 a 5 M, y LiCl a 40 mM. La -catenina se detectó con anticuerpo anti--catenina, o anticuerpos anti-
fosfo--catenina.
Fig. 5e: contribución comparable de CKI alfa y épsilon a la fosforilación de -catenina en células RKO.
Abreviaturas: inhib., inhibidor. 5
Figura 6a-d: la ruta de Wnt selecciona como diana la fosforilación cebadora de -catenina en S45 mediada por axina.
Fig. 6a: Wnt3A inhibe la fosforilación en S45. Células 10 L de ratón, células de hepatoma SNU449 [Satoh et a1.(2000) Nat Genet 24(3):245-50], células HeLa y célu-las T Jurkat transfectadas con -catenina se incubaron (5 h) con medio acondicionado de células L de tipo sal-vaje (wt) o que segregan Wnt3A [Shibamoto et al. (1998) 15 Genes Cells 3: 659-670]. A los cultivos indicados se les añadió MG-132 o ácido okadaico (OKA, 1 M). La -catenina endógena (células HeLa, L y SNU449) y exógena (Jurkat) se detectó con anticuerpo anti--catenina, o anticuerpos anti-fosfo--catenina. Los números bajo las 20 diferentes líneas son cifras de densitometría relati-vas, que se prefieren frente a la intensidad de señal de cultivos no tratados.
Fig. 6b: Dvl-1 inhibe la fosforilación en S45 mediada por axina. Espectro de masas del péptido Asp32-Glu55 25 con un grupo fosfato (+1P): procedente de -catenina coexpresada con L525P-axina (m-axina), en comparación con el de -catenina coexpresada con L525P-axina y Dvl-1.
Fig. 6c: la sobreexpresión de DVl-1 da como resultado 30
la inhibición de la fosforilación en S45 y la estabili-zación de -catenina. La -catenina de transfectantes 293 se detectó usando anticuerpos anti-Myc o anti-fosfo--catenina.
Fig. 6d: Dvl-1 no tiene ningún efecto sobre la cascada 5 de GSK3 iniciada por la fosforilación en S45 indepen-diente de axina: análisis de células transfectadas con 45PKA.
Figura 7a-c: el tratamiento con ácido okadaico induce la fosforilación en Ser45 y Ser33 y la actividad de S45 10 cinasa.
Fig. 7a: se incubaron células HeLa con MG132, con o sin ácido okadaico (1 M durante 3 h). Los lisados celula-res se analizaron mediante transferencia Western con p45 y p33. 15
Fig. 7b: células SNU449 [Satoh et al. (2000) id ibid.] se trataron con ácido okadaico (1 M durante 1 ó 3 h), y sus lisados se evaluaron para determinar la fosfori-lación en S45 mediante transferencia Western.
Fig. 7c: el ácido okadaico induce la fosforilación y 20 degradación de -catenina en la estirpe celular mutada de APC SW480.
Figura 8a-e: modelo putativo que representa la cascada de fosforilación/degradación de -catenina.
Fig. 8a: la axina recluta CKI para fosforilar -25 catenina en S45.
Fig. 8b: la fosforilación en S45 ceba a la -catenina para la cascada de fosforilación mediante GSK-3 subsi-guiente, alcanzando finalmente a los sitios S33/37.
Fig. 3c: igual que 8b. 30
Fig. 8d: la fosforilación en S33/37 crea un sitio de acoplamiento para la -TrCP/E3RS que promueve la ubi-quitinación y degradación de -catenina.
Fig. 8e: la señalización de Wnt, posiblemente a través de Dvl y CKI, regula la fosforilación en S45. 5
Figura 9: FRAT1 estabiliza -catenina fosforilada.
Fig. 9a: transferencia Western que muestra los niveles de fosfo--catenina (pCat), -catenina (Cat) y las proteínas reguladoras, según se indican, en células 293 transfectadas. Frat1 estabiliza fosfo--catenina, que 10 es aumentada además por una baja expresión de Dvl. La expresión de Dvl se varió mediante un incremento conse-cutivo de dos veces del plásmido transfectado (0,25-4 g).
Fig. 9b: transferencia Western que muestra los niveles 15 de expresión de fosfo--catenina (pCat), -catenina (Cat) y las proteínas reguladoras indicadas. DvlPDZ es incapaz de cooperar con Frat1 en la estabilización de fosfo--catenina, e incluso suprime la fosforilación de -catenina en S45, induciendo así la estabilización 20 de -catenina no fosforilada.
Fig. 9c: Frat1 estabiliza fosfo--catenina transcrip-cionalmente activa en células 293. Gráfica que muestra la actividad transcripcional de -catenina fosforilada, a través de su activación del informador de luciferasa 25 TOP-FLASH [Korinek et al. (1997) Science, 275: 1752-3], según se expresa en Unidades de Luciferasa Relativas (RLU), en presencia o ausencia de Frat1. El informador del sitio mutante de TCF (FOPFLASH) se usó para contro-lar el efecto, independiente de TCF, de la transfección 30
con Frat1/axina/GSK.
Fig. 9d: transferencia Western que muestra los niveles de -catenina endógena y transfectada, así como -catenina fosforilada, en presencia de p300/CBP, E1A y Frat. La expresión de E1A varió un incremento consecu-5 tivo de dos veces del plásmido transfectado (3-6 g). p300/CBP y E1A estabiliza fosfo--catenina de forma si-milar a Frat1. La línea izquierda se transfectó sin GSK3.
Fig. 9e: la fosfo--catenina estabilizada por p300/CBP 10 y Frat1 es acetilada en los restos de lisina. Se trans-fectaron células 293 con Myc--catenina y se analizaron mediante inmunoprecipitación de Myc--catenina y trans-ferencia Western, usando anticuerpos anti-acetil-lisina o anti-p33, 37, 41 (Cell Signaling Inc). MG = tratado 15 con el inhibidor de proteasoma MG132-a. NT = sin ningún plásmido transfectado adicional (excepto -catenina, GSK3 y axina).
Figura 10: la fosforilación de -catenina es esencial para la activación transcripcional de MITF-M, un gen de 20 supervivencia de melanoma, y para el crecimiento de me-lanomas en cultivo tisular.
Fig. 10a: gráfica que muestra la actividad transcrip-cional de -catenina sobre el plásmido informador de luciferasa pGL3-MITF/M. La actividad transcripcional 25 inducida por Frat1 requiere la fosforilación de -catenina. La actividad transcripcional de MITF-M es ex-presada en Unidades de Luciferasa Relativas (RLU). Se usó un informador del sitio mutante de TCF (pGL3-MITF/M195.3) para controlar el efecto, independiente de 30
TCF, de la transfección con Frat1. Los plásmidos de CKI dominantes negativos K/R y D/N son explicados en la Fig. 5b.
Fig. 10b: la fosforilación de -catenina es exclusiva para el derivado metastásico B1 del tumor de melanoma 5 A1. Células LB33A1 y LB33B1 se trataron con o sin 20 M de MG132 durante 4 horas, se cosecharon, y sus lisados se analizaron mediante transferencia Western con los anticuerpos indicados.
Fig. 10c: la actividad transcripcional de MITF requiere 10 la fosforilación de -catenina. Las dos estirpes celu-lares de melanoma relacionadas LB33A1 y LB33B1 se transfectaron con el plásmido del informador de lucife-rasa pGL3-MITF/M [Takeda et al. (2000) J Biol Chem 275: 14013-6] solo o junto con el plásmido de expresión 15 DvlPDZ. Veinticuatro horas después de la transfección, una muestra de células se trató con 20 mM de LiCl du-rante 24 horas, según se indica. Las células se cose-charon y su actividad de luciferasa del lisado se de-terminó usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa de 20 Promega. La actividad transcripcional de MITF-M se ex-presa en Unidades de Luciferasa Relativas (RLU). Para controlar la transcripción independiente de TCF, se usó un informador del sitio mutante de TCF (pGL3-MITF/M195.3). 25
Fig. 10d: el bloqueo de la fosforilación de -catenina en una estirpe celular de melanoma afecta al crecimien-to celular. Células LB33B1 se trataron con concentra-ciones crecientes del inhibidor de la fosforilación en S45 CKI7, y las células vivas se contaron 24 horas des-30 pués del tratamiento.
Abreviaturas: U.T., no tratada o no transfectada; Re-al. ce. numb. 24 hrs. po. treat., número relativo de célu-las 24 horas después del tratamiento.
5
Descripción Detallada de la Invención
En esta Solicitud se usan las siguientes abreviatu-ras:
10
- APC: poliposis adenomatosa del colon
- CKI: caseína cinasa I
- DP: dominante positivo
- Dvl: Dishevelled
- GFP: proteína fluorescente verde 15
- GSK3 (GSK): glucógeno sintasa cinasa 3
- MS: espectrometría de masas
- OKA: ácido okadaico
- PKA: proteína cinasa A
- S45: serina 45 de -catenina. 20
Los estudios de los inventores se dirigieron a resol-ver ciertas cuestiones claves en la regulación de la ruta de Wnt--catenina, a saber, qué suceso o sucesos molecula-res disparan la cascada de fosforilación-degradación de -25 catenina, y cuales de ellos son una diana para la regula-ción de Wnt.
La presente descripción muestra la modulación de la fosforilación de -catenina. Específicamente, comprende mo-duladores de la fosforilación en la serina 45 (S45) de -30 catenina, y métodos para identificar tales moduladores, así
como composiciones y sus usos.
En un aspecto, la presente invención comprende el uso de un modulador de la fosforilación en la serina 45 (S45) de -catenina, en el que dicho modulador es un inhibidor que es CKI-7. 5
Se entenderá que el término modulador se usa en toda esta memoria descriptiva como cualquier sustancia, ya sea un fármaco, un compuesto, una proteína o un péptido, capaz de potenciar o disminuir la fosforilación de -catenina. El modulador es capaz de interaccionar directa o indirectamen-10 te con -catenina, de tal forma que puede potenciar o in-hibir su fosforilación. Como alternativa, el modulador pue-de afectar, es decir, inducir o reprimir la maquinaria de la fosforilación en S45 (o la actividad de S45 cinasa).
Además, otro efecto del modulador puede ser desenca-15 denar un cambio en la localización intracelular de -catenina, y de esa forma afectar a su fosforilación. Nor-malmente, la -catenina se encuentra en dos conjuntos in-tracelulares: unida a E-cadherina en la membrana celular, y en un complejo con otras proteínas, incluyendo APC y axina, 20 en el citoplasma. Con la activación, la -catenina se transloca al núcleo. De este modo, la fosforilación o des-fosforilación de -catenina puede afectar a su localización intracelular y provocar su translocación entre estos com-partimientos celulares diferentes. 25
Dicho inhibidor, según se describe, se selecciona de una cualquiera de la proteína Dishevelled (Dvl), una pro-teína Wnt, y la fosfatasa PP2A.
Contrariamente al conocimiento general en el campo, los experimentos de los inventores indicaron sorprendente-30 mente que la fosforilación de -catenina en S45, mediada
por axina/CKI, en lugar de la fosforilación de -catenina mediada por GSK3, es el suceso molecular regulado principal de la ruta de señalización de Wnt. Liu et al. publicaron resultados señalando a un mecanismo de cinasa dual para la fosforilación-degradación de -catenina [Liu, C. et al. 5 (2002) Cell 108: 837-847]. Sin embargo, los resultados de Liu se ajustan a la noción general de que la señalización de Wnt regula la estabilización de -catenina a través de GSK3. Esto contrasta enormemente con los resultados presen-tados aquí, en los que la señalización de Wnt3A y la sobre-10 expresión de Dvl regulan la fosforilación en S45, indepen-dientemente de GSK3. Para observar el grado completo de fosforilación en S45, la -catenina se ha de estabilizar. Esto se puede lograr mediante inhibición proteasómica, o usando una estirpe celular mutada en los sitios de fosfori-15 lación aguas arriba de S45 (véase la Fig. 6a). Bajo estas condiciones, las cuatro estirpes celulares ensayadas (in-cluyendo una estirpe celular derivada de carcinoma de colon que posee una -catenina mutada en S37) respondieron a Wnt3A disminuyendo toda la cascada de fosforilación desde 20 S45 en adelante (Fig. 6a). De este modo, los resultados de los inventores muestran que la fosforilación en S45 es la etapa principal para la cascada de fosforilación de -catenina, y está regulada por la señalización de Wnt vía axina e independiente de GSK3. 25
Como se demuestra en el Ejemplo 7 y en la Fig. 10d, la abolición de la fosforilación de -catenina con CKI7, un inhibidor de CKI, en células de melanoma LB33B1 afecta a su proliferación.
A menudo, la -catenina hiperfosforilada es detectada 30
en ciertos tipos de tumores, tales como melanomas malignos humanos, en los que se acumula especialmente en el núcleo [Kielhorn, E. et al. (2003) Int. J. Cancer 103 (5): 652-6]. Parece que la -catenina fosforilada estabilizada contribu-ye a la inducción de un conjunto único de genes diana de 5 TCF, distintos de los genes regulados por TCF conocidos (que son dianas de la -catenina no fosforilada). Un ejem-plo de este conjunto diferente de genes puede ser MITF-M, un factor de transcripción que es necesario para la super-vivencia de células de melanoma [Widlund, H. R. et al. 10 (2002) J. Cell Biol. 158 (6): 1079-87]. Por tanto, la -catenina fosforilada también puede desempeñar un papel im-portante en el proceso de tumorigénesis, posiblemente como un activador transcripcional de oncogenes potenciales. De este modo, la inhibición de la fosforilación de -catenina 15 en S45 sería el medio de reprimir factores críticos de tu-morigénesis, tales como MITF-M.
PP2A estuvo implicada antes en la señalización de Wnt, pero su sitio diana y su efecto (es decir, S45) fueron desconocidos. Inhibiendo la fosfatasa PP2A, el ácido oka-20 daico o un agente similar puede ser útil en la inducción de la actividad de fosforilación por axina-CKI, dando como re-sultado una degradación potenciada de -catenina en cáncer de colon mutado por APC, y posiblemente en otros tumores. Esto es debido a que la sobreexpresión de axina en células 25 mutadas por APC o axina puede conducir a la degradación de -catenina [Kishida S. et al. (1998) J Biol Chem 273 (18): 10823-6] y a la apoptosis tumoral [Satoh S. et al. (2000) id ibid.]. Aumentando la actividad de axina endógena, el ácido okadaico induciría la apoptosis del tumor. Por lo 30 tanto, los compuestos que faciliten la fosforilación en S45
serán útiles como agentes contra el cáncer.
Se describe además que dicho potenciador de la fosfo-rilación de -catenina es uno cualquiera de FEAT, p300/CBP, E1A, o cualquier otra proteína acetilasa. El potenciador de la fosforilación de -catenina puede ser cualquier proteí-5 na, o factor, como por ejemplo un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), que promueve la acetilación de -catenina. Preferiblemente, dicho potenciador es FRAT, in-cluyendo cualquiera de sus isoformas FRAT1, FRAT2 o FRAT3 [Chai, J. H. et al. (2001) Mamm. Genome 12 (11): 813-21; 10 Saitoh y Katoh (2001) Int. J. Oncol. 19 (2): 311-5; Jonk-ers, J. et al. (1997) EMBO J. 16 (3): 441-50].
En el Ejemplo 6, los inventores mostraron que la on-coproteína Frat1 [Jonkers, J. et al. (1997) id ibid.], que se piensa habitualmente que funciona como un inhibidor de 15 la fosforilación por GSK3 [Li, L. et al. (1999) EMBO J. 18 (15): 4233-40; Salic, A. et al. (2000) Mol. Cell 5 (3): 523-32], es de hecho un potenciador de la fosforilación de -catenina. Además, como se muestra en la Figura 9d, los inventores identificaron otros dos potenciadores de la fos-20 forilación de -catenina, el adenovirus E1A y p300/CBP [Go-odman y Smolik (2000) Genes Dev. 14 (13): 1553-77], los cuales cuando se sobreexpresan en células 293 inducen la acumulación de -catenina hiperfosforilada. Los resultados de los inventores sugieren que la -catenina fosforilada 25 sufre acetilación de sus restos de Lys. Esta -catenina fosforilada y acetilada es resistente a la degradación, y puede funcionar como un activador transcripcional.
La presente descripción muestra además un método para identificar un agente que modula la fosforilación en S45 de 30
-catenina, en el que dicho método comprende las etapas de:
a. proporcionar un agente candidato, poner en contacto dicho agente con una mezcla de reacción que comprende -catenina y cualquier otro reactivo o reactivos nece-5 sarios para la fosforilación de -catenina, en el que dicha mezcla es una mezcla celular o una mezcla libre de células,
b. incubar dicha mezcla en condiciones adecuadas, y 10
c. detectar por medios adecuados si S45 de -catenina se ha fosforilado o no,
con lo que la fosforilación potenciada de S45 de -catenina indica que dicha sustancia es un potenciador 15 de la fosforilación de -catenina, y la fosforilación reducida de S45 de -catenina indica que dicha sustan-cia es un inhibidor de la fosforilación de -catenina.
El método se puede llevar a cabo en una mezcla de 20 células o en una mezcla libre de células, que comprende -catenina, axina, opcionalmente CKI y GSK3, y cualquier otro reactivo necesario para la fosforilación de -catenina. La fosforilación en S45 de -catenina se puede observar por cualquier medio adecuado para la detección de 25 la fosforilación de proteínas. Preferiblemente, la fosfori-lación en S45 de -catenina se detecta mediante un anti-cuerpo específico anti-fosfopéptido, mediante cartografiado de fosfopéptidos, o espectrometría de masas.
Como se demuestra en los Ejemplos, los genes regula-30
dos por TCF se pueden usar como un punto final para el método de la invención. De este modo, los potenciadores de la fosforilación de -catenina deben inducir la expresión de un informador de TCF con la transfección de dicho infor-mador en combinación con el potenciador que se esté ensa-5 yando, en las células de interés. Otro gen informador a usar como punto final para el método de la invención es el plásmido informador del MITF.
Los potenciadores de la fosforilación de -catenina deben inducir la expresión de un plásmido informador de 10 MITF, mientras que los inhibidores de la fosforilación de -catenina deben de suprimir su expresión.
Otro punto final a usar en el método de la invención es la velocidad de proliferación de ciertas estirpes celu-lares en presencia de -catenina fosforilada o no fosfori-15 lada. Como se muestra en el Ejemplo 7, células de melanoma B1 ralentizaron su proliferación en presencia del inhibidor específico de CKI. De este modo, los factores que son capa-ces de ralentizar el crecimiento de células de melanoma B1, por ejemplo, se deben de identificar como inhibidores de la 20 fosforilación de -catenina.
Como se demuestra en los Ejemplos 1, 2 y 3, un papel principal de la axina en la ruta de Wnt es proporcionar la actividad de cinasa que inicia la cascada de fosforilación de -catenina en S45. Este proceso es mediado por las iso-25 formas , o de CKI, puesto que se detectaron todas en asociación con axina mediante LC/MS. Incluso, en condicio-nes fisiológicas específicas, una isoforma de CKI particu-lar puede funcionar con axina. La asociación de axina con una única isoforma de CKI puede requerir una molécula in-30 termedia. La fosforilación en S45 por el complejo de axina-
CKI es necesaria y suficiente para movilizar una cascada mediada por GSK3.
Por lo tanto, en el método de identificación de un modulador de -catenina, la mezcla de reacción puede conte-ner preferiblemente axina y/o CKI. Específicamente, la axi-5 na se puede inmunopurificar a partir de células transfecta-das.
Sin estar atados por la teoría, se puede proponer un modelo para la cascada de fosforilación/degradación de -catenina, como se representa en la Fig. 8. En este modelo, 10 la axina se une a -catenina y recluta a CKI para fosfori-lar S45. La fosforilación en S45 ceba a la -catenina para la cascada de fosforilación mediante GSK-3 subsiguiente, alcanzando finalmente a los sitios S33/37. La fosforilación en S33/37 crea un sitio de acoplamiento para el complejo -15 TrCP/E3RS, que promueve la ubiquitinación y degradación de -catenina. La señalización de Wnt, posiblemente a través de Dvl y CKI, regula la fosforilación en S45, eliminando la axina (por ejemplo, induciendo su degradación), o detenien-do el reclutamiento de CKI para S45. Como alternativa, la 20 señalización de Wnt, posiblemente a través de PP2A, induce la desfosforilación de -catenina en S45.
Por tanto, la descripción muestra un modulador de la fosforilación en la Serina 45 (S45) de -catenina que es identificado por el método de identificación descrito en la 25 invención. Dicho modulador puede ser un inhibidor o un po-tenciador de la fosforilación en S45 de -catenina.
El modulador identificado por el método de la inven-ción se puede usar para potenciar o para inhibir la fosfo-rilación de -catenina, preferiblemente en el resto S45 de 30
-catenina.
Se describe adicionalmente un método para potenciar la fosforilación de -catenina en una célula, tratando la célula con un modulador de la fosforilación de -catenina, en el que dicho modulador es un potenciador de la fosfori-5 lación de -catenina, tal como un inhibidor de fosfatasa. Dicho potenciador puede ser ácido okadaico. Como alternati-va, dicho potenciador puede ser una proteína que promueve la acetilación de -catenina.
Como se demuestra en el Ejemplo 6, las proteínas como 10 E1A y FRAT1 pueden inducir la estabilización de -catenina fosforilada, probablemente mediante acetilación proteica. De este modo, FRAT1 es otro potenciador preferido de la fosforilación de -catenina.
En un aspecto adicional, la presente invención pro-15 porciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, que comprende un modulador de -catenina como se define en la invención, que es CKI-7. En tanto que la -catenina esté estabilizada, dicho modulador puede ser un potenciador o un inhibidor de la fosforilación de -20 catenina.
Se entenderá que por catenina estabilizada se quiere decir tal forma de -catenina que no sufre degradación.
Se describe que dicha composición farmacéutica es pa-ra uso en el tratamiento de células cancerosas de un orga-25 nismo, particularmente un ser humano, en el que la -catenina está estabilizada. En ciertos casos en los que la -catenina está estabilizada, y su ruta de fosforilación está alterada, como por ejemplo en células cancerosas pro-cedentes de carcinoma o adenoma colorrectal, la composición 30
farmacéutica preferida a usar debe comprender como agente activo un potenciador de la fosforilación de -catenina.
Como alternativa, cuando la -catenina está estabili-zada, pero su ruta de fosforilación no está alterada, como por ejemplo en células cancerosas procedentes de melanoma 5 maligno, la composición farmacéutica a usar debe comprender como agente activo un inhibidor de la fosforilación de -catenina.
La composición farmacéutica de la invención puede contener además agentes activos adicionales y/o aditivos, 10 diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
La preparación de composiciones farmacéuticas es bien conocida en la técnica y se ha descrito en muchos artículos y libros de texto; véase, por ejemplo, Gennaro A. R. ed. (1990) Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing 15 Company, Easton, Pennsylvania, y especialmente las páginas 1521-1712 allí.
Se han encontrado mutaciones en -catenina que afec-tan a su fosforilación en una amplia variedad de cánceres humanos. La inmensa mayoría de tumores colorrectales con-20 tienen mutaciones en el gen APC, cuyo producto se ha demos-trado que está implicado en la fosforilación de -catenina. Los tumores colorrectales que carecen de una mutación de APC tienen una gran probabilidad de tener una mutación en el gen de -catenina, que afecta a los sitios de fosforila-25 ción. De forma interesante, la mayoría de las mutaciones de -catenina encontradas en cánceres humanos están localiza-das entre la serina 29 (S29) y lisina 49 (K49), una región rica en sitios de fosforilación y que también está implica-da en la degradación de -catenina. Además de los tumores 30
colorrectales, también se han encontrado tales mutaciones en tumores tales como tumor desmoide (también conocido como fibromatosis agresiva), endometrial, gástrico, hepatocelu-lar, hepatoblastoma, tumor de Wilm (cáncer de riñón pediá-trico), meduloblastoma; melanoma, ovárico, pancreático, po-5 limatricoma, cáncer de próstata, tumores de tiroides y de endometrio uterino [Polakis (2000) id ibid.]. De este modo, la estabilización de -catenina puede promover el cáncer en muchos tipos de tejidos.
La fuerte correlación entre una ruta de fosforilación 10 de -catenina defectuosa y la formación (y progresión) de tumores ha hecho a esta ruta un foco para la terapia. La restauración de la fosforilación de -catenina debería de detener el proceso canceroso. Hay indicaciones de que la desestabilización inducida de -catenina dispara la muerte 15 de células cancerosas [Verma et al. (2003) Clin. Cancer Re-s. 9:1291-300; Kim et al. (2002) Mol Cancer Ther. 1: 1355-9]. La expresión de axina conduce concomitantemente a la destrucción de -catenina y a la apoptosis en células tumo-rales [Satoh et al. (2000) id ibid]. Además, los resultados 20 de los inventores muestran que un efecto principal de la axina es inducir la fosforilación en S45 y subsiguientemen-te la degradación de -catenina. De este modo, se corrobora la idea de que la apoptosis tumoral es una consecuencia del efecto de la fosforilación de axina. 25
Por tanto, los resultados presentados aquí, que mues-tran que la fosforilación en S45 es la etapa cebadora para la fosforilación de -catenina, y que la modulación de esta etapa puede afectar a la fosforilación de -catenina, son muy aplicables para la terapia contra el cáncer. Como se 30
muestra en la Fig. 7, los inhibidores de fosfatasa, en par-ticular ácido okadaico, son potenciadores importantes de la fosforilación de -catenina.
Sin embargo, en células cancerosas en las que se en-cuentra -catenina fosforilada, es importante utilizar un 5 modulador diferente. En este caso, el modulador debería de ser un inhibidor de la fosforilación de -catenina, como por ejemplo CKI-7.
Así, en otro aspecto, la presente invención comprende el uso de CKI-7 para el tratamiento de cáncer o células 10 cancerosas.
El uso del modulador de la invención es para el tra-tamiento de células cancerosas en las que la fosforilación de -catenina no está impedida. En dicho cáncer (o células cancerosas), dicho modulador es un inhibidor de la fosfori-15 lación de -catenina, que es CKI-7.
El modulador de la fosforilación de -catenina, como se describe, se usará en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer. Como alternati-va, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento 20 de células cancerosas.
Como se demuestra mediante los siguientes ejemplos, la regulación fina de la fosforilación de -catenina es crítica para la homeostasia celular y difiere en diferentes tipos de células. En linajes hematopoyéticos, por ejemplo, 25 Wnt puede inducir la proliferación de células madre hemato-poyéticas multipotentes a través de la estabilización de -catenina [X. He (2003) Juan March meeting review, Dev. Cell. (en prensa)]. Cuando la -catenina estabilizada está presente en las células (es decir, cuando está presente en 30
niveles elevados en su forma no degradable) – y dichas células son células cancerosas -, hay dos rutas a seguir. La ruta A, si dicha -catenina no está fosforilada, como en adenomas o carcinomas de colon por ejemplo, es deseable pa-ra potenciar su fosforilación a fin de inducir su degrada-5 ción. De este modo, se debe de usar un potenciador de la invención para tratar dicho cáncer, o células cancerosas. La ruta B, cuando dicha -catenina está fosforilada, como por ejemplo en melanomas malignos, es deseable para inhibir su fosforilación a fin de bloquear la activación transcrip-10 cional de dianas aguas abajo que son oncogenes potenciales. De este modo, se debe de usar un inhibidor de la invención, que es CKI-7, para tratar dicho cáncer, o células cancero-sas.
Finalmente, la descripción pretende mostrar un método 15 para el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del modulador como se describe, que debe de ser un potenciador o un inhibidor, según el tipo específico de cáncer, como se especifica antes. 20
Se debería observar que, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones anejas, las formas singulares “un” y “el” incluyen referentes plurales excepto que el contenido dicte claramente otra cosa.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivin-25 dicaciones que siguen, excepto que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, im-plica la inclusión de una entidad completa señalada o etapa o grupos de entidades completas o etapas, pero no la exclu-30 sión de cualquier otra entidad completa o etapa o grupo de
entidades completas o etapas.
Los siguientes Ejemplos 1-4 y 7 son representativos de técnicas empleadas por los inventores para llevar a cabo aspectos de la presente invención. Se debería apreciar que aunque estas técnicas son ejemplares de realizaciones pre-5 feridas para la práctica de la invención, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, recono-cerán que se pueden hacer numerosas modificaciones sin se-pararse del espíritu ni alcance pretendido de la invención.
10
Ejemplos
Procedimientos Experimentales
Transferencia Western 15
Las transferencias Western se llevaron a cabo en el método clásico descrito en “Molecular Cloning - A laborato-ry manual de Sambrock et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edición, 1989”. 20
Sistema de expresión de -catenina
Se transfectaron transitoriamente células 293T usando el procedimiento de fosfato de calcio. Se usaron los si-25 guientes vectores de expresión: -catenina marcada con Myc o con Flag (0,5 g) (un clon de -catenina humana obtenido de R. Grosschedl), axina marcada con Flag o Myc (2 g) (ADNc de ratón proporcionado por F. Costantini), HA-GSK3 o Flag-GSK3 (3,5 g) (un clon de conejo obtenido de JR Wood-30 gett) [Woodgett, J. R. (1990) EMBO J 9: 2431-2438]. Los mu-
tantes de -catenina incluyen DP, (S33, S37, T40, S45, S47 sustituida por alanina) mutantes de un solo punto (S29F, S33Y, S37A, T41A, S45F) y 45PKA (T41S, T42R, A43R). Vecto-res adicionales: Flag-WD, un fragmento de -TrCP dominante negativo (caja F) [Yaron, A. et al. (1998) Nature 396: 5 590-594]; Flag-Dvl-1 (un clon de ADNc de ratón obtenido de S-I Yanagawa) [Lee, J.S. et al. (1999) J Biol Chem 274: 21464-21470]; CKI de Xenopus de tipo salvaje (wt) y domi-nante negativa (XCKI-D128N) (proporcionada por T. Shcwarz-Romond) [McKay, R.M. et al. (2001) Dev Biol 235: 378-387]. 10 24-48 h después de la transfección, las células se cosecha-ron y se procesaron para los diversos experimentos. MG-132 (Sigma) se usó a 20 M durante 5 h; se añadió LiCl (40 mM) durante 6 h, y CKI-7 (100 M) durante 16 h antes de cose-char. La -catenina, axina o GSK-3 en lisados celulares se 15 detectaron usando anticuerpos anti-Myc (Ab-1, Oncogenes Re-search Products, 2 g/ml), anti-Flag (M2, Sigma, 1 g/ml) y anti-HA (fluido de ascitis 12CA5; 1:5000), respectivamente. La expresión de GFP se monitorizó con anticuerpo anti-GFP (JL-8, Clontech, 1 g/ml). En algunos experimentos (Fig. 20 4), la GSK-3 se detectó usando anticuerpos monoclonales anti-GSK-3 (clon 7, Transduction Laboratories, 0,1 g/ml). La -catenina endógena y exógena (Figs. 5d y 6a) se detec-taron con anticuerpos anti--catenina (clon 14, Transduc-tion Laboratories) (0,25 g/ml). 25
Ensayos de cinasa in vitro
Se inmunoadsorbieron 250 g de lisado proteico proce-
dente de transfectantes 293 de Flag--catenina mediante perlas de afinidad unidas covalentemente a anti-Flag M2, y se usaron como sustrato para reacciones de cinasa. Las in-munoperlas se incubaron en tampón de cinasa que contiene 50 mM de Tris (pH 7,5), 10 mM de MgCl, 5 mM de DTT, 5% de gli-5 cerol, ATP (30 M) e inhibidores de fosfatasa. A la mezcla de reacción se añadieron CKI- recombinante (fragmento de aa1-318, 200U, New England Biolabs), GSK-3 (20U, New En-gland Biolabs) o Flag-axina inmunopurificada (0,2 g de proteína, péptido eluido de un lisado celular 293 adsorbido 10 sobre inmunoperlas), durante 30 minutos en 30ºC. La fosfo-rilación secuencial de -catenina se llevó a cabo añadiendo GSK-3 15 minutos después de CKI-, e incubando después du-rante 15 minutos.
15
Análisis de la fosforilación de -catenina
Transferencia Western y espectrometría de masas (MS). Se usaron tres anticuerpos comerciales diferentes anti-fosfopéptido de -catenina: i) anti-fosfo-Thr41/Ser45 (Cell 20 Signaling Technology), un anticuerpo policlonal específico tanto para pT41 como para pS45 (p41,45). ii) Anti-fosfo-Ser33/37/Thr41 (Cell Signaling Technology), un anticuerpo policlonal que reconoce pS33 (p33). Estos dos anticuerpos policlonales se usaron a una dilución 1:1000, según las 25 instrucciones del fabricante. iii) Anti-fosfo-Ser 33/37 (BC-22, Sigma), un anticuerpo monoclonal específico para pS37 (usado como fluido ascítico a una dilución 1:3000; p37). Las especificidades por los anticuerpos se determi-naron mediante estudios de inhibición del fosfopéptido. 30
D32S(PO4) GIHSGATTTAPS45 abolió la señal de p33, pero no la de p37; D32SGIHS(PO4)GATTTAPS45 bloqueó la señal de p37 pero no la de p33. La señal de fosforilación de -catenina de p41,45 fue inhibida por dos fosfopéptidos de -catenina: parcialmente por G34IHS(PO4)GATT(PO4)TA43 y com-5 pletamente por G38ATT(PO4)TAPS(PO4)LS47, indicando que tanto pT41 como pS45 son reconocidos por los anticuerpos. Las proteínas para el análisis mediante MS se inmunopurificaron mediante perlas de afinidad unidas covalentemente a anti-Flag M2 (Sigma), se separaron mediante SDS-PAGE, se tiñeron 10 con azul de Coomassie, y las bandas de -catenina se digi-rieron en gel con endoproteinasa Asp-N. Los péptidos resul-tantes se desalaron en pequeñas columnas, se eluyeron con 20% de MeOH, 5% de HCOOH, y se analizaron mediante espec-trometría de masas de nanoelectropulverización [Yaron et 15 al. (1998) id ibid.], usando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (PE-Sciex, Canadá).
Monitorización de la transactivación transcripcional de -catenina 20
Las células se transfectaron con el plásmido informa-dor de luciferasa TOPFLASH o pGL3-MITF/M [Korinek et al. (1997) Science, 275: 1752-3; Takeda et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:14013-6] y las combinaciones de plásmidos de ex-25 presión pertinentes. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se cosecharon. La actividad de luciferasa se determinó en el lisado de células usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa de Promega. La actividad de la transcripción se expresa en Unidades de Luciferasa Rela-30 tivas (RLU). Se usaron informadores del sitio mutante de
TCF (FOP-FLASH y pGL3-MITF/M195.3) para controlar la trans-activación transcripcional independiente de TCF.
Ejemplo 1
5
La axina induce la cascada de fosforilación-degradación de -catenina, iniciada por la fosforilación en un resto de serina 45.
Para estudiar la cascada de fosforilación que promue-10 ve la degradación de -catenina, se diseñó un sistema de expresión de proteínas simple en células 293: la sobreex-presión combinada de axina y GSK-3 dispara la degradación de -catenina expresada exógenamente (marcada con Myc) (Fig. 1a). En este sistema, ningún componente solo fue su-15 ficiente para promover la degradación de -catenina a lo largo de un amplio intervalo de expresión plasmídica (Fig. 1a y datos no mostrados). La degradación se bloqueó con el tratamiento celular con el inhibidor de proteasoma MG-132 (Fig. 1b), o mediante la sobreexpresión de una -TrCP domi-20 nante negativa, una ligasa de ubiquitina de -catenina re-conocida (E3) [Polakis (2000) id ibid.] (Fig. 1a, línea 7). Se analizaron lisados celulares para determinar la fosfori-lación de -catenina usando una serie de anticuerpos anti-fosfopéptido de -catenina comerciales: anticuerpo especí-25 fico tanto para pT41 como pS45 (p41,45), y anticuerpos que reconocen pS33 o pS37. No se detectó fosforilación con la transfección de Myc--catenina sola, o en combinación con GSK-3 (Fig. 1b, líneas 2, 3). La expresión de axina indujo una señal importante con p41,45 y señales minori-30
tarias con p33 y p37, posiblemente atribuible a la acti-vidad de GSK-3 exógena (línea 5). La coexpresión de axina y GSK-3 potenció la fosforilación en S33 y S37 en gran me-dida (10-30 veces), mientras que la señal de fosforilación en T41/S45 se potenció modestamente (2-4 veces, compárense 5 líneas 4, 5), probablemente debido a la fosforilación en T41 mediada por GSK-3. Por el contrario, una -catenina mutada N-terminal (dominante positiva, DP) no mostró ningu-na señal de fosforilación, y fue estable independientemente de la inhibición proteasómica (Fig. 1a, b). La fosforila-10 ción en S45 también se observó con la sobreexpresión de APC, aunque en un grado mucho menor (datos no mostrados). Esto puede sugerir que APC tiene un papel en la reacción de cebado, que probablemente está limitado a mantener la acti-vidad de axina. De hecho, el análisis mutacional de APC en 15 cáncer ha mostrado que muchas mutaciones de APC prohíben su acoplamiento con axina, mientras que conserva la asociación con -catenina [Hart, M.J. et al. (1998) Curr Biol 8: 573-581; Fearnhead, N.S. et al. (2001) Hum Mol Genet 10: 721-733]. 20
Para resolver la especificidad de la axina y GSK-3 por la fosforilación, se analizó adicionalmente la fosfori-lación de -catenina mediante espectrometría de masas (MS). El análisis de MS mostró una fosforilación en trazas de la región N-terminal de -catenina cuando se transfecta sola 25 (Fig. 1c, paneles 1, 2). La coexpresión de axina dio como resultado una señal importante de fosforilación en S45, con señales de fosforilación apenas detectables en ningún otro sitio de fosforilación N-terminales potencial (paneles 3, 4, 7). Por el contrario, la expresión combinada de axina y 30
GSK-3 dio como resultado señales de fosforilación en S45 y cuatro sitios de fosforilación N-terminales consecutivos: T41, S37, S33 (paneles 6, 8) y S29 (no mostrado), con in-tensidad de señal decreciente.
Estudios de -catenina en una variedad de tumores 5 humanos indicaron que a menudo varios sitios de fosforila-ción N-terminales potenciales están mutados, conduciendo a la estabilización y a la expresión nuclear potenciada de la proteína mutada [Morin et al. (1997) id ibid.; Rubinfeld et al. (1997) id ibid.; Wong et al. (2001) id ibid.]. Muchas 10 de estas mutaciones tumorales se concentran alrededor del sitio de unión de consenso de -TrCP [Yaron et al. (1998) id ibid.] (DS*GXXS*, representando S* fosfoserina), dando cuenta de la estabilización de -catenina. Sin embargo, dos sitios habituales de mutación, S45 y T41, están situados 15 terminalmente en C con respecto al motivo de reconocimiento de -TrCP canónico. De este modo, la estabilización de -catenina por las mutaciones de T41/S45 exige una explica-ción diferente. Una posibilidad es la formación de un sitio de anclaje de E3 redundante alrededor de pT41 y pS45 20 (S*XXXS*) [Aberle et al. (1997) id ibid; Yaron et al. (1998) id ibid.], que está ausente en los mutantes. La otra posibilidad es que estas mutaciones influyan en la fosfori-lación de S33 y S37, que es necesaria para generar el sitio de unión a -TrCP. Para resolver este asunto, se creó una 25 serie de mutaciones de punto en sitios de fosforilación N-terminales detectados mediante MS, y se examinó su fosfori-lación y degradación en el sistema de células 293. La ex-presión de axina o axina-GSK-3 produjo señales de fosfori-lación con p41,45 en todos los mutantes, aparte de S45F 30
(Fig. 2a). Esto pertenece también al mutante T41A, que sólo se puede fosforilar en S45, indicando que la axina puede inducir una fosforilación en S45 exclusiva. Por otro lado, ninguno de los mutantes, con la excepción de S29F, se fos-foriló tanto en S33 como en S37 en respuesta a la transfec-5 ción con axina-GSK-3 (Fig. 2a). Consistente con su estado de fosforilación, sólo la -catenina de tipo salvaje (wt) y la -catenina S29F se degradaron tras la coexpresión de axina-GSK-3 (Fig. 2b). Todos los otros mutantes resistie-ron a la degradación, según la estabilidad de sus contra-10 partes tumorales en cáncer humano [Polakis (2000) id ibid.]. Puesto que las mutaciones en S37 y S33 permiten la fosforilación en T41/S45 (Fig. 2a, líneas 7-12), pero re-sisten la degradación (Fig. 2b, líneas 5-8), es improbable la aparición de un sitio de reconocimiento de -TrCP fun-15 cionalmente redundante aguas abajo de S37. Por lo tanto, parece que la fosforilación en S45 inicia una cascada de GSK-3 lineal, en la que cada sitio de fosforilación sirve como un sitio de cebado necesario para el sucesivo. Aunque llega hasta S29, el objetivo de la cascada está aparente-20 mente restringido a generar el sitio de reconocimiento de -TrCP canónico alrededor de S33/37. Esta suposición está apoyada por la prevalencia de mutaciones tumorales en Asp32 y Gly34 [Wong et al. (2001) id ibid.], que no afectan a la fosforilación, pero que es probable que comprometan al si-25 tio de reconocimiento de -TrCP.
Ejemplo 2
La fosforilación en S45, que por sí misma es independiente 30
de GSK-3, es tanto necesaria como suficiente para iniciar una cascada de fosforilación-degradación dependiente de GSK-3
Los experimentos anteriores implican a la axina en la 5 fosforilación en S45, pero no descartan la contribución de GSK-3 a este suceso. Se sabe tradicionalmente que GSK-3 selecciona como diana la fosforilación de sustratos cebados +4P [Frame, S. et al. (2001) Mol Cell 7: 1321-1327], una especificidad apoyada por estudios estructurales recientes 10 de la enzima [Dajani, R. et al. (2001) Cell 105: 721-732]. El hecho de que el sitio de fosforilación de S45 no esté precedido por un sitio de cebado +4P condujo a la proposi-ción de que el complejo molecular de axina y GSK-3 es ca-paz de esquivar el requisito de cebado de la enzima no com-15 plejada [Cohen y Frame (2001) id ibid.]. Para evaluar la contribución de GSK-3 en la fosforilación de S45 mediada por axina, se llevaron a cabo dos tipos de experimentos. En el primer conjunto, se incubaron células 293 antes de cose-charlas con LiCl, un inhibidor de GSK-3 capaz de imitar un 20 efecto de Wnt [Klein, P.S. y D.A. Melton (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93: 8455-8459; Shambolic, V. et al. (1996) Curr Biol 6: 1664-1668]. Mientras que la modesta fosforila-ción en S33/37 de -catenina de tipo salvaje (wt) inducida por axina fue abolida por LiCl, la señal equivalente de 25 fosforilación en T41/S45 se vio mínimamente afectada (Fig. 3a, compárense líneas 3, 6). De forma similar, no se ob-servó diferencia en el análisis de MS de péptidos S45 pro-cedentes de células tratadas con LiCl frente a las no tra-tadas (datos no mostrados). Además, el tratamiento con LiCl 30 no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación en S45 de una
-catenina mutada T41A (Fig. 3a, compárense líneas 3, 6), indicando que la fosforilación en S45 fue independiente de GSK-3.
En un segundo conjunto de experimentos, se ensayó (Fig. 3b) una axina mutada (Leu 525 convertida en Pro, 5 [L525P-axina]), que es capaz de interaccionar con GSK-3 [Smaller, M.J. et al. (1999) EMBO J 18: 2823-2835; Rubin-feld, B. et al. (2001) J Biol Chem 276: 39037-39045]. La L525P-axina fue tan eficaz como la axina de tipo salvaje (wt) induciendo la fosforilación en S45 (Fig. 3c, líneas 2, 10 4) y el análisis de MS [véase más abajo, Fig. 5c]). A dife-rencia de la axina de tipo salvaje (wt), el mutante L525P es incapaz de acoplarse a la GSK-3 endógena para fosfori-lar S33/37 (Fig. 3c, líneas 2 frente a 4). Sin embargo, cuando se complementa con GSK-3 exógena, la axina L525P y 15 la de tipo salvaje (wt) generaron señales de fosforilación en S33/37 comparables (Fig. 3c, líneas 3, 5, y datos de MS [no mostrados]) y degradación de -catenina (Fig. 3c, línea 7, y Fig. 1a, línea 6). De forma acumulativa, estos experi-mentos muestran que la fosforilación de cebado en S45 no 20 requiere GSK-3, sino una proteína cinasa diferente.
Estos datos muestran que la fosforilación en S45 es esencial para iniciar la fosforilación por GSK-3, pero no indican si es suficiente para movilizar la cascada. Para resolver esta cuestión, se construyó una -catenina que 25 contiene un sitio de fosforilación mediada por proteína ci-nasa A (PKA) sustituto en S45 (45PKA). Esta manipulación no afectó a la expresión ni a la estabilidad de la -catenina (datos no mostrados), sino que dio como resultado su fosfo-rilación constitutiva en S45 en células 293 (Fig. 4, línea 30
1), que fue inhibida por H89, un inhibidor de PKA específi-co (datos no mostrados). La fosforilación en S45 de 45PKA no requiere axina, ni estuvo potenciada por la sobreexpre-sión de axina (Fig. 4, líneas 1 y 2). Por lo tanto, 45PKA demostró ser una contribución decisiva en el estudio del 5 inicio y progresión de la cascada de fosforilación por GSK-3 independientemente de axina. La transfección mediante GSK-3 dio como resultado una fosforilación pronunciada en S33/37 del mutante 45PKA (línea 3), así como su degradación completa (línea 5). Esto contrasta llamativamente con la 10 incapacidad de GSK-3 para inducir la fosforilación y de-gradación de -catenina de tipo salvaje (wt) cuando se transfecta sola (Fig. 1). Para controlar el efecto de GSK-3 de tipo salvaje (wt), se usó un mutante R96A-GSK-3, que no puede alojar una fosfoserina de cebado y, por lo tanto, 15 es incapaz de fosforilar sustratos dependientes del cebado [Frame et al. (2001) id ibid.]. R96A-GSK-3 no indujo la fosforilación de 45PKA en S33/37 (Fig. 4, línea 4) y su de-gradación subsiguiente (línea 6). Estos resultados indican que -catenina es un sustrato genuino dependiente del ceba-20 do para GSK-3, y que el cebado de S45 es tanto necesario como suficiente para conducir la cascada de GSK-3. No obs-tante, los experimentos anteriores no pueden resolver pape-les adicionales para la axina en la cascada. Es posible que cuando GSK-3 esté presente en cantidades limitantes, la 25 axina ayude a reclutar GSK-3 para -catenina. Para apoyar tal papel, existen datos que comparan el efecto de la axina de tipo salvaje (wt) con el de la L525P-axina: esta última, que es incapaz de asociarse con GSK-3 endógena, no indujo la fosforilación en S33/37 (Fig. 3c, línea 4). 30
Ejemplo 3
La fosforilación en S45 inducida por axina está mediada por CKI 5
Para identificar la cinasa cebadora asociada con axi-na, se inmunopurificó Flag-axina a partir de células trans-fectadas 293, y se analizó mediante LC/MS sus proteínas asociadas endógenas. Sólo se detectaron 5 proteína cinasas 10 en asociación con axina en una puntuación elevada: las dos isoformas de GSK-3, y , y las tres isoformas de CKI, , y . Estas isoformas de CKI tienen un dominio de cinasa muy conservado, y parece que tienen una especificidad simi-lar o idéntica por el sustrato [Fish, K.J. et al. (1995) J 15 Biol Chem 270: 14875-14883]. Varios estudios implicaron a CKI en la ruta de Wnt, mayoritariamente como un efector positivo [Peters, J.M. et al. (1999) Nature 401: 345-350; Lee, E. et al. (2001)J Cell Biol 154: 983-993; McKay et al. (2001) id ibid.; Gao, Z.H. et al. (2002) Proc Natl Acad Sci 20 U S A 99: 1182-1187]. Se ha demostrado que CKI interaccio-na con axina [Sakanaka, C. et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96: 12548-12552; Rubinfeld et al. (2001) id ibid.], y se propuso recientemente que esta cinasa media la fosfori-lación de APC inducida por axina, estabilizando de ese modo 25 el complejo de degradación de -catenina [Rubinfeld et al. (2001) id ibid.]. Por lo tanto, se juzgó a CKI como una S45 cinasa candidata tanto en ensayos in vitro como in vivo.
En primer lugar, se ensayó la fosforilación in vitro de -catenina usando una Flag-axina inmunopurificada (la 30 preparación de LC/MS) y las enzimas recombinantes CKI (un
fragmento de 318aa N-terminal) y GSK-3 (Fig. 5a). Tanto CKI como axina indujeron la fosforilación de -catenina en S45/T41, pero no en S33 (líneas 3-7). Para implicar direc-tamente a la CKI en el cebado de la cascada de fosforila-ción por GSK-3, la -catenina se sometió a fosforilación 5 secuencial mediante CKI, seguido de GSK-3. GSK-3 fue in-capaz de fosforilar por sí sola la -catenina (línea 4), aunque indujo una señal de pS33 pronunciada tras la fosfo-rilación en S45 por CKI (línea 5).
En otro conjunto de experimentos, se analizó el papel 10 in vivo de CKI en la fosforilación en S45, usando dos cons-tructos de CKI dominantes negativos (dnXCKIs K85R y D128N) [McKay et al. (2001) id ibid.] y un inhibidor de CKI es-pecífico (CKI-7) [Chijiwa, T. et al. (1989) J Biol Chem 264: 4924-4927]. La coexpresión de los dos dnXCKI, pero no 15 la cinasa de tipo salvaje (wt), con axina, suprimió la ca-pacidad de la axina para inducir la fosforilación en S45 en células 293 (Fig. 5b, líneas 5, 4, 3). Después, se ensayó el efecto de CKI-7 sobre la fosforilación en S45 inducida por axina, en comparación con su efecto sobre la fosforila-20 ción constitutiva de 45PKA. El tratamiento con CKI-7 dismi-nuyó la señal de p45 inducida por axina de la -catenina de tipo salvaje (wt), pero no afectó a la fosforilación en p45 de 45PKA (Fig. 5c). El efecto inhibidor se ensayó adicio-nalmente sobre la fosforilación en S45 de -catenina endó-25 gena en células HeLa inhibidas proteasómicamente (Fig. 5d): CKI-7 suprimió la fosforilación tanto en S45/T41 como en S83 (línea 3), mientras que el inhibidor de GSK-3, LiCl, bloqueó exclusivamente la fosforilación en S33 (línea 6). En el mismo experimento, H89, un inhibidor de PKA, no tuvo 30
ningún efecto sobre la fosforilación de -catenina de tipo salvaje (wt) (línea 5). Acumulativamente, estos resultados in vitro e in vivo indican que CKI media la función de axi-na iniciando la cascada de fosforilación-degradación de -catenina. 5
El análisis de LC/MS/MS del complejo de fosforilación en S45 reveló tres isoformas de CKI en asociación con axina inmunopurificada. Para determinar qué CKI fue responsable de la fosforilación en S45, se trataron células RKO con oligonucleótidos de ARNsi de CKI, o un ARNsi normal para 10 CKI y CKI. La fosforilación de -catenina en S45 y p33 se determinó 72 horas después del tratamiento con ARNsi, en comparación con el tratamiento con los inhibidores prote-osómicos solos (Fig. 5e). El análisis de transferencia Wes-tern muestra una expresión reducida de la CKI y CKI, jun-15 to con una reducción notable de las señales de fosforila-ción tanto en S45 como en S33. Por tanto, parece que las dos isoformas de CKI tienen un efecto comparable induciendo la fosforilación en S45 en células RKO.
20
Ejemplo 4
La fosforilación en S45 está regulada mediante la señaliza-ción de Wnt a través de Dvl
25
El control de la estabilidad de -catenina es una ta-rea principal de la ruta de Wnt, y está mediada a través de miembros de la familia de proteínas conservadas Dishevelled (Dvl 1, 2, 3) [Boutros y Mlodzik (1999) id ibid.]. El mode-lo actual sugiere que Dvl difunde la señal de Wnt mientras 30 está asociada con axina [Kishida, S. et al. (1999) Mol Cell
Biol 19: 4414-4422; Smalley et al. (1999) id ibid.; Salic, A. et al. (2000) Mol Cell 5: 523-532]. Puesto que los re-sultados previos mostraron que la axina controla el suceso iniciador en la cascada de fosforilación-degradación de -catenina, quedaba por ver si Wnt y Dvl regulan la fosfori-5 lación en S45. Para este fin, se estimularon primero varias estirpes celulares con Wnt3A [Roelink, H. y R. Nusse, (1991) Genes Dev 5: 381-388; Shibamoto, S. et al. (1998) id ibid.; Lee et al. (1999) id ibid.], y se monitorizó la fos-forilación en S45 mediante análisis de transferencia Wes-10 tern. La estimulación con Wnt estabilizó -catenina endóge-na en células L de ratón (fibroblastos) (Fig. 6a, líneas 1, 2) y -catenina exógena en linfocitos Jurkat (líneas 5, 6). No afectó a los niveles de una -catenina mutada en S37 ya estabilizada en la estirpe celular de hepatoma SNU449 [Sa-15 toh, S. et al. (2000) Nat Genet 24: 245-250] (líneas 9-11). La fosforilación en S45 de -catenina fue evidente en célu-las L inhibidas proteasómicamente (línea 3), células Jurkat (línea 7) y células HeLa (línea 14). También fue manifiesta en células SNU449 tratadas con ácido okadaico (OKA, línea 20 10). El tratamiento con Wnt3A dio como resultado la inhibi-ción de la fosforilación en S45 en las cuatro estirpes ce-lulares (líneas 4, 8, 11, 15), y la inhibición subsiguiente de la fosforilación en S33/37 en células Jurkat, HeLa y L (líneas 8, 15, 4), sugiriendo que la señalización de Wnt 25 interviene entre la axina y la fosforilación en S45.
Para examinar el papel de Dvl en la regulación de la fosforilación en S45, se introdujo Dvl-1 de ratón [Lee et al. (1999) idi ibid.] en el sistema 293, y se evaluó la fosforilación en S45 mediante análisis de transferencia 30 Western y MS. La transfección con Dvl dio como resultado
una inhibición casi completa de la fosforilación en S45 in-ducida por axina (Fig. 6c, líneas 5, 6), en paralelo con la estabilización de -catenina (línea 9). Se observó un efec-to similar de Dvl para la fosforilación en S45 inducida por L525P-axina. El análisis de MS (Fig. 6b) y de transferencia 5 Western (datos no mostrados) indicó que Dvl inhibe la fos-forilación en S45 inducida por axina-CKI. Sin embargo, Dvl, como mediador de la señal de Wnt, también podría regular las etapas subsiguientes de la cascada de fosforilación me-diante GSK-3. Para evaluar este posible papel dual de Dvl, 10 Dvl se coexpresó con el mutante de -catenina 45PKA, que inicia la cascada de GSK-3 independientemente de axina (Fig. 4). Dvl no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación en S45 mediada por PKA (Fig. 6d, compárense líneas 1, 2), ni bloqueó la fosforilación en S33/37 mediada por GSK-3 15 (Fig. 6d, líneas 3, 4). Igualmente, en diferencia notable con el efecto estabilizador de Dvl sobre -catenina de tipo salvaje (wt) (Fig. 6c, línea 9), la degradación de 45PKA no fue inhibida por Dvl (Fig. 6d, líneas 6, 7). Este hallazgo indica que el suceso de fosforilación en S45 mediado por 20 axina/CKI, en lugar de la cascada de fosforilación por GSK-3 resultante, es la diana crítica para la señalización de Wnt.
Ejemplo 5 25
Inducción de la fosforilación de pSer45 y pSer33 mediante ácido okadaico
El ácido okadaico es un inhibidor selectivo de fosfa-30 tasa PP2A, mientras que inhibe en menor grado (10-50 veces
menos) la fosfatasa PP1. Células HeLa y SW480 inhibidas proteasómicamente (tratadas con 20 M de MG132) o células de carcinoma de colon SNU449 mutadas en Ser37 [Satoh et al. (2000) id ibid.] se trataron con ácido okadaico (1 M) du-rante 1 ó 3 h, se cosecharon, y su lisado se analizó me-5 diante transferencia Western con anticuerpos anti-fosfo--catenina: anti-pSer45 y anti-pSer33 (para células HeLa y RKO solamente). Como se ve en la Fig. 7, el tratamiento con ácido okadaico induce una señal de fosforilación masiva con ambos anticuerpos. Además, puesto que la fosforilación en 10 S45 precede a la fosforilación en S33, el efecto del ácido okadaico se puede reservar para S45. Este es un ejemplo de un compuesto que puede aumentar la fosforilación en S45, mientras que Wnt3A disminuye el mismo suceso de fosforila-ción (Fig. 6a). 15
Ejemplo 6
FRAT1 promueve la fosforilación de -catenina
20
La sobreexpresión de Frat1 en células 293 junto con axina y GSK3 da como resultado la hiperfosforilación de -catenina en el cebado mediante GSK3 de S45 (no mostrado) y los sitios de fosforilación mediante GSK3 sucesivos (T41, S37 y S33, Fig. 9a). Sorprendentemente, la -catenina fos-25 forilada no se degradó, a pesar de la ausencia de inhibido-res proteasómicos, y, en su lugar, se acumuló en las célu-las transfectadas (Fig. 9a). La coexpresión de cantidades pequeñas de Dvl en estas células no reprimió la fosforila-ción en S45 ni en S33, sino que al contrario aumentó el 30 efecto de estabilización de Frat1 sobre fosfo--catenina
(Fig. 9a). Una mayor expresión de Dvl suprimió la fosfori-lación de -catenina, probablemente debido a su efecto pre-dominante sobre la fosforilación en S45 (Fig. 9a). A dife-rencia del efecto de Dvl de tipo salvaje (wt), la transfec-ción de células 293 con un mutante de supresión de Dvl des-5 provisto del motivo de interacción de Frat, PDZ (Dvl-PDZ), dio como resultado la estabilización de -catenina no fos-forilada (Fig. 9b). Dvl-PDZ suprime la fosforilación en S45, aunque no puede activar Frat y de este modo es incapaz de estabilizar -catenina fosforilada. 10
Células 293 se transfectaron con el plásmido informa-dor de luciferasa TOPFLASH y los plásmidos de expresión pa-ra -catenina, axina, GSK, Frat y Dvl, según las combina-ciones indicadas en la Figura 9c. Veinticuatro horas des-pués de la transfección, las células se cosecharon y se de-15 terminó su actividad de luciferasa del lisado usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa de Promega. Los ensayos con el informador de TCF indicaron que la -catenina robusta-mente fosforilada obtenida con la sobreexpresión de Frat1 en células 293 funciona como un coactivador de TCF/LEF efi-20 caz, mucho mejor que la -catenina estabilizada mediante Dvl (Fig. 9c).
p300/CBP es un activador transcripcional, que se ha señalado que coopera con -catenina en la activación de ge-nes regulados por TCF [Hecht, A. et al. (2000) EMBO J. 25 19(8): 1839-50]. Se transfectaron células 293 con los plásmidos de expresión para Myc--catenina, p300/CBP, E1A y Frat, como se indica en la Figura 9d. p300/CBP y E1A esta-bilizan la fosfo--catenina de forma similar a Frat1.
En algunos casos, los efectos transcripcionales de 30
p300/CBP están mediados vía su actividad de acetil-transferasa [Chan, H. M. y La Thangue, N. B. (2001) J. Cell Sci. 114(Pt13):2363-73]. De forma interesante, se encontró que la sobreexpresión tanto de p300/CBP como de Frat1 indu-ce la acetilación de la lisina de -catenina (Fig. 9e). La 5 especie de -catenina acetilada coincide con las fosforila-das, indicando una posible relación de los dos sucesos. La acetilación proteica prohíbe la ubiquitinación de los res-tos de lisina modificados, y de este modo puede dar como resultado la estabilización de una proteína modificada 10 [Brooks y Gu (2003) Curr. Opin. Cell Biol. 15(2): 164-71]. E1A puede funcionar tanto como un regulador negativo como positivo de la actividad de acetil-transferasa de p300/CBP [Chan y La Thangue (2001) id ibid.; Gallimore y Turnell (2001) Oncogene 20(54): 7824-35]. A menores concentracio-15 nes, E1A funciona reclutando p300/CBP, y de este modo puede facilitar la acetilación proteica [Ait-Si-Ali, S. et al. (1998) Nature 3 96(6707):184-6], mientras que a concentra-ciones elevadas antagoniza la actividad de acetil-transferasa de p300/CBP [Li, Q. et al. (1999) EMBO J. 20 18(20): 5634-52]. Esto puede explicar los efectos opuestos de E1A en combinación con p300/CBP y Frat1 sobre la fosfo-rilación de -catenina: mientras que concentraciones bajas de E1A potencian la estabilización de -catenina fosforila-da, mayores concentraciones de E1A suprimen la acumulación 25 de -catenina fosforilada (Fig. 9d). Por lo tanto, los ex-perimentos indican que ciertos oncogenes tales como Frat1 y E1A tienen la capacidad de inducir la estabilización de -catenina fosforilada, posiblemente vía la acetilación pro-teica. 30
Ejemplo 7
La inhibición mediante CKI suprime la fosforilación de -catenina
5
MITF (factor de transcripción asociado con la microf-talmia) es un factor de transcripción de la determinación del linaje, que modula la diferenciación y pigmentación me-lanocítica, funcionando aguas abajo de la ruta de Wnt. MITF se ha usado como un marcador de células de melanoma, y se 10 ha demostrado que es necesario para la inducción por -catenina del crecimiento de melanomas [Widlund et al. (2002) id ibid.].
Células RKO se transfectaron con el plásmido informa-dor de luciferasa pGL3-MITF/M [Takeda et al. (2000) id 15 ibid.] y las combinaciones de plásmidos de expresión indi-cadas en la gráfica (Fig. 10a). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se cosecharon, y su activi-dad de luciferasa del lisado se determinó usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa de Promega. La cotransfección de un 20 plásmido informador de MITF con Frat1 en células RKO au-mentó su transcripción (Fig. 10a), mientras que se encontró que los plásmidos de CKI dominante negativos (DN-CKI) redu-cen la actividad informadora de MITF tanto basal como po-tenciada por Frat1. Las CKI dominante negativas funcionan 25 suprimiendo la fosforilación en S45 de -catenina, provo-cando la acumulación de -catenina en las células en su forma no fosforilada (véase la Fig. 5b). Puesto que la -catenina no fosforilada no se ve afectada por Frat1, la -catenina no se acumuló en las células RKO transfectadas con 30 Frat1, y consiguientemente no hubo ninguna transcripción
del informador de MITF (Fig. 10a).
La estirpe de células de melanoma muy metastásica LB33B1 (B1) es un derivado de las células cancerígenas de bajo grado LB33A1 (A1) [Ikeda H. et al. (1997) Immunity 6(2): 199-208]. Ambas estirpes celulares poseen un conteni-5 do elevado similar de -catenina, independientemente de la inhibición proteasómica, aunque la -catenina de B1 está fosforilada (Fig. 10b). Los inventores muestran que el in-formador de MITF es muy activo en las células B1, pero no en el melanoma de A1 (Fig. 10c). Para evaluar la contribu-10 ción a la actividad transcripcional de MITF de la -catenina fosforilada frente a la no fosforilada, células B1 transfectadas con el informador se trataron con LiCl, que suprime la fosforilación por GSK3, o se cotransfectaron con Dvl-PDZ, que no puede cooperar con Frat1, aunque suprime 15 la fosforilación en S45. Tanto el tratamiento con LiCl como la transfección con Dvl-PDZ dieron como resultado la in-hibición de la actividad promotora de MITF (Fig. 10c), a pesar de la presencia de -catenina estable (Fig. 10b). La abolición de la fosforilación de -catenina en células de 20 melanoma puede comprender su crecimiento y, de hecho, el tratamiento de células de melanoma B1 con CKI7, un inhibi-dor de CKI específico de pequeña molécula, ralentizó su proliferación (Fig. 10d) además de suprimir la fosforila-ción de -catenina (datos no mostrados). De este modo, los 25 experimentos de los inventores sugieren que los inhibidores de la fosforilación en S45, tales como CKI7, pueden consti-tuir un medio eficaz de quimioterapia de ciertas enfermeda-des cancerígenas (por ejemplo, melanoma maligno).
30
Claims (7)
- Reivindicaciones1.- Un método para identificar un agente contra el cáncer, en el que dicho método comprende las etapas de:5(a) poner en contacto un agente con una mezcla de reac-ción que comprende -catenina, axina y/o caseína cinasa I alfa (CKIa),(b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan un cambio en la fosforilación de -catenina en la serina 10 45 (S45), y(c) detectar la fosforilación de -catenina en S45,con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicho agente es útil como un agente con-tra el cáncer. 15
- 2.- Uso de CKI-7 para la fabricación de un medica-mento identificado para el tratamiento de cáncer.
- 3.- El uso de la reivindicación 2, en el que -catenina de dicho cáncer está estabilizada, y su fosforila-20 ción no está impedida.
- 4.- El uso de la reivindicación 3, en el que dicho cáncer es melanoma maligno.
- 5.- Una composición farmacéutica que comprende CKI-7. 25
- 6.- Uso de un ARNsi de CKI- para la fabricación de un medicamento identificado para el tratamiento de cáncer.
- 7.- Una composición farmacéutica que comprende un ARNsi de CKI-.
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