ES2348187T3 - Amplificacion proteomica de pequeñas moleculas que se unen a proteinas celulares diana. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto que comprende (a) poner en contacto una primera alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza el compuesto; (b) poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido como en (a), separando posteriormente la segunda alícuota del analito de dicho soporte sólido; (c) poner de nuevo en contacto el analito separado de la etapa (b) con un soporte sólido como en (a); (d) determinar las cantidades del componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (c); y (e) comparar la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (a) con la cantidad de componente diana unido al soporte sólido de la etapa (c).

Description

Amplificación proteómica de pequeñas moléculas que se unen a proteínas celulares diana.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con métodos para la evaluación y/o cuantificación de la afinidad de unión de moléculas pequeñas u otros compuestos a componentes diana contenidos dentro de un analito, tales como proteínas diana contenidas dentro del proteoma de una célula o tejido.

Antecedentes de la invención

La industria farmacéutica en la actualidad se enfrenta a dos retos fundamentales en su procedimiento de desarrollo de fármacos, concretamente la identificación de proteínas diana apropiadas para intervención en enfermedad y la identificación de candidatos a fármaco de alta calidad que actúan específicamente en estas dianas. Estos dos retos son de máxima importancia en el diseño de medicinas exitosas.

La intervención con compuestos de bajo peso molecular representa un concepto terapéutico fundamental para el tratamiento de trastornos humanos. Debido a sus papeles clave en los procesos de transducción de señales implicados en la aparición y progreso de varias enfermedades tales como cánceres humanos, diversos miembros de la superfamilia de enzimas proteína quinasa se han fijado considerablemente como objetivos por moléculas pequeñas que interrumpen sus funciones catalíticas. Estos esfuerzos en el desarrollo de fármacos han proporcionado una plétora de herramientas para la disección de la señalización celular mediante enfoques genéticos químicos. A diferencia de la inactivación genética clásica, la inhibición de moléculas pequeñas puede modular selectivamente la actividad catalítica de una proteína quinasa de un modo que es rápido, ajustable y, en la mayoría de los casos, reversible. Además, muchas interacciones proteína-proteína formadas mediante proteínas quinasas se preservan en presencia de antagonistas de moléculas pequeñas y pueden por lo tanto diseccionarse a partir de sus funciones catalíticas.

A pesar de estas obvias ventajas, los antagonistas de moléculas pequeñas desarrollados para inhibición de quinasas tienen el potencial de inactivar varias dianas en células intactas, debido a elementos estructurales comunes que se encuentran en los dominios catalíticos de diferentes proteínas quinasas o incluso miembros de otras familias enzimáticas. La selectividad de los inhibidores de quinasa puede evaluarse mediante actividad paralela in vitro o ensayos de unión para grandes cantidades de proteínas quinasas recombinantes (Fabian, M.A. et al., Nat. Biotechnol. 23, 329-36 (2005); Davies, S.P. et al., Biochem. J. 351, 95-105 (2000)). Este enfoque proporciona sin duda datos cuantitativos y valiosos acerca de la selectividad de los fármacos, pero tiene dos limitaciones principales: Primero, además de una parte significativa del complemento de proteína quinasa (= el quinoma), las dianas potenciales de otras clases enzimáticas están poco representadas o completamente ausentes de estos formatos de exploración. En segundo lugar, y quizás de forma más importante, la colección de quinasas recombinantes incluidas en un panel de selectividad no se ajusta al perfil celular de dianas potenciales expresadas en, por ejemplo, un sistema celular en el que se investigan los efectos biológicos de un inhibidor de quinasa.

Estos defectos pueden abordarse con enfoques proteómicos, que emplean compuestos inmovilizados, por ejemplo, inhibidores de quinasa, para la purificación selectiva por afinidad de proteínas diana en combinación con identificación de proteínas, por ejemplo, mediante espectrometría de masas (MS). Esta sencilla técnica se ha usado con éxito para identificar los componentes diana de diversos inhibidores de quinasa en extractos celulares. Sin embargo, la identificación de componentes diana estaba limitada en el sentido de que las afinidades del inhibidor hacia sus parejas de unión celular no pudieron inferirse a partir de los datos de MS. Para obtener información cuantitativa adicional, fue necesario recurrir a ensayos de actividad in vitro secundarios para identificar las dianas de inhibidor que se inhibían potentemente y por lo tanto eran potencialmente relevantes para las acciones celulares observadas del fármaco. Sin embargo, en la práctica, es un desafío evaluar el espectro de dianas completo de un fármaco de molécula pequeña debido al hecho de que las proteínas recombinantes requeridas no están todas disponibles o los ensayos in vitro demuestran ser difíciles de establecer.

El documento US 5324633 describe un método para medir la afinidad de unión de un receptor a un ligando, de manera que un conjunto de polímeros, que se sintetizan o inmovilizan en un sustrato, se exponen a un receptor marcado con fluorescencia en soluciones de diversa concentración y la intensidad de fluorescencia del receptor marcado se mide por medio de, por ejemplo, un contador de fotones que usa microscopía confocal. Un método para identificar dianas de SB 203580 mediante la inmovilización de un análogo de SB 203580 adecuado y cromatografía de afinidad se describe en Godl et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Dec 23; 100(26):15434-9, que permitió el enriquecimiento e identificación de dianas de proteína quinasa de SB 203580. Una técnica general libre de radiomarcaje sin modificación o inmovilización de los compuestos o de la partícula diana para clasificar las afinidades de unión proteína-ligando y determinar la competición alostérica contra la de sitio de unión directa en mezclas de compuestos se describe en Annis DA et al., J Am Chem Soc. 2004 Dec 1; 126(47):15495-503. El documento US 2007087348 (A1) describe un método para determinar uno o más parámetros cinéticos de unión entre un primer miembro de unión y un segundo miembro de unión mediante la adsorción del primer miembro de unión a una superficie en una pluralidad de micropuntos. El segundo miembro de unión se presenta después al primer miembro de unión en cada uno de los micropuntos, existiendo una pluralidad de combinaciones de densidad de superficie del primer miembro de unión y concentración del segundo miembro de unión entre la pluralidad de micropuntos. Se obtienen después datos indicativos de una reacción de unión entre el primero de los micropuntos y se analizan para obtener uno o más parámetros cinéticos de la unión entre el primer y segundo miembros de unión. Valsasina B et al., da una visión de conjunto de algunos ejemplos de perfilación de selectividad de quinasas mediante cromatografía por afinidad con el inhibidor (Expert Rev Proteomics. 2004 Oct; 1(3):303-15). Un método de espectrometría de masas por selección de afinidad (AS-MS) para medidas cuantitativas de afinidad de unión proteína-ligando (Kd) en grandes bibliotecas de compuestos, mediante el que la capacidad de un ligando de valoración para desplazar un miembro de la biblioteca unido a diana, como se midió mediante MS, revela la clasificación de afinidad del componente de la mezcla con relación a compuestos "calibrantes por afinidad interna" de afinidad conocida para la diana CDK2 se describe en Annis DA et al., Anal Chem. 2007 Jun 15; 79(12):4538-42.

Lowe y colaboradores determinan la constante de disociación (K_{L}) de lactato deshidrogenasa (componente diana del analito) para 5'-AMP inmovilizado (ligando inmovilizado) en presencia de un NADH competidor en condiciones de lote. Basándose en volúmenes de elución K_{L} puede calcularse, siempre que K_{i} sea conocido (C. R. Lowe, et al., Eur. J. Biochem., 1974, Vol. 42, páginas 1-6).

Un conocimiento exhaustivo de las proteínas celulares marcadas como objetivo por la intervención de moléculas pequeñas es un prerrequisito para definir interacciones químico biológicas a nivel molecular (Daub, H. et al., Assay Drug Dev. Technol. 2, 215-24 (2004); Fabian, M. A. et al., Nat. Biotechnol. 23, 329-36 (2005)). Aunque las técnicas de purificación por afinidad junto con la espectrometría de masas (MS) se han usado exitosamente para identificar las proteínas interactuantes de inhibidores de moléculas pequeñas inmovilizadas, estos enfoques previos proteómicos no suministran información de afinidades de dianas celulares (Godl, K. et al., PNAS U.S.A., 100, 15434-9 (2003); Brehmer, D. et al., Cancer Res. 65, 379-82 (2005); Daub, H., Biochim. Biophys. Acta 1754, 183-90 (2005)).

Existe por lo tanto la necesidad de métodos de proteómica que permitan la evaluación o determinación directa cualitativa y/o cuantitativa de interacciones de compuesto-componente diana, por ejemplo, interacciones inhibidor-proteína diana. También existe la necesidad de métodos del tipo mencionado anteriormente que pueden adaptarse para aplicaciones de alto rendimiento.

Descripción resumida de la invención

Los objetos anteriores se resuelven mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. En virtud de estos métodos, es posible ahora determinar inmediatamente las afinidades de unión de un compuesto diana, tal como un inhibidor, hacia sus parejas de unión celular, bien cualitativa o bien cuantitativamente, sin tener que recurrir a unión secundaria in vitro o ensayos de actividad. Los métodos de la invención permiten adicionalmente la clasificación de un gran número de líneas celulares de un compuesto inmovilizado de acuerdo con sus afinidades y además evaluar sus propiedades de unión competitiva con relación a un inhibidor definido sin inmovilización adicional. Esto se demuestra ejemplarmente en la presente memoria en más de 100 dianas celulares de inhibidores de quinasa. Los nuevos métodos son ampliamente aplicables y permiten la caracterización simple y rápida de interacciones farmacológicas y farmacocinéticas y/o funciones de cualquier tipo de moléculas pequeñas u otros compuestos de interés en diversos sistemas biológicos.

Así pues, en un aspecto, la invención proporciona un método para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto que comprende (a) poner en contacto una primera alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza el compuesto; (b) poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a), separar posteriormente la segunda alícuota del analito de dicho soporte sólido; (c) volver a poner en contacto el analito separado del paso (b) con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a); (d) determinar las cantidades del componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (c); y (e) comparar la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (a) con la cantidad de componente diana unido al soporte sólido de la etapa (c). Los métodos de acuerdo con este aspecto también se denominan en la presente memoria como métodos de acuerdo con IVA2 (Asociación In Vitro: Composición 2).

Aunque no es estrictamente obligatorio, el método anterior puede comprender adicionalmente la etapa de poner en contacto una tercera alícuota de dicho analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a), que no tiene, sin embargo, dicho compuesto inmovilizado en él y determinar la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido. Esta etapa puede servir como un control negativo mediante el que puede determinarse una unión posiblemente inespecífica de los componentes diana del analito al soporte sólido a diferencia de la unión específica del mismo al compuesto inmovilizado de interés.

En consecuencia, la etapa (e) del método anterior puede comprender adicionalmente comparar las cantidades del componente diana unido al soporte sólido a las etapas (a) y (c) con la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido que no tiene dicho compuesto inmovilizado en él. Como alternativa, la etapa (e) puede comprender comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (c) con una cantidad de componente diana unido inespecíficamente al material de soporte habiéndose determinado previamente o teniendo aún que determinarse dicha cantidad en un experimento o experimentos independientes o se determina por otros medios, tales como cálculo o extrapolación de datos preexistentes, por ejemplo, datos disponibles de la bibliografía o datos aún por obtener.

En una realización preferida, las etapas de contacto (a) y (b) y preferiblemente también la etapa de contacto relativa a la tercera alícuota del método anterior se realizan simultáneamente. Como alternativa, la etapa de contacto (a) y la etapa de recontacto (c) y preferiblemente también la etapa de contacto relativa a la tercera alícuota del método anterior pueden realizarse simultáneamente.

En un aspecto adicional relacionado la invención proporciona un método para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto que comprende (a) poner en contacto una primera alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza el compuesto; (b) poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a) en el que dicho compuesto se inmoviliza, sin embargo, a una mayor concentración que en (a); (c) poner en contacto una tercera alícuota del analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a) en el que dicho compuesto se inmoviliza, sin embargo, a una concentración mayor que la etapa (b); (d) determinar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido de las etapas (a), (b) y (c); y (e) comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a), (b) y (c). Los métodos de acuerdo con este aspecto también se denominan en la presente memoria métodos de acuerdo con IVA1 (Asociación In Vitro: Composición 1).

Se pondrá de manifiesto que la etapa (c) del método anterior no es estrictamente obligatoria, puesto que el método proporciona información útil cualitativa y también cuantitativa sobre la afinidad de unión incluso en ausencia de la etapa opcional (c). En una realización preferida de la invención, los métodos de acuerdo con IVA1 contienen, sin embargo, una etapa (c) como se ha definido anteriormente.

También con respecto a este aspecto de la invención, puede ser útil incluir adicionalmente un control negativo, aunque esto de nuevo no es estrictamente obligatorio. Así pues, el método puede comprender la etapa de poner en contacto una cuarta alícuota de dicho analito con un soporte sólido del tipo de la etapa (a) que, sin embargo, no tiene dicho compuesto inmovilizado en él y determinar la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido. Esto permite determinar la unión posiblemente inespecífica del componente diana al soporte sólido a diferencia de la unión específica del componente diana al compuesto de interés inmovilizado en dicho soporte.

En consecuencia, la etapa (e) del método de acuerdo con IVA1 puede comprender adicionalmente comparar las cantidades de compuesto diana unido al soporte sólido en las etapas (a), (b) y (c) con la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido que no tiene dicho componente inmovilizado en él. Como alternativa, la etapa (e) puede comprender comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a), (b) y (c) con una cantidad de componente diana unido inespecíficamente al material de soporte, en el cual esta cantidad se ha determinado previamente o debe aún determinarse en un experimento o experimentos independientes o se determina mediante otros medios, tales como cálculo o extrapolación de datos preexistentes, por ejemplo, datos disponibles de la bibliografía o de datos aún por obtener.

En una realización preferida de este aspecto, las etapas de contacto (a), (b) y (c) y preferiblemente también la etapa de contacto relacionada con la cuarta alícuota del método anterior se realizan simultáneamente. Como alternativa, las etapas de contacto (a), (b) y (c) y preferiblemente también la etapa de contacto relativa a la cuarta alícuota del método anterior pueden realizarse consecutivamente.

Se pondrá de manifiesto que los métodos de la presente invención de acuerdo con IVA1 o IVA2 descritos y/o reivindicados en la presente memoria pueden combinarse. Específicamente, la unión de un componente diana de un analito a un compuesto inmovilizado puede primero determinarse o evaluarse mediante un método de acuerdo con IVA1 y posteriormente, puede evaluarse adicionalmente por un método de acuerdo con IVA2.

En un aspecto relacionado adicional más, la invención proporciona un método para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto competidor que comprende (a) poner en contacto una primer alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza un compuesto que se une al componente diana con una afinidad de unión dada, en el cual el contacto se realiza en presencia de dicho compuesto competidor; (b) poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a) en presencia de dicho compuesto competidor, en el cual la concentración de dicho compuesto competidor es más alta que en la etapa (a); (c) poner en contacto una tercera alícuota del analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a) en presencia de dicho compuesto competidor, en el cual la concentración de dicho compuesto competidor es más alta que en la etapa (b); (d) determinar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido de las etapas (a), (b) y (c); y (e) comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a), (b) y (c). Los métodos de acuerdo con este aspecto también se denominan en la presente memoria como métodos de competidor IVA (Asociación In Vitro).

Se pondrá de manifiesto que la etapa (c) del método anterior no es estrictamente obligatoria, puesto que el método proporciona información útil cualitativa y también cuantitativa sobre la afinidad de unión incluso en ausencia de la etapa opcional (c). En una realización preferida de la invención, los métodos de competidor IVA contienen, sin embargo, una etapa (c) como se ha definido anteriormente.

También se pondrá de manifiesto que de acuerdo con este aspecto de la invención, la afinidad de unión dada con la que el compuesto inmovilizado se une al componente diana puede ser una afinidad de unión predeterminada. En una realización preferida, la afinidad de unión, por ejemplo, un valor K_{d}, se determina o se ha determinado, mediante cualquiera de los métodos de la presente invención de acuerdo con IVA1 y/o IVA2.

Como alternativa, la afinidad de unión dada con la que el compuesto inmovilizado se une al componente diana también puede ser una afinidad de unión que se ha determinado previamente o va a determinarse en un experimento o unos experimentos independientes o que se determina por otros medios, tales como cálculo o extrapolación de datos preexistentes, por ejemplo, datos disponibles en la bibliografía o de datos aún por obtener.

Un método de competidor IVA de la invención puede comprender adicionalmente la etapa de poner en contacto una cuarta alícuota de dicho analito con un soporte sólido del tipo usado en la etapa (a) en el que dicho compuesto con dicha afinidad de unión dada se inmoviliza, en el cual el contacto se realiza, sin embargo, en ausencia de dicho compuesto competidor. En este caso, la etapa (e) del método preferiblemente comprende adicionalmente la comparación de las cantidades del componente diana unido a soportes sólidos de las etapas (a), (b) y (c) con la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido en ausencia de dicho compuestos competidor.

De acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descritos en la presente memoria, los componentes diana en el analito preferiblemente se marcan con una marca detectable. Mientras que el marcador detectable puede ser el mismo en cada alícuota, el marcador detectable es preferiblemente diferente en cada alícuota, es decir, los componentes diana de la primera alícuota tienen un marcador que es diferente de los componentes diana de la segunda alícuota y así sucesivamente. Esto puede lograrse fácilmente mediante marcaje directo de las alícuotas con marcadores detectables diferentes, o en el caso de los analitos, que se derivan de tejido, cultivo tisular, células, cultivo celular o fluidos corporales, mediante marcaje metabólico in vivo o en cultivo usando diferentes marcadores detectables.

En caso de que se usen diferentes marcadores detectables para marcar los componentes diana de las diferentes alícuotas usadas en los métodos de la invención, la determinación de la etapa (d) de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención se realiza ventajosamente mediante la combinación de dichos componentes diana unidos en una muestra y la detección de las cantidades de los componentes diana marcados de forma diferente en dicha muestra. A este respecto, puede ser ventajoso eluir los componentes diana del soporte sólido antes de combinarlos en dicha muestra.

Se pondrá de manifiesto que la comparación de acuerdo con la etapa (e) de cualquiera de los métodos de la invención puede usarse para determinar o calcular cualitativa y/o cuantitativamente la afinidad de unión del componente diana al compuesto.

Se pondrá de manifiesto también que en virtud de los métodos de acuerdo con la invención la afinidad de unión de una multitud de componentes diana hallados dentro de un analito por el compuesto inmovilizado y/o el compuesto competidor puede simultáneamente evaluarse y determinarse.

Se pondrá de manifiesto adicionalmente que los métodos de acuerdo con la invención son particularmente adecuados para aplicarse a enfoques de exploración de alto rendimiento. Así pues, en otra realización de la invención los métodos descritos y/o reivindicados en la presente memoria se realizan al completo o al menos en parte en un modo de alto rendimiento.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Representación esquemática de métodos preferidos de acuerdo con la invención.

(a) IVA1 (Asociación In Vitro: Composición 1) - Cuantificación de unión dependiente de dosis de proteínas celulares diana a un inhibidor inmovilizado de molécula pequeña.

(b) IVA2 (Asociación In Vitro: Composición 2) - Ciertos defectos de IVA1 resueltos por dos ciclos paralelos de purificación por afinidad consecutivos a la mayor densidad de ligando y una incubación adicional con perlas control desprovistas de inhibidor inmovilizado.

(c) Experimento control para verificar que el ligando inmovilizado está presente en exceso molar sobre sus proteínas diana en el extracto biológico analizado.

Figura 2: Dianas celulares específicas del inhibidor V16742 identificadas por el enfoque de MS químico cuantitativo.

(a) Estructura química del compuesto V16742, que se acopló mediante el grupo amino primario a sefarosa epoxi-activada.

(b) Las dianas celulares de V16742 identificadas mediante MS cuantitativa se disponen de alta a baja afinidad de las dianas en una escala de valor de Kd. Se muestran las exploraciones de FT-MS LTQ-Orbitrap representativas correspondientes a las composiciones IVA1 e IVA2 para una diana de cada clase (afinidad alta, moderada y baja). Los máximos monoisotópicos usados para la cuantificación se marcan con las flechas de diferentes sombreados de acuerdo con el esquema presentado en la Figura 1.

(c) Confirmación de resultados de análisis por espectrometría de masas. Asociación in vitro de lisados totales de células HeLa con matriz de control o matriz V16742 según composiciones IVA1 (unión dependiente de dosis) o IVA2 (enriquecimiento en segundo ciclo de IVA) representado en la Figura 1. Las proteínas unidas eluidas de la matriz se inmunotransfirieron con anticuerpos específicos para JNK2 (diana de Alta afinidad), RIPK2 (diana de afinidad Moderada), ERK2 (diana de afinidad Baja) y ROCK2 (diana de afinidad Muy baja no enriquecida significativamente en IVA2).

(d) Perfil de especificidad del inhibidor V16742. El dendograma de quinasa se adapta de Cell Signalling Technology, Inc. TK, tirosina quinasas no receptoras; RTK, tirosina quinasas receptoras; TKL, quinasas de tipo tirosina quinasa; CK, familia de caseína quinasa; PKA, familia de proteína quinasa A; CAMK, quinasas dependientes de calcio/calmodulina; CDK, quinasas dependientes de ciclina; MAPK, proteína quinasas activadas por mitógeno; CLK, quinasas de tipo CDK. Las dianas de quinasa de V16742 con afinidades de unión altas, moderadas o bajas se representan mediante círculos de diferentes tamaños como se indica en la Figura.

Figura 3: Determinación de CI_{50} para un inhibidor de interés (SB203580) con respecto a la competición para su unión a un inhibidor inmovilizado (V16742).

(a) Representación esquemática del enfoque de unión competitiva para análisis de selectividad: diseño experimental para MS cuantitativa de prevención dependiente de dosis de la unión de diana SB203580 al inhibidor de molécula pequeña V16742.

(b) Espectros de MS de un péptido representativo derivado de la proteína diana más alta SB203580, RIPK2, se muestra que se retiene con afinidad moderada mediante resina V16742.

(c) Análisis por inmunotransferencia del perfil de selectividad competidora. Las reacciones IVA de lisados de células HeLa con perlas V16742 inmovilizadas se realizaron en presencia de concentraciones crecientes de SB203580. Las proteínas unidas eluidas de la matriz se inmunotransfirieron con anticuerpos indicados contra las dianas SB203580 para confirmar los resultados de espectrometría de masas.

Descripción detallada de la invención

El término "analito" como se usa en la presente memoria puede ser un proteoma, una mezcla de diferentes proteomas, un lisado o extracto celular, un lisado o extracto tisular, un sobrenadante de cultivo celular, un sobrenadante de cultivo tisular o un fluido corporal, tal como leche, líquidos o linfa.

El término "proteoma" como se usa en la presente memoria se refiere a la composición proteica específica de una célula, tejido u organismo. Dependiendo de las células individuales contenidas en el mismo, un cultivo de una célula o un tejido puede, teóricamente, contener tantos proteomas como células hay contenidas en el mismo. Por conveniencia, los proteomas de un cultivo celular o de un tejido se consideran como representativos de un proteoma. Los proteomas de un tipo de organismo pueden diferir de otro dependiendo del estado y fondo genómico de sus células.

Para los propósitos de la presente invención, pueden usarse una diversidad de proteomas como analitos. Dichos proteomas pueden derivarse de células individuales o cultivos celulares realizados a partir de una población homogénea de células o de una mezcla de células. También pueden derivarse de un tejido, órgano u organismo. Además, la dicha célula individual, cultivo celular o mezcla de células, tejido, órgano u organismo puede exponerse a ciertas condiciones, tales como calor, estrés, deprivación de alimento, fármacos, radiactividad, agentes químicos, toxinas, infección viral, antibióticos y envejecimiento. Estas condiciones conducen a diferentes "conjuntos" de proteomas que también pueden usarse como analitos en los métodos de la invención y compararse entre sí en términos de la unión a los componentes diana contenidos en los mismos para un compuesto dado de interés. Estos proteomas reflejan de este modo una situación que se asemeja a la situación in vivo tanto como sea posible.

Los proteomas a usar como analitos de acuerdo con la invención pueden derivarse de células procariotas o eucariotas, tales como células bacterianas, microorganismos patógenos, células fúngicas, células de levadura, células vegetales, células de mamífero, células de peces, células de nematodo, células de insectos y, en particular, células madre tales como células madre embriónicas o adultas, por ejemplo, células madre embriónicas madre o adultas no humanas. Adicionalmente, los métodos de la invención pueden aplicarse a una amplia diversidad de proteomas que están presentes en o derivan de un tejido u órgano, tal como tejido conectivo, tejido endotelial, cerebro, hueso, hígado, corazón, músculo esquelético, próstata, colón, riñón, glándulas, ganglios linfáticos, páncreas, raíces, hojas y flores. Finalmente, los proteomas adecuados pueden ser los presentes en un organismo no humano o derivados de un organismo, tales como E. coli, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, pez cebra, rata, hámster, ratón, cabra, oveja, mono, ser humano y medusa o un organismo vegetal tal como arroz, patata, arabidopsis, trigo, avena y tabaco.

Como se usa en la presente memoria, un "componente diana" puede ser cualquier componente dentro de un analito que es capaz de interactuar, por ejemplo, unirse, al compuesto de interés. Un componente diana puede ser, por lo tanto, por ejemplo, un oligo o polisacárido, un ácido nucleico, un proteoglicano, un péptido o una proteína, que incluye glicoproteínas. En una realización preferida, el componente diana del analito de acuerdo con la invención es una proteína. Preferiblemente, la proteína es una quinasa y más preferiblemente una proteína quinasa. En una realización igualmente preferida, el componente diana es una lípido quinasa.

El compuesto inmovilizado en el soporte sólido o el compuesto competidor de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier compuesto de interés seleccionado de enzimas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, oligo o polisacáridos, proteoglicanos, entidades químicas, moléculas pequeñas, fármacos, metabolitos o profármacos. Preferiblemente, el compuesto o compuesto competidor es un inhibidor del componente diana en el analito.

Son ejemplos preferidos de dichos compuestos o compuestos competidores los compuestos químicos, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, anticuerpos y similares sintéticos y/o de origen natural.

La expresión "molécula pequeña" como se usa en la presente memoria se refiere a moléculas que muestran un peso molecular de menos de 5000 Da, más preferiblemente menos de 2000 Da, incluso más preferiblemente menos de 1000 Da y más preferiblemente menos de 500 Da. Dichos compuestos pueden ser "candidatos" adecuados para optimización adicional.

Los compuestos o compuestos competidores que son compuestos de "moléculas pequeñas" sintéticos y/o de origen natural, por ejemplo fármacos, metabolitos, profármacos, fármacos potenciales, metabolitos potenciales, profármacos potenciales y similares, se prefieren para su uso en los métodos descritos y revindicados en la presente memoria. Preferiblemente, dichos compuestos o compuestos competidores se seleccionan del grupo que consiste en compuestos químicos sintéticos o de origen natural o fármacos orgánicos sintéticos, más preferiblemente moléculas pequeñas, fármacos orgánicos o compuestos de moléculas pequeñas naturales.

En una realización preferida de los métodos de la invención, el componente diana es una quinasa y el compuesto inmovilizado de interés y el compuesto competidor es un inhibidor de quinasa.

Sin embargo, también se comprende en la presente invención el uso de compuestos o compuestos competidores que son ácidos nucleicos, tales como ADN, ARN y/o ANP (ácido nucleico proteico). Dichos ácidos nucleicos pueden estar presentes en forma de oligonucleótidos o polinucleótidos, incluyendo ácidos nucleicos que comprenden secuencias y/o motivos de nucleótidos específicos. También pueden usarse híbridos entre las diferentes formas de ácidos nucleicos.

La expresión "soporte sólido" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier soporte no disuelto capaz de inmovilizar el espectro anterior de compuestos de interés en su superficie. Los materiales que pueden usarse como soportes sólidos son muchos e incluyen, pero no se limitan a, sílice fundida, cuarzo, silicio, plásticos, vidrio, oro, metales, electrodos transparentes (por ejemplo, óxido de indio estaño o materiales relacionados), cerámicas (por ejemplo, óxidos de metal), papel, carbono conductor, polímeros conductores, filtros, portaobjetos de vidrio, superficies de silicio, perlas y una microserie química adaptada (en inglés "customized chemical microarray"). Dichos materiales adecuados pueden tomar la forma de perlas pequeñas, sedimentos, discos, microplacas, platos, placas multipocillo, obleas o similares, aunque también pueden usarse otras formas.

En una realización preferida de cualquiera de los métodos de la presente invención, los compuestos se unen a perlas, tales como perlas de sefarosa (por ejemplo, sefarosa activada por NHS) o agarosa. En una realización particularmente preferida, dichas perlas son de sefarosa, opcionalmente epoxi activada o NHS activada, o perlas de agarosa. Por ejemplo, un compuesto inhibidor (tal como V16742, Figura 2a) puede acoplarse a perlas de sefarosa epoxi activadas a tres concentraciones diferentes y la concentración relativa de inhibidor inmovilizado covalentemente en las resinas definidas se determina por espectrofotometría (aquí 1, 5 y 25 veces la concentración más baja).

El material de soporte sólido adecuado también puede comprender o consistir en partículas ferro o ferrimagnéticas como se conocen, por ejemplo, a partir del documento WO 01/71732. Las partículas ferro o ferrimagnéticas pueden comprender vidrio o plástico. Las partículas ferro o ferrimagnéticas que pueden usarse en el contexto de la presente invención pueden ser porosas. Las partículas de vidrio ferro o ferrimagnéticas pueden comprender aproximadamente del 30 al 50% en peso de Fe_{3}O_{4} y aproximadamente del 50 al 70% en peso de SiO_{2}. Las partículas ferro o ferrimagnéticas útiles preferiblemente tienen un tamaño medio de aproximadamente 5 a 25 \mum en diámetro, más preferiblemente aproximadamente de 6 a 15 \mum y particularmente aproximadamente de 7 a 10 \mum. El área de superficie total de las partículas ferro o ferrimagnéticas puede ser de 190 g/m o mayor, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 190 a 270 g/m (como se determinó de acuerdo con el método del Brunaur Emmet Teller
(BET)).

Estas partículas magnéticas facilitan la purificación, separación y/o ensayo de biomoléculas, tales como proteína quinasas. Las partículas magnéticas (o perlas) que se unen a una molécula de interés pueden recogerse o recuperarse mediante la aplicación de un campo magnético externo a un depósito que comprende las partículas.

La inmovilización de los compuestos en el material de soporte sólido puede conseguirse mediante adsorción, absorción, enlace iónico, enlace covalente, un grupo amino o grupo carboxi o grupo hidroxi, interacciones (estrept)avidina-biotina o tiol-oro y cualquier otro método que pueda unir los materiales a una densidad o concentración controlables.

El compuesto inmovilizado está presente preferiblemente en una concentración definida en el soporte sólido. Las concentraciones o los intervalos de concentración preferidos a este respecto son concentraciones de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 10 mM, preferiblemente de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 nM o de aproximadamente 1 \muM a aproximadamente 5 mM.

En una realización preferida de cualquiera de los métodos de la invención, el compuesto se acopla covalentemente al soporte sólido. Antes del acoplamiento, el material de soporte sólido o matriz puede contener grupos activos tales como NHS, carbodiimida, etc. para permitir la reacción de acoplamiento con compuestos. Los compuestos pueden acoplarse al soporte sólido mediante acoplamiento directo (por ejemplo usando grupos funcionales tales como grupos amino, sulfidrilo, carboxilo, hidroxilo, aldehído y cetona) y por acoplamiento indirecto, por ejemplo, mediante biotina, estando la biotina unida covalentemente al compuesto y unión no covalente de biotina a estreptavidina que se une al soporte sólido directamente.

El par de afinidad biotina-avidina es la técnica de secuestro y separación por afinidad más explotada para aplicaciones biológicas. El sistema se basa en la movilización de avidina, estreptavidina o neutravidina en un soporte sólido. Una molécula cebo biotinilada se mezcla con un lisado celular. Esta mezcla se carga después en la columna de afinidad basada en avidina y se lava para eluir las proteínas de unión inespecífica. La proteína deseada puede después liberarse mediante lavado con varios reactivos disponibles. Una cantidad sustancial de trabajo indica que la neutravidina monomérica puede usarse para minimizar interacciones inespecíficas con proteínas comunes. Adicionalmente están fácilmente disponibles muchos reactivos químicos que permiten la biotinilización de moléculas pequeñas que tienen grupos funcionales específicos.

En una realización preferida de cualquiera de los métodos de la invención, el compuesto se inmoviliza en el material de soporte sólido, particularmente perlas, mediante un grupo amino, un grupo hidroxi o un grupo carboxi.

Aunque no es obligatorio, puede ser útil inmovilizar el compuesto en el material de soporte sólido mediante un agente de unión o un espaciador. Para unir compuestos al soporte sólido pueden usarse varios sistemas de anclaje. Por ejemplo, pueden usarse agentes de unión covalentes entre compuesto y soporte sólido. Pueden usarse técnicas combinatorias para optimizar factores tales como el tipo de agente de unión, rigidez y longitud óptima para unión proteica, mientras que se minimizan interacciones inespecíficas no buscadas. Los expertos en la materia conocen los sistemas adecuados y técnicas para optimizarlos.

En el contexto de la presente invención, el término "contactar" o "contacto" incluye todas las medidas o etapas que permiten la interacción entre el analito y el soporte sólido. El contacto se realiza de manera que los componentes diana en el analito pueden interactuar o unirse al compuesto inmovilizado. La unión entre el componente diana y el compuesto será preferiblemente una unión reversible no covalente, por ejemplo, unión mediante puentes de sal, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas o una combinación de los mismos.

Los métodos de la presente invención permiten la evaluación o determinación directa cualitativa y/o cuantitativa de la interacción de un compuesto de interés con componentes diana en un analito, tal como un lisado o extracto celular o tisular.

En un primer aspecto de la invención, también denominado en la presente memoria como método de acuerdo con IVA1 (Asociación In Vitro, composición 1), la inmovilización del compuesto de interés en el soporte sólido se realiza en diferentes concentraciones en combinación con diferentes etapas de purificación por afinidad paralelas o consecutivas, tales como las etapas de contacto (a), (b) y (c) mencionadas anteriormente, que permiten determinar la afinidad del componente diana de dicho compuesto.

Diversas relaciones de las concentraciones en las que el compuesto de interés está inmovilizado en el soporte sólido son adecuadas en el contexto del aspecto de la invención. Las relaciones preferidas de las concentraciones en las etapas anteriormente mencionadas (a), (b) y (c) se seleccionan de las relaciones de aproximadamente 1:5:25 o aproximadamente 1:10:100. Sin embargo, otras relaciones son igualmente adecuadas, por ejemplo relaciones de aproximadamente 1:3:9, aproximadamente 1:4:16, aproximadamente 1:6:36, aproximadamente 1:7:49, aproximadamente 1:8:64 o aproximadamente 1:9:81.

Mediante la determinación de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a), (b) y (c) y la comparación de las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en estas etapas, el método permite determinar cualitativa y, hasta cierto punto, cuantitativamente la afinidad de la unión del componente diana en el analito al compuesto de interés.

En los métodos de acuerdo con IVA1, la cantidad de componente diana unido al soporte sólido se refleja, por ejemplo, mediante las intensidades de señal determinadas en la etapa (d), medidas, por ejemplo, por MS. Cantidades crecientes de componente diana unido al compuesto de las etapas (a), (b) y (c), como se refleja mediante intensidades de señal crecientes, indican que el componente diana puede ser uno con afinidad de unión solamente baja o media para el compuesto unido al soporte sólido. Sólo pequeños aumentos de las cantidades de componente diana unido al compuesto en las etapas (a), (b) y (c), como se refleja mediante intensidades de señal similares, son indicativas de componentes diana con afinidad de unión alta para el compuesto unido al soporte sólido. Si las cantidades de componente diana unido al compuesto de las etapas (a), (b) y (c) son iguales, lo que puede visualizarse mediante intensidades de señal iguales, esto puede ser indicativo de unión muy fuerte al compuesto unido al soporte sólido o unión inespecífica al material sólido.

Para una determinación precisa de valores Kd con los métodos de acuerdo con IVA1, la concentración del inhibidor inmovilizado preferiblemente debería estar en exceso molar de la concentración de su componente o componentes diana correspondientes en el analito, preferiblemente en al menos un exceso molar de dos veces. Sin embargo, incluso en condiciones en las que la concentración de ligando inmovilizado es limitante, el ensayo aún clasificará diferentes componentes diana de acuerdo con sus afinidades por el ligando inmovilizado. Por lo tanto, un exceso molar de ligando es conveniente y un requerimiento opcional, pero no esencial.

El aspecto anterior de la invención se demuestra ejemplarmente en la Figura 1a (IVA1, Asociación In Vitro, Composición 1). Un método de acuerdo con este aspecto se realiza preferiblemente mediante el uso de lisados celulares de tres cultivos de las mismas células, que difieren, sin embargo, en que se han marcado metabólicamente con diferente marcaje isotópico. Estos lisados marcados de forma diferente se procesan en el método como alícuotas separadas del mismo analito. Específicamente, se ponen en contacto con un compuesto inhibidor de interés (en la Figura se usa V16742) inmovilizado a diferentes concentraciones en un soporte sólido (en la Figura en una relación de 1:5:25). Después de asociación in vitro con el ligando, las proteínas de cada alícuota unidas al soporte sólido se combinan y analizan mediante LC-MS/MS. Posteriormente, la abundancia relativa de las proteínas que interactúan puede cuantificarse mediante la determinación de relaciones de intensidad de los iones peptídicos marcados con isótopos derivados de las tres incubaciones paralelas (Figura 1a).

Se pondrá de manifiesto que de acuerdo con el aspecto anterior de la invención, ciertas determinaciones cualitativas, pero también cuantitativas, pueden realizarse con respecto a la afinidad del componente diana al compuesto de interés.

Como se muestra esquemáticamente en la Figura para un componente diana representativo retenido con afinidad media o baja por V16742, las intensidades reflejan la unión de componente diana aumentada desde menores a mayores concentraciones del compuesto inhibidor inmovilizado (Figura 1a-ii).

A partir de este experimento, no puede deducirse con certeza, sin embargo, que porcentaje de un componente celular diana se retiene a la máxima concentración del compuesto inhibidor inmovilizado y por lo tanto puede ser difícil determinar un valor K_{d} (constante de disociación) para la interacción de un inhibidor-componente diana (Figura 1a-ii).

En el caso de componentes diana con alta afinidad, que ya están agotados del analito a concentración de inhibidor media, la intensidad no aumenta adicionalmente con más inhibidor presente en las perlas de afinidad (Figura 1a-iii). Si las intensidades de señal (que representan cantidades de componente diana relativas) son iguales para las tres asociaciones in vitro, esto podría, sin embargo, deberse a unión a componente diana con muy alta afinidad o indicar unión "de fondo" de un componente diana, que se retiene a través de interacciones débiles, inespecíficas con el material de soporte sólido (Figura 1a-iv).

En otro aspecto de la invención, también denominado en la presente memoria como método de acuerdo con IVA2 (Asociación In Vitro, Composición 2), se proporciona un método que permite distinguir entre estos dos posibles escenarios. Este método comprende realizar dos ciclos de etapas de asociación in vitro consecutivas de un componente diana dentro de un analito con un compuesto inmovilizado en un soporte sólido a una alta concentración (por ejemplo, la concentración más alta usada o determinada en un método de acuerdo con el primer aspecto de la invención) y comparar la cantidad de componente diana unido en el segundo ciclo de estas etapas a la cantidad de componente diana unido en una asociación paralela in vitro con sólo una etapa de asociación (Figura 1b-i).

De acuerdo con este método, se usan de nuevo lisados celulares de tres cultivos de las mismas células que difieren, sin embargo, en su marcaje isotópico metabólico, procesándose dichos lisados de nuevo como alícuotas separadas del mismo analito. Una primera alícuota se pone en contacto con el soporte sólido con el compuesto de interés (aquí: V16742) inmovilizado a una concentración alta. Después de permitir la asociación in vitro, el sobrenadante se separa del soporte sólido y se pone de nuevo en contacto con el material de soporte sólido del tipo mencionado anteriormente con el compuesto inmovilizado a una concentración alta. El método también incluye poner en contacto una segunda alícuota marcada de manera diferente con el tipo anteriormente mencionado del material de soporte sólido con el compuesto inmovilizado a una alta concentración. Un control negativo, con una tercera alícuota marcada de manera diferente en contacto con el soporte sólido que está, sin embargo, desprovisto del compuesto anterior inmovilizado en él se ejecuta en paralelo. Las proteínas de la primera y tercera alícuotas unidas al soporte sólido y las proteínas de la segunda alícuota unidas al soporte sólido en la etapa de recontacto se combinan, se analizan mediante LC-MS/MS y se cuantifica la abundancia relativa de proteínas interactuantes mediante la determinación de las relaciones de intensidad de los iones peptídicos marcados con isótopo derivados de las tres incubaciones paralelas (Figura
1b).

En contraste con los componentes diana de interacción débil del analito, los componentes diana con una mayor afinidad por el compuesto inmovilizado, por ejemplo, un compuesto inhibidor, se agotan en su mayor parte en la primera etapa de contacto a la que se somete la segunda alícuota.

Por comparación cuantitativa con los componentes diana marcados diferencialmente retenidos del sobrenadante en el segundo ciclo de purificación por afinidad con el mismo soporte sólido que tiene un compuesto inmovilizado en él, por ejemplo, perlas inhibidoras, el porcentaje de unión al componente diana a la mayor concentración de compuesto inhibidor puede ahora calcularse (ejemplos para 10% y 75% de unión dados en la Figura 1b-ii y Figura 1b-iii respectivamente). El factor de enriquecimiento para cada diana específicamente unida a la resina de afinidad V16742 puede calcularse de acuerdo con la fórmula E_{n} = (1-r_{n}) X 100 en la que, r_{n} representa la relación de la unión observada para la diana enésima en el ciclo 2 contra el ciclo 1 de la composición IVA2 con resina de afinidad V16742 y E_{n} es el factor de enriquecimiento porcentual para la diana enésima.

Además, el uso de soporte sólido que no tiene compuesto unido a él, es decir, un control, proporciona un medio para identificar los componentes diana del analito, que no interactúan específicamente con el compuesto inmovilizado (Figura 1b-iv).

Para permitir la determinación de afinidades de unión mediante los métodos de la invención de acuerdo con IVA2, el compuesto inmovilizado en el soporte sólido debería estar presente durante las etapas de contacto en exceso molar en comparación con el componente diana.

En los métodos de acuerdo con IVA2, la cantidad de componente diana unido a soporte sólido se refleja, por ejemplo, mediante las intensidades de señal determinadas en la etapa (d), medidas, por ejemplo, mediante MS. Las cantidades decrecientes de componente diana unido al compuesto en las etapas (a) y (c) se refleja mediante intensidad de señal decreciente. El grado de disminución es indicativo de la afinidad de unión del componente diana al compuesto unido al soporte sólido. Si sólo existe una pequeña diferencia (disminución) en las cantidades unidas en las etapas (a) y (c), esto indica una unión de afinidad baja, mientras que una gran diferencia (disminución) indica que el componente diana se une con afinidad media o alta al compuesto unido al soporte sólido. Si las cantidades de componente diana unido al compuesto en las etapas (a), (b) y (c) son iguales, esto es indicativo de unión de fondo o inespecífica.

Para una determinación precisa de valores Kd, la concentración del inhibidor inmovilizado está preferiblemente en un exceso molar de al menos dos veces sobre la concentración de su componente o componentes diana en el analito. Sin embargo, incluso en condiciones en las que la concentración de ligando inmovilizado es limitante, el ensayo aún clasificará los componentes diana de acuerdo con sus afinidades para el ligando inmovilizado. Por lo tanto, un exceso molar de ligando es conveniente y un requerimiento opcional, pero no esencial.

Puede realizarse un experimento control adicional para confirmar que el compuesto inmovilizado no es limitante en los métodos IVA de la invención. Como se muestra en la Figura 1c-i, los lisados celulares (por ejemplo, de células HeLa) marcados diferencialmente (por ejemplo, codificados con SILAC), preferiblemente del mismo volumen, que contienen diferentes cantidades de proteína celular pueden incubarse con perlas del tipo usado de acuerdo con IVA1 o IVA2, por ejemplo, las perlas que contienen la concentración más baja de ligando inmovilizado. Si la relación de intensidades de señal derivadas de proteínas diana que interactúan con ligando corresponde a la relación de la concentraciones de proteína inicial, puede concluirse que la concentración de ligando inmovilizado ha estado presente en exceso molar sobre sus proteínas diana en el ensayo de unión.

En un tercer aspecto de la invención, también denominado en la presente memoria como método de competidor IVA (Asociación In Vitro), la afinidad de unión de un compuesto competidor de interés puede determinarse para cualquier componente diana en un analito con respecto al cual la afinidad de unión (por ejemplo, en términos de un valor K_{d}) de un compuesto inmovilizado (por ejemplo un inhibidor inmovilizado) se ha determinado, o se determinará, mediante competición dependiente de concentración. La afinidad de unión del compuesto inmovilizado puede, por ejemplo, determinarse mediante cualquiera de los métodos de la invención de acuerdo con IVA1 y/o IVA2. Una ventaja de este método es que el compuesto competidor no tiene que estar inmovilizado en este método.

El tiempo de incubación en las etapas de contacto de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención (por ejemplo, los métodos de acuerdo con IVA1 o IVA2 o el método de competidor IVA) debería preferiblemente ser suficientemente largo como para alcanzar equilibrios de unión para interacciones diana-inhibidor. Los inventores han verificado experimentalmente que este es típicamente el caso después de un tiempo de incubación de 2 horas y media. Sin embargo, los equilibrios de unión también pueden alcanzarse con tiempos de incubación más cortos. Las concentraciones de tampón, sales y otros componentes tales como agentes quelantes tales como EDTA y EGTA o cofactores adicionales pueden en principio variarse a lo largo de un amplio intervalo de concentración. Además, las etapas de contacto pueden hacerse a diferentes temperaturas. Las temperaturas preferidas se seleccionan de aproximadamente 4ºC, aproximadamente 15ºC, temperatura ambiente, aproximadamente 25ºC, aproximadamente 37ºC y aproximadamente 42ºC, siendo aproximadamente 4ºC, temperatura ambiente y aproximadamente 37ºC particularmente
preferidas.

Las etapas de contacto de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención se realizan preferiblemente en condiciones fisiológicas o esencialmente fisiológicas. Esto permite imitar la situación in vivo tan estrechamente como sea posible. La posibilidad de trabajar en condiciones fisiológicas o esencialmente fisiológicas es una de las ventajas de los métodos de la presente invención, en contraste con otros métodos de acuerdo con el estado de la técnica que dan como resultado fácilmente resultados de falso positivo. El contacto se realiza preferiblemente usando un tampón adecuado y, opcionalmente, un cofactor, tal como calcio, magnesio, potasio, NAD+/NADH, GMPc, NADP+/NADPH, ATP, ADP, AMPc, y similares. Los cofactores pueden mejorar significativamente la formación de complejos y proteomas y a la vez la interacción del proteoma y/o los complejos con el compuesto potencialmente interactuante. Como se usa en la presente memoria la expresión "condiciones fisiológicas" se refiere a temperatura, pH, fuerza iónica, viscosidad y parámetros bioquímicos similares que son compatibles con un organismo viable y/o que existen típicamente intracelularmente en una célula en cultivo viable, tal como una célula de levadura o una célula mayor eucariota, tal como una célula de mamífero.

Por ejemplo, las condiciones intracelulares en una célula de levadura crecida en condiciones de cultivo de laboratorio típicas son condiciones fisiológicas. Las condiciones de reacción in vitro adecuadas para combinaciones de transcripción in vitro son generalmente condiciones fisiológicas. En general, las condiciones fisiológicas in vitro comprenden NaCl o KCl 50-200 mM, pH 6,5-8,5, 20-45ºC y cationes divalentes 0,001-10 mM (por ejemplo, Mg++, Ca++); preferiblemente NaCl o KCl aproximadamente 150 mM, pH 7,2-7,6, catión divalente 5 mM y con frecuencia incluyen 0,01-1,0 por ciento de proteína inespecífica (por ejemplo, BSA). Un detergente no iónico (Tween, NP-40, Triton X-100) puede con frecuencia estar presente, habitualmente de aproximadamente 0,001 a 2%, típicamente de 0,05 a 0,2% (v/v). Las condiciones particularmente adecuadas pueden seleccionarse fácilmente por el facultativo experto de acuerdo con métodos convencionales. Como guía general, pueden usarse las siguientes soluciones acuosas tamponadas: NaCl 10-1200 mM, Tris/HCl 5-50 mM, pH 5-8, con adición opcional de catión o cationes divalentes y/o quelantes metálicos y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespuma y/o centelleantes.

"Condiciones esencialmente fisiológicas" se pretende que se refiera a, por ejemplo, un pH de 6,5 a 7,5, preferiblemente de 7,0 a 7,5 y/o una concentración de tampón de 10 a 50 mM, preferiblemente de 25 a 50 mM y/o una concentración de sales monovalentes (por ejemplo, Na o K) de 120 a 170 mM, preferiblemente 150 mM. Adicionalmente puede estar presente sales divalentes (por ejemplo, Mg o Ca) a una concentración de 1 a 5 mM, preferiblemente 1 a 2 mM, en las que más preferiblemente el tampón se selecciona del grupo que consiste en Tris-HCl o HEPES.

Las etapas de contacto de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención pueden, sin embargo, también realizarse ventajosamente en presencia de mayores concentraciones de sal (por ejemplo, hasta 1,2 M) para reducir la unión inespecífica de proteínas de fondo o a temperatura más baja (por ejemplo, 4ºC) para asegurar estabilidad de las proteínas y evitar agregación proteica.

Como se ha mencionado anteriormente, los métodos de la invención pueden incluir una etapa de eluir el analito del soporte sólido con o sin un compuesto unido a él. Preferiblemente, los componentes diana de la presente invención se eluyen del soporte sólido antes de combinarse en una muestra, basándose en la cual se realiza la etapa de detección.

Los métodos de elución adecuados se conocen principalmente en la técnica y dependen de la naturaleza de la interacción. Principalmente, los cambios de fuerza iónica, el valor de pH, la temperatura o la incubación con detergentes son adecuados para disociar el componente diana del analito del compuesto inmovilizado o el soporte sólido (en caso de interacción inespecífica). La aplicación de un tampón de elución puede disociar parejas de unión mediante valores pH extremos (pH alto o bajo; por ejemplo, disminución del pH mediante el uso de citrato 0,1 M, pH 2-3), cambio de fuerza iónica (por ejemplo, alta concentración de sal usando Nal, Kl, MgCl_{2} o KCl), agentes reductores de polaridad que interrumpen las interacciones hidrofóbicas (por ejemplo, dioxán o etilenglicol) o agentes desnaturalizantes (sales caotrópicas o detergentes tales como sodio-dodecil-sulfato (SDS); para una revisión, véase Subramanian A., 2002, Immunoaffinity chromatography. Mol. Biotechnol. 20(1), 41-47).

Con estos métodos bastante no específicos la mayoría o todos los componentes diana unidos del analito se liberarán y pueden por lo tanto analizarse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas (o como alternativa mediante cualquier otro método de detección adecuado, véase posteriormente).

Si el material de soporte está contenido dentro de una columna el material liberado puede recogerse como flujo continuo de columna. En caso de que el material de soporte se mezcle con el analito (denominado procedimiento de lote) una etapa de separación adicional tal como centrifugación suave puede ser útil o incluso necesaria y el material liberado se recoge como sobrenadante. Como alternativa, pueden usarse perlas magnéticas como soporte sólido de modo que las perlas pueden eliminarse de la muestra mediante el uso de un dispositivo magnético.

El experto apreciará que entre las etapas individuales de los métodos de la invención, pueden ser necesarias etapas de lavado. Dicho lavado es parte del reconocimiento del experto en la materia. El lavado sirve para eliminar componentes no unidos del analito del soporte sólido. Las interacciones de unión inespecífica (por ejemplo iónica simple) pueden minimizarse mediante la adición de niveles bajos de detergente o mediante ajustes moderados de las concentraciones de sal en el tampón de lavado.

La identificación y cuantificación de los componentes diana eluidos se basa en localización de señal resuelta espacialmente y la magnitud de señal. Pueden usarse muchas tecnologías de dispositivos diferentes que pueden resolver espacialmente una magnitud de señal o tasa de apariencia de señal para la detección de unión a componente diana.

Estos métodos pueden emplearse en cualquiera de los métodos de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, detección de fluorescencia a partir de componentes diana marcados, intercaladores fluorescentes, agentes de uniones de hendidura fluorescente, balizas moleculares, radioisótopos, potenciales de superficie, productos de colores, dianas marcadas con enzimas, dianas marcadas con anticuerpos y dianas marcadas con partículas de oro.

Preferiblemente, los componentes diana eluidos se detectan preferiblemente usando métodos de detección de radiactividad, métodos de detección de fluorescencia, métodos de detección de luminiscencia, métodos de detección de tinción, métodos de detección enzimática y espectrometría de masas.

En una realización preferida, los componentes diana eluidos se detectan, es decir, caracterizan y cuantifican, mediante espectrometría de masas.

La identificación de proteínas con análisis espectrométrico de masas (espectrometría de masas) se conoce en la técnica (Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858; Mann et al., 2001, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annual Review of Biochemistry 70, 437-473) y se ilustra adicionalmente en la sección ejemplo.

Los componentes diana en el analito se marcan ventajosamente con un marcador detectable. Como se ha mencionado anteriormente, en una realización preferida de los métodos de la invención el marcador detectable es diferente en cada alícuota del analito.

El procedimiento SILAC (marcaje del isótopo estable con aminoácidos en cultivo celular) establecido para análisis de proteína cuantitativo mediante espectrometría de masas puede usarse en este sentido. Por ejemplo, tres poblaciones de células pueden estar codificadas por SILAC usando tres combinaciones distintas de arginina y lisina marcadas con isótopos (Arg^{0}/Lys^{0}, Arg^{6}/Lys^{4}, Arg^{10}/Lys8). Sin embargo, los métodos o etapas de la presente invención también pueden combinarse con cualquier otra estrategia para cuantificación de proteínas mediante espectrometría de
masas.

Otros marcadores detectables pueden, sin embargo, emplearse también en los métodos de la invención. Por ejemplo, los marcadores detectables adecuados se seleccionan del grupo de radiomarcadores, tales como ^{13}C, ^{32}P ^{35}S ^{3}H, ^{129}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y similares, marcadores de tinción, marcadores que pueden detectarse con anticuerpos, marcadores enzimáticos y marcadores que tienen una masa detectable. Se describen ejemplos para el uso de espectroscopía de masas en análisis proteómico en Ho Y, et al. (sin marcadores) ("Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry" Nature 2002, Jan. 10; 415(6868): 180-3.); Gu S, et al. ("Precise peptide sequencing and protein quantification in the human proteome through in vivo lysine-specific mass tagging". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003, Jan; 14(1):1-7) y Williams C y Addona TA ("The integration of SPR biosensors with mass spectrometry: possible applications for proteome analysis." Trends Biotechnol. 2000 Feb; 18(2):45-8).

El marcador del componente diana también puede seleccionarse de marcadores fosforescentes, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, fosfatasa, avidina, estreptavidina, biotina, marcadores por el método de TAP y peroxidasas. Además de TAG, otros marcadores son diana Arg, péptido de unión a calmodulina, péptido de unión a celulosa, DsbA, etiqueta c-myc, glutatión S-transferasa, etiqueta FLAG, etiqueta HAT, etiqueta His, proteína de unión a maltosa, NusA, etiqueta S, etiqueta SBP, etiqueta Strep y tioredoxina. Los usos de estas etiquetas se describen exhaustivamente en la bibliografía (por ejemplo, en Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Jan; 60(5):523-33).

Como se ha indicado previamente en la presente memoria, los métodos de la invención pueden realizarse al completo o al menos en parte de un modo de alto rendimiento.

Los métodos de la presente invención permiten la determinación de valores K_{d} para todos los componentes diana identificados en el intervalo de concentración cubierto por diferentes concentraciones de compuesto (densidades) del compuesto inmovilizado. Para los componentes diana con afinidad muy alta, puede estimarse que los valores de K_{d} son más bajos que los correspondientes a la concentración de compuestos inmovilizados más baja, mientras que para dianas de interacción bastante débil con menos de el 50% de unión a la concentración de compuesto más alta, puede concluirse que los valores K_{d} están por encima de un cierto umbral. Además de recuperar información cuantitativa acerca de sensibilidades de proteína diana al compuesto inmovilizado, los agentes de unión de fondo pueden distinguirse fácilmente de las proteínas diana retenidas específicamente.

La presente invención resuelve los principales defectos de procedimientos proteómicos químicos previos basados en purificaciones por afinidad de inhibidor inmovilizado. Usando extracto de células HeLa, el análisis químico cuantitativo descrito de V16742 inmovilizado dio como resultado la determinación de K_{d} para 131 dianas celulares que incluyen 96 proteína quinasas identificadas y cuantificadas mediante espectrometría de masas (Figura 2b y Tabla 1). La distribución de dianas de quinasa identificadas en el árbol del quinoma sugiere que V16742 es un inhibidor bastante no selectivo (Figura 2d). Las dianas no quinasa también pueden identificarse por el método de la invención. Los métodos de la invención pueden adaptarse para cualquier tipo de ligando de afinidad, que puede inmovilizarse en un soporte sólido.

Para confirmar los resultados de espectrometría de masas, los lisados totales de células HeLa se sometieron a IVA1 e IVA2 con perlas de control o perlas V16742. Las proteínas retenidas en las perlas se inmunotransfirieron con anticuerpos específicos para JNK2, RIPK2, ERK2 y ROCK2, variando las afinidades de dianas de altas a muy bajas como se identificó/predijo mediante espectrometría de masas. Las quinasas interactuaron específicamente con la matriz de V16742 (Figura 2c) con patrones de acuerdo con los predichos por el diseño experimental (Figura 1) así como los datos cuantitativos obtenidos mediante la espectrometría de masas (Tabla 1).

La información de los valores K_{d} diana para un inhibidor inmovilizado permite adicionalmente establecer una plataforma proteómica química cuantitativa para un análisis de selectividad rápido de compuestos de ensayo libres contra esas dianas, que se retienen por el inhibidor inmovilizado. Para establecer este enfoque de exploración, se añadieron concentraciones crecientes del inhibidor de quinasa SB203580 a asociaciones in vitro con lisados celulares marcados diferencialmente con SILAC y el inhibidor bastante no selectivo V16742 inmovilizado a la densidad más alta (Figura 3a). Se ensayaron diferentes concentraciones (100 nM, 1 \muM, 10 \muM, 100 \muM) de SB203580 con respecto a su capacidad para competir con la interacción entre la lista completa de dianas quinasa/no quinasa y V16742 inmovilizada. La prevención dependiente de dosis de unión de proteínas diana SB203580 al inhibidor inmovilizado se midió mediante MS cuantitativa y pudo usarse para determinar las concentraciones IC_{50} específicas de diana para SB203580, a las que el compuesto libre inhibió la unión a V16742 inmovilizada en un 50%. Los espectros representativos para la RIPK2, la diana que compite más fuertemente con SB203580 con respecto a su interacción con V16742 inmovilizada, se muestra en la Figura 3b. Posteriormente, usando la ecuación clásica de Cheng-Prusoff, los valores IC_{50} para SB203580 y los valores K_{d} previamente determinados para V16742 inmovilizada se pudieron usar para determinar los valores K_{d} para dianas SB203580 representadas en la resina de afinidad V16742 (Tabla 2).

Una vez más, los resultados de espectrometría de masas se confirmaron mediante inmunotransferencia. Las reacciones IVA en presencia de concentraciones crecientes de SB203580 se exploraron con anticuerpos específicos para RIPK2, GAK, CK1\alpha, GSK3\beta y JNK2 las dianas de SB203580 identificadas/predichas por espectrometría de masas. La interacción entre las quinasas y la V16742 inmovilizada competía específicamente con SB203580 de un modo dependiente de dosis (Figura 3c) validando los resultados de espectrometría de masas cuantitativa (Tabla 2) añadiendo de este modo a la prueba de hipótesis.

Así pues, una vez que se han determinado los valores K_{d} para unión a proteína diana de un inhibidor o inhibidores de quinasa no selectivos (o una combinación de no selectivos) para las proteínas en un extracto biológico mediante la estrategia proteómica química descrita anteriormente, esta información puede usarse para establecer un panel de selectividad, en el que todas las proteínas retenidas pueden ensayarse rápidamente con respecto a sus sensibilidades a compuestos de interés (que no tienen que estar ellos mismos inmovilizados).

Usando la tecnología proteómica química de acuerdo con los métodos de la presente invención, las moléculas candidatas, sus dianas moleculares, mecanismos de acción, selectividad y eficacia puede evaluarse al mismo tiempo, mejorando así dramáticamente el procedimiento de descubrimiento de fármacos y disminuyendo la tasa de desgaste de los compuestos en trayectos de desarrollo clínicos.

El uso de compuestos tipo fármaco inmovilizados en un soporte sólido como sondas de afinidad para identificar y cuantificar la unión de proteínas directamente desde lisados celulares o muestras tisulares ofrece la ventaja de identificar las proteínas que son inherentemente susceptibles de convertirse en fármacos. Así pues, la aplicación de esta tecnología para buscar nuevos miembros de una familia diana da como resultado no sólo la identificación de nuevos miembros diana sino también la identificación de compuestos de alta afinidad altamente selectivos para la diana.

La presente invención describe el uso de los métodos descritos en la presente memoria como una herramienta general de descubrimiento de fármacos. Este enfoque proteómico químico facilita el entendimiento de dianas proteicas funcionales y proporciona herramientas para diseccionar complejos procesos celulares.

La presente invención describe el uso de los métodos descritos y reivindicados en la presente memoria para la identificación de nuevas indicaciones para fármacos aprobados existentes. Con el propósito de ilustrar considérese un fármaco que es un inhibidor de quinasa. Dado el gran número de quinasas que se espera que existan, es altamente probable que este compuesto inhiba otras dianas de quinasas oportunistas implicadas en patologías de más amplio impacto. Por lo tanto, es razonable predecir que el potencial de mercado de este compuesto podría aumentar en gran medida.

La presente invención describe adicionalmente el uso de los métodos descritos y reivindicados en la presente memoria para definir el mecanismo de acción de un candidato temprano a fármaco. En el escenario en el que un candidato a fármaco muestra un efecto biológico interesante, pero para el que se desconoce el mecanismo molecular general, la tecnología puede usarse para permitir una optimización racional de la actividad. Por ejemplo, si una compañía tiene una molécula candidata pequeña o una clase de moléculas que muestran un efecto biológico interesante y eficacia en un modelo de enfermedad dado, pero el mecanismo exacto de acción no se entiende, la identificación de dianas de efecto relacionado servirá para facilitar su desarrollo a fármacos. Si los datos de relación estructura-actividad están disponibles, pueden identificarse regiones de la molécula que pueden modificarse sin suprimir la actividad biológica. La inmovilización de este candidato a fármaco permite que un análisis proteómico identifique la diana o dianas del compuesto. La información de este tipo es de tremendo valor en el procedimiento de optimización, especialmente cuando la diana de interés es responsable del diseño de fármaco basado en estructura.

La presente invención describe adicionalmente el uso de los métodos descritos y reivindicados en la presente memoria para su perfilación ADME/Tox. La tecnología descrita en la presente memoria puede usarse para generar perfiles de toxicidad y evaluar las propiedades ADME de candidatos a fármaco antes de que se introduzcan a la clínica. Las propiedades farmacocinéticas de un candidato a fármaco pueden evaluarse mediante la exposición del compuesto o clase de compuesto a una batería/panel de proteomas relevantes ADME/Tox (es decir, proteínas de unión a suero para su uso en, por ejemplo, la evaluación de biodisponibilidad de un fármaco potencial), que proporciona información importante útil en la priorización de candidatos y las etapas de optimización de candidatos. Dadas las varias posibles clases de candidatos a llevar a optimización de candidatos, una rápida evaluación de las propiedades de cada clase ayuda al químico a seleccionar en que clase centrarse. La clase con mayor probabilidad de tener buenas propiedades ADME tiene más probabilidad de generar un candidato a fármaco que tiene las propiedades deseadas para el desarrollo de fármaco. De igual modo, el conocimiento de las dianas secundarias y terciarias para dichos compuestos reducirá la aparición de efectos secundarios potencialmente tóxicos, incrementando de este modo la tasa de éxito del desarrollo clínico. En general, esta técnica puede usarse como un filtro para priorizar qué compuestos deben llevarse a estudios farmacocinéticos y toxicológicos más rigurosos y caros.

Así pues, los métodos para cuantificación en todo el proteoma de unión de moléculas pequeñas a proteínas diana celulares descritos y reivindicados en la presente memoria pueden aplicarse para resolver problemas fundamentales y proporcionar servicios a la industria farmacéutica.

La invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, que no deben considerarse como limitantes para el campo de la protección conferida por las reivindicaciones de la presente solicitud.

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Ejemplo 1

Síntesis de Compuestos y Unión Covalente

El inhibidor de quinasa V16742 se sintetizó en base a las rutas sintéticas descritas. El inhibidor (V16742) se unió a perlas de Sefarosa epoxi activadas a tres diferentes concentraciones y la concentración relativa de inhibidor inmovilizado covalentemente en las resinas específicas se determinó mediante espectrometría (aquí 1, 5 y 25 veces la concentración más baja).

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Ejemplo 2

Cultivo Celular y Experimentos de Asociación In Vitro

Para el marcaje de isótopo estable con aminoácidos en cultivo celular (SILAC), se cultivaron células HeLa S3 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal dializado al 10% (Invitrogen) y L-arginina (Arg^{0}) a 42 mg I^{-1} y L-lisina (Lys^{0}) a 71 mg I^{-1} no marcadas o cantidades equimolares de las variantes isotópicas L-arginina-U-^{13}C_{6} (Arg^{6}) y L-lisina-^{2}H_{4} (Lys^{4}) o L-arginina-U-^{13}C_{6}-^{14}N_{4} (Arg^{10}) y L-lisina-^{13}C_{6}-^{15}N_{2} (Lys^{8}) (de Cambridge Isotope Laboratories).

Usando las tres poblaciones de células marcadas con SILAC y las tres diferentes resinas inhibidoras, se realizaron dos experimentos paralelos denominados IVA1 (Asociación In Vitro, Composición 1) e IVA2 (Asociación In Vitro, Composición 2). Para la asociación in vitro con perlas de afinidad del inhibidor, se lisaron células HeLa marcadas diferencialmente en tampón que contenía HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,5%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM más aditivos. Después de la centrifugación, los lisados se ajustaron a NaCl 1 M antes de la asociación in vitro de 3 mg de lisado de alto contenido salino con 30 \mul de matriz V16742 drenada o matriz control según el esquema representado en la Figura 1 durante 2,5 horas a 4ºC. En IVA1 las resinas con inhibidor inmovilizado a tres diferentes concentraciones (siendo las concentraciones finales 50 \muM, 8,74 \muM y 1,87 \muM en la reacción) se incubaron con lisados celulares de células HeLa marcadas diferencialmente. En IVA2, los lisados de células HeLa codificados con SILAC se sometieron a dos ciclos paralelos de purificación por afinidad consecutiva a la mayor densidad de ligando en los que el sobrenadante remanente después de la primera IVA se usó para el segundo ciclo de IVA. Una incubación adicional de lisado de células HeLa con perlas de control desprovistas de inhibidor inmovilizado también se realizó para distinguir agentes de unión de fondo. Después de tres etapas de lavado con tampón de lisis (dos veces con tampón de lisis que contenía NaCl 1 M y una vez con tampón de lisis) las perlas se eluyeron con 30 \mul de tampón de muestra LDS 1,5x a 70ºC durante 10 minutos para liberar el material unido a resina.

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Ejemplo 3

Experimentos IVA en Presencia del Competidor SB203580

Los lisados de células marcadas diferencialmente con SILAC se preincubaron con concentraciones crecientes del inhibidor de quinasa SB203580 (0 nM, 100 nM, 1 \muM, 10 \muM, 100 \muM) durante 30 minutos a 4ºC en la oscuridad. Estos lisados se sometieron después a asociaciones in vitro con las perlas inhibidoras de alta densidad (V16742) durante 2,5 horas a 4ºC. Las muestras se procesaron después como se ha descrito anteriormente.

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Ejemplo 4

Preparación de Muestra para Espectrometría de Masas

Los eluatos de cromatografía de afinidad se combinaron y resolvieron mediante electroforesis en geles preparados (NuPage Bis-Tris al 4-12%, Invitrogen) y se visualizaron mediante tinción coloidal de Coomassie (Shevchenko, A., et al., Nat. Protoc. 1, 2856-60 (2006)). Los geles se cortaron después en 3 láminas, seguido de digestión en el gel con tripsina y extracción de péptidos con StageTips (Rappsilber, J. et al., Nat. Protoc. 2, 1896-906 (2007); Olsen, J. V. et al., Cell 127, 635-48 (2006)).

Ejemplo 5

Análisis por Inmunotransferencia

La inmunotransferencia de los eluatos de cromatografía de afinidad de las composiciones IVA1 o IVA2 se realizó con los siguientes anticuerpos: anti-caseína quinasa I\alpha de conejo, anti-JNK2 de conejo, anti-ROCK-II de conejo (todos de Cell Signaling Technology, Inc.), anti-GSK3\beta, anti-RIPK2, anti-GAK, anti-ERK2 (Santa Cruz).

Las reacciones IVA de lisados celulares HeLa con perlas V16742 inmovilizadas se realizaron en presencia de concentraciones crecientes de SB203580 (0 nM, 100 nM, 1 \muM, 10 \muM, 100 \muM). Para validar los resultados de espectrometría de masas, las proteínas unidas eluidas de la matriz se inmunotransfirieron con anticuerpos específicos contra las dianas de SB203580 concretamente JNK2, RIPK2, ERK2 y ROCK2.

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Ejemplo 6

Análisis Espectrométrico de Masas

Todos los análisis espectrométricos de masas (MS) se realizaron con un sistema HPLC de nanoflujo (Agilent Technologies 1100, Waldbronn, Alemania) conectado a espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap híbrido (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización (Proxeon Biosystems, Odense, Dinamarca) esencialmente como se ha descrito (Olsen, J. V. et al., Cell 127, 635-48 (2006)). Brevemente, el péptido tríptico y las mezclas fosfopeptídicas se separaron en una columna analítica de 15 cm (diámetro interior de 75 \mum) empaquetada interiormente con perlas C18 de 3 \mum (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch) con un gradiente de 2 horas de acetonitrilo del 5 al 40% en ácido acético al 0,5%. El efluente del HPLC se electropulverizó directamente en el espectrómetro de masas. El instrumento de MS se operó en modo dependiente de datos para que cambiara automáticamente entre MS de exploración completa y adquisición de MS/MS. Se obtuvieron espectros de MS de exploración completa en el estudio (de m/z 300 a 2000) en el orbitrap con resolución R=60.000 a m/z 400 (después de la acumulación hasta un "valor diana" de 1.000.000 en la trampa iónica lineal). Los cinco iones peptídicos más intensos con estados de carga \geq 2 se aislaron secuencialmente hasta un valor diana de 5.000 y se fragmentaron en la trampa iónica lineal mediante activación multietapa (MSA o seudo MS^{3}) (Olsen, J. V. et al., Cell 127, 635-48 (2006); Schroeder, M.J. et al., Anal. Chem. 76, 3590-8 (2004)). Todos los espectros iónicos de fragmentos se registraron en la parte LTQ del instrumento. Para todas las mediciones con el detector orbitrap, se usó un ión de masa fija de aire ambiental (m/z 429,08875) para calibración interna como se ha descrito (Olsen, J. V. et al., Mol. Cell Proteomics 4, 2010-21 (2005)). Las condiciones espectrométricas de masa típicas fueron: tensión de pulverización, 2,4 kV; flujo de gas sin envoltura y auxiliar; temperatura capilar caliente, 150ºC; energía de colisión normalizada 35% para MSA en LTQ. El umbral de selección iónica fue de 500 conteos para MS^{2}. Se usaron un q de activación = 0,25 y un tiempo de activación de 30 ms.

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Ejemplo 7

Identificación y Cuantificación de Péptidos

La lista de picos MS/MS se extrajeron de los archivos MS sin procesar y se exploraron mediante MASCOT contra una base de datos diana/señuelo concatenada (Elias et al., Nat. Methods 2, 667-75 (2005)) consistente en una versión directa y reversa combinada de la base de datos humana IPI versión 3.19. La tolerancia de masa inicial en el modo MS se ajustó a 25 ppm y la tolerancia de masa MS/MS fue de 0,5 Da. Se buscó la carbamidometilación de cisteína como una modificación fija, mientras que la N-acetil proteína, N-piroglutamina, metionina oxidada, fosforilación de serina, treonina y tirosina y marcadores SILAC en arginina y lisina se buscaron como modificación variable. El archivo de salida html MASCOT se enlazó a los archivos MS sin procesar y se cargaron en el software MSQuant (http://msquant.sourceforge.net). Para minimizar la tasa de falso descubrimiento (FDR), se filtraron todas las identificaciones peptídicas mediante umbrales de error de masa y puntuación MASCOT. Se aceptaron péptidos basándose en el criterio de que el número de aciertos directos en la base de datos era al menos 200 veces mayor que el número de aciertos inversos en la base de datos (secuencias peptídicas incorrectas), lo que da un FDR estimado de menos del 1% (p<0,01) (Elias et al., Nat. Methods 2, 667-75 (2005)). Los criterios finales de filtrado a los que p < 0,01 era error de masa < 5 ppm (todos los experimentos), puntuación MASCOT \geq 16 (IVA 1 e IVA2; experimento 1) puntuación de MASCOT \geq 18 (IVA1, experimento 2), puntuación de MASCOT \geq 17 (IVA1, experimento 2) o puntuación de MASCOT \geq 12 (experimento de competición 1 y 2). MSQuant calculó la relación media sobre el tiempo de elución del péptido y las tareas usadas para cuantificación se presentaron visualmente y se validaron. En particular, los criterios de validación incluyeron que el péptido se identificara en la forma correcta SILAC (pesada, media o ligera) y contuviera el número correcto de restos de lisina y arginina especificados por la diferencia de masas observado en la exploración completa entre las parejas de SILAC.

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Ejemplo 8

Análisis de los Datos

Se asignó un molde identificador IPI común a péptidos basándose en el archivo de salida html MASCOT para la composición IVA2 en el primer experimento. Los aciertos de proteínas identificados basándose en péptidos únicos se filtraron con respecto a error de masas y puntuación de MASCOT. Eventualmente, los aciertos identificados tanto en el primer como en el segundo experimentos IVA2 se cuantificaron para la composición IVA2 del primer experimento mediante MSQuant. Después se separaron por filtración los agentes de unión de fondo que mostraron más de un 25% de unión a las perlas de control en comparación con la unión observada en perlas de ligando de alta densidad. Se hizo un siguiente ciclo de clasificación para separar por filtración los aciertos de proteínas que estaban enriquecidas en menos de un 50% en el segundo ciclo IVA en comparación con el primer ciclo IVA. Esto se debe a que en un enriquecimiento por debajo del 50% podía haber errores significativos en la deducción de valores Kd para las dianas correspondientes. Para las dianas que estaban específicamente enriquecidas en IVA2 del experimento 1, las relaciones que representaban unión de proteínas diana a diversas concentraciones de ligando (V16742) (composición IVA1) se obtuvieron después mediante MSQuant. Se cuantificó también el mismo conjunto de dianas en las composiciones IVA2 e IVA1 de un segundo experimento independiente.

Para los experimentos de competición con SB203580, los análisis de datos eran esencialmente similares a los de los experimentos IVA y las relaciones obtenidas a través de MSQuant se representaron de acuerdo con el molde identificador común IPI. Se seleccionaron después proteínas diana que mostraron al menos un 50% menos de unión a la concentración de competidor más alta de 100 \muM en comparación con la reacción IVA control con perlas de ligando de alta densidad en ausencia de SB203580. Para estas dianas seleccionadas, las relaciones que representaban competición a SB203580 1 \muM y 0,1 \muM también se obtuvieron mediante MSQuant.

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Ejemplo 9

Determinación de Constantes de Unión

Las relaciones obtenidas de los experimentos IVA1 e IVA2 se convirtieron a porcentajes de unión a diferentes densidades de ligando. Los valores K_{d} se determinaron usando software SIGMA PLOT, módulo de Unión de Ligando usando ecuación para una saturación de sitio con unión máxima ajustada al 100%. El valor K_{d} para dianas individuales calculado a partir de dos experimentos independientes generalmente estaba dentro de dos veces.

La prevención dependiente de dosis de la unión de las proteínas diana SB203580 al inhibidor inmovilizado medida por MS cuantitativa pudo representarse como curvas de dosis-respuesta. Los datos se ajustaron a ecuación de competición de un sitio usando SIGMAPlot para determinar la CI_{50} específica de diana para SB203580. Posteriormente, los valores de CI_{50} para SB203580 y los valores de K_{d} determinados previamente para V16743 inmovilizada pudieron usarse para determinar los valores de K_{d} para dianas SB203580 representadas en la resina de afinidad V16742, de acuerdo con la fórmula:

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5324633 A [0006]

\bullet WO 0171732 A [0045]

\bullet US 2007087348 A1 [0006]

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

\bulletFabian, M.A. et al. Nat. Biotechnol., 2005, vol. 23, 329-36 [0004] [0008]

\bulletDavies, S.P. et al. Biochem. J., 2000, vol. 351, 95-105 [0004]

\bulletGodl et al. Proc Natl Acac Sci U S A., 23 December 2003, vol. 100 (26), 15434-9 [0006]

\bulletAnnis DA et al. J Am Chem Soc., 01 December 2004, vol. 126 (47). 15495-503 [0006]

\bulletValsasina B et al. give an overview on some examples of kinase selectivity profiling by inhibitor affinity chromatography. Expert Rev Proteomics, October 2004, vol. 1 (3), 303-15 [0006]

\bulletAnnis DA et al. Anal Chem., 15 June 2007, vol. 79 (12), 4538-42 [0006]

\bullet C.R. Lowe. Eur. J. Biochem., 1974, vol. 42, 1-6 [0007]

\bulletDaub, H. et al. Assay Drug Dev. Technol., 2004, vol. 2, 215-24 [0008]

\bulletGodl, K. et al. PNAS U.S.A, 2003, vol 100, 15434-9 [0006]

\bulletBrehmer, D. et al. Cancer Res., 2005, vol. 65, 379-82 [0003]

\bulletDaub, H. Biochim. Biophys. Acta, 2005, vol. 1754, 183-90 [0008]

\bulletSubramanian A. Immunoaffinity chromatography. Mol. Biotechnol., 2002, vol. 20 (1), 41-47 [0081]

\bulletShevchenko et al. Analytical Chemistry, 1996, vol. 68, 850-853 [0089]

\bulletMann et al. Analysis of proteins ard proteomes by mass spectromstry. Annual Review of Biochemistry, 2001, vol. 70, 437-473 [0089]

\bulletHo Y et al. Systematic identification of pratein complexes in Saccharcmyces cerevisiae by mass Spectrometry. Nature, 10 January 2002, vol. 415 (6868), 180-3 [0092]

\bulletGu S et al. Precise peptide sequencing ard protein quantification in the human proteome through in vivo lysine-specific mass tagging. J. Am. Soc. Mass Spectrom, January 2003, vol. 14 (1), 1-7 [0092]

\bulletWilliams C; Addona TA, The integration of SPR biosensors with mass spectrometry: possible applications for proteome analysis. Trends Biotechnol., February 2000, vol. 18 (2), 45-8 [0092]

\bulletTerpe K. Appl. Microbiol. Biotechnol., January 2003, vol. 60 (5), 523-33 [0093]

\bulletShevchenko, A. et al. Nat. Protoc., 2006, vol. 1, 2856-60 [0113]

\bulletRappsilber, J. et al. Nat. Protoc., 2007, vol. 2, 1896-906 [0113]

\bulletOlsen, J.V. et al. Cell, 2006, vol. 127, 635-48 [0113] [0116]

\bulletSchroeder, M.J. et al. Anal. Chem., 2004, vol. 76, 3590-8 [0116]

\bulletOlsen, J.V. et al. Mol. Cell Proteomics, 2005, vol. 4, 2010-21 [0116]

\bulletElias et al. Nat. Methods, 2005, vol. 2,667-75 [0117]

Claims (32)

1. Procedimiento para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto que comprende

(a)

poner en contacto una primera alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza el compuesto;

(b)

poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido como en (a), separando posteriormente la segunda alícuota del analito de dicho soporte sólido;

(c)

poner de nuevo en contacto el analito separado de la etapa (b) con un soporte sólido como en (a);

(d)

determinar las cantidades del componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (c); y

(e)

comparar la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (a) con la cantidad de componente diana unido al soporte sólido de la etapa (c).

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2. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente poner en contacto una tercera alícuota de dicho analito con un soporte sólido como en (a), que no tiene, sin embargo, dicho compuesto inmovilizado en él y determinar la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido;

en el que la etapa (e) comprende adicionalmente comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (c) con la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido que no tiene dicho compuesto inmovilizado en él.

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3. Procedimiento para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto que comprende

(a)

poner en contacto una primera alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza el compuesto;

(b)

poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido como en (a) en el que dicho compuesto está, sin embargo, inmovilizado a una concentración más alta que en (a);

(c)

opcionalmente poner en contacto una tercera alícuota del analito con un soporte sólido como en (a) en el que dicho compuesto está, sin embargo, inmovilizado a una concentración mayor que en (b);

(d)

determinar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido de las etapas (a) y (b) y, si el procedimiento comprende la etapa (c), también la cantidad de componente diana unido al soporte sólido de la etapa (c); y

(e)

comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (b) y, si el procedimiento comprende la etapa (c), también la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (c).

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4. Procedimiento de la reivindicación 3, en el que la relación de las concentraciones en las que se inmoviliza el compuesto en el soporte sólido en las etapas (a) y (b) se selecciona de las relaciones de aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9 o aproximadamente 1:10.

5. Procedimiento de la reivindicación 3, en el que la relación de las concentraciones en las que el compuesto se inmoviliza en el soporte sólido en las etapas (a), (b) y (c) se selecciona de las relaciones de aproximadamente 1:2:4, aproximadamente 1:3:9, aproximadamente 1:4:16, aproximadamente 1:5:25, aproximadamente 1:6:36, aproximadamente 1:7:49, aproximadamente 1:8:64, aproximadamente 1:9:81 o aproximadamente 1:10:100.

6. Procedimiento de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende adicionalmente poner en contacto una cuarta alícuota de dicho analito con un soporte sólido como en (a) que, sin embargo, no tiene dicho compuesto inmovilizado en él y determinar la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido; donde la etapa (e) comprende adicionalmente comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (b) y, si el procedimiento comprende la etapa (c), también la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (c) con la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido que no tiene dicho compuesto inmovilizado en él.

7. Procedimiento para evaluar la afinidad de unión de un componente diana de un analito a un compuesto competidor que comprende

(a)

poner en contacto una primera alícuota del analito con un soporte sólido en el que se inmoviliza un compuesto, en donde dicho compuesto inmovilizado se une al componente diana con una afinidad de unión dada, realizándose el contacto en presencia de dicho compuesto competidor;

(b)

poner en contacto una segunda alícuota del analito con un soporte sólido como en (a) en presencia de dicho compuesto competidor, en donde la concentración de dicho compuesto competidor mayor que en (a);

(c)

poner en contacto opcionalmente una tercera alícuota del analito con un soporte sólido como en (a) en presencia de dicho compuesto competidor, en donde la concentración de dicho compuesto competidor mayor que en (b);

(d)

determinar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (b) y, si el procedimiento comprende la etapa (c), también la cantidad del componente diana unido al soporte sólido en la etapa (c); y

(e)

comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (b) y, si el procedimiento comprende la etapa (c), también la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (c).

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8. Procedimiento de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente poner en contacto una cuarta alícuota de dicho analito con un soporte sólido como en (a), en el que el contacto se realiza, sin embargo, en ausencia de dicho compuesto competidor;

en el que la etapa (e) comprende adicionalmente comparar las cantidades de componente diana unido al soporte sólido en las etapas (a) y (b) y, si el procedimiento comprende la etapa (c), también la cantidad de componente diana unido al soporte sólido en la etapa (c) con la cantidad de componente diana unido a dicho soporte sólido en ausencia de dicho compuesto competidor.

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9. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los componentes diana del analito se marcan con un marcador detectable.

10. Procedimiento de la reivindicación 9, en el cual dicho marcador detectable es diferente en cada alícuota.

11. Procedimiento de las reivindicaciones 9 ó 10, en el cual los componentes diana del analito son péptidos o proteínas, dicho marcaje se realiza mediante el procedimiento SILAC (marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular) y en el cual dicha determinación de acuerdo con la etapa (d) se realiza mediante análisis cuantitativo de proteína a través de espectrometría de masas.

12. Procedimiento de las reivindicaciones 10 u 11, en el cual la determinación de la etapa (d) se realiza combinando dichos componentes diana unidos en una muestra y detectando las cantidades de los componentes diana diferencialmente marcados en dicha muestra.

13. Procedimiento de la reivindicación 12, en el cual los componentes diana se eluyen del soporte sólido antes de combinarse en dicha muestra.

14. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la comparación de la etapa (e) se usa para determinar la afinidad de unión del componente diana al compuesto.

15. Procedimiento de la reivindicación 14, en el cual la comparación de la etapa (e) se usa para determinar el valor CI_{50} de dicho compuesto competidor.

16. Procedimiento de las reivindicaciones 14 ó 15, en el que la comparación de la etapa (e) se usa para determinar el valor K_{d} de la unión de dicho compuesto inmovilizado y/o dicho compuesto competidor a dicho componente diana.

17. Procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho compuesto inmovilizado es un inhibidor de quinasa no selectivo o una combinación de inhibidores de quinasa no selectivos.

18. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el compuesto está presente durante dichas etapas de contacto en un exceso molar en comparación con el componente diana.

19. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual dichas etapas de contacto se realizan simultáneamente.

20. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el analito se selecciona del grupo que consiste en un proteoma, una mezcla de diferentes proteomas, un extracto o lisado celular, un extracto o lisado tisular, un sobrenadante de cultivo celular, un sobrenadante de cultivo tisular o un fluido corporal.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el proteoma está presente en o se deriva de una célula única o un cultivo celular, una mezcla de células, un tejido, un órgano o un organismo.

22. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual dicho compuesto unido al soporte sólido y/o dicho compuesto competidor se selecciona de enzimas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, oligo o polisacáridos, proteoglicanos, entidades químicas, moléculas pequeñas, fármacos, metabolitos o profármacos.

23. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual dicho compuesto inmovilizado está presente en una concentración definida en el soporte sólido.

24. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en filtros, portaobjetos de vidrio, superficies de silicio, perlas y una microserie química adaptada.

25. Procedimiento de la reivindicación 24, en el cual dichas perlas son perlas de sefarosa, opcionalmente epoxi-activadas o NHS-activadas o perlas de agarosa.

26. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el compuesto inmovilizado se inmoviliza en el soporte sólido mediante adsorción, absorción, enlace iónico, enlace covalente, un grupo amino o grupo carboxi o grupo hidroxi, interacciones (strept)avidina-biotina o tiol-oro.

27. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en radiomarcadores, marcadores de tinción, marcadores que pueden detectarse con anticuerpos, marcadores enzimáticos, marcadores fosforescentes, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, fosfatasas, avidina, estreptavidina, biotina, TAP, peroxidasas y marcadores que tienen una masa detectable.

28. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual dicho contacto se realiza esencialmente en condiciones fisiológicas.

29. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual dicho contacto se realiza usando un tampón adecuado y, opcionalmente, un cofactor tal como NAD+/NADH, GMPc, NADP+/NADPH, ATP, ADP o AMPc.

30. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 y 12-29, en el cual la determinación de acuerdo con la etapa (d) comprende detectar el marcador mediante un método seleccionado de métodos de detección de radioactividad, métodos de detección de fluorescencia, métodos de detección de luminiscencia, métodos de detección de tinción, métodos de detección enzimática y espectrometría de masas.

31. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho procedimiento evaluar simultáneamente la unión de una multitud de componentes diana del analito al compuesto inmovilizado y/o al compuesto competidor.

32. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho procedimiento se realiza en su totalidad o al menos en parte de una manera de alto rendimiento.