ES2347739T3 - Nuevos retinoides y su uso. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto retinoide que es un isómero 9(Z) o un todo(E) con la estructura: **(Ver fórmula)** en la que R1 es fenilo, bencilo, alquilo cíclico C3-C8, arilo o arilalquilo; R2 es hidrógeno, etilo, metilo, n-propilo o isopropilo y n es de 0 a 3.
Description
Nuevos retinoides y su uso.
Esta invención se realizó en parte usando fondos
suministrados por el gobierno de los EE.UU. con la subvención PO1
CA34968. Por consiguiente, el gobierno de los EE.UU. tiene ciertos
derechos en esta invención.
La presente invención se refiere en general a
los campos de la química y el tratamiento del cáncer. Más
específicamente, la presente invención se refiere a nuevos
retinoides y su uso en la quimioprevención y tratamiento del
cáncer.
En las descripciones químicas que siguen, se
puede considerar que E es sinónimo de trans y Z
se puede considerar sinónimo de cis. Los receptores
retinoides y otros miembros de esta superfamilia de receptores
nucleares (que incluyen los receptores de hormonas esteroideas,
tiroideas y de vitamina D y otros receptores "huérfanos" sin
ligandos conocidos) son nuevos objetivos para el desarrollo de
fármacos (1). Se cree que el ácido retinoico (AR) y los retinoides
sintéticos actúan como factores de transcripción dependientes de
ligandos con diferentes miembros de receptores de retinoides
nucleares para controlar la transcripción génica responsable de la
proliferación celular, diferenciación, desarrollo y muerte celular
(2). Hasta ahora se han identificado dos clases de receptores
retinoides nucleares (los RAR y los RXR) y cada uno presenta
diversos subtipos diferentes (\alpha, \beta, \gamma). Tanto
(todos E)- como (9Z)-AR se unen a los RAR y
activan la transcripción mediada por heterodímeros RAR/RXR, pero
(9Z)-AR es el único ligando natural conocido para
los RXR que median la transcripción mediante la formación de
homodímeros o heterodímeros.
Los recientes avances en la quimioprevención han
aumentado el interés por el uso de retinoides en diversos tipos de
tumores de órganos sólidos y se han demostrado mayores éxitos
terapéuticos con retinoides en ciertas leucemias (3). El
tratamiento con (todos E)-AR de pacientes con
leucemia promielocítica aguda (APL, por sus siglas en inglés)
conduce a un índice de remisión completa del 90% en estos pacientes
por inducción de maduración normal y apoptosis de mieloblastos APL
a neutrófilos, pero este tratamiento de diferenciación es
transitorio y es seguido comúnmente por recaída dentro de los
3-15 meses, probablemente debido al desarrollo de
resistencia al ácido retinoico (4). El (13Z)-AR
controla eficazmente la excesiva mieloproliferación en hasta el 50%
de los niños con leucemia mielomonocítica juvenil (JMML, por sus
siglas en inglés) (5). Sin embargo, este tratamiento no es curativo
y a lo sumo puede conducir a un periodo de estabilización prolongada
de la enfermedad pero los pacientes por último necesitan
experimentar transplante alogénico de médula ósea (4, 6).
El ácido retinoico todo-trans
(ATRA, por sus siglas en inglés) es el primer ejemplo de un agente
homologado por la FDA usado para tratamiento de diferenciación (más
bien que la quimioterapia citotóxica clásica del cáncer) de
pacientes con APL. Incluso aunque se ha demostrado que es muy eficaz
en el tratamiento de APL, la resistencia clínica con frecuencia
tiene lugar con dosis farmacológicas de ATRA y los pacientes de APL
con frecuencia sufren una recaída (Degos et al., 1.995,
Blood, 85, 2.643). Para proporcionar tratamientos más
eficaces, se requiere identificar nuevos retinoides altamente
activos con la esperanza de que dosis inferiores de estos agentes
no induzcan la recaída tan rápidamente como ATRA.
Los compuestos retinoides acetato de retinilo,
N-(4-hidroxifenil)retinamida,
retinilideno dimedona, N-etilretinami-
da y N-benzoilretinilamina demostraron actividad como inhibidores de transformación neoplásica inducida por metilcolantreno en líneas celulares de fibroblastos in vitro (Bertram, JS, 1.980, Cancer Research 40, 3.141-3.146). En un modelo de ratas la todo(E) N(4-hidroxifenil)retinamida demostró un efecto preventivo contra el cáncer de mama (Moon, et al., 1.979, Cancer Research 39, 1.339-1.346).
da y N-benzoilretinilamina demostraron actividad como inhibidores de transformación neoplásica inducida por metilcolantreno en líneas celulares de fibroblastos in vitro (Bertram, JS, 1.980, Cancer Research 40, 3.141-3.146). En un modelo de ratas la todo(E) N(4-hidroxifenil)retinamida demostró un efecto preventivo contra el cáncer de mama (Moon, et al., 1.979, Cancer Research 39, 1.339-1.346).
- Se han sintetizado homólogos de retinoides
9(Z) y todo(E) que están sustituidos en el anillo de
ciclohexenilo de ácido retinoico en el C5-C6 con
sustituyentes alquílicos o como combinados como sustituyentes
cicloalquílicos o cicloalquenílicos imitan el volumen estérico del
resto trimetilciclohexilo de retinoides sin pérdida de actividad
efectiva. Los compuestos particulares se sustituyen con hidrógeno,
restos metilo, etilo y/o isopropilo (Muccio et al., 1.996,
J. Med. Chem. 39, 3.625-3.635; Alan et
al., 1.995, J. Med. Chem. 38,
2.302-2.310 y Vaezi et al., 1.994, J. Med.
Chem. 37, 4.499-4.507). La patente de EE.UU.
A-5.094.783 describe homólogos de retinoides
adicionales donde los sustituyentes C5-C6 pueden ser
alcoxi o formar un resto cicloalquilo o cicloalquenilo.
La línea celular NB4, que se aisló de un
paciente APL que experimenta tratamiento con ATRA ofrece un
excelente modelo in vitro de APL. La traslocación
t(15, 17), que es característica de APL, se realiza de manera
estable en células NB4 y la proteína de fusión
PML/RAR-a se expresa en esta línea celular
transformada (Lanotte et al., 1.991, Blood, 77:
1.080). El tratamiento con ATRA de las células NB4 retira el bloque
PML/RAR-a para la diferenciación y permite que los
promielocitos maduren normalmente y mueran. El mecanismo por el que
el ATRA retira el bloque de diferenciación no se entiende bien. Las
pruebas recientes sugieren que el ATRA regula hacia la baja la
expresión de PML/RAR-a y restablece la
diferenciación mieloide normal (Raelson et al., 1.996,
Blood, 88, 2.826).
La técnica anterior es deficiente en agente
terapéuticos eficaces con los efectos beneficiosos del ácido
retinoico pero que presentan efectos secundarios reducidos. La
presente invención satisface esta antigua necesidad y deseo en la
técnica.
Según una realización, la presente invención se
refiere a un compuesto retinoide que es un isómero 9(Z) o un
todo(E) de una estructura que comprende:
en la que R_{1} es fenilo,
bencilo, alquilo cíclico C_{3}-C_{8}, arilo o
arilalquilo;
R_{2} es hidrógeno, etilo, metilo,
n-propilo o iso-propilo y n es de 0
a 3.
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Se proporciona un nuevo retinoide, UAB30, cuyo
isómero todo-E presenta diferente
selectividad de los receptores nucleares (retinoide selectivo de
subtipo RAR\beta y RAR\gamma y antagonista de RAR\alpha) que
(todo-E)-UAB8.
La presente invención también evalúa nuevos
retinoides restringidos de manera conformacional, denominados
retinoides UAB, en ensayos de diferenciación de células NB4 y se
identificó todo-trans-UAB8 con más potencia
que ATRA (Muccio et al., 1.998, J. Med. Chem. 41,
1.679). Para evaluar además su potencial en el tratamiento de APL,
se estudió su capacidad para inducir diferenciación de células NB4
en presencia de retinoides selectivos de RXR, que se ha demostrado
que mejoran la eficacia de ATRA (Chen et al., 1.996,
Nature, 382, 819). Además, se identificaron y se usaron
retinoides UAB que disocian la trans-activación de
RAR-\alpha y las acciones de
trans-represión de ATRA para entender los mecanismos
mediados por RAR de todo-trans-UAB8
en diferenciación de células NB4.
En una realización de la presente invención, se
proporcionan compuestos para una nueva clase estructural de
retinoides, en la que los compuestos son UAB30 y análogos. Ejemplos
representativos son (9Z)-UAB30,
(9Z)-UAB31, (9Z)-UAB32,
(9Z)-UAB33, (todo E)-UAB33,
(9Z)-UAB34, (9Z)-UAB35 y
(9Z)-UAB40.
En otra realización más de la presente
invención, se proporciona un uso de los nuevos compuestos retinoides
como medicamento en una dosis eficaz para tratara un individuo con
necesidad de tal tratamiento. Preferiblemente, el individuo
necesita tratamiento para leucemia o necesita quimioprevención del
cáncer. Los compuestos retinoides se pueden usar de manera
sinérgica para el tratamiento.
Otros y más aspectos, características y ventajas
de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente
descripción de las realizaciones preferidas en el momento presente
de la invención dadas para los fines de descripción.
A fin de que la materia en que las
características, ventajas y objetos ya mencionados de la invención,
así como otros que serán evidentes, se consigan y se puedan
entender con detalle, las descripciones más particulares de la
invención resumidas brevemente anteriormente pueden tener como
referencia ciertas realizaciones de las mismas que se ilustran en
los dibujos adjuntos. Estos dibujos forman parte de la memoria
descriptiva. Se debe observar que, sin embargo, los dibujos
adjuntos ilustran realizaciones preferidas de la invención y por lo
tanto no deben considerarse limitantes de su alcance.
La Figura 1 muestra estructuras I y II generales
que describen UAB8 y análogos (UAB8 se define como R_{1} = etilo
y R_{2} = isopropilo en la estructura I), en la que R_{1} se
selecciona del grupo que consiste en: H, etilo, metilo,
n-propilo, isopropilo, terc-butilo,
fenilo, bencilo, alquilo cíclico (de C3-C8), arilo
y arilalquilo y R_{2} se selecciona del grupo que consiste en
2-metilpropilo, n-butilo,
ciclohexilo, 3-ciclohexenilo, bencilo, alquilo
cíclico (de C3-C8) y arilalquilo. Y en la que
R_{1} se selecciona del grupo que consiste en fenilo, bencilo,
alquilo cíclico (de C3-C8), arilo y arilalquilo y
R_{2} se selecciona del grupo que consiste en: H, etilo, metilo,
n-propilo, e isopropilo.
La Figura 2 muestra estructuras generales III y
IV que describen UAB30 y análogos, en las que R_{1} representa
uno o dos sustituyentes en el anillo arílico y se selecciona del
grupo que consiste en: H, etilo, metilo, n-propilo,
isopropilo, terc-butilo, fenilo, bencilo, cloro,
fluoro, metoxi, etoxi, benciloxi, alquilo cíclico (de
C1-C8), arilo, arilalquilo, alquiloxi, ariloxi,
arilalquiloxi y halógeno; R_{2} se selecciona del grupo que
consiste en: H, etilo, metilo, n-propilo,
isopropilo, 2-metilpropilo,
n-butilo, ciclohexilo,
3-ciclohexenilo, bencilo, metoxi, etoxi, benciloxi,
alquilo cíclico (de C1-C8), arilo, arilalquilo,
alquiloxi, ariloxi y arilalquiloxi y en las que n =
0-3.
La Figura 3 muestra el esquema de preparación de
UAB30.
La Figura 4 muestra las estructuras de ácido
todo-trans-retinoico (ATRA)
comparado con los isómeros todo-tras y
9-cis de retinoides UAB8 y UAB30.
La Figura 5 muestra inhibición de la actividad
transcripcional de RAR-\alpha inducida por ácido
todo-trans-retinoico en células
CV-1 por antagonistas de
RAR-\alpha,
todo-trans-UAB30 y
Ro-41-5253. La dosis de ácido
todo-trans-retinoico dosis fue de
50 nM y la dosis de todo-trans-UAB30
y Ro-41-5253 se variaron entre
10^{-8} y 10^{-6} M.
La Figura 6 muestra inhibición de actividad
transcripcional de RAR-\alpha inducida por TPA en
células HeLa por ácido
todo-trans-retinoico (ATRA) e
isómeros UAB8 y UAB30 a dos dosis (10^{-7} y 10^{-6} M).
La Figura 7 muestra diferenciación de células
NB4 por ATRA (círculos rellenos),
todo-trans-UAB8 (triángulos
rellenos), 9-cis-UAB8 (cuadrados
rellenos), todo-trans-UAB30
(triángulos rellenos boca abajo) y
9-cis-UAB30 (diamantes rellenos).
Se cultivaron células durante 3 días en medio enriquecido con FBS al
10% y la concentración indicada de cada retinoide. Se evaluó la
diferenciación como porcentaje de célula NBT positiva.
La Figura 8A muestra la capacidad del ácido
todo-trans-retinoico (ATRA) para
diferenciar las células NB4 (círculos rellenos) solas o junto con
9-cis-UAB8 (1:2,5) (triángulos
rellenos), 9-cis-UAB30 (1:10)
(cuadrados rellenos) o
todo-trans-UAB30 (1:10) (diamantes
rellenos).
La Figura 8B muestra la capacidad de
todo-trans-UAB8 para diferenciar
células NB4 (círculos rellenos) solas o junto con
9-cis-UAB8 (1:2,5) (triángulos
rellenos), 9-cis-UAB30 (1:10)
(cuadrados rellenos) o
todo-trans-UAB30 (1:10) (diamantes
rellenos).
La Figura 9 muestra la capacidad de
todo-trans-UAB8 para diferenciar las
células NB4 (círculos rellenos) solas o junto con
4-hidroxifenilretinamida a 1 \muM (triángulos
rellenos) y 4 \muM (cuadrados rellenos).
La Figura 10 muestra el peso de tumor de mama
promedio/rata (gramos) durante un periodo de tiempo
post-inducción de metilnitrosourea (MNU). Se
trataron ratas del grupo 17 con Vehículo (dieta Teklad) (círculos),
mientras el Grupo 29 con UAB30 (dieta de 200 mg/kg) (cuadrados
rellenos).
La Figura 11 muestra el peso corporal promedio
/rata (gramos) en diferentes días de edad. Las ratas del Grupo 17
se trataron con Vehículo (dieta Teklad) (círculos), mientras el
Grupo 29 con UAB30 (dieta de 200 mg/kg) (cuadrados rellenos).
La presente invención se dirige a nuevos
compuestos retinoides y sus usos.
El ácido
todo-trans-retinoico (ATRA) induce
que la línea celular de leucemia promielocítica aguda (APL), NB4,
diferencie de manera terminal a granulocitos. Clínicamente, se usa
ATRA como tratamiento alternativo para pacientes de APL que llegan
a ser refractivos a la quimioterapia citotóxica normal. Sin embargo,
la mayoría de los pacientes APL desarrollan resistencia clínica con
el tratamiento prolongado con ATRA. Se identifica
todo-trans-UAB8 como agente más
eficaz que ATRA en inducir que se diferencien las células NB4. La
presente invención también investiga los efectos de
todo-trans-UAB8, un retinoide
selectivo de RAR, en la diferenciación de células NB4 cuando se usa
junto con 9-cis-UAB8 o
9-cis-UAB30, dos retinoides
selectivos de RXR. El uso combinado de
todo-trans-UAB8 y
9-cis-UAB30 actuó sinérgicamente en
la diferenciación de células NB4, mientras
9-cis-UAB30 presentó poco efecto
solo. Adicionalmente,
todo-trans-UAB8 y
4-hidroxifenilretinamida actúan sinérgicamente para
inducir que se diferencien las células NB4.
Los mecanismos a base de receptores nucleares
potenciales de acción de diferenciación inducida por retinoides en
esta línea celular se exploraron a continuación. Se demostró que
todo-trans-UAB8 era muy eficaz tanto
en la transactivación mediada por RAR de genes como en la
trans-represión mediada por RAR del complejo
AP-1 (c-Jun/c-Fos).
Para distinguir entre estos dos mecanismos a base de receptor, se
evaluó todo-trans-UAB30 y fue activo
en la trans-represión de complejo
AP-1 pero como antagonista de
RAR-\alpha. Cuando se usó solo,
todo-trans-UAB30 no indujo
diferenciación de células NB4 y, cuando se usó en asociación, redujo
la eficacia de o todo-trans-UAB8 o
ATRA. Estos datos soportan un mecanismo a base de
RAR-\alpha de diferenciación inducida por
todo-trans-UAB8 de células NB4.
Finalmente, se encontró que
todo-trans-UAB8 se metabolizaba a la
misma velocidad que ATRA, pero que
9-cis-UAB30 era metabólicamente
estable durante 5 días. Tomados juntos, la presente invención
describe que la eficacia de
todo-trans-UAB8 se puede aumentar
además cuando se usa junto con ligandos selectivos de RXR
metabólicamente estables, proporcionando un nuevo tratamiento de
asociación para el tratamiento clínico de APL.
En una realización de la presente invención, se
proporcionan compuestos retinoides (que son isómeros 9(Z) o
todo(E) de estructura III)
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en la que R_{1} es fenilo,
bencilo, alquilarilo cíclico C_{3}-C_{8} o
arilalquilo; R_{2} es hidrógeno, etilo, metilo,
n-propilo o isopropilo y n =
0-3.
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Preferiblemente, los compuestos retinoides UAB30
y análogos se seleccionan del grupo que consiste en
(9Z)-UAB30, (9Z)-UAB31,
(9Z)-UAB32, (9Z)-UAB33, (todo
E)-UAB33, (9Z)-UAB34,
(9Z)-UAB35, en que (9Z)-UAB30,
(9Z)-UAB31, (9Z)-UAB32,
(9Z)-UAB33, (todo E)-UAB33,
(9Z)-UAB34 y (9Z)-UAB35 presentan la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que (9Z)-UAB30 tiene un
sustituyente H en el anillo arílico; (9Z)-UAB31,
tiene un sustituyente 5'-metoxi en el anillo
arílico; (9Z)-UAB32, tiene un sustituyente
6'-metoxi en el anillo arílico;
(9Z)-UAB33, tiene un sustituyente 7'metoxi en el
anillo arílico; (todo E)-UAB33 tiene un sustituyente
7'-metoxi en el anillo arílico;
(9Z)-UAB34 tiene un sustituyente 4'metiloi en el
anillo cicloalquílico y (9Z)-UAB35 tiene dos
sustituyentes 5', 7'-dimetilo en el anillo
arílico.
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Más preferiblemente, (9Z)-UAB40
que tiene la estructura:
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\vskip1.000000\baselineskip
es un ejemplo representativo de
UAB30 y
análogos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización más, la presente invención
se refiere al uso de los compuestos retinoides como medicamento
para tratar a un individuo con una afección neoplásica, una dosis
eficaz para tratar un neoplásico o neoplásico sospechado o afección
similar a neoplásica en un individuo. Preferiblemente, el compuesto
retinoide se combina además con
4-hidroxifenilretinamida para el tratamiento. Más
preferiblemente, el individuo necesita tratamiento para leucemia o
necesita quimioprevención del cáncer, tal como cáncer de piel o de
mama. Aún preferiblemente, el compuesto se administra en un
intervalo de administración de desde aproximadamente 10 mg/kg a
aproximadamente
300 mg/kg.
300 mg/kg.
\newpage
En otra realización más de la presente
invención, se proporciona un uso de una asociación de dos o más de
dos compuestos retinoides descritos en la presente memoria como
medicamento eficaz para tratar una afección neoplásica en un
individuo. La asociación puede comprender además
4-hidroxifenilretinamida. Aún preferiblemente, el
individuo necesita tratamiento para leucemia o necesita
quimioprevención del cáncer.
La presente invención también es refiere al uso
de una asociación de dos o más de dos compuestos UAB30 o compuestos
análogos de UAB30 como medicamento eficaz para tratar una afección
neoplásica en un individuo. La asociación puede comprender además
4-hidroxifenilretinamida. Aún preferiblemente, el
individuo necesita tratamiento para leucemia o necesidad
quimioprevención del cáncer. Las afecciones neoplásicas
representativas que se pueden tratar así incluyen cáncer de piel,
cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de
pulmón, cáncer de colon y leucemia. Preferiblemente, el compuesto
se administra a una dosis de desde aproximadamente 10 mg/kg a
aproximadamente 300 mg/kg. Los siguientes ejemplos se dan con el fin
de ilustrar varias realizaciones de la invención y no se desea que
limiten la presente invención de ninguna manera.
Se obtuvieron espectros de RMN de ^{1}H a
400,1 MHz (espectrómetro Bruker DRX) en CDCl_{3}. Se realizaron
experimentos NOE de muestras desgaseadas usando experimentos NOESY
sensibles a la fase 2D con diferentes tiempos de mezcla (entre 250
y 2.000 ms). Típicamente, se usaron tiempos de mezcla de 1 s con 16
pulsos para ciclación de fase y 2 barridos ficticios. Se procesaron
los datos con ensanchamiento de línea de 0,3 Hz en cada dimensión y
carga cero para proporcionar representaciones gráficas de contorno
2D 512 x 4.096. Las intensidades integradas de los cruce de picos
negativos se determinaron usando características de software de RMN
Bruker.
Se registraron espectros UV/vis en un
espectrofotómetro AVIV 14DS en disoluciones de ciclohexano o metanol
(Fisher, Spectrograde). Se registraron espectros IR usando un
espectrómetro de FT IR Nicolet en películas delgadas. Se realizaron
separaciones HPLC en un sistema de gradiente HPLC Gilson usando
cabezas de bomba de 25 ml y un detector de longitud de onda
variable ISCO V^{4}. La columna empleada fue una Whatman Partisil
10 M20/50 (500 x 22 mm de d. i.) con un caudal de 5 ml/min y se
controló por detección UV/vis a 340 nm. Se realizó cromatografía
TLC sobre placas de vidrio GF de gel de sílice de 250 \mum
prerecubiertas (Analtech, Inc.; 5 x 10 cm). Se destilaron
previamente a su uso los disolventes y materiales de partida
líquidos. Se realizaron las reacciones y purificaciones con
disolventes desoxigenados, bajo gas inerte (N2) y sometido a
iluminación. Los datos seleccionados para los compuestos intermedios
y los productos en el esquema mostrado en la Figura 3 se encuentran
en la Tabla 1.
Se agitó polvo de cinc (1,75 g; 26,8 mmoles) con
HCl al 5% (5 ml) durante 2 min a temperatura ambiente. Se permitió
que la mezcla sedimentara y se retiró cuidadosamente el líquido por
pipeta. De una manera similar se lavó el Zn, bajo nitrógeno, con
agua (3 x 5 ml), acetona (3 x 5 ml) y éter (2 x 8 ml). Después de
que se hubiera retirado el éter residual bajo una corriente de
nitrógeno, se calentó fuertemente el matraz que contenía el polvo
de Zn con una llama de quemador Bunsen durante 30 s. Se suspendió el
polvo de Zn enfriado en dioxano anhidro (3 ml) y se calentó la
suspensión agitada para hacerla hervir a reflujo. Se preparó bajo
nitrógeno una disolución de \alpha-tetralona
recién destilada (0,520 g; 3,56 mmoles), bromosenecionato de etilo
(1,47 g; 7,12 mmoles) y dioxano anhidro (2,5 ml) y se añadió una
porción de esta disolución (0,,5 ml) a la suspensión de Zn
calentada. Esto produjo una reacción exotérmica y se añadió después
el resto de la disolución que contenía
\alpha-tetralona durante 10 min a una velocidad
suficiente para controlar el reflujo. Se agitó la mezcla de
reacción final a reflujo durante 8 horas y después se dejó enfriar a
temperatura ambiente. Se añadió agua (5 ml), se agitó la mezcla
durante 20 min y se añadió éter (20 ml). Se filtró la suspensión por
una almohadilla de Celite y se lavó el filtro bien con éter (40
ml). El líquido filtrado se extrajo con HCl al 15% (40 ml), agua
(40 ml), NaOH 1 N (40 ml) y una cantidad adicional de agua (30 ml),
se combinaron el lavado básico y el lavado final con agua, se
ajustó a pH 1-2 con HCl al 15% y se extrajo con
éter (2 x 100 ml). Se secó la capa orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se
concentró a vacío a (9Z)-2 como cristales amarillos
(0,70 g; rendimiento del 86%); pf 153-154ºC
(hexano-acetato de etilo 1:1).
Se dejó enfriar una disolución de ácido
(9Z)-2 (0,11 g; 0,48 mmoles) en THF anhidro (10
ml), a -78ºC y se añadió gota a gota LiAlH_{4} 1 M/éter (0,50 ml;
0,50 mmoles), con agitación, bajo nitrógeno. Se retiró el baño de
hielo seco-acetona y se llevó la mezcla de reacción
a temperatura ambiente y se agitó durante 3 h. Se enfrió la mezcla
de reacción a 0ºC y se añadió gota a gota metanol (0,2 ml) seguido
por HCl al 10% (10 ml). Se permitió que esto se calentara a
temperatura ambiente y se extrajo la mezcla con éter (2 x 20 ml).
Se lavó la capa de éter con salmuera (1 x 20 ml), se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró a vacío para dar un residuo
oleoso (0,113 g). Esto se puso en una columna súbita de gel de
sílice (1 x 30 cm) y se eluyó con Et_{2}O-hexano
al 30% para dar una mezcla 1:1 de (9E)- y
(todo-E)-3 (0,068 g;
rendimiento del 67%). Se llevó la mezcla de alcohol en esta forma
sin más purificación.
A una disolución agitada de alcohol 3 (0,065 g;
0,30 mmoles) en Ch_{2}Cl_{2} seco (10 ml) a 0ºC, bajo
nitrógeno, se añadieron tamices moleculares de 4 \ring{A} (1,5 g)
seguido por MnO_{2} activado (0,53 g; 6,1 mmoles) y se agitó la
mezcla a 0ºC durante 3 h. Se filtró la mezcla de reacción por una
almohadilla de gel de sílice súbita y se lavó el filtro con
CH_{2}Cl_{2}/éter al 50% frío (100 ml). Se concentró a sequedad
el líquido filtrado a vacío para dar un aceite residual (0,05). Esto
se puso en una columna de gel de sílice súbita (1 x 15 cm) y se
eluyó con Et_{2}O-hexano al 10% para dar
(9Z)-4 (0,018 g),
(todo-E)-4 (0,016 g) y
alcohol 3 de partida (0,007 g). El rendimiento total de 4 fue 0,034
g (rendimiento del 59% basado en alcohol de partida no
recuperado).
Se lavó NaH (1,2 eq) en THF seco tres veces para
eliminar aceite de parafina. A 0ºC en N_{2} se añadió
fosfonosenecioato de trietilo (1,1 equiv.) recién destilado en THF.
Después de agitar la mezcla durante 30 min, se añadió HMPA (0,2
equiv.) seguido por éter (9Z)- o
(todo-E)-4 (1 equiv.,
concentración final 0,8 M). Después de que hubo reaccionado la
mezcla durante 120 min a temperatura ambiente, se añadió agua y se
repartió la mezcla de reacción entre éter y agua. Se lavó la capa
de éter una vez con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se
concentró a vacío para dar éster como mezcla de principalmente dos
isómeros configuracionales. Por este método se preparó lo
siguiente.
siguiente.
Esta preparación empleó una suspensión de NaH
(0,060 g; 2,5 mmoles) en THF seco (1 ml), una disolución de
fosfonosenecioato de trietilo (0,14 g; 0,53 mmoles) en THF seco (1
ml), HMPA (0,041 g; 0,21 mmoles) y una disolución de
(9Z)-4 (0,089 g; 042 mmoles) en THF seco (1 ml) para
dar una mezcla 2:1 de ésteres (9Z)- y (9Z,13Z)-5
(0,12 g; rendimiento del 78%). Esta mezcla se preparó por HPLC en
gel de sílice usando Et_{2}O al 0,5%, THF 01% en hexano.
Esta preparación empleó una suspensión de NaH
(0,050 g; 2,1 mmoles) en THF seco (1 ml), una disolución de
fosfonosenecianato de trietilo (0,11 g; 0,40 mmoles) en THF seco (1
ml), HMPA (0,048 g; 0,22 mmoles) y una disolución de (todo
E)-4 (0,065 g; 0,31 mmoles) en THF seco (1 ml)
para dar una mezcla 2:1 de ésteres (todo-E)
y (13)-5 (0,12 g; rendimiento del 78%). Esta mezcla
se separó por HPLC sobre gel de sílice usando Et_{2}O al 1%, THF
al 0,5% en hexano.
A una disolución del éster 5 (1 equiv.) en
metanol (concentración final 0,061 M) se añadió una disolución
acuosa de KOH 2 M (10 equiv.). Se calentó esta disolución para
hacerla hervir a reflujo y se controló el progreso de la reacción
por TLC. Después de 90 min se vertió la disolución caliente en un
vaso de precipitados de hielo (40 g) y se acidificó con HCl al 10%
hasta pH 2. Después se extrajo la mezcla con Et_{2}O, que se lavó
con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró bajo
presión reducida para dar el producto. La RMN reveló que la
hidrólisis tenía lugar sin isomerización. Se sintetizaron los
siguientes ácidos por este método.
Esta preparación utilizó una disolución de KOH
(0,258 g; 4,61 mmoles) en agua (2 ml) y una disolución caliente de
éster (todo-E)-5 (0,122 g;
0,378 mmoles) en metanol (10 ml) para proporcionar ácido
(todo-E)UAB30 (0,104 g; rendimiento del 93%)
como un sólido amarillo; pf 192-197ºC
(ciclohexano).
Esta preparación utilizó una disolución de KOH
(0,15 g; 2,8 mmoles) en agua (1 ml) y una disolución caliente de
éster (9Z)-5 (0,073 g; 0,23 mmoles) en metanol (3
ml) para proporcionar ácido (9Z)-UAB30 (0,065 g;
rendimiento del 98%) como un sólido amarillo; pf
182-185ºC (ciclohexano).
Esta preparación empleó una disolución de KOH
(0,085 g; 1,50 mmoles) en agua (1 ml) y una disolución caliente de
éster (13Z)-5 (0,040 g; 0,12 mmoles) en metanol (4
ml) para proporcionar ácido (13Z)-UAB30 (0,034 g;
rendimiento del 93%) como un sólido amarillo; pf
180-185ºC (ciclohexano).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de unión de CRABP de piel de pollito
midió valores IC_{50} para unión de retinoides a
CRABP-II usando un ensayo de competición de
radiomarcado (8-10). Los valores de IC_{50} para
retinoides con RAR y RXR se midieron con un ensayo de competición
de radiomarcado (8-10). Los ensayos de actividad
transcripcional del receptor nuclear se realizaron usando células
CV-1. La transinfección transitoria de estas células
con un plásmido de ADN se realizó esencialmente como se describe en
Alam et al (9). El ensayo de antipapiloma de piel de ratón
midió los valores ED_{50} para la inhibición de tumores con
retinoides en la piel dorsal de ratones. La inhibición del papiloma
de piel de ratón por retinoides se realizó según una modificación
del procedimiento desarrollado por Verma y Boutwell (14) como se
indicó previamente por Muccio et al (8).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células NB4 de Dr Waxman después
de que las hubiese recibido del Dr. M. Lanotte. Las células NB4 se
mantuvieron en cultivo en RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY)
enriquecido con FBS (suero fetal bovino) al 10% (v/v) (GIBCO) y
ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
10 mM (pH 7,3). Se cultivaron las células a 37ºC en una atmósfera
humidificada de CO_{2} al 5% en aire. Se estimó una densidad de
células en un contador de partículas electrónico (Coulter
electronic, Hialeah, FL) y viabilidad celular con exclusión con
colorante azul de trypan. Las células NB4 no contenían micoplasma
cuando se evalúa por el Laboratorio de micoplasma, centro de
Investigación y Desarrollo del Cáncer NCI-Frederick,
PRI/DynCorp, MD, usando colorante fluorescente Hoechst 33258 y
métodos de detección de cultivo con agar (Del Giudice et al.,
1.984 monografía nº 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos antagonistas de los retinoides UAB30
en la transcripción de RAR\alpha se determinaron en células
CV-1. Los métodos son casi idénticos a los usados
para realizar ensayos transcripcionales. Estos estudios utilizaron
el TREpal que contenía gen indicador CAT con un activador de la
timidina cinasa
[(TREpal)_{2}-tk-CAT] como
se describe por Vaezi et al. (11). Veinticuatro horas después
de la transinfección, se trataron las células con (todo
E)-AR (1-1.000 nM) solo o junto con
el retinoide UAB indicado (100 ó 1.000 nM). Después de 24 horas, se
recogieron las células y se midieron los efectos transcripcionales
relativos a la actividad CAT, después de la corrección con
actividad \beta-gal para eficacia de
transinfección. Se hicieron estudios similares con un antagonista
de RAR\alpha conocido, Ro-41-5253.
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se
promediaron. Se definió antagonismo como una disminución de la
actividad CAT relativa de la transcripción inducida por
(todo-E)-AR en presencia de
retinoides cuando se compara con controles positivos que no
contenían retinoides. Tanto
(todo-E)-UAB30 como
Ro-41-5253 presentaron antagonismo a
cada concentración de
(todo-E)-AR usada para
inducir la transcripción, pero los efectos no fueron perceptibles
cuando (todo-E)-AR fue 50
nM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron HL-60 y NB4 líneas
celulares de leucemia humana para medir la capacidad de los
retinoides para inducir la diferenciación terminal. Ambas líneas
celulares son predominantemente promielocitos y se inducen por ácido
retinoico para madurar células con muchas características de
granulocitos maduros. La inducción de esta diferenciación es la
base para ensayar una de las actividades biológicas de análogos de
ácido retinoico. Para el ensayo de diferenciación, se cultivaron
células HL-60 o NB4 en medio nutriente con suero
fetal bovino como detalla Breitman
(15).
(15).
El ácido
todo-trans-retinoico y nitroazul de
tetrazolio (NBT) se adquirieron en Sigma Chemical Co. St Louis, MO.
Los isómeros todo-trans y 9-cis de
UAB8 y UAB30 se sintetizaron según los métodos descritos previamente
(Alam et al. 1.995; Muccio et al., 1.998). Se
disolvieron ATRA y retinoides UAB en dimetilsulfóxido (DMSO) a una
concentración de 0,1 a 10 mM y después se diluyó, 1.000 veces para
tratamiento celular. El crecimiento y la diferenciación de células
NB4 se realizaron según métodos descritos previamente (Breitman,
1.990, Methods Enzymol. 190, 118; Taimi & Breitman, 1.997,
Experimental Cell Research, 230, 69). Después de 3 días de
incubación, se evaluó la diferenciación celular por la capacidad
para reducir NBT como el porcentaje de células con depósitos de
nitroazul de diformazan asociado a las células que resultan de la
reducción de NBT (Breitman, 1.990, Methods Enzymol. 190, 118). El
porcentaje de células que consiguió este marcador se midió
microscópicamente. El porcentaje de células positivas se representó
entonces gráficamente como una función de la concentración de
retinoides para determinar valores de ED_{50} y ED_{30} usados
en la formación de isobolos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de transinfección transitoria para
inducción de retinoides ATRA o UAB de la transcripción mediada por
o RAR-\alpha o RXR-\alpha se
midieron usando los métodos indicados previamente (Alam et
al., 1.995, J. Med. Chem. 38, 2.302). Estos ensayos se
realizaron en células CV-1 con el gen RAR o RXR y el
gen informador cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) que contiene
TREpal con un activador de timidina cinasa
[(TREpal)_{2}-tk-CAT].
Veinticuatro horas después de la transinfección, las células se
trataron con una dosis única de retinoide y se ensayaron los
extractos de células para b-galactosidasa y
actividad CAT. Los efectos antagonistas de retinoides UAB30 en la
transcripción de RAR-\alpha también se
determinaron en células CV-1. Los métodos son casi
idénticos a los usados para realizar ensayos transcripcionales.
Estos estudios utilizaron el gen informador CAT
[(TREpal)_{2}-tk-CAT].
Veinticuatro horas después de la transinfección las células se
trataron con ATRA (1 a 1.000 nM) solo o junto con el retinoide UAB
indicado (100 ó 1.000 nM). Después de 24 horas, se recogieron las
células y se midieron los efectos transcripcionales en actividad CAT
relativa, después de corrección con actividad de
\beta-galactosidasa para eficacia de
transinfección. Se hicieron estudios similares con un antagonista
RAR-\alpha conocido,
Ro-41-5253. Se realizaron
experimentos por triplicado y se promediaron los datos. Se definió
antagonismo como una disminución de la actividad CAT relativa de
transcripción inducida por ATRA en presencia de retinoides cuando
se compara con controles positivos que no contenían
retinoide.
retinoide.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transinfectaron células HeLa con -73
Col-CAT en que el activador de colagenasa que
contiene un sitio de unión a AP-1 está unido con el
gen CAT junto con el vector de expresión de los receptores de
retinoides indicado. Veinticuatro horas después de transinfección,
las células se mantuvieron en suero fetal bovino al 0,5% y se
trataron con la concentración de retinoides indicada con o sin TPA
(100 mg/ml) durante 24 horas. Se cosecharon las células y se
determinaron las actividades CAT y se corrigieron con la
correspondiente actividad de \beta-galactosidasa
para eficacia de transinfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó en los retinoides
(todo-E)- y (9Z)-AR, UAB8 y
UAB30 su capacidad para inhibir el crecimiento de colonias
CFU-GM espontáneo en tres muestras de pacientes JMML
como describe Emanuel et al., (5, 16). Brevemente, después
de obtener el consentimiento de los padres y con la aprobación del
Institutional Review Board, se recogieron muestras de sangre
periférica y médula ósea JMML de pacientes y se envió por entrega
durante la noche a la Universidad de Alabama en Birmingham. Se
separaron células mononucleares por centrifugación en gradiente de
densidad, se lavaron y se congelaron en alícuotas. Más tarde se
congelaron alícuotas de muestras de pacientes JMML, se lavaron y se
montaron en ensayos clonales de agar suave al 0,3% en medio 5A de
McCOY enriquecido con nutrientes así como suero fetal bovino al
15%. No se añadieron factores de crecimiento u otro estímulo
exógeno a los cultivos. Se disolvieron retinoides UAB e isómeros de
ácido retinoico en o etanol al 100% o DMSO. Se hicieron diluciones
apropiadas y se montaron controles usando la respectiva
concentración de etanol o DMSO en paralelo. Se añadieron dosis
variables de retinoides sólo una vez, 24 horas después de la
iniciación de los ensayos con agar suave pipeteando la disolución de
retinoides en la parte superior del agar suave y permitiendo que la
disolución entrara en el agar e interactuara con la células por
difusión. Se incubaron los cultivos durante 14 días a 37ºC en una
atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%.Se puntuaron las colonias
CFU-GM (1 colonia tiene > 40 células) y la
cantidad resultante de inhibición de crecimiento de colonias
CFU-GM espontáneo se comparó con
(13Z)-AR.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron ratas
Sprague-Dawley hembras obtenidas de Harlan
Sprague-Dawley, Inc. (colonia sin virus número
218). Las ratas llegaron a los 28 días de edad y tuvieron una dieta
de Teklad (4%) el día de la llegada. A los 50 días de edad, las
ratas recibieron una inyección IV de metilnitrosourea (MNU) (50
mg/kg de peso corporal) por la vena yugular. Se adquirió MNU en
Ash-Stevens, Inc. Comenzando a los 53 días de edad
se les administró a las ratas (9Z)-UAB30 en la
dieta (200 mg/kg de alimentación). Se pesaron las ratas una vez a la
semana, se palparon los tumores mama dos veces a la semana y se
comprobaron a diario los signos de toxicidad. Los pesos corporales
de las ratas se analizaron estadísticamente 5 semanas, 10 semanas y
15 semanas después de la administración inicial de
(9Z)-UAB30. A los 140 días después de inducción de
MNU, se terminó el estudio. Se pesaron todos los tumores de mama
cuando se retiraron en necropsia y se clasificaron
histológicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron estructuras retinoides con versión
Sybyl 6.2 (Trips Inc., St. Louis, MO) en una estación de trabajo
Graphics Indigo 2 de silicio. La estructura de
(9Z)-2 se construyó usando la estructura de cristal
de rayos-x indicada recientemente (17). Esta
estructura cristalizó en la conformación
8-s-trans. Para generar las conformaciones
8-s-cis se rotó esta estructura
alrededor del enlace C8-C9 seguido por minimización
de energía usando campos de fuerza MM3(94) de Allinger. La
estructura de ácidos UAB30 finales se generó a partir de estas
estructuras 8-s-cis- y
8-s-trans- de 2. Los parámetros
termodinámicos se calcularon según los métodos descritos
previamente (8).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 resume los métodos empleados para
preparar UAB30. La propuesta fue similar a la que se indicó
previamente para la síntesis de los retinoides UAB
alquil-sustituidos (por ejemplo, UAB8) (9, 10),
excepto que se usó \alpha-tetralona como enona de
partida (1 en la Figura 1). Empezando con las cetonas apropiadas,
se usaron métodos similares para preparar todos los retinoides
pertenecientes a las estructuras generales I y III (Figuras 1 y
2).
La numeración de los átomos en la Figura 3 no es
sistemática para permitir una comparación fácil con ácido
retinoico. Como se indicó anteriormente (9), no se detectó una
\delta-lactona intermedia en estas condiciones
pero se asume que es un compuesto intermedio en la producción de
(9Z)-2. A diferencia de informes anteriores para
compuestos relacionados (8-10), la reducción de
ácido (9Z)-2 a alcohol 3 estuvo acompañada por la
isomerización para dar una mezcla 1:1 de isómeros
todo-E- y 9Z. Esta mezcla se oxidó con
MnO_{2} para dar una mezcla comparable de aldehídos (4), que se
separó de manera preparativa usando cromatografía súbita sobre gel
de sílice. Cada isómero puro de 4 se olefinó como se muestra para
proporcionar una mezcla de o (9Z) o (9Z, 13Z) o
(todo-E) y (13Z)-5. Cada
mezcla se separó de manera preparativa por HPLC sobre gel de sílice
(Et_{2}O al 0,5%, THF al 0,1% en hexano para la primera y
Et_{2}O al 1%, THF al 0,5% en hexano para la última) usando
métodos similares al descrito (8-11). Isómeros
individuales del éster 5 se hidrolizaron después a los
correspondientes ácidos en KOH, sin isomerización E/Z (12). La
pureza isomérica para los ácidos finales (>97%) se verificó por
RMN y HPLC de fase inversa (8-11). Los rendimientos
experimentales y los datos seleccionados para los compuestos
intermedios y los productos en la Figura 1 se resumen en la Tabla 1.
Los datos espectrales UV/vis de los isómeros purificados se dan en
la Tabla 1 y las asignaciones RMN de ^{1}H completas se recogen en
la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La estructura del cristal de rayos X de
(9Z)-2 se indicó recientemente (17), que
cristalizaba en una conformación 8-s-trans.
Para comparar la estructura de rayos X de (9Z)-2 a
la generada por mecánica molecular, los cálculos de MM3 de Allinger
(94) se realizaron como se describe para calcular las estructuras de
retinoides UAB1-UAB8 (8). La estructura calculada
de este compuesto intermedio fue muy similar a la estructura de
estado sólido. Los ángulos torsionales \psi_{5,6,7,8} fueron
casi planos (-160º) en cada estructura, como otros retinoides UAB
con sustituyentes alquilo (8). El ángulo torsional
\psi_{7,8,9,10} fue -133º para la estructura por mecánica
molecular y -134,3º en la estructura del cristal. Este ángulo es no
plano debido a interacciones estéricas entre el metileno C2' y el
grupo metilo C19. También se generaron las estructuras de la
mecánica molecular de retinoides (9Z)- y
(todo-E)-UAB30. Cuando se
comparan con los isómeros UAB8 (8), los confórmeros de baja energía
esperados son muy similares; el anillo aromático de retinoides UAB30
ocupa espacio que es muy similar al de los grupos alquilo (R1 = Et;
R2 = ^{i}Pr) de UAB8.
Se observó previamente que el confórmero
8-s-cis era tan estable como el confórmero
8-s-trans para diferentes retinoides UAB
(8). También se calcularon las estructuras de baja energía del
confórmero 8-s-cis de isómeros UAB30. Los
ángulos torsionales \psi_{5,6,7,8} eran casi idénticos al del
confórmero 8-s-trans y el ángulo
\psi_{7,8,9,10} fue -70º. Además, el confórmero
8-s-cis era ligeramente más estable
(\DeltaG \approx 1 kcal/mol) que el correspondiente confórmero
8-s-trans.
Se realizaron experimentos Nuclear Overhauser
(NOESY) (2D) en (9Z)-2 en CDCl_{3}. Se observaron
NOE significativos entre H-19 y
H-2' (consistente con el confórmero
8-s-trans) y entre H-19 y
H-8 (consistente con el confórmero
8-s-cis). En relación con la intensidad de
cruce de picos muy intensa encontrada entre los protones metílicos
H-19 y H-10 (indicando la
configuración 9Z), las intensidades negativas de los cruces de picos
observada entre H-19/H-2' y
H-19/H-8 fueron aproximadamente la
mitad de esta intensidad integrada. Se obtuvieron resultados
similares de experimentos NOESY en isómeros todo-E y
9Z de UAB30. Los resultados NOE son en soporte de los cálculos MM3
que identificaron dos confórmeros de baja energía alrededor del
enlace C8-C9 en la cadena de polieno de estos
retinoides.
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores IC_{50} se evaluaron en un ensayo
de unión de radioligando CRABP de piel de pollito con
[^{3}H]-(todo-E)-AR como
el radioligando (18). A un exceso de 100 veces de retinoide UAB no
marcado, (todo-E)-UAB30
inhibió la unión de [^{3}H]-AR por sólo el 75%;
(13Z)-UAB30 (inhibición del 28%) y
(9Z)-UAB30 (inhibición del 5%) presentaron incluso
menos afinidad por CRABP. La menor afinidad de los isómeros UAB30
(IC_{50}>2.000 nM) relativa a los isómeros
todo-E de AR (IC_{50} = 600 nM) es especialmente
sorprendente puesto que los retinoides UAB7 y UAB8 presentaron
afinidades de unión comparables con la de AR. Aparentemente, los
restos de anillo aromático de UAB30 no interactúan tan bien como
los grupos alquilo voluminosos de UAB8 en el sitio de unión de AR
de CRABP, incluso aunque estos grupos estén colocados en una región
similar del espacio en disolución.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó en los isómeros
todo-E-, 9Z- y 13Z- de UAB30 su capacidad
para inhibir la unión de
[^{3}H]-(todo-E)-AR a los
RAR. Para estudiar el proceso de inhibición, se expusieron primero
receptores nucleares (RAR\alpha, RAR\beta, RAR\gamma y
RXR\alpha) a retinoides UAB 1.000 nM y
[^{3}H]-(todo-E)-AR 5 nM.
Esto se comparó con un control positivo usando
(todo-E)-AR no marcado 1.000
nM y un control no usando retinoide. Para los retinoides activos,
se determinaron valores IC_{50} por valoración con concentraciones
variables de retinoides UAB.
(todo-E)-UAB30
fue el único isómero UAB30 que se unió eficazmente a los RAR. Los
valores IC_{50} (30-50 nM) para los RAR sólo
fueron aproximadamente 5 veces mayores que los de
(todo-E)-AR o
(todo-E)-UAB30 (Tabla 3) y
comparables con el de (9Z)-AR. Los valores IC_{50}
para (9Z)-UAB30 fueron >1.000 nM indicando que
no se unían a receptores de RAR (Tabla 3), que es consistente con
los datos en (9Z)-UAB8. La baja afinidad para los
RAR no es compartida por (9Z)-AR, que casi se une
tan bien como (todo-E)-AR a
estos receptores. También, (13Z)-UAB30 fue un
ligador ineficaz para los subtipos RAR, que es diferente de las
propiedades de unión de (13Z)-UAB8 a estos
receptores nucleares (9).
Se evaluaron los isómeros UAB30 en ensayos que
miden su actividad funcional en células para inducir actividad
transcripcional mediada por RAR\alpha-, RAR\beta- y RAR\gamma.
Las células CV-1 se transinfectaron de manera
transitoria con plásmido de ADN del subtipo RAR apropiado y
(TREpal)_{2}-tk-CAT (9,
19). Usando una curva dosis-respuesta, se midieron
y después se compararon con los encontrados para
(todo-E)- y (9Z)-AR y para
(todo-E)- y (9Z)-UAB8 (Tabla
3). Transcripción activada por receptores mediada por RAR\beta
inducida por (todo-E)-UAB30;
sin embargo, se requirieron concentraciones 5 veces mayores para
conseguir una activación similar a las observadas para
(9Z)AR o
(todo-E)-UAB8.
(todo-E)-UAB30 mostró una
actividad moderada en la inducción de trancripción mediada por
RAR\gamma y no presentó actividad para inducir transcripción
RAR\alpha. Como tal este isómero UAB30 muestra selectividad de los
subtipos RAR\beta y RAR\gamma y propiedades antagonistas de
RAR\alpha, que es muy diferente a
(todo-E)-UAB8 -un agonista
pan-RAR muy eficaz. (13Z)-UAB30 mostró
propiedades transcripcionales de receptores nucleares muy diferentes
a las de su análogo de UAB8; no presentó actividad en la inducción
de expresión génica mediada por RAR, mientras que
(13Z)-UAB8 fue un activador eficaz de transcripcion
génica mediada por los RAR8. (9Z)-UAB30 fue incluso
un activador más deficiente de genes receptores mediados por los
RAR; fue mucho menos activo en estos ensayos que
(9Z)-UAB8.
La afinidad de unión de los isómeros UAB30 para
RXR\alpha se examinó a continuación. Sólo
(9Z)-UAB30 inhibió la unión de
[^{3}H]-(9Z)-AR 20 nM a RXR\alpha (Tabla 3). Un
exceso de 100 veces de retinoide UAB no marcado,
(9Z)-UAB30 inhibió el 70% de la actividad en
relación con (9Z)-AR. El valor IC_{50} para este
isómero fue mejor que para (9Z)-UAB8 y sólo 4 veces
mayor que el de (9Z)-AR. Los otros isómeros fueron
mucho menos eficaces (IC_{50}>2.000 nM). Cuando el efecto en
la actividad transcripcional mediada por homodímero RXR\alpha por
(9Z)-UAB30 fue aproximadamente 4 veces menos eficaz
que por (9Z)-AR pero 2 veces mejor que por
(9Z)-UAB38. De los isómeros
(9Z)-UAB, UAB30 es el ligando más potente y
selectivo para la activación de los RXR.
Puesto que
(todo-E)-UAB30 se une bien a
RAR\alpha (IC_{50}=35 nM) pero no se activó este receptor bien
(EC_{50}>1.000 nM), se evaluó a continuación su potencial para
actuar como antagonista RAR\alpha. Se evaluaron concentraciones
de (todo-E)-AR fijadas que
oscilan entre 1 y 1.000 nM en el ensayo transcripcional mediado por
homodímeros RAR\alpha usando dos concentraciones de
(todo-E)-UAB30 (10 ó 100 nM).
Estos se compararon con un control negativo de
(todo-E)-AR solo y un control
positivo usando Ro-41-5253, un
antagonista de RAR\alpha conocido, a 10 y 100 nM. Para
concentraciones 50 y 100 nM de
(todo-E)-AR, la actividad
CAT relativa de las células tratadas con 100 nM de
(todo-E)-UAB30 disminuyó en
relación con las que contenían sólo
(todo-E)-AR. Esta disminución
de la actividad CAT es consistente con antagonismo de ácido
retinoico por (todo-E)-UAB30,
pero la magnitud de estos efectos fue 2 veces menor que la
demostrada por Ro-41-5253.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó en los retinoides UAB30 a continuación
su actividad en la prevención de la inducción química de los
papilomas en piel de ratón (14). Tanto
(todo-E)-AR como
(todo-E)-UAB8 fueron muy
eficaces en este ensayo quimiopreventivo. A una dosis de 45,9
nmoles, evitaron completamente la formación de tumor (95% para
ácido retinoico; 99% de UAB8). Los valores de ED_{50} para estos
retinoides fueron 3,0 (AR) y 2,5 (UAB8) nmoles (8).
(todo-E)-UAB30 fue menos
eficaz que este ácido retinoico o isómero UAB8 en el ensayo de
antipapiloma de piel; sólo redujo un 59% de los papilomas a 45,9
nmoles. Usando curvas dosis-respuesta, un ED_{50}
no se pudo determinar con precisión para este retinoide,
consistente con los esfuerzos para cuantificar la actividad de
otros retinoides UAB marginalmente activos (8). Previamente, la alta
actividad de (todo-E)- UAB8 (que contenía
grupos alquilo grandes a R1 y R2) se correlaciona (en relaciones
estructura-actividad) con su unión y/o activación
eficaz de los RAR. Usando estas tendencias, la actividad reducida de
(todo-E)-UAB30 puede ser
debida a su deficiente capacidad para activar RAR\gamma y/o
ausencia de capacidad para activar RAR\alpha (Tabla 3),
especialmente en comparación con
(todo-E)-UAB8 que presenta
excelente actividad RAR\gamma. El isómero
(9Z)-UAB8 también era menos eficaz que
(9Z)-AR en este ensayo; sólo evitó el 54% de la
formación de tumores a 45,9 nmoles, una dosis a la que
(9Z)-AR era ligeramente activo (95%) (8). Esta baja
actividad, sin embargo, es comparable con la de
(9Z)-UAB8 en este ensayo (8). Puesto que tanto
(9Z)-UAB8 como (9Z)-UAB30 son
retinoides selectivos de RXR, no son eficaces activadores de rutas
mediadas por RAR, en particular las mediadas por receptores
nucleares de RAR\beta y RAR\gamma. Chandraratna et al
(20) mostraron que los retinoides selectivos de RAR\beta y
RAR\gamma son excelentes inhibidores de la actividad de la
descarboxilasa de ornitina (ODC) inducida por TPA en la piel, un
ensayo que se correlaciona bien con el ensayo antipapiloma de piel
(14). Sugirieron que estos retinoides selectivos de RAR\beta y
RAR\gamma eran potentes inhibidores de la actividad de la ODC
in vivo por antagonización de la expresión génica mediada por
AP-1 por unión de RAR\alpha. Si éste es el caso,
entonces (todo-E)-UAB30 (un
antagonista de RAR\alpha débil) no sería un antagonista de
AP-1 eficaz, pero
(todo-E)-UAB8 debería tener
actividad para reprimir la transcripción génica de
AP-1 además de su actividad de transcripción potente
demostrada de homodímeros de RAR (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron retinoides UAB8 y UAB30 previamente
en ensayos de unión y transcripcionales de receptores nucleares RAR
y RXR (Muccio et al., 1.998). Se encontró que el
todo-trans-UAB8 es un excelente
agonista pan-RAR con propiedades similares a ATRA.
9-cis-UAB30 fue esencialmente un
agonista selectivo de RXR con poca actividad para inducir la
transcripción de RAR. 9-cis-UAB8 fue
similar a 9-cis-UAB30 excepto que
activaba débilmente RAR\beta y RAR\gamma.
Todo-trans-UAB30 se unía bien a cada
receptor RAR (valores de IC50 30-55 nM), pero sólo
la transcripción activada mediada por RAR\beta y RAR\gamma. Para
comprender si todo-trans-UAB30 puede
actuar como antagonista de RAR-\alpha, se
estudiaron los efectos de este retinoide en la transcripción mediada
por RAR-\alpha inducida por ATRA. Como se muestra
en la Figura 5, dosis crecientes de
todo-trans-UAB30 (10 a 1.000 nM)
redujo la transcripción mediada por RAR-\alpha por
ATRA a una dosis fija. Ro-41-5253,
un antagonista de RAR-\alpha conocido (Apfel
et al., 1.992, PNAS, 89, 7.129) produce una tendencia similar
a la observada por
todo-trans-UAB30, pero es dos veces
más activo.
ATRA reprime la transcripción de los genes
AP-1 (c-Jun/c-Fos)
de una manera dependiente de la dosis. Para estudiar los retinoides
UAB, se usó el activador de colágeno que contiene un sitio de unión
a AP-1 unido al gen CAT. Junto con el vector de
expresión del receptor de retinoide RAR-\alpha, se
midió la represión de la expresión de los genes inducida por TPA
para los diferentes retinoides UAB en relación con ATRA. Como se
muestra en la Figura 6, los isómeros todo-trans de
UAB8 y UAB30 fueron ambos tan eficaces como ATRA en la reducción de
la expresión de los genes inducida por TPA. Los isómeros
9-cis de los retinoides UAB8 y UAB30 sólo eran muy
eficaces a dosis altas. Así,
todo-trans-UAB8 comparte las
propiedades de ATRA; es un excelente agonista de
pan-RAR y es muy activo en la
trans-represión de AP-1.
Interesantemente, todo-trans-UAB30
sólo reprime la transcripción de AP-1 como otros
retinoides descubiertos (Fanjul et al., 1.994, Nature, 372,
107; Nagpal et al., 1.995, J. Biol. Chem. 270, 923).
\vskip1.000000\baselineskip
Para explorar el potencial de los retinoides UAB
para el tratamiento de APL, se evaluaron los isómeros UAB8 y UAB30
en ensayos in vitro que medían su capacidad para inducir
diferenciación de dos líneas celulares de leucemia APL, células
HL-60 y NB4. Incluso aunque se aislaron células
HL-60 de pacientes APL, sólo la línea celular NB4
contiene la traslocación t (15; 17) que implica que la RAR\alpha
forme la proteína de fusión RAR\alpha/PML. Debido a que esta
mutación característica se realiza de manera estable en células NB4,
es un modelo mejor para juzgar la eficacia retinoide para esta
enfermedad. Una comparación de la eficacia, que ATRA y otros
retinoides UAB inducen diferenciación de células NB4 después de 3
días, se muestra en la Figura 7.
Todo-trans-UAB8 es aproximadamente
10 veces más activo que ATRA durante un intervalo de dosis
(ED_{30} 110 frente a 810 nM). La actividad del ácido
9-cis-retinoico es comparable con la
de ATRA (datos no mostrados); sin embargo, la actividad de
9-cis-UAB30, un ligando altamente
selectivo de RXR, presenta poca actividad incluso a dosis mayores
de 1 mM (ED_{30} > 10 mM). Por el contrario a
todo-trans-UAB8,
todo-trans-UAB30 no es activo hasta
40 mM consistente con el antagonismo del receptor nuclear de
RAR-\alpha. La actividad de
9-cis-UAB8 es sólo 50% tan activa
como ATRA (ED_{30} > 3 mM). Esta actividad puede ser debida a
su capacidad para activar la transcripción mediada por
RAR-\alpha a dosis altas (Muccio et al.,
1.998).
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos sinérgicos potenciales se exploraron
a continuación de usar agonistas RAR y RXR en asociación en
diferenciación de células NB4. Como se indica en la Figura 8A, se
trataron células NB4 con dosis variables de ATRA sólo y en
asociación con isómeros UAB8 y UAB30. Las dosis de los retinoides
UAB8 y UAB30 se eligieron para permitir actividad casi igual de
cada retinoide en relación con ATRA (Berenbaum, 1.989, Pharmacol.
Rev. 41:93). Cuando se trataron células NB4 con ATRA y
9-cis-UAB30, tuvo lugar una
disminución de 10 veces en el valor de ED_{30} (día 3) para la
diferenciación de células NB4. Puesto que
9-cis-UAB30 sólo no presentó efecto
en la diferenciación de células NB4 (Figura 7), esto es un signo
claro de sinergia entre estos dos retinoides.
9-cis-UAB30 potenció el efecto de
ATRA y desplazó el ED_{30} de 810 a 50 nM (ATRA:
9-cis-UAB30 = 1:10). Efectos
similares se observaron también para la diferenciación de células
NB4 usando todo-trans-UAB8 en
asociación con 9-cis-UAB8 (Figura
8B); el desplazamiento en ED_{30} fue de 110 a 25 nM. Los efectos
sinérgicos no son tan evidentes usando 9.cis-UAB8;
sin embargo, cuando se hacen isobolos también se observa sinergia
(Breitman). La sinergia entre los agonistas selectivos RAR y RXR se
ha observado en células NB4 (Chen et al., 1.996, Nature,
382:819) usando otros análogos de retinoides. Los efectos observados
aquí son comparables con los producidos usando el ligando selectivo
de RXR BMS649 (SR11237) y otros agonistas selectivos de RAR.
También se evaluaron los efectos de combinación
entre ATRA y todo-trans-UAB30 para
evaluar los efectos de un antagonista de RAR-a en
la diferenciación de células NB4. Los efectos de la combinación
fueron los más evidentes a altas dosis de ATRA (Figura 8A) fueron
el ED_{30} incrementado de 810 a 2.800 nM. En estudios similares
con todo-trans-UAB8 (Figura 8B),
todo-trans-UAB30 aumentó los valores
de ED_{30} por aproximadamente 5 veces (de 660 a 3.000 nM).
Puesto que todo-trans-UAB30 puede
reprimir la transcripción de AP-1 pero es inactivo
en la diferenciación de células NB4, es poco probable que este modo
de acción desempeñe un papel importante para la diferenciación de
células NB4. En su lugar, el antagonismo de la diferenciación de
células NB4 tanto inducida por ATRA como inducida por
todo-trans-UAB8 por
todo-trans-UAB30 es lo más
consistente con un mecanismo de acción que implica
RAR-\alpha.
Previamente Breitman y colaboradores han
demostrado que la 4-hidroxifenilretinamida
(4-HPR) sola no induce que se diferencien las
células NB4 pero cuando se usa en asociación con ácido
todo-trans-retinoico, aumenta la
diferenciación de células NB4. El uso de la combinación de
todo-trans-UAB8 con
4-HPR se estudió aquí para determinar si se podía
inducir un efecto similar. La diferenciación de células NB4 aumentó
significativamente cuando se expusieron células a
4-HPR 1 y 4 uM con concentraciones variables de
todo-trans-UAB8 (Figura 9). Los
valores de ED50 de todo-trans-UAB8
se desplazaron 100 veces menos (50 nM) con adición de
4-HPR.
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Se aislaron células NB4 de un paciente de APL
que desarrolló resistencia clínica a tratamiento con ATRA (Lanotte
et al., 1.991, Blood, 77: 1.080). Estas células metabolizan
ATRA rápidamente implicando una hidroxilasa citocromo P450
inducible (White et al., 1.996, J BC, 271: 29922). Este
metabolismo reduce rápidamente la eficacia de ATRA e inhibidores
potenciales de esta enzima mejoran la eficacia de esta hormona en la
diferenciación de células NB4.
\vskip1.000000\baselineskip
En 1.991, Emanuel et al (21) demostraron
que la formación espontánea de colonias CFU-GM
observada en JMML se relaciona con la hipersensibilidad selectiva
de células progenitoras hematopoyéticas de JMML a factor de
estimulador de colonias de granulocito-macrófagos
(GM-CSF, por sus siglas en inglés). Desde este
informe inicial, otros (22) han confirmado estas observaciones de
hipersensibilidad GM-CSF como un mecanismo
patogénico en JMML. Adicionalmente en 1.991, Castleberry, Emanuel y
colaboradores también presentaron pruebas preliminares de la
capacidad de (13Z)-AR para inhibir un crecimiento
CFU-GM espontáneo de JMML in vitro así como
pruebas de su posible eficacia clínica en JMML (21). Este estudio
clínico piloto sugirió que los efectos de (13Z)-AR
en el tamiz in vitro están de acuerdo con su eficacia en el
tratamiento de pacientes con JMML en el clínico (5). En este
estudio, se evaluaron primero (todo-E)- y
(9Z)AR en este ensayo in vitro y se demostró que
estos isómeros AR también presentan excelente potencial para inhibir
el crecimiento espontáneo de colonias CFU-GM en
células aisladas de tres pacientes con JMML (Tabla 4).
Los efectos de los isómeros UAB8 y UAB30 sobre
la inhibición de la proliferación de células de JMML humanas se
estudiaron a continuación. Se evaluaron los isómeros de UAB8 en este
ensayo usando células de dos pacientes (Tabla 4).
(Todo-E)-UAB8 fue tan eficaz
como (todo-E)-AR en el
control del crecimiento espontáneo de estas colonias
CFU-GM. Sin embargo, (9Z)- y
(13Z)-UAB8 fueron menos eficaces que los
correspondientes isómeros AR en el control del crecimiento. En
particular, para células J84 de pacientes hay una disminución de 2
veces en la actividad de estos retinoides. Para isómeros UAB30, el
isómero más potente es el (13Z)-UAB30 que presenta
actividad en dos pacientes sólo ligeramente menor que la de AR. Por
el contrario para isómeros UAB8, los isómeros
todo-E de este retinoide es menos activo que
AR y (todo-E)-AUB8. También,
(9Z)-UAB30 presenta menor actividad en este ensayo,
similar al de (9Z)-UAB8.
\vskip1.000000\baselineskip
No hay anormalidades cromosómicas consistentes
en JMML y ninguna que parezca implicar los receptores de retinoides.
Sin embargo, un mecanismo muy plausible (23) para explicar los
efectos de modulación aparentes de AR en la hipersensibilidad en
GM-CSF en JMML es por los efectos antagonistas
inducidos por AR de RAR\alpha sobre el factor de transcripción,
AP-1 (c-jun/c-fos).
La cascada de transducción de la señal GM-CSF por
Ras pareció tener como uno de sus principales criterios de
valoración una regulación ascendente o activación del elemento de
respuesta de AP-1. Este elemento respuesta es
activado por c-jun/c-fos y cuando se
estimula por señalización extracelular (por ejemplo,
GM-CSF), la inducción de AP-1
conduce a proliferación celular entre otros procesos. De hecho en
experimentos de Northern que investigan la expresión de los genes de
respuesta temprana en JMML, Emanuel (22) han observado una
regulación ascendente constitutiva aparente de tanto
c-jun como c-fos, pero no
c-myc. Pfahl (24) demostró en células
epiteliales (25), que el mecanismo por el que AR reprime la
transcripción de los genes mediada por AP-1 es
línea celular específica y puede estar mediada por o los RAR o los
RXR.
El mecanismo preciso para la alta actividad de
(13Z)-AR en la inhibición de la proliferación de
estas células progenitoras mieloides en JMML sigue siendo un área
de investigación. Asumiendo un mecanismo basado en receptor, el
isómero (13Z)-AR puede isomerizar o a
(todo-E)- como a (9Z)-AR e
interactuar con receptores RAR/RXR. La presente invención demuestra
que estos últimos dos isómeros son tan activos como
(13Z)-AR en la prevención de la proliferación en
células JMML, soportando esta suposición. Para demostrar las rutas
mediadas por RAR/RXR, se investigó la capacidad de los retinoides
selectivos de los receptores para evitar la proliferación de células
JMML. La alta actividad de
(todo-E)-UAB8 en este ensayo
de JMML in vitro y la actividad reducida de o
(9Z)-UAB8 o (9Z)-UAB30, dos
retinoides selectivos de RXR, son consistentes con una ruta mediada
por RAR de trans-represión.
(Todo-E)-UAB30 es menos
activo que los otros isómeros AR naturales y
(todo-E)-UAB8. Puesto que se
une bien a cada subtipo RAR, pero no activa la transcripción para
antagonista de RAR\alpha), esta menor actividad en el ensayo de
JMML in vitro en relación con
(todo-E)-UAB8 puede ser
debida a su antagonismo de RAR\alpha o en otras palabras, falta
de antagonismo de AP-1. La unión de ligando es una
condición necesaria pero no suficiente para antagonismo de
AP-1. Esta no es una propiedad inusual de los
retinoides, puesto que se han identificado retinoides que son
antagonistas de RAR\alpha pero no inducen la
trans-represión mediada por RAR de transcripción
mediada por AP-1 (26).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la eficacia de
(9Z)-UAB30 en tumores malignos de mama inducidos por
metilnitrosourea (MNU). La Tabla 5 y la Figura 10 muestran la
comparación entre dos grupos de ratas de peso de tumor
promedio/rata durante un periodo de tiempo
post-inducción con MNU. La Tabla 6 y la Figura 11
muestran la comparación entre los mismos dos grupos de ratas del
peso corporal promedio/rata medido en días diferentes. Los datos
demuestran que el tratamiento de UAB-30 inhibió el
crecimiento de los tumores malignos de mama inducidos por MNU,
mientras no presentaban efectos evidentes para el crecimiento del
cuerpo total.
\vskip1.000000\baselineskip
Se enumeran a continuación ejemplos de
compuestos sintetizados que se relacionan con UAB30 con datos
analíticos:
(9Z)-UAB31
RMN de ^{1}H: (t) 1H \delta 7,17 J = 7,95,
(d) 1H \delta 6,77 J = 7,96, (dd) 1H \delta 6,67 J = 11,10;
4,06, (s) 1H \delta 6,46, (d) 1H \delta 6,25 J = 15,34, (d) 1H
\delta 6,12 J = 11,0; (s) 1H \delta 5,76, (t) 2H \delta 2,75
J = 6,30, (t) 2H \delta 2,34, J = 5,86, (s) 3H \delta 2,21; (s)
3H \delta 1,98; (qui) 2H \delta 1,84 J = 6,10.
\vskip1.000000\baselineskip
(9Z)-UAB32
RMN de ^{1}H: (d) 1H \delta 7,60 J = 8,79,
(m) 3H \delta 6,79-6,65, (s) 1H \delta 6,36, (d)
1H \delta 6,25 J = 15,32, (d) 1H \delta 6,10 J = 10,94, (s) 1H
\delta 5,77, (s) 3H \delta 3,81, (t) 2H \delta 2,83 J = 6,20,
(t) 2H \delta 2,38 J = 6,05, (s) 3H \delta 2,23, (s) 3H \delta
1,98, (qui) 2H \delta 1,82 J = 6,1.
\vskip1.000000\baselineskip
(9Z)-UAB33
RMN de ^{1}H: (d) 1H \delta 7,16 J = 2,54,
(d) \delta 7,06 J = 8,40, (dd) 1H \delta 6,80 J = 2,56, J =
5,81, (dd) 1H \delta 6,68 J = 4,24, J = 11,02, (s) 1H \delta
6,45, (d) 1H \delta 6,26, J = 15,32, (d) 1H \delta 6,13 J =
10,85, (t) 2H \delta 2,79 J = 6,20, (t) 2H \delta 2,38 J = 5,20,
(s) 3H \delta 1,98, (qui) 2H \delta 1,81 J = 6,17.
RMN de ^{13}C (CDCl_{3}): \delta 172,10;
158,27; 155,90; 141,60; 138,71; 136,92; 134,29; 134,18; 130,69;
130,57; 127,82; 122,98; 117,81; 114,59; 109,34; 55,80; 29,81; 28,92;
25,12; 24,45; 14,46.
UV-VIS: I_{max} = 332 nm, e =
19.838
\vskip1.000000\baselineskip
(todo-E)-UAB33
RMN de ^{1}H: (dd) 1H \delta 7,58 J = 3,73;
1,84, (m) 4H \delta 7,20-6,97, (s) 1H \delta
6,51 (d) 1H \delta 6,33, J = 15,05, (d) 1H \delta 6,25 J =
11,4; (s) 1H \delta 5,82, (m) 4H \delta
2,83-2,76, (s) 3H \delta 2,39, (s) 3H \delta
2,09, (qui) 2H \delta 1,85, J = 6,27.
\vskip1.000000\baselineskip
(9Z)-UAB34
RMN de ^{1}H: (d) 1H \delta 7,63 J = 7,29,
(m) 4H \delta 7,26-7,17, (m) 1H \delta
6,74-6,66, (s) 1H \delta 6,46, (d) 1H \delta
6,26 J = 15,35, (d) 1H \delta 6,13 J = 15,35, (s) 1H \delta
5,77, (m) 2H \delta 3,00-2,92, (m) 1H \delta
2,54-2,30, (s) 3H \delta 2,23, (s) 3H \delta
1,99, (m) 2H 1,64-1,54, (d) 3H \delta 1,30 J =
6,98.
\vskip1.000000\baselineskip
(9Z)-UAB35
RMN de ^{1}H: (s) 1H \delta 7,33, (s) 1H
\delta 6,95, (dd) 1H \delta 6,68 J = 4,23 J = 11,04, (s) 1H
\delta 6,41, (d) 1H \delta 6,25 J = 15,33, (d) 1H \delta 6,12
J = 10,98, (s) 1H \delta 5,76, (t) 2H \delta 2,68 J = 6,36, (s)
3H \delta 2,32, (m) \delta 2,36-2,27, (s) 3H
\delta 2,22, (s) 3H \delta 1,97, (qui) 2H \delta 1,85, J =
6,24.
RMN de ^{13}C (CDCl_{3}):
\vskip1.000000\baselineskip
(9Z)-UAB40
RMN de ^{1}H (DMSO): (s) 1H \delta 12,03,
(m) 4H \delta 7,23-7,05, (d) 1H \delta 6,37 J =
15,40, (d) 1H \delta 6,18, J = 11,51, (s) 1H \delta 6,07 (s) 1H
\delta 5,78, (s) 2H \delta 2,74, (s) 2H \delta 2,30, (s) 3H
\delta 2,20, (s) 3H \delta 2,00, (s) 4H \delta 1,66.
Como conclusión, la presente invención muestra
que la sustitución de un anillo de bencilo condensado por grupos
alquilo tiene poco efecto en la conformación en la cadena de polieno
entre C-8 y C-15, pero cambia mucho
las propiedades biológicas de los retinoides UAB restringidos
conformacionalmente. En particular, los perfiles transcripcionales
de los receptores nucleares de isómeros
todo-E se modifican espectacularmente. Para
UAB30, este isómero muestra selectivamente activación de la
transcripción mediada por RAR\beta y RAR\gamma (un antagonista
RAR\alpha), mientras
(todo-E)-UAB8 es un potente
agonista pan-RAR. Los perfiles transactivacionales de los
isómeros 9Z son muy similares; tanto los isómeros (9Z) de UAB8 como
UAB30 son compuestos selectivos de RXR\alpha, mostrando los
últimos la mayor potencia y selectividad. Estos retinoides también
presentan eficacias muy diferentes en diversos ensayos biológicos y
los cambios en sus actividades se correlacionan bien con sus
propiedades transcripcionales individuales. Por ejemplo, la alta
actividad de (todo-E)-UAB8
sobre (todo-E)-UAB30 y
(9Z)-UAB8/(9Z)-UAB30 en la
prevención de papilomas de piel, en la inhibición de la
proliferación de células JMML es consistente con su demostrada
potente actividad para activar la expresión génica mediada por cada
subtipo RAR y/o su actividad putativa para reprimir la expresión
génica de AP-1 por subtipos RAR. Un aspecto
excitante del presente trabajo es la mayor eficacia de
(todo-E)- y (13Z)-UAB8 sobre
(todo-E)-AR en su capacidad
para diferenciar células NB4. El isómero
todo-E de UAB8 es 2 veces menos tóxico que
este isómero de AR 929) y su plasma durante tiempos prolongados.
Tomados juntos, estos dos isómeros de UAB8 y análogos pueden ser
agentes mejorados para uso clínico en el tratamiento de pacientes de
APL.
Además, la presente invención muestra que el uso
de un potente RAR\alpha,
todo-trans-UAB8 junto con un
agonista selectivo de RXR,
9-cis-UAB30, mejora
significativamente la diferenciación de células NB4. Cuando se
compara con ATRA solo, esta combinación es 30 veces más eficaz en
la diferenciación de células NB4. Los datos de toxicidad in
vivo en todo-trans-UAB8 indica
que es menos tóxico que ATRA (Lin et al., 1.996, Toxicol.
Appl. Pharmaco. 139: 310) y los datos preliminares en
9-cis-UAB30 muestran que es mucho
menos tóxico que el ácido
9-cis-retinoico. Tomados junto con
la estabilidad mejorada de los retinoides UAB30, estos datos
sugieren que se puede obtener un tratamiento mejorado de APL cuando
estos agentes se usan combinados.
Las siguientes referencias se citaron en la
presente memoria.
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819-822. (1.996)
(29) Lin, T.-H., et al.,
Toxicol. Appl. Pharmacol. 139: 310-316.
(1.996)
Claims (11)
1. Un compuesto retinoide que es un isómero
9(Z) o un todo(E) con la estructura:
en la que R_{1} es fenilo,
bencilo, alquilo cíclico C_{3}-C_{8}, arilo o
arilalquilo; R_{2} es hidrógeno, etilo, metilo,
n-propilo o isopropilo y n es de 0 a
3.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El compuesto retinoide que es un isómero
9(Z) con la estructura:
en la que el hidrógeno está en el
anillo arílico o un grupo metoxi está en la posición 5', 6' ó 7' en
el anillo arílico o un grupo metilo está en la posición 4' en el
anillo cicloalquílico o un grupo metilo está en la posición tanto
5' como 7' en el anillo
arílico.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El compuesto retinoide que es un isómero
todo(E) con la estructura:
en el que un grupo metoxi está en
la posición 7' en el anillo
arílico.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El compuesto retinoide que es un isómero
9(Z) con la estructura:
\newpage
5. El uso de uno o más de los compuestos
retinoides según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la
preparación de un medicamento eficaz para tratar una afección
neoplásica en un individuo.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que
uno o más compuestos retinoides se combinan con
4-hidroxifenilretinamida.
7. El uso según cualquiera de la reivindicación
5 o la reivindicación 6, en el que la afección neoplásica es un
cáncer de piel, un cáncer de mama, un cáncer de vejiga, un cáncer de
próstata, un cáncer de pulmón, un cáncer de colon o una
leucemia.
8. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en el que el medicamento es eficaz para
reducir o prevenir el caso de la afección neoplásica en el
individuo.
9. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, en el que una dosis de uno o más compuestos
es aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg.
10. Una composición que comprende uno o más de
los compuestos retinoides según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y 4-hidroxifenilretinamida
para el tratamiento de una afección neoplásica en un individuo.
11. Una composición según la reivindicación 10,
en la que la afección neoplásica es un cáncer de piel, un cáncer de
mama, un cáncer de vejiga, un cáncer de próstata, un cáncer de
pulmón, un cáncer de colon o una leucemia.
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