ES2345987T3 - Plantas que tienen un mejor rendimiento y metodo para su elaboracion. - Google Patents

Abstract

Un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, que comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente que codifica una proteína ciclina A2 que contiene un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo que consiste de E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S, que tiene tres residuos (- -T- - - - -F-F- - -), cuyo ácido nucleico para ciclina A2 está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla.

Description

Plantas que tienen un mejor rendimiento y método para su elaboración.

La presente invención se relaciona generalmente con el campo de la biología molecular y particularmente con un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para incrementar el rendimiento de una planta que comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente que codifica una proteína ciclina A2 que incluye un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S, que tiene tres residuos (- - T - - - - - F - - F - - -), cuyo ácido nucleico está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla. La presente invención también se relaciona con plantas que tienen mayor expresión de un ácido nucleico para ciclina A2 en tejido de semilla de la planta y/o actividad modulada y/o niveles de una proteína ciclina A2 en tejido de semilla de la planta, cuyas plantas tienen mayor rendimiento con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre y con relación a las correspondientes plantas transgénicas en las cuales se expresa constitutivamente la ciclina A2.

La población mundial siempre en crecimiento y la disminución de la oferta de tierras cultivables disponibles para la agricultura estimulan la investigación agrícola hacia el mejoramiento de la eficiencia de la misma. Un medio convencional para mejoras en los cultivos y en la horticultura utiliza técnicas selectivas de reproducción para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de reproducción tienen varios inconvenientes, a saber, que estas técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en plantas que contienen a menudo componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden resultar en el paso del rasgo deseable de las plantas madre. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de entregar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos agronómicos u hortícolas económicos mejorados. Se produce un rasgo de interés económico particular. Normalmente se define el rendimiento como la producción mensurable de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diferentes factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), la producción de semillas y más. El desarrollo de raíces, el consumo de nutrientes y la tolerancia al estrés son también factores importantes en la determinación del rendimiento. El rendimiento del cultivo puede incrementarse optimizando uno de los factores anteriormente mencionados, que puede lograrse modificando los mecanismos inherentes de crecimiento de una
planta.

Los mecanismos inherentes de crecimiento de una planta residen en una secuencia altamente ordenada de eventos colectivamente conocidos como el "ciclo celular". La progresión a través del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los componentes principales del ciclo celular están altamente conservados en levadura, mamíferos, y plantas. El ciclo celular se divide típicamente en las siguientes fases secuenciales: G0- G1 - S - G2 - M. La replicación o la síntesis del ADN generalmente tienen lugar durante la fase S ("S" es por la síntesis de ADN) y la segregación mitótica de los cromosomas ocurre durante la fase M (la "M" es por mitosis), con la intervención de fases de crecimiento, G1 (durante la cual las crecen las células antes de la replicación del ADN) y G2 (un período después de la replicación del ADN durante el cual se prepara la célula para la división). La división celular se completa después de citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han salido del ciclo celular y que se han vuelto inactivas se dice que están en la fase G0. Las células en esta fase pueden ser estimuladas para reingresar al ciclo celular en la fase G1. La "G" en G1, G2 y G0 significa "crecimiento". La terminación del proceso del ciclo celular permite que cada célula hija durante la división celular reciba una copia completa del genoma de los padres.

La división celular se controla por dos eventos principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la síntesis del ADN y la iniciación de la mitosis. Cada transición a cada uno de estos eventos clave es controlada por un punto de control representado por complejos específicos de proteína (involucrados en la replicación y división del ADN). La expresión de los genes necesarios para la síntesis de ADN en el límite de G1/S es regulada por la familia E2F de factores de transcripción en mamíferos y células vegetales (La Thangue, 1994; Muller y colaboradores, 2001; De Veylder y colaboradores, 2002). La entrada en el ciclo celular es regulada/activada por un complejo E2F/Rb que integra señales y permite la activación de la transcripción de genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por lo tanto el progreso a través del ciclo celular, es conducido por la formación y activación de diferentes proteína serina/treonina quinasas, generalmente denominadas como quinasas dependientes de la ciclina (CDK). Un prerrequisito para la actividad de estas quinasas es la asociación física con una ciclina específica, siendo el momento de la activación muy dependiente de la expresión de la ciclina. El enlazamiento de ciclina induce cambios conformacionales en el lóbulo N-terminal de la CDK de asociación y contribuye a la localización y especificidad del sustrato del complejo. Las CDK monoméricas se activan cuando están asociadas con ciclinas y por lo tanto tienen actividad de quinasa. Los niveles de proteína ciclina fluctúan en el ciclo celular y por lo tanto representan un factor principal en la determinación del momento de activación de la CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular media la regulación temporal de las transiciones del ciclo celular (puntos de control). Otros factores que regulan la actividad de la CDK incluyen inhibidores de CDK (las CKI o las ICK, las KIP, las CIP, las INK), quinasas que activan CDK (las CAK), una CDK fosfatasa (Cdc25) y una subunidad de CDK (CKS) (Mironov y colaboradores, 1999; Reed 1996).

Se han descrito tres subclases diferentes de ciclinas tipo A de Arabidopsis (A1, A2, y A3) (que contienen 10 ciclinas). Se han reportado dos genes del tipo A1 (CYCA1;1 y CYCA1;2), cuatro genes del tipo A2 (CYCA2;1, CYCA2;2, CYCA2;3, y CYCA2;4), y cuatro genes del tipo A3 (CYCA3;1, CYCA3;2, CYCA3;3, y CYCA3;4) en Vandepoele y colaboradores (The Plant Cell, Vol. 14, 903 - 916, Abril 2002).

La solicitud internacional WO 01/85946 describe diferentes proteínas del ciclo celular, incluida la ciclina As. Se menciona que se pueden utilizar las proteínas del ciclo celular en agricultura para mejorar las características de crecimiento de una planta, tales como la velocidad de crecimiento o el tamaño de tejidos u órganos específicos, arquitectura o morfología de una planta, mayor rendimiento del cultivo, mayor tolerancia a las condiciones de estrés ambiental (tales como sequía, salinidad, temperatura o privación de nutrientes), mejor tolerancia a los patógenos de la planta que abusan del ciclo celular o como objetivos para facilitar la identificación de inhibidores o activadores de los CCP que pueden ser útiles como herbicidas o reguladores del crecimiento de la planta.

Se puede incrementar el rendimiento de muchas formas, algunas sorprendentes. Por ejemplo, el factor principal que contribuyó a mejorar el rendimiento del trigo y el arroz en los años 60 (la así llamada revolución verde) es la reducción de la altura de la planta (Sakamoto y Matsuoka, Current Opinion in Biotechnology 2004, 15: 144 - 147). Habiendo utilizado grandes cantidades de fertilizador de nitrógeno, las variedades tradicionales de ese tiempo crecieron excesivamente altas y derrumbadas, conduciendo a pérdidas significativas en rendimiento. En contraste, debido a su corta estatura, las variedades semienanas de la revolución verde fueron más resistentes, lo cual resultó en doble rendimiento del cultivo.

Se ha encontrado sorprendentemente ahora que se puede incrementar el rendimiento de semillas de la planta por medio de la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente codificando una proteína ciclina A2 que incluye un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S, que tiene tres residuos (- - T - - F - - F- - -), cuyo ácido nucleico para ciclina A2 está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla. La expresión de un ácido nucleico para ciclina A2 bajo el control de un promotor preferido de la semilla resulta en un mayor rendimiento que aquel obtenido por la expresión de una ciclina A2 que es constitutivamente expresada en una planta.

Por lo tanto de acuerdo a una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semilla de una planta, que comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico para ciclina A, preferiblemente que codifica una proteína ciclina A2 que incluye un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S, que tiene tres residuos (- - T - - - - - F - - F - - -), cuyo ácido nucleico para ciclina A2 está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla.

El desempeño del método de acuerdo con la presente invención resulta en un mayor rendimiento de la planta. El término "mayor rendimiento" como se define aquí abarca un incremento en biomasa (peso) en una o más partes de un planta con relación a la biomasa de las plantas de control. El término también incluye un incremento en el rendimiento de semilla, que incluye un incremento en la biomasa de la semilla (peso de la semilla) y/o un incremento en el número de semillas (llenas) y/o un incremento en el tamaño de las semillas y/o un incremento en el volumen de las semillas, cada uno con relación a las plantas de control. Un incremento en el tamaño y/o el volumen de las semillas puede influir también en la composición de las semillas. Un incremento en el rendimiento de semillas puede resultar de un incremento en el número y/o el tamaño de las flores. Un incremento en el rendimiento puede incrementar también el índice de cosecha, que se expresa como la relación de la biomasa total sobre el rendimiento de partes cosechables, tal como semillas. Un incremento en rendimiento puede incrementar también el peso de mil granos (TKW), que se extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso total.

Tomando al maíz como ejemplo, un incremento en rendimiento se puede manifestar como uno o más de lo siguiente: un incremento en el número de plantas por hectárea o acre, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de hileras, en el número de granos por hilera, en el peso del grano, en el peso de mil granos, en la longitud/diámetro, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, un incremento en rendimiento puede manifestarse como un incremento en uno o más de lo siguiente: el número de plantas por hectárea o acre, el número de panículas por planta, el número de espiguillas por panícula, el número de flores por panícula, un incremento en la tasa de llenado de las semillas, un incremento en el peso de mil granos, entre otros.

Se puede incrementar adicionalmente el rendimiento, o se puede evaluar mejor el rendimiento en plantas híbridas. Un cultivo tal como el maíz se comercializa típicamente como un híbrido. El objetivo de la reproducción del cultivo en el campo es el de combinar diferente rasgos deseables en una variedad única o en un híbrido. La reproducción se efectúa a través de diferentes técnicas que toman ventaja del método de polinización de las plantas (autopolinización, como ocurre con el arroz o la polinización cruzada, como en el caso del maíz). La reproducción de los cereales involucra a menudo autopolinización y etapas de polinización cruzada. Tomando al maíz como ejemplo, la producción de nuevas variedades frecuente implica el desarrollo, selección y producción de líneas parentales puras que son posteriormente utilizadas para producir maíz híbrido con ciertas características deseadas. Por lo tanto, el desarrollo de híbridos de maíz requiere del desarrollo de líneas puras homocigotas, el cruzamiento de estas líneas y la evaluación de estos cruces (híbridos). Luego puede hacerse la introducción de características deseables por medio de cruzamiento (introducción genética) o por introducción molecular a través de técnicas de transformación. Para determinar el comportamiento del producto en el campo, se puede hacer una evaluación del nuevo cultivo sobre una población homogénea de plantas endogámicas homocigotas, o sobre un híbrido entre dos líneas endogámicas homocigotas. Las técnicas anteriormente mencionadas son bien conocidas en el arte.

Más particularmente, el mayor rendimiento de semillas de acuerdo con el método de la invención se manifiesta como uno o más de lo siguiente: mayor peso de la semilla, mayor número de semillas llenas, mayor número de semillas, mayor tamaño de las semillas, mayor índice de cosecha, mayor peso de mil granos y composición modificada de la semilla, cada uno con relación a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semilla de una planta, en donde el mayor rendimiento de semilla de una planta se selecciona de uno o más de: mayor peso de la semilla, mayor número de semillas llenas, mayor número de semillas, mayor tamaño de las semillas, mayor índice de cosecha, mayor peso de mil granos y composición modificada de la semilla, cada uno con relación a las plantas de control, cuyo método comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente que codifica una proteína ciclina A2 que incluye un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S, que tiene tres residuos (- - T - - - - - F - - F - - -), cuto ácido nucleico para ciclina A está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla.

Ya que las plantas transgénicas descritas aquí han incrementado el rendimiento de semillas, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (al menos durante parte de su ciclo de vida) con relación a la tasa de crecimiento de las plantas de control en la etapa correspondiente en su ciclo de vida. La mayor tasa de crecimiento puede ser específica para una o más partes de una planta (incluidas las semillas), o puede ser sustancialmente a través de toda la planta. En el caso de las semillas, especialmente aquellas de los cereales, la madurez de la semilla puede estar relacionada con el contenido de humedad de las semillas cuando están intactas en una planta. El contenido de humedad, que da una indicación de la madurez de la semilla, dará por lo tanto también una indicación de la tasa de crecimiento de las semillas comparado con las plantas de control. Una persona capacitada en el arte será muy consciente, para cualquier especie dada de planta, de que el contenido de humedad es indicativo de que una semilla está lista para la cosecha. El contenido de humedad se puede medir utilizando técnicas conocidas.

Además, el incremento en la tasa de crecimiento puede presentarse en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante todo el ciclo de vida de la planta. La mayor tasa de crecimiento durante las primeras etapas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un mayor vigor.

El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que sería posible. El término "ciclo de cosecha" como se define aquí se entiende como el tiempo entre la siembra y la cosecha de una planta. Si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, puede permitir la siembra de más semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de las plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz, todo entro de un período convencional de crecimiento). En forma similar, si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, puede dar lugar a la posibilidad de sembrar más semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido, por ejemplo, por la siembra y cosecha opcional de soja, patatas o cualquier otra planta adecuada). La cosecha del mismo rizoma puede tener lugar, en el caso de algunas plantas, en períodos adicionales del año. La posibilidad de alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que cualquier planta particular puede ser sembrada y cosechada). Un incremento en la tasa de crecimiento puede permitir también el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que los límites territoriales para la siembra de un cultivo a menudo se determinan por medio de condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la siembra (comienzo de la temporada) o al momento de la cosecha (fin de la temporada). Tales condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha.

Se puede determinar la tasa de crecimiento derivando diferentes parámetros a partir de curvas de crecimiento por medio de las gráficas de experimentos de crecimiento; tales parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar 90% de su tamaño máximo), entre otros.

También se describen métodos de la invención que resultan en plantas que tienen una tasa de crecimiento modificada. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se revela un método para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, el cual comprende la introducción en una planta de ácido nucleico para ciclina A, que preferiblemente codifica una proteína ciclina A, en donde el ácido nucleico para ciclina A está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla.

Un incremento en el rendimiento y/o en la tasa de crecimiento también incluye un mejor desempeño de la planta bajo condiciones sin estrés así como bajo condiciones de estrés comparado con las plantas de control. Las plantas responden típicamente a la exposición al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta puede detener el crecimiento completamente. Por otro lado, un estrés suave es definido aquí como cualquier estrés en el cual la planta no detiene su crecimiento completamente. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con plaguicidas) no se encuentran a menudo estreses severos en plantas de cultivo cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés suave es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Los estreses suaves son los estreses típicos a los cuales puede ser sometida una planta. Estos estreses pueden ser los estreses bióticos y/o abióticos diarios (ambientales) a los cuales está expuesta una planta. Los estreses abióticos o ambientales típicos incluyen estreses por temperatura causados por calor atípico o por temperaturas frías o de congelación; estrés por salinidad; estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos pueden ser provocados también por compuestos químicos. Los estreses bióticos son típicamente aquellos estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.

En una modalidad de la presente invención, la ciclina A2 que es introducida en una planta es preferiblemente una ciclina A2;2.

Un "ácido nucleico para ciclina A" como se define aquí se entiende como un ácido nucleico que codifica una proteína que en forma nativa incluye un motivo 1, que es representado como: W L V/I E.V S/A D/E D/E Y K/R/T L (motivo 1), donde una barra invertida (/) significa "o", es decir donde "V/I" significa V o I. La presencia del motivo 1 en una secuencia de aminoácidos permite que la secuencia sea identificada como una ciclina A en vez de cualquier otro tipo de ciclina.

El término "ácido nucleico para ciclina A2" como se define aquí es cualquier ácido nucleico que codifica una proteína que en su forma nativa incluye un motivo 1 como se definió anteriormente y adicionalmente un motivo 2, que se representa como: E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G \sneg{F} R/L L/R/K/N \sneg{F} L P S (motivo 2), en donde la presencia de al menos dos de los residuos identificados (-T- - - -F- -F- -) (y subrayados anteriormente) permiten identificar la secuencia como una ciclina de tipo A2 en vez de cualquier otra ciclina A. Los guiones (-) anteriores representan residuos aminoácidos, donde un guión es igual a un residuos aminoácido en una posición correspondiente en el motivo 2.

El término "ácido nucleico para ciclina A2;2" como se define aquí es cualquier ácido nucleico para ciclina A que codifica una proteína que tiene un orden creciente de preferencia al menos de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad de secuencia o en forma similar a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.

Un "aminoácido para ciclina A" o una "proteína ciclina A" como se define aquí se entiende como un aminoácido que en su forma nativa incluye un motivo 1, que se representa como: W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L (motivo 1), donde una barra invertida (/) significa "o", es decir donde "V/I" significa V o I. La presencia del motivo 1 en una secuencia de aminoácidos permite que la secuencia sea identificada como una ciclina A en vez de cómo cualquier otro tipo de ciclina.

El término "aminoácido para ciclina A2" o "proteína ciclina A2" como se define aquí es cualquier aminoácido que en su forma nativa incluye al motivo 1 como se identificó anteriormente y adicionalmente el motivo 2, que se representa como: ELI L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S (motivo 2), en donde la presencia de al menos dos de los residuos identificados (-T- -F-F- -) (y subrayados anteriormente) permite que la secuencia sea identificada como una ciclina de tipo A2 en vez de cómo cualquier otra ciclina A. Los guiones (-) anteriores representan residuos aminoácidos, donde un guión es igual a un residuo aminoácido en una posición correspondiente en el motivo 2.

El término "aminoácido para ciclina A2;2" o "proteína ciclina A2;2" como se define aquí se entiende una proteína ciclina A que tiene en orden creciente de de preferencia al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de homología con la secuencia de aminoácidos representada como la SEQ ID NO: 2.

El ácido nucleico para ciclina A2 que se introduce en una planta se puede derivar de cualquier fuente siempre que el ácido nucleico, cuando se sobreexpresa en el tejido de la semilla de una planta, conduce a mayor rendimiento de semilla de la planta. El ácido nucleico que va a ser introducido en una planta se puede aislar a partir de una fuente microbiana, tal como bacteria, levadura u hongo, o de una planta, alga o fuente animal. Este ácido nucleico puede ser sustancialmente modificado a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de una manipulación humana deliberada. La secuencia de ácido nucleico es preferiblemente una secuencia homóloga de ácido nucleico, es decir una secuencia de ácido nucleico obtenida a partir de una planta, ya sea de la misma especie de planta o diferente. La secuencia de ácido nucleico se puede aislar a partir de una especie monocotiledónea o dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, preferiblemente además de Arabidopsis thaliana. Más preferiblemente, la ciclina A es del tipo ciclina A2, tal como una ciclina A2;1, A2;2, A2;3 o A2;4. En una modalidad particularmente preferida, la ciclina A2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

Aunque la presente invención ha sido ejemplificada con un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1 y un aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2, se pueden llevar a cabo los métodos utilizando variantes de aminoácidos de ciclina A2 y variantes de ácidos nucleicos para ciclina A2.

La variante de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos útiles en la práctica de los métodos de acuerdo con la invención, incluye:

(i)

Porciones funcionales de un ácido nucleico para ciclina A2;

(ii)

Secuencias capaces de hibridar hasta un ácido nucleico para ciclina A2/gen;

(iii)

Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico para ciclina A2/gen;

(iv)

Variantes alélicas de un ácido nucleico para ciclina A2/gen;

(v)

Variantes debidas a la degeneración del código genético; y

(vi)

Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína ciclina A2.

El término "ácido nucleico" como se lo utiliza aquí abarca hebras complementarias y al correspondiente ARN, ADN, ADNc y ADN genómico. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario.

Para una persona capacitada en el arte sería evidente que una secuencia completa de ADN para ciclina A2 no es un prerrequisito para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención, pero que se pueden emplear porciones funcionales de un ácido nucleico para ciclina A. Una porción funcional se refiere a una pieza de ADN derivada o preparada a partir de una molécula original de ADN (más larga), cuya porción de ADN, cuando se la introduce y expresa en una planta, produce plantas que tienen mayor rendimiento de semillas. La porción puede incluir muchos genes, con o sin elementos adicionales de control, o puede contener solo secuencias espaciadoras. Las porciones adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas de rutina. Por ejemplo, se pueden hacer una o más supresiones y/o truncamientos a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 sin afectar su habilidad para desempañarse en los métodos de acuerdo con la invención. Las porciones adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas de rutina, tal como por medio del análisis de la actividad de la ciclina A2 y/o siguiendo los métodos descritos en la sección de los Ejemplos simplemente por sustitución de la secuencia utilizada en el ejemplo concreto con la porción que va a ser analizada por funcionalidad. Una porción preferida para uso en los métodos de la invención es capaz de codificar una proteína que incluye un motivo 1 y preferiblemente adicionalmente al motivo 2. Preferiblemente además, la porción es una porción de un ácido nucleico para ciclina A2 como el representado por la SEQ ID NO: 1.

Por lo tanto, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, que comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de una porción funcional de un ácido nucleico para ciclina A, preferiblemente como el representado por la SEQ ID NO: 1, cuya porción funcional está operativamente enlazada a un promotor preferido de la semilla.

Las secuencias capaces de hibridar hasta un ácido nucleico para ciclina A2, tal como aquella representada por la SEQ ID NO: 1, puede ser útil también en la realización de los métodos de acuerdo con la invención. El término "hibridación" como se lo define aquí es un proceso en donde secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede presentarse completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas en biología molecular que se apoyan en tal proceso incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los métodos con base en la misma), hibridación substractiva, extensión aleatoria del iniciador, mapeo mediante nucleasa S1, extensión del iniciador, transcripción inversa, síntesis de ADNc, despliegue diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN. Puede presentarse también el proceso de hibridación con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a una matriz tal como cuentas magnéticas, cuentas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular que confían en tal proceso incluyen el aislamiento de poli (A+) ARNm. El proceso de hibridación puede presentare además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado por ejemplo por medio de fotolitografía por ejemplo a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología molecular que se apoyan en tal proceso incluyen análisis de transferencias en gel de ARN y ADN, hibridación en colonia, hibridación en placa, hibridación in situ e hibridación en microarreglo. Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una hebra doble en dos hebras sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleico monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal y la composición del amortiguador de hibridación. Las condiciones altamente rigurosas para hibridación incluyen alta temperatura y/o baja concentración de sal (las sales incluyen NaCl y citrato de Na_{3}) y/o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o la disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergente) en el amortiguador de hibridación y/o la exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol (que promueve el amontonamiento molecular) del amortiguador de hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación están descritas, por ejemplo, en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, pero la persona capacitada se dará cuenta que se pueden diseñar numerosas condiciones diferentes de hibridación en función de la homología conocida o la esperada y/o la longitud de la secuencia de ácido nucleico. Se prefieren particularmente las condiciones de hibridación de baja rigurosidad para aislar ácidos nucleicos heterólogos a las secuencias de ADN de la invención definidas más arriba. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad es 4 - 6x SSC/0.1 - 0.5% p/v de SDS a 37 - 45ºC durante 2 - 3 horas. Dependiendo de la fuente y concentración del ácido nucleico involucrado en la hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de rigurosidad, tal como condiciones de rigurosidad media. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad media incluyen 1 - 4 x SSC/0.25% p/v de SDS a \geq 45ºC durante 2 - 3 horas. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye 0.1 - 1 x SSC/0.1% p/v de SDS a 60ºC durante 1 - 3 horas. La persona capacitada en el arte será consciente de diferentes parámetros que pueden ser alterados durante la hibridación y el lavado y que o bien cambiarán o mantendrán las condiciones de rigurosidad. Los elementos que contribuyen a la heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y diferencias en el uso del codón preferido.

Las secuencias preferidas capaces de hibridación con un ácido nucleico para ciclina A2, tal como la representada como la SEQ ID NO: 1, son aquellas secuencias de hibridación capaces de codificar una proteína que contiene un motivo 1 y adicionalmente preferiblemente un motivo 2. Las secuencias de hibridación adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas de rutina, tales como el análisis de la actividad de la ciclina A2 y/o siguiendo los métodos descritos en la sección de los Ejemplos simplemente sustituyendo la secuencia utilizada en el ejemplo concreto con la secuencia de hibridación que es analizada por funcionalidad.

Por lo tanto, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, que comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico para ciclina A2 como se definió aquí anteriormente, preferiblemente con un ácido nucleico para ciclina A2 como el representado por la SEQ ID NO: 1 que incluye un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/A/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N E L P S, que tiene tres residuos (- - T - - - - - F - - F - - -), cuya secuencia de hibridación está operativamente enlazada a un promotor preferido de la semilla.

Los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados también utilizando una variante alternativa de empalme de un ácido nucleico para ciclina A2, tal como aquel representado por la SEQ ID NO: 1. El término "variante alternativa de empalme" como se lo utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual han sido cortados, reemplazados o añadidos intrones y/o exones seleccionados. Tales variantes serán aquellas en las cuales la actividad biológica de la proteína permanece inalterada, lo cual puede lograrse reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteína codificada por el ácido nucleico. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser producidas por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes de empalme son conocidos en el arte. Las variantes preferidas de empalme codifican una proteína que contiene un motivo 1 y preferiblemente adicionalmente un motivo 1 y preferiblemente adicionalmente un motivo 2. Las variantes de empalme de un ácido nucleico para ciclina A2 adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar muy fácilmente utilizando técnicas de rutina, tales como por medio del análisis de la actividad de la ciclina A2 y/o siguiendo los métodos descritos en la sección de Ejemplos simplemente sustituyendo la secuencia utilizada en el ejemplo concreto con la variante de empalme que va a ser analizada por funcionalidad.

Por lo tanto, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, que comprende la introducción en una planta de una variante de empalme de un ácido nucleico para ciclina A, preferiblemente una variante de empalme de una secuencia de ácido nucleico como la representada por la SEQ ID NO: 1, cuya variante de empalme está operativamente enlazada a un promotor preferido de la semilla.

Convenientemente, los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados también utilizando variantes alélicas de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente variantes alélicas de un ácido nucleico para ciclina A2 como el representado por la SEQ ID NO: 1. Existen variantes alélicas en la naturaleza y dentro de los métodos de la presente invención está incluido el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótidos Individuales (SNP), así como Pequeños Polimorfismos de Inserción/Supresión (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menor a 100 pb). Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos. Las variantes alélicas preferidas codifican una proteína que contiene un motivo 1 y preferiblemente adicionalmente un motivo 2. Las variantes alélicas de un ácido nucleico para ciclina A adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas de rutina, tales como por medio del análisis de la actividad de la ciclina A2 y/o siguiendo los métodos descritos en la sección de Ejemplos por simple sustitución de la secuencia utilizada en el ejemplo concreto con la variante alélica que va a ser analizada por funcionalidad.

Por lo tanto, de acuerdo a otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, que comprende la introducción en una planta de una variante alélica de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente una variante alélica de un ácido nucleico para ciclina A2 como el representado por la SEQ ID NO: 1, cuya variante alélica está operativamente enlazada a un promotor preferido de la semilla.

Los ejemplos de variantes de aminoácidos de ciclina A2 incluyen homólogos, derivados y fragmentos activos de una ciclina A2 representada por la SEQ ID NO: 2.

Los "homólogos" de una proteína ciclina A2 abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada a partir de la cual se derivan ellos. Para producir tales homólogos, se pueden reemplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como similar, hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras de hélice \alpha o estructuras de lámina \beta). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company). Preferiblemente, los homólogos tienen un orden mayor de preferencia al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% o más de identidad de secuencia (identidad funcional) con la ciclina A representada por la SEQ ID NO: 2. Los homólogos que tienen al menos 40% de identidad de secuencia abarcan ciclina A sin cubrir ninguna otra clase de ciclina.

Dos formas especiales de homología, ortólogos y parálogos, son conceptos evolutivos utilizados para describir relaciones ancestrales de genes. El término "parálogos" se relaciona con duplicaciones de genes dentro del genoma de una especie conduciendo a genes parálogos. El término "ortólogos" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a relaciones ancestrales.

Ortólogos, por ejemplo en especies de plantas monocotiledóneas se pueden encontrar fácilmente llevando a cabo la así llamada búsqueda recíproca por rompimiento. Esto puede hacerse por medio de un primer rompimiento que involucra el rompimiento de la secuencia en cuestión (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI que se encuentra públicamente disponible que puede encontrarse en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si sembraran ortólogos en arroz, se rompería la secuencia en cuestión contra, por ejemplo los 28,469 clones de ADNc de longitud completa de Nippombare de Oryza sativa disponible en la NCBI. Se puede utilizar BLASTn cuando se parte de nucleótidos o TBLASTX cuando se parte de la proteína, con valores estándar por defecto (expectativa 10 alineación 50). Se pueden filtrar los resultados del rompimiento. Se rompen entonces nuevamente las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los no filtrados (segundo rompimiento) contra la secuencia en cuestión (SEQ ID NO: 1 ó 2). Se comparan luego los resultados del primero y segundo rompimientos. En el caso de familias grandes, se utiliza ClustalW seguido por un árbol de unión de vecinos para ayudar a visualizar el agrupamiento. Los ejemplos de ortólogos de ciclina A incluyen las secuencias depositadas bajo los siguientes números de accesos: un ortólogo de arroz depositado bajo el número de acceso de proteína AK106653 (ciclina tipo A2), un ortólogo de arroz depositado bajo el número de acceso de proteína BAA86628 (ciclina tipo A1) y un ortólogo de maíz depositado bajo el número de acceso AAC50013.

El término "homólogos" como se lo utiliza aquí también abarca parálogos y ortólogos de las proteínas útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

"Variantes de sustitución" de una proteína son aquellas en las cuales se ha removido al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones serán usualmente aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos aminoácidos y las supresiones están en el rango aproximadamente de 1 a 20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Las "variantes de inserción" de una proteína son aquellas en las cuales se introducen uno o más residuos aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo así como inserciones dentro de la secuencia de múltiples aminoácidos o de aminoácidos individuales. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán menores que las fusiones del terminal amino o del terminal carboxilo, aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión del terminal amino o del terminal carboxilo incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de un activador transcripcional como el utilizado en el sistema doblemente híbrido de levadura, etiqueta de (histidina) 6, etiqueta de glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo, Tag 100, epítopo c-myc, epítopo de FLAG®, lacZ, CMP (péptido para enlazamiento de calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Las "variantes de supresión" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de la proteína. Las variantes de aminoácidos de una proteína pueden ser elaboradas fácilmente utilizando técnicas conocidas en el arte para síntesis de péptidos, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para elaboración de mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN son conocidas por aquellos capacitados en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro del Gen T7 (USB, Cleveland, OH), mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Los métodos para la búsqueda e identificación de homólogos de ciclina A2 estarían también dentro del campo de conocimiento de una persona capacitada en el arte. Los métodos para el alineamiento de secuencias para comparación son conocidos en el arte, y tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 - 453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de correspondencias y minimiza el número de vacíos. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para llevar a cabo el análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information.

El término "derivados" se refiere a péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que incluyen sustituciones, supresiones o adiciones de residuos aminoácidos de ocurrencia natural y no natural comparados con una secuencia de aminoácidos para ciclina A2, tal como aquella representada por la SEQ ID NO: 2. Los "derivados" de una proteína ciclina A2 abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos aminoácidos de ocurrencia no natural o alterados, glicosilados, asilados de ocurrencia natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes que no son aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando enlazado en forma covalente o no covalente con la secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, una molécula reportera que está enlazada para facilitar su detección, y residuos aminoácidos de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de ocurrencia natural.

Los "fragmentos activos" de una proteína ciclina A2 incluyen al menos un motivo 1 y preferiblemente adicionalmente un motivo 2 y retienen una actividad biológica y/o funcional similar a la de la proteína de ocurrencia natural.

Se transforman las plantas con un vector que contiene la secuencia de interés (es decir, el ácido nucleico para ciclina A2), cuya secuencia está operativamente enlazada a un promotor preferido de la semilla.

Por lo tanto, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona una construcción que comprende:

(i)

un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L UR/K/N E L P S, que tiene tres residuos (- - T - - - - - F - - F - - -);

(ii)

un promotor preferido de la semilla; y opcionalmente

(iii)

una secuencia de terminación de la transcripción.

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El ácido nucleico para ciclina A puede ser cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas para ciclina A2 incluidas las secuencias de la variante para ciclina A. Los promotores adecuados preferidos de la semilla se definen aquí más adelante.

Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" son todos utilizados aquí en forma intercambiable y se deben entender en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces efectuar la expresión de las secuencias con las cuales están ligadas. El término "operativamente enlazado" como se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia del promotor y el gen de interés, de tal manera que la secuencia del promotor sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Abarcadas por los términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluida la caja TATA que es requerida para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias de activación secuencia arriba, reforzadores y silenciadores) que alteran la expresión del gen en respuesta a estímulos externos y/o de desarrollo, o en una forma específica del tejido. También está incluida dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula sintética de fusión o derivada que confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Convenientemente, se pueden llevar a cabo los métodos de la invención utilizando cualquier promotor preferido de la semilla. Un promotor preferido de la semilla en el contexto de la presente invención es un promotor que es predominantemente activo en tejido de la semilla, pero no necesariamente exclusivamente activo en tejido de la semilla. Tejido de la semilla incluye a cualquier parte de la semilla incluido el recubrimiento de la semilla, la capa de aleurona, el endospermo (para monocotiledóneas y dicotiledóneas endospérmicas), el embrión (escutelo, epiblasto, plúmula, radícula para monocotiledóneas; cotiledóneas, hipocotiledóneas, y radícula para dicotiledóneas). Un promotor preferido para la realización del método de acuerdo con la invención es uno que sea activo en el endospermo, tal como el promotor de globulina alfa del arroz, el promotor de globulina de la avena, el promotor de glutelina del trigo o el arroz, blz2, el factor de transcripción del arroz RISBZ1. Se prefiere particularmente un promotor activo en el endospermo, cuyo promotor sea preferiblemente activo durante y después de la germinación, tal como el promotor de prolamina del arroz.

Los ejemplos de promotores adecuados para la práctica de los métodos de la presente invención se presentan en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 Promotores preferidos de la semilla

1

TABLA 1 (continuación)

2

Opcionalmente, se pueden utilizar también una o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término "terminadora" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento y poliadenilación 3' de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir reforzadores tanto transcripcionales como de traducción. Aquellos capacitados en el arte se darán cuenta de secuencias terminadoras y reforzadoras que pueden ser adecuadas para ser utilizadas en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o las podría obtener fácilmente una persona capacitada en el arte.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando se requiere que una construcción genética sea mantenida en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo una molécula de plásmido o de cósmico). Los orígenes preferidos de replicación incluyen pero no se limitan al f1-ori y colE1.

La construcción genética puede incluir opcionalmente un gen marcador que puede ser seleccionado. Como se lo utiliza aquí, el término "gen marcador que puede ser seleccionado" incluye a cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o selección de células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar a partir de marcadores que confieran resistencia a los antibióticos o a los herbicidas o que introduzcan un nuevo rasgo metabólico o que permitan selección visual. Las células que contienen al ADN recombinante serán capaces por lo tanto de sobrevivir en presencia de concentraciones de antibiótico o de herbicida que matan a las células no transformadas. Los ejemplos de genes marcadores que pueden ser seleccionados incluyen al gen bar que proporciona resistencia al herbicida Basta; el gen npt que confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el gen hpt que confiere resistencia a la higromicina. Se pueden utilizar también marcadores visuales tales como la Proteína Fluorescente Verde (GFP, Haseloff y colaboradores, 1997, \beta-glucuronidasa (GUS) o luciferasa como marcadores que pueden ser seleccionados).

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el arte. Se pueden insertar las construcciones génicas en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformación en plantas y adecuados para expresión del gen de interés en las células transformadas.

La proteína ciclina A2 por sí misma y/o el ácido nucleico para ciclina A por sí mismo pueden ser introducidos directamente en una célula vegetal o en la misma planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de la planta). De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el ácido nucleico en una planta por medio de transformación.

El término "transformación" como se lo utiliza aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de una propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada a partir de ella. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles, y más adecuados, para la especie particular que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejidos de callo, tejido meristmático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes auxiliares, y meristemas de la raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotiledón. Se puede introducir en forma transitoria o estable el polinucleótido en una célula huésped y se lo puede mantener en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede ser integrado en el genoma huésped. Se puede utilizar entonces la célula vegetal transformada resultante para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas capacitadas en el arte.

La transformación de una especie de planta es hoy en día una técnica bastante rutinaria. Convenientemente cualquiera de los diferentes métodos de transformación puede ser utilizado para introducir el gen de interés en una célula adecuada de un antepasado. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, compuestos químicos que incrementan la incorporación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a partir del método de calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens, F. A. y colaboradores, 1882, Nature 296, 72 - 74; Negrutiu I. y colaboradores, Junio 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363 - 373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. y colaboradores, 1985 Bio/Technol 3, 1099 - 1102); microinyección en material vegetal (Crossway A. y colaboradores, 1986, Mol. Gen Genet 202, 179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein T.M. y colaboradores, 1987, Nature 327, 70), infección con (sin integración) virus y similares. Un método preferido de acuerdo con la presente invención es el protocolo de acuerdo con Hiei y colaboradores 1994 en el caso de transformación del arroz. Para transformación del maíz se han descrito previamente métodos que comprenden la transformación con base en Agrobacterium de tejido de maíz en EP0604662, EP0672752; EP0971578, EP0955371, EP0558676 etc. Los métodos preferidos para transformación del maíz con alta eficiencia son los protocolos descritos en Ishida y colaboradores (High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745 - 50) y descritos en Frame y colaboradores (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 2002 May; 129(1): 13 - 22).

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones de células por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en la planta cotransfectados con el gen de interés, después de los cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Después de la transferencia y regeneración del ADN, se pueden evaluar las plantas transformadas en forma putativa, por ejemplo utilizando análisis tipo Southern, por la presencia del gen de interés, el número de copia y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorear los niveles de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis tipo Northern y/o tipo Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitadas en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio de propagación clonal o de técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una primera generación de una planta transformada (o T1) puede ser autofecundada para producir transformantes homocigotos de segunda generación (o T2), y las plantas T2 propagadas adicionalmente a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; Los transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).

La presente invención claramente se extiende a cualquier célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos aquí y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención se extiende además para abarcar la progenie de una célula primaria transformada o transfectada, tejido, órgano o planta entera que ha sido producida por cualquiera de los métodos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) fenotípica(s) y/o genotípica(s) como aquellas producidas en los padres por medio de los métodos de acuerdo con la invención. La invención también incluye células huésped que contienen una molécula aislada de ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente que codifica una proteína ciclina A2. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallo, tallo, rizomas, raíces, tubérculos y bulbos.

El término "planta" como se lo utiliza aquí abarca plantas completas, ancestros y progenie de las plantas y partes de la planta, incluidas semillas, brotes, tallos, raíces (incluidos tubérculos), y células vegetales, tejidos y órganos. El término "planta" también abarca por lo tanto cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, semillas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluido forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena loucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, coles de Bruselas, col, colza, zanahoria, coliflor, apio, hojas de col, lino, col rizada, lentejas, colza de semillas oleaginosas, quimbombó, cebolla, patata, arroz, soja, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, te calabaza, árboles y algas entre otros.

De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que comprende tomate, patata, tabaco, centeno, soja, girasol, canola, alfalfa, colza o algodón. Preferiblemente además, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar. Lo más preferible, la planta es un cereal, tal como avena, centeno, arroz, maíz, trigo, mijo, sorgo o cebada.

La presente invención también abarca plantas que pueden obtenerse por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención, las cuales tienen mayor rendimiento de semilla con relación a las plantas de control, en donde las plantas incluyen un ácido nucleico asilado que codifica una proteína ciclina A2 que contiene el motivo como se definió aquí, en donde el ácido nucleico está operativamente enlazado a un promotor específico de la semilla.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se divulga un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento con relación a las plantas de control, que comprende la introducción en una planta de un ácido nucleico para ciclina A operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla. La ciclina A puede ser el ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o puede ser cualquiera de las variantes de los ácidos nucleicos para ciclina A como se definió aquí anteriormente o puede ser cualquier ácido nucleico que cae dentro de la definición de un ácido nucleico para ciclina A como se definió aquí más arriba.

Descripción de las figuras

Se describirá ahora la presente invención con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

La Fig. 1 es un árbol filogenético preparado por medio de la alineación de diferentes secuencias de la proteína ciclina A de longitud completa (excepto por 1 secuencia parcial de arroz) se hizo la alineación utilizando el programa Clustal usando ajustes por defecto y visto como un filograma. Como se observa, las secuencias se agrupan en los cuatro grupos principales mostrados.

La Fig. 2 es el vector binario para la expresión en Oryza sativa del gen para la ciclina A2;2 de Arabidopsis thaliana bajo el control del promotor PROLAMINA. Este vector contiene un T-ADN derivado del Plásmido TI, limitado por un borde izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y un borde derecho (repetición RB, RB Ti C58).

La Fig. 3 es una tabla que muestra un motivo conservado de una especie cruzada en ciclina As. Se puede utilizar el motivo 1 para distinguir una ciclina A de cualquier otro tipo de ciclina y se pueden utilizar el Motivo 1 y el Motivo 2 para distinguir una ciclina A2 de cualquier otra ciclina de tipo A. A manera de control, se muestra un motivo encontrado en la ciclina B;1.

La Fig. 4 es una lista de las secuencias utilizadas en los métodos de la invención.

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Descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 representa el ácido nucleico para la ciclina A2;2 utilizado en los métodos de acuerdo con la invención. Es idéntica a la secuencia de codificación de la secuencia depositada bajo el número de acceso NM_121168, excepto por dos sustituciones, la primera en la posición 851 en la cual C está sustituida por G y la segunda en la posición 1295 en la cual C está sustituida por T. Se considera que estos cambios no traen ninguna consecuencia.

La SEQ ID NO: 2 representa al aminoácido de la ciclina A2;2 codificado por el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. Es idéntica a la secuencia depositada bajo el número de acceso NP_568248, excepto porque contiene dos sustituciones de aminoácidos, la primera en la cual la prolina en posición 284 está sustituida por una arginina y la segunda en la cual la cerina en posición 432 está sustituida por una fenilalanina. Se considera que estos cambios no traen ninguna consecuencia.

La SEQ ID NO: 3 es una representación del promotor de prolamina del arroz.

La SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 representan las secuencias de los iniciadores utilizados para la clonación del gen.

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Ejemplos

Se describirá ahora la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente para propósitos de ilustración.

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Manipulación del ADN

A menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo las técnicas de ADN recombinante de acuerdo a protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1984), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y los métodos estándar para el trabajo molecular de la planta están descritos en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

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Ejemplo 1 Clonación del Gen

Se amplificó la ciclina A2;2 de Arabidopsis thaliana (referencia interna CDS95) por medio de PCR utilizando como molde una biblioteca de ADNc de plantas de semillero de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de la transcripción inversa del ARN extraído de las plantas de semillero, se clonaron los ADNc en pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto del banco era de 1.5 kb, y el número original de clones era de 1.59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de 9.6x10^{5} cfu/ml después de la primera amplificación de 6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng de molde en una mezcla PCR de 50 \mul. Se utilizaron iniciadores prm582 (sentido, codón de inicio en negrilla, sitio AttB1 en itálicas: 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagca ggcttcacaatg tattgctcttcttcgatgc 3') y prm583 (inverso, complementario, codón de detención en nigrilla, sitio AttB2 en itálicas: 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggt gcttggtgtcatcttgagaatag 3'), que incluyen sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa bajo condiciones estándar. Se amplificó un fragmento PCR de 1311 pb y se purificó utilizando también métodos estándar. Se llevó a cabo entonces la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se rembino in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p754. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway@.

Ejemplo 2 Construcción del Vector

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p754 que contiene una ciclina A2;2 en una reacción LR con un vector de destinación utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites del T-ADN: un marcador seleccionable de una planta; un marcador visual; y un casete Gateway destinado a la recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se localiza un promotor de PROLAMINA para la sobreexpresión (PRO90) secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la Figura 2 (ciclina A2;2: favorecimiento de la expresión de prolamina) en Agrobacterium y posteriormente plantas de Oryza sativa. Se les permitió a las plantas transformadas de arroz crecer y fueron luego examinadas por los parámetros descritos en el Ejemplo 3.

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Ejemplo 3 Evaluación y Resultados A. Análisis estadístico: prueba F

Se utilizó como modelo estadístico un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) para la evaluación completa de las características fenotípicas de una planta. Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. Se lleva a cabo la prueba F para comprobar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como un "efecto global del gen". Si el valor de la prueba F muestra que los datos son significativos, se concluye entonces que existe un efecto del "gen", lo cual significa que es más que solo la presencia o la posición del gen lo que causan las diferencias en fenotipo. El umbral para la significación de verdadero efecto génico global se fija en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F.

B. Protocolo de Evaluación

Se generaron aproximadamente de 15 a 20 transformantes independientes de arroz T0. Se transfirieron los transformantes primarios de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para cultivo y cosecha de semillas T1. Se conservaron diferentes eventos, de los cuales la progenie T1 segregó 3:1 por la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas de semillero T1 que contenían al transgén (hetero y homocigotos), y aproximadamente 10 plántulas de semillero T1 que carecían del transgén (nulicigotos).

(i). Mediciones del crecimiento vegetativo

Se transfirieron las plantas T1 seleccionadas (aproximadamente 10 con el transgén y aproximadamente 10 sin el transgén) a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta con un código de barras único para relacionar en forma no ambigua los datos del fenotipo con la planta correspondiente. Se cultivaron las plantas T1 seleccionadas sobre suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo los siguientes parámetros ambientales: período de luz = 11.5 h, intensidad de luz natural = 30.000 lux o más, temperatura durante el día = 28ºC o superior, temperatura durante la noche = 22ºC, humedad relativa = 60 - 70%. Se cultivaron las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos una al lado de la otra en posiciones aleatorias. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez cada planta fue pasada varias veces a través de una cámara para tomar imágenes digitales y fotografiadas. En cada momento se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta al menos desde 6 ángulos diferentes. Se derivaron parámetros tales como el área por encima del suelo en una forma automatizada a partir de las imágenes digitales de todas las plantas utilizando un software para análisis de imágenes.

(ii). Mediciones de los parámetros relacionados con la semilla

Se cosecharon, empacaron, marcaron con un código de barras las panículas primarias maduras y luego se las secó durante tres días en el horno a 37ºC. Se trillaron luego las panículas y se recolectaron y contaron todas las semillas. Se separaron las vainas llenas de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Se descartaron las vainas vacías y se contó nuevamente la fracción restante. Se pesaron las vainas llenas en una balanza analítica. Este procedimiento condujo al conjunto de parámetros relacionados con la semilla descritos más abajo.

(a) Número Total de Semillas

Se midió el número total de semillas contando el número de vainas cosechadas de una planta. Se muestran los resultados para el número total de semillas de las plantas que expresan ciclina A2;2 bajo el control de un promotor preferido de la semilla (prolamina) a continuación en la Tabla 2.

TABLA 2 Número total de semillas de ciclina A2;2: promotor referido de la semilla (prolamina)

3

El número total de semillas para las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control de un promotor constitutivo (datos no mostrados) fue menor que el número total de semillas obtenido de las plantas que expresan un gen para ciclina A2;2 dirigido por un promotor de prolamina (que como se muestran más arriba produjo un valor p significativo de la prueba F indicando un efecto génico total).

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(b) Número de Semillas Llenas

Se determinó el número de semillas llenas por medio del conteo del número de vainas llenas que quedó después de la etapa de separación. A continuación se muestran los resultados para el número de semillas llenas de las plantas que expresan la ciclina A2;2 bajo el control de un promotor preferido de la semilla (prolamina) (Tabla 3 para las plantas T1 y Tabla 4 para las plantas T2) versus los resultados del número de semillas llenas de las plantas que expresan la ciclina A2;2 bajo el control de un promotor constitutivo (Tabla 5).

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TABLA 3 Evaluación T1 - Número de semillas ciclina A2;2: pProlamina

4

Los resultados muestran un efecto génico total significativo (con un valor p significativo de la prueba F). Las plantas transgénicas T1 muestran un incremento significativo en el número de semillas llenas con relación a las plantas de control.

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TABLA 4 Evaluación T2 - Número de semillas llenas ciclina A2;2: pProlamina

5

Los resultados muestran un efecto génico total significativo (con un valor p significativo de la prueba F). Las plantas transgénicas T2 muestran un incremento significativo en el número de semillas llenas con relación a las plantas de control.

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TABLA 5 Número de Semillas llenas ciclina A2;2: pGOS2

6

Los resultados muestran que existe un incremento en el número de semillas llenas para las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control de un promotor constitutivo con relación a las plantas de control, sin embargo las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control del promotor de prolamina muestran un mayor número de semillas llenas (ver la Tabla 3 y la Tabla 4 más arriba).

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(c) Rendimiento Total de Semillas

Se midió el rendimiento total de semillas por planta pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. Los resultados de el rendimiento total de semillas de las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control de pProlamina (ver la Tabla 6 para los resultados de la evaluación de T1 y la Tabla 7 para los resultados de la evaluación de T2) versus el rendimiento total de semillas de las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control de pGOS2 (ver la Tabla 8) como se muestra más abajo.

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TABLA 6 Evaluación T1 - Rendimiento total de semilla ciclina A2;2: pProlamina

7

Los resultados de la evaluación de T1 muestran un efecto génico total con un valor p significativo de la prueba F.

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TABLA 7 Evaluación T2 - Rendimiento total de semilla ciclina A2;2: pProlamina

8

Los resultados de la evaluación de T2 muestran un efecto génico total con un valor p significativo de la prueba F.

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TABLA 8 Rendimiento total de semilla ciclina A2;2: pGOS2

9

Como se muestra en la Tabla 8, el rendimiento total de semillas para las plantas que expresan una ciclina A2;2 constitutivamente no es tan bueno como los resultados para la expresión preferida de la semilla (ver la Tabla 6 y la Tabla 7 más arriba).

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(d) Índice de Cosecha

Se define aquí el índice de cosecha como la relación entre el rendimiento total de semilla y el área por encima de suelo (mm^{2}), multiplicado por un factor 10^{6}. El índice de cosecha para las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control de un promotor preferido de la semilla (prolamina) es mostrado más abajo en la Tabla 9.

TABLA 9 Índice de cosecha ciclina A2;2: pProlamina

10

El índice de cosecha para plantas que expresan ciclina A2;2: pProlamina muestra que existe un efecto génico total (ver el valor p de la prueba F). El índice de cosecha para las plantas que expresan una ciclina A2;2 bajo el control de un promotor constitutivo (resultados no mostrados) no fue tan bueno como los resultados mostrados en la Tabla 9 anterior.

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(e) Peso de Mil Granos (TKW)

Se extrapola TKW del número de semillas llenas contabilizadas y su peso total. Los resultados para TKW de las plantas que expresan una ciclina A2;2: pProlamina (ver la Tabla 10) versus el TKW de las plantas que expresan una ciclina A2;2: pGOS2 (ver la Tabla 11) se muestran más abajo.

TABLA 10 TKW ciclina A2;2: pProlamina

11

Un efecto génico total es evidente a partir de la tabla anterior que muestra un valor p significativo de la prueba F.

TABLA 11 TKW ciclina A2;2: pGOS2

12

Los resultados para TKW para ciclina A2;2: pGOS2 muestran un incremento en TKW, pero el incremento no es tan grande como el incremento mostrado en la Tabla 10 anterior.

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(iii) Evaluación del estrés: ciclina A2;2: pProlamina

Se sembraron semillas y, diez días después, se trasplantaron las plantas de semillero en macetas de 10 cm de diámetro llenas con una mezcla 1:1 de arena húmeda y vermiculita. Se insertaron las macetas de 10 cm de diámetro en macetas de 12 cm de diámetro con una capa de una tela plástica entre las dos macetas para evitar que se filtre el sustrato. Se remojaron luego las macetas con agua fresca antes del trasplante. Un día después del trasplante, se presentaron las plantas de semillero a las condiciones salinas. Se humedecieron las macetas 4 veces por día a las 8 am, 12 am, 4 pm y 9 pm con un estrés de salinidad introduciendo una solución de nutriente que contenía los siguientes elementos:

\bullet

Mezcla de nutrientes NPK, 20-20-20 Peters professional (Scotts) en una concentración de 1 kg/m^{3}.

\bullet

Quelato de magnesio, Chelal Mg (BMS, Bornem, Bélgica) a razón de 333.33 ml/m^{3}

\bullet

Quelato de hierro, Libfer (CIBA, Bradford, RU) a razón de 21.67 g/m^{3}

\bullet

NaCl 1.425 kg/m^{3}.

Se monitoreó la concentración de sal semanalmente con adiciones según se requiriera. Se cultivaron las plantas bajo condiciones de estrés por salinidad hasta el inicio de la aparición de los granos. En ese momento se transfirieron las plantas a un compartimiento diferente del invernadero donde se las regó diariamente con agua fresca hasta la cosecha de las semillas. Se midieron entonces los siguientes parámetros y se los registró en la misma forma que para las plantas sin estrés como se indica en (a) hasta (e) más arriba.

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TABLA 12 Rendimiento total de semilla ciclina A2;2: pProlamina

13

Los resultados que aparecen en la Tabla 12 muestran un efecto génico significativo como se evidencia a partir del valor p de la prueba F para las plantas con ciclina A2;2: pProlamina bajo condiciones de estrés como los ejemplos por estrés por salinidad.

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TABLA 13 Número de semillas llenas ciclina A2;2: pProlamina

14

Los resultados que aparecen en la Tabla 13 muestran un efecto génico significativo como se evidencia a partir del valor p de la prueba F para las plantas con ciclina A2;2: pProlamina bajo condiciones de estrés como los ejemplos por estrés por salinidad.

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TABLA 14 Número total de semillas ciclina A2;2: pProlamina

15

Los resultados que aparecen en la Tabla 14 muestran un incremento en el número total de semillas con relación a las plantas de control.

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TABLA 15 Índice de Cosecha ciclina A2;2: pProlamina

16

Los resultados que aparecen en la Tabla 15 muestran un incremento en el índice de cosecha con relación a las plantas de control.

TABLA 16 TKW ciclina A2;2: pProlamina

17

Los resultados que aparecen en la Tabla 16 muestran un efecto génico significativo como se evidencia a partir del valor p de la prueba F para las plantas con ciclina A2;2: pProlamina bajo condiciones de estrés como los ejemplos por estrés por salinidad.

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Ejemplo 4 Aplicación de la invención en maíz

También se puede utilizar la invención descrita aquí en maíz. Se clona una ciclina A bajo el control de un promotor preferido de la semilla en un vector para transformación de una planta adecuado para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium. Tales vectores y los métodos para la transformación del maíz han sido descritos en la literatura (EP0604662, EP0672752, EP0971578, EP0955371, EP0558676, Ishida y colaboradores 1996; Frame y colaboradores, 2002).

Las plantas transgénicas elaboradas por medio de estos métodos se cultivan en el invernadero para la producción de semilla T1. La heredabilidad y número de copia del transgén se verifica por medio de PCR cuantitativa en tiempo real y análisis de transferencias tipo Southern y se determinan los niveles de expresión del transgén por medio de PCR inversa y análisis tipo Northern. Se seleccionan líneas transgénicas con inserciones de una sola copia del transgén y con diferentes niveles de expresión del transgén para la producción de semilla T2. Se germinan las semillas de la progenie y se las cultiva en el invernadero en condiciones adaptadas para el maíz (período de luz 16:8, temperatura durante el día 26 - 28ºC y temperatura durante la noche de 22 - 24ºC) así como condiciones bajo deficiencia de agua, deficientes de nitrógeno, y exceso de NaCl.

En el caso de autofecundación, se utilizan como controles segregantes nulos de la misma línea parental, así como plantas del tipo silvestre del mismo cultivo. Se evalúan las plantas de la progenie resultantes de la autofecundación o los cruces para diferentes parámetros de biomasa y crecimiento, incluida la altura de la planta, el espesor del tallo, el número de hojas, el área por encima del suelo, el verdor de las hojas, el tiempo de maduración, tiempo para la emisión de estigmas, tiempo de floración, número de espigas, longitud de las espigas, número de hileras, número de granos, tamaño de los granos, contenido de aceite de los granos, madures de los granos, tiempo de cosecha. Se seleccionan las líneas que se mejoras más significativamente para cualquiera de los parámetros anteriormente mencionados para un análisis de campo adicional y reproducción asistida por un marcador, con el objeto de transferir los rasgos transgénicos validados en el campo en el germoplasma comercial. Los métodos para analizar el crecimiento del maíz y los parámetros relacionados con el rendimiento en el campo están bien establecidos en el arte, como lo son las técnicas para introgresión de loci específicos (tal como los loci que contienen el transgén) de un germoplasma en otro. Esto también incluye transferir un rasgo(s) de interés de una línea innata transformada a un híbrido comercial con valor médico o nutricional o agronómico añadido deseable.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 0185946 A [0006]

\bullet EP 0971578 A [0064] [0111]

\bullet EP 99106056 A [0057]

\bullet EP 0955371 A [0064] [0111]

\bullet EP 0604662 A [0064] [0111]

\bullet EP 0558676 A [0064] [0111]

\bullet EP 0672752 A [0064] [0111]

\bullet US 60532287 B [0114]

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Literatura citada en la descripción que no es de patente

\bulletVandepoele y colaboradores. The Plant Cell, April 2002, vol. 14, 903 - 916 [0005]

\bulletSakamoto; Matsuoka. Current Opinion in Biotechnology, 2004, vol. 15, 144 - 147 [0007]

\bulletSambrook. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0033]

\bulletNeedleman; Wunsch. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 - 453 [0048]

\bulletSimon y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1985, vol. 5, 191 [0057]

\bulletScofield y colaboradores. J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, 12202 [0057]

\bulletBaszczynski y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1990, vol. 14, 633 [0057]

\bulletPearson y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1992, vol. 18, 235 - 245 [0057]

\bulletEllis y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1988, vol. 10, 203 - 214 [0057]

\bulletTakaiwa y colaboradores. Mol. Gen. Genet, 1986, vol. 208, 15 - 22 [0057]

\bulletTakaiwa y colaboradores. FEBS Letts., 1987, vol. 221, 43 - 47 [0057]

\bulletMol Gen Genet, 1989, vol. 216, 81 - 90 [0057]

\bulletNAR, 1989, vol. 17, 461 - 2 [0057]

\bulletEMBO, 1984, vol. 3, 1409 - 15 [0057]

\bulletTheor Appl Gen, 1999, vol. 98, 1253 - 62 [0057]

\bulletPlant J, 1993, vol. 4, 343 - 55 [0057]

\bulletMol Gen Genet, 1996, vol. 250, 750 - 60 [0057]

\bulletMena y colaboradores. The Plant Journal, 1998, vol. 116 (1), 53 - 62 [0057]

\bulletVicente-Carbajosa. Plant J., 1998, vol. 13, 629 - 640 [0057]

\bulletWu y colaboradores. Plant Cell Physiology, 1998, vol. 39 (8), 885 - 889 [0057]

\bulletSato y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, 8117 - 8122 [0057]

\bulletNakase y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1997, vol. 33, 513 - 522 [0057]

\bulletTrans Res, 1997, vol. 6, 157 - 68 [0057]

\bulletPlant J, 1997, vol. 12, 235 - 46 [0057]

\bulletPMB, 1996, vol. 32, 1029 - 35 [0057]

\bulletPostma-Haarsma y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1999, vol. 39, 257 - 71 [0057]

\bulletWu. J. Biochem., 1998, vol. 123, 386 [0057]

\bulletCummins y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1992, vol. 19, 873 - 876 [0057]

\bulletKrens, F. A. y colaboradores. Nature, vol. 296, 72 - 74 [0064]

\bulletNegrutiu I. y colaboradores. Plant Mol. Biol., June 1987, vol. 8, 363-373 [0064]

\bulletShillito R. D. y colaboradores. Bio/Technol, 1985, vol. 3, 1099 - 1102 [0064]

\bulletCrossway A. y colaboradores. Mol. Gen Genet, 1986, vol. 202, 179 - 185 [0064]

\bulletKlein T. M. y colaboradores. Nature, 1987, vol. 327, 70 [0064]

\bulletIshida y colaboradores. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol., June 1996, vol. 14 (6), 745 - 50 [0064]

\bulletFrame y colaboradores Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol., May 2002, vol. 129 (1), 13 - 22 [0064]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard materials and methods for plant molecular work. Ausubel y colaboradores Plant Molecular Biology Labfase. BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK), 1984, vol. 1, 2 [0081]

<110> CropDesign N.V.

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<120> Plantas que tienen mayor rendimiento y método para su elaboración

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<130> CD-106-PCT

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<150> US 60/532.287

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<151> 2003-12-22

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<160> 5

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 1311

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> Característica nueva

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<223> Una variante de la secuencia de codificación de la secuencia depositada bajo el número de acceso NM_121168 contiene una G en vez de una C en la posición 851 y una T en vez de una C en la posición 1295

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<400> 1

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18

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<210> 2

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<211> 436

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> Característica nueva

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<223> Una variante de la secuencia depositada bajo el número de acceso NP_568248 contiene una arginina en vez de una prolina en la posición 284 y una fenilalanina en vez de una serina en la posición 432

\newpage

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<400> 2

19

20

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<210> 3

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<211> 654

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<212> ADN

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<213> Oryza sativa

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<400> 3

21

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<210> 4

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<211> 56

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> iniciador PRM582

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtat tgctcttctt cgatgc

\hfill

56

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<210> 5

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> iniciador PRM583

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<400> 5

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Claims (15)

1. Un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, que comprende la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico para ciclina A2, preferiblemente que codifica una proteína ciclina A2 que contiene un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo que consiste de E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S, que tiene tres residuos (- -T- - - - -F-F- - -), cuyo ácido nucleico para ciclina A2 está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla.

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicho rendimiento de la planta se selecciona de uno o más de los siguientes: mayor peso de la semilla, mayor número de semillas llenas, mayor número de semillas, mayor tamaño de las semillas, mayor índice de cosecha, mayor peso de mil granos y composición modificada de las semillas, cada uno con relación a las correspondientes plantas de control.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho ácido nucleico para la ciclina A es una ciclina A2, seleccionada entre ciclina A2;1, ciclina A2;2, ciclina A2;3 y ciclina A2;4.

4. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha ciclina A2 es una variante de la secuencia de la ciclina A2 seleccionada de:

(i)

Porciones funcionales de un ácido nucleico para ciclina A2;

(ii)

Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico/gen para ciclina A2;

(iii)

Variantes alélicas de un ácido nucleico/gen para ciclina A2;

(iv)

Variantes debidas a la degeneración del código genético; y

(v)

Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína ciclina A2.

5. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho promotor preferido de la semilla es un promotor activo en el endospermo.

6. Un método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde dicho promotor es un promotor de prolamina.

7. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho mayor rendimiento de semilla se logra en condiciones de crecimiento óptimas y por debajo del óptimo.

8. Un método de acuerdo a la reivindicación 7, en donde dicha condición de crecimiento por debajo del óptimo incluye condiciones de estrés abiótico, tales como estrés por salinidad.

9. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha planta se selecciona entre arroz, maíz, trigo, cebada, soja, girasol, canola, caña de azúcar, alfalfa, mijo, cebada, colza, sorgo y algodón.

10. Plantas que contienen un ácido nucleico aislado que codifica una proteína ciclina A2 que contiene un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G F R/L UR/K/N F L P S, que tiene presente los tres residuos (- -T- - - - -F-F- - -), cuyo ácido nucleico está operativamente enlazado a un promotor preferido de la semilla.

11. Construcción que comprende:

(i)

un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene un motivo que consiste de W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L y un motivo E L \sneg{T} L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/G \sneg{F} R/L UR/K/N \sneg{F} L P S, que tiene tres residuos (- - T - - - - - F - - F - - -);

(ii)

un promotor preferido de la semilla; y opcionalmente

(iii)

una secuencia de terminación de la transcripción.

12. Construcción de acuerdo a la reivindicación 11, en donde dicho promotor preferido de la semilla es un promotor activo en el endospermo.

13. Construcción de acuerdo a la reivindicación 12, en donde dicho promotor es un promotor de prolamina.

14. Planta de acuerdo a la reivindicación 10, en donde dicho promotor preferido de la semilla es un promotor activo en el endospermo.

15. Planta de acuerdo a la reivindicación 14, en donde dicho promotor es un promotor de prolamina.