CN106434668B - 小麦种子皮层特异启动子pTaWG04及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦种子皮层特异启动子pTaWG04的分离及其应用。该启动子包含1571bp碱基，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。该启动子驱动下游基因TaWG04的表达，或者驱动外源基因在小麦种子皮层中特异表达。本申请首次克隆获得了pTaWG04启动子，并对其生物学信息进行了初步分析，认为其属于一个种子特异性启动子。进一步通过Real‑time PCR对其驱动的下游基因TaWG04进行定量分析，结果进一步证明，pTaWG04是一个种子皮层特异启动子。而通过重组载体构建及GUS染色实验，结果证明，该启动子可驱动外源基因在种子皮层中特定表达。

Description

小麦种子皮层特异启动子pTaWG04及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦种子皮层特异启动子pTaWG04的分离及其应用。

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物之一，约占全世界粮食种植面积的17%。目前，小麦的年消耗量超过了680万吨，为全世界五分之一的人口提供了食物来源。小麦种子主要由三个主要的部分构成：胚、胚乳和麦麸。麦麸是小麦磨取面粉后筛下的种皮，含有丰富的膳食纤维，其用途不仅可以用作饲料，而且可以用于维生素E、麸皮蛋白、植物酸的提取，低聚糖的制取，丙酮和丁醇的生产，尤其可以用作药膳且拥有食疗功效，对促进人类健康、预防疾病十分有益。因此分离和鉴定小麦种子皮层特异表达启动子，并利用基因工程技术对小麦种皮中的营养成分进行遗传改良已成为当前一种非常有效的手段。

高等植物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，通过和众多转录因子结合进而决定了基因的表达模式和表达强度。对特异型启动子的筛选和鉴定一直是基因工程研究的热点之一，目前已经鉴定出多个在种子中表达的特异型启动子，如水稻胚乳特异启动子Gt1（籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证，长江大学学报，2010 (2)：44-48）、小麦储藏蛋白基因Avenin-like b的启动子（小麦储藏蛋白基因Avenin-like b启动子的克隆及表达载体构建，华中科技大学，2011）、大豆油酸脱氢酶FAD2-1B启动子（大豆油酸脱氢酶基因启动子的克隆及其表达活性分析，中国生物工程杂志，2013 (4)：80-84）等等，利用信息生物学分析这些启动子发现，它们均含有典型的种子特异性表达元件Skn-1 motif和GCN4 motif，这些元件的发现对初期启动子功能的鉴别具有一定的指导意义。

小麦种子皮层特异启动子作为一类专一性启动子，能指导外源基因在小麦种皮中特异表达，它不仅能使目的基因定向、高效、稳定在种子皮层中表达，而且可以有效的规避外源基因在其它器官发生诸如代谢负担之类的负面效应。所以，利用小麦种子皮层特异启动子控制目的基因的特异表达具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明主要目的是提供一种小麦种子皮层特异启动子pTaWG04，该启动子能驱动外源基因在小麦种子皮层中特异表达，利用这一特性，可为小麦新品种培育奠定良好应用基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

小麦种子皮层特异启动子pTaWG04，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，包含1571bp碱基，该启动子含有RNA聚合酶结合位点TATA-box，转录因子结合位点MBS，光响应元件4cl-CMA2b、AT1-motif、Box4、GA-motif、I/L-box、TCT-motif等，以及种子启动子所特有的元件Skn-1-motif和GCN4-motif。

所述小麦种子皮层特异启动子pTaWG04，既驱动下游基因TaWG04的表达，同时也能驱动外源基因在小麦种子皮层中特异表达的启动子，所述外源基因，具体例如GUS基因。

所述小麦种子皮层特异启动子pTaWG04的制备方法，通过PCR制备获得，具体步骤为：

（1）提取小麦品种郑麦004的基因组DNA；

（2）设计引物，以步骤（1）中基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

引物设计如下：

pTaWG04F：5’-ACGCGTCGACACACAAGCTGCCTTTCCATAA-3’（序列中5’端ACGCGTCGAC部分碱基为SalI酶切位点）；

pTaWG04R：5’-CGCGGATCCTGAATTTGTGGTTACTCTTGAT-3’（ 序列中5’端CGCGGATCC部分碱基为BamHI酶切位点）；

50μL的PCR反应体系设计如下：

含Mg²⁺的 5×HF buffer，10μL；

浓度为2.5mM 的dNTP，2μL；

浓度均为5μM的pTaGW04F，2μL；

浓度均为5μM的pTaGW04R，2μL；

Phusion酶，0.5μL；

步骤（1）中所提取基因组模板，2μL；

ddH₂O， 31.5μL；

PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min。

本申请首次克隆获得了pTaWG04启动子，并对其生物学信息进行了初步分析，认为其属于一个种子特异性启动子。进一步通过Real-time PCR对其驱动的下游基因TaWG04进行定量分析，结果进一步证明，pTaWG04是一个种子皮层特异启动子。而通过重组载体构建及GUS染色实验，结果证明，该启动子可驱动外源基因在种子皮层中特定表达。

本发明所提供的小麦种子皮层特异启动子pTaWG04，其克隆鉴定将对小麦品质的改良和麦麸食疗、药用等具有重要的应用价值。

附图说明

图1为利用Real-time PCR技术对启动子pTaWG04驱动的下游基因TaWG04进行的定量分析情况，其中A图是Real-time PCR检测TaWG04基因在小麦根、茎、叶、花药、授粉后7天、14天、21天、28天和35天种子的表达情况；B图是分离出授粉后28天种子的胚和胚乳，利用Real-time PCR检测TaWG04基因的表达量；Real-time PCR分析过程中，Actin作为内标；

图2为利用启动子在线分析软件PlantCARE对pTaWG04启动子分析情况；

图3为构建含有pTaWG04启动子和GUS基因的重组质粒过程示意图及酶切验证结果；其中A图为重组质粒构建过程示意图；B图为对构建的PMDC83-pTaWG04-GUS重组质粒的酶切验证结果；

图4为转基因小麦阳性苗PCR检测，其中P为质粒对照；阴性对照CK（郑麦103）与water（水）；M：分子量标记Maker；

图5为不同组织的GUS化学染色结果；其中A：小麦根部；B小麦茎部；C小麦叶片；D小麦花药；E：授粉后7天种子；F：授粉后14天种子；G：授粉后21天种子；H：授粉后28天种子；I：授粉后35天种子；

图6为授粉后28天种子的石蜡切片，其中A图：授粉后28天种子（CK）；B：授粉后28天种子（转基因植株）。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

郑麦004、郑麦366和郑麦103，商品化小麦品种；

大肠杆菌DH5α感受态购自北京全式金公司；

植物表达载体pMDC83-GUS ：由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室涂金星教授赠予；

实验试剂：

DNA分子量标记、PCR mix等购自TaKaRa 公司；

高保真酶Phusion、限制性内切酶BamHI、SalI、T4 DNA连接酶、PMD18-T载体、cDNA第一条链合成试剂盒均购自于Fermentas公司；

质粒小提试剂盒和胶回试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司；

RNA提取试剂盒TransZol^TM Plant购自于北京全式金生物技术有限公司；

实时定量荧光PCR试剂盒购自于TOYOBO公司。

实施例1

本实施例首先对pTaWG04启动子在植株体内表达情况进行分析，具体过程如下。

首先，分别提取郑麦004根、茎、叶片、花药、授粉后7天、14天、21天、28天、35天的种子、胚和纯胚乳的RNA，反转录成cDNA；

组织RNA提取按TransZol^TM Plant RNA提取试剂盒说明书操作，其步骤简述如下：

（1）液氮研磨：选取郑麦004不同组织的样品0.1g放入研钵中，加入液氮并迅速研磨，

直至样品呈粉末状；

（2）匀浆：加入1mL TP1，室温放置5min，使其充分裂解；12000g、4℃离心5min；

（3）吸取上清600μL至新的2mL RNase-free离心管中，并加入等体积的TPII溶液，颠倒混匀后加入150μL氯仿，再次颠倒混匀，室温放置5min后，12000g、4℃离心5min；

（4）吸取上层水相500μL于新的2mLRNase-free离心管中；按等体积加入异丙醇混匀，室温放置5~10min，12000g、4℃离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

（5）加入1mL 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，10000g、4℃离心10min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5~10min；

（6）用30μL RNA溶解液溶解沉淀，即得到总RNA。

cDNA第一条链合成使用Fermentas cDNA 第一条链合成试剂盒，其步骤简述如下：

（1）取上述提取的组织RNA 1μg于200μL RNase-free离心管中，加入1 μL Oligo（dT）引物，并补充DEPC水至12μL，充分混匀，65℃孵育5min后置于冰上；

（2）在步骤（1）的混合物中，分别加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL RiboLockRNase Inhibitor、2μL 10mM dNTP Mix、1μL RevertAid^TM M-MuLV，混匀后，42℃孵育1小时；

（3）70℃加热5min，终止反应，得到组织的cDNA。

其次，设计基因特异引物pTaGW04F和pTaGW04R，以小麦基因Actin作为内参基因，利用Real time PCR方法检测其在各个部位的表达。

具体引物序列设计如下：

TaWG04-F：5’- TGCATGTCCCATCTGATTGC-3’，

TaWG04-R：5’-TTTCCATTGCTACATCGATGGT-3’；

Actin-F:：5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R：5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

20μL的Real time PCR反应体系设计如下：

cDNA 模板，60ng/μL、8.4μL；

上游引物，10μM、0.8μL；

下游引物，10μM、0.8μL；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix，10μL；

Real time PCR 扩增程序如下：

95℃、2min (1 个循环)；95℃、10s，60℃、10s，72℃、30s，40个循环；95℃、10s (1个循环)；65℃至95℃ 5s。

最后，依照2^{−ΔΔ Ct}方法，利用Bio-Rad CFX Manager软件分析Real-time PCR 的结果。根据表达量均值±SEM作图。

结果如图1A所示，经Real-time PCR对其驱动的下游基因TaWG04进行定量分析，发现该基因在授粉后14天、21天、28天和35天的种子中表达，而在根、茎、叶、花药和授粉后7天的种子中无表达。分离出种子皮层、胚和纯胚乳进行定量分析发现（图1B），该基因在种子皮层中表达，进一步表明pTaWG04是种子皮层特异启动子。

实施例2

本实施例主要介绍一下对pTaWG04启动子片段的克隆情况。具体过程如下。

首先，利用植物DNA提取试剂盒提取郑麦004幼嫩叶片基因组；

其次，以上述所提取基因组为模板，使用高保真酶Phusion，利用特异引物对：pTaWG04F和pTaWG04R进行PCR扩增，

引物对序列设计如下：

pTaWG04F：5’-ACGCGTCGACACACAAGCTGCCTTTCCATAA-3’，

pTaWG04R：5’-CGCGGATCCTGAATTTGTGGTTACTCTTGAT-3’；

50μL的PCR反应体系设计如下：

含Mg²⁺的 5×HF buffer，10μL；

浓度为2.5mM 的dNTP，2μL；

浓度均为5μM的pTaGW04F，2μL；

浓度均为5μM的pTaGW04R，2μL；

Phusion酶，0.5μL；

步骤（1）中所提取基因组模板，2μL；

ddH₂O， 31.5μL；

PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃、1min，30个循环；72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

将其回收产物pTaWG04与PMD18-T载体 (Fermentas公司)进行连接。

10μL连接体系为：

PMD18-T Vector，1μL；

Solution I，5μL；

pTaWG04回收片段， 4μL；

16℃连接过夜。

将连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α，进行阳性（氨苄霉素抗性，50mg/mL）筛选，将阳性克隆送上海生工生物有限公司测序，测序正确单克隆命名为pMD18-T-pTaWG04。

利用启动子在线分析软件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html ）对pTaWG04启动子进行分析，结果如图2及下表所示。分析表明，该启动子含有RNA聚合酶结合位点TATA-box，转录因子结合位点MBS，光响应元件4cl-CMA2b、AT1-motif、Box4、GA-motif、I/L-box、TCT-motif等，以及种子启动子所特有的元件GCN4 motif、Skn-1 motif。此外，还包括生长素、茉莉酸甲酯、低温胁迫响应元件以及MYB转录结合位点。

pTaWG04顺式作用元件情况：

。

实施例3

在实施例2对pTaWG04启动子分析基础上，为进一步验证该启动子能否驱动外源基因在小麦体内进行表达，发明人以GUS基因（β-葡聚糖苷酶基因）作为外源基因为例，通过构建含有pTaWG04启动子和GUS基因的重组质粒，并进一步利用基因枪介导法将该重组质粒转化了小麦愈伤组织，结果表明，pTaWG04启动子可以驱动外源基因在小麦体内表达，从而为该基因在小麦品质改良方面的具体应用奠定了理论基础和应用基础，相关实验简要介绍如下。

（一）含有pTaWG04启动子和GUS基因的重组质粒的构建

重组质粒构建过程示意图如图3A所示，具体为：

首先，用限制性内切酶SalI和BamHI分别对pMD18-T-pTaWG04（实施例2所制备）和植物表达载体PMDC83-GUS进行双酶切，并回收纯化酶切片段；

酶切时的双酶切体系设计为：

10×Fast Digest buffer，6μL；

pMDC83-GUS质粒（或pMD18-T-pTaWG04），2μg、20μL；

SalI，1U/L、2μL；

BamHI，1U/L、2μL；

ddH₂O，30 μL。

其次，利用T4 DNA连接酶将上述酶切产物进行连接；

T4 DNA连接酶连接时的连接体系设计如下：

10×T4 DNA 连接缓冲液，1μL；

pTaWG04片段，7μL；

pMDC83-GUS，1μL；

T4 DNA 连接酶，1μL；

16℃连接过夜。

最后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α并进行抗性筛选，挑取阳性克隆菌株提取质粒后，送上海生工测序，测序正确的质粒命名为PMDC83-pTaWG04-GUS，即欲构建的含有pTaWG04启动子和GUS基因的重组质粒。

对测序正确的载体再进行双酶切（SalI和BamHI，酶切体系参考前述重组质粒构建过程中的酶切体系）验证，酶切产物进行电泳，可以得到约1500bp的片段，与pTaWG04的片段一致（电泳结果如图3B所示）。

（二）含有pTaWG04启动子和GUS基因的重组质粒转化小麦

利用基因枪介导法，将上述所构建的含有pTaWG04启动子和GUS基因的重组质粒PMDC83-pTaWG04-GUS转化小麦愈伤组织，筛选获得转基因植株，并通过种子石蜡切片染色方法，检测判定GUS基因是否得到了表达，相关实验过程介绍如下。

（1）以小麦品种郑麦103 的幼胚为受体材料，取开花后12左右未成熟的种子，用70%的酒精对其进行消毒，用无菌水冲洗3 次后，用0.1%的HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗3~4次；

（2）无菌条件下剥出幼胚（约1mm），于MS 诱导培养基（MS+2mg/L 2,4-D+4g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=6.2）上暗培养5天后，再置于高渗培养基（MS+2mg/L 2,4-D+7g/L琼脂+72.88g/L甘露醇+30g/L蔗糖，pH=5.8）上渗透处理4~6h；

（3）金粉制备：将25mg金粉（直径为1.0 μm）置于1.5mL离心管中，加入1mL无水乙醇，漩涡混匀，超声波处理2 min，离心使金粉沉淀于管底，弃上清，重复2次，加入500μL无菌水，漩涡混匀，离心使金粉沉淀于管底，弃上清，重复1次；

金粉沉淀重悬于500μL无菌水中，使浓度达到50 μg/μL，涡旋混匀后分装，每管50μL，-20℃保存备用；

（4）DNA 包被：

取50μL制备好的金粉悬液在室温条件下融化，涡旋，并超声处理1min；

加入5μL含15μg DNA的水溶液；

加入50μL、2.5M的CaCl₂和20μL、0.1M的亚精胺，涡旋3min充分混匀，冰上静置15min，弃上清；

加入300μL、70%乙醇，涡旋混匀后冰上静置15 min，弃上清；

加入10μL 无水乙醇重悬后均匀涂在微弹载体中心，超净工作台吹干，用于基因枪轰击；

（5）使用 PDS 1000/He 型基因枪，可裂圆片压力为1100 psi，轰击距离为9 cm，真空度为28 cm Hg，轰击次数为 1 次；

（6）基因枪轰击后在高渗培养基上继续处理16h，转至分化筛选培养基（MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+4g/L琼脂+30g/L蔗糖+2％Hygromycin，pH=6.2），25℃光照条件下培养14天；

（7）待分化出绿芽后，转至潮霉素筛选再生培养基（1/2MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/LKT+4g/L琼脂+30g/L蔗糖+4％Hygromycin，pH=6.2），25℃光照条件下培养，连续筛选2 代，每代2 周；

（8）待绿芽生长至2~3cm后，转至生根培养基（1/2MS+0.2mg/L NAA+4g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=6.5）中，25℃光照条件下培养，每14天继代一次，继代2-3次后，待再生幼苗根系健壮时，洗去根系携带的培养基残渣移入苗钵。

对上述移入苗钵的植株进行转基因植株鉴定，步骤为：

首先，提取植株的叶片DNA

其次，利用上述步骤（1）中的DNA为模板，设计检测引物进行PCR鉴定，检测引物设计如下：

GUS-F： 5'-GACGCTCACACCGATACCATCA-3'，

GUS-R： 5'-CGAAGTTCATGCCAGTCCAGCG-3'；

PCR鉴定结果如图4所示。对图4进行分析可以看出，转基因植株中成功转入有GUS基因。经验证，最终统计获得抗性再生植株16 株。

对所获得的再生植株，将T1代转基因植株种入温室，分别取小麦根、茎、叶片、花药、授粉后7天、14天、21天、28天、35天的种子进行GUS组织化学染色，以检测判定GUS基因是否表达，具体实验过程为：

配制GUS染色液（0 .1M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0 .5mM铁氰化钾；0 .5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0 .1％Triton X-100）；

将试验材料在90%丙酮中（冰浴）固定15-20min；然后在染色液（不含X-Gluc ）中漂洗3次；

将材料置于GUS染色液中，37℃放置12-16h；先用70%酒精脱色半小时，再用100%酒精脱色；镜检照相。

结果如图5所示。分析表明，21天、28天和35天种子能染上蓝色，其余组织不能染上蓝色。因此，pTaWG04能驱动外源基因在小麦的种子中特异表达，它是一个种子特异表达启动子。

进一步地，制备种子石蜡切片，以便进行进一步分析，具体实验过程为：

取授粉后28天种子用FAA固定液固定48小时以上，用50%酒精、70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精分级洗脱，每级4~12小时，100%酒精中1.5小时；

随后进行5级氯仿透明，每级4个小时，纯氯仿2次，每次2~3小时；

透明后，将氯仿中加入少许碎蜡，置于36℃温箱过夜，之后经过50%、70%蜡各3小时，更换纯蜡三次，每次1个小时；

随后进行包埋，提升温箱温度至60℃，利用牛皮纸叠成纸盒置于温箱，倒入材料，补足石蜡，均匀后取出石蜡凝固晾干；

切片机进行切片后利用二甲苯进行脱蜡，用番红染色4小时以上后进行封片、镜检和拍照。

对转基因植株授粉后28天的种子进行石蜡切片观察发现，结果如图6所示，从图中可以看出，种子皮层上着色明显，进一步证明该启动子是一个种子特异表达启动子。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院小麦研究所

<120> 小麦种子皮层特异启动子pTaWG04及其应用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1571

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

tagatcccct gttgtaattt atcaaaaatt tatacacaag ctgcctttcc ataatttgaa 60

acattgtact ttctacttgc ctgcaggaag aactcttttg ttatggaccc ccttatctgg 120

cgaatagtcg ccaggagggg gtggcatttg cgaatgattc gctggcagtt ttagtttgag 180

ggatggaagt ttacatcagg gcgacatgac aatttctttt tgagaaggca aattgttgtt 240

ttaaataggc atcgtttgat cttgtctcgg aaccgaaact gccatcgaaa gagtttcgtt 300

tgccacctct ctcccagcaa acgattgcca attatgatta ccgtttgtta tatgcatgaa 360

ctgtgcgtct acagttggcg gcagcgaggt tgaggagacc ggtgtcatcg gcagcggctt 420

cagccggtgg aggcgtccta tggttgacgg ccgtgctcct tcctgctcga gaagagaagt 480

gagagggtgg tgagaggtga agagagcagg aggcggcagc ctggtgctgc tgcgggtcgt 540

agtaggagcc aaggcggcgg tgctgggtgg ctcgggctgt tatgcgggcg cgcgagcgac 600

accaagccct caacaaccgt gtccgtttca gttgggtctt ccatgttggg tacactggtg 660

gtgtccggct ctccgtctgc gtccattgtc cgttttggcg acccaaacgg acaaaaagcg 720

gacaaaaatt cgtgtccgtt tgagtcattg cgttgaagtt ggccttatgc tattccacag 780

tatactcaac gcactctaat tcacattgca tgctattaca tgcgtcattg tatttgatac 840

accgtgtgca atattttttt tctggtgaca atatatctac tatcgaacca agtataaagt 900

tcctcaaagg gtttaatatc atgttcatgg tgttcccgcg gaaatgcatg ggaatcatct 960

agtgtctatt aacaactata cgacattact aacattggca taaaaaaaag aattgatgag 1020

tcatgtatgc ttgttcatct taccatcata ttacacaaaa ctacgaagtt agttcagaaa 1080

gaaatagtct agaacaatct tcatattaat agtatgatct atcttaacaa cgccaagcaa 1140

gactataaac ttagttcccg acaagctatg ccaacctaga tgtgcctaac aacttgcaga 1200

acattacaaa cttagtttta gaaaggggtg taatatagat aagtgtttcg catgtaaaat 1260

gaatatgatg agtcattacg attatcaagc tttcctggca ctccatggat gtgtgctgca 1320

agaaagcaac tttggcgatc aatctgaaaa ttacacttgt aagtagcgcc accgaacaaa 1380

acataccaaa ggatcagttt gataagagta gaggaacttt acaagaaagc aaatgtgaag 1440

acgaaaagaa atcatttcat ggcagctata aatagccata cgccatgaag acccccttcc 1500

atcatccatc cttcagaaat ttggagcaca agcatccata ataaacaatc aagagtaacc 1560

acaaattcac c 1571

Claims (2)

1.小麦种子皮层特异启动子pTaWG04在小麦育种中的应用，其特征在于，该启动子驱动外源基因在小麦种子皮层中特异表达；

所述小麦种子皮层特异启动子pTaWG04，含有1571bp碱基，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述小麦种子皮层特异启动子pTaWG04在小麦育种中的应用，其特征在于，所述外源基因为GUS基因。