ES2344943T3 - Determinacion simultanea de la actividad inhibitoria de la proliferacion celular y la toxicidad utilizando citometria de flujo. - Google Patents
Determinacion simultanea de la actividad inhibitoria de la proliferacion celular y la toxicidad utilizando citometria de flujo. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2344943T3 ES2344943T3 ES04005789T ES04005789T ES2344943T3 ES 2344943 T3 ES2344943 T3 ES 2344943T3 ES 04005789 T ES04005789 T ES 04005789T ES 04005789 T ES04005789 T ES 04005789T ES 2344943 T3 ES2344943 T3 ES 2344943T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- cell
- fluorescent
- latex particles
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 title claims description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 134
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 27
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 26
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 31
- 230000030833 cell death Effects 0.000 abstract description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 25
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 16
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 15
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 15
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 8
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000011464 Pachycereus pringlei Nutrition 0.000 description 1
- 240000006939 Pachycereus weberi Species 0.000 description 1
- 235000011466 Pachycereus weberi Nutrition 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 231100000480 WST assay Toxicity 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000013043 cell viability test Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229920002102 polyvinyl toluene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Un método para la determinación simultánea de actividad inhibitoria de la proliferación celular y de toxicidad celular de un compuesto químico de bajo peso molecular utilizando una muestra de células de mamífero en proliferación como sistema control, que se caracteriza por a) tratar dicha muestra de células que es una suspensión celular o células adherentes en un volumen predeterminado con dicho compuesto en al menos dos concentraciones predeterminadas diferentes; b) tratar dicha muestra de células con un primera tinción de colorante fluorescente específica de las células muertas o de las viables, y opcionalmente con una segunda tinción de colorante fluorescente de todas las células; c) añadir a dicha muestra de células una cantidad predeterminada de partículas de látex con un tamaño que oscila entre alrededor de 1 y alrededor de 20 μm a dicho volumen y opcionalmente teñir dichas partículas de látex con un tercer colorante fluorescente; d) determinar la proporción entre la cantidad de células totales y la cantidad de partículas de látex en dicha muestra; e) determinar, con los resultados del paso d) y mediante un análisis de citometría de flujo en dicha muestra, el número de células muertas o viables mediante la luz fluorescente emitida por dicho primer colorante fluorescente a una primera longitud de onda, el número de células totales por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un primer ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho segundo colorante fluorescente a una segunda longitud de onda, el número de partículas de látex por unidad de volumen mediante la luz dispersada en un segundo ángulo o alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho tercer colorante fluorescente a una tercera longitud de onda; f) y determinar con los resultados de los pasos d) y e) la actividad sobre la proliferación celular y la toxicidad de dicho compuesto.
Description
Determinación simultánea de la actividad
inhibitoria de la proliferación celular y la toxicidad utilizando
citometría de flujo.
La invención proporciona un método para la
determinación simultánea de la actividad inhibitoria de la
proliferación celular y la toxicidad de una sustancia que puede
realizarse mientras se realiza un cribado de la actividad de tal
sustancia en la inhibición de la proliferación.
\vskip1.000000\baselineskip
La identificación de sustancias que son potentes
inhibidores de la proliferación es de gran importancia en el
descubrimiento de fármacos, especialmente en el área de la
oncología. Existe una variedad de ensayos in vitro basados
en células para la investigación de los efectos antiproliferativos
de tales sustancias candidatas. Ejemplos de tales ensayos son, por
ejemplo, el ensayo colorimétrico MTT, el ensayo de captación de
timidina [^{3}H], y el ensayo WST (Johnston, P., en: Cellular
Assays in HTS, Methods in Molecular Biology, Vol. 110, Janzen W.P.
(Ed.), Humana Press, NJ, págs. 107-116; Bellamy,
W.T., Drugs 44 (1992) 690-708). Respecto al
desarrollo de fármacos, es necesario que tales ensayos puedan
utilizarse en un cribado de alta eficiencia de un gran número de
potenciales fármacos candidatos.
Para la determinación del estado de
proliferación de las células hematopoyéticas, normalmente se pone en
contacto la población celular con la sustancia en investigación y
un reactivo capaz de generar luminiscencia en presencia de ATP y se
detecta la luminiscencia como medida del estado de proliferación (US
2002/0146680). En la patente estadounidense Nº 5.972.639 se
describe un ensayo para determinar el número de células en un
cultivo celular mediante una medida de fluorescencia.
Sin embargo, tales ensayos son costosos en
tiempo, proporcionan sólo resultados limitados, y no discriminan
entre la inhibición de la proliferación y la inducción de muerte
celular.
Por lo tanto, existe la necesidad de un ensayo
que permita la determinación de la influencia de una sustancia
sobre la proliferación y sobre la inducción de muerte celular de
forma simple y simultánea. Además, existe la necesidad de que tales
ensayos puedan realizarse de forma automática.
Chandrasekaran et al. (1995. Canc
Chemother Pharmacol, 35, 489-495) describen la
determinación mediante citometría de flujo del efecto citostático y
citotóxico de la
3'-azido-3'-desoxitimidina.
La distinción entre la citostasis y la citotoxicidad se realiza
mediante experimentos adicionales que involucran entre otros la de
incorporación BdRD. Dos muestras separadas se procesan
separadamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un método para la
determinación simultánea de la actividad inhibitoria de la
proliferación celular y de la toxicidad celular (inducción de
muerte celular) de un compuesto químico de bajo peso molecular
utilizando una muestra de células de mamífero en proliferación como
sistema control, que se caracteriza por
a) tratar dicha muestra de células que es una
suspensión celular o células adherentes en un volumen predeterminado
con dicho compuesto en al menos dos concentraciones predeterminadas
diferentes;
b) tratar dicha muestra de células con un
primera tinción de colorante fluorescente específicamente de las
células muertas o de las viables, y opcionalmente con una segunda
tinción de colorante fluorescente de todas las células;
c) añadir a dicha muestra de células una
cantidad predeterminada de partículas de látex con un tamaño que
oscila entre alrededor de 1 y alrededor de 20 \mum a dicho volumen
y opcionalmente teñir dichas partículas de látex con un tercer
colorante fluorescente;
d) determinar la proporción entre la cantidad de
células totales y la cantidad de partículas de látex en dicha
muestra;
e) determinar, con los resultados del paso d) y
mediante un análisis de citometría de flujo en dicha muestra, el
número de células muertas o viables por la luz fluorescente emitida
por dicho primer colorante fluorescente a una primera longitud de
onda, el número de células totales por unidad de volumen mediante la
luz dispersada en un primer ángulo o alternativamente mediante la
luz fluorescente emitida por dicho segundo colorante fluorescente a
una segunda longitud de onda, el número de partículas de látex por
unidad de volumen mediante la luz dispersada en un segundo ángulo o
alternativamente mediante la luz fluorescente emitida por dicho
tercer colorante fluorescente a una tercera longitud de onda;
f) y determinar con los resultados de los pasos
d) y e) la actividad sobre la proliferación celular y la toxicidad
de dicho compuesto.
En una realización preferible de la invención,
las células muertas están teñidas específicamente con un colorante
fluorescente y el número de partículas de látex y de células se mide
mediante la diferencia entre luz dispersada lateral y luz
dispersada hacia delante.
En una realización más preferible de la
invención, las células son células progenitoras CD34+ humanas.
En una realización preferible de la invención,
el método se realiza en al menos cinco concentraciones diferentes
de dicha sustancia en investigación, lo que preferiblemente permite
el cálculo de los valores CI_{50} de la proliferación y de
inducción de muerte celular. Preferiblemente, el rango de
concentración está entre un factor de alrededor de 1 y 10.000.
Tras el tratamiento de las células con la
sustancia en investigación, las células se cultivan bajo condiciones
estándar que permitirían la proliferación celular. En una
realización preferible de la invención, las células se cultivan en
paralelo en múltiples dispositivos, preferiblemente en placas
microtituladas multipocillo. Además, también se añaden las
sustancias en investigación a estos dispositivos en las diferentes
concentraciones, preferiblemente mediante métodos de dispensación
automática.
Un crecimiento celular retrasado durante el
cultivo de células en presencia de una sustancia que se sospecha es
un inhibidor celular puede estar causado por muerte celular y/o
inhibición de la proliferación celular. Por lo tanto, a partir de
una mera determinación de la cantidad de células tras el cultivo no
es posible concluir directamente la toxicidad y/o la actividad
inhibitoria de la sustancia. Es necesario conocer las cantidades de
células viable y muertas y su proporción respecto de la cantidad de
células totales para llegar a tal conclusión. La invención
proporciona un método para la determinación simultánea de estos
parámetros de forma rápida. Además, el método de acuerdo con la
invención puede realizarse de forma automática y por lo tanto
permite una investigación a gran escala de la toxicidad y actividad
inhibitoria de la proliferación de las sustancias.
De acuerdo con la invención, una alícuota
definida (predeterminada) de partículas de látex se añade a cada
dispositivo de cultivo celular. En base al contaje de las partículas
de látex durante el análisis de citometría de flujo, puede
estimarse el volumen de líquido en el que se realiza todo el
contaje. Por lo tanto, la invención proporciona un método para la
determinación simultánea de la cantidad de células totales por
unidad de volumen (lo que es una medida de la proliferación
celular) y de la cantidad de células viables por unidad de volumen
tras el cultivo en presencia de una sustancia que se sospecha es un
inhibidor de la proliferación y/o que es toxico para las células
del sistema control. La comparación de la cantidad de células
totales con la cantidad de células muertas o células viables para
diferentes concentraciones de la sustancia proporciona información
sobre la relación entre la inhibición de la proliferación celular y
la toxicidad de la sustancia. Esto puede deducirse inmediatamente
de la Fig. 3. Si el porcentaje de células muertas respecto a las
células totales aumenta significativamente mientras el número de
células totales disminuye, esto indica una elevada toxicidad de la
sustancia. Sin embargo, si el porcentaje de células muertas respecto
a las células totales no aumenta significativamente al aumentar la
concentración de sustancia mientras el número de células totales
disminuye, entonces la sustancia muestra una baja toxicidad.
Ejemplos de sustancias con una elevada toxicidad se muestran en la
Fig. 3. El 5-fluorouracilo y la doxorubicina son
sustancias que muestran toxicidad en paralelo a una significativa
inhibición de la proliferación. Para el
5-fluorouracilo el porcentaje de células muertas
respecto a las células totales está en el rango entre el 0 y el 25%
para el rango de concentración de la sustancia en la que la
inhibición de la proliferación se encuentra en más del 50%. Para la
doxorubicina el porcentaje de células muertas aumenta con la
concentración de sustancia hasta un 40% e incluso superior mientras
la inhibición de la proliferación es de alrededor del 80%.
El proceso de cultivo de las células en
proliferación, por ejemplo las células CD34, se realiza como se
describe a continuación. Previamente al análisis de FACS, se añaden
a cada dispositivo de pocillos (preferiblemente placas
microtituladas o similares) el colorante fluorescente para la
tinción de células viables o muertas y un número concreto de
cuentas de látex, para teñir las células viables o muertas y contar
las partículas de látex como medida del volumen de medio de cultivo
celular analizado, respectivamente. Tras añadir las sustancias en
investigación y tras realizar el cultivo de células en los
diferentes dispositivos, la placa microtitulada se sitúa en un
instrumento de dispensación automática que introduce alícuotas de la
muestra de células de cada pocillo en la cámara de flujo del FACS.
Se analiza un número concreto de cuentas de látex (proporcionando
así información sobre el volumen de medio analizado), se detiene la
medida y el robot de dispensación toma alícuotas del siguiente
pocillo y se inicia el análisis de nuevo como anteriormente.
El término "sustancias en investigación"
son sustancias de las que se sospecha que poseen una actividad
inhibitoria de la proliferación o actividad citotóxica. Estas
sustancias son compuestos químicos de bajo peso molecular. Los
compuestos se utilizan en al menos dos concentraciones diferentes,
preferiblemente, sin embargo, en más concentraciones, por ejemplo
en cinco concentraciones diferentes o más. La razón para ello es que
en base a los resultados de tales concentraciones diferentes, es
posible investigar la inhibición de la proliferación y la inducción
de muerte celular dependientes de la concentración muy fácilmente y
decidir si la sustancia induce una muerte celular considerable y/o
inhibe la proliferación. Mediante la comparación de estos valores,
especialmente mediante la comparación de la dependencia de la
concentración en la proliferación y en la inducción de muerte
celular, es posible identificar sustancias candidatas potenciales
que muestran por ejemplo una fuerte inhibición de la proliferación
sin una considerable inducción de muerte celular. Además, realizando
el método de la invención a diferentes concentraciones permite
calcular los valores de CI_{50} tanto para la proliferación
("actividad proliferativa") como para la inducción de muerte
celular ("toxicidad"). Las concentraciones y el rango de
concentraciones dependen de la potencia deseada de la sustancia en
investigación y también del tipo de células utilizadas en la
investigación. Normalmente, el rango de concentraciones está en el
rango micromolar y entre alrededor de 0,01 \muM/ml y 100
\muM/ml.
El término "célula" como se utiliza aquí
describe células de mamífero en proliferación que son útiles como
sistema control en los ensayos de proliferación. Tales células son
bien conocidas en el estado de la materia y son, por ejemplo, las
células progenitoras CD34+ y células madre humanas, linfocitos,
fibroblastos/queratinocitos normales, células endoteliales y
epiteliales normales, células de mamífero transformadas
artificiales, células leucémicas y células de tumor sólido. La
proliferación de tales células puede inhibirse mediante inhibidores
conocidos como el paclitaxel, la doxorubicina o el
5-fluorouracilo.
Normalmente, las células se siembran en
dispositivos paralelos y se propagan en suspensión. Normalmente, y
por ejemplo, si se utilizan placas microtituladas de 96 pocillos
para el cultivo de células CD34, se siembran entre 100 y 400
células/200 \mul por pocillo y se propagan preferiblemente hasta
que han alcanzado alrededor de 10.000 células/200 \mul por
pocillo bajo condiciones estándar (sin la sustancia en
investigación). Para el cultivo de las células, se utilizan medios
de cultivo convencionales, preferiblemente con factores de
crecimiento añadidos.
El término "partículas de látex" como se
utiliza aquí describe tales partículas de látex y su amplia
utilización en la calibración de fluidos en los instrumentos
automáticos de contaje celular. Tales partículas de látex se
describen, por ejemplo, en la Patente Estadounidense Nº 3.977.995.
Tales partículas de látex normalmente constan de látex sintético
fabricado a partir de un copolímero de poliestiren polivinil tolueno
o estiren divinil benzeno. El tamaño de las partículas normalmente
oscila entre 1 y alrededor de 20 \mum y las partículas se añaden
a la suspensión celular en una cantidad de 10.000 partículas/200
\mul.
La medida de los parámetros para la
determinación de acuerdo con la invención se realiza mediante un
análisis de citometría de flujo en un aparato en el que puede
medirse la fluorescencia a diferentes longitudes de onda y la luz
dispersada en diferentes ángulos, y correlacionarse con la cantidad
de células que proporcionan tales señales. Los parámetros se
determinan mientras las células de una muestra fluyen a través del
instrumento analítico ya sea en paralelo o un parámetro
inmediatamente tras otro (determinación simultánea).
Preferiblemente, tal determinación se realiza mediante la
utilización de un instrumento de análisis de FACS. La luz dispersada
es mide en diferentes ángulos, preferiblemente como luz dispersada
hacia delante (FSC) (ángulo máximo de la luz dispersada hasta 20º,
preferiblemente inferior) y como luz dispersada lateral (SSC)
(ángulo alrededor de 90º). Como el tamaño de las células y las
partículas de látex puede no diferir considerablemente, su
comportamiento en relación a la dispersión de la luz es
considerablemente diferente, presumiblemente en base a la estructura
interna y la forma de las células así como por su diferente índice
refractivo. En base a esta diferencia, las células (viables/en
proliferación, células viables en reposo y células muertas) pueden
discriminarse fácilmente de las partículas de látex por un ángulo
considerablemente diferente de la luz dispersada. SSC se refiere a
las cuentas de látex y FSC se refiere a las células (véase la Fig.
2a). Sin embargo, también es posible teñir todas las células o
todas las partículas de látex con colorantes fluorescentes y
discriminar las partículas de látex y las células mediante la
investigación de la luz fluorescente a diferentes longitudes de
onda. La utilización de los parámetros medidos depende simplemente
de las posibilidades y la comodidad que proporcione el aparato que
se está utilizando. Si un aparato puede medir la luz fluorescente
simultáneamente a tres o cuatro longitudes de onda fluorescentes
diferentes, pueden marcarse las partículas de látex, todas las
células y las células en división o muertas específicamente con
colorantes fluorescentes. Por lo tanto, pueden utilizarse todas las
combinaciones de luz dispersada y luz fluorescente para la medida de
los parámetros, teniendo en cuenta que el parámetro de luz
dispersada no es útil para una discriminación directa de las
partículas de látex y las células muertas de las células viables y
en proliferación, y las células viables y en reposo.
El término "colorante fluorescente que tiñe
específicamente las células muertas o las células viables" como
se utiliza aquí describe los colorantes que penetran sólo en las
células muertas (por ejemplo el yoduro de propidio), o que se
enriquecen sólo en las células viables (por ejemplo diacetato de
fluoresceína). Si el contaje de todas las células es necesario, son
útiles los colorantes fluorescentes para teñir células muertas así
como los colorantes para teñir células viables (por ejemplo Hoechst
33342). Se han descrito numerosos colorantes fluorescentes útiles
para el marcaje selectivo de las células viables o muertas (por
ejemplo en el catálogo de Molecular Probes;
http://www.molecularprobes.com/). Los colorantes fluorescentes se
añaden en una cantidad adecuada, que es por ejemplo una
concentración final de 1 \mug/ml.
Los siguientes ejemplos, listado de referencias
y figuras se proporcionan para ayudar a mejorar la compresión de la
presente invención, cuyo verdadero alcance se fija en las
reivindicaciones anexas. Se debe entender que pueden realizarse
modificaciones en los procedimientos indicados sin alejarse del
espíritu de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 Análisis microscópico del crecimiento
celular y la muerte celular en poblaciones de células CD34. las
células CD34 estimuladas con citoquinas se cultivaron durante 4 y 7
días sin tratar o tratadas con un compuesto citotóxico.
Figura 2 Análisis de FACS de cuentas estándar, y
de células CD34 estimuladas con citoquinas viables y muertas
cultivadas durante 10 días. Las células se dejaron sin tratar (fila
izquierda) o se trataron con un fármaco citotóxico que induce
diferentes niveles de citotoxicidad.
Figura 3 Número de células y porcentaje de
células muertas cuantificadas a partir de un análisis de FACS como
se muestra en la Figura 2. Se muestran dos compuestos citotóxicos
típicos, 5-fluorouracilo (0,1-100
\mumol/l) y doxorubicina (1-1000 ng/ml). El valor
CI_{50} del análisis del número de células se corresponde a 0,34
\mumol/l y 0,67 ng/ml para el 5-fluorouracilo y
la doxorubicina, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En un escenario experimental típico, se aíslan
células CD34+ de sangre de cardón humana con una pureza elevada
(>90%) mediante separación celular inmunomagnética, se alicuotan
y se congelan en medio que contiene DMSO. Para el cultivo celular,
las células CD34+ congeladas se descongelan y se siembran 200
células en 200 \mul de medio completo en un pocillo de una placa
de 96 pocillos. El medio de cultivo celular básico consiste en
medio IMDM suplementado con suero AB humano al 20% y antibióticos
(pen./estrep.). Las células CD34+ se activan mediante la adición
del siguiente cóctel de citoquinas: hu-SCF (100
ng/ml), hu-IL6 (10 ng/ml),
hu-GM-CSF (100 U/ml),
hu-TPO (25 ng/ml) y hu-EPO (5 U/ml).
El cultivo se realiza en incubadores a 37ºC, humedad elevada y un
7% de CO_{2}.
Pueden utilizarse dos procedimientos
experimentales diferentes: 1) adición del compuesto inhibidor
previamente a la adición de suplementos al medio con citoquinas
para que afecte preferentemente a las células en reposo, y 2)
adición del compuesto inhibidor 4 días tras la activación de CD34
con citoquinas para que afecte preferentemente a las células
activadas.
Como se muestra en la Figura 1, las células CD34
activadas y viables aparecen como células grandes esferoides tras
un periodo de cultivo de 4 días (panel A). El número de células
aumenta significativamente cuando las células se dejan crecer
durante 3 días adicionales (panel C). Un fármaco citotóxico induce
muerte celular en células CD34 que aparecen fragmentadas en las
imágenes de microscopio tras un periodo de cultivo de 4 días (panel
B), y el número de células fragmentadas aumenta sin que haya un
aumento significativo del número de células (panel D).
Dependiendo de la tasa de proliferación de las
células CD34+, la recogida y análisis del número de células y de la
citotoxicidad se realiza tras un cultivo de las células de
9-10 días. El número de células y la citotoxicidad
se analiza mediante la técnica de FACS. El número de células
presentes en el pocillo se cuenta por comparación con un estándar
interno de cuentas. A cada pocillo, que contiene un volumen de 200
\mul de medio, se añade una alícuota de 10.000 cuentas
(FluoSpheres® de poliestireno, 15 \mum; Molecular Probes). Como se
muestra en la Fig. 2, en una programación típica del instrumento de
FACS, las células viables aparecen en una posición central/derecha
de la dispersión hacia delante (FSC) y la dispersión lateral
inferior (SSC) pero las cuentas estándar añadidas están presentes
en una región con un FSC inferior y SSC superior (panel A). Una
ventana, que se muestra como una región rectangular, se fija sobre
las cuentas estándar, se cuenta un número concreto, se detiene el
análisis y se calcula el volumen correspondiente de medio con
células. El Panel E muestra el ensayo de viabilidad de las células
CD34 analizadas en esta medida. Las células viables aparecen de
nuevo en posición central/derecha de la dispersión hacia delante
(FSC) y no muestran marcaje o muy poco con yoduro de propidio. Las
pocas células muertas aparecen en posición izquierda o
superior/izquierda en relación a la población de células viables.
En la medida de FACS se realiza en este momento un contaje de las
cuentas de la alícuota y se calcula el número de células presentes
en el pocillo, mientras la citotoxicidad, el número de células
muertas, se registra en paralelo durante esta medida (adición de
yoduro de propidio; concentración final 1 \mug/ml). Con
concentraciones crecientes de un compuesto citotóxico el número de
células en el grupo de células muertas aumenta significativamente
(Fig. 2 paneles F y G). A la mayor concentración inhibitoria y
citotóxica se encuentran ya muy pocas células en el grupo de células
viables y la mayoría de células han muerto como se hace evidente
por el aumento de tinción con PI o la fragmentación (panel H).
Un ejemplo típico de cálculo del número de
células CD34 y el porcentaje de células muertas en un pocillo se
muestra en la Fig. 3 para dos compuestos citotóxicos, el
5-fluorouracilo y la doxorubicina. El número de
células por pocillos se muestra como una barra para cada
concentración analizada. Para el 5-fluorouracilo el
número de células disminuye significativamente entre 0,3 y 1,0
\mumol/l y a la menor concentración de 1 ng/ml de doxorubicina el
número de células ya es bajo. Utilizando un programa de cálculo de
la CI_{50}, se calcularon los valores de CI_{50} para los
compuestos inhibidores en 0,34 \mumol/l y 0,67 ng/ml para el
5-fluorouracilo y la doxorubicina, respectivamente.
El aumento del porcentaje de células muertas obtenido en el análisis
de la fracción celular positiva en PI (Fig.2 paneles de E a H) se
muestra con una línea continua.
Claims (4)
1. Un método para la determinación simultánea de
actividad inhibitoria de la proliferación celular y de toxicidad
celular de un compuesto químico de bajo peso molecular utilizando
una muestra de células de mamífero en proliferación como sistema
control, que se caracteriza por
a) tratar dicha muestra de células que es una
suspensión celular o células adherentes en un volumen predeterminado
con dicho compuesto en al menos dos concentraciones predeterminadas
diferentes;
b) tratar dicha muestra de células con un
primera tinción de colorante fluorescente específica de las células
muertas o de las viables, y opcionalmente con una segunda tinción de
colorante fluorescente de todas las células;
c) añadir a dicha muestra de células una
cantidad predeterminada de partículas de látex con un tamaño que
oscila entre alrededor de 1 y alrededor de 20 \mum a dicho volumen
y opcionalmente teñir dichas partículas de látex con un tercer
colorante fluorescente;
d) determinar la proporción entre la cantidad de
células totales y la cantidad de partículas de látex en dicha
muestra;
e) determinar, con los resultados del paso d) y
mediante un análisis de citometría de flujo en dicha muestra, el
número de células muertas o viables mediante la luz fluorescente
emitida por dicho primer colorante fluorescente a una primera
longitud de onda, el número de células totales por unidad de volumen
mediante la luz dispersada en un primer ángulo o alternativamente
mediante la luz fluorescente emitida por dicho segundo colorante
fluorescente a una segunda longitud de onda, el número de
partículas de látex por unidad de volumen mediante la luz dispersada
en un segundo ángulo o alternativamente mediante la luz
fluorescente emitida por dicho tercer colorante fluorescente a una
tercera longitud de onda;
f) y determinar con los resultados de los pasos
d) y e) la actividad sobre la proliferación celular y la toxicidad
de dicho compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
que se caracteriza porque las células muertas se tiñen
específicamente mediante un colorante fluorescente y el número de
partículas de látex y las células se mide mediante la diferencia
entre la luz dispersada lateral y la luz dispersada hacia el
frente.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, que se caracteriza porque las células son células
progenitoras CD34+ humanas.
4. Un método de acuerdo con las reivindicaciones
de 1 a 3, que se caracteriza porque las células se cultivan
en paralelo en múltiples dispositivos y las muestras se transfieren
al instrumento de análisis mediante citometría de flujo a través de
dispensación automática.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03005335 | 2003-03-12 | ||
| EP03005335 | 2003-03-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2344943T3 true ES2344943T3 (es) | 2010-09-10 |
Family
ID=32946848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04005789T Expired - Lifetime ES2344943T3 (es) | 2003-03-12 | 2004-03-11 | Determinacion simultanea de la actividad inhibitoria de la proliferacion celular y la toxicidad utilizando citometria de flujo. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7202081B2 (es) |
| JP (1) | JP2004337152A (es) |
| CN (1) | CN100439919C (es) |
| AT (1) | ATE470856T1 (es) |
| CA (1) | CA2456534A1 (es) |
| DE (1) | DE602004027567D1 (es) |
| ES (1) | ES2344943T3 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101017168B (zh) * | 2007-02-15 | 2012-08-29 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 荧光胶乳定量层析试纸条及其制备方法 |
| CN101481651B (zh) * | 2009-02-05 | 2011-09-21 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 金属纳米材料毒性检测板及其检测方法 |
| GB0911060D0 (en) | 2009-06-26 | 2009-08-12 | Ge Healthcare Uk Ltd | Methods for predicting the toxicity of a chemical |
| JP2011092104A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Hitachi Engineering & Services Co Ltd | 微生物などの検査方法及び検査装置 |
| CN103267752B (zh) * | 2013-05-31 | 2015-04-08 | 北京大学 | 测定胰岛中a细胞与b细胞数目比例的方法 |
| CN104807788B (zh) * | 2014-12-18 | 2018-09-14 | 中山大学 | 一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒 |
| CN106053405B (zh) * | 2016-05-10 | 2018-10-02 | 东南大学 | 一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US643378A (en) * | 1899-10-30 | 1900-02-13 | Charles C Jordan | Washboiler. |
| CN1180108A (zh) * | 1997-10-08 | 1998-04-29 | 陈学清 | 细胞增殖检测试剂盒(酸性磷酸酶法) |
-
2004
- 2004-01-30 CA CA002456534A patent/CA2456534A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-11 US US10/776,733 patent/US7202081B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-11 ES ES04005789T patent/ES2344943T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-11 DE DE602004027567T patent/DE602004027567D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-11 AT AT04005789T patent/ATE470856T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-03-11 JP JP2004068280A patent/JP2004337152A/ja active Pending
- 2004-03-12 CN CNB2004100396518A patent/CN100439919C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040180390A1 (en) | 2004-09-16 |
| CN100439919C (zh) | 2008-12-03 |
| ATE470856T1 (de) | 2010-06-15 |
| DE602004027567D1 (de) | 2010-07-22 |
| JP2004337152A (ja) | 2004-12-02 |
| CA2456534A1 (en) | 2004-09-12 |
| US7202081B2 (en) | 2007-04-10 |
| CN1530643A (zh) | 2004-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eccles et al. | Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery | |
| Gilbert et al. | Clinical and biological significance of CXCL12 and CXCR4 expression in adult testes and germ cell tumours of adults and adolescents | |
| US8900843B2 (en) | Kit and method for the capture of tumor cells | |
| JP2011501190A (ja) | 細胞分析の進歩した方法および装置 | |
| ES2344943T3 (es) | Determinacion simultanea de la actividad inhibitoria de la proliferacion celular y la toxicidad utilizando citometria de flujo. | |
| JP2019513418A (ja) | がん治療における患者特有の治療決定のための診断方法 | |
| CN102947266A (zh) | 分析细胞或含有核酸的其它生物材料的方法 | |
| US20240069011A1 (en) | Predicting efficacy of or resistance to treatment of colon cancer | |
| US20130071874A1 (en) | System and method for anti-cancer drug candidate evaluation | |
| US20180051319A1 (en) | High-throughput drug and genetic assays for cellular transformation | |
| KR102145344B1 (ko) | 마이크로필러를 이용한 시료 박편의 제조방법 | |
| CA2438406A1 (en) | Materials and methods for the induction of premature chromosome condensation | |
| WO2023010101A1 (en) | Methods for improving reproductive cell sample quality | |
| EP1457781B1 (en) | Simultaneous determination of cell proliferation inhibition activity and toxicity using flow cytometry | |
| US20240101965A1 (en) | Ex vivo tumor angiogenesis model | |
| US8614054B2 (en) | Laser scanning cytometry mediated analysis of therapeutic efficacy in tumors | |
| Kuen | Influence of 3D tumor cell/fibroblast co-culture on monocyte differentiation and tumor progression in pancreatic cancer | |
| WO2006089048A2 (en) | Methods of screening compounds to predict toxicity and residual proliferative and differentiation capacity of the lympho-hematopoietic system | |
| Vishwanath et al. | A quantitative high-throughput chemotaxis assay using bioluminescent reporter cells | |
| Benz et al. | Flow cytometric analysis of fluorescent estrogen binding in cancer cell suspensions | |
| US20110244503A1 (en) | System and Method for Anti-Cancer Drug Candidate Evaluation | |
| RU2737248C1 (ru) | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ РАБДОМИОСАРКОМЫ ЧЕЛОВЕКА 862 RMSar KDD | |
| Li et al. | Modulation of multidrug resistance on the same single cancer cell in a microfluidic chip: intended for cancer stem cell research | |
| Lymberopoulos et al. | Impact of Storage and Purification on Mitochondrial Membrane Potential of Boar Spermatozoa. | |
| US7749728B2 (en) | Method and system for measuring the penetration of drugs and other substances into tissue |