CN1180108A - 细胞增殖检测试剂盒(酸性磷酸酶法) - Google Patents
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Abstract
本发明为一种非放射性检测细胞增殖和活性的试剂盒,其利用活细胞酸性磷酸酶的活性与细胞数成正相关关系的原理。本试剂盒由磷酸酶底物缓冲液、磷酸酶底物、反应中止液和/或磷酸酶底物稀释瓶组成。主要用于96孔细胞培养板贴壁和悬浮细胞的测定。应用范围:①测定细胞对生长因子、细胞因子、促分裂因子和营养因子刺激的增殖反应;②分析抗肿瘤药物及其它化学药物的细胞毒和细胞抑制作用;③评价生长抑制抗体和生理调节因子的作用等。
Description
本发明专利为一种非放射性的检测细胞增殖和活性的方法，也是一种间接的活细胞计数方法，适应于96孔细胞培养板中培养的贴壁和悬浮细胞的检测。
细胞增殖的检测一般包括：①光镜下直接作细胞计数；②电子颗粒计数；③测定细胞DNA和蛋白质的含量，包括用同位素35S-甲硫氨酸和3H-TdR及非同位素BrdU进行标记；④细胞压积判断细胞容量；⑤细胞摄取染料颗粒；⑥细胞内酶检测方法，以及⑦流式细胞仪计数等。其中细胞摄取染料颗粒和细胞压积判断细胞容量等方法目前已较少采用。在常用的几种方法中，细胞直接计数和电子颗粒计数方法，由于存在主观性，或上样等原因，样品间差异较大。而细胞DNA和蛋白质测定，属于从另一个侧面反应细胞增殖，不是一种间接反应细胞数的方法。将流式细胞仪用于细胞增殖测定，准确性较高，而且信息量大。但其需要较高的条件，操作复杂，费用高，不适用一般研究工作。
细胞内酶检测方法用于细胞增殖，最常用的为四甲基偶氮唑盐比色法，即MTT法。其原理是活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化MTT形成蓝色甲肷，形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。MTT法的缺陷是灵敏性较差，重复性不佳(姜泊，张亚历，周殿元主编：分子生物学常用实验方法.人民军医出版社第一版.1996：101)。但在作了一些改进后已由Promega公司(1992)和Boehringer Mannheim公司推出，作为无同位素的细胞增殖测定试剂盒。其它细胞酶内方法还包括酸性磷酸酶和碱性磷酸酶方法等，后者用于体外含丰富碱性磷酸酶的骨母细胞瘤细胞增殖的测定[Bone miner 1994；Oct 27(1)：57]。我们曾将碱性磷酸酶方法用于其它类型细胞的检测，结果不佳。
利用细胞内酸性磷酸酶活性检测细胞增殖的方法，最早出现在1986年，由Connolly等人用于测定内皮细胞的增殖(Analytical Biochemistry 1986；152：136)，其灵敏度可达100细胞/孔。其原理是活细胞内的酸性磷酸酶可以准确反映细胞数。在一定条件下，用去垢剂使细胞膜破裂释放出酸性磷酸酶，使其与磷酸酶底物作用，这一呈色反应可用酶标仪检测，所测的吸光度即可代表酸性磷酸酶的活性，也间接反映了活细胞数。国内沈敏等也用于内皮细胞计数，重复其方法也得到很好的结果[上海第二医科大学学报1989；9(2)：149]。我们将这一方法用于上皮细胞的计数，结果发现，细胞内酸性磷酸酶也能较好地反应上皮细胞的增殖情况[中华消化杂志1994；14(S)：42，胃肠病学和肝病学杂志1994；3(4)：279]。近来，我们将其用于中性粒细胞、淋巴细胞、神经胶质细胞和骨细胞等计数，也取得了很好的结果。细胞数与所测定得的吸光度(细胞内酸性磷酸酶底物呈色反应405nm处测定结果)的相关系数均大于0.96，大部分在0.99左右，重复性好。因此，在较广义的范围内，细胞内酸性磷酸酶活性可以准确地反映检测的活细胞数，可以用于检测细胞的增殖和活性。
一种好的细胞增殖检测方法应该有以下特点：能准确地反映细胞的增殖和活性，即能真实地反映细胞数或细胞内的DNA和蛋白质的含量；操作简便，无污染；重复性好；成本低。将酸性磷酸酶方法用于细胞增殖检测，虽然有准确、重复性好和无污染等特点，但工作浓度的磷酸酶底物难于保存，应用时配制较繁琐，限制了其推广应用。我们发现，将磷酸酶底物配制成储存液(5--10×)，避光保存于-10℃以下，应用时将其稀释成工作液，在一定时间内(--1年)将对检测结果无明显影响。出于大家熟知的原因，将磷酸酶底物以固态形成保存结果将更好。因此，如果将本方法的其它试剂也配成储存浓度，将可使方法简便化。基于此种设想，本专利设计了一种利用细胞内酸性磷酸酶活性检测细胞增殖的试剂盒。
本发明的目的是利用细胞内酸性磷酸酶活性可以准确地反映检测的活细胞数的原理，设计应用简单方便，无污染和成本低的检测细胞增殖和活性的试剂盒。本方法主要用于96孔细胞培养板的测定。应用范围可包括：①测定细胞对生长因子、细胞因子、促分裂因子和营养因子刺激的增殖反应；②分析抗肿瘤药物及其它化学药物的细胞毒和细胞抑制作用；③评价生长抑制抗体和生理调节因子的作用等
本试剂盒由磷酸酶底物缓冲液、磷酸酶底物、反应中止液和/或磷酸酶底物稀释瓶组成。所说的磷酸酶底物缓冲液为含去垢剂的酸性缓冲液，磷酸酶底物为硝基苯磷酸盐(4-Nitrophenyl phosphate，p-Nitrophenyl phosphate)，或磷酸酶底物缓冲液和硝基苯磷酸盐充分混合后无沉淀的混合物。反应中止液为碱性的氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
本设计中，磷酸酶底物缓冲液中的去垢剂可以是TritonX-100或Tween-20，其中TritonX-100的工作浓度为0.1-0.5％，Tween-20的工作浓度为0.05-0.2％；磷酸酶底物缓冲液中的酸性缓冲液的pH为5.0--6.0之间，可以为乙酸钠缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种，乙酸钠缓冲液的工作浓度可以为0.05--0.5M，磷酸盐缓冲液的工作浓度可以为0.01--0.1M；磷酸酶底物其工作浓度时，硝基苯磷酸盐的浓度可以为5--20mM；反应中止液氢氧化钠或氢氧化钾的工作浓度可以为0.05--0.5M。
为体现试剂盒使用简便的特点，本设计中磷酸酶底物和磷酸酶底物缓冲液以储存液的形式存在，其浓度均为工作浓度的5--10倍。使用者只要简单地用蒸馏水将磷酸酶底物缓冲液稀释5--10倍，再用稀释后的磷酸酶底物缓冲液将磷酸酶底物稀释5--10倍，即可配成磷酸酶底物的工作液。另外，为更有效地保存磷酸酶底物中硝基苯磷酸盐，本设计中还采用了另一种方法，即先将硝基苯磷酸盐以固体的形式：粉剂、颗粒状和片剂中的一种形式保存。在使用前，操作者只需简单地将硝基苯磷酸盐中加入试剂盒提供的磷酸酶底物缓冲液原液，充分搅拌至无沉淀即可形成储存液形式，这时磷酸酶底物中硝基苯磷酸盐的浓度应为工作浓度的5--10倍。
更具体地解释本试剂盒的组成，以其中的一种组合为例说明(磷酸酶底物和磷酸酶底物缓冲液以10×储存液浓度配制)。本例中，试剂盒在使用时，去垢剂为Triton X-100(工作浓度为0.1％)，酸性缓冲液为pH 5.5的乙酸钠缓冲液(工作浓度为0.1M)，硝基苯磷酸盐为p-Nitrophenyl phosphate，disodium，hexahydrate(工作浓度为10mM)，反应中止液为氢氧化钠(工作浓度为0.1M)。为确切地描述试剂盒的组成，将一个试剂盒所测定的样本定为1000份，即可检测10个96孔细胞培养板。该试剂盒组成如下：
1)磷酸酶底物缓冲液：1M乙酸钠缓冲液(pH5.5，含1％的Triton X-100)10.0ml；
2)磷酸酶底物：100mM硝基苯磷酸盐10.0ml，用含0.1％Triton X-100的0.1M乙酸钠配制，pH 5.5；
3)反应中止液：0.1M氢氧化钠10.0ml；
4)10ml的磷酸酶底物稀释瓶一个。
由于96孔细胞培养板一次可以检测96孔，而加入的磷酸酶底物为100μl/孔，因而检测一个细胞培养板需9600μl，约为10.0ml。以检测一个96孔细胞培养板为例，本试剂盒的标准应用程序如下：
1)取磷酸酶底物缓冲液1.0ml，加入9.0ml蒸馏水，摇匀后取9.0ml加入磷酸酶底物稀释瓶中；
2)取磷酸酶底物1.0ml加入稀释瓶中，充分摇匀；
3)96孔细胞培养板中培养细胞，用细胞洗涤液(0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.0，含0.85％的氯化钠)洗涤1次(如为悬浮细胞则用离心洗涤)，去洗涤液后加入上述稀释后的磷酸酶底物100μl/孔；
4)37℃，孵育1-4小时(细胞数每孔约＞105，则控制在2小时以内；
5)加入0.1M氢氧化钠100μl/孔；
6)在多孔酶标仪上405nm处测光吸收度，将细胞培养板其中不含细胞，同样处理过的一孔作为空白对照，所测的每孔光吸收度可间接反映每孔中的细胞数。如在同样条件下作一细胞数的系列标准对照，以细胞数为X轴，光吸收度为Y轴，可作直线回归，可推算出每孔中的细胞数。
Claims (5)
1.一种非放射性用于细胞增殖检测试剂盒，适用于检测培养于96孔细胞培养板中的贴壁和悬浮细胞，是由磷酸酶底物缓冲液、磷酸酶底物、反应中止液和/或磷酸酶底物稀释瓶组成。所说的磷酸酶底物缓冲液为含去垢剂的酸性缓冲液。所说的磷酸酶底物为硝基苯磷酸盐(4-Nitrophenyl phosphate，p-Nitrophenyl phosphate)，或磷酸酶底物缓冲液和硝基苯磷酸盐充分混合后无沉淀的混合物。所说的反应中止液为碱性的氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
2.根据权利要求1所说的磷酸酶底物缓冲液，其特征是所说的酸性缓冲液的pH值为5.0-6.0，是磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液中的一种，所说的去垢剂是Triton X-100或Tween-20。
3.根据权利要求1和权利要求2，所说的磷酸酶底物缓冲液，其特征是，酸性缓冲液和去垢剂的浓度是储存浓度，为工作浓度的5--10倍。
4.根据权利要求1所说的磷酸酶底物，其特征是，磷酸酶底物可以是粉末状、颗粒状、片剂、液体(0℃下为固体形态)中形态的一种。
5.根据权利要求1和权利要求4所说的磷酸酶底物的液体形态(0℃下为固体形态)，其特征是，由硝基苯磷酸盐和磷酸酶底物缓冲液充分混合后无沉淀的混合物，其硝基苯磷酸盐的浓度为工作浓度的5--10倍。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1086665C (zh) * | 1999-12-15 | 2002-06-26 | 赵永兴 | 卫生卷烟的包装方法 |
| CN100439919C (zh) * | 2003-03-12 | 2008-12-03 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 同时检测细胞增殖抑制活性和毒性的方法 |
| CN1721851B (zh) * | 2005-04-21 | 2010-08-18 | 梁亮胜 | 定量测定睫状神经营养因子相关因子生物活性的方法 |
| CN103808712A (zh) * | 2012-11-05 | 2014-05-21 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒和检测方法 |
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1997
- 1997-10-08 CN CN 97116976 patent/CN1180108A/zh active Pending
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