ES2340006T3 - Un procedimento de obtencion de un compuesto por formacion de un polimero a partir de un farmaco modelo. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE FORMACION DE POLIMEROS EN PRESENCIA DE ACIDO NUCLEICO, UTILIZANDO UNA POLIMERIZACION POR MATRIZ. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO QUE PERMITE QUE SE PRODUZCA LA POLIMERIZACION EN SISTEMAS HETEROFASICOS. DICHOS PROCEDIMIENTOS SE PUEDEN USAR PARA CANALIZAR ACIDOS NUCLEICOS, PARA CONDENSAR EL ACIDO NUCLEICO, PARA FORMAR POLIMEROS QUE UNEN EL ACIDO NUCLEICO, PARA FORMAR COMPLEJOS SUPRAMOLECULARES QUE CONTIENEN ACIDO NUCLEICO Y POLIMEROS Y PARA FORMAR UN COMPLEJO INTERPOLIELECTROLITA.
Description
Un procedimiento de obtención de un compuesto
por formación de un polímero a partir de un fármaco modelo.
Se usan polímeros para el suministro de fármacos
para una diversidad de fines terapéuticos. También se han usado
polímeros para el suministro de ácidos nucleicos (polinucleótidos y
oligonucleótidos) a las células con fines terapéuticos, que han
sido denominados terapia génica o terapia antisentido. Uno de los
varios métodos de suministro de ácidos nucleicos a las células es
el uso de complejos de DNA - policationes. Se ha demostrado que
proteínas catiónicas como las histonas y las protaminas, o polímeros
sintéticos como la polilisina, la poliarginina, la poliornitina, el
DEAE dextrano, el polibreno y la polietilenimina, eran eficaces
agentes de suministro intracelular, mientras que los policationes
pequeños, como la espermina, eran ineficaces. (Felgner, P.L. (1990)
Advanced Drug Delivery Rev. 5, 163-187; Boussif, O.,
Lezoualch, F., Zanta, M.A., Mergny, M. D., Scherman, D., Demeneix,
B., y Behr, J. P. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
7297-7301). El mecanismo por el cual los
policationes facilitan la absorción de DNA no está dilucidado del
todo, pero los siguientes son algunos principios importantes:
1) Los policationes proporcionan la fijación
del DNA a la superficie de la célula diana: El polímero forma
un puente entre los ácidos nucleicos polianiónicos y las superficies
polianiónicas de las células. Como resultado, el mecanismo
principal de la translocación de DNA al espacio intracelular podría
ser endocitosis adsortiva no específica, que puede ser más efectiva
que la endocitosis de líquidos o endocitosis mediada por un
receptor. Además, los policationes son un enlazador muy conveniente
para fijar receptores específicos al DNA y, como resultado, los
complejos DNA - policatión pueden ser dirigidos a tipos de células
específicos (Perales, J.C., Ferkol, T. Molas, M. y Hanson, W.
(1994) Eur. J. Biochem. 226, 255-266; Cotten, M.,
Wagner,E. y Birnstiel, M.L. (1993) Methods in Enzymology 217,
618-644; Wagner, E., Curiel, D., y Cotten, M. (1994)
Advanced Drug Delivery Rev. 114, 113-135).
2) Los policationes protegen el DNA en
complejos contra la degradación por nucleasa (Chiou, H. C.,
Tangco, M. V. Levina, S. M., Robertson, D., Kormis, K., Wu, C. H.,
y Wu, G. Y. (1994) Nucleic Acids Res. 22,
5439-5446). Esto es importante para la preservación
tanto extracelular como intracelular del DNA. La etapa endocítica
en la absorción intracelular de los complejos de DNA - policatión
está sugerida por resultados en los que la expresión del DNA se
obtiene solamente incorporando una etapa de lisis hipertónica suave
(bien sea por glicerol o DMSO) (Lopata, M. A., D. Clevland, W., y
Sollner-Webb, B. (1984) Nucleic Acids Res. 12,
5707-5717; Golub, E. I., Kim, H. y Volsky, D. J.
(1989) Nucleic Acid Res. 17, 4902). La expresión génica es también
posibilitada o incrementada evitando la acidificación del endosoma
con NH_{4}Cl o cloroquina (Luthman, H. y Magnusson, G. (1983)
Nucleic Acids Res. 11, 1295-1300). La
polietilenimina que facilita la expresión génica sin tratamientos
adicionales probablemente rompe la propia función endosomal
(Boussif, O., Lezoualch, F., Zanta, M. A., Mergny, M. D., Scherman,
D., Demeneix, B., y Behr, J.P. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
7297-7301). La rotura de la función endosomal se ha
realizado también por unión con los agentes rompedores endosomales
de policatión tales como la fusión de péptidos o adenovirus
(Zauner, W., Blaas, D., Kuechler, E., Wagner, E., (1995) J.
Virology 69, 1085-1092; Wagner, E., Plank, C.,
Zatloukal, K., Cotten, M., y Birnstiel, M.L. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. 89, 7934-7938) (Fisher, K.J., y Wilson,
J.M. (1994) Biochemical J. 299, 49-58).
3) Los policationes generan condensación de
DNA: El volumen que ocupa una molécula de DNA en complejo con
policationes es radicalmente más pequeño que el volumen de una
molécula de DNA libre. El tamaño del complejo de DNA/polímero es
crítico para el suministro de genes in vivo. En términos de
inyección intravenosa, el DNA necesita cruzar la barrera endotelial
y llegar a las células parenquimales de interés. Las más grandes
ventanas endoteliales (endotelia fenestrae; orificios en la
barrera endotelial) se presentan en el hígado y tienen un diámetro
medio de 100 nm. El tamaño de las ventanas (fenestrae) en
otros órganos es mucho menor. El tamaño de los complejos de DNA es
también importante para el proceso de absorción celular. Después de
la unión a las células diana el complejo de DNA - policatión debe
ser absorbido por endocitosis. Como las vesículas endocíticas
tienen un diámetro interno homogéneo de aproximadamente 100 nm en
hepatocitos de tamaño similar en otros tipos de célula, los
complejos de DNA necesitan ser menores que 100 nm (Geuzze, H.J.,
Slot, J. W., Strous, G. J., Lodish, H. F., y Schwartz, A. L. (1982)
J. Cell Biol. 92, 865-870).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado que un número significativo de
cationes polivalentes con estructuras moleculares muy diferentes
inducen la condensación del DNA. Estos incluyen espermidina,
espermina, Co(NH_{3})63+, protamina, histona H1, y
polilisina (Gosule, L. C. y Schellman, J. A. (1976) Nature 259,
333-335; Chattoraj, D. K., Gosule, L. C. y
Schellman, J. A. (1978) J. Mol. Biol. 121, 327-337;
Had, N.V., Downing, K. H. y Balhorn, R. (1993) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 193, 1347-1354; Hsiang, M. W y Cole, R.
D. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4852-4856;
Haynes, M., Garret, R. A. y Gratzer, W. B. (1970) Biochemistry 9,
4410-4416; Widom, J. y Baldwin, R. L. (1980) J.
Mol. Biol. 144, 431-453). El análisis cuantitativo
ha demostrado que la condensación del DNA es favorecida cuando el
90% o más de las cargas a lo largo del esqueleto de
azúcar-fosfato están neutralizadas (Wilson, R. W. y
Bloomfield, V. A. (1979) Biochemistry 18,
2192-2196). Dependiendo de la concentración de DNA,
la condensación conduce a tres tipos de estructuras principales:
\newpage
1) En solución extremadamente diluida
(aproximadamente 1 \mug/ml o inferior), las moléculas de DNA
largas pueden experimentar un colapso monomolecular y formar
estructuras descritas como toroides.
2) En solución muy diluida (aproximadamente 10
\mug/ml) se forman microagregados con moléculas cortas o largas y
permanecen en suspensión. Los toroides, varillas y pequeños
agregados pueden observarse en tal solución.
3) En solución diluida (aproximadamente 1
mg/ml), se forman grandes agregados que sedimentan fácilmente.
(Sicorav, J. L., Pelta, J., y Livolant, F (1994) Biophysical Journal
67, 1387-1392).
Los toroides se han considerado una forma
atractiva para el suministro de genes porque tienen el tamaño más
pequeño. Aunque se ha encontrado que el tamaño de toroides de DNA
producidos dentro de preparados simples varía considerablemente, el
tamaño del toroide no es afectado por la longitud del DNA que se
condensa. Las moléculas de DNA de 400 pb a la longitud genómica
producen toroides similares en tamaño (Bloomfield, V. A. (1991)
Biopolymers 31, 1471-1481). Por consiguiente un
toroide puede incluir de una a varias moléculas de DNA. La cinética
del colapso del DNA por policationes que tuvo por resultado
toroides, es muy lenta. Por ejemplo la condensación del DNA por
Co(NH_{3})_{6}Cl_{3} necesita 2 horas a
temperatura ambiente (Arscott, P. G., Ma, C., y Bloomfield, V. A.
(1995) Biopolymers 36, 345-364).
El mecanismo de la condensación del DNA no es
evidente. Las fuerzas electrostáticas entre las hélices no
perturbadas proceden principalmente de un mecanismo de fluctuación
de ion contrario que requiere cationes polivalentes y desempeña el
principal papel en la condensación del DNA (Riemer, S. C. y
Bloomfield, V. A. (1978) Biopolymers 17, 789-794;
Marquet, R. y Houssier, C. (1991) J. Biomol. Struct. Dynam. 9,
159-167; Nilsson, L. G., Guldbrand, L. y
Nordenskjold L. (1991) Mol. Phys. 72, 177-192). La
fuerzas de hidratación predominan sobre las fuerzas electrostáticas
cuando las hélices de DNA se acercan más de unos cuantos diámetros
del agua (Leikin, S., Parsegian, V. A., Rau, D.C. y Rand, R. P.
(1993) Ann. Rev. Phys. Chem. 44, 369-395). En el
caso de interacciones DNA - policatión polimérico, la condensación
del DNA es un proceso más complicado que en el caso de policationes
de bajo peso molecular. Diferentes proteínas policatiónicas pueden
generar la formación de toroides y varillas con DNA de diferente
tamaño a una relación de carga positiva a negativa de 0,4
(Garciaramirez, M., y Subirana, J. A. (1994) Biopolymers 34,
285-292). Se demostró por microscopía de
fluorescencia que el DNA de T4 complejado con poliarginina o
histona puede formar dos tipos de estructuras; una estructura
alargada con una elevada longitud del eje de aproximadamente 350 nm
(como el DNA libre) y partículas esféricas densas (Minagawa, K.,
Matsuzawa, Y., Yshikawa, K., Matsumoto, M., y Doi, M. (1991) FEBS
Lett. 295, 60-67). Ambas formas existen al mismo
tiempo en la misma solución. La razón de la coexistencia de las dos
formas puede explicarse como una distribución desigual de las
cadenas de policatión entre las moléculas de DNA. La distribución
desigual genera dos conformaciones termodinámicamente favorables
(Kabanov, A. V., y Kabanov, V. A. (1995) Bioconjugate Chem. 6,
7-20).
También se demostró que la movilidad
electroforética de los complejos de DNA - policatión puede cambiar
de negativa a positiva en exceso de policatión. Es probable que los
policationes grandes no se alineen completamente a lo largo del DNA
sino que formen lazos de polímero que interaccionan con otras
moléculas de DNA. La rápida agregación y las intensas fuerzas
intermoleculares entre diferentes moléculas de DNA pueden evitar el
lento ajuste entre hélices que se necesita para formar
ordenadamente partículas estrechamente empaquetadas. Esta memoria
describe un nuevo método, que los autores de la presente invención
han denominado Polimerización con Plantilla de Polinucleótidos,
para superar este problema de agregación no específica y formación
de un grande complejo de DNA - policatión que se presenta cuando se
forman complejos policatión/DNA en concentraciones de DNA que son
de valor práctico para la transferencia de polinucleótidos a
células, y para terapia génica o antisentido.
En cuanto a un método para preparar un complejo
que comprende un ácido nucleico para el suministro del mismo a una
célula, el documento WO-A-96/11712,
a nombre del California Institute of Technology, describe un sistema
de suministro que se forma complejando un ácido nucleico con una o
más moléculas polímeras.
Se describe un procedimiento para el suministro
de fármacos en el que se inducen procesos de polimerización y de
reacción química en presencia del fármaco con el fin de suministrar
el fármaco o el compuesto biológicamente activo. El suministro de
fármacos comprende el suministro de un compuesto biológicamente
activo a una célula. Por "suministro" se entiende en el
presente texto que el fármaco llega a ser asociado con la célula. El
fármaco puede estar en la membrana de la célula o en el interior
del citoplasma, el núcleo u otro orgánulo de la célula. El proceso
de suministro de un polinucleótido a una célula se ha denominado
también comúnmente "transfección" o proceso de
"transfectar", y también se le ha denominado
"transformación". Un compuesto biológicamente activo es un
compuesto que tiene el potencial de reaccionar con componentes
biológicos. Los productos farmacéuticos, proteínas, péptidos y
ácidos nucleicos son ejemplos de compuestos activos biológicamente.
El polímero plantilla puede ser un ácido nucleico. El
polinucleótido podría ser usado para producir un cambio en una
célula que puede ser terapéutico. El suministro de polinucleótidos
o material genético con fines terapéuticos se denomina comúnmente
"terapia génica".
Se describe un nuevo método para formar ácido
nucleico condensado haciendo que tenga lugar una reacción química
en presencia del ácido nucleico. También se describe un proceso de
formación en presencia del ácido nucleico de un polímero que tiene
afinidad para el ácido nucleico. Además, se describe un proceso de
formación de un complejo interpolielectrolito que contiene ácidos
nucleicos, haciendo que tenga lugar una reacción química en
presencia del ácido nucleico. Además, puede formarse el polímero de
unión con el ácido nucleico como resultado de la polimerización con
plantilla. Esto excluye obviamente la formación de polímeros tales
como proteínas o ácidos nucleicos u otros derivados que se unen al
ácido nucleico por unión de Watson-Crick.
La invención se describe en las reivindicaciones
anexas.
Anteriormente, la aparición de reacciones
químicas o el proceso de polimerización en presencia del ácido
nucleico ha sido evitada sistemáticamente cuando se han
suministrado ácidos nucleicos. Quizás, esto surgió por el problema
de que los procesos de reacciones químicas o polimerización
modificarían químicamente el ácido nucleico y por ello lo harían no
activo biológicamente. Sorprendentemente, los autores de la presente
invención demuestran que se pueden realizar polimerizaciones en
presencia de ácidos nucleicos sin modificar químicamente el ácido
nucleico, y que el ácido nucleico sigue siendo funcional. Por
ejemplo, una construcción de plásmido que contiene un promotor y el
gen informador de luciferasa puede expresar aún tanta luciferasa
como el plásmido nativo después de la transfección en las
células.
El proceso de formación de un polímero en
presencia de ácido nucleico tiene varias ventajas. Como ilustra la
Figura 1, la agregación y la precipitación del ácido nucleico pueden
evitarse haciendo que la polimerización tenga lugar en presencia
del ácido nucleico. Este procedimiento recién descrito permitió a
los autores de la presente invención formar complejos
supramoleculares de ácido nucleico y polímero rápidamente,
consistentemente, y a concentraciones muy altas de poliácido
nucleico. De hecho, la elevada concentración del ácido nucleico
plantilla favorece este proceso. En cambio, el proceso anteriormente
descrito de mezcla de un ácido nucleico y un policatión ya formado
(tal como polilisina) se ha de hacer a concentraciones muy diluidas.
Además, el procedimiento anteriormente descrito requiere que las
condiciones de mezclado, sal y ionicidad estén también
cuidadosamente controladas. Esto explica porqué el uso de complejos
de polilisina-DNA no está muy extendido para la
transferencia de DNA a células, y se hace solamente en unos pocos
laboratorios.
La otra ventaja que surge del proceso recién
descrito de hacer que la polimerización tenga lugar en presencia
del ácido nucleico, es que podrían formarse polímeros que no
pudiesen asociarse con ácidos nucleicos si el polímero se formó
primero. Por ejemplo, el proceso de polimerización podría tener por
resultado un polímero hidrófobo que no es soluble en soluciones
acuosas, a menos que esté asociado con ácido nucleico. Un resto
hidrófobo comprende un alcano C_{6}-C_{24},
alqueno C_{6}-C_{24}, esterol, esteroide,
lípido, o hormona hidrófoba. Además, el proceso de hacer que la
polimerización tenga lugar en disolventes orgánicos y sistemas
heterofásicos permite que se formen más tipos y tipos más definidos
de vesículas.
Este procedimiento permitirá que los complejos
supramoleculares se ensamblen con mayor facilidad. También
permitirá hacer complejos nuevos y más definidos. Otra ventaja más
que surge de la presente invención es que los complejos ácido
nucleico/polímero serán más pequeños. El tamaño del complejo
DNA/polímero es crítico para el suministro de genes, especialmente
in vivo.
Estos procesos pueden usarse para transferir
ácidos nucleicos a células o un organismo, por ejemplo para el
suministro de fármacos. También pueden usarse para métodos
analíticos o para la construcción de nuevos materiales. También
pueden usarse para métodos preparativos tales como en la
purificación de ácidos nucleicos. Son también útiles para muchos
tipos de tecnología de DNA recombinante. Por ejemplo, pueden usarse
para generar moléculas de unión de secuencia y proteger secuencias
específicas frente a la digestión por nucleasa. La protección de
regiones del DNA específicas es útil en muchas aplicaciones para
tecnología de DNA recombinante.
Otros objetos, aspectos, y ventajas de la
invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción
detallada, tomándola junto con los dibujos anexos.
La Fig. 1 es una comparación del pDNA después de
la polimerización con plantilla y la complejación contrastada con la
unión y la precipitación de policationes preformados.
La Fig. 2 muestra complejos de tamaño variable
entre 40 y 70 nanómetros de diámetro después de ser secados sobre
rejillas de carbono y teñidos con tungstato de metilamina.
La Fig. 3 ilustra la polimerización dependiente
de plantilla de péptidos NLS (señales de localización nuclear)
usando SDS-PAGE.
La Fig. 4 ilustra la relación entre turbidez
(una indicación de agregación) y la relación de carga molar de
polilisina (PLL):DNA de plásmido, sin y con NaCl 100 mM y sin y sin
polimerización con plantilla/enjaulamiento ("caging")
(indicado por +DTBP).
La Fig. 5 ilustra la capacidad del sulfato de
dextrano (DS) para permitir que el bromuro de etidio interaccione
con DNA de plásmido que ha sido complejado con relaciones variables
de PLL/DNA (relación molar de resto de lisina base de DNA) (números
en las leyendas) con o sin adición de DTBP.
La Fig. 6 ilustra el efecto de variar la
relación histona/DNA sobre el tamaño de los complejos histona/DNA,
con adición de DTBP.
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Se describe un procedimiento para el suministro
de fármacos en el que los procesos de polimerización y reacción
química tienen lugar en presencia del fármaco, con el fin de
suministrar el fármaco. El polímero se forma a partir de una
diversidad de monómeros en presencia del fármaco y luego se
suministra la mezcla. La mezcla podría experimentar más
purificación o métodos preparativos. El suministro de fármacos
comprende el suministro de un compuesto biológicamente activo a una
célula. Esto puede realizarse con una célula procariótica o
eucariótica. Incluye células de mamífero que están bien sea en el
exterior, o bien en el interior de un organismo. También incluye la
administración del fármaco al organismo completo por rutas estándar
tales como intravenosa, intra-arterial,
intra-biliar, intramuscular, subcutánea,
intraperitoneal, o inyecciones directas en tejidos tales como el
hígado, cerebro, riñones, corazón, ojos, ganglios linfáticos,
huesos, tubo digestivo. También incluye el suministro en vasos, tal
como sanguíneos, linfáticos, biliares, renales, o ventrículos
cerebrales.
En una realización preferida, este proceso se
usa para suministrar ácidos nucleicos. El proceso de suministro de
ácidos nucleicos significa exponer la célula al polinucleico en
presencia del sistema de suministro. Las células suponen tanto
procariotas como eucariotas. La célula se sitúa en un organismo vivo
y la exposición se realiza administrando el ácido nucleico y el
sistema de suministro al organismo. También significa mezclar los
ácidos nucleicos con células en cultivo, o administrar los ácidos
nucleicos a un organismo completo. Suministrar los ácidos nucleicos
comprende transfectar una célula con un ácido nucleico. Estos
procesos de suministro incluyen métodos de inyección estándar tales
como intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, e
intra-arterial. También incluye inyecciones en
cualquier vaso, tal como el conducto biliar, e inyecciones en
cualquier tejido tal como hígado, riñón, cerebro, timo, corazón,
ojo, o piel.
Los fármacos, productos farmacéuticos,
proteínas, péptidos y ácidos nucleicos son compuestos activos
biológicamente. El fármaco puede ser el polímero plantilla o el
polímero hijo. De acuerdo con la invención, el polímero plantilla
es un ácido nucleico. La expresión "ácido nucleico" es una
expresión de la técnica que se refiere a un cordón de al menos dos
combinaciones base-azúcar-fosfato.
Los nucleótidos son la unidades monómeras de los polímeros de ácido
nucleico. El término incluye ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido
ribonucleico (RNA) en forma de oligonucleótido, RNA mensajero,
anti-sentido, DNA de plásmido, partes de un DNA de
plásmido o material genético derivado de un virus. La expresión
"ácido nucleico" incluye tanto ácidos oligonucleicos como
ácidos polinucleicos. Los ácidos polinucleicos se distinguen del
ácido oligonucleico porque contienen más de 120 unidades monómeras.
En el caso de la transferencia de ácidos nucleicos a células, el
ácido nucleico es la plantilla.
El ácido nucleico (polinucleótido) podría usarse
también para producir un cambio en una célula que puede ser
terapéutico. El suministro de polinucleótidos o material genético
con fines terapéuticos se denomina comúnmente "terapia
génica". El polinucleótido suministrado podría producir una
proteína terapéutica tal como una hormona, citocina, o factor de
crecimiento. Por ejemplo, el polinucleótido en forma de un DNA de
plásmido podría producir la hormona humana del crecimiento. El
polinucleótido podría producir una enzima que es deficitaria o
carencial en pacientes con un error innato de metabolismo. Por
ejemplo, un DNA de plásmido podría producir fenilalanina
hidroxilasa que sería terapéutica en pacientes con fenilcetonuria.
Además, el polinucleótido podría suministrar un
anti-sentido que sería terapéutico en pacientes con
un tumor, cáncer, o infección. Por ejemplo, el polinucleótido podría
ser un DNA que es transcrito en una molécula antisentido.
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Un polímero es una molécula construida mediante
la unión repetitiva de unidades más pequeñas llamadas monómeros. En
esta solicitud el término polímero incluye tanto los oligómeros que
tienen de dos a 80 monómeros como polímeros que tienen más de 80
monómeros. El polímero puede ser de los tipos de red lineal,
ramificada, en estrella, tipo peine ("comb"), o en
escalera. El polímero puede ser un homopolímero en el que se usa un
único monómero o puede ser un copolímero en el que se usan dos o
más monómeros. Los tipos de copolímeros incluyen alternantes, al
azar, de bloques y de injerto.
Asociado con el polímero en una realización
preferida está un estabilizante estérico que es un grupo hidrófilo
de cadena larga que evita la agregación del polímero final
impidiendo estéricamente las interacciones electrostáticas de
partícula con partícula. Los ejemplos incluyen: grupos alquilo,
cadenas de PEG, polisacáridos, moléculas de hidrógeno o alquil
aminas.
Para los que son expertos en la técnica de la
polimerización, hay varias categorías de procesos de polimerización
que pueden ser utilizados en el proceso descrito. La polimerización
puede ser en cadena o en etapas. Esta descripción de clasificación
se usa con más frecuencia que la anterior terminología de polímero
de adición y de condensación. "Most step-reaction
polymerizations are condensation processes and most
chain-reaction polymerizations are addition
processes (La mayoría de las polimerizaciones de reacción en etapas
son procesos de condensación y la mayoría de las polimerizaciones
de reacción en cadena son procesos de adición)" (M. P. Stevens
Polymer Chemistry: An Introduction New York Oxford University Press
1990).
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En la polimerización en etapas, la
polimerización tiene lugar paso a paso. El crecimiento del polímero
ocurre por la reacción entre monómeros, oligómeros y polímeros. No
se necesita iniciador ya que es siempre la misma reacción y no hay
etapa de terminación, de forma que los grupos terminales siguen
siendo reactivos. La velocidad de polimerización disminuye a medida
que son consumidos los grupos funcionales.
Típicamente, la polimerización en etapas se hace
de una de estas dos formas distintas. De una forma, el monómero
tiene los dos grupos funcionales reactivos (A y B) en la misma
molécula de forma que
- A-B da -[A-B]-
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El otro planteamiento es tener dos monómeros
difuncionales.
- A-A + B-B da -[A-A-B-B]-
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Generalmente, estas reacciones pueden implicar
acilación o alquilación. La acilación se define como la introducción
de un grupo acilo (-COR) en una molécula. La alquilación se define
como la introducción de un grupo alquilo en una molécula.
Si el grupo funcional A es una amina, entonces B
puede ser (pero sin limitarse a ellos) un isotiocianato,
isocianato, azida de acilo, N-hidroxisuccinimida,
cloruro de sulfonilo, aldehído (incluyendo formaldehído y
glutaraldehído), epóxido, carbonato, imidoéster, carboxilato, o
alquilfosfato, haluros de arilo
(difluoro-dinitrobenceno) o anhídrido succínico. En
otras palabras, cuando la función A es una amina entonces la función
B puede ser un agente de acilación o de alquilación.
Si el grupo funcional A es un sulfhidrilo
entonces la función B puede ser (pero sin limitarse a ellos) un
derivado yodoacetilo, maleimida, derivado de aziridina, derivado de
acriloílo, derivados de fluorobenceno, o derivado disulfuro (tal
como un disulfuro de piridilo o derivado de ácido
5-tio-2-nitrobenzoico
(TNB)).
Si el grupo funcional A es carboxilato entonces
la función B puede ser (pero sin limitarse a ellos) un diazoacetato
o una amina en la que se usa carbonildiimidazol o carbodiimida.
Si el grupo funcional A es un hidroxilo entonces
la función B puede ser (pero sin limitarse a ellos) un epóxido,
oxirano, o una amina en la que se usa carbonildiimidazol o
carbodiimida o carbonato de N,N'-disuccinimidilo, o
cloroformiato de N-hidroxisuccinimidilo.
Si el grupo funcional A es un aldehído o cetona
entonces la función B puede ser (pero sin limitarse a ellos) una
hidrazina, derivado de hidrazida, aldehído (para formar una base de
Schiff que puede o no ser reducida por agentes reductores tales como
NaCNBH_{3}).
Otro planteamiento más es tener un monómero
difuncional de forma que
- A-A más otro agente da -[A-A]-.
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Si la función A es un grupo sulfhidrilo,
entonces puede ser convertido en enlaces disulfuro por agentes
oxidantes tales como yodo (I_{2}) o NaIO_{4} (peryodato
sódico), u oxígeno (O_{2}). La función A puede ser también una
amina que es convertida en un grupo sulfhidrilo por reacción con
2-iminotiolato (reactivo de Traut), que entonces
experimenta oxidación y formación de disulfuro. Los derivados
disulfuro (tales como un disulfuro de piridilo o derivados de ácido
5-tio-2-nitrobenzoico
(TNB)) pueden también ser usados para catalizar la formación del
enlace disulfuro.
El grupo funcional A o B en cualquiera de los
ejemplos anteriores podría ser también un grupo fotorreactivo tal
como las azidas de arilo, azidas de arilo halogenadas, o derivados
diazo, benzofenonas, alquinos o diazirina.
Las reacciones de los grupos amina, sulfhidrilo,
carboxilato dan enlaces químicos que se describen como enlaces
amida, amidina, disulfuro, éteres, ésteres, isotiourea, isourea,
sulfonamida, carbamato, doble enlace
carbono-nitrógeno (enamina o imina) enlace
alquilamina (amina secundaria), enlaces simples
carbono-nitrógeno en los que el carbono contiene un
grupo hidroxilo, tio-éter, diol, hidrazona, diazo, o sulfona.
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En la polimerización por reacción en cadena, el
crecimiento del polímero ocurre por adición sucesiva de unidades de
monómero a un número limitado de cadenas en crecimiento. Los
mecanismos de iniciación y propagación son diferentes y normalmente
hay una etapa de terminación de la cadena. La velocidad de
polimerización se mantiene constante hasta que se agota el
monómero.
Los monómeros que contienen grupos vinilo,
acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, pueden
experimentar reacción en cadena que puede ser por radicales,
aniónica o catiónica. La polimerización en cadena puede realizarse
también mediante polimerización con apertura de ciclo o de anillo.
Podrían usarse varios tipos diferentes de iniciadores de radicales
libres, que incluyen peróxidos, hidroxiperóxidos, y compuestos azo
tales como dihidrocloruro de
2,2'-azobis(-amidinopropano) (AAP).
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Una amplia variedad de monómeros puede ser usada
en los procesos de polimerización. Estos incluyen monómeros
orgánicos con carga positiva tales como aminas, imidina, guanidina,
imina, hidroxilamina, hidrozina, heterociclos (como imidazol,
piridina, morfolina, pirimidina, o pireno. Las aminas podrían ser
sensibles al pH por cuanto el pKa de la amina está dentro del
intervalo fisiológico de 4 a 8. Las aminas específicas incluyen
espermina, espermidina,
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD), y bromuro de
3,3'-diamino-N,N-dimetildipropilamonio
(Compuesto 9).
(Compuesto 9).
- 1.
- Los monómeros pueden también ser oligopéptidos, polipéptidos o proteínas (producidas sintéticamente o en un organismo). Estos oligopéptidos pueden ser un péptido NLS que corresponde a la secuencia de localización nuclear de 12 aminoácidos del antígeno T de SV40, péptidos de fusión (derivados de virus), péptidos endosomolíticos y péptidos anfipáticos. Los compuestos anfipáticos tienen partes tanto hidrófilas (solubles en agua) como hidrófobas (insolubles en agua). El compuesto anfipático puede ser catiónico o incorporado a un liposoma que está cargado positivamente (catiónico) o no catiónico, lo que significa neutro, o cargado negativamente (aniónico). Pueden usarse también proteínas tales como histona H1. También podrían usarse proteínas que unen DNA a secuencias específicas de la secuencia, tales como proteína Gal4.
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Los monómeros pueden ser también hidrófobos,
hidrófilos o anfipáticos. Los ejemplos de compuestos anfipáticos
incluyen, pero no se limitan a ellos, bromuro de
3,3'-diamina-N-(7-octeno)-N-metildipropilamonio
(Compuesto 7), bromuro de
N,N'-dinonacrilato-N,N,N',N'-tetrametilpropanodiamonio
(Compuesto 10), bromuro de
N,N',N''-trinonacrilato-N,N,N',N',N''-pentametildietilentriamonio
(Compuesto 11) y péptidos anfipáticos tales como
CKLLKKLLKLWKKLLKKLKC. Los monómeros pueden ser también agentes
intercalantes tales como acridina, naranja de tiazol, o bromuro de
etidio.
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Los polímeros tienen otros grupos que hacen
aumentar su utilidad. Estos grupos pueden ser incorporados en
monómeros antes de la formación del polímero o fijados al polímero
después de su formación. Estos grupos incluyen:
a. Grupos de direccionamiento (señalamiento como
diana o targeting). Estos grupos se usan para señalar como
diana ("direccionar") los complejos
polímero-fármaco o polímero-ácido nucleico a células
o tejidos específicos. Los ejemplos de tales agentes de
direccionamiento o señalamiento como diana incluyen agentes que se
dirigen al receptor de asialoglicoproteína usando restos de
asiologlicoproteínas o galactosa. Otras proteínas tales como la
insulina, EGF, o transferrina, pueden ser usadas para el
direccionamiento. Los péptidos que incluyen la secuencia RGD pueden
ser usados para direccionar muchas células. Los grupos químicos que
reaccionan con grupos sulfhidrilo o disulfuro en las células pueden
también ser usados para direccionar muchos tipos de células. El
folato y otras vitaminas pueden también ser usados para
direccionamiento. Otros grupos de direccionamiento incluyen
moléculas que interaccionan con membranas tales como los ácidos
grasos, colesterol, compuestos de dansilo, y derivados de
anfotericina.
Después de la interacción de los complejos
supramoleculares con la célula, pueden usarse otros grupos de
direccionamiento para aumentar el suministro del fármaco o ácido
nucleico a ciertas partes de la célula. Por ejemplo, pueden usarse
agentes para romper los endosomas y puede usarse una señal de
localización nuclear (NLS) para direccionar el núcleo.
Se han usado una variedad de ligandos para
direccionar fármacos y genes a receptores celulares específicos. La
unión de estos ligandos a estos receptores típicamente inicia la
endocitosis. También podrían usarse ligandos para el suministro de
DNA que se une a los receptores que no son endocitados. Por ejemplo
podrían usarse péptidos que contienen la secuencia del péptido RGD
que se une al receptor de integrina. Además podrían usarse proteínas
virales para unir células. Lípidos y esteroides podrían usarse para
insertar directamente en las membranas celulares.
\newpage
b. Grupos informadores - Los grupos informadores
("reporter") o marcadores son moléculas que pueden ser
detectadas fácilmente. Típicamente son compuestos fluorescentes
tales como fluoresceína, rodamina, rojo Texas, cy 5, o compuestos
de dansilo. Pueden ser moléculas que pueden ser detectadas por
espectroscopía UV o visible o por interacciones con anticuerpos o
por resonancia de espín de electrones. La biotina es otra molécula
informadora que puede ser detectada por avidina marcada. La biotina
podría también usarse para fijar grupos de direccionamiento o
señalamiento como diana.
c. Grupos segmentables - Los polímeros pueden
contener grupos segmentables dentro de la parte que une la plantilla
o entre la parte que une la plantilla y las moléculas de
direccionamiento o informadoras. Cuando es dentro de la parte que
une la plantilla, la rotura de los grupos segmentables conduce a la
interacción reducida de la plantilla y los polímeros hijos. Cuando
se une al grupo de direccionamiento, la segmentación lleva a reducir
la interacción entre la plantilla y el receptor para el grupo de
direccionamiento. Los grupos segmentables incluyen pero no se
limitan a ellos enlaces disulfuro, dioles, enlaces diazo, enlaces
éster y enlaces sulfona.
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La polimerización con plantilla ha sido definida
de la forma siguiente (van de Grampel, H. T., Tan, Y. Y. y Challa,
G. Macromolecules 23, 5209-5216, 1990):
"Las polimerizaciones con plantilla pueden ser
definidas como polimerizaciones en las cuales las cadenas de
polímero pueden crecer a lo largo de las macromoléculas de la
plantilla durante la mayor parte de su tiempo de vida. Tal modo de
propagación puede ser conseguido mediante la existencia de
interacciones cooperadoras entre la cadena en crecimiento y la
cadena de la plantilla, y normalmente conduce a la formación de un
complejo de interpolímero. Por lo general, una plantilla bien
escogida es capaz de afectar a la velocidad de polimerización así
como al peso molecular y la microestructura del polímero formado
(polímero hijo). Los conceptos de polimerización con plantilla
fueron descritos por Ballard y Bamford con la polimerización con
apertura del anillo de N-carboxianhídrido de la
DL-fenilalanina sobre una plantilla de
polisarcosina. Desde entonces, se han estudiado otros muchos
sistemas que implican la iniciación por radicales y no radicales de
monómeros de vinilo, en los que se identificaron uno o más efectos
de la plantilla, procedentes de este peculiar modo de propagación.
Se han estudiado cierto número de polimerizaciones con plantilla
iniciadas por radicales, empleando agua como disolvente".
Las características principales de la
polimerización con plantilla son:
1. La formación del complejo tiene lugar entre
polímeros.
2. La velocidad de polimerización aumenta a
medida que aumenta la concentración de la plantilla (Fujimori, K.,
(1979) Makromol. Chem. 180, 1743).
3. La estructura y la características
conformacionales de la plantilla se reflejan en el correspondiente
polímero
hijo.
hijo.
En la polimerización con plantilla, propagación
de una nueva cadena de polímero sucede predominantemente a lo largo
de la plantilla, una cadena macromolecular, por medio de una
interacción cooperadora específica. La naturaleza de la interacción
puede ser electrostática, puente de H, transferencia de carga, y
fuerzas de van der Waals en combinación con encaje estereoquímico.
La presencia de la plantilla usualmente afecta a varias
características de polimerización así como a la microestructura del
polímero formado. El mecanismo de polimerización con plantilla
depende del grado de adsorción del monómero. Pueden distinguirse dos
casos extremos: el coeficiente de equilibrio de adsorción para el
monómero, K_{M} = \cdot (tipo 1) y K_{M} = 0 (tipo 2). En el
tipo l (reacción "zip") el monómero es adsorbido completamente
en todos los sitios de la plantilla y la polimerización sucede
solamente en la plantilla. A medida que la constante K_{M} se hace
más pequeña, la propagación de la plantilla tiene lugar cada vez
más a través de monómeros de reacción desde la solución circundante
a expensas de la reacción con monómero adsorbido en las
inmediaciones. Cuando K_{M} = 0 (tipo 2) solamente está presente
monómero no adsorbido y las macromoléculas de la plantilla están
completamente solvatadas por los disolventes en vez de estarlo los
monómeros. Un requisito previo para la propagación de la plantilla
bajo esta condición es el crecimiento del oligómero hijo, creado en
la solución global, que después se compleja con la plantilla
(reacción "pick-up" o de captura). La
longitud de cadena por debajo de la cual no tiene lugar complejación
(longitud de cadena crítica) es importante para la magnitud del
efecto de la plantilla. De hecho, no hay un límite estricto entre
las polimerizaciones de tipo 1 y de tipo 2.
Se describen varios procesos para el uso de la
polimerización con plantilla para el suministro de fármacos. El
polímero hijo podría ser el fármaco. De acuerdo con la presente
invención, la plantilla es un ácido nucleico. El proceso de usar
polimerización con plantilla para el suministro de fármacos
comprende mezclar la plantilla con monómeros y hacer que se forme
un polímero hijo a partir de los monómeros. La mezcla de polímero
plantilla y polímero hijo se administra después a una célula
poniendo la mezcla en contacto con una célula o cerca de una
célula. La mezcla de polímero plantilla y polímero hijo podría
también ponerse en una formulación farmacéutica y un vial para
suministro a un animal. El polímero plantilla es un ácido nucleico
incluyendo DNA, RNA o una secuencia antisentido. El DNA puede
producir un agente terapéutico tal como una proteína terapéutica o
RNA anti-sentido.
En una realización preferida, los grupos de
direccionamiento podrían ser añadidos durante la etapa inicial de
polimerización con plantilla o durante las etapas subsiguientes de
polimerización. Además, después de la polimerización con plantilla,
pueden añadirse al polímero redes o redes adicionales. Estas podrían
usarse para entrecruzar los polímeros. Por ejemplo, el polímero
podría ser entrecruzado para poner la plantilla en una "jaula"
("cage"). El entrecruzamiento es la unión de dos restos
de un polímero a otro usando un enlazador químico bifuncional. Un
resultado es que el polímero, como una red, se hace más fuerte y más
resistente a su disolución. Los enlazadores bifuncionales de unión
covalente pueden ser homobifuncionales (que implica la misma
reacción química para unir ambos restos) o heterobifuncionales
(implica dos reacciones distintas que permiten la unión de grupos
funcionales diferentes). Por entrecruzamiento puede formarse una
jaula alrededor o cerca del poli-ión que crea un
complejo de poli-ión y polímero. El entrecruzamiento
del polímero protege al poli-ión de ser destruido
por enzimas y otros sustratos degradadores. Por ejemplo, si el
poli-ión es DNA, el polímero entrecruzado o
enjaulado protege al DNA frente a las DNasas.
En una realización preferida, las partículas
poli-ión enjauladas estables llevarán una carga neta
positiva. Sin embargo, es deseable recargarlas para que
interaccionen menos con polímeros y partículas cargados
negativamente in vivo. Recargar es conmutar la carga neta de
la partícula de poli-ión a una carga opuesta.
Pueden formarse complejos y continúan
funcionando en una solución de tonicidad cambiable, lo que significa
que la solución puede ser hipotónica, hipertónica o de tonicidad
normal. Hipotónica significa cualquier solución que tenga una
presión osmótica más baja que otra solución (esto es, que tiene una
concentración de solutos más baja que otra solución). Una solución
hipotónica es lo contrario de una solución hipertónica. La tonicidad
normal en las realizaciones preferidas es la tonicidad de los
fluidos del cuerpo humano, específicamente de la sangre.
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Los procesos de reacción química y
polimerización pueden tener lugar en sistemas homofásicos en los que
el monómero y el ácido nucleico están en la misma solución. Esta
solución puede ser agua, alcohol, cloroformo, ésteres, disolventes
orgánicos, o disolventes polares apróticos tales como DMF, DMSO o
dioxano. Pueden ser mezclas de disolventes acuosos y orgánicos.
Los procesos de reacción química y
polimerización pueden tener lugar en sistemas heterofásicos en los
que el ácido nucleico está en una fase y el monómero está en otra
fase. Tales sistemas heterofásicos pueden ser "aceite en agua"
y también "agua en aceite", en donde el aceite se define como
un disolvente que tiene una baja solubilidad en agua. Este
planteamiento podría permitir la formación de estructuras de tipo
micelar que tienen las partes hidrófobas del polinucleótido en el
interior de una vesícula y la partes hidrófilas en el exterior, o
viceversa. La reacción de polimerización puede ser realizada tanto
en emulsiones directas
(aceite-en-agua) como inversas
(agua-en-aceite). Este planteamiento
permite el uso de monómeros hidrófobos o anfipáticos (Blackley, D.
C. Emulsion Polymerization, London: Appl. Sci., 1975). La
polimerización heterofásica permite que se produzcan vesículas,
partículas, o complejos supramoleculares, en las que el ácido
nucleico está en la superficie de micelas de polímero o el ácido
nucleico está dentro de micelas de polímero inverso monocapa. En
este último caso pueden usarse diferentes lípidos para la formación
de la capa externa. La emulsión en fase inversa puede ser preparada
de manera que, como promedio, solamente una molécula de biopolímero
esté presente en cada gota de agua (Martinek, K., Levashov, A. V.,
Klyachko, N., Khmelnitski, Y. L., y Berezin, I. V. (1986) Eur. J.
Biochem. 155, 453-468).
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Un complejo supramolecular es una estructura que
contiene dos o más moléculas diferentes que no están unidas
covalentemente. Los complejos supramoleculares pueden ser usados
para el suministro de fármacos y para otros fines tales como para
métodos preparativos o analíticos, o para la construcción de nuevos
materiales. Los autores de la presente invención describen un nuevo
método para formar un complejo supramolecular que contiene ácido
nucleico y un polímero, en el que el polímero se forma en presencia
del ácido nucleico.
El complejo supramolecular puede contener otros
componentes además del ácido nucleico y el polímero. Puede contener
otro polímero que está ya formado. Este polímero ya formado puede
unirse al ácido nucleico o al polímero hijo. El componente
adicional puede ser una proteína. Esta proteína puede ser catiónica
y contener cargas positivas que la permiten unirse al ácido
nucleico. Tales proteínas catiónicas podrían ser histona, polilisina
o protamina. El complejo supramolecular podría también contener
grupos de direccionamiento.
Un complejo supramolecular formado de esta
manera podría contener compuestos anfipáticos que podrían ser parte
de liposomas, micelas, o micelas inversas. Los liposomas son
vesículas microscópicas que contienen moléculas anfipáticas que
contienen dominios tanto hidrófobos como hidrófilos. Los liposomas
pueden contener un volumen acuoso que está enteramente encerrado
por una membrana compuesta de moléculas de lípido (normalmente
fosfolípidos) (R. C. New, p. 1, capítulo 1, "Introduction" en
Liposomes: A Practical Approach, ed. R. C. New IRL Press en Oxford
University Press, Oxford 1990). Las micelas y las micelas inversas
son vesículas microscópicas que contienen moléculas anfipáticas
pero no contienen un volumen acuoso que está enteramente encerrado
por una membrana. En las micelas la parte hidrófila del compuesto
anfipático está en el exterior (sobre la superficie de la vesícula)
mientras que en las micelas inversas es la parte hidrófoba del
compuesto anfipático la que está en el exterior.
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Se define un método de condensación de ácidos
nucleicos como la disminución de la longitud lineal del ácido
nucleico. Condensar ácido nucleico significa también compactar ácido
nucleico. Condensar ácido nucleico significa también hacer
disminuir el volumen que ocupa la molécula de ácido nucleico. Un
ejemplo de condensación de ácido nucleico es la condensación del
DNA que sucede en las células. El DNA de una célula humana tiene
aproximadamente un metro de longitud, pero está condensado para que
encaje en el núcleo de una célula que tiene un diámetro de
aproximadamente 10 micrómetros. Las células condensan (o compactan)
DNA por una serie de mecanismos de empaquetamiento en el que
intervienen histonas y otras proteínas cromosómicas, para formar
nucleosomas y cromatina. El DNA dentro de estas estructuras se hace
parcialmente resistente a la acción de la nucleasa (DNasa). Las
estructuras condensadas pueden observarse también al microscopio
electrónico.
El proceso de condensar ácido nucleico puede ser
usado para transferir ácidos nucleicos a células o a un organismo,
como para el suministro de fármacos. Podría también usarse para
métodos preparativos o analíticos o para la construcción de nuevos
materiales.
Los autores de la presente invención describen
un nuevo método para formar ácido nucleico condensado haciendo que
tenga lugar una reacción química en presencia del ácido nucleico.
Una reacción química se define como un cambio molecular en los
átomos o moléculas participantes que intervienen en la reacción. Un
ejemplo de cambio molecular sería la rotura y formación de enlaces
covalentes de los compuestos participantes. Los enlaces covalentes
se definen por tener uniones con electrones compartidos tales como
las que se encuentran en los enlaces
carbono-carbono, carbono-nitrógeno,
carbono-hidrógeno, carbono-oxígeno,
carbono-azufre, carbono-halógeno,
nitrógeno-hidrógeno,
oxígeno-hidrógeno, oxígeno-oxígeno y
azufre-oxígeno. La o las reacciones químicas podrían
tener por resultado que se formase un polímero. El proceso de
polimerización podría tener lugar mediante el proceso de
polimerización con plantilla. Un complejo supramolecular podría
formarse como resultado de este proceso.
En una realización preferida, un método utiliza
compuestos unidos covalentemente a poli-iones tales
como genes, para potenciar el transporte celular del
poli-ión manteniendo al mismo tiempo su
funcionalidad. Una solicitud de patente que lleva el título "A
Method For Covalent Attachment Of Compound To Genes", Serial
No.____ , presentada el 12 de diciembre de 1997, que describe
métodos para unir compuestos covalentemente así como estructuras
usadas en la misma, es incorporada al presente texto como
referencia. Aunque la solicitud citada enseña la fijación de
compuestos a genes, los métodos y estructuras pueden ser aplicados a
la fijación de moléculas a un polímero como se discute en la
presente memoria descriptiva y el término polímero no se limita a
los ácidos nucleicos.
Las señales que potencian la liberación desde
compartimentos intracelulares (señales de liberación) pueden causar
la liberación de poli-iones desde compartimentos
intracelulares tales como los endosomas (tempranos y tardíos), los
lisosomas, los fagosomas, la vesícula, el retículo endoplásmico, el
aparato de Golgi, la red trans golgi (TGN), y el retículo
sarcoplásmico. La liberación incluye el movimiento fuera de un
compartimento intracelular al citoplasma o a un orgánulo tal como
el núcleo. Las señales de liberación incluyen sustancias químicas
tales como cloroquina, bafilomicina o Brefeldina A1 y la señal de
retención ER (secuencia KDEL), componentes virales tales como
péptidos HA-2 subunidad hemaglutinina del virus de
la influenza y otros tipos de péptidos anfipáticos.
Las señales de localización nuclear potencian la
entrada de un poli-ión en el núcleo o dirigen al gen
a la proximidad del núcleo. Tales señales de transporte nuclear
pueden ser una proteína o un péptido tal como la NLS del antígeno T
largo de SV40 o la NLS de la nucleoplasmina.
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Los autores de la presente invención describen
un procedimiento para la formación en presencia del ácido nucleico
de un polímero que tiene afinidad para el ácido nucleico. Esto
excluye el proceso de formación de polímeros que son proteínas o
ácido nucleicos. También excluye polímeros que se unen al ácido
nucleico por unión de Watson-Crick. La unión de
Watson-Crick se define como la disposición de
emparejamiento de bases normal en la que la base guanina se
empareja con la base citosina y en la que la base adenina se
empareja con bases timina. Afinidad indica que el polímero es
atraído al ácido nucleico y se mantiene unido a él por fuerzas no
covalentes (tales como van der Waals, enlaces de hidrógeno, y
enlaces iónicos), bajo condiciones bien sea fisiológicas o bien no
fisiológicas.
El proceso de formación de un polímero en
presencia del ácido nucleico puede ser usado para transferir ácidos
nucleicos a las células o a un organismo, por ejemplo para el
suministro de fármacos. También podría ser usado para métodos
preparativos o analíticos o para la construcción de nuevos
materiales.
El polímero de unión de ácido nucleico puede
formarse como resultado de la polimerización con plantilla.
Los autores de la presente invención también
describen un procedimiento de formación de un complejo
interpolielectrolito que contiene ácidos nucleicos, haciendo que
tenga lugar una reacción química en presencia del ácido nucleico.
Se define un complejo interpolielectrolito como una mezcla de dos
polímeros con cargas opuestas. En esta situación el ácido nucleico
es un polianión y el polímero formado es un policatión.
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Ortogonal - Se refiere a un grupo protector que
puede ser retirado selectivamente en presencia de otros grupos
protectores contenidos en la molécula de interés.
Monovalente - se refiere a una especie iónica
que posee carga 1.
Grupo protector - Un grupo químico que está
unido temporalmente a funcionalidades dentro de un compuesto
multifuncional que permite que tengan lugar reacciones selectivas en
otros sitios dentro del compuesto. Los grupos protectores comunes
incluyen, pero sin limitarse a ellos, carbamatos, amidas, y grupos
N-alquilo.
Funcionalidad - Se refiere a clases generales de
compuestos orgánicos tales como alcoholes, aminas, carbonilos,
carboxilos y tioles.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos que siguen demuestran que la
polimerización puede tener lugar en presencia de DNA. Dado que la
característica central de estos polímeros es su capacidad para
unirse al DNA, los autores de la presente invención eligieron un
ensayo relativamente simple para detectar la formación de tales
polímeros, que es la electroforesis en gel de agarosa con tinción
del DNA con bromuro de etidio. Un polímero fuerte de unión del DNA
retarda (hace más lenta) la migración del DNA en el gel. En las
muestras experimentales en las que el DNA está ya presente durante
el proceso (reacción) de polimerización, la muestra simplemente se
carga en el gel de agarosa. En las muestras testigo en las que el
DNA no está presente durante el proceso de reacción, el DNA es
añadido después de la reacción. Este planteamiento es también un
método potente para determinar si cualquier polímero es formado por
un proceso de polimerización con plantilla. Es decir, si el polímero
solamente se forma cuando está presente el DNA plantilla y no
cuando está ausente el DNA plantilla, esto es entonces una prueba
definitiva de la polimerización con plantilla. Los resultados
iniciales con electroforesis en gel de agarosa son seguidos por un
ensayo más sofisticado para polímeros y partículas que incluyen
cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaños),
microscopía electrónica de transmisión, y clasificación de tamaño de
partículas mediante dispersión dinámica de luz.
El proceso de polimerización en presencia de
ácidos nucleicos puede ser usado para transferir y expresar genes
en células. Además de mostrar la utilidad de este procedimiento,
también indica que las reacciones químicas no modificaron
químicamente ni destruyeron el ácido nucleico. Se usó también otro
método para detectar el daño en el ácido nucleico. Los autores de
la presente invención incorporaron enlaces disulfuro en los
polímeros y después rompieron los polímeros añadiendo ditiotreitol
(DTT, conocido también como reactivo de Cleland), que reduce los
enlaces disulfuro. Después de la rotura de los polímeros el ácido
nucleico DNA (que estaba dentro de las partículas de polímero) fue
transfectado en las células usando otro método de transfección (con
un lípido catiónico). La expresión era la misma que la del DNA
nativo. La expresión es un indicador muy sensible de cualquier
destrucción o modificación a lo largo de la longitud completa del
gen informador (luciferasa) y el promotor. Estos polímeros fueron
diseñados con enlaces disulfuro para que se rompiesen más fácilmente
dentro de las células.
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La polimerización en etapas con DNA como
plantilla se llevó a cabo usando la poliamina
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,
3-propanodiamina (AEPD) y
ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP). Esta polimerización
con plantilla se hizo usando dos especies de monómero diferentes
juntas en las que cada una de las especies poseía al menos dos
extremos reactivos para propagar una cadena en crecimiento. Usando
una amina bifuncional con afinidad para DNA de plásmido como
monómero y un agente de entrecruzamiento bifuncional reactivo con el
grupo amino como co-monómero, los autores de la
presente invención demostraron que 1) es posible obtener poliamida
unida a DNA como resultado de tal polimerización, y 2) el polímero
resultante puede condensar el DNA plantilla en estructuras
compactas.
\vskip1.000000\baselineskip
La amina que sigue fue usada como monómero:
1.
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD, Aldrich, Milwaukee, WI).
\vskip1.000000\baselineskip
El agente de entrecruzamiento que sigue fue
usado como co-monómero:
1. Ditiobis(succinimidilpropionato),
(DSP, bis succinimida éster S-S segmentable, Pierce,
Rockford, IL).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de reacción optimizadas con
AEPD/DSP fueron las siguientes: El DNA de plásmido (pCIluc, 50 mg)
y el AEPD (10 mg) fueron mezclados en 50 ml de solución tampón
(HEPES 0,1 M, EDTA 1 mM, pH 7,4). Después de 5 min se añadió DSP
(60 mg en 1,5 ml de dimetilformamida). Después de mezclar, la mezcla
de reacción se dejó durante 1 hora en la oscuridad a temperatura
ambiente. Finalmente, la mezcla de reacción se dializó frente a
agua o la solución tampón deseada, en una célula de microdiálisis
con un corte de peso molecular de 1.000 (Rainin, Ridgefield,
NJ).
El plásmido pCILuc expresa una luciferasa
citoplásmica del promotor citomegalovírico (CMV) inmediatamente
temprano humano. Fue construido insertando el cDNA de la luciferasa
citoplásmica en el vector de expresión de CMV pCI (Promega Corp.,
Madison, WI). Específicamente, un fragmento de digestión con enzima
de restricción Nihau/EcoRI que contiene el cDNA de la luciferasa
citoplásmica fue obtenido a partir de pSPLuc (Promega Corp.) e
insertado en pDNA de pCI que fue digerido con NheI y EcoRI. El DNA
de plásmido fue purificado usando el sistema de purificación de
plásmido Qiagen (Chatswort, CA) (lisis alcalina seguida por
cromatografía de intercambio aniónico).
La electroforesis en gel de agarosa y tinción
con bromuro de etidio del DNA se hizo usando técnicas estándar
(Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989) en Molecular
Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY).
Se realizó una cromatografía de filtración en
gel estándar (exclusión de tamaños) para determinar el tamaño de
los polímeros que se formaron en presencia y en ausencia de DNA.
Dado que el DNA se une fuertemente al polímero, fue necesario
primero eliminar el DNA. Esto se hizo por digestión vigorosa con
DNasa. Las muestras de mezcla de reacción DNA/AEPD/DSP (50 \mug
de DNA total, pCIluc) fueron suplementadas con solución de NaCl 5M
hasta NaCl 0,5 M. Se añadió DNasa I (Sigma) a la mezcla (0,06
U/\mug de DNA). La digestión con DNasa se llevó a cabo en el
tampón que contiene Tris 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, CaCl_{2} 1 mM,
pH 7,0, durante 4 horas a 37ºC. Después de esta reacción, la mezcla
se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 min y se aplicó a la columna
Sephadex G-75 (Sigma) (0,8 x 20 cm) equilibrada con
HEPES 20 mM, NaCl 0,5, pH 7,4. Las fracciones (0,5 ml) fueron
analizadas en relación con la DO a 260 nm.
Microscopía electrónica de transmisión de los
complejos formados usando procedimientos estándar de tinción
negativa en rejillas recubiertas. Después de teñir las muestras con
tungstato de metilamina (BioRAD), las rejillas fueron examinadas
usando un microscopio electrónico de transmisión Jeol 100CX.
El preparado para dispersión de luz se obtuvo
esencialmente con las mismas relaciones DNA/AEPD/DSP que para EM
(véase AEPD/DSP optimizada) pero con 3 mg de DNA (pCIluc). La mezcla
DNA/AEPD fue incubada agitando en vórtice de vez en cuando durante
10 min a temperatura ambiente antes de la adición de DSP. La muestra
se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 min y se pasó por un filtro de
policarbonato de 0,2 \mum (Poretics Corp., Livermore, CA) y se
analizó usando un analizador de tamaño de partículas equipado con
láser de argón 15 M (Brookhaven Instruments, Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
La electroforesis en gel de agarosa de los
complejos experimentales finales (formados haciendo reaccionar AEPD
y DSP en presencia de DNA) demostraron un característico retardo en
gel del DNA de plásmido, en el gel en el que el DNA de plásmido
complejado migró más lentamente que el DNA de plásmido original.
Además había algo de material de DNA en el pocillo de partida. Los
complejos finales fueron también tratados con ditiotreitol (DTT) 25
mM (Fisher, Itasca IL) durante 30 minutos a 37ºC para segmentar los
enlaces disulfuro dentro del polímero (parte del
co-monómero DSP). El tratamiento con DTT reinvirtió
el patrón de electroforesis al del DNA de plásmido nativo y no
había presente material de DNA retardado. Esto indica que el patrón
retardado era debido a la complejación del polímero con el DNA.
También indica que los monómeros o el polímero no reaccionaron con
el DNA. La transfección del DNA (tras el tratamiento con DTT) en
células en cultivo usando un reactivo de transfección comercial
(LT-1, Mirus, Madison, WI) tuvo por resultado tanta
expresión de luciferasa como el DNA nativo. Esto también indica que
el DNA no estaba modificado químicamente.
Una muestra testigo contenía AEPD y DSP a las
mismas concentraciones, pero el DNA de plásmido fue omitido durante
la reacción. El DNA fue añadido una vez completada la reacción. La
electroforesis en gel de agarosa indicó mucho menos retardo del DNA
que la anterior muestra experimental. Esto indica que en la muestra
testigo no sucedió la polimerización y que la polimerización
observada en la muestra experimental sucedió por polimerización con
plantilla.
Se llevaron a cabo otros estudios para
determinar el tamaño del polímero que se formó en presencia del DNA.
Esto se hizo digiriendo primero el DNA exhaustivamente con DNasa, y
después pasando el polímero restante a través de una columna de
exclusión de tamaños. La filtración en gel del lisado de DNasa
exhaustivo del complejo en NaCl 0,5 M demostró la formación del
producto con un peso molecular aparente mayor que 3.000 Da. La
muestra testigo (DNA añadido después de la reacción de AEPD y DSP)
no contenía ningún polímero grande de este peso molecular. Esto
indica que el polímero que se formó en presencia de DNA fue por
polimerización con plantilla.
Se emplearon métodos físicos para determinar
directamente el tamaño y la forma de los complejos de polímero/DNA.
La microscopía electrónica de transmisión de los complejos
experimentales (formados haciendo reaccionar AEPD y DSP en
presencia de DNA) reveló la formación de estructuras esféricas con
40-50 nm de diámetro (individuales y agregadas)
(Fig. 2). La dispersión dinámica de luz del mismo preparado dio un
tamaño medio de partícula de 80 nm. Estos resultados son
consistentes con la capacidad de las partículas para pasar a través
de filtros de 0,2 micrómetros. Las muestras testigo (DNA añadido
después de la reacción de AEPD y DSP) no contenían partículas al
microscopio electrónico o en la clasificación de partículas.
\vskip1.000000\baselineskip
1. La poliamina fue
co-polimerizada con DSP para formar un polímero en
presencia de DNA y este polímero se unió al DNA.
2. El polímero se formó por un proceso de
polimerización con plantilla.
3. El polímero condensó el DNA para formar
partículas de menos de 80 nm de diámetro.
4. El DNA no era modificado químicamente por el
proceso de polimerización y aún era capaz de expresar luciferasa
después de la transfección en células en cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La polimerización en etapas con DNA como
plantilla se realizó usando la poliamina
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD) como en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se usó DPBP como
co-monómero.
\vskip1.000000\baselineskip
La amina siguiente fue usada como monómero:
1.
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD, Aldrich, Milwaukee, WI).
\vskip1.000000\baselineskip
El agente de entrecruzamiento siguiente fue
usado como co-monómero:
1.
Dimetil-3,3'-ditiobispropionimidato
(DPBP, bisimido éster segmentable en S-S,
Pierce)
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones optimizadas de reacción con
AEPD/DPBP fueron las siguientes. El DNA de plásmido (pCIluc, 50 mg)
y el AEPD (24 mg) se mezclaron en 150 ml de solución tampón (HEPES20
mM, EDTA 1 mM, pH 7,4). Al cabo de 5 min se añadió DPBP (155 mg en 5
ml de metanol). Después de mezclar, la reacción se dejó durante 1
hora en la oscuridad a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
A diferencia de la reacción de
bis-succinimidato (ejemplo 1), el entrecruzamiento
de diimidoéster (usado en este ejemplo) preserva las cargas
positivas de los grupos amino convirtiéndolos en amidinas.
Por consiguiente, se formó un polímero muy
cargado positivamente como resultado de esta reacción que causó el
retardo completo del DNA en geles de agarosa. La adición de DNA a la
mezcla de reacción después de la reacción entre la amina y el agente
de entrecruzamiento no indujo retardo del DNA en el gel. El
tratamiento de los complejos retardados con DTT tuvo por resultado
la restauración del patrón electroforético del plásmido nativo.
\vskip1.000000\baselineskip
1. La polimerización de AEPD y DPBP sucedió en
presencia de DNA y tuvo por resultado un polímero que se unió al DNA
muy fuertemente.
2. El polímero se formó por polimerización con
plantilla.
3. El DNA no fue modificado químicamente y pudo
ser recuperado intacto después del tratamiento con DTT.
\vskip1.000000\baselineskip
La polimerización en etapas con DNA como
plantilla se llevó a cabo usando la poliamina
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD) como en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se usó
2-iminotiolano (reactivo de Traut) como
co-monómero. Esto es un ejemplo de apertura de
anillo del 2-iminotiolano y después oxidación de los
grupos SH que se forman como resultado de la apertura del
anillo.
\vskip1.000000\baselineskip
La amina siguiente se usó como monómero:
1.
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD, Aldrich, Milwaukee, WI).
\vskip1.000000\baselineskip
El agente de entrecruzamiento siguiente fue
usado como co-monómero:
1,2-iminotiolano (agente
heterobifuncional de unión tiol/amino, Pierce).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones optimizadas de reacción con
AEPD/2-iminotiolano fueron las siguientes. El DNA de
plásmido (pCILuc, 50 mg), AEPD (1 mM) y el iminotiolano (4 mM) se
mezclaron en 450 ml de solución tampón (HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, pH
8,0). Después de 30 min se añadieron 5 ml de solución de yodo (40 mM
en etanol). La reacción se dejó reposar durante 1,5 h en la
oscuridad a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Generalmente, el procedimiento anterior es una
polimerización en dos etapas con formación de monómero reactivo. El
2-iminotiolano forma derivado AEPD bistiol en el DNA
que puede seguir polimerizándose oxidando los grupos SH con yodo
molecular. Los resultados para el retardo del DNA en gel y
tratamiento de DTT son básicamente los mismos que para la pareja
AEPD/DPBP. Bajo las condiciones indicadas anteriormente el DNA y el
polímero AEPD/2-iminotiolano forman un complejo
verdaderamente soluble completamente retardado en gel de
agarosa.
El DNA en la muestra testigo (DNA añadido
después de la reacción del polímero) no fue retardado en la
electroforesis en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Los procesos de apertura del anillo y
polimerización en dos etapas pueden ser usados para la formación de
polímeros plantilla que se unen al DNA.
2. Las poliaminas pueden ser polimerizadas en
presencia de DNA usando la conversión de aminas en grupos SH con
reacciones de oxidación subsiguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Similares resultados fueron obtenidos cuando se
usó espermina en vez de AEPD como en el Ejemplo 1. El DNA de
plásmido (10 \mug) y la espermina (1,5 \mug) se mezclaron en 15
\mul de HEPES 0,1 M, pH 8,0. Al cabo de 5 min de incubación se
añadió DSP (25 \mug en 1 ml de DMF) con agitación intensa. Después
de 1 hr de incubación a temperatura ambiente, se analizó el DNA en
gel de agarosa. En el caso del experimento "DNA después", el
DNA (10 \mug) fue añadido tras el apagado de la reacción de DSP
con glicina 0,1 M durante 0,5 hr. Se encontró que el patrón
electroforético era similar al obtenido con AEPD/DSP en el Ejemplo
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una nueva amina como monómero junto con
DTBP para la polimerización con plantilla de DNA.
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente amina fue usada como monómero:
1. Bromuro de
3,3'-(N',N''-terc-butoxicarbonil)-N-(7-octeno)-N-metildipropil-amonio
(compuesto 7, véase la sección de síntesis).
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente agente de entrecruzamiento fue
usado como co-monómero:
1.
Dimetil-3,3'-ditiopbispropionimidato
(DTBP, bisimido éster segmentable en S-S,
Pierce).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones optimizadas de reacción con
compuesto 6/DTBP fueron las siguientes. Se mezclaron DNA de plásmido
(pCILacZ, 10 mL de una solución madre de 3,4 mg/mL, 34 mg, base de
nucleótido 103 nmol) y compuesto 6 (3 mL de una solución madre de
1,29 mg/mL, 39 mg, 108 nmol) 85 ml de agua y 10 ml de solución
tampón (HEPES 0,2 M, EDTA 10 mM, pH 8,0). Se añadió DTBP (1,1 mL de
una solución 100 mM en DMF, 33,7 mg, 109 nmol). Después de mezclar,
la reacción se dejó durante 1 h en la oscuridad a temperatura
ambiente.
El plásmido pCILacZ fue construido de un modo
similar poniendo el fragmento de digestión de restricción del gen de
galactosidasa de E. coli en el vector pCI.
\vskip1.000000\baselineskip
La electroforesis en gel de agarosa de los
complejos finales demostraron un retardo característico del DNA de
plásmido. La muestra testigo (DNA añadido después de la reacción) no
mostró retardo alguno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un péptido como monómero para la
polimerización en presencia de DNA, y este proceso permite la
formación de complejos que expresan luciferasa después de la
transfección en células en cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido NLS corresponde a la secuencia de
localización nuclear de 12 aminoácidos del antígeno T de SV40. Este
péptido fue sintetizado por Genosys Biotechnologies Inc con una
cisteína en cada extremo con fines de entrecruzamiento (Pm = 1481).
La histona H1 fue obtenida de Sigma. Los agente de entrecruzamiento
DSP (ditiobis[succinimidilpropionato]) y DPDPB
(1,4-di-[3'-(2'-piridildtio)-propionamido)]butano)
fueron proporcionados por Pierce.
El péptido NLS se mezcló con DNA de plásmido
(pCILuc) en varias relaciones (0,4, 0,8, 1,2, 1,6) en HEPES 20 mM
pH 7,5, EDTA 1 mM a una concentración de DNA de plásmido de 0,3
mg/ml. El agente de entrecruzamiento segmentable en disulfuro DPDPB
fue añadido a concentraciones finales de 2 y 6 mM y las mezclas se
incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad. Los productos de la reacción fueron analizados por
electroforesis en gel de agarosa y el DNA fue visualizado por
tinción con bromuro de etidio. La cuantía de la polimerización de
los monómeros catiónicos (péptidos NLS) se determinó en
SDS-PAGE. Brevemente, los complejos de péptido
NLS/pDNA (con y sin agente de entrecruzamiento DPDPB) fueron
incubados con 2,5 unidades de DNasa I durante 1 hora a 37ºC para
eliminar el DNA de los complejos. Después de la digestión, los
componentes de proteína que quedan se aplicaron a un ensayo
SDS-PAGE 15% y se tiñeron con azul coomassie.
Todas las transfecciones se llevaron a cabo en
pocillos de 35 mm usando 2 \mug de pDNA por pocillo. Los
complejos de péptido NLS/pDNA (con y sin agente de entrecruzamiento
DPDPB) fueron diluidos en Opti-MEM (Life
Technologies) y se añadió una poliamina catiónica fusogénica (ODAP,
Mirus Corp, Madison, WI) para potenciar la transfección. Se cree
que esta poliamina contribuye a facilitar el escape endosomal
intracelular de los complejos al citoplasma. Los complejos
preformados fueron incubados con células NIH3T3 lavadas con solución
salina tamponada con fosfato durante 4 horas a 37ºC. Después se
retiraron los complejos de transfección y se reemplazaron con medio
completo de crecimiento. Las células se desarrollaron durante 40 a
48 horas, y se recolectaron y se ensayaron en relación con la
expresión del gen informador (luciferasa).
Para la determinación de la actividad de
luciferasa, las células fueron lisadas mediante la adición de 100
\mul, para placas de 25 mm de diámetro, y 200 \mul, para placas
de 35 mm de diámetro, de tampón para lisis (0,1% Triton
X-100, fosfato K 0,1 M, DTT 1 mM pH 7,8). Se
analizaron 20 \mul del extracto celular en relación con la
actividad de luciferasa como se publicó anteriormente (Wolff, J. A.,
Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. y
Felgner, P. L. Direct gene transfer into mouse muscle in
vivo. Science, 1465-1468, 1990.). Se usó un
luminómetro Lumat LB 9507 (EGyG Bertold,
Bad-Wildbad, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
El entrecruzamiento por etapas de péptidos NLS a
lo largo de la plantilla de DNA altera drásticamente la movilidad
del pDNA en la electroforesis en gel de agarosa. A relaciones bajas
de péptido a pDNA (0,4:1, 0,8:1) los complejos de péptido
NLS/pDNA/DPDPB migraron como una mancha característica con varias
bandas prominentes en comparación con los complejos de péptido
NLS/pDNA sin agente de entrecruzamiento, que migraron de un modo
similar al pDNA solo. A relaciones más altas (1,2:1, 1,6:1) la
carga neta de los complejos se hace positiva y tiene lugar la
precipitación con o sin el agente de entrecruzamiento DPDPB. Cuando
el pDNA es añadido después de la reacción de polimerización
(péptido NLS/DPDPB) el patrón de migración en el gel de agarosa
parece casi idéntico al de los complejos de péptido NLS/pDNA sin
agente de entrecruzamiento, indicando que no tuvo lugar
polimerización sin la
plantilla.
plantilla.
Para determinar el grado de polimerización de
los péptidos NLS dentro de los complejos de péptido
NLS/pDNA/
DPDPB, los productos fueron analizados en 15% SDS-PAGE (sin agentes reductores) después de eliminar el DNA (por digestión con DNasa I) como se ilustra en la Fig. 3. Solamente fueron observados multímeros del péptido NLS en las reacciones cuando el agente de entrecruzamiento y la plantilla (pDNA) estaban presentes junto con los monómeros de péptido NLS (panel A, calles 6 y 7). Con tratamiento de DTT (50 mM) antes de la SDS-PAGE los péptidos NLS en las reacciones polimerizadas con plantilla migraron a posiciones que corresponden a monómeros otra vez (panel B, calles 6 y 7) indicando que había presentes enlaces disulfuro en las uniones entre los monómeros. Calles: M - patrones de proteína marcadora; 1 - péptido NLS solo (7 \mug); 2 - DNasa I solo (2,5 u); 3 - péptido NLS/pDNA; 4 - péptido NLS/DPDPB (2 mM) + pDNA añadido después de la reacción de polimerización; 5 - péptido NLS/DPDPB (6 mM) + pDNA añadido después de la reacción de polimerización; 6 - péptido NLS/DPDPB (2 mM) / pDNA; 7 - péptido NLS/DPDPB (2 mM)/pDNA. La tinción de la proteína muestra claramente una escalera de bandas de tamaño creciente que indican una polimerización por etapas de péptidos NLS con dímeros que aparecen como la especie que migra más rápidamente. Esta escala de bandas se observó solamente en las reacciones cuando el agente de entrecruzamiento (DPDPB) estaba presente junto con el pDNA y el péptido NLS, indicando que la polimerización procedía de una manera dependiente de la plantilla. Además, el tratamiento de los complejos con el agente reductor DTT en el tampón para muestra suprimió completamente la escalera, lo que indica que la escalera era resultado del entrecruzamiento del péptido NLS a través del DPDPB que contiene disulfuro.
DPDPB, los productos fueron analizados en 15% SDS-PAGE (sin agentes reductores) después de eliminar el DNA (por digestión con DNasa I) como se ilustra en la Fig. 3. Solamente fueron observados multímeros del péptido NLS en las reacciones cuando el agente de entrecruzamiento y la plantilla (pDNA) estaban presentes junto con los monómeros de péptido NLS (panel A, calles 6 y 7). Con tratamiento de DTT (50 mM) antes de la SDS-PAGE los péptidos NLS en las reacciones polimerizadas con plantilla migraron a posiciones que corresponden a monómeros otra vez (panel B, calles 6 y 7) indicando que había presentes enlaces disulfuro en las uniones entre los monómeros. Calles: M - patrones de proteína marcadora; 1 - péptido NLS solo (7 \mug); 2 - DNasa I solo (2,5 u); 3 - péptido NLS/pDNA; 4 - péptido NLS/DPDPB (2 mM) + pDNA añadido después de la reacción de polimerización; 5 - péptido NLS/DPDPB (6 mM) + pDNA añadido después de la reacción de polimerización; 6 - péptido NLS/DPDPB (2 mM) / pDNA; 7 - péptido NLS/DPDPB (2 mM)/pDNA. La tinción de la proteína muestra claramente una escalera de bandas de tamaño creciente que indican una polimerización por etapas de péptidos NLS con dímeros que aparecen como la especie que migra más rápidamente. Esta escala de bandas se observó solamente en las reacciones cuando el agente de entrecruzamiento (DPDPB) estaba presente junto con el pDNA y el péptido NLS, indicando que la polimerización procedía de una manera dependiente de la plantilla. Además, el tratamiento de los complejos con el agente reductor DTT en el tampón para muestra suprimió completamente la escalera, lo que indica que la escalera era resultado del entrecruzamiento del péptido NLS a través del DPDPB que contiene disulfuro.
Las transfecciones mediadas por poliamina
realizadas con complejos de péptido NLS/pDNA/DPDPB tuvieron como
resultado el aumento del nivel de producción de luciferasa en
comparación con transfecciones con péptido NLS/pDNA solo o la
polimerización con péptido NLS/DPDPB antes de la adición de pDNA
(Tabla 1). Por ejemplo, con la relación 0,8:1 de péptido a DNA
compárense los niveles de luciferasa en la muestra testigo (9,4
millones, segunda fila, NLS + DPDPB 2 mM, DNA añadido después de la
reacción) con los niveles en la muestra experimental (365,9
millones, tercera fila, NLS + DPDPB 2 mM en presencia de DNA). El
proceso de polimerización con plantilla produjo un aumento de la
expresión de 40 veces.
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1. Los péptidos pueden ser usados para la
polimerización con plantilla en presencia de DNA.
2. Este procedimiento permite preparar complejos
que pueden transfectar eficientemente células de mamífero.
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Las condiciones para la polimerización con
plantilla de 1-vinil imidazol (VIm) como monómero
usando 2,2'-azobis (amidinopropano) dihidrocloruro
(AAP) como iniciador fueron los siguientes. Se preparó una solución
madre 400 mM de VIm (TCI America 0GB01, Pm 94,72, densidad 1,04)
con agua desionizada estéril. El pH se ajustó en 6 con HCl. Después
la solución se desgasificó con nitrógeno gas. También se preparó una
solución madre 200 mM de AAP (Wako 11 G2606, Pm 271,2) con agua
desionizada estéril, y se desgasificó con nitrógeno gas. Se
mezclaron 20 mM de DNA de plásmido (pBlueRSVLux, 800 \mul de 6,9
mg/ml) con 20 mM de VIm y 2 mM de AAP de las soluciones madre
anteriores. Una muestra testigo contenía VIm y AAP a las mismas
concentraciones pero el DNA de plásmido fue omitido. Tanto la
reacción experimental (VIm/AAP/DNA) como la testigo (VIm/AAP pero no
DNA) se llevaron a cabo en agua desionizada estéril. Las reacciones
se incubaron durante 2 horas a 50ºC y después las muestras fueron
analizadas por electroforesis en gel de agarosa seguida por tinción
con bromuro de etidio. Se añadieron 20 mM de DNA de plásmido a la
muestra testigo antes de cargarla en el gel.
El DNA de plásmido pBlueRSVLux anteriormente
descrito (también conocido como pBS.RSVLux) fue usado para expresar
el gen informador de la luciferasa de la luciérnaga desde el
promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (Rous Sarcoma Virus:
RSV) (Danko, I., Fritz, J. D., Jiao, S., Hogan, K., Latendresse, J.
L., y Wolff, J. A. Gene Therapy Pharmacological enhancement
of in vivo foreign gene expression in muscle, volumen 1, pp.
114-121, 1994). El plásmido también contiene el
intrón SV40 y señales de adición de poli A para el procesado
apropiado y eficiente del mRNA.
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El análisis de electroforesis en gel de agarosa
indicó que el DNA de plásmido en la muestra testigo (DNA añadido
después de la reacción) migró con el mismo patrón que el DNA de
plásmido original. En la muestra experimental (DNA presente durante
la reacción), el DNA de plásmido fue retardado, migrando las bandas
de DNA más lentamente que el DNA de plásmido original.
También hubo material de tinción del DNA
material en los pocillos de partida.
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1. Un polímero de polivinil imidazol fue formado
en presencia de DNA, y este polímero fue complejado con el DNA, como
se evidenció por análisis por electroforesis en gel.
2. Este polímero se formó por polimerización con
plantilla porque el polímero no se formaba si se omitía el DNA
plantilla.
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Se obtuvieron
poli-L-lisina (hidrobromuro, masa
molecular de 30 a 70 kDa) (PLL) y polialilamina (hidrocloruro) (55
kDa) (PAA) de Aldrich. La histona H1 (tipo III-S
procedente de timo de ternera) fue obtenida de Sigma. El 3,3'-
ditiobispropionimidato de dimetilo (DTBP) se adquirió en Pierce. Los
policationes se disolvieron en agua desionizada: la PLL y la H1 a
la concentración de 10 mg/ml y la PAA a la de 2 mg/ml. El DTBP se
disolvió en H_{2}0 (30 mg/ml) inmediatamente antes de la
utilización.
Los complejos de DNA/policatión fueron
preparados mediante la agitación rápida de 37 \mug de DNA de
plásmido con cantidades variables de policationes en 750 \mul de
HEPES 25 mM pH 8,0, EDTA 0,5 mM. Las mezclas se mantuvieron 30 min
a temperatura ambiente y se añadieron diversas cantidades de DTBP.
Las mezclas se incubaron 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió
NaCl 2 M a los complejos a una concentración final de 100 mM al
tiempo que se agita vigorosamente.
Se realizaron medidas de dispersión de luz con
noventa grados usando a espectrofotómetro de fluorescencia. El
ajuste de la longitud de onda fue 600 nm tanto para el haz incidente
como para la detección de dispersión de luz. Las rendijas para
ambos haces se fijaron en 2 nm. El tamaño del complejo resultante se
determinó mediante dispersión de luz en un clasificador de tamaños
de partículas Brookhaven ZetaPlus. Las muestras se centrifugaron a
12.000 g durante 7 min. La cantidad de DNA que queda en el
sobrenadante se determinó mediante la medida de la absorbancia a 260
y 280 nm.
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Se añadió PLL a DNA de plásmido en 0,75 ml de
HEPES 25 mM pH 8,0 agitando vigorosamente. La cinética de la
dispersión de luz fue determinada inmediatamente después del
mezclado. La turbidez de los complejos de DNA/PLL era muy superior
a la del DNA libre en todo el intervalo de concentración de PLL.
Como se muestra en la Fig. 4 la agregación del complejo aumentó
cuando la relación molar de carga PLL/DNA es próxima a 1 y se hizo
máxima para la relación 1,17. Aumentando más la concentración de
PLL el resultado fue la disminución de la turbidez del complejo. La
dispersión de luz no cambió con el tiempo durante al menos 30
min.
Para una relación baja de carga positiva a
negativa se forman complejos no estequiométricos solubles en agua.
A relación 1 los complejos se hacen insolubles. El aumento del
contenido de policatión puede dar lugar a que el complejo cambie su
signo y se haga de nuevo soluble. Presumiblemente, las partículas
son estabilizadas en solución por los lazos cargados positivamente
y las colas colgantes del policatión unido al DNA de la cadena. Con
el aumento de la concentración de sal a 100 mM, los complejos
estabilizados por la carga (relación +/- mayor que 1) comenzaron a
agregarse (Fig. 4). La velocidad de agregación disminuyó al aumentar
la relación PLL/DNA, pero el nivel de turbidez final fue el mismo
para todas las muestras.
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La incubación de complejos de DNA/PLL con 0,97
\mumoles de DTBP durante 2 h a temperatura ambiente tuvo por
resultado un desplazamiento del máximo de turbidez para una relación
PLL/DNA de 0,88 (Fig. 4). Esto puede ser explicado como un aumento
de la carga de PLL como resultado de la modificación. Aparentemente,
el DTBP no entrecruzó los complejos PLL/DNA entre sí a una relación
de más de 1. La adición de NaCl a una concentración de 100 mM no
cambió la dispersión de luz en todo el intervalo de concentración de
PLL (Fig. 4). Estos resultados indican que la adición de DTBP evitó
que los complejos de PLL/DNA se agregasen en sal 100 mM.
La capacidad para centrifugar el DNA fue usada
como otra indicación de la agregación (Tabla 2). Todas las muestras
fueron centrifugadas 7 min a 12.000 rpm y se determinó la cantidad
de DNA en el sobrenadante. Como se indica, los complejos de PLL/DNA
entrecruzados con una relación molar 4,1 y 5,9 no precipitaron. Por
consiguiente el tamaño de los complejos era muy pequeño. En cambio,
el DNA en los complejos no entrecruzados precipitó
completamente.
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En la Tabla 3, está claro que los complejos de
PLL/DNA con relación superior a 1,3 se hicieron sustancialmente
menos propensos a agregar en presencia de NaCl 100 mM después de la
modificación por DTBP. La reacción estabilizada de complejo PLL/DNA
es entrecruzamiento intra complejo porque el tratamiento de los
complejos modificados PLL/DNA con relación 4,12 y 6,18 por DTT 50 mM
durante 1 h tuvo por resultado la agregación. En esta condición los
entrecruzados debían segmentarse pero el nivel de modificación de
lisina no cambia.
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El complejo PLL/DNA en relación 41:12 fue
tratado con diferentes concentraciones de DTBP durante 2h. El tamaño
de las partículas sin y en presencia de NaCl 100 mM fue determinado
por dispersión de luz cuasi elástica.
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La Tabla 4 muestra que se necesitó un exceso de
DTBP para la protección del complejo contra la agregación
dependiente de la sal. Debe observarse que el DTBP hasta la relación
de 3,05 no indujo entrecruzamiento entre las partículas de DNA/PLL.
Para muestras con una relación DTBP/PLL de 2,03 y 3,05 los valores
del potencial zeta fueron 16,16 \pm 3,23 mV y 20,33 \pm 3,3 mV
respectivamente, en HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 100 mM.
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Complejos de DNA/PLL (relación molar de 0,87,
1,74, 3,04 o 4,35 como se indica en la Fig. 5) fueron preparados
como antes pero en 1 ml de tampón. Se añadieron 0,97 \mumoles de
DTBP. Las mezclas se incubaron 2 horas a temperatura ambiente. Se
añadieron 10 \mul de bromuro de etidio (EB) (0,1 mg/ml) en cada
muestra y las muestras se incubaron 30 min. Después se añadieron
secuencialmente las partes alícuotas DS, con agitación. Después de
cada adición, se dejó estabilizar la fluorescencia 30 segundos.
La adición de PLL a DNA en solución dio caídas
rápidas en la fluorescencia, que corresponden a la formación de
complejo. La adición de DS a los complejos preformados puede
restablecer la fluorescencia del EB y puede ser tomada como
indicador de la estabilidad del complejo (Fig. 5). Sin DTBP, la
fluorescencia del EB subió con la adición de DS en cada relación de
PLL/DNA (Fig. 5). Con DTBP, el aumento fue atenuado y no hubo una
influencia clara de la modificación con DTBP sobre la estabilidad
del complejo: la fracción de complejos no pudo ser rota en ninguna
concentración de DS. La parte de los complejos que son estables a la
rotura por DS dependió de la relación PLL/DNA.
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La polialilamina (PAA) es similar a PLL y
contiene grupos amino primarios. Pero el pK medio de la PAA es más
bajo que el de PLL por la influencia más fuerte de un grupo en
otro.
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Los resultados de la Tabla 5 son muy similares a
los resultados obtenidos con los complejos de PLL/DNA, pero se
requieren grandes excesos de policationes para la preparación de
partículas pequeñas estables.
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La H1 tiene una carga positiva total de 55 por
molécula (Pm 21,3 kDa) y puede formar un complejo
interpolielectrolito con el DNA. A diferencia de PLL y PAA, la
interacción de la H1 con el DNA da lugar a un aumento considerable
de la turbidez en un amplio intervalo de concentración de H1. La
turbidez no cambia después de la adición de NaCl l00 mM. El
tratamiento del complejo H1/DNA con relación de carga 3,42 con DTBP
da lugar a un descenso significativo de la turbidez de 1929 a 348.
La adición posterior de NaCl hace que la turbidez aumente a 458.
La centrifugación de los complejos de H1/DNA en
un tampón con NaCl 100 mM durante 7 min a 12.000 rpm tuvo por
resultado la precipitación del DNA, pero después de la modificación
con DTBP la mayor parte del DNA queda en solución, lo que indica la
presencia de partículas pequeñas (Fig. 6). La Tabla 6 muestra que
los tamaños de las partículas formadas con DTBP (Tabla 6B) en NaCl
100 mM eran mucho menores que los de las partículas formadas sin
DTBP (Tabla 6A).
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A. H1/DNA- no DTBP
B. H1/DNA + DTBP
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1. La polimerización con plantilla de DNA de
grandes polímeros da partículas pequeñas que no se agregan en
soluciones salinas fisiológicas.
2. La capacidad para preparar partículas
pequeñas de DNA condensado que no se agregue en una solución salina
fisiológica será una formulación extraordinariamente útil para la
transferencia y la terapia génicas.
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La polimerización en etapas con DNA como
plantilla se llevó a cabo usando la poliamina
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD) como en el Ejemplo 1, excepto que se añadió a la mezcla de
reacción AEPD pegilado (Compuesto 18,
N2,N2,N3,N3-tetra(PEG-amino
propil)-AEPD, o se denominará
AEPD-PEG) junto con el AEPD. Este ejemplo enseña
cómo se preparan partículas solubles en agua no agregadas (diámetro
< 100 nm) de DNA condensado mediante el procedimiento de la
polimerización con plantilla.
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La mezcla de las siguientes aminas fue usada
como comonómeros:
1.
N,N'-bis(2-aminoeti1)-1,3-propanodiamina
(AEPD, Aldrich, Milwaukee, WI).
2.
N2,N2,N3,N3-tetra(PEG-amino
propil)-AEPD (Compuesto 18).
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Se usó el agente de entrecruzamiento
siguiente:
1.
Dimetil-3,3'-ditiobispropionimidato
(DTBP, bisimido éster segmentable S-S, Pierce
Chemical Co.).
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Las condiciones optimizadas de la reacción con
la mezcla AEPD/AEPD-PEG fueron las siguientes. Se
mezclaron DNA de plásmido (pCIluc, 10 \mug), AEPD (58 \mug),
AEPD-PEG (5 mg) y DTBP (187 \mug) en 0,5 ml de
solución tampón (HEPES 20 mM, EGTA1 mM, pH 8,5). La relación molar
de AEPD total (AEPD + AEPD-PEG) a base DNA fue 20:1.
La reacción se dejó transcurrir durante tres horas a temperatura
ambiente. En los momentos correspondientes a los tiempos 10, 30, 60
y 180 min se llevó a cabo la medida de tamaños de partícula usando
un espectrómetro de correlación de fotones como se describe en el
Ejemplo 1. Los datos obtenidos fueron comparados con el experimento
en el que solamente fue usado AEPD como monómero. Se midieron tres
muestras independientes de cada mezcla de reacción de
polimerización con plantilla, y los datos se expresaron como media
\pm SD. La microscopía electrónica de transmisión de las muestras
de mezcla AEPD/AEPD-PEG se realizó como se describe
en el Ejemplo 1.
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La formación de partículas de DNA condensado
para mezcla de polimerización AEPD/AEPD-PEG con
plantilla fue confirmada tanto por dispersión dinámica de luz como
por microscopía electrónica.
A diferencia de la mezcla 20:1 con AEPD solo que
da agregados, la mezcla AEPD/AEPD-PEG tuvo por
resultado el aumento de la población de partículas de DNA
individuales no agregadas con un tamaño < 100 nm con una
morfología de varilla característica.
El 85% del DNA condensado queda en solución
después de la centrifugación en microcentrífuga durante 5 min a
12000 g. En estas condiciones se encontró que precipitó el 100% del
DNA condensado con AEPD solo (relación 1:20).
La mezcla de reacción 1:20 de DNA/AEPD/DTBP en
presencia de moléculas de AEPD-PEG con grupos amina
primaria protegidos (precursor de monómero AEPD-PEG,
véase el Ejemplo ??) tuvo por resultado la formación de DNA
agregado.
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1. La polimerización con plantilla puede ser
realizada en presencia de moléculas de AEPD pegilado. El monómero
que contiene PEG fue incluido en el complejo de DNA condensado
final.
2. La adición de PEG pegilado en la mezcla de
polimerización con plantilla de DNA/AEPD/DTBP estándar tuvo por
resultado la formación de partículas no agregadas de DNA condensado
mediante el mecanismo de estabilización estérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinó DNA de plásmido (pCI luc, 10 mg) en
660 \muL de agua con 1380 \muL de metanol y 660 \muL de
cloroformo que contiene 144 mg of Compuesto 11, dando una solución
clara con un exceso de 7 veces de carga positiva. La solución se
agitó en vórtice y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20
minutos. Se reservó la mitad de la monofase. La monofase restante
se separó en dos capas mediante la adición de 375 \muL más de
agua. Las dos capas resultantes se separaron. La presencia de DNA en
la capa de cloroformo fue confirmada por la absorbancia a 260 nm.
Los tamaños de las partículas en la capa de cloroformo y en la
monofase reservada se midieron en un medidor de tamaños de
partículas Brookhaven ZetaPlus. La monofase Bligh/Dyer (Bligh, E.G.
y Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and
purification. Can. J. Biochem. Fisiol., 37,
911-917) tenía dos grupos de partículas en el
intervalo de tamaños de 80 a 128 nm y 7000 a 10000 nm. La capa de
cloroformo mostró un grupo de partículas con un intervalo de tamaños
de 4 a 7 nm, sin embargo la intensidad de la señal era baja.
La monofase Bligh/Dyer y la capa de cloroformo
fueron polimerizadas en presencia de AIBN al 1% (Aldrich Chemical
Company) durante 1 hora a 55ºC. El tamaño de partícula se midió
después de la polimerización. La monofase de Bligh/ Dyer contenía
una población de partículas con intervalo de tamaños de 700 a 1000
nm. La capa de cloroformo contenía una población de partículas con
un intervalo de tamaños de 340 a 400 nm. Los productos de reacción
polimerizados fueron analizados en un gel de
SDS-PAGE (Novex, 10-20% de triceno).
Aproximadamente 50 \mug de las mezclas de reacción polimerizadas
y un testigo que consiste en 7 \mug de DNA y 50 \mug de
compuesto 11 sin polimerización se cargaron en el gel y se
visualizaron por tinción con coomassie. Una mancha de polímero de
alto peso molecular comenzando en el pocillo fue observada en las
dos reacciones de polimerización. El testigo mostró una banda de
bajo peso molecular.
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El sulfato de dextrano (Pm = 500.000, DS) fue
obtenido de Sigma. La sal sódica del ácido polimetacrílico (pMAA, Pm
= 9.500) fue obtenida de Aldrich. Las partículas de DNA enjauladas
fueron preparadas como se describe en el ejemplo "Polimerización
con plantilla (caging: enjaulado) de polímeros grandes"
con DTBP como agente de entrecruzamiento. Los potenciales zeta de
las partículas obtenidas se midieron usando un espectrómetro
Zeta-Plus Photon Correlation (Brookhaven Instruments
Corp.).
Se llevaron a cabo medidas de dispersión de la
luz a noventa grados y ensayos de unión de TOTO usando un
espectrofotómetro de fluorescencia. El ensayo de TOTO fue usado para
establecer el grado de condensación del DNA (Wong FM. Reimer DL.
Bally MB, Cationic lipid binding to DNA: characterization of complex
formation. Biochemistry 35(18):5756-63,
1996).
\newpage
Después de obtener partículas solubles de los
complejos de DNA/PLL enjaulados cargados positivamente, su
superficie se convirtió en cargada negativamente complejándola con
el exceso de polianión. Se encontró que al tener lugar la adición de
solución de polianión al complejo DNA/PLL soluble, la carga neta del
triple complejo puede cambiar a la opuesta a la concentración del
polianión determinada.
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Los complejos triples formados a 150 \mug de
DS fueron ensayados por su solubilidad en sal fisiológica. Se
encontró que el 60% de I90 queda en la solución después de 5 min de
centrifugación a 12.000 g, tanto para los complejos enjaulados como
para los no enjaulados. La medida de tamaños de partícula usando
dispersión dinámica de luz mostró un 80% de partículas < 150 nm
en diámetro en estas condiciones.
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El ensayo con TOTO (Tabla 8) demostró que el DNA
queda condensado después de la formación de complejo triple cargado
negativamente, aunque tuvo lugar algo de descondensación parcial. El
complejo enjaulado se encontró más resistente a la descondensación
durante la recarga (80% de condensación preservada para una adición
de 400-500 \mug de DS).
Es posible recargar complejos DNA/PLL con otros
polianiones. Se obtuvieron datos similares con ácido polimetacrílico
(no mostrado).
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Materials y métodos: Los espectros de
H-NMR se obtuvieron en un espectrofotómetro Bruker
AC 250 o un Bruker AC 300, dándose los desplazamientos químicos a
campo más bajo en partes por millón a partir de un patrón interno
de tetrametilsilano. La
diamino-N-metildipropilamina
(Aldrich Chemical Co.), el anhídrido Boc (Aldrich Chemical Co.), la
trietilamina (Aldrich Chemical Co.), el anhídrido trifluoroacético
(Aldrich Chemical Co.), el
9-bromo-1-nonanol
(Aldrich Chemical Co.), el cloruro de acriloílo (Aldrich Chemical
Co.), el hidrobromuro de 3-bromopropilamina
(Aldrich Chemical Co.), el
7-bromo-1-octeno
(Aldrich Chemical Co.), la trimetilamina (solución en agua al 25%)
(Aldrich Chemical Co.), el yoduro de metilo (Aldrich Chemical Co.),
la N,N,N',N'-tetrametil-propano
diamina (Aldrich Chemical Co.) y la
N,N,N',N',N''-pentametiletilentriamina (Aldrich
Chemical Co.) se usaron tal como fueron suministrados. Todos los
disolventes fueron obtenidos de Aldrich Chemical Co. Todos los
disolventes anhidros fueron obtenidos de Aldrich Chemical Co. en
recipientes de seguridad Sure/Seal.
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Compuesto
1
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Se disolvió
3,3'-diamino-N-metildipropilamina
(0,800 mL, 0,721 g, 5,0 mmoles) en 5,0 mL de hidróxido sódico 2,2 N
(11 mmoles). A la solución se añadió anhídrido Boc (2,50 mL, 2,38 g,
10,9 mmoles) con agitación magnética. La mezcla de reacción se dejó
agitando a temperatura ambiente durante la noche (aproximadamente 18
horas). La mezcla de reacción se alcalinizó añadiendo más NaOH 2,2 N
hasta que todo el ácido t-butil carboxílico estaba
en solución. Después se extrajo la solución en cloroformo (2 x 20
mL). Los extractos en cloroformo combinados se lavaron 2 x 10 mL de
agua y se secaron sobre sulfato de magnesio. La eliminación del
disolvente dio 1,01 g (61,7%) de producto en forma de un sólido
blanco: 1H-NMR (CDCl_{3}) d 5,35 (bs, 2H); 3,17
(dt, 4H); 2,37 (t, 4H); 2,15 (s, 3H); 1,65 (tt, 4H); 1,45 (s,
18H).
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Compuesto
2
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Se disolvieron
3,3'-diamino-N-metildipropilamina
(0,504 mL, 436 mg, 3,0 mmoles) y trietilamina (0,920 mL, 6,6 mmoles)
en 20 mL de cloruro de metileno seco. La solución se enfrió en un
baño de hielo. Se añadió anhídrido trifluoroacético (0,932 mL, 1,39
g, 6,6 mmoles) disuelto en 40 ml de cloruro de metileno seco, gota a
gota y con agitación magnética, a lo largo de un periodo de
aproximadamente 20 minutos. Se dejó que la mezcla de reacción
alcanzase la temperatura ambiente y se agitó durante la noche
(aproximadamente 18 horas). La mezcla de reacción se lavó 2 x 15 mL
de bicarbonato sódico al 2%, 2 x 15 mL de agua, y se secó sobre
sulfato de magnesio. La eliminación del disolvente dio 763 mg
(67,9%) del producto en forma de un aceite amarillo:
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d 8,20 (bs, 2H); 3,45 (dt,
2H); 2,47 (t, 2H); 2,20 (s, 3H); 1,75 (tt, 2H).
\newpage
Compuesto
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
9-Bromo-1-nonanol
(0,939 g, 4,0 mmoles) fue disuelto en 4,0 mL de dietil éter anhidro
en un matraz r. b. (de fondo redondo) de 10 mL secado a la llama,
bajo nitrógeno seco. Se añadió carbonato sódico (6,36 g, 6,0 mmoles)
a la mezcla de reacción. Se añadió gota a gota cloruro de acriloílo
(0,356 mL, 0,397 g, 4,2 mmoles) disuelto en 3,5 mL de éter anhidro a
lo largo de un periodo de aproximadamente 10 minutos. Se dejó que la
mezcla de reacción llegase a la temperatura ambiente y se agitó
durante 2 días. La mezcla de reacción se diluyó a 40 mL con éter y
se lavó 3 x 10 mL de bicarbonato sódico al 2% para eliminar el
cloruro de acriloílo no reaccionado. La capa orgánica se secó sobre
sulfato de magnesio y se pasó por una columna corta de alúmina
(aproximadamente 7 g) para eliminar el alcohol no reaccionado. La
eliminación del disolvente dio 390 mg (35,2%) de producto en forma
de un líquido claro: ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d 6,40
(dd, 1H); 6,12 (dd, 1H); 5,82 (dd, 1H); 4,15 (t, 4H); 3,40 (t, 2H);
1,85 (dt, 2H); 1,65 (dt, 2H); 1,35 (m, 10 H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron hidrobromuro de
3-bromopropilamina (2,19 g, 10,0 mmoles) y
trietilamina (1,67 mL, 12,0 mmoles) en 60 mL de cloruro de metileno
seco. La solución se enfrió en un baño de hielo. Se añadió gota a
gota anhídrido trifluoroacético (1,69 mL, 2,51 g, 12,0 mmoles)
disuelto en 60 mL de cloruro de metileno a lo largo de
aproximadamente 20 minutos. Se dejó que la mezcla de reacción
llegase a la temperatura ambiente y se agitó durante la noche
(aproximadamente 18 horas). La mezcla de reacción se lavó 1 x 10 mL
de bicarbonato sódico al 2%, 1 x 10 mL de agua, y se secó sobre
sulfato de magnesio. La eliminación del disolvente dio 2,07 g
(88,5%) del producto en forma de un polvo blanco:
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d 6,70 (bs, 1H); 3,55 (dt,
2H); 3,45 (t, 2H); 2,17 (tt, 2H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinó
7-bromo-1-octeno
(0,168 mL, 191,2 mg, 1,00 mmoles) con trimetilamina (2,40 mL de
solución en agua al 25%). La mezcla se incubó a 50ºC en un agitador
rotatorio durante 18 horas. La eliminación del disolvente y la
recristalización en acetona/dietil éter dieron 191,6 mg (76,6%) del
producto en forma de placas blancas: ^{1}H-NMR
(CDCl_{3}) d 5,75 (m, 1H); 5,00 (m, 211); 3,60 (m, 2H); 3,45 (s,
9H); 2,05 (m, 2H); 1,75 (m, 2H); 1,40 (m, 6H).
\newpage
Compuesto
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 1 (86,3 mg, 0,25 mmoles) fue
combinado con
7-bromo-1-octeno y
disuelto en 0,050 mL de metil sulfóxido. La mezcla de reacción se
incubó a 55ºC durante 18 horas. La mezcla de reacción viscosa fue
triturada con éter dos veces. El aceite restante fue recristalizado
en cloroformo/éter para dar 55,3 mg (48,7%) del producto en forma de
cristales blancos: ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d 5,75
(m, 3H); 4,95 (m, 2H); 3,55 (m, 4H); 3,30 (m, 6H); 3,15 (s, 3H);
2,05 (m, 4H); 1,97 (m, 2H); 1,70 (m, 2H); 1,45 (s, 18H); 1,35 (m,
6H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 6 fue combinado con 0,350 mL de
acetato de etilo, 0,150 mL de metanol, y 0,150 mL de ácido
clorhídrico 12 N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 2,5 horas, y durante este tiempo la reacción se
hizo homogénea. Se eliminó el disolvente y el producto fue
precipitado en una pequeña cantidad de metanol con éter para dar
36,0 mg (95,2%) de producto en forma de un aceite incoloro:
^{1}H-NMR (CD_{3}OD) d 5,85 (m, 1H); 5,00 (m,
2H); 3,55 (m, 4H); 3,45 (m, 2H); 3,20 (s, 3H); 3,15 (t, 4H); 2,25
(m, 4H); 2,10 (m, 2H) 1,85 (m, 2H); 1,50 (m, 6H).
\newpage
Compuesto
8
El compuesto 1 (75,0 mg, 0,217 mmoles) fue
disuelto en 0,5 mL de éter seco, se añadió alcohol etílico gota a
gota hasta que el compuesto 1 estaba completamente disuelto. La
solución de reacción se enfrió en un baño de hielo y se purgó con
nitrógeno seco. Se añadió yoduro de metilo (0,021 mL, 33,7 mmoles),
y la mezcla de reacción se agitó a 4ºC durante 18 horas. Se vertió
la mezcla de reacción en agua y se lavó con éter. Después de
eliminar el agua, el producto fue disuelto en cloroformo, decolorado
con carbón activo, y secado con sulfato de magnesio. La eliminación
del disolvente dio 92,0 mg (87,0%) del producto en forma de un
aceito amarillo: ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d 5,50
(bs, 2H); 3,60 (m, 4H); 3,30 (s, 6H); 3,25 (m, 4H); 2,07 (m, 4H);
1,45 (s, 18H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
9
El compuesto 8 (92,0 mg, 0,189 mmoles) fue
disuelto en 0,200 mL de acetato de etilo y 0,150 mL de ácido
clorhídrico 12 N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 1 hora. El disolvente fue eliminado y el residuo
oleoso se trituró tres veces con éter. El producto restante secó
bajo vacío dando 43,9 mg (100%) de producto en forma de un sólido
ceroso amarillo: ^{1}H-NMR (CD_{3}OD) d 3,55 (m,
4H); 3,20 (s, 6H); 3,20 (t, 4H); 2,22 (m, 4H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
10
Se disolvieron
N,N,N'N'-tetrametilpropano diamina (0,0252 mL, 0,15
mmoles) y compuesto 3 (131 mg, 0,148 mmoles) en 0,150 mL de
dimetilformamida. La mezcla de reacción se incubó 50ºC durante 5
días. El producto se precipitó de la mezcla de reacción mediante la
adición de éter. El sólido resultante se recogió y se recristalizó
dos veces en etanol/éter dando 56,9 mg (55,4%) de producto en forma
de cristales blancos: ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d
6,40 (dd, 2H); 6,15 (dd, 211); 5,85 (dd, 1H); 4,15 (t, 4H); 3,88 (m,
4H); 3,52 (m, 4H); 3,40 (s, 12H); 2,75 (m, 2H); 1,82 (m, 4H); 1,65
(m, 4H); 1,35 (m, 20H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
11
Se disolvieron
N,N,N',N',N''-pentametiletilentriamina (0,031 mL,
0,15 mmoles) y el compuesto 3 (187 mg, 0,675 mmoles) en 0,150 mL de
dimetilformamida. La mezcla de reacción se incubó a 50ºC durante 5
días. El producto fue precipitado de la mezcla de reacción mediante
la adición de éter. El sólido resultante se recogió y se
recristalizó en etanol/éter dando 36,6 mg (24,3%) de producto en
forma de cristales blancos: ^{1}H-NMR (CDCl_{3})
d 6,40 (dd, 3H); 6,15 (dd, 3H); 5,83 (dd, 3H); 4,15 (t, 6H); 3,95
(m, 4H); 3,60 (m, 411); 3,40 (s, 15H); 3,17 (m, 6H); 1,70 (m, 12H);
1,35 (m, 30H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
12
Se disolvieron el compuesto 2 (233 mg, 0,691
mmoles) y el compuesto 3 (282 mg, 1,01 mmoles) en 0,200 mL de
dimetilformamida. La mezcla de reacción se incubó a 50ºC durante 4
días. El producto fue precipitado de la mezcla de reacción mediante
la adición de éter. El aceite resultante fue triturado 3 x con éter.
El aceite se secó bajo vacío dando 385,5 mg (90,8%) de producto en
forma de un aceite claro: ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d
9,05 (bs, 2H); 6,35 (dd, 1H); 4,15 (t, 211); 3,50 (m, 8H); 3,20 (m,
2H); 3,15 (s, 3H); 2,20 (m, 4H); 1,70 (m, 4H); 1,30 (m, 10H).
\newpage
Compuesto
13
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 1 (100,6 mg, 0,291 mmoles) y el
compuesto 4 (76,8 mg, 0,328 mmoles) se disolvieron en 0,150 mL de
dimetilformamida. La mezcla de reacción se incubó a 50ºC durante 3
días. La TLC (fase inversa; acetonitrilo: acetato de amonio 50 mM pH
4,0; 3:1) indicó 1 mancha mayoritaria y 2 manchas minoritarias,
ninguna de las cuales correspondía al material de partida. Los
intentos de realizar la recristalización fueron infructuosos por lo
que el producto se precipitó en etanol con éter dando 165,5 mg
(98,2%) de producto e impurezas menores, en forma de un aceite
claro: ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) d 9,12 (bs, 1H);
5,65 (bs, 2H); 3,50 (m, 8H); 3,20 (m, 4H); 3,15 (s, 3H); 2,20 (m,
2H); 2,00 (m, 4H); 1,45 (s, 18H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
14
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 13 (1,09 g, 1,88 mmoles) fue
disuelto en 10 mL de metanol y 1,0 mL de agua. Se añadió carbonato
sódico (1,00 g, 9,47 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 18 horas. El carbonato sódico y el
disolvente se eliminaron dejando un aceite claro que fue triturado
3x con éter. El secado bajo vacío dio 898,2 mg (98,8%) de producto
en forma de un sólido blanco. La TLC (fase inversa; acetonitrilo:
acetato de amonio 50 mM pH 4,0; 1:3) dio una mancha a Rf = 0,54.
^{1}H-NMR (D_{2}O) d 3,55 (m, 6H); 3,27 (m, 4H);
3,05 (s, 3H); 2,87 (m, 2H); 1,97 (m, 6H); 1,45 (s, 18H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
15
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió AEPD (275 mg, 1,72 mmoles) en 5,0 mL
de tetrahidrofurano y se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Se añadió
gota a gota BOC-ON (800 mg, 3,25 mmoles, Aldrich
Chemical Co.) disuelto en 3 mL de tetrahidrofurano con agitación
magnética, a lo largo de aproximadamente 15 minutos. El baño de
hielo se retiró y se dejó que la mezcla de reacción agitada llegase
a la temperatura ambiente. Después de 2 horas el disolvente fue
eliminado en un evaporador rotatorio, y el residuo fue disuelto en
20 mL de cloroformo. La capa de cloroformo fue lavado con hidróxido
sódico 2 N. La capa de cloroformo se extrajo después con ácido
clorhídrico 0,1 N. La capa de ácido se alcalinizó después mediante
la adición de hidróxido sódico 2 N y el producto se
re-extrajo en cloroformo. La capa de cloroformo se
secó sobre sulfato de magnesio. La eliminación del disolvente
proporcionó 288 mg de producto (49,2%). ^{1}H-NMR
(CD_{3}OD) 3,15 (t, 4H); 2,65 (m, 8H); 1,70 (m, 2H); 1,45 (s,
18H).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
16
El compuesto 15 (33,0 mg, 91,7 \mumoles) y
3-bromo-1-(trifluoroacetamidil)propano
(128 mg, 547 \mumoles) fueron combinados en 200 \muL de
dimetilformamida y se incubaron a 55ºC durante 24 horas. La TLC
(sílice: 90% de acetonitrilo, 10% de acetato de amonio 50 mM pH 4,0)
mostró una mezcla de productos. Se añadió más
3-bromo-l-(trifluoroacetamidil)
propano (100 mg, 427 \mumoles) en 200 \muL de dimetilformamida y
se incubó 24 horas más. La TLC mostró 2 manchas a rf 0,51 y 0,58 en
el sistema anterior cuando se desarrolló en reactivo de Dragendorff
(Sigma Chemical Co.). La precipitación con dietil éter dio 56,0 mg
de producto (53%). El producto final puede ser una mezcla de AEPD
tri-alquilado y AEPD
tetra-alquilado. Se están realizando la
caracterización y la purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
17
El compuesto 16 (28,0 mg, 24,7 \mumoles) fue
disuelto en 1 mL de metanol y agua 6:4 junto con carbonato cálcico
(104 mg, 1,0 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a 60ºC durante
3 horas. La TLC (sílice: 90% de acetonitrilo, 10% de acetato de
amonio 50 mM pH 4,0) indicó el término de la reacción quedando todo
el material en el origen. El producto fue aislado después de
eliminar el carbonato cálcico por filtración para dar 13,0 mg
(75,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
18
El compuesto 17 (13 mg, 18,6 \mumoles) y
O-[2-(N-succinimidiloxicarbonil)-etil]-O'-metilpolietilenglicol
5.000 [NHS-Peg] (180 mg, 36 \mumoles) en 0,5 mL de
dimetilformamida. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos.
Se comprobó en la mezcla de reacción la presencia de aminas
primarias punteando manchas en una placa de TLC y desarrollando con
un pulverizador de ninhidrina. Todavía había aminas primarias, por
lo que se añadió más NHS-Peg (80 mg, 16 \mumoles).
La mezcla de reacción fue cribada de nuevo en cuanto a la presencia
de aminas primarias, y no se encontró ninguna presente. La reacción
se detuvo por precipitación con dietil éter. El precipitado se lavó
2x con dietil éter, y se secó bajo vacío para dar 198 mg de
producto. El producto fue disuelto en 2 mL de ácido
trifluoroacético, y se incubó 20 minutos para eliminar los grupos
protectores de BOC. El ácido trifluoroacético se eliminó bajo una
corriente de nitrógeno. El residuo se secó bajo vacío para dar 198
mg de producto en forma de un sólido blanquecino. La presencia de
grupos amino libres después de la eliminación de los grupos
protectores de BOC fue confirmada por una prueba de ninhidrina
positiva. El producto final debe contener aproximadamente 3 cadenas
de Peg por molécula, tal como se determina por la cantidad de
NHS-Peg usada en la reacción.
Lo que antecede se considera solamente
ilustrativo de los principios de la presente invención. Además, dado
que hay numerosas modificaciones y cambios que se les ocurrirán
fácilmente a los expertos en la técnica, no se desea limitar el
alcance de la invención a la construcción y la operación exactas que
se han mostrado y descrito. En consecuencia, todas las
modificaciones y equivalentes adecuados caen dentro del alcance de
la invención.
Claims (45)
1. Un método para preparar un complejo para
suministrar a una célula, que comprende formar covalentemente un
polímero, a partir de monómeros, en presencia de un ácido nucleico,
y en el que el polímero es modificado covalentemente en presencia
del ácido nucleico.
2. El método según la reivindicación 1ª, en el
que uno o más de los monómeros tiene afinidad por el ácido
nucleico.
3. El método según la reivindicación 2ª, en el
que dichos uno o más monómeros interaccionan con el ácido nucleico
mediante interacción electrostática, enlace de H, transferencia de
carga o fuerzas de van der Waals.
4. El método según la reivindicación 3ª, en el
que los monómeros consisten en policationes o polianiones.
5. El método según la reivindicación 4ª, en el
que el policatión comprende una poliamina.
6. El método según la reivindicación 1ª, en el
que la formación del polímero condensa el DNA.
7. El método según la reivindicación 1ª, en el
que los monómeros condensan el ácido nucleico.
8. El método según las reivindicaciones 1ª a
5ª, en el que modificar covalentemente el polímero comprende unir
una molécula al polímero.
9. El método según la reivindicación 8ª, en el
que uno o más de los monómeros comprenden un estabilizante
estérico.
10. El método según la reivindicación 9ª, en el
que el estabilizante estérico comprende polietilenglicol (PEG).
11. El método según la reivindicación 8ª, en el
que la molécula comprende una señal de potenciación de la
transferencia génica.
12. El método según la reivindicación 11ª, en el
que la señal de potenciación de la transferencia génica se elige
entre el grupo que consiste en una señal de localización nuclear, un
ligando que se une a una célula, y una señal de liberación.
13. El método según la reivindicación 8ª, en el
que en el que la molécula cambia la carga del polímero.
14. El método según la reivindicación 8ª, en el
que la molécula se elige entre el grupo que consiste en compuestos
anfipáticos, hidrófobos e hidrófilos.
15. El método según la reivindicación 8ª, en el
que la molécula altera la carga neta del complejo.
16. El método según la reivindicación 5ª, que
comprende además asociar no covalentemente una molécula con el
complejo.
17. El método según la reivindicación 16ª, en el
que la molécula comprende una señal de potenciación de la
transferencia génica.
18. El método según la reivindicación 16ª, en el
que la molécula comprende un polímero.
19. El método según la reivindicación 16ª, en el
que la molécula se elige entre el grupo que consiste en:
estabilizante estérico, PEG, compuesto anfipático, compuesto
hidrófobo y compuesto hidrófilo.
20. El método según la reivindicación 16ª, en el
que la molécula altera la carga neta del complejo.
21. El método según la reivindicación 1ª, en el
que el polímero contiene un enlace disulfuro.
22. El método según la reivindicación 5ª, en el
que el complejo adopta un tamaño para que pase a través de las
ventanas endoteliales.
23. Un complejo para suministrar un ácido
nucleico a una célula, preparado mediante el procedimiento que
comprende:
a) asociar un policatión con el ácido nucleico
condensando así el ácido nucleico.
b) hacer reaccionar un agente de
entrecruzamiento con el complejo entrecruzando así el policatión en
presencia del ácido nucleico.
24. El complejo según la reivindicación 23ª, en
el que el policatión comprende una poliamina.
25. El complejo según la reivindicación 23ª, que
comprende además una molécula unida covalentemente al
policatión.
26. El complejo según la reivindicación 25ª, en
el que la molécula comprende un estabilizante estérico.
27. El complejo según la reivindicación 26ª, en
el que el estabilizante estérico comprende polietilenglicol
(PEG).
28. El complejo según la reivindicación 25ª, en
el que la molécula se elige entre el grupo que consiste en una señal
de localización nuclear, un ligando que se une a una célula, y una
señal de liberación.
29. El complejo según la reivindicación 25ª, en
el que la molécula altera el potencial zeta del complejo.
30. El complejo según la reivindicación 25ª, en
el que la molécula se elige entre el grupo que consiste en un
compuesto anfipático, un compuesto hidrófobo y un compuesto
hidrófilo.
31. El complejo según la reivindicación 23ª, que
comprende además una molécula asociada no covalentemente con el
complejo.
32. El complejo según la reivindicación 31ª, en
el que la molécula se elige entre el grupo que consiste en
polianión, estabilizante estérico, PEG, compuesto anfipático,
compuesto hidrófobo y compuesto hidrófilo.
33. El complejo según la reivindicación 31ª, en
el que la molécula altera el potencial zeta del complejo.
34. El complejo según la reivindicación 23ª, en
el que el polímero o el agente de entrecruzamiento contiene un
enlace disulfuro.
35. El complejo según la reivindicación 23ª, en
el que el complejo adopta un tamaño para que pase a través de las
ventanas endoteliales.
36. El uso para el suministro in vitro
del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 23ª a 35ª a
una célula, en el que el suministro comprende transfectar la célula
con un ácido nucleico.
37. El uso según la reivindicación 36ª, en el
que el suministro comprende el suministro a una célula, a la
membrana de la célula, dentro del citoplasma de la célula, el núcleo
de la célula u otro orgánulo de la célula.
38. El uso según la reivindicación 36ª, en el
que el suministro es mezclando el ácido nucleico con las células en
cultivo.
39. El uso del complejo según cualquiera de las
reivindicaciones 23ª a 35ª para la preparación de un medicamento
para el tratamiento o la profilaxis de un mamífero por terapia
génica, que comprende suministrar el complejo a una célula, en donde
el ácido nucleico comprendido por el complejo produce proteína
terapéutica o una molécula antisentido.
40. El uso según la reivindicación 39ª, en el
que la proteína terapéutica es una hormona, una citocina, un factor
de crecimiento o una enzima.
41. El uso según las reivindicaciones 39ª o 40ª,
en el que la enzima, tal como se produce, es deficitaria o carencial
en pacientes con un fallo innato de metabolismo.
42. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 39ª a 41ª, en el que la enzima es fenilalanina
hidrolasa y el paciente tiene fenilcetonuria.
43. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 39ª a 42ª, en el que la molécula antisentido es
terapéutica en pacientes con tumor, cáncer o infección.
44. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 39ª a 43ª, en el que el suministro es intravenoso,
intraarterial, intra ducto biliar, intramuscular, subcutáneo o
intraperitoneal; por suministro en los vasos sanguíneos, vasos
linfáticos, vasos biliares, vasos renales o ventrículos cerebrales;
o por inyecciones directas en los tejidos.
45. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 39ª a 44ª, en el que las inyecciones directas son
en el hígado, cerebro, timo, riñones, corazón, ojos, piel, ganglios
linfáticos, huesos o tubo digestivo.
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| US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
| US20030069173A1 (en) * | 1998-03-16 | 2003-04-10 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced transfections |
| US6126964A (en) * | 1996-01-04 | 2000-10-03 | Mirus Corporation | Process of making a compound by forming a polymer from a template drug |
| WO1999055825A1 (en) * | 1998-04-30 | 1999-11-04 | Mirus Corporation | A process of making a compound by forming a polymer from a template drug |
| US7396919B1 (en) * | 1998-07-17 | 2008-07-08 | Mirus Bio Corporation | Charge reversal of polyion complexes |
| WO2000027795A1 (en) * | 1998-11-12 | 2000-05-18 | Invitrogen Corporation | Transfection reagents |
| EP1698629A3 (en) * | 1999-04-30 | 2006-11-29 | Cellgate, Inc. | Polyamines and their use in therapy |
| CA2368801A1 (en) * | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Slil Biomedical Corporation | Conjugates as therapies for cancer and prostate diseases |
| EP1102785B1 (en) * | 1999-06-07 | 2013-02-13 | Arrowhead Research Corporation | COMPOSITIONS FOR DRUG DELIVERY USING pH SENSITIVE MOLECULES |
| US6770740B1 (en) | 1999-07-13 | 2004-08-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods |
| EP1235914A2 (en) * | 1999-11-24 | 2002-09-04 | Joseph Rosenecker | Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells |
| US6881576B2 (en) * | 1999-12-31 | 2005-04-19 | Mirus Bio Corporation | Formation of polyampholytes in the presence of a polyion |
| US20020042388A1 (en) * | 2001-05-01 | 2002-04-11 | Cooper Mark J. | Lyophilizable and enhanced compacted nucleic acids |
| EP1337504A4 (en) * | 2000-11-08 | 2005-10-05 | Cellgate Inc | NOVEL AMINO ACID CONJUGATES AND POLYAMINE ANALOGUES USEFUL AS ANTICANCING AGENTS |
| US20030096414A1 (en) | 2001-03-27 | 2003-05-22 | Invitrogen Corporation | Culture medium for cell growth and transfection |
| CA2463771A1 (en) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Slil Biomedical Corporation | Oligoamine compounds and derivatives thereof for cancer therapy |
| IL161733A0 (en) * | 2001-11-02 | 2005-11-20 | Insert Therapeutics Inc | Methods and compositions for therapeutic use of rna interference |
| US20040063654A1 (en) * | 2001-11-02 | 2004-04-01 | Davis Mark E. | Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference |
| ES2328031T3 (es) | 2002-05-24 | 2009-11-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Composiciones para distribuir acidos nucleicos a celulas. |
| US7348453B2 (en) * | 2003-09-04 | 2008-03-25 | Mirus Bio Corporation | Labile linkage for compound delivery to a cell |
| MXPA06004304A (es) * | 2003-10-24 | 2006-06-05 | Hoffmann La Roche | Antagonistas del receptor ccr-3. |
| US7524827B2 (en) | 2004-06-01 | 2009-04-28 | Pronai Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the inhibition of gene expression |
| US8172855B2 (en) | 2004-11-24 | 2012-05-08 | Abdou M S | Devices and methods for inter-vertebral orthopedic device placement |
| JP5014572B2 (ja) * | 2004-12-20 | 2012-08-29 | 正彦 阿部 | 重合性界面活性剤およびその製造方法 |
| JP5623016B2 (ja) | 2005-12-01 | 2014-11-12 | プロネイ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＰｒｏｎａｉｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． | 癌治療法およびそれに用いる医薬組成物 |
| TWI428135B (zh) * | 2007-03-26 | 2014-03-01 | Hirofumi Takeuchi | And a carrier composition for quick-acting nucleic acid delivery |
| CN101270168B (zh) * | 2008-05-13 | 2011-06-22 | 中国药科大学 | 透明质酸接枝聚乙烯亚胺共聚物、制备方法及其作为基因载体的应用 |
| US8950583B2 (en) * | 2008-12-06 | 2015-02-10 | Ermes Medical Company Limited | Method to remove heavy metals from a mammal |
| WO2010101226A1 (ja) | 2009-03-04 | 2010-09-10 | 大塚製薬株式会社 | 核酸複合体、及び核酸送達用組成物 |
| US8921448B1 (en) * | 2009-09-07 | 2014-12-30 | Mirus Bio Llc | Transfection compositions using amphipathic compounds |
| US8575218B2 (en) * | 2009-09-28 | 2013-11-05 | The University Of Kentucky Research Foundation | Thiol-containing compounds for the removal of elements from tissues and formulations therefor |
| RU2528396C2 (ru) * | 2009-09-28 | 2014-09-20 | Юнивёрсити Оф Кентукки Рисёч Фаундейшн | Тиолсодержащие соединения для удаления элементов из загрязненной окружающей среды и способы их применения |
| US8764806B2 (en) | 2009-12-07 | 2014-07-01 | Samy Abdou | Devices and methods for minimally invasive spinal stabilization and instrumentation |
| US8426368B2 (en) * | 2010-03-25 | 2013-04-23 | The University Of Kentucky Research Foundation | Method of ameliorating oxidative stress and supplementing the diet |
| US20110237776A1 (en) * | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Haley Boyd E | Aromatic compounds with sulfur containing ligands |
| JP2013528665A (ja) | 2010-03-26 | 2013-07-11 | メルサナ セラピューティックス， インコーポレイテッド | ポリヌクレオチドの送達のための修飾ポリマー、その製造方法、およびその使用方法 |
| US8845728B1 (en) | 2011-09-23 | 2014-09-30 | Samy Abdou | Spinal fixation devices and methods of use |
| US20130226240A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Samy Abdou | Spinous process fixation devices and methods of use |
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| US9320617B2 (en) | 2012-10-22 | 2016-04-26 | Cogent Spine, LLC | Devices and methods for spinal stabilization and instrumentation |
| KR20150087270A (ko) | 2012-11-05 | 2015-07-29 | 프로나이 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | Bcl2 발현 조절에 의한 암치료용 바이오마커 이용 방법 |
| WO2016011203A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-21 | Life Technologies Corporation | Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells |
| US10857003B1 (en) | 2015-10-14 | 2020-12-08 | Samy Abdou | Devices and methods for vertebral stabilization |
| US10973648B1 (en) | 2016-10-25 | 2021-04-13 | Samy Abdou | Devices and methods for vertebral bone realignment |
| US10744000B1 (en) | 2016-10-25 | 2020-08-18 | Samy Abdou | Devices and methods for vertebral bone realignment |
| US10303608B2 (en) * | 2017-08-22 | 2019-05-28 | Qualcomm Incorporated | Intelligent data prefetching using address delta prediction |
| US11179248B2 (en) | 2018-10-02 | 2021-11-23 | Samy Abdou | Devices and methods for spinal implantation |
| US11724260B2 (en) | 2019-04-08 | 2023-08-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Microfluidic sensor |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5223424A (en) * | 1985-09-06 | 1993-06-29 | Prutech Research And Development | Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence |
| US4861719A (en) * | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
| US5585481A (en) * | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
| US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| US5149543A (en) * | 1990-10-05 | 1992-09-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Ionically cross-linked polymeric microcapsules |
| US5270170A (en) * | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
| US6113946A (en) * | 1992-04-03 | 2000-09-05 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations |
| US5562909A (en) * | 1993-07-12 | 1996-10-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Phosphazene polyelectrolytes as immunoadjuvants |
| US6232295B1 (en) | 1994-10-12 | 2001-05-15 | Jon Faiz Kayyem | Cell-specific contrast agent and gene delivery vehicles |
| US6126964A (en) * | 1996-01-04 | 2000-10-03 | Mirus Corporation | Process of making a compound by forming a polymer from a template drug |
| EP0904031A4 (en) * | 1996-05-29 | 2002-05-02 | Cell Genesys Inc | CATIONIC POLYMERS / LIPIDS AS VEHICLES FOR PROVIDING NUCLEIC ACID |
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